Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Динамика васкуляризации ворсин плаценты человека в течение физиологической беременности

ВАК РФ 03.03.04, Клеточная биология, цитология, гистология

Автореферат диссертации по теме "Динамика васкуляризации ворсин плаценты человека в течение физиологической беременности"

На правах рукописи

АЛЕКСАНДРОВИЧ НАТАЛЬЯ ВИКТОРОВНА

ДИНАМИКА ВАСКУЛЯРИЗАЦИИ ВОРСИН ПЛАЦЕНТЫ ЧЕЛОВЕКА В ТЕЧЕНИЕ ФИЗИОЛОГИЧЕСКОЙ БЕРЕМЕННОСТИ

03.03.04 - клеточная биология, цитология, гистология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

2 9 АВГ 2013

Москва

2013

005532383

Работа выполнена в Государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Московский государственный медико-стоматологический университет имени А.И.Евдокимова» Министерства здравоохранения Российской Федерации и в Федеральном государственном бюджетном учреждении «Научно-исследовательский институт морфологии человека» РАМН

Научный руководитель:

доктор биологических наук, профессор Ерофеева Людмила Михайловна

Научный консультант:

Заслуженный деятель науки РФ, доктор медицинских наук, профессор Милованов Андрей Петрович

Официальные оппоненты:

Ведущий научный сотрудник лаборатории стволовых клеток Института экспериментальной кардиологии Российского кардиологического научно-производственного комплекса, доктор медицинских наук, профессор Павлович Евгений Ростиславович

Профессор кафедры гистологии с эмбриологией и цитологией ГОУ ВПО «Ярославская государственная медицинская академия» Минздрава России, доктор медицинских наук Гансбургский Андрей Николаевич

Ведущая организация: Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Первый Московский государственный медицинский университет имени И.М. Сеченова» Министерства здравоохранения Российской Федерации

Защита диссертации состоится <л/уЬ » 2013 г. в 12 часов на

заседании диссертационного совета Д 001.004.01 при Федеральном государственном бюджетном учреждении «Научно-исследовательский институт морфологии человека» РАМН по адресу: 117418, Москва, ул. Цюрупы, д.З

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБУ «НИИ морфологии человека» РАМН

Автореферат разослан «

» СоНи^2013 года

Ученый секретарь диссертационного совета,

доктор медицинских наук Михайлова Лилия Петровна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

Ключевым моментом для функционирования репродуктивной системы «мать-плацента-плод» и реализации детородной функции являются сопряженные механизмы васкуло- и ангиогенеза, которые в полном объеме можно наблюдать в развивающейся плаценте. Опираясь на базовые данные W. Risau et. al. (1988) о разграничении процессов васкуло- и ангиогенеза в тканях эмбриона, этой важной проблеме посвящено большое количество морфологических исследований и обзоров (Leach L. et. aL, 2002; Mayhew T.M. et. al., 2004; Charnock-Jones D.S. et. al., 2004; Kaufmann P. et. al., 2004; Lisman B.A. et. al., 2007; Van Oppenraaij R.H. et. al., 2009). Наибольший интерес в изучении васкуляризации ворсин плаценты человека представляет первый триместр беременности, поскольку на примере плаценты легко прослеживаются самые ранние стадии васкулогенеза. Известно, что первые ангиобласты в строме ворсин появляются на 20-21 сутки после оплодотворения (Castellucci М. et. al., 1990). Имеются сведения о формировании тяжей ангиобластов, затем небольших, потом увеличивающихся просветов первичных капилляров (Asan Е. et. al., 1999; Demir R. et. al., 2006). По определению Kaufmann P. et. al. (2004), в течение физиологической беременности происходят два типа ангиогенеза: с ветвлением сосудов -«ветвящийся» и с удлинением сосудов - «неветвящийся», однако нет единого мнения о сроках их возникновения. Кроме того, точно не установлено, когда заканчивается васкулогенез и заканчивается ли вообще, когда начинается ангиогенез, и какой из двух процессов преобладает на разных сроках физиологической беременности. Кровеносные сосуды во всех уровнях ворсин плаценты человека не описаны, нет данных о стадийности их формирования и преобразований. Мало работ, где приведены данные с использованием

иммуноморфологического маркера CD34 для лучшей визуализации ангиобластов и эндотелиоцитов в строме ворсин плаценты человека (teVelde Е.А. et. al., 1997; Huisman М.А. et. al., 2010). Только в отдельных исследованиях предпринимается попытка морфометрической объективизации процессов васкуло- и ангиогенеза (Huisman М.А. et. al., 2010). Признанным стимулятором роста эндотелия капилляров является семейство VEGF, включающее формы: VEGF-A, VEGF-B, VEGF-C, VEGF-D, VEGF-E и PIGF. Сигнальная деятельность VEGF относительно клетки зависит от наличия у нее определенных мембранных рецепторов (VEGFR-1, VEGFR-2, VEGFR-3). В большинстве работ, посвященных изучению плаценты, охарактеризован VEGF-A и его рецепторы 1 и 2 типа, так как первоначально рецептор 3 типа (VEGFR-3) описан как маркер эндотелия лимфатических сосудов (Lee J., 1996; Achen M.G., 1998; Makinen T., 2001). В современной литературе сообщается, что члены семейства контролируют все стадии васкуло- и ангиогенеза в плаценте, стимулируя рост эндотелиальных клеток, их выживание, пролиферацию, миграцию, формирование просвета капилляра (D'Amore P. et. al., 2007; Arroyo J.A. et. al., 2008; Burton G.J. et. al., 2009; de la Paz N. G. et. al., 2012). Известно, что белки VEGF и их рецепторы имеют специфичное распределение и выявляются в клетках Кащенко-Гофбауэра, в ангиобластах и эндотелиоцитах, цито- и синцитиотрофобласте. Некоторые работы приводят сведения о том, что в плаценте человека выявляется и VEGFR-3. Однако, до сих пор вопрос о том, в каких клетках локализован этот рецептор остается спорным. Его экспрессию отмечают либо в синцитиотрофобласте, либо в ангиобластах и эндотелиоцитах кровеносных сосудов, но предположения относительно его роли не высказываются ввиду отсутствия достаточного количества наблюдений (Helske S. et. al., 2001; Gu В. et. al., 2006; Груздев С.А., 2012). Данные о становлении микроциркуляторного русла плаценты в ранние

сроки (I триместр) беременности, относительно сроков начала и типа васкуляризации ворсин плаценты представлены фрагментарно, без морфофункциональных сопоставлений, поэтому представляется актуальным исследование процессов васкуло- и ангиогенеза в плаценте человека на протяжении всей физиологической беременности с использованием йммуногистохимических маркеров визуализации капилляров и методов их морфометрии.

Цель исследования - изучить динамику становления гемомикроциркуляторного русла ворсин плаценты человека с уточнением сроков в течение всей неосложненной беременности.

Задачи исследования

1. Выделить этапы васкулогенеза и ангиогенеза ворсин плаценты человека с уточнением гестационных сроков.

2. Визуализировать и изучить распределение в плаценте клеток (ангиобласты, эндотелиоциты) с использованием маркера С1334.

3. Оценить процентную долю ангиобластов и эндотелиоцитов в строме ворсин с помощью морфометрического метода.

4. Исследовать локализацию и динамику экспрессии рецептора УЕОРЯ-З в плаценте по триместрам беременности.

Научная новизна

Впервые обнаружены признаки аутохтонного васкулогенеза, протекающего одновременно и в стенке хориального мешка, и в ворсинах хориона, и в тканях эмбриона.

Впервые с помощью иммуногистохимического метода идентификации ангиобластов и эндотелиоцитов (СБ34 положительные клетки) проведена морфометрическая объективизация васкуляризации ворсин плаценты человека: выделено 7 этапов становления

микроциркуляторного русла: 1этап - 4-ая неделя, преобладает аутохтонный васкулогенез; 2 этап - 5-ая неделя, васкулогенез продолжается и начинается «ветвящийся» ангиогенез; 3 этап — 6-7-ая недели, «ветвящийся» ангиогенез продолжается, усложняется стенка центрально расположенных капилляров в строме опорных ворсин, 4 этап - 8-10-ая недели, выявляется «ветвящийся» и «неветвящийся» ангиогенез; 5 этап - 18-20-ая недели, преобладает «неветвящийся» ангиогенез во множестве боковых промежуточных ветвей; 6 этап - 25-28-ая недели, протекает только «неветвящийся» ангиогенез, начало формирования синцитиокапиллярных мембран; 7 этап - 39-40-ая недели, интенсивный «неветвящийся» ангиогенез, капилляры терминальных ворсин формируют синцитио-капиллярные мембраны.

Впервые изучена экспрессия рецептора васкулоэндотелиального фактора роста - УЕвРЯ-З в плаценте человека в течение всей физиологической беременности: показано, что он не экспрессируется в ангиобластах и эндотелии сосудов ворсин, но выявляется в цито- и синцитиотрофобласте. Установлено, что его экспрессия максимальна на 4-й неделе беременности, и она снижается к концу гестации.

Теоретическая и практическая значимость работы

Наиболее значимым показателем развития ворсин плаценты является степень их васкуляризации. Выделенные в работе этапы васкуляризации ворсин плаценты и особенности экспрессии рецептора УЕСРГ1-3 могут послужить основой при оценке состояния плаценты в патологии, в частности, полученные данные будут полезны для разработки новых методов диагностики и лечения плацентарной недостаточности.

Предложен новый взгляд на роль УЕСРЯ-З в плаценте. Рецептор рассматривается как противоапоптотический фактор, препятствующий апоптозу эпителия ворсин.

Внедрение в практику. Материалы исследования могут быть использованы в научных целях, при составлении руководств, чтении лекций и проведении занятий по гистологии и эмбриологии, патологической физиологии и анатомии, биохимии, акушерству и гинекологии в высших учебных заведениях биологического и медицинского профиля.

Результаты исследования внедрены в учебный процесс на кафедрах анатомии, патологической анатомии, гистологии, эмбриологии, цитологии ГБО ВПО МГМСУ имени А.И.Евдокимова Минздрава России.

Апробация работы

Результаты и положения диссертации доложены и обсуждены на научно-методическом заседании кафедры гистологии, эмбриологии, цитологии МГМСУ им. А.И. Евдокимова (Москва, 2009); научно-практической конференции «Научная организация деятельности анатомических кафедр в современных условиях» (Витебск, 2009); X Конгрессе Международной Ассоциации морфологов (Ярославль, 2010); IX Всероссийской университетской научно-практической конференции молодых ученых по медицине (Тула, 2010); III Эмбриологическом симпозиуме Всероссийского научного медицинского общества анатомов, гистологов, эмбриологов «Югра-Эмбрио-2011. Закономерности эмбрио-фетальных морфогенезов у человека и позвоночных животных» (Ханты-Мансийская государственная медицинская академия, 2011); совместном заседании кафедры гистологии, эмбриологии, цитологии ГБО ВПО МГМСУ имени А.И.Евдокимова и лаборатории ФГБУ «Научно-исследовательского института морфологии человека» РАМН (май, 2013).

Публикация материалов исследования

По материалам диссертации опубликовано 7 печатных работ, из них 2 статьи в журналах из списка ВАК РФ.

Структура и объем диссертации

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, глав, посвященных материалам и методам исследования, результатам исследования и их обсуждению, выводов и списка литературы. Материалы диссертации изложены на 127 страницах машинописного текста. Работа содержит 4 таблицы, иллюстрирована 30 рисунками. Список литературы содержит 187 источников литературы (17 отечественных и 170 иностранных авторов).

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материал и методы исследования

Исследовали биологический материал после медицинских абортов различного гестационного срока и срочных родов здоровых женщин в возрасте от 22 до 28 лет.

Характеристика материала. Самые ранние случаи - это лекарственные аборты после введения препарата «Мифегин» по желанию женщин. Целые хориальные мешки помещали в чашку Петри, заливали физиологическим раствором и прицельно выбирали фрагменты гладкого и ветвистого хориона. Наиболее частый материал 1 триместра - это медаборты путем вакуум-экстракции или выскабливания содержимого полости матки. После промывания соскоба водой выбирали пузырькообразные ворсины. Во 2 и 3 триместрах рождались целые плаценты, которые разрезали со стороны материнской поверхности на параллельные блоки, из них были взяты по 6 кусочков размером 1,0x0,5x0,5 см: 2 из центральной, 2 из парацентральной и 2 из краевой

зоны плаценты. Материал фиксировали 10% нейтральным формалином, проводили по спиртам восходящих концентраций и ксилолу, заливали в парафин. Срезы толщиной 5-6 мкм окрашивали гематоксилином и эозином.

Материал распределен по группам (табл. 1). Учитывали гинекологический анамнез женщин и результаты предварительного УЗИ с определением копчико-теменного размера (КТР) для уточнения срока I триместра беременности.

Таблица 1. Распределение материала по группам.

№ группы п Гестационный срок

I триместр

1 10 4 неделя

2 11 5 неделя

3 9 6 неделя

4 9 7 неделя

5 11 8 неделя

6 10 9-10 недели

II триместр

7 10 18-20 недели

8 9 25-28 недели

III триместр

9 10 39-40 недели

Иммуногистохимический метод. Целые хориальные мешки и кусочки плацент фиксировали 10% нейтральным формалином, подвергали стандартной процедуре проводки, заливки в парафин, делали срезы толщиной 5-6 мкм. После депарафинирования в ксилоле срезы регидратировали в спиртах снижающейся концентрации. Для подавления активности эндогенной пероксидазы срезы инкубировали в 3% перекиси водорода в течение 30 минут и промывали в фосфатном буфере. Затем проводили нагревание в цитратном буфере в течение 30 мин. при

температуре 94°С для демаскировки антигенов, охлаждали и промывали в фосфатном буфере (pH 7,6) два раза по 5 минут.

Для идентификации ангиобластов и эндотелиоцитов использовали мышиные моноклональные антитела к CD34 (клон QBEnd/10, «Novocastra») в разведении 1:100 в фосфатном буфере с добавлением 1% бычьего сывороточного альбумина, чтобы минимизировать

неспецифическую реактивность.

Рецептор VEGFR-3 выявляли с помощью мышиных моноклональных антител против VEGFR-3 (клон KLT9, «Novocastra») в разведении 1:200. Инкубацию с первичными антителами проводили при +4°С в течение 18-20 часов. Для визуализации использовали стрептавидин-биотиновую систему детекции Novolink («Novocastra»). Конечный продукт реакции выявляли с помошью 3,3'-диаминобензидина (DAB, Sigma Chemical Со), содержащего 0,01 % перекиси водорода, в течение-2-3 мин. Срезы докрашивали гематоксилином Майера.

Морфометрический метод. Препараты исследовали и фотодокументировали под световым микроскопом «Leica DM 2500» с использованием системы Leica Application Suite и цифровой фотокамеры высокого разрешения. По программе Adobe Photoshop CS3 Extended проводили морфометрию новых генераций ворсин в поперечном сечении, то есть, небольших, округлой или овальной формы, имеющих в строме ангиобласты и капилляры. Определяли площадь следующих компонентов: (рис.1) 1) по внутреннему контуру эпителия - площадь стромы (мкм2); 2) по иммуноэкспрессии CD34 - суммарную площадь ангиобластов и эндотелиоцитов без учета просветов капилляров (мкм2); 3) высчитывали долю ангиобластов и эндотелия по отношению к строме. В каждой группе изучено около 100 ворсин.

Рис. 1. Схема. Ворсины плаценты в поперечном срезе.

1 - внутренний контур эпителия;

2 - зоны иммуноэкспрессии СЭ34 (без учета площади просвета);

3 - строма ворсин.

Интенсивность иммунореактивности клеток цитотрофобласта и синцитиотрофобласта с антителами против УЕОРЯ-З была полуколичественно оценена в баллах с помощью шкалы цветов иммуноокрашивания (рис.2). Для оценки были отобраны по 5 случаев на срок, в каждом случае по 10 ворсин, использовано увеличение микроскопа 200.

Рис.2. Шкала цветов иммуноокрашивания для балльной оценки: 0 — окрашивание отсутствует; 1 — слабое; 2 - явное; 3 — интенсивное;

4 -максимальное иммуноокрашивание.

Электронномикроскопический метод. Выборочно по 4 наблюдения (с 7 нед. и далее) сразу после выскабливания или родов материал по стандартной схеме обрабатывали для электронной микроскопии: фиксировали в глутаровом альдегиде и заливали в эпон. Делали ультратонкие срезы толщиной 30-50 нм. Для контрастирования срезов применяли уранилацетат. Срезы просматривали в электронном микроскопе «1ет-100В».

Статистический анализ. Полученные цифровые данные были проверены на нормальность распределения при помощи критерия Колмогорова-Смирнова в программе ЗГайвПса 6,0. Количественные показатели площади стромы ворсин, ангиобластов и эндотелиоцитов обработаны параметрическими методами вариационной статистики,

сравнение групп проводили с помощью ^критерия Стьюдента. В сравниваемых группах определяли среднюю арифметическую величину (М) и стандартную ошибку (т). Показатели интенсивности иммуноокрашивания, доли ангиобластов и эндотелиоцитов в строме ворсин обработаны при помощи непараметрического метода, сравнение групп проводили с помощью и-критерия Манна-Уитни и вычисляли медиану и интерквартильный размах (Ме (Ь;Ц)). Различия считали значимыми при пороговом уровне значимости р < 0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Васкуло- и ангиогенез ворсин плаценты человека в течение I триместра физиологической беременности

Наибольший интерес в изучении васкуло- и ангиогенеза ворсин плаценты представляет I триместр беременности, ему в нашем исследовании отводится основное внимание. Сроки обозначены по дню оплодотворения (п.о.) и размерам (КТР) эмбриона. На основании наших наблюдений и морфометрических показателей в процессе развития сосудистого русла плаценты можно выделить этапы.

На 4-ой нед. беременности видны изолированные скопления и тяжи СОЪЛ положительных ангиобластических клеток, расположенные равномерно и в центре, и по периферии стромы ворсин. Сосуды с просветом встречаются редко. В этот гестационный отрезок происходит преимущественно васкулогенез. Доля ангиобластов и эндотелиоцитов в строме ворсин — 0,10 (0,07;0,11) (рис. 3). Эти данные соответствуют первому этапу становления сосудистого русла ворсин плаценты. Мы располагали целыми хориальными мешками или их фрагментами и отметили важную, ранее не описанную, особенность - васкулогенез наблюдается в одинаковой мере в стенке хориального мешка, во всех окружающих ворсинах и в тканях эмбриона, что свидетельствует об

аутохтонном примерно одовременном возникновении ангиобластов из мезенхимных клеток.

1 2 3 4 5 6

недели

Рис. 3. Динамика изменений соотношения площади ангиобластов и эндотелиоцитов к площади стромы ворсин плаценты в I триместре физиологической беременности (Ме (Ь;Щ).

Известно, что на 5-ой нед. из равномерно рассеянных по окружности хориального мешка ворсин формируются гладкий хорион и ранняя плацента (ВетгесИке К. е!а1., 1995). Васкулогенез в гладком хорионе прекращается, а в области ворсинчатого хориона появляются соединительные ветви и боковые выросты из предсуществующих капилляров, формируется капиллярная сеть, то есть, васкулогенез переходит в ангиогенез. Капилляры с просветом встречаются чаще, чем в предыдущем сроке. Площадь ангиобластов и эндотелиоцитов увеличилась почти в два раза, но при этом их доля в строме увеличилась немного и составляет 0,11 (0,10;0,14), р=0,0273 (рис.3), так как показатель площади стромы ворсин тоже стал больше, что свидетельствует о начале второго этапа васкуляризации ворсин плаценты. Аналогичные картины были видны в мезенхимальной строме ворсин, стенке хориального мешка, а также в тканях эмбриона.

На 6-ой нед. наблюдается капиллярная сеть, которая, главным образом, располагается по периферии опорных ворсин. В центре стромы капилляров меньше, они имеют широкие просветы. На 7-ой нед. усложняется структура стенок капилляров в центре стромы опорных ворсин, появляются первые гладкие миоциты, то есть, центрально расположенные сосуды опорных ворсин развиваются в сторону артериол и венул. В просвете сосудов видны эритробласты и типичные безъядерные эритроциты, образованные в печени эмбриона. Показатель доли эндотелиоцитов и ангиобластов в строме промежуточных ворсин оказался максимальным в I триместре - 0,18 (0,12;0,25), р= 0,0463 (рис.3). Эти изменения характеризуют третий этап васкуляризации ворсин, который совпадает с важным событием - гемодинамической связи сосудистой сети ворсин с хорионом, пуповиной и эмбрионом (Меекиш .Г.Ш. е!а1., 1997). Ворсины растут в длину и дифференцируются на опорные и боковые, количество боковых ветвей увеличивается.

Иммуноэкспрессия рецептора УБОРЫ-3 выявлена с 4 по 6-ую нед. в цито- и синцитиотрофобласте, в свободных симпластах, с наиболее интенсивным иммуноокрашиванием на 4-ой нед. (4 (4;4) балла), но оно отсутствует в ангиобластах и эндотелиоцитах. С 7-ой нед. до конца беременности в цитотрофобласте экспрессия рецептора не выявлена. Оценка экспрессии рецептора в синцитиотрофобласте на 7-ой нед. - 3 (3;3) балла (табл.2).

Следующий - четвертый этап: в это время первая волна инвазии цитотрофобласта достигает максимума, гестационная перестройка стенки спиральных артерий обеспечивает постоянный приток артериальной крови в межворсинчатое пространство (Милованов А.П., Кириченко А.К., 2009), и в плаценте выявляются все основные компоненты. На 8-ой нед. многие капилляры в боковых промежуточных ворсинах расположены близко к эпителию.

Таблица 2. Иммуноэкспрессия рецептора УЕОРЯ-З в цито- и синцитиотрофобласте ворсин плаценты человека в течение физиологической беременности.

Гестационный срок (недели)

4 5 6 7 8 9 18-20 25-28 39-40

Баллы Ме (L;U)

4 (4;4) 4ГЗ;4) 3 (3;4)_ 3 (3;3) 3 (2;3) 2 (2;3) 2 (2;2) 2 (2;2)J 1 (1;2)

Статистическая значимость Р

0,18 0,035 0,008 0,003 0,17 0,005 0,31 0,0049

На 9-10-ой нед. опорные ворсины уже различаются на первый и второй уровни ветвления, с множеством боковых промежуточных ветвей. В одних опорных ворсинах в центре стромы располагаются 2-3 крупных сосуда, которые пока невозможно дифференцировать на артериолы и венулы, в других - в центре стромы различимые артериола и венула. Многие периферические капилляры этих ворсин имеют узкие просветы и располагаются достаточно близко к эпителию ворсин. Доля эндотелиоцитов промежуточных ворсин уменьшилась до 0,14 (0,12;0,19), р=0,86 (рис.3). Это объясняется увеличением площади стромы исследуемых ворсин и расширением просвета капилляров, при небольшом приросте площади эндотелиоцитов (табл. 3).

Интенсивность иммуноокрашивания УЕвРЯ-З в

синцитиотрофобласте в сравнение с предыдущим этапом снижается и с 8 нед. наблюдается преимущественно в апикальной части. Оценка экспрессии в баллах на 9-10-ой нед. - 2 (2;3) (табл. 2).

Таким образом, в I триместре выделены 4 этапа васкуляризации ворсин плаценты: 1 - преобладает аутохтонный васкулогенез; 2 -васкулогенез продолжается и начинается «ветвящийся» ангиогенез; 3 - «ветвящийся» ангиогенез продолжается, усложняется стенка

Таблица 3. Морфометрические показатели ворсин плацент в I триместре физиологической беременности М±т (мкм2).

Срок (недели) п Площадь стромы ворсин Площадь ангиобластов и эндотелиоцитов

4 93 8287,41±593,27 784,16±53,31

р=0,0001 р=0,001

5 95 11931,31±433,091 1545,31±235,94

р=0,024 р=0,12

6 99 12895,80±689,379 1925,99±110,352

р=0,85 р=0,027

7 95 13167,71±823,584 2374,7±161,186

р=0,0007 р=0,76

8 97 16959,90±780,124 2430,55±189,377

р=0,11 р=0,78

9-10 98 18797,16±837,175 2496,20± 122,884

центрально расположенных капилляров в строме опорных ворсин; 4 -протекает «ветвящийся» и «неветвящийся» ангиогенез, сосуды, расположенные в центре стромы опорных ворсин, транспортируют питательные вещества и газы к эмбриону и плоду; субэпителиальные капилляры имеются в ворсинах всех уровней, их просветы пока узкие, они используются для более эффективного обмена. Формируется плацентарно-эмбриональный кровоток, что подтверждается присутствием типичных эритроцитов в просвете капилляров. В конце триместра микроциркуляторное русло плаценты подготовлено к интенсивному гемохориальному типу обмена.

Особенности васкуляризации ворсин плаценты человека во II и III триместрах.

Сроки обозначены по первому дню последней менструации (п.м.)

На 18 нед. достигает максимума вторая волна инвазии цитотрофобласта (Милованов А.П., Кириченко А.К., 2009). В структурном отношении

плацента готова обеспечить быстрый прирост массы плода. Опорные ворсины можно разделить на три уровня: 1 — самые крупные ворсины, отходящие от хориальной пластины, содержат одну артериолу и тонкостенную венулу. В ворсинах 2-3-его уровня сосуды трудно дифференцировать на артериолы и венулы из-за тонкого строения их стенок. Периферические сосуды под эпителием остаются капиллярами, либо сосудами очень мелкого калибра, которые невозможно различить, артериолы это или венулы. Они составляют так называемое парасосудистое русло. Формируется множество боковых промежуточных ветвей ворсин. На больших увеличениях четко видно, как в мелкие боковые ответвления проникают петли капилляров. Все капилляры в этих ворсинах имеют умерено расширенные просветы. Изолированные группы и тяжи ангиобластов не обнаружены. Морфометрия стромы и С034 положительных эндотелиоцитов, показала статистически значимые различия в сравнении с аналогичными показателями I триместра (р=0,001). Меньше стало среднее значение площади стромы ворсин, а площадь эндотелиоцитов уменьшилась незначительно (табл. 4). Доля эндотелиоцитов в строме ворсин 0,17 (0,14;0,22), р=0,045 (рис. 4).

Таблица 4. Морфометрические показатели ворсин плацент во II и III триместре физиологической беременности М±т (мкм2).

Срок (недели) п Площадь стромы ворсин Площадь эндотелиоцитов

18-20 94 11335,90±424,701 2081,08± 112,22

Р=0,12 р=0,025

25-28 97 9321,30±1258,487 1797,84±67,046

р=0,001 р=0,05

39-40 95 3294,05± 171,087 1625,85±69,946

Следовательно, по описанным выше изменениям можно выделить пятый этап становления сосудистого русла ворсин плаценты.

Иммуноэкспрессия VEGFR-3 (2 (2;2) балла) (табл. 2) сохраняется в апикальной области синцитиотрофобласта и свободных симпластах.

25-28-ая нед. физиологической беременности соответствуют шестому этапу, так как формируются первые генерации терминальных ворсин, продолжается интенсивное внедрение капиллярных петель в новообразованные терминальные ветви.

1,20 -------------------------------------- ------- -------------- -------- --------

недели

Рис. 4. Динамика изменений соотношения площади эндотелиоцитов к площади стромы ворсин плаценты во II и III триместре физиологической беременности (Ме (L;U)).

В дистальных отделах ворсинчатого дерева преобладают опорные ветви третьего уровня, многочисленные промежуточные ветви, которые дают начало мелким терминальным ветвям. Во всех опорных ворсинах обнаруживаются различимые по строению стенки артериола и венула. Мелкие сосуды по периферии опорных ворсин выглядят аналогично предыдущему сроку. В промежуточных ветвях, на поперечных срезах определяется по 2-3 широких капилляра и 3-5 узких с преимущественным расположением на периферии стромы. Если промежуточная и терминальная ворсины срезаны в продольном

направлении, то видны, идущие в таком же направлении длинные капилляры. Морфометрическая оценка площади эндотелиоцитов по маркеру СОЭ4 показала слабую тенденцию к уменьшению площади эндотелиоцитов, при этом, гораздо меньше стало среднее значение площади стромы ворсин (табл. 4). Подобное соотношение объясняет рост доли площади эндотелия к строме ворсин - 0,21 (0,17;0,22), р=0,29 (рис 4).

Выраженность иммуноэкспрессии рецептора УЕОРЯ-З аналогична предыдущему этапу - 2 (2;2) балла (табл. 2), сохраняется в апикальной части синцитиотрофобласта.

Седьмой, завершающий этап - 39-40-ая нед. В микропрепаратах преобладающим типом являются самые мелкие терминальные ворсины, в которых капилляры занимают большую часть стромы. Большинство из них имеют достаточно широкий просвет и приближены к эпителию. Электронномикроскопически в этот период наблюдаются самые тонкие фрагменты гемато-плацентарного барьера: безъядерные участки эндотелия, общая базальная мембрана и синцитиотрофобласт. Формируется тонкий плацентарный барьер, максимально приспособленный для интенсивных транспортных процессов. Площадь эндотелиоцитов в капиллярной сети, в отличие от площади стромы ворсин уменьшилась незначительно по сравнению с предыдущими сроками второго триместра беременности (табл. 4). Подобные взаимоотношения площади стромы ворсин и площади эндотелиоцитов выразились в максимальной величине доли эндотелия к строме ворсин - 0,48 (0,39;0,57), р=0,0001 (рис. 4).

Таким образом, во II и III триместрах выделены 3 этапа васкуляризации ворсин плаценты: 5 - преобладает «неветвящийся» ангиогенез, в ворсинчатом дереве формируется множество боковых

промежуточных ветвей; 6 - протекает исключительно «неветвящийся» ангиогенез, начало формирования синцитиокапиллярных мембран; 7 -интенсивный «неветвящийся» ангиогенез со структурно-функциональными признаками максимальной транспортной способности плаценты.

Экспрессия VEGFR-3 в синцитиотрофобласте на 39-40 нед. слабая, не равномерная, и сам синцитиотрофобласт становится тоньше. Оценка иммуноэкспрессии рецептора VEGFR-3 - 1 (1;2) балла (табл. 2).

Анализ литературы позволяет объяснить, казалось бы, нетипичную локализацию VEGF в плаценте. Так, Asan Е. et.al. (1999 г.) на основании электронномикроскопического исследования ворсин плаценты на 12-14 нед. (п.м.) сделали вывод о том, что цитотрофобласт влияет на васкуляризацию, привлекая мезенхимные клетки к периферии ворсин, и стимулируя их дифференцировку в эндотелий за счет того, что клетки цитотрофобласта синтезируют VEGF. В литературе последних лет имеются сведения о том, что рецептор VEGFR-3 является маркером эндотелия лимфатических сосудов (Byrne A.M. et. al., 2005; Breen E.C. et. al., 2007; Otrock Z.K. et. al., 2007). Лимфатическая система поддерживает гомеостаз, играет роль в метастазировании опухолей и в иммунных реакциях. В плаценте она отсутствует. Обнаруженная нами локализация рецептора VEGFR-3 в плаценте человека совпадает с данными литературы о его экспрессии в цито- и синцитиотрофобласте (Helske S. et.al., 2001; Yan Zhou et.al., 2002; Kristy Red-Horse et.al., 2006). Yuping W. и Shuang Z. (2010) предполагают, что прямой контакт синцитиотрофобласта с материнской кровью заставляет его вести себя как эндотелий кровеносных сосудов.

Исследование динамики васкуляризации ворсин плаценты и экспрессии VEGFR-3 позволило нам выявить увеличение доли

эндотелиоцитов в строме ворсин и снижение интенсивности экспрессии VEGFR-3 в цито- и синцитиотрофобласте с 4 по 39-40 нед. физиологической беременности. Данные литературы о том, что VEGF-C локализуется также в синцитиотрофобласте, не исключают аутокринную роль VEGFR-3 (Ahmed A. et.al., 2001; Helske S. et.al., 2001; Gu В. et. al., 2006). Известно, что VEGFR-3 и его лиганд VEGF-C выявляются в опухолях (Thornton A.D. et. al., 2006). VEGFR-3 обеспечивает выживание опухолевых клеток человека (Stewart J.E. et. al, 2013). Интересен подход Yan Zhou et. al. (2002) к развитию плаценты человека, авторы считают, что оно объединяет элементы онкогенеза и васкулогенеза. В дополнение к общей способности к инвазии через нормальные ткани, и раковые клетки и клетки развивающейся плаценты создают микроокружающую среду, способствующую и иммунологической толерантности и ангиогенезу (Shernan G. Holtan et. al, 2009).

Известно, что с увеличением сроков физиологической беременности отмечается нарастание апоптозных изменений в плаценте. Апоптозный каскад, препятствует слиянию клеток в синцитий (Ishihara N. et. al., 2002). Включению этого каскада противодействуют белковые продукты генов-ингибиторов апоптоза (Petras A.M. et. al., 2004). По нашему мнению, выявленные нами особенности иммуноэкспрессии VEGFR-3 в течение неосложненной беременности могут быть связаны со способностью данного рецептора препятствовать апоптозу эпителия ворсин.

Таким образом, трофобластический эпителий - это особый вид эпителия, который сочетает в себе фенотипические особенности эндотелия лимфатических и кровеносных сосудов, поэтому экспрессия рецептора VEGFR-3 вполне закономерна. Возможно, что VEGFR-3 способствует выживанию цито- и синцитиотрофобласта, создает микроокружение, необходимое для благоприятных взаимоотношений в системе мать-плацента-зародыш, эмбрион, плод.

выводы

1. С помощью маркера ангиобластов и эндотелиоцитов CD34 и на основании морфометрических данных, выделено 7 этапов становления микроциркуляторного русла в ворсинах плаценты человека в течение физиологической беременности.

2. На 4-ой неделе физиологической беременности происходит одновременный, аутохтонный васкулогенез в ворсинах плаценты, в стенке хориального мешка, и в тканях эмбриона, о чем свидетельствует наличие аналогичных картин в виде изолированных скоплений и тяжей ангиобластов.

3. I триместр неосложненной беременности включает 4 этапа васкуляризации ворсин плаценты, в течение которых вначале доминирует васкулогенез, с 5-ой недели начинается ветвящийся ангиогенез, интенсивность которого усиливается по 7-ую неделю, что подтверждается увеличением доли ангиобластов и эндотелиоцитов от 0,10 (0,07;0,11) - на 4-ой неделе, до 0,18 (0,12;0,25) - на 7-ой неделе.

4. С 8-ой недели за счет снижения интенсивности ветвящегося ангиогенеза, и незначительного увеличения площади эндотелиоцитов, а также при значительном увеличении площади стромы ворсин, доля ангиобластов и эндотелиоцитов составляет лишь 0,17 (0,11;0,19).

5. Во II и III триместрах физиологической беременности изолированные группы и тяжи ангиобластов не обнаружены, следовательно, динамика васкуляризации ворсин плаценты происходит только за счет ангиогенеза.

6. На 18-ой неделе площадь стромы ворсин значительно уменьшается, а площадь эндотелиоцитов, в сравнение с I триместром практически не изменяется, и поэтому доля эндотелиоцитов составляет

0,17 (0,14;0,22), что свидетельствует о преобладании процесса неветвящегося ангиогенеза.

7. Среднее значение площади эндотелиоцитов на 39-40 неделях физиологической беременности 1625,85±69,946 мкм2, что меньше чем на 25-28-ой неделях, при этом доля этих клеток в строме имеет максимальное значение, что связано с самым низким средним значением площади стромы ворсин, увеличением просветов капилляров, и неветвящимся ангиогенезом.

8. В эндотелии сосудов ворсин плаценты экспрессия VEGFR-3 не выявлена, но определяется в цито- и синцитиотрофобласте. Интенсивность иммуноокрашивания с течением беременности постепенно снижается от 4 (4;4) баллов на 4-ой неделе, до 1 (1;2) балла на 39-40 неделях.

Список работ, опубликованных по материалам диссертации

1. А.П. Милованов, Л.М. Ерофеева, И.А. Золотухина,

Н.В. Александрович. Морфогенез плаценты человека в 1 триместре беременности. // Морфология, С-Пб.: «Эскулап», 2011. - Т. 139, № 2. -С. 72-76.

2. Александрович Н.В., Ерофеева Л.М. Сосудистый эндотелиальный фактор роста (VEGF) в васкуло- и ангиогенезе ворсин плаценты в течение первого триместра физиологической беременности. Материалы III Эмбриологического симпозиума. Ханты-Мансийск. // Морфология, СПб.: «Эскулап», 2011. - Т. 140, № 5. - С. 33.

3. А.П.Милованов, Л.М.Ерофеева, Н.В.Александрович, И.А.Золотухина. Морфология плаценты человека во II и III триместрах беременности. // Морфология, С-Пб.: "Эскулап", 2012. -

Т. 142, №5. - С. 64-67.

4. Александрович Н.В., Золотухина И.А. Морфофункциональная характеристика ворсин плаценты в разные сроки неосложненной беременности. Материалы научной конференции «Научная организация деятельности анатомических кафедр в современных условиях». Витебск:, 2009.-С. 146-147.

5. Александрович Н.В., Золотухина И.А. Ранние сроки развития плаценты человека. Материалы докладов X Конгресса Международной Ассоциации морфологов. Ярославль. //Морфология, С-Пб.: «Эскулап», 2010. - Т. 137, №4. - С. 14-15.

6. Александрович Н.В., Милованов А.П. Васкуло- и ангиогенез ворсин хориального мешка в течение первого триместра физиологической беременности. Материалы научной конференции «Актуальные вопросы морфогенеза в норме и патологии - М.: МДВ, 2010. - 224с.

7. Александрович Н.В., Золотухина И.А. Морфогенез ворсин плаценты в течение физиологической беременности. Вестник новых медицинских технологий (приложение к журналу). Материалы докладов IX Всероссийской университетской научно-практической конференции молодых ученых по медицине, Тула: 2010. - T.XVII, № 2. - С.7-8.

Отпечатано в РИО МГМСУ 127473, г. Москва, ул. Делегатская, д. 20, стр. 1. Заказ №805. Тираж 100 экз.

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Александрович, Наталья Викторовна, Москва

Министерство здравоохранения Российской Федерации Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ МЕДИКО-СТОМАТОЛОГИЧЕСКИЙ УНИВЕРСИТЕТ ИМЕНИ А.И. ЕВДОКИМОВА

ФГБУ «Научно-исследовательский институт морфологии» РАМН

04201361002 На правах рукописи

АЛЕКСАНДРОВИЧ НАТАЛЬЯ ВИКТОРОВНА

ДИНАМИКА ВАСКУЛЯРИЗАЦИИ ВОРСИН ПЛАЦЕНТЫ ЧЕЛОВЕКА В ТЕЧЕНИЕ ФИЗИОЛОГИЧЕСКОЙ БЕРЕМЕННОСТИ

03.03.04 - клеточная биология, цитология, гистология

ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор Л.М. Ерофеева

Научный консультант: доктор медицинских наук, профессор, Заслуженный деятель науки РФ А.П. Милованов

Москва, 2013

ОГЛАВЛЕНИЕ

Перечень применяемых сокращений 2

Введение 3-8

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Общие принципы васкулогенеза и ангиогенеза 9-14

1.2. Васкулогенез и ангиогенез ворсин плаценты человека

в течение физиологической беременности 15-28

1.3. Васкуло-эндотелиальный фактор роста (УЕвР) как регулятор васкулогенеза и ангиогенеза в ворсинах плаценты 29-64

1.4. Васкулогенез и ангиогенез в течение осложненной беременности 36-37 Глава 2. МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ 38-42 Глава 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

3. 1. Васкулогенез и ангиогенез ворсин плаценты человека в течение первого триместра 43-70

3.2. Особенности васкуляризации ворсин плаценты во втором и третьем триместрах 71 -90

Глава 4. ОБСУЖДЕНИЕ ПОЛУЧЕННЫХ РЕЗУЛЬТАТОВ 91 -105 Выводы 106-107

Список литературы 108-129

Список сокращений

ХМ - хориальный мешок ТВ - терминальная ворсина ПВ - промежуточная ворсина ЭК - эндотелиальная клетка БМ - базальная мембрана ЦТ - цитотрофобласт СТ - синцитиотрофобласт СС - свободный симпласт СП - синцитиальная почка ЩК - щеточная кайма П - перицит К - капилляр КО - клеточный островок А - артериола В -венула

П.о. - после оплодотворения

П.м. - постменструальный срок

УЕвР - васкулоэндотелиальный фактор роста

Введение

Актуальность исследования

Развитие органов обязательно сопровождается врастанием (или

образованием) сосудов. Деятельность любого органа невозможна без

адекватной доставки питательных веществ и своевременного удаления

продуктов обмена, чем, в основном и занимается кровеносная система. В

последние годы проблема образования сосудов выдвинулась в ряд самых

актуальных в биологии и патологии человека [28, 32, 37, 39, 40, 100]. Опираясь

на базовые данные W. Risau et al. (1988) о разграничении процессов васкуло- и

ангиогенеза в тканях эмбриона [153], этой важной проблеме посвящено

большое количество морфологических исследований и обзоров [45, 111, 125,

135, 139, 183]. Васкуло- и ангиогенез - ключевые проблемы в эмбриогенезе,

развитии органов и опухолевом росте. Удобным объектом для изучения

появления первых капилляров и формирования их сети является развитие

ворсин хориона, поскольку на их примере легко прослеживаются самые ранние

стадии васкулогенеза. Вероятно, поэтому плацента уже давно является

объектом для изучения, вначале традиционным гистологическим методом [30,

62], затем электронномикроскопическим [57, 104, 110, 113], а также

современными иммуногистохимическими методами [185]. Многие авторы,

занимающиеся изучением акушерской патологии, все больше внимания

уделяют исследованию особенностей васкулогенеза и ангиогенеза плаценты,

как основы успешного развития беременности [2,16, 25, 79, 87, 140]. Известно,

что первые ангиобласты в строме ворсин появляются на 20-21 сутки после

оплодотворения [43]. Имеются сведения о формировании тяжей ангиобластов,

затем небольших, потом увеличивающихся просветов первичных капилляров

[26, 58]. По определению Kaufmann Р. et al. (2004), в течение физиологической

беременности происходят два типа ангиогенеза: с ветвлением сосудов -

3

«ветвящийся», и с удлинением сосудов - «неветвящийся» [107], однако нет единого мнения о сроках их возникновения. Кроме того, точно не установлено, когда заканчивается васкулогенез и заканчивается ли вообще, когда начинается ангиогенез, и какой из двух процессов преобладает на разных сроках физиологической беременности. Кровеносные сосуды во всех уровнях ворсин плаценты человека не описаны, нет данных о стадийности их формирования и преобразований. Мало работ, где приведены данные с использованием иммуноморфологического маркера СОЭ4 для лучшей визуализации ангиобластов и эндотелиоцитов в строме ворсин плаценты человека [88, 177]. Только в отдельных исследованиях предпринимается попытка морфометрической объективизации процессов васкуло- и ангиогенеза плаценты [178].

Признанным стимулятором роста эндотелия капилляров является

семейство УЕСР, включающее формы: УЕСР-А, УЕвР-В, УЕвР-С, УЕвР-Б,

УЕвР-Е и РЮР. Сигнальная деятельность УЕСР относительно клетки зависит

от наличия у нее определенных мембранных рецепторов (УЕСР11-1, УЕСРК-2,

УЕСРЯ-З). В большинстве работ, посвященных изучению плаценты,

охарактеризован УЕСР-А и его рецепторы 1 и 2 типа, так как первоначально

рецептор 3 типа (УЕСРЯ-З) описан как маркер эндотелия лимфатических

сосудов [17, 18, 128]. В современной литературе сообщается, что члены

семейства контролируют все стадии васкуло- и ангиогенеза в плаценте,

стимулируя рост эндотелиальных клеток, их выживание, пролиферацию,

миграцию, формирование просвета капилляра [25, 36, 53, 55]. Известно, что

белки УЕСР и их рецепторы имеют специфичное распределение и выявляются

в клетках Кащенко-Гофбауэра, в ангиобластах и эндотелиоцитах, цито- и

синцитиотрофобласте. Некоторые работы приводят сведения о том, что в

плаценте человека выявляется и УЕСРЯ-З. Однако, до сих пор вопрос о том, в

4

каких клетках локализован этот рецептор остается спорным. Его экспрессию отмечают либо в синцитиотрофобласте, либо в ангиобластах и эндотелиоцитах кровеносных сосудов, но предположения относительно его роли не высказываются ввиду отсутствия достаточного количества наблюдений [3, 82, 86].

Данные о становлении микроциркуляторного русла плаценты представлены фрагментарно, с использованием разных подходов к определению гестационного срока, без морфофункциональных сопоставлений, поэтому представляется актуальным исследование процессов васкуло- и ангиогенеза в плаценте человека на протяжении всей физиологической беременности с использованием иммуногистохимических маркеров визуализации капилляров и методов их морфометрии.

Отмеченные выше положения послужили основанием для формулирования цели и задач данной работы.

Цель исследования - изучить динамику становления гемомикроциркуляторного русла ворсин плаценты человека с уточнением сроков в течение всей неосложненной беременности.

Задачи исследования

1. Выделить этапы васкулогенеза и ангиогенеза ворсин плаценты человека с уточнением гестационных сроков.

2. Визуализировать и изучить распределение в плаценте клеток (ангиобласты, эндотелиоциты) с использованием маркера СБ34.

3. Оценить долю ангиобластов и эндотелиоцитов в строме ворсин с помощью морфометрического метода.

4. Исследовать локализацию и динамику экспрессии рецептора УЕОБЯ-З в

плаценте по триместрам беременности.

5

Научная новизна

Впервые обнаружены признаки аутохтонного васкулогенеза, протекающего одновременно и в стенке хориального мешка, и в ворсинах хориона, и в тканях эмбриона.

Впервые с помощью иммуногистохимического метода идентификации ангиобластов и эндотелиоцитов (СБ34 положительные клетки) проведена морфометрическая объективизация васкуляризации ворсин плаценты человека: выделено 7 этапов становления микроциркуляторного русла: 1этап - 4-ая неделя, преобладает аутохтонный васкулогенез; 2 этап - 5-ая неделя, васкулогенез продолжается и начинается ветвящийся ангиогенез; 3 этап - 6-7-ая недели, ветвящийся ангиогенез продолжается, усложняется стенка центрально расположенных капилляров в строме опорных ворсин, 4 этап - 8-10-ая недели, выявляется ветвящийся и неветвящийся ангиогенез; 5 этап - 18-20-ая недели, преобладает неветвящийся ангиогенез во множестве боковых промежуточных ветвей; 6 этап - 25-28-ая недели, протекает только неветвящийся ангиогенез, начало формирования синцитиокапиллярных мембран; 7 этап - 39-40-ая недели, интенсивный неветвящийся ангиогенез, капилляры терминальных ворсин формируют синцитио-капиллярные мембраны.

Впервые изучена экспрессия рецептора васкулоэндотелиального фактора роста - УЕвРЯ-З в плаценте человека в течение всей физиологической беременности: показано, что он не экспрессируется в ангиобластах и эндотелии сосудов ворсин, но выявляется в цито- и синцитиотрофобласте. Установлено, что его экспрессия максимальна на 4-й неделе беременности и снижается к концу гестации.

Научно-практическая значимость

Наиболее значимым показателем развития ворсин плаценты является

6

степень их васкуляризации. Выделенные в работе этапы васкуляризации ворсин плаценты и особенности экспрессии рецептора васкулоэндотелиального фактора роста 3 типа могут послужить основой при оценке состояния плаценты в патологии, в частности, полученные данные будут полезны для разработки новых методов диагностики и лечения плацентарной недостаточности.

Предложен новый взгляд на роль УЕОРИ-З в плаценте. Рецептор рассматривается как противоапоптотический фактор, препятствующий апоптозу эпителия ворсин.

Материалы исследования могут быть использованы в научных целях, при составлении руководств, чтении лекций и проведении занятий по гистологии и эмбриологии, патологической физиологии и анатомии, биохимии, акушерству и гинекологии в высших учебных заведениях биологического и медицинского профиля.

Результаты исследования внедрены в учебный процесс на кафедрах анатомии, патологической анатомии, гистологии, эмбриологии, цитологии ГБО ВПО МГМСУ имени А.И. Евдокимова Минздрава России.

Апробация результатов

Результаты и положения диссертации доложены и обсуждены на: Научно-методическом заседании кафедры гистологии, эмбриологии, цитологии МГМСУ им. А.И. Евдокимова (Москва, 2009); Научно-практической конференции «Научная организация деятельности анатомических кафедр в современных условиях» (Витебск, 2009); X Конгрессе Международной Ассоциации морфологов (Ярославль, 2010); IX Всероссийской университетской научно-практической конференции молодых ученых по медицине (Тула, 2010); III Эмбриологическом симпозиуме Всероссийского научного медицинского

общества анатомов, гистологов, эмбриологов «Югра-Эмбрио-2011.

7

Закономерности эмбрио-фетальных морфогенезов у человека и позвоночных животных» (Ханты-Мансийская государственная медицинская академия, 2011); совместном заседании кафедры гистологии, эмбриологии, цитологии ГБО ВПО МГМСУ имени А.И. Евдокимова и лаборатории ФГБУ «Научно-исследовательского института морфологии человека» РАМН (май, 2013).

Публикации

По материалам диссертации опубликовано 7 печатных работ, из них 3 в журналах из списка ВАК РФ.

Объем и структура диссертации

Диссертация построена по традиционному плану и состоит из введения, обзора литературы, главы, посвященной материалам и методам исследования, результатов исследования и их обсуждения, выводов и списка литературы. Материалы диссертации изложены на 129 страницах машинописного текста. Работа содержит 4 таблицы, иллюстрирована 30 рисунками, в том числе гистологическими и электронными микрофотографиями. Список литературы содержит 187 источников литературы (15 отечественных и 172 иностранных авторов).

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Общие принципы васкулогенеза и ангиогенеза

Процессы образования сосудов во взрослом организме и в эмбриональном периоде изучают уже давно [3, 61, 95, 98, 137]. В настоящее время эта проблема в ряду самых актуальных в биологии и патологии человека [32, 37, 38, 88, 143,166]. Подробную литературную справку, относящуюся к истории изучения капилляров в эмбриональном и плодном периоде можно найти в монографиях И.И.Бобрика с соавторами [1] и В.В. Куприянова с соавторами [9-11].

Принято выделять два основных механизма: васкулогенез и ангиогенез,

которые имеют между собой определенные различия в механизмах

формирования капиллярной стенки [105, 155]. Существует некоторая

неопределенность в использовании этих двух терминов. Традиционно под

термином «васкулогенез» понимают первичное образование сосудов в ходе

эмбрионального развития (что вполне справедливо, поскольку только в этот

период капилляры возникают de novo) посредством дифференцировки

мезенхимальных клеток в сторону ангиобластов [153, 154]. Однако, в

эмбриогенезе механизм новообразования сосудов не ограничивается только

васкулогенезом. Полагают, что после того, как образовался эндотелий,

формирование новых капилляров идет уже путем роста их из существующих

сосудистых структур, «сосудов из сосудов», «эндотелия из эндотелия». Этот

процесс на этапах гисто- и органогенеза, так и после рождения принято

обозначать, как «ангиогенез». Достаточно часто в качестве синонима термина

«васкулогенез» используют понятие «первичный ангиогенез». Он подчеркивает

особенности образования сосудов de novo, в той ситуации (ранний

эмбриогенез), когда сосудов еще вообще нет. Во всех остальных случаях речь

идет о вторичном ангиогенезе - развитии сосудов из сосудов. Эта парадигма

считается почти абсолютной во всех случаях, когда не анализируется

9

эмбриональное развитие. Дальнейшее подразделение может быть связано с периодом развития (эмбриональный, фетальный, постнатальный), с нормальным или патологическим состоянием (физиологический и патологический ангиогенез), с конкретной ситуацией (регенерационный, воспалительный, естественный, опухолевый и т.д.). Классификация, которая предлагается в монографии В.В. Куприянова с соавторами [11], просто обозначает ситуацию или состояние, но не определяет в деталях механизмы формирования сосуда. Широкое распространение получил термин «опухолевый ангиогенез» [72, 74], выделение которого вполне оправдано не только особенностями новообразования микрососудов в опухолях (особенно злокачественных), ной клиническим значением их исследования [169].

Эндотелиальные клетки (ЭК) являются центральной клеточной организующей единицей (unit) в сосудистых структурах. Они играют определенную роль в сосудистой интеграции, регуляции тромботического статуса, транспорта и барьерной функции. В эмбриональной жизни ЭК являются примитивными предшественниками, которые формируют сосудистую сеть. Эти процессы чрезвычайно важны для органогенеза, и особо тщательно изучены у куриных и мышиных эмбрионов. Вместе с тем, сосудистые ЭК обладают регулирующими локальными факторами, которые важны и в эмбриогенезе и во взрослом организме. Здесь определенную роль играют кислород и VEGFA [22, 86, 95, 102].

У взрослого человека в нормальных условиях жизненный цикл

эндотелиальных клеток очень продолжителен: длительность G1 фазы может

занимать годы и митотический индекс не превышает 0,3 %о [85]. Деление ЭК

необходимо, в основном, для физиологической репарации эндотелиального

пласта и очень умеренной перестройки капиллярного ложа, которая происходит

постоянно по мере изменения местных условий (физическая нагрузка,

10

изменения гемодинамики и т.д.). Любой сосуд, как бы он не назывался и какую бы функцию не выполнял, закладывается или развивается вначале как сосуд капиллярного типа [1, 8]. В этом смысле понимание терминов «новообразование сосудов» или «новообразование капилляров» синонимично.

Результатом исследования роста микрососудов в тканях при самых различных состояниях и патологических ситуациях in vivo и in vitro являются представления о стадийности процессов, участвующих в ангиогенезе [28, 29, 38]. Основой процесса ангиогенеза во взрослом организме является развитие микрососудов с помощью образования выростов или «почек» роста [88, 95, 158]. В.В. Куприянов [11] выделяет следующие этапы образования новых сосудистых сетей: почкование, анастомозирование, дифференциация, специализация. Вначале, в ответ на ангиогенную стимуляцию, в капиллярах появляются отросчатые эндотелиоциты, формирующие сосудистые зачатки, которые по мере своего развития продвигаются в направлении индуктора роста. Усиленное размножение эндотелиоцитов приводит к образованию почки роста из тяжа ЭК, а поскольку этот процесс повторяется многократно, возникают ветвящиеся структуры, которые с течением времени канализируются и приобретают вид самостоятельных сосудов [78]. Сосудистые зачатки появляются преимущественно в тех участках микрососудов, которые не содержат перицитов. Сосудистые почки роста чаще всего образуются на выпуклой части капилляров или на вершине капиллярной петли, ближе к венозному сегменту [8]. Сначала отпочковывающийся зачаток растет в направлении, перпендикулярном материнскому сосуду. В дальнейшем направление е