Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Биохимический анализ гиалуронидазного взаимодействия с эндотелиальным гликокаликсом при нарушениях микроциркуляции

ВАК РФ 03.01.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Биохимический анализ гиалуронидазного взаимодействия с эндотелиальным гликокаликсом при нарушениях микроциркуляции"

На правах рукописи

005006225

ТУРАШЕБ АСКАР ДАМИРОВИЧ

БИОХИМИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ ГИАЛУРОНИДАЗНОГО ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ С ЭНДОТЕЛИАЛЬНЫМ ГЛИКОКАЛИКСОМ ПРИ НАРУШЕНИЯХ МИКРОЦИРКУЛЯЦИИ

03.01.04-биохимия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

1 5 ЛЕК 2011

Москва-2011 год

005006225

Работа выполнена в лаборатории биохимической инженерии НИИ экспериментальной кардиологии ФГБУ «Российский кардиологический научно-производственный комплекс» МЗ и СР РФ

Научный руководитель:

доктор биологических наук, профессор Максименко Александр Васильевич

Официальные оппоненты:

Ведущая организация:

ГУРАН Институт биохимии им. А.Н. Баха РАН

Защита состоится 25 января 2012 г. в 1330 часов на заседании диссертационного совета Д 208.073.01 по присуждению ученой степени кандидата биологических наук в ФГБУ «Российский кардиологический научно-производственный комплекс» МЗ и СР РФ (121552 Москва, ул. 3-я Черепковская, д. 15а)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБУ «РКНПК» МЗиСР РФ.

Автореферат разослан_« 6 » декабря_20 11 года

Ученый секретарь диссертационного

член-корреспондент РАН

доктор биологических наук, профессор,

Тоневицкий Александр Григорьевич

доктор биологических наук Писаренко Олег Иванович

совета, д.м.н., профессор

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы. Сердечно-сосудистые заболевания являются одной из ведущих причин инвалидности и смертности населения развитых стран мира. Необходимость совершенствования существующих и разработки новых средств их лечения требует изучения факторов риска, развития стратегий диагностики и профилактики, фармакологических и хирургических методов. Целью подобных разработок является, в частности, устранение последствий острого коронарного синдрома, представленного нестабильной стенокардией, острым инфарктом миокарда, внезапной сердечной смертью.

Острое критическое состояние может быть вызвано закупоркой коронарной артерии в результате ряда причин, что приводит к нарушению метаболизма миокарда, его сократимости, развитию некроза. Восстановление коронарного кровотока - реперфузия - за кратчайшие сроки с момента возникновения поражения позволяет сократить зону инфаркта, восстановить сократительную способность миокарда, снизить возможность появления осложнений и наступления летального исхода. Современная реперфузионная терапия способна ограничивать размер инфаркта примерно на 50% у половины пациешш. В ряде случаев терапия не обеспечивает восстановления функции поврежденного миокарда из-за развития сопутствующих осложнений. При этом функциональное восстановление миокарда наблюдается только при достаточной реканализации инфаркт-связанной артерии и адекватном восстановлении системы микроциркуляции и тканевой перфузии зоны инфаркта.

Микроциркуляция представляет собой значительную долю системы кровообращения, реализующую доставку циркулирующей крови и обмен кислородом, нутриентами и метаболитами жизнедеятельности к клеткам органов и тканей организма. Нарушения функций этой системы могут быть вызваны рядом патологических процессов, в том числе и распространенным при остром коронарном синдроме явлением отсутствующего кровотока (no-reflow). Вклад в развитие no-reflow вносят функциональные и структурные изменения на уровне тканевой микроциркуляции, агрегация клеток крови, развитие воспалительных процессов, гиперпродукция активных форм кислорода, активация системы врожденного иммунитета при ишемии/реперфузии и микроэмболизация [Rezkalla S.H. and Kloner R.A., 2002]. Существующие на сегодняшний день представления о молекулярных и клеточных механизмах no-reflow, как и других нарушениях микроциркуляции, игнорируют роль одного из возможных участников этого процесса, люминального покрытия сосудистого эндотелия -эндотелиального гликокаликса (ЭГК). Эта комплексная и многокомпонентная структура принимает участие в ряде функций, поддерживающих метаболизм системы кровообращения [Pries A.R. et al., 2000]. В условиях патологии происходит полная или частичная потеря

гликокаликса, что приводит к нарушению целостности сосудистой стенки и изменению ее функций. Роль ЭГК при нарушениях микрониркуляции исследована мало и весьма неполно.

Группа гликозидазных ферментов (гиалуронидазы и гепарин/гепараназы) принимает участие в катаболизме компонентов ЭГК гликозаминогликанов (ГАГ), благодаря чему такие биокатализаторы становятся эффективным инструментом исследования функции гликокаликса в норме и патологии. Функционирование гликозидаз происходит в условиях сахаридного микроокруження (низкомолекулярные сахара кровотока; ГАГ гликокаликса и их фрагменты), регулирующего структуру и специфические активности ферментов. Поэтому исследование поведения гликозидазных ферментов в естественном микроокружении и разработка подходов к стабилизации их активностей являются обоснованными как для изучения функционирования гликокаликса в условиях модельной патологии, так и для разработки новых подходов лечения заболеваний, связанных с нарушением функционирования системы микроциркуляции.

Цели и задачи исследования. Целью нашего исследования стало доказательство участия эндотелиального гликокаликса и его структурных компонентов в развитии нарушений микроциркуляторного русла, что в ряде случаев определяет тяжесть развития сердечно-сосудистых поражений и усложняет проводимую терапию.

В соответствии с целью диссертационной работы были поставлены следующие задачи:

1. Изучить инактивирующее гликирование нативной (ГУ) и модифицированной хондроитинсульфатом (ГУ-ХС) гиалуронидазы сахаридными маркерами нарушения углеводного обмена (моно- и дисахариды кровотока) и модельными сахаридами продуктов деградации ЭГК (N-ацетилгексозамины);

2. Определить инактивирующее действие фрагментов гиалуронана общей формулы G1cA-(-G1cNHAc-<j1cA-)„-G1cNHAc (где п варьируется от 0 до 4) и их смеси на эндогликозидазную активность ГУ и ГУ-ХС;

3. Изучить действие производных ГУ на процесс восстановления микроциркуляции кожи на модели ишемии/реперфузии задней конечности крысы методом лазерной допплеровской флоуметрии (ЛДФ) при введении препаратов до ишемии и перед реперфузией;

4. Сравнить на модели ишемии/реперфузии задней конечности крысы действие белковых и гликозаминогликановых производных на восстановление микроциркуляции после ишемии/реперфузии при введении исследуемых соединений до ишемии и перед реперфузией.

Научная новизна. В работе впервые исследовано гликирующее действие углеводных производных различной природы (низкомолекулярных нейтральных моно- и дисахаридов

кровотока, N-ацетилгексозаминов как модельных компонентов продуктов деградации ЭГК и олигомеров ГАГ гиалуронана различной длины) на эндогликозидазную активность нативной ГУ и ее производного, оригинального ковалентного конъюгата ГУ-ХС. На основании полученных данных разработан специфичный ферментный тест для выявления присутствия продуктов деградации ЭГК, возникающих при ишемии/реперфузии.

На модели ишемии задней конечности крысы изучено влияние полученных ферментных производных на характер восстановления постышемической кожной микроциркуляции с помощью метода лазерной допплеровской флоуметрии при превентивном (до ишемии) и остром (перед реперфузией) введении исследуемых препаратов. Получены экспериментальные данные об участии гликокаликса в нарушениях микроциркуляции после ишемии/реперфузии, подтверждено значение стабильной гиалуронидазной активности для скорейшего восстановления микроциркуляции и антиишемическое действие свободного хондроитинсульфата и его смеси с нативной гиалуронидазой.

Практическая значимость работы. Полученные данные демонстрируют участие поверхностной структуры сосудистого эндотелия - ЭГК - в развитии патологических нарушений микрососудистой циркуляции, в частности, при регионарном ишемическом воздействии с последующей реперфузией. Изучение подобных патологических процессов и разработка способов их коррекции представляет значимый научно-практический интерес для разработки терапевтических подходов по лечению заболеваний, связанных с нарушениями микроциркуляции.

Апробация работы. Основные результаты диссертационной работы были представлены на следующих конференциях: XII Международной научно-практической конференции «Наукоемкие химические технологии» (Россия, Волгоград, 2008); XIII International biotechnology symposium and exhibition (КНР, Далянь, 2008); Всероссийская конференция с международным участием «Тромбозы, кровоточивость, ДВС-синдром: современные подходы к диагностике и лечению» (Россия, Москва, 2008 и 2010); IV и V Всероссийские конференции по клинической гемостазиологии и гемореологии в сердечнососудистой хирургии с международным участием (Россия, Москва, 2009 и 2011); VII и VIII международные конференции "Системное кровообращение, микроциркуляция и гемореология (от ангиогенеза до центрального кровообращения)" (Россия, Ярославль, 2009 и 2011). Апробация диссертационной работы была проведена на межлабораторном семинаре НИИ экспериментальной кардиологии ФГБУ РКНПК МЗиСР РФ 16 июня 2011 г.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 17 работ: 9 статей и 8 тезисов докладов конференций.

Структура и объем работы. Диссертационная работа состоит го введения, обзора литературы (пять глав), описания материалов и методов исследования, результатов и их обсуждения (три главы), заключения, выводов и списка цитируемой Л1ггературы. Работа содержит 140 страниц печатного текста, 19 рисунков, 11 таблиц и 170 ссылок.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Обзор литературы включает пять глав. В главе I кратко рассмотрены структура и функции сосудистого эндотелия. Глава 11 посвящена визуализации, биохимическому составу и структуре ЭГК. В главе Ш подробно рассмотрены функции эндотелиального гликокаликса как регулятора сосудистой проницаемости, механотранедуктора напряжения сдвига кровотока, регулятора сосудистого микроокружения и взаимодействия эндотелия с циркулирующими клетками крови. Глава IV посвящена участию гликокаликса в патологических процессах сердечно-сосудистой системы. В последней, V главе приведены подходы по регуляции структуры гликокаликса, преимущественно при помощи ферментных производных.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Используемые материалы. В работе использованы тестикулярная гиалуронидаза (КФ 3.2.1.35) из семенников быка производства (ФГУП "Микроген" МЗиСР РФ, Россия) со специфической активностью нативного производного 950-970 NFU/мг белка, подвергшаяся предварительной очистке с помощью гель-хроматографии на носителе Sephadex® G-100 Medium (Sigma, США). Для синтеза ГУ-ХС использованы хондроитин-4-сульфат из трахеи быка со средней молекулярной массой 30-50 кДа (Sigma, США), пара-бензохинон (Aldrich, США), тринитробензосульфокислота (Sigma, США). Для изучения кинетики пикирования ГУ и ГУ-ХС использованы: субстрат в виде лиофилизированной калиевой соли гиалуроновой кислоты (гиалуронан) средней молекулярной массы 700-800 кДа из пуповины человека, натриевая соль высокомолекулярного гепарина бычьего происхождения молекулярной массы 16-18 кДа, D-глюкоза (Glc), D-галактоза (Gal), D-лактоза (Lac), D-мальтоза (Mal), D-целлобиоза (Cel), N-ацетилглюкозамин (N-AcGlcNbb), N-ацетилгалактозамин (N-AcGalNHi) фирмы Sigma-Aldrich, США. Индивидуальные фрагменты (олигомеры) гиалуроновой кислоты общей формулы GlcA-[-GlcNHAc-GlcA-]„-GlcNHAc, где и равно 0 (димер), 1 (тетрамер), 2 (гексамер), 3 (октамер), 4 (декамер гиалуронана), были любезно предоставлены профессором Keiichi Takagaki, Department of Biochemistry, Hirosaki University School of Medicine, Hirosaki, Japan. Все остальные реактивы

отечественного или зарубежного производства (фирма Sigma-Aldrich, США) были аналитический степени чистоты.

Для оценки влияния препаратов нативной и модифицированной хондроитинсульфатом гиалуронидазы на состояние перфузии конечности крысы после ишемического воздействия методом ЛДФ-метрии были использованы крысы-самцы линии Вистар средней массы 320400 граммов в возрасте 1-1,3 года, полученные от зоопитомника филиал "Столбовая" ГУ НЦБМТ РАМН.

Методы исследования. 1) Ферментативную активность препаратов нативной и модифицированной гиалуронидазы определяли, используя метод вискозиметрии, согласно установленным рекомендациям [Vercruysse К.Р. et al., 1995].

2) Активацию ГАГ хондроигинсульфата (ХС) л-бензохиноном проводили по оригинальной методике путем смешивания растворов исходных соединений в весовом соотношении 1 : 1 и инкубацией в течении 1,5 часов с последующей хроматографической очисткой активированного ХС. Количество гидрохиноновых центров присоединения на гликановой цепи хондроигинсульфата (10-20% от общего количества) определялось йодометрически [Maksimenko A.V. et al., 2001].

3) Ковалентное конъюгирование ГУ с активированным ХС проводили по оригинальной методике путем инкубации растворов предварительно очищенной хроматографически ГУ и активированного ХС (соотношения компонентов в реакционной смеси: 20 мкМ ГУ - 10-15 мкМ ХС, 18-22 часов, рН 8,2-8,7). После инкубации реакционная смесь проходила стадию очистки (хроматографической или ультрафильтрационной) с последующей лиофилизацией. Эндогликозидазная активность полученного производного составляла 76-78% от активности ГУ, степень экспонирования поверхностных аминогрупп ГУ-ХС (степень модификации фермента) - 84-86%. Содержание белка в модифицированном препарате - 3-6%.

4) Содержание белка в препаратах ГУ и ГУ-ХС определяли по методу Брэдфорд [Bradford М.М., 1976].

5) Степень модификации ГУ измеряли путем титрования поверхностных аминогрупп гиалуронидазных производных тринитробензосульфокислотой по методу Spadaro А.С. et al. (1979), принимая содержание аминогрупп нативного фермента за 100%.

6) Гликирование производных ГУ осуществляли при их инкубации с сахаридными формами: моно- (Glc, Gal), дисахаридами (Lac, Mal, Cel), N-ацетилгексозаминами (N-AcGlcNth и N-AcGalNHî) и олигомерами гиалуроновой кислоты общей формулы GlcA-[-GlcNHAc-GlcA-]n-<}lcNHAc, где п равно 0 (димер), 1 (тетрамер), 2 (гексамер), 3 (октамер), 4 (декамер гиалуронана). Инкубацию ферментных производных проводили в 0,05 M фосфатном буфере рН 5,5 или рН 7,5 (в присутствии 0,15 или 0,75 M NaCl) при 37°С в

течение 8 суток. В случав инкубации с олигосахаридами гиалуроповой кислоты в течение трех часов из инкубационного раствора отбирались пробы по 0,1 мл и определялась ее эндоглпкозидазная активность по вышеописанной методике через 10, 30 мин, 1, 2, 3 часа после начала инкубации. В остальных случаях забор пробы происходил 1 раз в сутки.

7) Влияние ионной силы раствора на активность производных ГУ оценивалось путем вышеописанного измерения активности термостатированного при температуре 37°С буферного раствора ГУ и ГУ-ХС с заданными аналитическими концентрациями хлорида натрия при значениях рН раствора 5,5 и 7,5.

8) Резистентность производных ГУ к ингибированию гепарином оценивали по величине их остаточной эндогликозидазной активности в присутствии избытка гепарина (соотношение весовых концентраций фермент/гепарин 1:100).

9) Спектрофлюориметрическое исследование изменения степени экспонирования поверхностных аминогрупп при инкубировании производных ГУ с нейтральными сахаридами проводили на спектрофлюориметре Hitachi F-4010 (Япония) при длине волны возбуждения 280 нм, испускания 348 нм с одинаковой концентрацией белка (0,2 мг/мл).

10) Эксперименты in vivo по оценке действия препаратов ГУ на состояние системы микроциркуляции после ишемии/реперфузии были выполнены на анестезированных хлороформом крысах, задняя конечность которых подвергалась 3-х часовой ишемии с последующей реперфузией. Характер восстановления перфузии микроциркуляции задней конечности при внутривенном болюсном введении исследуемых препаратов оценивали методом ЛДФ с использованием одноканального лазерного анализатора кожного кровотока ЛАКК-02 (НПП «JIA3MA», Россия). В зависимости от используемого препарата и вида его введения (превентивного или острого) животные были сформированы в группы по 6 голов. Описания групп приведены в Таблице 1.

11) Вейвлет-анализ экспериментальных данных опытов in vivo выполнен с помощью программного обеспечения LDF 2.2.0.507 для оценки влияния механизмов локальной и системной регуляции микроциркуляции на ее функционирование в условиях ишемии/реперфузии и воздействия исследуемых соединений.

12) Статистическая обработка результатов опытов in vivo выполнена с использованием программного пакета Statistica 6.0 (StatSoft Inc., США) согласно рекомендациям [Реброва О.Ю., М.: МедиаСфера, 2006].

Таблица 1. Исследованные производные, дозы их препаратов и количество животных в группах сравнения

Схема 1 Схема 2

Введенный препарат Доза Количество Доза Количество

животных животных

Контроль (физиологический раствор) 1 мл 6 1 мл 6

Змг белка/кг 3 мг белка/кг

ГУ (2800-2900 №и/кг веса) 6 (2800-2900 №и/кг веса) 6

3 мг белка/кг 3 мг белка/кг

ГУ-ХС (2200-2300 ЫШ/кг веса) 6 (2200-2300 ОТи/кг веса) 6

Свободный ХС 5 мг/кг 6 5 мг/кг 6

5 мг 5 мг

гликозамино- гликозамино-

Смесь ГУ с ХС гл и кана/кг и 3 мг белка/кг (2800-2900 ОТи/кг веса) 6 гликана/кг и 3 мг белка/кг (2800-2900 ЫЩ/кг веса) 6

БСА 3 мг белка/кг 4 3 мг белка/кг 3

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Получение модифицированной гналуронндазы. Обработка ХС (и других ГАГ) бензохиноном делает этот полимер пригодным для ковалентного связывания с ферментами. Ковалентное присоединение биокатализатора к активированному бензохиноном ГАГ обеспечивается за счет поверхностных аминогрупп фермента и подтверждается данными денатурирующего электрофореза с додецилсульфатом натрия. Ранее в работах нашей лаборатории было экспериментально продемонстрировано влияние ГАГ-микроокружения ГУ на эндогликозидазную активность и резистентность к гепариновому ингибированию, при этом упомянутое микроокружение моделировалось ковалентным присоединением ГАГ к гиалуронидазе [Максименко A.B., 2003]. Полимерные ГАГ (гиалуронан, ХС) стабилизировали эндогликозидазную активность фермента, а сополимерные (гепарин/ гепарансульфат, дерматансульфат) дестабилизировали ее. Инактивирующее влияние сополимерных ГАГ было связано с присутствием в микроокружении ГУ остатков идуроновой кислоты и а(1-3)-, а(1-4)-гликозидных связей. Наибольшим стабилизирующим эндогликозидазную активность фермента эффектом обладало ХС-микроокружение биокатализатора. По оригинальной методике было наработано препаративное количество препарата ГУ-ХС для выполнения дальнейших сравнительных исследований.

Исследование действия гликирующих агентов на активность ГУ и ГУ-ХС.

Гликироеание моно- и ди- сахаридами. Для выяснения закономерностей структурно-функциональных изменений ГУ и ГУ-ХС была выполнена оценка влияния нейтральных

с&харидов (как простых пикирующих агентов в виде моносахаридов, так и структурных аналогов полимерных звеньев ГЛГ - дисахаридов) на эндогликозидазную активность ферментных производных.

Гликирование ГУ moho- (Gic и Gal, их смесью) и дисахаридами (Lac, Mal, Cel, их смесью) влияло на активное! и ферментов сходным образом, вызывая снижение активности как при рН 5,5, так и при рН 7,5. При этом сильным инактивирующим действием в отношении ГУ обладали Gal (при рН 5,5) и Lac (при рН 5,5 и 7,5). Смесь моно- и дисахаридов наиболее значимо ипактнвировали ГУ. Присутствие в растворе субстрата гепарина вызывало снижение активности ГУ во всех случаях. Инкубация с моносахаридами Glc и Gal по отдельности, а также с дисахаридами Mal и Cel приводила к постепенному снижению степени экспонирования поверхностных аминогрупп ГУ. Характер изменения степени экспонирования аминогрупп существенно варьировался при инкубации ГУ с Lac и смесью моно- и дисахаридов (Табл. 2 и 3).

Напротив, инкубация ГУ-ХС с моно- и дисахаридами не приводила к существенным потерям эндогликозидазной активности, вне зависимости от значения рН инкубационной среды (Табл. 2 и 3). В отличие от нативного фермента, Gal и Lac не оказывали ингибирующего воздействия на ГУ-ХС и только смесь моно- и дисахаридов приводила к ее заметной инактивации. Кроме того, ГУ-ХС обладала резистентностью к ингибированию гепарином. Параметр степени экспонирования поверхностных аминогрупп обладал значительной вариабельностью с тенденцией к росту.

Спектрофлуориметрическое исследование не выявило существенных изменений в зависимости 1ф от времени инкубационного процесса, демонстрирующей изменение конформации фермента с изменением положения групп-флуорофоров на белковой поверхности в процессе гликнрования, при его проведении с ГУ в отсутствии моно- и дисахаридов. В присутствии моносахаридов происходит почти одинаковое, монотонно возрастающее со временем инкубации тушение флуоресценции для всех случаев. Для ГУ-ХС значение 1ф при инкубации с моно- и дисахаридами монотонно снижалось во всех случаях.

Гликирование N-ацетилгексозаминами. Помимо нейтральных гликирующих агентов в условиях сосудистого поражения могут появляться также заряженные сахаридные производные, способные возникать в результате деградации ЭГК. Модельными гликирующими агентами, представляющими эти сахаридные производные, выступают N-ацетилгексоз амины.

Гликирование ГУ N-ацетилгексозаминами не вызывает существенных потерь активности (Табл. 4). Наблюдалось некоторое падение активности гиалуронидазы при рН 5,5 от действия смеси N-ацетилгексозаминов. В сравнении с контрольными показателями не

Таблица 2. Параметры ГУ в ходе 8-суточной инкубации при 37°С, рН 5,5 и 7,5 без и в присутствии избытка моносахаридов (Glc и Gal, значения указаны в [%], ±5% погрешность измерений)

Исследуемые компоненты инкубационной смеси рН 5.5

активность без гепарина С = 8) активность с гепарином (< = 0) активность с гепарином «=8) глубина падения активности с гепарином, Д степень экспонирования аминогрупп

ГУ 80 38 8 30 70

ГУ + Glc 85 48 33 15 40

ГУ + Gal 65 73 55 18 54

ГУ + смесь Glc и Gal 61 78 54 24 128

Исследуемые компоненты инкубационной смеси рН 7,5

активность без гепарина (/ = 8) активность с гепарином С=0) активность с гепарином (í = 8) глубина падения активности с гепарином, Д степень экспонирования аминогрупп

ГУ 82 36 14 22 84

ГУ + Glc 70 50 44 6 75

ГУ + Gal 80 75 60 15 46

ГУ + смесь Glc и Gal 66 82 60 22 102

Параметры ГУ-ХС, в ходе 8-суточной инкубации при 37°С, рН 5,5 и 7,5 без и в присутствии избытка моносахаридов (Glc и Gal, значения указаны в [%], ±5% погрешность измерений)

Исследуемые компоненты инкубационной смеси рН 5,5

активность без гепарина е=8) активность с гепарином (í = 0) активность с гепарином (< = 8) глубина падения активности с гепарином, Д степень экспонирования аминогрупп

ГУ-ХС 92 100 90 10 98

ГУ-ХС + Glc 96 85 78 7 157

ГУ-ХС + Gal 100 90 85 5 165

ГУ-ХС+смесь Glc, Gal 85 90 78 12 140

Исследуемые компоненты инкубационной смеси рН7,5

активность активность с активность с глубина паде- степень

без гепарина (/■=8) гепарином (' = 0) гепарином (f = 8) ния активности с гепарином, Д экспонирования аминогрупп

ГУ-ХС 98 100 98 2 102

ГУ-ХС + Glc 87 88 85 3 130

ГУ-ХС + Gal 98 96 95 4 142

ГУ-ХС+смесь Glc, Gal 82 82 65 17 156

наблюдалось выраженных изменений гепаринового ингибирования ГУ при пикировании N-ацетилгексозаминами.

К достоверному снижению эндогликозидазной активности модифицированного фермента приводило его гликирование N-ацетилгексозаминами (Табл. 4). Меньшее инактивирующее действие вызвал N-AcGalNH2, большее - N-AcGlcNHj, а наибольшую инактивацию активности вызывало действие их смеси. Ингибирующий эффект гепарина был сходен по глубине с эффектами для случаев ГУ, и был больше в сравнении с инкубацией ГУ-ХС без N-ацетилгексозаминов.

Эффекты гликирования N-ацетилгексозаминами оказались противоположными гликирующему действию нейтральных моно- и дисахаридов, когда ХС-микроокружение

Таблица 3 (часть 1)

Параметры ГУ в ходе 8-суточной инкубации при 37°С, pH 5,5 и 7,5 без и в присутствии избытка дисахаридов (Mal, Cet и Lac, значения указаны в [%], ± 5% погрешность измерений)

pH 5.5

Исследуемые активность без гепарина ((=8) активность с гепарином (( = 0) активность с гепарином 0 = 8) глубина падения активности с гепарином, Д изменение

компоненты инкубационной смеси степени экспонирования аминогрупп

ГУ 80 38 8 30 Монотонное снижение до 70

ГУ + Mal, /Glca(l -4)Glc/ 85-91 43 23 20 Монотонное снижение до 65

ГУ + Cet, /Glcß(l-4)GIc / 98-100 20 14 6 Неуклонное снижение до 52 Быстрое снижение за 2

ГУ + Lac, /Galß(l-4)Glc / 58 42 14 28 сутдо 35 и постепенное падение далее до 32 Падение за

ГУ + смесь /из Mal, Cel, Lac / 55-60 20 2 18 сутки до 55 с последующим

увеличением до 98

pH 7,5

Исследуемые компоненты инкубационной смеси активность без гепарина 0 = 8) активность с гепарином С=0) активность с гепарином (« = 8) глубина падения активности с гепарином, Д изменение степени экспонирования аминогрупп

ГУ 82 36 14 22 Монотонное снижение до 84

ГУ + Mal, /Glca(l-4)Glc/ 95-97 43 28 15 Монотонное снижение до 45

ГУ + Cel, /Glcß(l-4)Glc / 94-96 17 12 5 Неуклонное снижение до 52 Быстрое снижение за 2

ГУ + Lac, /Galß(l-4)Glc / 70-72 42 15 27 сутдо45 и постепенное падение далее до 35 Падение за

ГУ + смесь /из Mal, Cel, Lac/ 54-58 8 1 7 сутки до 70 с последующим

увеличением до 110

стабилизировало ГУ. Мы предполагаем, что указанное различие может быть обусловлено развитием кулоновских взаимодействий после модификации фермента ХС. Для выяснения этого было выполнено исследование влияния ионной силы на эндогликозидазную активность ферментных производных. Оказалось, что эндогликозидазная активность ГУ и ГУ-ХС зависит от величины ионной силы среды сходным образом (Рис. 1). Таким образом, электростатические взаимодействия не имеют решающего влияния на активность

Таблица 3 (часть 2)

Параметры гиалуронидазы, модифицированной хондроитинсульфатом (ГУ-ХС), в ходе 8-суточной инкубации при 37°С, pH 5,5 и 7,5 без и в присутствии избытка дисахаридов (Mal, Cel и Lac, значения указаны в [%], ± 5% погрешность измерений)

Исследуемые компоненты инкубационной смеси pH 5,5

активность без гепарина С = 8) активность с гепарином (< = 0) активность с гепарином е=8) глубина падения активности с гепарином, Д изменение степени экспонирования аминогрупп

ГУ-ХС 92 100 90 10 Отсутствие существенных изменений, 98

ГУ-ХС + Mal, /GMl-4)Glc/ 96 85 81 4 Ломанная кривая с тенденцией к росту, 136

ГУ-ХС + Cel, /Glcß(l-4)G!c/ 88 83 71 12 Снижение за трое суток до 76 с последующим ростом до 124

ГУ-ХС + Lac, /Galß(l-4)GIc / 101 88 78 10 Ломанная кривая с тен-денцией к росту на поздних (более 4 сут) сроках инкубации, 130

ГУ-ХС + смесь /из Mal, Cel, Lac / 75 86 66 20 Ломанная кривая (на 4-е сутки - 64) с ростом на поздних сроках до 138

Исследуемые компоненты инкубационной смеси pH 7,5

активность без гепарина С=8) активность с гепарином 0 = 0) активность с гепарином глубина падения активности с гепарином, Д изменение степени экспонирования аминогрупп

ГУ-ХС 98 100 98 2 Отсутствие существенных изменений, 102

ГУ-ХС + Mal, /Glca(l-4)Glc/ 99-101 90 87 3 Ломанная кривая с возрастанием, 109

ГУ-ХС + Cel, /Glcß(l-4)Glc/ 91-92 87 75 12 Снижение за трое суток до 74 с поел еду-ющим ростом до 108

ГУ-ХС + Lac, /Galß(l-4)Glc/ 102 82 79 3 Ломанная кривая с тенденцией к росту на поздних (более 4 сут) сроках инкубации, 94

ГУ-ХС + смесь /из Mal, Cel, Lac / 72 88 72 16 Ломанная кривая (на 3-е сутки - 63) с ростом на поздних сроках до 142

ферментных производных. При этом обнаруженная зависимость была более выражена при рН 5,5 и менее значительна при рН 7,5. В последнем случае лимитирующее влияние электростатических взаимодействий на процесс гликирования может выявляться заметней при его проведении с повышенной величиной ионной силы инкубационной среды (0,75 М МаС1) со смесью Ы-ацетилгексозаминов.

Таблица 4. Гликирование ГУ Ы-ацетилгексозаминами в течение восьмисугочной инкубации (37°С, 0,15 М ЫаС1, значения указаны в [%] от исходного значения, ± 5% погрешность измерений)

Состав инкубационной смеси Параметры ГУ после восьми суток инкубации

рН 5,5 рН 7,5

Сохраняемая активность Сохраняемая активность в присутствии избытка гепарина Сохраняемая активность Сохраняемая активность в присутствии избытка гепарина

ГУ 80 72 82 68

ГУ сМ-АсИсШ) 78 68 80 70

ГУ сМ-АсОаШЯ; 88 78 86 77

ГУ со смесью Ьт-ЛсС!сКЬЬ иЫ-АсСаШНг 70 60 80 70

Гликирование ГУ-ХС Ы-ацетилгексозаминами в течение восьмисугочной инкубации (37°С, 0,15 М КаС1, значения указаны в [%] от исходного значения, ± 5% погрешность измерений)

Параметры ГУ-ХС после восьми суток инкубации

рН5,5 рН7,5

Состав инкубационной смеси Сохраняемая Сохраняемая активность в Сохраняемая Сохраняемая активность в

активность присутствии избытка гепарина активность присутствии избытка гепарина

ГУ-ХС 92 90 98 98

ГУ-ХС с Ы-АсИсЫНз 44 33 12 4

ГУ-ХС с Ы-АсОа1ЫН2 50 37 38 25

ГУ-ХС со смесью № АсгасШг и Ы-АсС>а1МН2 42 31 18 6

Было выполнено тестирование влияния величины ионной силы инкубационных растворов на процесс гликирования ферментов М-ацетилгексозаминами. Показано, что величина ионной силы практически не сказывается на пикировании ГУ и заметно влияет на гликирование ГУ-ХС (Рис. 2). Увеличение ионной силы уменьшало развитие кулоновских взаимодействий на больших сроках инкубации, что приводило к снижению гликирующей инактивации модифицированного фермента

Гликирование фрагментами гиалуронана. Взаимодействие производных ГУ с фрагментами гиалуронана общей формулы С1сА-[-01сКНАс-С1сА-],,-СНсННАс, где и от 0 до 4, продемонстрировало, что ГУ-ХС существеннее инактивируется в сравнении с ГУ (Рис. 3). С увеличением длины сахаридной цепи (рост молекулярного размера) гиалуронановых фрагментов инактивация уменьшалась для ГУ и ГУ-ХС. С увеличением времени инкубации (рН 5,5, 37°С) заметнее усиливалась инактивация ГУ-ХС, особенно смесью фрагментов гиалуронана. За три часа инкубации снижалось количество титруемых поверхностных аминогрупп ГУ на 50%, а ГУ-ХС на 34%. Наблюдаемые эффекты наглядно подтверждали инактивирующее действие Ы-ацетилгексозаминов (расположенных у восстанавливающего конца фрагментов гиалуронана) на ГУ-ХС. Смесь гиалуронановых фрагментов моделировала действие смеси продуктов деградации ЭГК.

Концентрация МаС1, М Концентрация ЫаС1, М

Рисунок 1. Влияние величины ионной силы среды (концентрация №С1, М) на эндогликозидазную активность ГУ (кружки) и ГУ-ХС (квадратики) при рН 5,5 (А) и 7,5 (Б).

Модель поражения микроциркуляции крысы. Выбор модели ишемического поражения микроциркуляции нижней конечности крысы был обусловлен доступной возможностью слежения за изменением уровня подкожной микроциркуляции во времени с помощью метода ЛДФ и тем, что аналогичная модель была подробно описана при изучении комплексного регионарного болевого синдрома [Сос1егге Т.Г й а!., 2004].

Экспериментально установленная продолжительность ишемии (три часа) позволяет достигать исходного уровня микроциркуляции после снятия зажима в контрольной группе в течение периода в 2-3 мин, что было удобно для оценки эффектов исследуемых соединений.

Время инкубации (сутки) Время инкубации (сутки)

Рисунок 2. Зависимость сохраняемой эндогликозидазной активности ГУ-производных при гликировании смесью М-Ас01с№Ь и Ы- АсОа1ЫН2 при рН 5,5 (А) и рН 7,5 (Б). Гликирование проводили при величине ионной силы инкубационной среды 0,15 М №С1 (ГУ - 1, ГУ-ХС - 3) и 0,75 М ЫаС1 (ГУ - 2, ГУ-ХС - 4).

Остаточная активность (%)

ГУ или ГУ-ХС

Остаточная активность (%}

ГУ или ГУ-ХС

Без фрагментов . 0 гиалуронана ^—

2

4 , или Смесь —' + фрагментов гиалуронана

Без фрагментов 0 гиалуронана ^—

2

4. или Смесь —s + фрагментов

■ GlcA -f GIcNHAc-GlcA)- GIcNHAc

гиалуронана

+ GlcA-tGIcNHAc-GlcAf GIcNHAc

Рисунок 3. Величина остаточной эндогликозидазной активности ГУ (1) и ГУ-ХС (2) при инкубации ферментных производных с олигосахаридами гиалуронана: через 2 часа (А) и 3 часа (Б) при рН 5,5 и 37°С.

Кроме того, выбранный период ишемии не способствовал развитию интерстициального отека и необратимого разрушения микроциркуляторного русла. Нарушения микроциркуляции могли быть связаны в этих условиях с "реперфузионным" поражением (ишемия/реперфузия), эндотелиальным набуханием, вазоспазмом, воспалительным ответом. Установленный интервал (2,3-3,5 мг белка/кг веса животного, 2200-3400 NFU/кг) белковой дозы ГУ соответствовал ее оптимальному эффекту и в этих границах (с учетом содержания компонентов в ГУ-ХС) сравнивалось действие изученных веществ.

Флоуметрическое рассмотрение данных экспериментов in vivo.

Схема 1. Время достижения исходного уровня микроциркуляции после ишемии было различным для рассматриваемых групп (Рис. 4). При проведении парного сравнения групп животных по тесту Манна-Уитни, сопоставляемого в ANOVA Краскела-Уоллиса, было найдено, что действие ГУ и ГУ-ХС достоверно отличаются между собой и от показателей других групп, тогда как показатели контрольной группы достоверно не отличались от показателей свободного ХС и его смеси с ГУ (Табл. 5-6, Рис. 5). ГУ ускоряет восстановление микроциркуляции, а ГУ-ХС замедляет этот процесс, указывая на возможную роль ингибирующего действия продуктов деградации ЭГК.

Воздействие ишемии/реперфузии и воспалительных процессов разрушает ЭГК в венулах и капиллярах системы микроциркуляции. Вероятно, гликокаликс в этом случае выступает в качестве фактора резистентности кровотоку, создавая дополнительные препятствия при локальных нарушениях целостности микрососудистого эндотелия,

J6

Уровень микроциркуляции, (%)

Рисунок 4. Флоуметрические данные восстановления исходного уровня микроциркуляции в конечности крысы при внутривенном болюсном введении указанных средств (в 1 мл физиологического раствора) за минуту до начала трехчасовой ишемии (схема 1). Экспериментальные группы животных (п = 6): 1 - контрольная (физ. раствор), 2 - ГУ, 3 - ГУ-ХС, 4 -свободный ХС, 5 - смесь ГУ + ХС.

способствуя агрегации циркулирующих белковых компонентов и клеток крови. Деструкция одного из компонентов ЭГК, гиалуронана, может определять функционирование капилляров (Cabrales Р. et al., 2007). Системно введенное в кровоток производное ГУ (в нашем исследовании) способно воздействовать на гиалуронан ЭГК и может подвергаться действию метаболитов карбогидратного окружения. В условиях продолжительной ишемии в их роли могут выступать продукты деградации ЭГК. Свидетельством первого направления

-о- Медиана I 1 Квартили 25%-75% 7 Min-Max о Выбросы ♦ Экстремумы

п 6

OPGU

А

Т>

J.

Рисунок 5.

Сравнение экспериментально определенного времени достижения исходного уровня микроциркуляции в коробочной форме для экспериментальных групп животных, которым вводились исследуемые

соединения по схеме 1. Достоверность различий (р < 0,05) по АЫОУА Краскела-Уоллиса и медианному тесту указана в тексте.

Контроль ГУ ГУ-ХС ХС ГУ+ХС БСА

Таблица 5. Результаты сравнения групп по времени достижения исходного уровня значения показателя перфузии (сек) при вводе испытуемых препаратов с использованием метода Краскела-Уоллиса и медианного теста (р < 0,05)

Результаты первичного анализа для схемы 1

Квартили Стат.

Параметр № Ф- Кол-во об. Медиана (сек) 25% 75% критерий АНОУАпо Краскелу-Уоллису Значение Р медианный критерий хг Значение Р

г & 1 6 111,0 99,0 117,0

1 2 3 6 6 72,5 437,0 49,0 352,0 90,0 565,0 20,76803 0,0004 СМ^иаге = 12,58929 0,0135

О К «у 4 6 110,0 93,0 122,0 н

5 6 104,5 94,0 112,0

Результаты первичного анализа для схемы 2

Параметр № Ф- Кол-во об. Медиана (сек) Квартили Стат. критерий АШУА по Краскелу-Уоллису Значение Р медианный критерий % Значение Р

25% 75%

т о. 1 6 106,5 65,0 147,0

I о^ 2 6 114,5 103,0 184,0 СЫ-вдиаге

8 ° о 3 6 740,5 556,0 886,0 21,28172 0,0003 = 21,33333 0,0003

й ° к 4 6 711,5 613,0 913,0 = 4

5 6 544,0 408,0 733,0

Примечания. Группы: 1 - контроль; 2 - ГУ; 3 - ГУ-ХС; 4 - ХС; 5 - смесь ГУ + ХС.

Статистически значимые результаты отмечены серым курсивом.

взаимодействия выступает снижение резистентности кровотоку микрососудов, а второму -ингибирование ферментативной активности. При этом нейтральные сахариды инактивируют ГУ, а олигомерные формы продуктов ГАГ-деградации ЭГК - ГУ-ХС.

Вейвлет-преобразование полученных результатов демонстрирует уменьшение микрососудистой резистентности кровотоку в случае ГУ, поддерживаемое действием свободного ХС (достоверный рост амплитуды в нейрогенном и миогенном интервале -снижение резистентности кровотоку). Данные ЛДФ демонстрируют достоверный эффект ускорения (относительно контроля) восстановления уровня микроциркуляции после ишемии только с ГУ (Рис. 5). Можно полагать, что наблюдаемый эффект обусловлен ее эндогликозидазной активностью, поскольку использование другого белка (бычьего сывороточного альбумина, БСА), заведомо лишенного такой активности, не оказывает отмеченного действия. Более того, ГУ-ХС проявляет "тормозящий" эффект (относительно контроля) на скорость восстановления уровня микроциркуляции после ишемии. Это свидетельствует об ингибировании ферментативной активности, по-видимому, в результате действия именно продуктов деградации ЭГК и, возможно, об организации дополнительных барьеров микрокровотоку после ишемии.

Таблица 6. Результаты попарного сравнения групп по времени достижения исходного уровня значения показателя перфузии (сек) при вводе испытуемых препаратов с использованием критерия Манна-Уитни (р < 0,005)

Данные сравнения групп по схеме 1

Сравниваемые группы Дейст. кол-во в первой гр., /Vi Дейст. кол-во во второй гр.. Л/г Медиана для первой гр., Ме, (сек) Медиана для второй гр., Шг (сек) Доверит, инт. для первой гр., ДИ1 Доверит, инт. для второй гр., ДИ2 и- критерий Манна- Значение р

нижний верхний нижний верхний Уитни

1-2 6 6 111 72,5 90 123 24 93 1.5 0,0043

1-3 6 6 111 437 90 123 339 618 0 0,0022

........1-4 6 111 110 90 123 74 190 17,5 0,9372

1-5 6 " 6 111 104,5 90 123 93 190 15,5 0,6991

2-3 6 72,5 437 24 93 339 618 0 0,0022

2-4 6 6 72,5 110 24 93 74 "I 190 3,5 0,0152

2-5 6 6 72,5 104,5 24 93 93 190 0,5 0,0022

3-4 6 6 437 110 339 618 74 190 0 0,0022

3-5 6 6 437 104,5 339 618 93 190 0 0,0022

4-5 6 6 110 104,5 74 190 93 190 17,0 0,9372

Данные сравнения групп ло схеме 2

Сравниваемые группы Дейст. кол-во в первой rp.. Л/, Дейст. коп-во во второй ф., Л/г Медиана для первой гр., Ме 1 (сек) Медиана для второй тр., Мег (сек) Доверит, инт. для первой гр., ДИ, Доверит, инт. для второй гр., ДИ2 U-критерий Манна- Значение р

НИЖНИЙ верхний нижний верхний Уитни

1-2 6 6 106,5 114,5 54 161 47 187 15 0,6991

1-3 6 6 106,5 740,5 54 161 534 906 0 0,0022

1-4 6 6 106,5 711,5 54 •¡61 388 1049 0 0,0022

1-5 6 6 106,5 544 54 191 398 1800 0 0,0022

2-3 6 6 114,5 740,5 47 187 534 906 0 0,0022

2-4 6 6 114,5 711,5 47 187 388 1049 0 0,0022

2-5 6 6 114,5 544 47 187 398 1800 0 0,0022

3-4 6 6 740,5 711,5 534 906 388 1049 15 0,6991

3-5 6 6 740,5 544 534 906 398 1800 12 0,3939

4-5 6 6 771,5 544 388 1049 398 1800 14 0,5887

Примечания. Группы: 1 - контроль; 2 -ГУ; 3 - ГУ-ХС; 4 -ХС; 5 - смесь ГУ + ХС;

Статистически значимые результаты отмечены серым курсивом.

Полученные данные демонстрируют участие ЭГК в микроциркуляторных нарушениях, устранение которых ускоряется при активном ферментативном воздействии на его компоненты. Вероятно, такое воздействие будет более затруднительным при остром введении производных (перед окончанием ишемии и реперфузией), когда накоплены продукты деградации ЭГК (в зоне продолжительной ишемии) для проявления их "уДаРН0Г0" действия, а гиперемия сокращает дозу активного фермента в очаге поражения (нет системного распределения производного) и исключается возможность функционирования введенных соединений в период ишемии. Для подтверждения этого предположения были выполнены эксперименты по схеме 2.

Схема 2. Флоуметрическое исследование демонстрирует решающий вклад в достижение исходного уровня микроциркуляции после трехчасовой ишемии самого потока

Уровень микроциркуляции, (%)

300-

250-

200-

150 -

1 • контроль 2-ГУ -о-3 - ГУ-ХС -й-

4-ХС -о-

5-ГУ + ХС -»-

т Г ]'

100 -

Рисунок 6. Флоуметричеекие данные восстановления исходного уровня микроциркуляции в конечности крысы при внутривенном болюсном введении указанных средств (в 1 мл физиологического раствора) за пять минут до окончания трехчасовой ишемии (схема 2). Экспериментальные группы животных (п = 6): 1 - контрольная (физ. раствор), 2 - ГУ, 3 - ГУ-ХС, 4 - свободный ХС, 5 - смесь ГУ + ХС.

крови (Рис. 6). Статистическая обработка этих данных показывает достоверность сходства результатов контрольного эксперимента и эффекта ГУ, от которых достоверно отличаются сходные между собой "тормозящие" восстановление кровотока эффекты ГУ-ХС, ХС и его смеси с ГУ (Табл. 5-6, Рис. 7). Действие БСА подчеркивает значимость гиалуронидазной активности, которая, по-видимому, направлена на измененную ишемией структуру ЭГК и

2000 1800 1600 1400

Г 1200

I

1000 600 600 400

-о- Медиана О Квартили 25%-75% ~Т~ Шп-Мах

Рисунок 7.

Сравнение экспериментально определенного времени достижения исходного уровня микроциркуляции в коробочной форме для экспериментальных групп животных, которым вводились исследуемые

соединения по схеме 2. Достоверность различий [р < 0,05) по А!\'ОУА Краскела-Уоллиса и медианному тесту указана в тексте.

Контроль ГУ ГУ-ХС ХС ГУ+ХС БСА

снижается при функционировании ГУ в ишемизированной зоне микроциркуляции. Это влияние сказывается на действии смеси ГУ с ХС, обнаруживая, возможно, присутствие увеличенного количества нейтральных сахаридных производных (в сравнении с эффектами схемы 1). Доминирующее накопление продуктов деградации ЭГК инактивирует ГУ-ХС и ее электростатический комплекс ГУ с ХС (Рис. 7), подтверждая участие гликокаликса в развитии микроциркуляторных нарушений. Данные вейвлет-преобразования результатов флоуметрии предполагают возможное удержание гликокаликсом ХС и его ковалентных и электростатических комплексов с ГУ, что достоверно замедляет восстановление микроциркуляции (Рис. 7), вероятно, благодаря возникновению гидродинамических препятствий кровотоку. Сравнение данных разных экспериментальных схем (Рис. 5 и 7) подтверждает вероятность такой ситуации, указывая на антиишемическую защиту поверхности микрососудов свободным ХС и его смесью с ГУ. Полученные результаты поддерживают рассмотрение ЭГК как важной терапевтической мишени.

ВЫВОДЫ:

1. Модификация бычьей тестикулярной гиалуронидазы хондроитинсульфатом стабилизирует ее эндогликозидазную активность по отношению к инактивирующему гликированию моно- (глюкоза и галактоза) и ди- (целлобиоза, мальтоза, лактоза) сахаридами.

2. Гликирование нативной и модифицированной хондроитинсульфатом гиалуронидазы N-ацетилгексозаминами (как в виде индивидуальных соединений, так и в составе структуры фрагментов гиалуронана) значительно инактивирует эндогликозидазную активность модифицированной гиалуронидазы и незначительно влияет на нативный фермент.

3. Противоположное влияние на эндогликозидазную активность нативной и модифицированной хондроитинсульфатом гиалуронидазы моно- и дисахаридов, с одной стороны, и N-ацетилгексозаминов (расположенных у восстанавливающего конца продуктов деградации эндотелиального гликокаликса), с другой, предполагает использование этих ферментных производных для выяснения участия продуктов деградации эндотелиального гликокаликса в развитии нарушений микроциркуляции, вызванных процессом ишемии с последующей реперфузией.

4. На модели ишемии/реперфузии мышц задней конечности крысы превентивное (предышемическое) внутривенное болюсное введение нативной гиалуронидазы быстрее вызывает восстановление исходного уровня микроциркуляции, чем действие модифицированного фермента. Эти результаты свидетельствуют о преобладании в ишемизированной микрососудистой сети продуктов деградации эндотелиального

гликокаликса, вносящих вклад в развитие микрососудитых обструкций в ишемизированных тканях и нигнбпрующих модифицированную хондроитинсульфатом гналуронидазу.

5. Ингибирующее действие продуктов деградации эндотелиальпого гликокаликса на модифицированную хондроитинсульфатом гиалуронидазу более выражено после постишемического внутривенного болюспого введения исследуемых агентов.

6. По данным биохимического тестирования с использованием нативной и модифицированной хондроитинсульфатом гиалуронидазы на модели ишемии/ реперфузии мышц задней конечности крысы эндотелиальный гликокаликс участвует в развитии нарушений микроциркуляции.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

Результаты исследования могут быть использованы в исследовательских целях для разработки ферментных препаратов, предназначенных для регуляции структуры эндотелиального гликокаликса при патологиях системы микроциркуляции, а также для возможного клинического использования в качестве вспомогательной терапии в случае возникновения микрососудистых осложнений. Данные работы могут использоваться для дальнейшего развития в ФГБУ РКНПК МЗиСР РФ, ГУ Институте биохимии им. А.Н. Баха РАН, ФГБУ ЦВКГ им. A.A. Вишневского МО РФ, химическом и биологическом факультетах МГУ им. М.В. Ломоносова, ГУ РОНЦ им. H.H. Блохина РАМН, ГУ НЦССХ им. А.Н. Бакулева РАМН, ФГБУ Гематологический Научный Центр РАМН и в ряде других мест, связанных с разработкой белковых препаратов медицинского назначения.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Турашев А.Д., Тищенко Е.Г., Максименко A.B. Состояние, деструкция и реконструкция околоклеточной углеводной оболочки люминальной сосудистой поверхности в атерогенезе. Кардиологический вестник. 2007: Том II (XIV), №2, стр. 64-68.

2. Максименко A.B., Турашев А.Д., Тищенко Е.Г. Подходы к регуляции углеводного покрытия люминальной поверхности сосудистой стенки для коррекции патофизиологических процессов. Молекулярная медицина. 2008, №2, стр. 12-17.

3. Турашев А.Д., Максименко A.B. Эндотелиальный гликокаликс в функционировании микроциркуляторного русла. Кардиологический вестник. 2009: Том IV (XVI), №2, стр. 59-65.

4. Турашев А.Д., Тищенко Е.Г., Максименко A.B. Гликирование нативной и модифицированной хондроитинсульфатом гиалуронидазы моносахаридами. Молекулярная медицина. 2009, №3, С. 51-56.

5. Турашев А.Д., Тищенко Е.Г., Максименко A.B. Неферментативное гликозилирование нативной и модифицированной хондроитинсульфатом гиалуронидазы дисахарами. Молекулярная медицина. 2009, №6, С. 50-55.

6. Максименко A.B., Турашев А.Д. Гликокаликс и его фрагменты в функционировании микроциркуляции. Регионар. кровообращ. микроциркул., 2009, Т. 8, №3, С. 4-13.

7. Максименко A.B., Турашев А.Д. Визуализация, состав и структура эндотелиалыюго гликокаликса. Атеросклероз и дислипидемии, 2011, №1,26-38.

8. Максименко A.B., Турашев А.Д. Функции и состояние эндотелиального гликокаликса в норме и патологии. Атеросклероз и дислипидемии, 2011, №2,4-17.

9. Максименко A.B., Турашев А.Д., Федорович A.A., Тищенко Е.Г., Рогоза А.Н. Эндотелиальный гликокаликс крыс участвует в нарушениях микроциркуляторного русла. Атеросклероз и дислипидемии, 2011, №3, 13-29.

10. Турашев А.Д., Бут A.C., Тищенко Е.Г., Лихацкая Г.Н., Максименко A.B.. Влияние гликирования дисахаридами нативной и модифицированной хондроитинсульфатом гиалуронидазы на структурно-функциональные соотношения фермента. Поиск подходов к регуляции плотности углеводной выстилки сосудистой стенки. XII Международная научно-техническая конференция «Наукоемкие химические технологии - 2008». 9-11 сентября 2008 года. Волгоград. Стр 169.

11. Maksimenko А. V., Turashev A. D., But A. S., Tischenko Е. G., Trifonov Е. V., Nurminski Е. A., Likhatskaya G. N. Glycation of Hyaluronidase by mono- and di-saccharides. Protective effect of chondroitin sulfate microenvironment in vitro and in silico: abstrs of the Thirteenth intern, biotechnology symp. and exhibition, Oct. 12-17,2008, Dalian, China//Journal of Biotechnology. -2008. - Vol. 136, Suppl. 1. - P. S202.

12. Турашев А.Д., Тищенко Е.Г., Максименко A.B. Стабилизация гиалуронидазной активности для регуляции плотности углеводного покрытия сосудистой стенки. Тезисы Всероссийская конференция с меяедународным участием «Тромбозы, кровоточивость, ДВС-синдром: современные подходы к диагностике и лечению». 16-18 октября 2008 года. Москва. Стр 134-135.

13. Турашев А.Д., Тищенко Е.Г., Максименко A.B. Регуляция активности гиалуронидазы разных форм гликированием низкомолекулярными сахаридными производными для коррекции микроциркуляторных нарушений. Тезисы. IV Всероссийская конференция по клинической гемостазиологии и гемореологии в сердечно-сосудистой хирургии (Москва, 4-6 февраля 2009 г.) Стр. 532-533.

14. Турашев А.Д., Тищенко Е.Г., Максименко A.B. Производные гиалуронидазы для исследования эндотелиального гликокаликса системы микроциркуляции. Тезисы. VII

Международная конференция «Гемореология и микроциркуляция (от функциональных механизмов в клинику)» (Ярославль, 15-15 июня 2009 г.), стр. 40.

15. Турашев А.Д., Тищенко Е.Г., Макснменко A.B. Флоуметрическое исследование с гиалуроиидазными производными участия эндотелиального гликокапикса в микроциркуляторных нарушениях. Тезисы всероссийской конференции «Тромбозы, кровоточивость, ДВС-сиидром: современные подходы к диагностике и лечению», г. Москва, 9-10 декабря 2010 г. Приложение №8, 83-84.

16. Турашев А.Д., Федорович A.A., Тищенко Е.Г., Рогоза А.Н., Максименко A.B. Ферментативное тестирование участия эндотелиального гликокапикса в ишемическом повреждении микроциркуляторного русла. Материалы конференции «V всероссийская конференция "Клиническая гемостазиология и гемореология в сердечно-сосудистой хирургии (с международным участием)"», Москва, НЦ Сердечно-сосудистой хирургии им. А.Н. Бакулева РАМН, 3-5 февраля 2011 г., 522-524.

17. Максименко A.B., Турашев А.Д., Федорович A.A., Рогоза А.Н., Тищенко Е.Г. Флоуметрическое исследование участия эндотелиального гликокаликса в нарушениях микроциркуляции посредством гиалуронидазного тестирования. Сборник материалов конференции «VIII международная конференция (со школой для молодых ученых) "Системное кровообращение, микроциркуляция и гемореология (от ангиогенеза до центрального кровообращения"», Ярославль, 10-14 июня 2011 г., 136.

Список используемых в работе сокращений.

ЭГК - эндотелиальный гликокаликс

ГАГ - гликозаминогликаны

ГУ - нативная гиалуронидаза

ХС - хондроитинсульфат

ГУ-ХС - модифицированная

хондроитинсульфатом гиалуронидаза ГУ + ХС — смесь нативной

гиалуронидазы со свободным хондроитин-сульфатом

Glc Gal Lac

- глюкоза

- лактоза

Mal Cel

N-AcGlcNH2 N-AcGalNH2 1ф

БСА

ЛДФ МЦР

мальтоза

целлобиоза

Ы-ацетилглюкозамин

Ы-ацетилгалактозамин

интенсивность флуоресценции

бычий сывороточный альбумин

лазерная доплеровская флоуметрия микроциркуляторное русло

Подписано в печать:

21.11.2011

Заказ № 6325 Тираж - 110 экз. Печать трафаретная. Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (499) 788-78-56 www.autoreferat.ru

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Турашев, Аскар Дамирович, Москва

ФГБУ «Российский кардиологический научно-производственный комплекс» Минздравсоцразвития РФ

61 12-3/417

На правах рукописи

Турашев Аскар Дамирович

Биохимический анализ гиалуронидазного взаимодействия с эндотелиальным гликокаликсом при нарушениях микроциркуляции

03.01.04 — Биохимия

диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научный руководитель: д.б.н., проф. Максименко A.B.

Москва 2011 год

СОДЕРЖАНИЕ

Список используемых сокращений...................................... 4

Введение....................................................................... 7

1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Структура и функции эндотелиального гликокаликса системы кровообращения

1.1 Эндотелиальная выстилка сосудов............................................................................12

1.2 Эндотелиальный гликокаликс..........................................................................................14

1.2.1 Визуализация эндотелиального гликокаликса................................................15

1.2.2 Биохимический состав и структура гликокаликса........................................21

1.2.3 Протеогликаны и гликозаминогликаны..................................................................22

1.2.3.1 Мембранные протеогликаны..........................................................................................25

1.2.3.2 Растворимые протеогликаны..........................................................................................28

1.2.4 Гликопротеины..............................................................................................................................28

1.2.5 Общая структура эндотелиального гликокаликса........................................31

1.3 Функции гликокаликса..........................................................................................................33

1-3.1 Эндотелиальный гликокаликс как регулятор сосудистой

проницаемости............................................................... 33

1.3.2 Гликокаликс как сенсор и преобразователь напряжение сдвига кровотока...................................................................... 35

1.3.3 Гликокаликс как регулятор взаимодействий эндотелия и клеток крови........................................................................... 42

1.3.4 Гликокаликс как регулятор микроокружения клеток эндотелия.. 48

1.4 Участие гликокаликса в развитии патологических процессов..... 51

1-5 Регуляция структуры гликокаликса (роль ферментных

производных).................................................................. 55

1.6 Определение цели и постановка задач исследования................ 61

2 ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Флоуметрическое исследование участия эндотелиального гликокаликса в нарушениях микроциркуляции с помощью производных гиалуронидазы и хондроитинсульфата

2.1 Материалы.................................................................... 64

22 Методы........................................................................ 65

3 РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

3.1 Результаты..........................................................................................................................................76

3.2 Обсуждение результатов......................................................................................................93

3.3 Заключение......................................................................................................................................116

ВЫВОДЫ..........................................................................................................................................117

Литература........................................................................................................................................119

Приложение к экспериментальной части..................................137

л

3

Список используемых сокращений

ССЗ сердечно-сосудистые заболевания

ОКС острый коронарный синдром

ИБС ишемическая болезнь сердца

ОИМ острый инфаркт миокарда

STEMI острый инфаркт миокарда с элевацией ST-сегмента на

электрокардиограмме (ST Elevation Myocardial Infarction) 4KB чрескожное коронарное вмешательство

ОЭКТ однофотонная эмиссионная компьютерная томография ПЭТ позитронно-эмиссионная томография

АФК активные формы кислорода АТФ аденозинтрифосфат

АДФ аденозиндифосфат вн-СОД (внеклеточная) супероксиддисмутаза КАТ каталаза

ЭЦМ экстрацеллюлярный (внеклеточный) матрикс ТФ тканевый фактор

PAI-1 ингибитор-1 активатора плазминогена (урокиназы) [plasminogen

activator inhibitor 1] ЭГК эндотелиальный гликокаликс

N0 оксид азота

IL интерлейкин

TNF-a фактор некроза опухолей a (tumor necrosis factor) vWF фактор фон Виллебранда (von Willebrand Factor)

ICAM-1(2) молекула клеточной адгезии 1, 2 (inter-cellular adhesion molecule 1, 2)

VCAM-2 молекула адгезии сосудистых клеток 2 (vascular cell adhesion molecule 2)

(ок.) ЛПНП (окисленные) липопротеины низкой плотности ЛПОНП липопротеины очень низкой плотности ТЭМ трансмиссионная электронная микроскопия

мк-PIV методика прижизненной лазерной анемометрии по изображениям

микрочастиц (intravital microparticle image velocimetry) FITC молекулярный флоуресцентный маркер флуоресцеин изотиоционат

(fluorescein isothiocyanate) CLSM конфокальная лазерная сканирующая микроскопия (confocal laser

scanning microscopy) TPLSM двухфотонная лазерная сканирующая микроскопия (two-photon

laser scanning microscopy) OPS методика ортогональной поляризационной спектроскопии

(orthogonal polarization spectroscopy) SDF методика темнопольной микроскопии (side-stream dark field

imaging) ГАГ гликозаминогликаны

GPI гликозилированный фосфатидилинозитол, выступающий в виде

липидного якоря белковой молекулы eNOS эндотелиальная NO-синтаза

CD44 гликопротеин клеточной поверхности, рецептор гиалуронана RHAMM рецептор опосредованной гиалуронаном клеточной подвижности

(hyaluronan-mediated motility receptor) LYVE-1 рецептор гиалуронана лимфатических сосудов 1 (lymphatic vessel

endothelial hyaluronan receptor 1) ЭПР эндоплазматический ретикулюм

HAS гиалуронан синтаза

PEC AM-1 молекула адгезии тромбоцитов с эндотелием 1 (platelet endothelial

cell adhesion molecule 1) PGI2 простациклин

DPAB плотные периферические полосы актина (dense peripheral actin bands)

PSGL-1 гликопротеиновый лиганд 1 Р-селектина тромбоцитов (P-selectin

glycoprotein ligand-1) CX3CR1 рецептор 1 хемокинов группы СХЗС (СХЗС chemokine receptor 1) FGF фактор роста фибробластов

TGF((31/2) трансформирующий ростовой фактор (transforming growth factor) ((31/2)

VEGF фактор роста эндотелия сосудов (vascular endothelial growth factor) LPS липополисахарид, эндотоксин (lipopolysaccharide)

НАВР гиалуронан-связываюгций белок 2 (hyaluronan binding protein 2) PAR-1,3 активируемый протеиназой рецептор 1,3 (proteinase-activated receptor 1,3)

RhoA малая гуанозинтрифосфатаза (ГТФ-аза) (Ras homolog gene family, member A)

ROCK серин/треонин киназа (Rho-associated, coiled-coil containing protein kinase 1)

TFPI белковый ингибитор тканевого фактора (tissue factor pathway

inhibitor)

Нуal-( 1 -4) гиалуронидаза-( 1 ^4) (hyaluronidase)

PH-20 тестикулярная гиалуронидаза человека, см. SPAM-1

SPAM-1 молекула адгезии сперматозойдов 1, см. PH-20 (sperm adhesion

molecule 1) кДа килоДальтон

ПЦР полимеразная цепная реакция

ВРН-20 бычья тестикулярная гиалуронидаза (bovine testicular hyaluronidase) BVHyal гиалуронидаза яда пчелы (bee venom hyaluronidase) TIM-бочка (З/а-триозофосфатизомеразная бочка ((3/a-triose phosphate isomerase barrel)

ВВЕДЕНИЕ

Сердечно-сосудистые заболевания (ССЗ) являются на сегодняшний день одной из ведущих причин инвалидности и смертности населения развитых стран мира. Необходимость совершенствования существующих и разработки новых средств лечения ССЗ требует изучения факторов риска, развития стратегий диагностики и профилактики, фармакологических и хирургических методов [1]. Важной целью подобных разработок является устранение последствий острого коронарного синдрома (ОКС), частного случая прогрессирующей ишемической болезни сердца (ИБС). ОКС, представленный нестабильной стенокардией, острым мелкоочаговым и трансмуральным инфарктом миокарда (ОИМ), внезапной сердечной смертью, доминирует по частоте распространения и количеству неблагоприятных исходов [2]. Большое внимание клиницистов сосредотачивается на ОИМ с подъемом БТ-сегмента (8ТЕМ!) и другом остром состоянии, внезапной сердечной смерти, из-за быстроты протекания этих патологических процессов и высокого уровня смертности [2, 3].

Острое критическое состояние может быть вызвано закупоркой коронарной артерии в результате: разрыва воспаленной бляшки с дальнейшей окклюзией просвета коронарной артерии тромбом (атеротромбоз); сужения просвета коронарной артерии при атеросклеротическом поражении (стеноз); или из-за внезапного увеличения нагрузки на миокард [4]. Это приводит к несоответствию потребности кардиомиоцитов в кислороде и нутриентах с пропускной способностью пораженной коронарной артерии и, как следствие, нарушению сократительной способности кардиомиоцитов и метаболизма миокарда с последующим развитием некроза этой ткани. Размер инфаркта служит первичным определяющим критерием прогноза выживаемости больного. Восстановление коронарного кровотока - реперфузия - за кратчайшие сроки с момента возникновения ОКС позволяет сократить зону инфаркта, восстановить (пусть и с некоторыми компенсаторными издержками) сократительную способность кардиомиоцитов, снизить возможность появления

осложнений и наступления летального исхода. Таким образом, целью проводимой реперфузионной терапии является скорейшее восстановление кровоснабжения для исключения возможности формирования застойных зон в системе циркуляции и расширения областей миокардиального некроза.

Современная реперфузионная терапия ОКС заключается в восстановлении коронарного кровотока с помощью фармакологических и интервенционных подходов. Помимо этого в настоящий момент формируется несколько альтернативных методик терапии ОКС, таких как терапевтический ангиогенез и терапия стволовыми клетками [5, 6]. Фармакологические стратегии реканализации коронарной артерии заключаются в проведении тромболизиса препаратами на основе активаторов плазминогена тканевого и урокиназного типа, стрептокиназой с последующим поддержанием целевого состояния при помощи различных классов антитромботических препаратов [7]. Из интервенциальных подходов наиболее широкое распространение сегодня получил набор процедур чрескожных коронарных вмешательств (ЧКВ) [8]. К ЧКВ, в основе которых лежат подходы, направленные на увеличение просвета стенозированной артерии с помощью введенного через сосуд катетера, относятся процедуры баллонной ангиопластики и установки стентов, в том числе с лекарственным покрытием. Сочетание ЧКВ с фармакологическими средствами (фракционированные гепарины, ингибиторы мембранных гликопротеинов ПЬ/Ша тромбоцитов, тромболитики) может улучшать результаты вмешательства. Благодаря этим подходам успешная реваскуляризация коронарной артерии может быть достигнута более чем в 90% случаев проведения ЧКВ.

Успешное использование стратегий экстренной реперфузионной терапии за последние десятилетия сформировали так называемую «концепцию открытой артерии» [9]. Согласно ей своевременное восстановление требуемой проходимости инфарктсвязанной артерии сохраняет целостность миокарда и моторную функцию желудочков сердца, что определяет благоприятный

клинический исход. При этом для максимального сокращения размера зоны некроза необходимо как можно раньше провести требуемые терапевтические процедуры. Тем не менее, очевидные положения этой концепции в ряде случаев не подтверждаются в клинической практике [10, 11]. Современная реперфузионная терапия способна ограничивать размер ОИМ примерно на 50% у половины пациентов, тогда как для четверти пациентов из общего числа размер обратимого поражения составляет более 75%. Стоит отметить, что вышеуказанные подходы в большинстве случаев хорошо подходят пациентам со сравнительно небольшим размером обратимого поражения миокарда (менее 20% левого желудочка), но не всегда эффективны в случае больных с большими размерами обратимого поражения [1]. В этих случаях проводимая терапия не достигает восстановления функции поврежденного миокарда и сопровождается значительным развитием сопутствующих осложнений, обусловленных реперфузионным поражением и нарушениями микроциркуляции. Необходимость поиска дополнительных методов терапии этих осложнений была показана с помощью методов электрокардиографии, эхокардиографии, магнитно-резонансной и позитронно-эмиссионной томографии (МРТ и ПЭТ), ангиографии с использованием полуколичественной классификации уровня микроциркуляторной перфузии, допплерографии [7, 12, 13]. Реальное функциональное восстановление миокарда наблюдается при достижении адекватного восстановления тканевой перфузии зоны инфаркта. За прошедшее десятилетие была пересмотрена концепция открытой артерии с созданием концепции оптимальной реперфузии [9, 14]. Согласно ей реперфузионная терапия должна наряду с достаточной реканализацией коронарной артерии обеспечивать адекватное восстановление перфузии на уровне системы микроциркуляции. Последняя представляет собой значительную долю системы кровообращения, реализующую доставку циркулирующей крови и обмен кислородом, нутриентами и метаболитами жизнедеятельности к клеткам органов и тканей организма [15]. Нарушения ее

функций могут быть вызваны рядом патологических процессов, таких как сепсис, гиповолюмический и кардиогенный шок [16]. Кроме того, причиной развития микроциркуляторных нарушений может выступать развитие явления по-гейош [17-21]. Таким образом, устранение нарушений микроциркуляции становится значимой целью при терапии тяжелых случаев ОКС.

Существующие на текущий момент представления о молекулярных и клеточных механизмах по-гейо\¥ игнорируют роль одного из его возможных участников. Им является белково-углеводная выстилка клеток сосудистого эндотелия, называемая гликокаликсом (далее ЭГК, эндотелиальный гликокаликс). Учитывая повсеместную распространенность этой структуры, ее размеры и биологические функции (которые, к слову, мало учитывается при изучении процессов функционирования системы микроциркуляции), она не может быть не задействована в явлении по-геАо\¥.

Целью настоящего исследования стало определение участия эндотелиального гликокаликса в развитии постишемических нарушений системы микроциркуляции. Для достижения поставленной цели мы использовали подход, основывающийся на применении участвующих в катаболизме гликокаликса ферментных препаратов. Известно, что структура гликокаликса определяется группой протеогликанов, гликопротеинов и гликоз-аминогликанов эндотелия, и белков кровотока [22]. Благодаря своим свойствам, гликокаликс принимает участие в ряде функций, поддерживающих метаболизм системы кровообращения. В условиях патологии происходит полная или частичная утрата этой структуры, что приводит к нарушению целостности сосудистой стенки и изменению ее функций. Группа гликозидазных ферментов принимает участие в катаболизме гликозаминогликанов ЭГК, в результате чего они становятся эффективным инструментом для исследования функции гликокаликса в норме и патологии. Функционирование этих ферментов происходит в условиях сахаридного микроокружения (сахариды кровотока; гликозаминогликаны гликокаликса и их фрагменты), регулирующего их

структуру и специфические активности. При этом ковалентная модификация структуры белков (в том числе и гликозидаз, участвующих в катаболизме гликокаликса) альдоспиртами (процесс, известный как гликирование), а также образование электростатических комплексов с блокированием активного центра биокатализатора приводит к значительной инактивации ферментов [23]. Поэтому исследование взаимодействия гликозидазных ферментов с гликирующими агентами различной природы актуальны для изучения состояния ЭГК в условиях модельной патологии. Данный подход может быть полезен для разработки терапевтических средств лечения заболеваний, связанных с нарушением функционирования системы микроциркуляции.

Таким образом, были определены основные направления исследования: 1) разработка гиалуронидазного теста участия ЭГК микроциркуляции в развитии микрососудистых поражений при ишемии/реперфузии; 2) тестирование предложенных ферментных соединений на модели ишемии/реперфузии задней конечности крысы.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Структура и функции эндотелиального гликокаликса системы кровообращения

1.1. Эндотелиальная выстилка сосудов

Эндотелий представляет собой клеточный слой, выстилающий внутреннюю поверхность кровеносных и лимфатических сосудов и полостей сердца. [24]. Этот слой обладает целым комплексом специфических функций. Основными являются: транспортная (или барьерная) функция, функции регуляции тонуса сосуда путем синтеза и секреции набора вазотонических соединений, участия в иммунной защите и регуляции воспаления, гемостаза и ангиогенеза. По своей структуре эндотелиальная выстилка неоднородна и специфична для определенных тканей [25]. Так, в головном мозге эндотелиальные клетки плотно сомкнуты между собой для обеспечения целостности гематоэнцефалического барьера. Напротив, в сосудах почек, кишечника и печени слой эндотелия имеет структуру, обеспечивающую непрерывный обмен разнообразными метаболитами. Помимо структурного различия, эндотелиальные клетки сосудов различных тканей способны секретировать или экспонировать на своей поверхности специфические молекулы адгезии, цитокины и ферменты (например, эндотелиоциты почечных сосудов экспрессируют активатор плазминогена урокиназного типа). Эндотелий гетерогенен не только в специализированных тканях, но и в различных сегментах микроциркуляторного русла: артериолах, капиллярах и венулах. Характер структуры и метаболизма типов эндотелия зависит в первую очере�