Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Состояние системы свертывания крови при хроническом описторхозе в условиях эндогенной и экзогенной тромбинемии

ВАК РФ 03.03.01, Физиология

Автореферат диссертации по теме "Состояние системы свертывания крови при хроническом описторхозе в условиях эндогенной и экзогенной тромбинемии"

005014615

На правах рукописи

Зиновьева Альбина Валерьевна

Состояние системы свертывания крови при хроническом опнсторхозе в условиях эндогенной и экзогенной тромбинемии

03.03.01 - Физиология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

1 5 МДР 2012

Челябинск-2012

005014615

Работа выполнена в Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования Ханты-Мансийского автономного округа -Югры «Ханты-Мансийская государственная медицинская академия»

Научный руководитель:

доктор медицинских наук Соловьев Владимир Георгиевич Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор, декан факультета экологии ФГБОУ ВПО «Челябинский государственный университет» - Лихачев Сергей Федорович

доктор биологических наук, доцент кафедры аналитической и биологической химии ГБОУ ВПО «Тюменская государственная медицинская академия» Миниздравсоцразвития России - Шаповалова Елена Михайловна

Ведущая оргапшация:

ФГАОУ ВПО «Северный (Арктический) федеральный университет имени М.В. Ломоносова», Институт медико-биологических исследований, г. Архангельск

Защита состоится 5апреля 2012 года в 14.00 часов на заседании диссертационного совета Д212.295.03 при ФГБОУ ВГ10 «Челябинский государственный педагогический университет» по адресу: 454080, г. Челябинск, пр. Ленина, 69, ауд. 116.

С диссертацией можно ознакомиться в читальном зале библиотеки ФГБОУ ВПО «Челябинский государственный педагогический университет»

Автореферат разослан « £»ащМТвшг г.

Ученый секретарь

диссертационного совета С') Байгужин П.А.

кандидат биологических наук " ./

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Изменение интенсивности непрерывно протекающего свертывания крови сопровождает большинство физиологических и патологических состояний, вызываемых реакцией напряжения (Альфонсова Е.В., Забродина Л.А., Бочарникова Н.В., 2011; Вавилова Т.В., Авдушкина Л.А., Зыбина И.Н. 2011; Захарова' И.О.! Брылякова С.Н., Николаева A.B., 2011; Усынин В.В., Карелова Н.Ю.' Плинокосова Л.А. с соавт., 2011; Rosencher N., 2011; Kontush А., 2011).

Не являются исключением в этом смысле и паразитарные заболевания Среди прочих биогельминтозов, в связи с достаточно высокой распространенностью, особое место занимает описторхоз - природно-очаговое заболевание, впервые описанное в конце XIX века (Виноградов К.Н.,1891; Rivolta S., 1884). Среди регионов Российской федерации крупнейшим очагом описторхоза является территория Ханты-Мансийского автономного округа - Югры, в отдельных районах которого экстенсивность инвазии населения составляет более 85%, а заболеваемость превышает среднефедеральный уровень более чем в 30 раз (Зеля О.П., Завойкин В.Д. , Сергеева М.Н., 1990; Зуевский В.П. с соавт.,2008; Зуевская Т.В., 2008).

О неблагоприятном влиянии описторхозной инвазии на организм хозяина свидетельствует достаточное количество научных фактов, однако важность дальнейшего изучения обозначенной проблемы определяется значением описторхоза как «фонового» заболевания. Описторхоз изменяет течение ряда патологических процессов (Бычков В.Г., Крылов ГГ., 2007; Вакулина О.Э., Хадиева Е.Д., 2011; Mordvinov V.A., 2011; Solov'eva O.G.' 2011), сопровождающихся, помимо прочего, ускорением непрерывно протекающего свертывания крови. При этом очевидно, что от суммации эффектов, вызываемых основной и «фоновой» (описторхоз) патологиями в отношении компонентов гемостаза зависит вероятность развития тромбогеморрагических осложнений, связанных с потреблением факторов свертывания и тромбоцитов, активацией фибринолиза, микротромбообразованием, дисфункцией органов и тканей («диссемшшрованное внутрисосудистое свертывание крови»).

Вместе с тем, в доступной литературе практически отсутствуют сведения о состоянии гемостаза при описторхозной инвазии, а единичные сообщения по данной тематике весьма противоречивы и касаются аспектов регуляции агрегатного состояния крови лишь косвенно (Гиновкер А.Г., Галян С.Л., 1982; Ободчук Г.С., Молокова O.A., 1987; Соловьева A.B., 2007).'

Принимая во внимание скудность литературных данных по обозначенной проблеме, а, также учитывая тот факт, что apriori существует множество реальных предпосылок для интенсификации гемостатических реакций в условиях описторхозной инвазии, нам представлялось актуальным ответить на вопрос: какова направленность влияния хронического

описторхоза на состояние различных компонентов гемостаза, и как это сказывается на их способности к адекватному ответу в условиях экспериментальной гипертромбинемии.

Цель работы: Оценка состояния системы внутрисосудистого свертывания крови и отдельных компонентов гемостаза при хроническом описторхозе в условиях эндогенной и экзогенной тромбинемии.

Для достижения поставленной цели были определены следующие задачи:

1. Произвести оценку состояния тромбоцитарного и коагуляционного гемостаза при хроническом описторхозе, воспроизводимом в экспериментальных условиях путем однократного заражения золотистых сирийских хомячков в количестве 25, 50 и 100 метацеркариев на одпо животное.

2. Охарактеризовать тромбопластическую активность циркулирующих надмолекулярных образований плазмы крови и внутренних органов, содержание маркеров внутрисосудистого свертывания и состояние микроциркуляторного русла на фоне хронического описторхоза.

3. Проанализировать влияние хронического описторхоза па состояние тромбоцитарного и коагуляционного звеньев гемостаза при экзогенной и эндогенной тромбинемиях.

4. Оценил, состояние противосвертываклцего потенциала эндотелия сосудов на фоне хронического описторхоза.

Научная новизна

Экспериментальными исследованиями впервые установлено, что хронический описторхоз вызывает ускорение непрерывно протекающего свертывания крови, проявляющееся активацией тромбоцитов и гиперкоагуляционными сдвигами разной степени выраженности в зависимости от объема инвазии.

Установлено, что интенсификация тромбиногенеза при хроническом описторхозе инициируется поступлением в кровоток тромбопластических субстанций, сопровождается гипофибриногенемией, возрастанием содержания продуктов паракоагуляции, уменьшением тромбопластической активности паренхиматозных органов, снижением противосвертывающего потенциала эндотелия сосудов и морфологическими признаками нарушения микроциркуляции в группах сравнения ОП-25, ОП-50 и ОП-ЮО (р<0.05).

Впервые показано, что при экспериментальной гипертромбинемии различного генеза, на фоне хронического описторхоза снижается толерантность животных к тромбину, увеличивается степень активации/потребления тромбоцитов и факторов плазмокоагуляции, а также замедляется нормализация параметров свертывания крови в динамике.

Теоретическая и практическая значимость работы

Полученные данные расширяют фундаментальные представления о биологических эффектах возбудителя описторхоза на организм

окончательного хозяина, в частности, его влияпии на различные компоненты гемостаза в норме и при активации свертывания крови. Результаты исследования мшут быть использованы научно-исследовательскими учреждениями при разработке программы мониторинга состояния гемостаза у лиц, больных хроническим описторхозом с сочетанной патологией с целью проведения своевременных мероприятий по профилактике тромбогеморрагических осложнений в клинической практике.

Внедрение результатов работы. Результаты исследования используются доя подготовки студентов по специальности «Лечебное дело» в рамках дисциплин «Биохимия», «Физиология» на кафедрах медицинской и биологической химии, нормальной и патологической физиологии Ханты-Мансийской государственной медицинской академии, в учебном процессе кафедры клинической лабораторной диагностики Хабаровского Краевого государственного института повышения квалификации специалистов здравоохранения на циклах профессиональной переподготовки и общего усовершенствования врачей клинической лабораторной диагностики.

Работа выполнена на базе кафедры медицинской и биологической химии Ханты-Мансийской государственной медицинской академии в рамках научной программы «Механизмы адаптации и гомеосгаза у человека в норме и при 08367)™ В УСЛ°БИЯХ северных территорий» (регистрационный номер 01.2.007

Положения, выносимые на защиту:

1. Хронический оиисторхоз сопровождается активацией тромбоцигарного гемостаза и гиперкоагуляционными сдвигами разной степени выраженности в зависимости от величины инвазии, вызывая в целом ускорение непрерывно протекающего свертывания крови.

2. Ускорение непрерывно протекающего свертывания крови при хроническом ошеторхозе инициируется поступлением в кровоток тромбопластических субстанций, сопровождается уменьшением плазменного содержания фибриногена, приростом концентрации продуктов паракоагуляции, уменьшением прокоагулянтной активности паренхиматозных органов, ослаблением антикоагулянтного потенциала эндотелия сосудов и морфологическими признаками нарушения микроциркуляции.

3. На фоне хронического описторхоза уменьшается толерантность к тромбину, что представляет собой потенциальную угрозу развития тромбогеморрагических осложнений в условиях дополнительного поступления в кровоток факторов, активирующих свертывание крови.

Апробация и публикации. Основные положения диссертационной работа доложены на XIV международном симпозиуме «Эколого-физиологические проблемы адаптации» (г. Москва, 2009), Российской

конференции, посвященной 80-летшо со дня рождения Р.И.Лифшица «Актуальные проблемы теоретической и прикладной биохимии» (г. Челябинск, 2009), XI Региональной конференции молодых ученых, специалистов и студентов «Актуальные проблемы теоретической и клинической медицины» (г. Ханты-Мансийск, 2009), международной научно-практической конференции «Здоровье в XXI веке - 2011» (г. Тула, 2010), пятой всероссийской конференции «Клиническая гемостазиология и гемореология в сердечно-сосудистой хирургии» (г. Москва, 2011), III Эмбриологическом симпозиуме Всероссийского научного медицинского общества анатомов, гистологов, эмбриологов «ЮГРА-ЭМБРИО-2011» (г. Ханты-Мансийск, 2011).

Результаты исследований опубликованы в материалах перечисленных научных форумов, в виде главы монографии «Хирургические осложнения описторхоза», в медико-биологических журналах (всего 12 публикаций, из них 4 в журналах рекомендованных ВАК РФ).

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 107 страницах, содержит 12 таблиц и 23 рисунка, состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследований, главы собственных результатов исследований, их обсуждения, выводов, а также списка использованных источников литературы (148 отечественных и 53 иностранных).

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы исследований. Модель хронической формы описторхоза воспроизводили на 792 самцах золотистых хомячков (МезоспсеНш аигаШв) 4-месячного возраста, массой тела 100-120 г, полученных из питомника «Пущино» Института биологической химии РАН им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова (г. Пущино Московской обл.). Среди прочих лабораторных животных хомячки отличаются наиболее высокой восприимчивостью к инвазированию о. Ге1теиз.

Животные содержались в стандартных условиях вивария на смешанном сбалансированном рационе питания с оптимальным соотношением белков, жиров и углеводов (Шпанов Н.Ю., Колтьппев А.Ф., Шаламова Е.Ю., 2002). Число хомячков в каждой группе сравнения составляло по 12 животных. Учитывая сезонные сдвиги гемостаза и его зависимость от метеофакторов, в каждую серию экспериментов включали контрольную группу интактных животных (контрольная 1руппа).

Воспроизведение модели хронического описторхоза. Для создания модели хронического описторхоза из мышечной ткани пораженной рыбы выделяли жизнеспособных метацеркарий оМтеиз согласно методике Г.А. Глазкова (1977). Заражение сирийских хомячков производили в количестве -25, 50 и 100 метацеркариев на одну особь (м/о). Через три месяца (90 сут)

после заражения у всех животных, подвергавшихся дополнительным воздействиям, а также у интакгаых (контроль) осуществляли забор крови из яремной вены.

Эвтаназию всех используемых в экспериментах животных производили под эфирным наркозом, забор крови осуществляли в шприц из обнаженной овальным разрезом яремной вены. Кровь для коахулологических исследований стабилизировали 3,8% раствором цитрата натрия в соотношении 1:9, а также 0,125% забуференным раствором глутаралвдсгида (для исследования морфологии тромбоцитов).

Экспериментальные модели. Экзогенную тромбипемию вызывали внутривенным введением в яремную вену взвеси тканевого факгора (TF) в дозах, не вызывающих гибель животных (1,5 мг/100 г массы тела, активность lie). Пробы крови отбирали через 0,5; 1; 3 и 6 ч после воздействия

Необратимая окклюзионная ишемия (эндогенная тромбинемия) моделировалась путем перевязки одной из яремных вен с забором крови из симметричной вены через 4 мин.

Обратимую оюслюзионную ишемию для оценки функционального состояния сосудистой стенки воспроизводили согласно рекомендациям (Полякова H.A., Дранишников Н.В., Власов Т.Д., 2004), вызывая дозированное «давление магистрального сосуда. Забор крови производили аналогичным способом.

Лабораторные методы исследования. Состояние параметров коагуляционного гемостаза (тромбопластиновое время, громбиновое время активированное частичное тромбопластиновое время (АЧТВ), содержание фибриногена) и активность плазменных факторов свертывания II VII X оценивали на коагулографе «Cormay» (Польша), определение активности антитромбина-Ш и растворимых комплексов мономерного фибрина осуществляли с помощью наборов фирмы «Технология-стандарт» (г Барнаул).

Количество тромбоцитов определяли с помощью прямой микроскопии в камере Горяева (Шишкова A.C., 1981, 2000). Для оценки функционального состояния тромбоцитов изучали: содержание дискоцитов суммы активированных форм и сфероцигов (в абсолютных и относительных значениях); количество малых (2-3 тромбоцита) и больших (4-5 тромбоцитов) агрегатов на общее количество клеток.

Гемокоагуляционную активность надмолекулярных частиц плазмы крови и гомогенатов органов оценивали с использованием ультрацентрифугирования согласно рекомендациям Е.В. Платонова (1990) и А.Ш. Бышевского (1996).

Толерантность к тромбину оценивали по степени уменьшения количества содержания фибриногена через 30 мин после инъекции в кровь прокоагулянта (тканевой фактор) (Бышевский А.Ш., Михайлова Л В Алборов Р.Г., 2003).

Трансмиссионная электронная микроскопия выполнялась на микроскопе LEO - 912 АВ (Zeiss) в патологоанатомическом отделении Ханты-Мансийской окружной клинической больницы.

Результаты исследований, имеющие цифровое выражение, анализировали методом вариационной статистики для малых рядов наблюдений с использованием программы Microsoft Excel, вычисляя среднюю арифметическую (М), среднюю ошибку средней арифметической (ш) и среднеквадратичное отклонение (о). Для оценки достоверности отличий вычисляли доверительный коэффициент Стьюдента (t) и степень вероятности (р). Различия считали достоверными при значениях степени вероятности р<0,05 (Гельман В.Я., 2001).

Результаты исследований и их обсуждение

Состояние тромбоцитарного и коагуляционного гемостаза, тромбопластическая активность надмолекулярных образований плазмы крови и тканей внутрештх органов на фоне хронического описторхоза.

Хронический описторхоз, вызванный инвазией паразита (o.filineus) в количестве 25 метацеркариев на одну особь (м/о), через 90 сут проявился ускорением непрерывно протекающего свертывания крови.

Со стороны тромбоцитарного звена наблюдался прирост как абсолютного, так и относительного количества активированных форм тромбоцитов. Особенно существенно (в 3 раза) увеличилось содержание рефрактерных клеток - сфероцитов на фоне снижения количества дискоцитов.

Об активации коагуляционного гемостаза свидетельствовали следующие показатели: укорочение АЧТВ (на 22,8%) и тромбинового времени (на 11,9%). Наряду с этим, концентрация фибриногена уменьшилась на 50%, а содержание растворимых комплексов мономерного фибрина (РКМФ) возросло на 16,2%.

Инвазия в количестве 50 м/о также способствовала активации гемостаза

- наблюдался, прирост содержания активированных. тромбоцитов на фоне снижения относительного уровня дискоцитов. В' условиях отсутствия существенных изменений: общих коагуляционных показателей (АЧТВ, ТПВ, ТВ), выявлялась гипофибриногенемия и увеличение концентрации продуктов паракоагуляции.

Наиболее выраженные сдвиги обнаружились у животных, подвергнувшихся инвазии в количестве 100 м/о (табл. 1). На 25,4% уменьшилось содержание тромбоцитов, абсолютное количество дискоцитов снизилось в 1,8 раза, а их доля от общего числа циркулирующих клеток - на 16,1%. Возросло относительное количество активированных форм. Достоин внимания тот факт, что подавляющее их большинство составляли сфероциты

- 43,2%, относительное содержание которых увеличилось в 7,6 раза, а

абсолютный прирост (даже с учетом тромбоцитопешга) составил 58,9%. Об активации тромбоцитарпого звена свидетельствовало и большее количество тромбоцигарных агрегатов.

Таблица 1

Состояние тромбоцитарпого гемостаза и плазмокоагуляции на фопе хронического описторхоза (ннвазия в количестве 100 м/о) М ± tn_

Исследуемые показатели Группы животных (п = 12)

Контроль (интактные) Описторхоз -100

Количество Тц, Ю'/л 929,0±31,0 693,0±27,0*

Дискоциты, % 59,3±0,7 43,2¿0,8*

Дискоциты, 10'7л 550,9±18,6 299,3±11.2*

АФ, % 40,7±0,7 56,8±0,8*

АФ, 107л 387,1±12,3 393,б±13

Сфероциты, % 5,7±1,2 43,2±0,8*

Сфероциты, 10*/л 53,0±9,1 84,2±8,1*

МА /общее число клеток 1,3±0,1 2,0±0.3*

БА / общее число клеток 1,2±0,1 3,2±0,2*

АЧТВ, с 37,3±0,9 30,7±0,8*

ТПВ, с 12,5±0,5 12,1 ±0,2

ТВ, с 16,0±0,5 13,7±0,1*

AT- III, % 88,3±2,6 93,4±3,5

ФГ, г/л 1,20±0,15 0,50±0,04*

РКМФ, мг/% 3,08±0,0б 4,75¿0,19*

Ф. II, % 100,0±4,8 121,5±12,1*

Ф. VII, % 100,0±5,2 99,3±12,0

Ф. X, % 100,0±11,2 95,7±10,3

Примечание: В этой и последующей таблице (3) Тц - тромбоциты, АФ - активированные формы, МА - малые агрегегаты, БА - большие агрегаты, АЧТВ - активированное частичное тромбопластиновое время, ТПВ - тромбопластиновое время, ТВ - тромбиновое время, AT-IH - антитромбин-III, ФГ - фибриноген, РКМФ - растворимые комплексы мономерного фибрина, фф. II, VII, X - факторы плазмокоагуляции. * уровень достоверности р<0,05 по сравнению с контрольной группой

Изучение параметров плазмокоагуляции позволило выявить признаки активации тромбиногенеза (укорочение АЧТВ - на 17,7%, тромбинового времени - 14,4%, снижение концентрации фибриногена - более чем в 2 раза, прирост содержания РКМФ - на 54,2%).

Таким образом, хронический описторхоз способствует ускорению непрерывно протекающего свертывания крови. Степень изменения параметров гемостаза отличается при этом в зависимости от дозы инвазии, и имеет в целом следующую направленность: сдвиги плазмокоагуляции характеризуются интенсификацией тромбиногенеза, гипофибриногенемией, приростом содержания РКМФ на фоне отсу тствия потребления II, VII и X факторов свертывания. Возрастает содержание активированных форм тромбоцитов (особенно выраженно - сфероцитов), а также уменьшается

количество дискоцитов, на фоне незначительного снижения общего числа кровяных пластинок.

Выявленные изменения свидетельствуют, с одной стороны, о напряжении гемостаза, повышении функционального потенциала и расходовании его клеточных и молекулярных ресурсов, а с другой -позволяет предполагать тот факг, что в кровотоке животных, подвергнувшихся инвазии, присутствует большее количество тромбоцитактивирующих и прокоагулянтных эффекторов. Как известно, в условиях нормокоагулемии, степень активации тромбоцитов зависит от динамических изменений содержания тромбина, важнейшим индуктором образования которого является поступление в кровоток тромбопластических субстанций (Зубаиров Д.М., Зубаирова Л.Д., 2009).

В связи с этим, для решения второй задачи необходимо было выяснить: меняется ли на фоне хронического описторхоза тромбопластическая активность циркулирующих в плазме крови надмолекулярных фрагментов, представляющих собой сумму носителей активности ТТ и фактора Р3 (т.н. «неполный тромбо пластин»).

Результаты исследований (рис. 1) показали, что у животных, подвергнутых инвазии, суммарная тромбопластическая активность плазмы крови выше, чем в контроле, При этом возрастание тромбодластической активности наблюдалось в ряд}' исследуемых групп «Описторхоз-25» —► «0писторхоз-50» —► «Описторхоз-ЮО», т.е., пропорционально увеличению степени инвазии. Из этого следует, что при хроническом описторхозе ускоряются процессы, приводящие к поступлению в кровоток надмолекулярных фрагментов, связанных непосредственно или косвенно с жизнедеятельностью паразитов и обладающих прокоагулянтной активностью.

Рис. 1. Суммарная тромбопластическая активность фрагментов клеточных мембран циркулирующих в плазме крови на фоне хронического описторхоза (* - уровень ' достоверности по сравнению с контрольной группой, рО,05).

Известно, что одним из возможных источников тромбошгастических субстанций, появляющихся в циркуляторном русле, являются ткани паренхиматозных органов (Байкеев Р.Ф.,1994).

В связи с этим, следующим фрагментом нашего исследования явилось изучение тромбопластической активности (ТПА) тканей легких, печени почек и кишечника у животных, подвергшихся описторхозной инвазии.

Как следует из данных таблицы 2, в целом общая тромбопластическая активность тканей внутренних органов снижалась, причем строгой зависимости между степенью ее уменьшения и дозой инвазии не наблюдалось. Наибольшие сдвиги обнаружились со стороны тканей тонкого кишечника, затем - легких и печени, а в почках ТПА практически не изменялась по сравнению с контролем. Это свидетельствует о том, что при описторхозе происходит перераспределение локализации субстанций обладающих тромбопластической активностью. Об этом свидетельствует рост ТПА в плазме крови и снижение ее - во внутренних органах. Именно повышение тромбопластинемии, является одним из причинных факторов приводящих к активации коагуляциопного и тромбоцитарного звеньев гемостаза.

Таблица 2

1 ромоопластическая активность тканей органов животных (ЕА/г) на фоне хронического описторхоза (инвазия в дозе 25,50 и 100 м/о) М ± ш

исследуемые -------г-_Группы животных, п = 12

ткани

Печень

Кишечник

Почки

Лёгкие

Примечание: контролем

Интакгные (контроль)

13200±550

11300±410

17200+930

20500±1300

Опытные

ОП-25

9790±440*

6200±290*

17900±800

19360±1100

ОП - 50

11350±610* 5450±255*

15150±510*

10530±690*

ОП-ЮО

11280±660*

8650±290*

16100±500

16100±1050*

уровень достоверности р<0,05 каждой опытной группы по сравнению с

Доказано, что нахождение в кровотоке избыточного количества тромбопласгических субстанций обусловлено нарушением гемореологии микроциркулягорного русла (Зубаирова Л.Д., 2007; Ьиуепс1ук I, I, К1етеп1 Р. е1 а1., 2007). В особеиности это касается ткани легкого - органа' являющегося своеобразной «ловушкой» тромбопластинов, а в случае с описторхозом - еще и метаболитов жизнедеятельности гельминтов, экскретируемых ими в кровоток.

В заключительной серии опытов данного этапа исследований мы изучили состояние микроциркулягорного русла легких в условиях хронического описторхоза.

Электронно-микроскопическая картина свидетельствовала о поражении всех компонентов аэрогематического барьера. Морфологические преобразования носили характер точечных' локальных нарушений, охватывающих, различные регионы респираторного отдела легких. Развитие патологического процесса в очагах поражения, прежде всего, характеризовалось нарушениями микроциркуляторного русла, что проявлялось повышенным кровенаполнением сосудов, вакуолизацией цитоплазмы эвдотелиоцитов, стазом и агрегацией эритроцитов, их адгезией к эвдотелиальной выстилке. В дальнейшем эндотелиоциты набухали, наблюдалась гомогенизация их цитоплазмы, исчезали щггоплазматические выросты и инвагинаты, а также компоненты везикулярного транспорта. Клетки эндотелия подвергались некрозу, что создавало благоприятный фон для последующего формирования микротромбов. Обозначенные изменения микропиркуляции сопровождались нарушением эпителиальной выстилки альвеол. Одновременно с этим выявлялись признаки разрушения сурфакганта и его элиминации в просвет альвеол, деструкции пневмоцитов (респираторных альвеолоцитов), разрушения базалыюй пластинки, цитоплазматических органелл, склерозирования интерстиция альвеол.

Таким образом, формирующиеся во время хронизации описторхозиой инвазии гиперкоагуляционные сдвиги, являются одним из важнейших патогенетических звеньев нарушения микроциркуляции, а в дальнейшем -альтерации структурных компонентов паренхиматозных органов, которые не являются естественной эконишей для гельминтов.

Динамика изменений гемостаза у животных, подвергавшихся экзогенной тромбннемии на фоне хронического описторхоза

"' Известно, что эффект патогенных факторов на биологические системы

организма наиболее выражено проявляется в условиях реакций напряжения. Исходя их этой предпосылки, в следующей серии исследований мы изучали состояние гемостаза на фоне описторхоза в условиях экзогенной тромбинемии.

Введение тканевого тромбопластина контрольным животным уже к 0,5 ч привело к коагулопатии потребления, а именно: в 2 раза удлинились тромбопластиновое и тромбиновое время, в такой же степени уменьшился уровень фибриногена, увеличилось в 2,5 раза содержание РКМФ, уменьшилось на 31% содержание тромбоцитов. Эти изменения свидетельствовали об активации клеточного звена гемостаза. Среди циркулирующих клеток преобладали активированные формы, относительное содержание которых выросло на 77,9%. Спустя 1 ч выраженность гипокоагулемии была более замеггной и характеризовалась удлинением АЧТВ и тромбинового времени, выраженным снижением содержания фибриногена и возрастанием уровня продуктов паракоагуляции. Общее содержание тромбоцитов возвратилось к исходному значению, но

относительное и абсолютное содержание их активированных форм оставалось высоким. К 3 ч исследования степень гипокоагулемии ослаблялась, но, по-прежнему, отмечался дисбаланс между относительным содержанием дискоцитов и активированных форм в пользу преобладания последних. Лишь к 6 ч наблюдения значения почти всех изучаемых показателей крови возвращались к исходному уровню.

Реакция на введение тромбопластина животных с описторхозной инвазией выглядела иначе. Так, у животных с минимальным объемом инвазии (25 м/о) тромбинемия вызвала коагулопатию и тромбоцитопению потребления более выраженную, чем в группе сравнения. Через 0,5 ч после воздействия общее содержание тромбоцитов оказалось меньше, чем в контроле на 19,6%, абсолютное содержание дискоцитов - на 37,5%, а относительное содержание активированных форм больше на 8,3%. В динамике восстановление параметров клеточного гемостаза до исходных величин заметно отставало от такового в группе контроля. Более того, к 6 ч исследования сохранялся тромбоцитоз и повышенное содержание активированных форм. В ускоренном темпе развивались и гипокоагулемические нарушения. Через 0,5 ч АЧТВ возрасло на 18,8% и оставалось повышенным (как и тромбиновое время) до завершения эксперимента. Это сопровождалось выраженной гипофибриногенемией, а именно:, содержание коагулирующего белка оказалось ниже, чем контроле в 2,2 (спустя - 0,5 ч) и 1,7 раза (спустя 1ч), уровень РКМФ превосходил таковые показатели группы сравнения в течение всего периода исследовании.

Еще более выраженные сдвиги тромбинемия вызвала у животных при инвазии в количестве - 50 м/о. Общее количество, тромбоцитов через 0,5 ч после воздействия уменьшилось в 2,3 раза (для сравнения: в контроле - в 1,4 раза), абсолютное содержание дискоцитов - в 6,8 раз (соответственно, в 3,1 раза). Доля активированных клеток на этом сроке исследования (и в дальнейшем) достоверно превосходила таковой показатель контрольной группы. Гипокоагулемические сдвиги носили более выраженный характер, чем у контрольных лшвотных. Об этом свидетельствовали показатели АЧТВ (на всех сроках наблюдения) и ТПВ (1,3 и 6 ч после введения).

Обращает на себя внимание тот факт, что даже к 6 ч наблюдения величины всех клоттинговых тестов не достигали исходных значений. Степень потребления фибриногена на ранних сроках исследования (0,5 и 1 ч) превосходила таковую в контрольной группе, далее его уровень компенсаторно возрастал. Об ускорении непрерывно протекающего свертывания крови также свидетельствовал и устойчивый прирост содержания РКМФ.

Наибольшие сдвиги экзогенная тромбинемия вызвала у животных с максимальной степенью инвазии (100 м/о). Содержание тромбоцитов на пике потребления (0,5 ч) снизилось в 2,2 раза, и составило лишь 49% от такого

показателя в контроле (табл. 3). В дальнейшем количество тромбоцитов возрастало и оставалось таковым к 6 ч. Относительное и абсолютное количество дискоцитов к 0,5 ч уменьшилось соответственно в 3,2 и 7,1 раза, затем на всех этапах исследования эти показатели были меньше, чем в контроле. Аналогичная разница, но в сторону увеличения, отмечалась по величинам содержания активированных форм. По сравнению с контролем, у животных этой группы была более выражена гипокоагулемия потребления, при которой даже к б ч ни один из клоттинговых показателей не возвращался к исходным значениям. Это сопровождалось развитием гипофибриногенемии в ранние сроки после воздействия, и приростом содержания РКМФ.

Таблица 3

Состояние гемостаза у животных с хроническим описторхозом (инвазия

в количестве -100 м/о) па фоне экзогенной тромбинемии, IV! ± т

Исследуемые показатели Группы животных (п = 12)

без введения Сроки наблюдения в условиях введения тканевого тромбо пластина

0,5 ч 1ч Зч 6ч

Кол-во Тц, 109/л 929„0±31.0 641,0-118,0* 1017,0x14,0* 1057,0±60.0* .969,0x26,0

693,0±33,0° 312,0±16,0*^ 944,0±25,0*° 923,0±48,0*° 878,0±35,0*°

Дисконты, % 59,3±0,7 , 27,6±о;8* . 48,11-0,3* ■ 47,3±0,8* • 6С,5±1,2

43Д±2,8° 13,6±2,2*° 29,6±1,9*° 38,8±2,3° 44,6±3,26

Дискоциты,109/л 550,9±18.б 176,9^10,5* " 489,2*12,6* 500,0±26,8 586,2*14.6

299,3±11,20 42,4±8,9*° 279,4±18,6° 358,1±23,5° 391,6±33,9*и

АФ, % 4(1 710 7 ~ 51.9-10,3* ' 52,8а0,8* 39,5*1,1

56,8±2,8° 86,4±3,9*° 70,4±3,4*° 61,2±2,9° 55,4±3,6°

АФ, 107л 387;Ш2,3 463,4-110.2* "527,8*12,6* ' 558,1 >23,5* 382,&± 12,9

393,6±13,5 269,6±16,8*° 664,6±28,6*° 564,9±32,8* 486,4±24,8*°

МА, /ОЧК 1,3x0,1 ¿9:0,3* ' 1,1 ±0,2 - 0,8^0,2 1,0±0,1

2,0±0,3° 2;8±0,2* 1,4±0,2 1,1 ±0,2* 1,0±0,1*

Б А, /ОЧК ' 1,Ыл ' 2.0.г0,4* ' " 0,6^,1*' 1Л±0Д • 1.3±0,2

3,2±0,2° 4,2±0,2*° 1,2±0,2*° 1,1±0,1* 1,2±0,2*

АЧТВ, с . 37,^0.,9 3(Х7±0,8° 39,310,9* ......38,6+2,2* 45,1=:0,б* -44,1±2,6* ■ 32,9-Ю,6* 36,4±1,8*° 39,6±1,2 38,4±3,2*

ТПВ, с . 12.5-10,5 • , !23,5±1Д* 16.4 ьО.6* 14.5±0,8* 12,7±0,1

12,1±0,2 21,5±1,2* 19,4±1,1*° 17,5±1,3*и 14,6±1,4*°

ТВ, с • 16.010,5 - 30.9±1,7* V 48,3±},1* ' 50,1* 1,9* . 17,4x1,6 1

13,7±0,1и 28,4±2,3* 44,6±2,2* 49,2±3,0* 18,ЗЫ,5* ■ Т2,2&16лТ*"1

ФГ, г/л ,.■ 1,2(Ш),15 0,56±0,06* . . 0,40*0,06* 2,64±0,0б*

0,50±0,04° 0,20±0,04*° 0,18±0,02*° 2,24±0,10*° 1,86Ю,24*и |

РКМФ, мг/% - З.НОД 9.4*0,5* 7,2±0,9*- • 6.3±0,4* 1

4,8±0,2° 12,4±0,3*6 14,4±1,0*° 10,6±0,4*° 10,2±0,2*°

Примечание: - контрольная группа, СП - группа ОП-ЮО. * уровень достоверности р<0,05 по сравнению с группой без воздействия, 0 уровень достоверности р<0,05 по сравнению с контролем.

Таким образом, негативные последствия экзогенной тромбинемии, связанные с ускорением непрерывно протекающего свертывания крови, на фоне хронического описторхоза лишь усугубляются. Это проявляется более выраженными и длительными, чем в контрольной группе, нарушениями гемостаза - активацией и потреблением тромбоцитов, вторичной гипокоагуляцией, потреблением факторов свертывания и увеличением содержания маркеров паракоагуляции. Об этом свидетельствует и расчет интегрального показателя - «толерантность к тромбину» (рис. 2).

Следует отметить, что на фоне различной степени инвазированности характер ответной реакции компонентов гемостаза на возмущающее воздействие почти не отличается.

□ контроль

И ОП-25

СЭ ОП-50

Рис. 2. Толерантность животных к введению тканевого тромбопластина на фоне хронического описторхоза ( * - уровень достоверности по сравнению с контрольной группой, р<0,05).

Изменения гемостаза у животных, подвергавшихся эндогенной тромбинемии на фоне хронического описторхоза

Появление в кровотоке повышенного содержания тромбина обусловлено, прежде всего, его ускоренным образованием. Активацию тромбиногенеза, приводящую к развитию эндогенной тромбинемии, провоцируют реакции напряжения в независимости от того, связаны ли они с наличием патологического процесса или не выходят за рамки «физиологической нормы». В наших экспериментах эндогенную тромбинемию моделировали путем необратимой окклюзии крупного магистрального сосуда, вызывающей острую ишемию тканей.

У животных контрольной группы ишемия способствовала активации коагуляционного и тромбоцитарного гемостаза: уменьшились во временном интервале значения всех клоттинговых показателей (ТПВ, ТВ и АЧТВ),

выросло содержание фибриногена и РКМФ, на фоне одновременного увеличения общего содержания тромбоцитов (в основном за счет прироста числа активированных форм).

У животных, предварительно подвергшихся инвазии в дозе 25 м/о, направленность реакции системы гемостаза на возмущающее воздействие была идентичной с таковой у контрольных животных. Вместе с тем, развивающиеся гиперкоагуляционные изменения, согласно ряду показателей (количество тромбоцитов, относительное содержание дискоцитов, относительное и абсолютное содержание активированных форм, число больших агрегатов, тромбиновое время, содержание фибриногена), были выражены в большей степени. Это свидетельствует, с одной стороны, о высоком напряжении компонентов системы гемостаза, а с другой -указывает, по-видимому, на ускоренное истощение коагуляциошюго потенциала в тех случаях, когда интенсивность тромбинемии была более значительной (табл. 4).

Таблица 4

Состояние гемостаза у животных с хроническим описторхозом (инвазия

в количестве -100 м/о) в условиях необратимой окклюзии ___магистрального сосуда, М ± т____

Показатели Группы животных (п = 12)

Контроль (интактная) Описторхоз-ЮО

до воздействия после воздействия до воздействия после воздействия

Количество Тц, Ю'/л 92£ь31 1066,2±19* 693±7 1184,8±30*°

Дискоциты, % 59,3±1,7 46,3±2,2* 43,2±2,8 37,7±3,5*°

Дискошты, 109/л 550,9±18,6 493,6± 13,6* 299,3± 11,2 446,4± 13,9*°

АФ, % 40,7±2,7 53,7±3,5* 56,8±2,8 62,3±2,5*°

АФ, 10у/л 387,1±12,3 572,4± 10,7* 393,6±13 737,6± 15,0*"

Сфероциты, % 5,7±1,2 14,5±1,87* 43,240,8 12,0±2,0

Сфероциты, 107 л 53,2+16,7 154,8±26,0* 84,2±10,3 142,7±29,5

МА, /общее число клеток 1,3±0Д 2,2±0,2* 2,010,3 4,5±0,3*°

Б А, / общее число клеток 1,2±0,1 3,8±0,2* . 3,2±0,2 5,3±0,3*"

АЧТВ, с 37,3±0,9 23,7±0,5* 30,7±0,8 24,1±0,8*

ТПВ, с 12,5±0,5 9,9±0,1* 12,1±0,2 10,3±0,3*

ТВ, с 16,0±0,5 12,6±0,4* 13,7±0,1 12,4±0,1*

ФГ, г/л 1,20±0,15 1,37±0,02* 0,50±0,04 1,68±0,03*°

РКМФ, мг/% 3,08±0,06 4,75±0,08* 4,75±0,19 7,75±0,75*°

Примечание: В этой и последующей таблице * - уровень достоверности в группах в условиях до и после воздействия,0 - уровень достоверности в сравнении между группами после воздействия, рО,05

Еще более существенные сдвиги наблюдались в группе животных, подвергавшихся инвазии в дозе 50 м/о. В большей степени, чем в контроле и группе «ОП-25», уменьшилось абсолютное и относительное содержание дискоцитов, возросло содержание активированных форм тромбоцитов.

Количество малых агрегатов увеличилось в 4,1, а больших - в 5 раз сравнительно с таковыми в контроле (в 1,7 и 3,2 раза соответственно). Прирост фибириногенемии составил 87% (в контроле - 14%), продуктов паракоагуляции - 75% (в контроле - 54%).

Следовательно, объем инвазии отражается на способности системы гемостаза реагировать на внешние стимулы. Это нашло подтверждение при изучении состояния гемостаза у животных группы «ОП-1СЮ»: на фоне окклюзии почти в 2 раза выросло общее содержание тромбоцитов, максимальных значений достигли показа тели фибриногена и РКМФ.

Таким образом, описторхозная инвазия, вызывая к 90 сут ускорение непрерывно протекающего свертывания' крови, изменяла реакцию системь1' свергывания крови на появление в кровотоке эндогенных стимуляторов тромбиногенеза. Это проявлялось, прежде всего, более выраженным нарастанием общего содержания тромбоцитов, увеличением количества их активированных форм, малых и больших агрегатов, фибриногена, РКМФ и уменьшением содержания дискоцитов в сравнении с контрольной группой. Выраженность сдвигов при эндогенной тромбинемии, как и при экзогенной, зависит от степени инвазии.

Изменения сосудистого компонента гемостша на фоне хронического описторхоза

Известно, что неповрежденные сосуды обладают тромборезистентностью, которая может изменяться в условиях реакций напряжения. Не менее важно и то, как данное свойство изменяется в условиях реакций напряжения.

В завершающем фрагменте исследования мы предприняли попытку изучить влияние хронического описторхоза на коагулотропные свойства сосудистой стенки. С этой целью моделировалась обратимая окклюзия магистрального сосуда по Е.А. Поляковой (2004). После воздействия из симметричного сосуда (яремной вены) отбирали кровь и оценивали плазменные и клеточные параметры гемостаза.

. В контрольной группе неполная окклюзия приводила к возрастанию на 25,1% тромбинов.ого времени, на 18% - АЧТВ, и на 25% - ТПВ. Наряду с этим отмечался прирост уровня фибриногена - на 77%, и активности АТ-П1 -на 1.1,5%. Одновременно на 15,3% увеличилось количество тромбоцитов, но без существенного изменения соотношения их активированных и неактивировапных форм. Таким, образом, щадящее механическое воздействие способствовало активизации антикоагулянтцого. потенциала эндотелия сосудов, о чем свидетельствовало повышение активности в плазме АТ-Ш. Это нашло подтверждение в возрастании значений всех клотгинговых тестов и фибриногенемии.

Обозначенные выше изменения сравнительно с группой хронического описторхоза (ОП-25) оказались идентичными, но степень

гипокоагулемических сдвигов была меньше (удлинение АЧТВ на 10,6%, ТПВ - 9,6%). Очевидно, это было связано с отсутствием достоверного прироста активности в плазме АТ-Ш. Содержание тромбоцитов возросло, но в меньшей степени (лишь на 5,5%), чем в контроле, а соотношение их морфологических форм практически не изменилось.

У животных, инвазированных 50 м/о, проявления компенсаторной гипокоагулемии были едва заметны: удлинение тромбинового времени составило 12%, ТПВ - 5,5%. Содержание фибриногена, АТ-Ш и соотношение клеточных форм тромбоцитов не изменилось, а количество кровяных пластинок выросло незначительно.

В группе животных инвазированностью - в дозе 100 м/о также развивались гипокоагулемические сдвиги, но менее выраженные, чем в контроле (удлинение на 14% тромбинового времени, на 10,5% - АЧТВ, и на 11,5% - ТПВ). Содержание тромбоцитов выросло на 11%, уровень фибриногена и АТ-Ш остались без изменения (табл. . 5).

Таблица 5

Состояние показателей гемостаза у животных с хроническим описторхозом (инвазия в количестве - 100 м/о) на фоне обратимой _окклюзии магистрального сосуда (М ± т)_

Группы животных (п= 12)

Показатели Контроль 0писторхоз-100

до после до после

воздействия воздействия воздействия воздействия

Количество Тц, 1(У7л 915±27 1055±33* 725±22 805±33*°

Дискоциты, % 58,2±3,2 59,7±3,9 42,3±2,7 45,4±4,0°

Дискоциты, 107л 532,5±21,6 629,8±31,2* 304,5±18,2 362,2416,3°*

АФ, % 41,8±2,2 40,3±2,9 57,4±2,7 54,1±3,0д

АФ, 107л 382,5±18,3 425,2±21,5 413,3±23,6 434,7±21,6

АЧТВ, с 36,2±0,9 43,2±1,2* 29,6±1,0 32,7±0,7*°

ТПВ, с 12,8±0,2 16,0±0,3* 12,2±0,3 13,6±0,2*°

ТВ, с 16,7±0,4 20,9±0,9* 14,2±0,5 16,2±0,7*°

ФГ, г/л 1,3±0,1 2,3±0,2* 0,6±0,1 0,9±0,2°

АТ-Ш, % 87,2±3,2 97,2±3,2* 82.01:4,1 85,2±2,б"

Таким образом, у животных опытных групп реакция сосудистой стенки, направленная на уменьшение угрозы тромбообразования при неполной окклюзии сосуда, снижается. Утверждая это положение, мы учитывали не столько абсолютные величины показателей изучаемых групп, сколько интенсивность развивающихся после воздействия сдвигов. Вместе с тем, отсутствие различий сравниваемых параметров тромбоцитарного гемостаза не позволяет однозначно судить об антиагрегационной функции сосудистой стенки при описгорхозе.

Полученные нами результаты свидетельствуют о том, что на фоне' хронического описторхоза снижается антикоагулянтный потенциал

сосудистой стенки, что, возможно, связано с интенсификацией механизмов тромбиногенеза. Не исключено, что данный факт может служить одной из потенциальных причин развития тромбогеморрагических осложнений в условиях пополнения кровеносного русла дополнительными порциями прокоагулянтов и/или активаторов функциональной активности тромбоцитов.

ВЫВОДЫ:

1. Хронический описторхоз, воспроизводимый в экспериментальных условиях на золотистых хомячках путем однократной инвазии в количестве 25, 50 и 100 метацеркариев на одно животное, через 90 сут приводит к ускорению непрерывно протекающего свертывания крови, а именно: достоверно увеличивалось число активированных форм тромбоцитов во всех опытных группах, уменьшалось значение показателей активированного частичного тромбопластинового времени на 17:7%, тромбинового времени 14,4% в группах с ОП-25 и ОП-ЮО (р<0,05). На фоне существенного изменения плазмокоагуляции (в среднем на 47%) уменьшился уровень фибриногена, и выросло содержание растворимых комплексов мономерного фибрина (3,70±0,22 для ОП -25, 3,3(Ж),05 для ОП-50, 4,75±0,19 для ОП-ЮО сравнительно с таковым в контрольной группе 3,08±0,06 мг/%).

2. Интенсификация тромбиногенеза при хроническом описторхозе инициируется поступлением в кровоток тромбопластических субстанций, что сопровождается гипофибриногенемией, приростом содержания продуктов паракоагуляции, уменьшением тромбопластической активности паренхиматозных органов, а также морфологическими признаками нарушений в микроциркуляторном сосудистом русле в группах ОП-25, 01150 и ОП-ЮО (р<0,05).

3. В условиях модели экзогенной тромбинемии у животных с хроническим описторхозом наблюдали снижение в динамике (0,5 -6 ч) толерантности к тромбину, увеличение степени активации/потребления тромбоцитов и факторов плазмокоагуляции, а также замедление нормализации значений параметров свертывания крови.

4. При эндогенной тромбинемии (необратимая окклюзия магистрального сосуда), сопровождающейся гаперкоагуляционными сдвигами, увеличением содержания активированных форм тромбоцитов и маркеров взаимодействия "тромбин - фибриноген", возрастает интенсивность вовлечения компонентов плазменного и клеточного гемостаза в тромбиногенез на фоне хронического описторхоза.

5. Хронический описторхоз сопровождается снижением противосвертывающего потенциала эндотелия сосудов, что морфологически (на ультраструктурном уровне) проявилось, прежде всего, нарушениями в микроциркуляторном русле: повышение кровенаполнения сосудов,

вакуолизация цитоплазмы эндотелиоцитов, стаз и агрегация эритроцитов, их адгезия к эндотелиальной выстилке.

* * *

Результаты экспериментальных исследований свидетельствуют о том, что хронический описторхоз, вызываемый одноразовой инвазией паразитов, вызывает ускорение непрерывно протекающего свертывания крови, что представляет собой потенциальную угрозу развития тромбогеморрагических осложнений в условиях дополнительного поступления в кровоток факторов, инициирующих ответные реакции компонентов системы гемостаза.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ Публикации в издании, рекомендованном ВАК РФ

1. Орлов С.А. Качественная оценка морфофункциональной активности тромбоцитов по данным атомно-силовой микроскопии / С. А. Орлов, М.Ю. Донников, A.B. Зиновьева, Е.И. Кутефа // Клиническая лабораторная диагностика. - 2009. - № 8. - С. 30-32.

2. Соловьев В.Г. Влияние хронического охшсторхоза на характеристики биохимического компонента гемостаза и морфологические изменения тромбоцитов при тромбинемии / В.Г. Соловьёв, A.B. Зиновьева // Образование, здравоохранение, физическая культура. - Вестник ЮУрГУ. -№24.-2010.-С. 109-112.

3. Соловьев В.Г. Состояние постоянно протекающего свертывания крови при хроническом описторхозе/ В.Г. Соловьев, A.B. Зиновьева, H.A. Курлович // Медицинская паразитология и паразитарные болезни. - 2011. - № 2. С. 26-27.

4. Соловьев В.Г. Состояние микроциркуляторного русла и интерстиция респираторного отдела легкого при суперинвазивном описторхозе / О.Г. Соловьева, В.Г. Соловьев, A.B. Зиновьева, Е.В. Золотухина, Е.Д. Хадиева // III Эмбриологический симпозиум Всероссийского научного медицинского общества анатомов, гистологов, эмбриологов «ЮГРА-ЭМБРИО-2011». Морфология. -2011. -№5. С. 116.

Статьи в журналах и сборниках

5. Соловьев В.Г. Влияние хронического описторхоза на характеристики биохимического компонента гемостаза и морфологические изменения тромбоцитов / В.Г. Соловьёв, A.B. Зиновьева // Научный вестник ХМГМИ. - 2009. - № 1-2. - С. 46-50.

6. Соловьев В.Г. Диагностическое значение различных способов оценки содержания тромбоцитов при экзогенной тромбинемии / В.Г. Соловьёв, A.B. Зиновьева, Е.Г. Никулина, С.П. Калашникова // «Актуальные проблемы теоретической и прикладной биохимии» Российская конференция, посвященная 80-летию со дня рождения Р.И. Лифшица: Сборник материалов конференции. - Челябинск, 2009. - С. 185-187.

7. Соловьев В.Г. Изменения коагулящюнного потенциала при эндогенной тромбинемии и их коррекция / В.Г. Соловьев, Е.Г. Никулина, A.B. Зиновьева // «Актуальные проблемы теоретической и прикладной биохимию) Российская конференция, посвященная 80-летию со дня рождения Р.И. Лифшица: Сборник материалов конференции. - Челябинск,

2009. -С. 138-140.

8. Соловьев В.Г. Коррекция интенсивности диссеминированного внутрисосудисгого свертывания крови природными цеолитами / В.Г. Соловьев, Е.Г. Никулина, A.B. Зиновьева // XIV Международный симпозиум «Эколого-физиологические проблемы адаптации»: Сборник материалов конференции. М., 2009. - С. 382-384.

9. Зиновьева A.B. К вопросу о выделении метацеркариев из язя (Leuciscus idus) и их устойчивости к факторам внешней среды / Зиновьева A.B., Каирбеков М.А., Калинин И.Э., Зуевский В.П., Соловьёв В.Г. // «Актуальные проблемы теоретической, экспериментальной и клинической медицины» XI Регионшшш конференция молодых ученых, специалистов и студентов: Сборник материалов конференции. - Ханты-Мансийск, 2009. -С. 39-41.

10. Соловьев В.Г. Влияние хронического описторхоза на характеристики биохимического компонента гемостаза и морфологические изменения тромбоцитов при ишемии / В.Г. Соловьёв, A.B. Зиновьева // Международная научно-практическая конференция «ЗДОРОВЬЕ В XXI ВЕКЕ-2011»: Материалы конференции. Тула 2010. С. 168-170.

И. Соловьев В.Г. Хронический описторхоз и толерантность к тромбину в эксперименте / В.Г. Соловьев, A.B. Зиновьева // Пятая всероссийская конференция «Клиническая гемостазиология и гемореология в сердечнососудистой хирургии» (с международным участием) Материалы конференции. Москва 2011. С. 475-476.

Прочие публикации 12. Соловьев В.Г. Метаболические сдвиги и принципы лабораторной диагностики при описторхозной инвазии: Глава в моно1рафии «Хирургические осложнения описторхоза» / В.Г. Соловьев, Л.Н. Деревянко, Л.Г. Никонова, С.П. Калашникова, Е.Г. Никулина, A.B. Зиновьева, М.А. Гагаро. Ханты-Мансийск, Издат. центр ХМГМА,

2010.-С. 60-66.

ИСПОЛЬЗОВАННЫЕ СОКРАЩЕНИЯ

AT-III - антитромбин - III

АФ - активированные формы тромбоцитов

АЧТВ - активированное частичное тромбопластиновое время

БА - большие агрегаты тромбоцитов

ДВС - диссеминированное внутрисосудистое свертывание

МЛ - малые агрегаты тромбоцитов

МО - метаболиты о. ГеНпеш

М/О - метацеркариев на одну особь

НПСК - непрерывно протекающее свертывание крови

ОП-25 - животные, инвазированные о.Шшеш в количестве 25 метацеркариев

на особь

ОП-50 - животные, инвазированные о.ГШпеш в количестве 50 метацеркариев на особь

ОП-1СЮ - животные, инвазированные о.Штеив в количестве 100 метацеркариев на особь

РКМФ - растворимые комплексы мономерного фибрина

ТПВ - тромбопластиновое время

ТВ - тромбиновое время

ТТ - толерантность к тромбину

ФГ - фибриноген

Подписано к печати 01,03.2012г. Формат 60x84 1/16 Объем 1,0 уч.-изд.л. Заказ № 773. Тираж 100 экз. Отпечатано на ризографе в типографии ФГБОУ ВПО ЧГПУ 454080, г. Челябинск, пр. Ленина, 69

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Зиновьева, Альбина Валерьевна, Челябинск

61 12-3/1060

ГОУ ВПО ХМАО - Югры Ханты-Мансийская государственная медицинская академия

На правах рукописи

Зиновьева Альбина Валерьевна

СОСТОЯНИЕ СИСТЕМЫ СВЕРТЫВАНИЯ КРОВИ ПРИ ХРОНИЧЕСКОМ ОПИСТОРХОЗЕ В УСЛОВИЯХ ЭНДОГЕННОЙ

И ЭКЗОГЕННОЙ ТРОМБИНЕМИИ

03.03.01 - Физиология

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научный руководитель: доктор медицинских наук

В.Г. Соловьев

Челябинск - 2012

ОГЛАВЛЕНИЕ

ВВЕДЕНИЕ............................................................................. 4

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ........................................................... 9

1.1. Современные сведения о гемостазе.................................... 9

1.2. Этиология и патогенез описторхозной инвазии..................... 26

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.................................. 39

2.1. Выбор животных........................................................... 39

2.2. Воспроизведение модели хронического описторхоза.............. 39

2.3. Экспериментальные модели............................................. 41

2.4. Лабораторные методы исследования.................................. 41

2.5. Математический анализ результатов.................................. 42

3. РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ................... 44

3.1. Динамика изменений тромбоцитарного и коагуляционного гемостаза, тромбопластическая активность надмолекулярных образований плазмы крови и тканей внутренних органов на фоне хронического описторхоза......................................... 44

3.2. Динамика изменений тромбоцитарного и коагуляционного гемостаза у животных, подвергавшихся экзогенной тромбинемии на фоне хронического

описторхоза..................................................................................................................................^2

3.3. Изменения тромбоцитарного и коагуляционного гемостаза у животных, подвергавшихся эндогенной тромбинемии на фоне хронического описторхоза............................................................................................58

3.4. Изменения сосудистого компонента гемостаза на фоне хронического описторхоза..............................................................................................62

4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ....................................................................................................................66

5. ВЫВОДЫ......................................................................................................................................................81

6. ЛИТЕРАТУРА..........................................................................................................................................83

ИСПОЛЬЗОВАННЫЕ СОКРАЩЕНИЯ

AT-III - антитромбин - III

АФ - активированные формы тромбоцитов

АЧТВ - активированное частичное тромбопластиновое время

БА - большие агрегаты тромбоцитов

ДВС - диссеминированное внутрисосудистое свертывание

МА - малые агрегаты тромбоцитов

МО - метаболиты о. felineus

М/О - метацеркариев на одну особь

НПСК - непрерывно протекающее свертывание крови

ОП-25 - животные, инвазированные o.filineus в количестве 25

метацеркариев на особь ОП-50 - животные, инвазированные o.filineus в количестве 50

метацеркариев на особь ОП-ЮО - животные, инвазированные o.filineus в количестве 100

метацеркариев на особь РКМФ - растворимые комплексы мономерного фибрина

ТПВ - тромбопластиновое время

ТВ - тромбиновое время

TT - толерантность к тромбину

ФГ - фибриноген

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы. Изменение интенсивности непрерывно протекающего свертывания крови сопровождает большинство физиологических и патологических состояний, вызываемых реакцией напряжения (Альфонсова Е.В., Забродина JI.A., Бочарникова Н.В., 2011; Вавилова Т.В., Авдушкина JI.A., Зыбина И.Н. 2011; Захарова Н.О., Брылякова С.Н., Николаева A.B., 2011; Усынин В.В., Карелова Н.Ю., Плинокосова Л.А. с соавт., 2011; Rosencher N., 2011; Kontush А., 2011).

Не являются исключением в этом смысле и паразитарные заболевания. Среди прочих биогельминтозов, в связи с достаточно высокой распространенностью, особое место занимает описторхоз - природно-очаговое заболевание, впервые описанное в конце XIX века (Виноградов К.Н.,1891; Rivolta S., 1884). Среди регионов Российской федерации крупнейшим очагом описторхоза является территория Ханты-Мансийского автономного округа - Югры, в отдельных районах которого экстенсивность инвазии населения составляет более 85%, а заболеваемость превышает среднефедеральный уровень более чем в 30 раз (Зеля О.П., Завойкин В.Д. , Сергеева М.Н., 1990; Зуевский В,П. с соавт.,2008; Зуевская Т.В., 2008).

О неблагоприятном влиянии описторхозной инвазии на организм хозяина свидетельствует достаточное количество научных фактов, однако важность дальнейшего изучения обозначенной проблемы определяется значением описторхоза как «фонового» заболевания. Описторхоз изменяет течение ряда патологических процессов (Бычков В.Г., Крылов Г.Г., 2007; Вакулина О.Э., Хадиева Е.Д., 2011; Mordvinov V.A., 2011; Solov'eva O.G., 2011), сопровождающихся, помимо прочего, ускорением непрерывно протекающего свертывания крови. При этом очевидно, что от суммации эффектов, вызываемых основной и «фоновой» (описторхоз) патологиями в отношении компонентов гемостаза зависит вероятность развития тромбогеморрагических осложнений, связанных с потреблением факторов

свертывания и тромбоцитов, активацией фибринолиза, микротромбообразованием, дисфункцией органов и тканей («диссеминированное внутрисосудистое свертывание крови»).

Вместе с тем, в доступной литературе практически отсутствуют сведения о состоянии гемостаза при описторхозной инвазии, а единичные сообщения по данной тематике весьма противоречивы и касаются аспектов регуляции агрегатного состояния крови лишь косвенно (Гиновкер А.Г., Галян С.Л., 1982; Ободчук Г.С., Молокова O.A., 1987; Соловьева A.B., 2007).

Принимая во внимание скудность литературных данных по обозначенной проблеме, а, также учитывая тот факт, что apriori существует множество реальных предпосылок для интенсификации гемостатических реакций в условиях описторхозной инвазии, нам представлялось актуальным ответить на вопрос: какова направленность влияния хронического описторхоза на состояние различных компонентов гемостаза, и как это сказывается на их способности к адекватному ответу в условиях

экспериментальной гипертромбинемии.

Цель работы: оценка состояния внутрисосудистого свертывания крови и отдельных компонентов гемостаза при хроническом описторхозе в условиях эндогенной и экзогенной тромбинемии.

Для достижения поставленной цели были определены следующие

задачи:

1. Произвести оценку состояния тромбоцитарного и коагуляционного гемостаза при хроническом описторхозе, воспроизводимом в экспериментальных условиях путем однократного заражения золотистых сирийских хомячков в количестве 25, 50 и 100 метацеркариев на одно животное.

2. Охарактеризовать тромбопластическую активность циркулирующих надмолекулярных образований плазмы крови и внутренних органов, содержание маркеров внутрисосудистого свертывания и состояние микроциркуляторного русла на фоне хронического описторхоза.

3. проанализировать влияние хронического описторхоза на состояние тромбоцитарного и коагуляционного звеньев гемостаза при экзогенной и

эндогенной тромбинемиях.

4. Оценить состояние противосвертывающего потенциала эндотелия

сосудов на фоне хронического описторхоза.

Научная новизна

Экспериментальными исследованиями впервые установлено, что хронический описторхоз вызывает ускорение непрерывно протекающего свертывания крови, проявляющееся активацией тромбоцитов и гиперкоагуляционными сдвигами разной степени выраженности в

зависимости от объема инвазии.

Установлено, что интенсификация тромбиногенеза при хроническом описторхозе инициируется поступлением в кровоток тромбопластических субстанций, сопровождается гипофибриногенемией, возрастанием содержания продуктов паракоагуляции, уменьшением тромбопластической активности паренхиматозных органов, снижением противосвертывающего потенциала эндотелия сосудов и морфологическими признаками нарушения микроциркуляции в группах сравнения ОП-25, ОП-50 и оп-100 (р<0.05).

Впервые показано, что при экспериментальной гипертромбинемии различного генеза, на фоне хронического описторхоза снижалась толерантность животных к тромбину, увеличивалась степень активации/потребления тромбоцитов и факторов плазмокоагуляции, а также замедлялась нормализация параметров свертывания крови в динамике.

Теоретическая и практическая значимость работы

Полученные данные расширяют фундаментальные представления о биологических эффектах возбудителя описторхоза на организм окончательного хозяина, в частности, его влиянии на различные компоненты гемостаза в норме и при активации свертывания крови. Результаты исследования могут быть использованы научно-исследовательскими учреждениями при разработке программы мониторинга состояния гемостаза

у лиц, больных хроническим описторхозом с сочетанной патологией с целью проведения своевременных мероприятий по профилактике тромбогеморрагических осложнений в клинической практике.

Внедрение результатов работы. Результаты исследования используются для подготовки студентов по специальности «Лечебное дело» в рамках дисциплин «Биохимия», «Физиология» на кафедрах медицинской и биологической химии, нормальной и патологической физиологии Ханты-Мансийской государственной медицинской академии, в учебном процессе кафедры клинической лабораторной диагностики Хабаровского Краевого государственного института повышения квалификации специалистов здравоохранения на циклах профессиональной переподготовки и общего усовершенствования врачей клинической лабораторной диагностики.

Работа выполнена на базе кафедры медицинской и биологической химии Ханты-Мансийской государственной медицинской академии в рамках научной программы «Механизмы адаптации и гомеостаза у человека в норме и при патологии в условиях северных территорий» (регистрационный номер 01.2.007

08367).

Положения, выносимые на защиту:

1. Хронический описторхоз сопровождается активацией тромбоцитарного гемостаза и гиперкоагуляционными сдвигами разной степени выраженности в зависимости от величины инвазии в целом, вызывая ускорение непрерывно протекающего свертывания крови.

2. Ускорение непрерывно протекающего свертывания крови при хроническом описторхозе инициируется поступлением в кровоток тромбопластических субстанций, сопровождается уменьшением плазменного содержания фибриногена, приростом концентрации продуктов паракоагуляции, уменьшением прокоагулянтной активности паренхиматозных органов, ослаблением антикоагулянтного потенциала

эндотелия сосудов и морфологическими признаками нарушения

микроциркуляции.

3. На фоне хронического описторхоза уменьшается толерантность к тромбину, что представляет собой потенциальную угрозу развития тромбогеморрагических осложнений в условиях дополнительного поступления в кровоток факторов, активирующих свертывание крови.

Апробация и публикации. Основные положения диссертационной работы доложены на XIV международном симпозиуме «Эколого-физиологические проблемы адаптации» (г. Москва, 2009), Российской конференции, посвященной 80-летию со дня рождения Р.И.Лифшица «Актуальные проблемы теоретической и прикладной биохимии» (г. Челябинск, 2009), XI Региональной конференции молодых ученых, специалистов и студентов «Актуальные проблемы теоретической и клинической медицины» (г. Ханты-Мансийск, 2009), международной научно-практической конференции «Здоровье в XXI веке - 2011» (г. Тула, 2010), пятой всероссийской конференции «Клиническая гемостазиология и гемореология в сердечно-сосудистой хирургии» (г. Москва, 2011), III Эмбриологическом симпозиуме Всероссийского научного медицинского общества анатомов, гистологов, эмбриологов «ЮГРА-ЭМБРИО-2011» (г.

Ханты-Мансийск, 2011).

Результаты исследований опубликованы в материалах перечисленных научных форумов, в виде главы монографии «Метаболические сдвиги и принципы лабораторной диагностики при описторхозной инвазии», в медико-биологических журналах (всего 12 публикаций).

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 107 страницах, содержит 12 таблиц и 23 рисунка, состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов собственных исследований их обсуждения, выводов, а также списка использованных источников литературы (150 отечественных и 43 иностранных).

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Современные сведения о гемостазе

По современным представлениям, система гемостаза является одной из составляющих единой структурно-функциональной полисистемы, играющей ключевую роль в сохранении гомеостаза организма. Кроме системы гемостаза, в нее включены калликреин-кининовая система, системы комплемента и гуморального иммунитета. Они объединены общими механизмами активации и ингибирования, возможностью активации в любой точке сосудистого русла (Балуда В.П., 1995; Бышевский А.Ш. с соавт., 2007, 2008; Пантелеев М.А. с соавт., 2008; Bartheis М., Kemkes-Matthes В., Pozsch

В. et al., 2008; Tripodi А., 2008; Rangarajan S., 2010)

Функция системы гемостаза двояка: с одной стороны, она обеспечивает сохранение жидкого состояния крови, а с другой - предупреждает и останавливает кровотечения путем поддержания структурной целостности стенок кровеносных сосудов и достаточно быстрого тромбирования последних при повреждениях (Баркаган З.С., 1988; Бокарев И.Н. и соавт., 1998; Бышевский А.Ш. и соавт., 2003, 2007; Зубаирова Л.Д., 2007; Кортусов В.Л., 2007; Бушин А.Е., 2009; Савченко А.П., Медведев И.Н., 2009; Gruel Y., 2010; Italiano Je Jr., Mairuhu A.T., Flaumenhaft R., 2010; Key N.S., Kwaan N.C., 2010).

Условно выделяют четыре функциональных звена гемостаза: коагуляционное, антикоагулянтное, фибринолитическое и

антифибринолитическое. Их взаимодействие позволяет системе гемостаза удерживаться в пределах физиологических колебаний между гипокоагуляцией и гиперкоагуляцией. Тонкий баланс между этими звеньями системы гемостаза может быть нарушен. В таких случаях возникают тромботические осложнения или патологическая кровоточивость (Зубаиров Д.М., 2000; Бутена С.С., Манн К.Г., 2002; Алексеев H.A., 2005; Баркаган З.С., Момот А.П., 2008; Mannucci P.M., Franchini М., 2010).

В системе гемостаза различают три структурных звена: интима кровеносных сосудов, клетки крови (тромбоциты, эритроциты, лейкоциты) и

плазменные ферментные системы крови.

Монослой эндотелиальных клеток, выстилающий внутреннюю поверхность кровеносных сосудов, обладает высокой

тромборезистентностью и является важнейшим фактором, поддерживающим жидкое состояние крови (Кузник Б.И., Скиперов В.П., 1974; Балуда В.П. с соавт., 1988; Manly D.A., Boles J., Mackman N., 2010). В норме эндотелий сосудов покрыт гликокаликсом, основа которого представлена трансмембранными белками, связанными с гепарансульфатами. Именно углеводные компоненты интегральных гликопротеинов обладают противосвертывающей активностью. Эти структуры способны связываться с антитромбином III, повышать активность кофактора II гепарина, препятствовать адгезии лейкоцитов и тромбоцитов, тем самым увеличивая антитромбогенный потенциал эндотелия (Галяутдинов Г.С., Корнилов Ю.Л., 2002; Морозова В.Т. , Авдеева H.A., 2006; Куртусов В.Л. с соавт., 2007;

ШойхетЯ.Н. с соавт., 2008; Nowak G., 2010).

Незамедлительной реакцией на травму сосудистого эндотелия является вазоконстрикция, а затем эндотелий трансформируется в мощную коагулотропную поверхность (Бышевский А.Ш. с соавт., 2008; Ma Z., Dong N., Zhang J. et al, 2010). Прокоагулянтная роль эндотелия сосудов состоит в синтезировании, выделении и привлечении разнообразных соединений, активирующих свертывание крови - тканевого фактора, фактора Виллебранда, фактора V, ингибиторов активатора плазминогена, интерлейкина-1, фактора некроза опухолей, эндотелина-1. Все это способствует адгезии тромбоцитов и лейкоцитов. Кроме того, выявлена существенная роль эндотелия в снижении уровня ингибитора пути тканевого фактора (ИПТФ), антитромбина-III, белков системы протеина С, а также в ингибировании фибринолиза.

При повреждении сосудов при участии фактора Виллебранда, выделяемого эндотелием сосудов, отрицательно заряженные тромбоциты (кровяные пластинки) прилипают к положительно заряженной раневой поверхности. Практически одновременно происходит агрегация - скучивание и склеивание тромбоцитов с образованием тромбоцитарной пробки, или тромба. Стимуляторами агрегации являются коллаген, а также более сильные индукторы - АДФ, катехоламины и серотонин (Байкеев Р.Ф., 1994; Баркаган З.С., Момот А.П., 2005; Sibbing D., Steinhubl S.R., Schulz S. et al., 2010). Другим важным фактором, вызывающим агрегацию, является тромбин (Горчакова H.A., Гудивок Я.С., Гунина Л.М. с соавт., 2010; Chappell D., Jacob

М., Pehm М. et al., 2008).

Таким образом, участие тромбоцитов в остановке кровотечения

обеспечивается следующими функциями:

- способностью поддерживать спазм поврежденных сосудов путем освобождения вазоактивных веществ - адреналина, норадреналина, серотонина, тромбоксана А2 (метаболита арахидоновой кислоты);

- способностью закупоривать поврежденные сосуды путем приклеивания тромбоцитов к субэндотелию (адгезивная функция) и склеивания тромбоцитов друг с другом (агрегационная функция);

- участием тромбоцитарных факторов в процессе свертывания к�