Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Роль тромбоцитов, эритроцитов и сосудистой стенки в регуляции тромбинемии при активации перекисного окисления липидов

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Роль тромбоцитов, эритроцитов и сосудистой стенки в регуляции тромбинемии при активации перекисного окисления липидов"

МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РОССИИ ЧЕЛЯБИНСКАЯ ГОСУДАРСТВЕННАЯ МЕДИЦИНСКАЯ АКАДЕМИЯ

РГ6 ОД

На правах рукописи

СОЛОВЬЕВ ВЛАДИМИР ГЕОРГИЕВИЧ

УДК 617-089.166-059:615.3 56-07:616.151.5

РОЛЬ ТРОМБОЦИТОВ, ЭРИТРОЦИТОВ И СОСУДИСТОЙ СТЕНКИ В РЕГУЛЯЦИИ ТРОМБИНЕМИИ ПРИ АКТИВАЦИИ ПЕРЕКИСНОГО ОКИСЛЕНИЯ ЛИПИДОВ

03.00.04 - Биологическая химия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени доктора медицинских наук

Челябинск -1997

Работа выполнена в Тюменской государственной медицинской

академии

Научный консультант:

Член-корр. АЕ и МАИ, заслуженный изобретатель РФ, доктор медицинских наук, профессор А.Ш.БышевскиП

Официальные оппоненты:

Член-корр. РАЕН, доктор медицинских наук, профессор

Э.Г.Давлетов

Доктор медицинских наук, профессор В.В.Саломатин

Доктор медицинских наук, профессор В.Е.Высокогорский

Ведущее учреждение: Саратовский государственный медицинский универститет

Защита диссертации состоится "_"_1997 г.

в "_" часов на заседании специализированного Ученого Совета

(Д-084.04.01) Челябинской государственной медицинской академии по адресу: 454092, г. Челябинск, ул. Воровского, 64.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Челябинской государственной медицинской академии

Автореферат разослан "_"_1997 г.

Ученый секретарь специализированного Ученого Совета, доктор медицинских наук, профессор Л.В.Кривохижина

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. К настоящему времени накоплен большой фактический материал, свидетельствующий об универсальной роли свободнорадикального окисления липидов в регуляции гомеостаза [В.Карножицкий, 1972; Л.К.Обухова, Н.М.Эмануэль, 1983] и значения ПОЛ в причинно-следственных механизмах развития разнообразных патологических состояний [Г.М.Богдан и соавт., 1995; В.П.Михин и соавт., 1996; Д.В.Морозов и соавт., 1996; В.Б.Шнейвайс, Г.С.Левин, 1996; Е.П.Шувалова и соавт., 1996; С.Л.Плавинский, А.С.Кузнецов, 1997; Р.М.Сафаров и соавг., 1997]. Среди них особое значение приобретают те, которые сопровождаются одновременным нарастанием ге-мостатического потенциала, что нередко приводит к развитию ДВС [А.Ш.Бышевский и соавт., 1995; С.С.Селицкая и соавт., 1996 ]. Данные о параллелизме активации свертывания крови и ПОЛ, полученные в условиях клиники [В.П.Мищенко, 1981; Л.В.Шаталина и соавт, 1996] и эксперимента [Г.АЛобань-Череда, 1992], сведения о способности ан-тиоксидантов ограничивать гемокоагуляционные сдвиги [В.А.Полякова, 1994; И.Ш.Весельский, А.В.Сонник, 1997; Yoshikawa е.а., 1986] обосновали необходимость выяснения механизмов взаимосвязи между свободнорадикальными процессами и гемостазом, что до сих пор детально не изучалось.

Учитывая тот факт, что все пути запуска коагуляционного каскада приводят к образованию центрального фермента свертывания крови - тромбина [Д.М.Зубаиров, 1978], мы предположили, что многократно выявленная зависимость между гиперкоагулемией и активацией ПОЛ может реализовываться посредством тромбинемии. В случае подтверждения этой гипотезы возникала необходимость исследования механизмов влияния тромбинемии на свободнорадикальные процессы крови.

Так как преимущественными субстратами свободнорадикального окисления являются жирнокислотные компоненты мембранных липидов, наше особое внимание в этом плане привлекли клетки крови, как структуры, потенциально способные реагировать на тромбин активацией внутриклеточных пероксидных реакций. В большей степени это относилось к тромбоцитам и эндотелиоцитам, имеющим рецепторы к тромбину [Г.Ю.Григорян, 1989; Jamieson е.а., 1980] и ферментные системы образования эндоперекисей простагландинов [Sicard, Lagarde, 1985; Siess, 1989], в меньшей - к эритроцитам. В то же время, сведения о модификации мембранных липидов под влиянием свободнорадикального окисления и роли фосфолипидов в формировании тромбо-пластической активности [Ю.А.Губский, 1978; Zwaal е.а., 1980] представляли интерес для изучения вклада ПОЛ в инициацию тромбиноге-неза. Установление, таким образом, связей "тромбинемия—»активация

ПОЛ" и "активация ПОЛ—>тромбинемия" позволяло бы утверждать о взаимоусилении двух процессов, что является важным не только с точки зрения теории, но и для обоснования комплексного подхода к предупреждению тромбогеморрагических осложнений совместным назначением антикоагулянтов и антиоксидантов.

Цель работы - изучить взаимосвязь активации тромбиногенеза и свободнорадикальных процессов в крови, оценить роль тромбоцитов, эритроцитов и эндотелиоцитов в ее реализации.

Задачи исследования : 1) Изучить состояние ПОЛ плазмы, тромбоцитов и эритроцитов при тромбинемии in vitro. 2) Изучить состояние ПОЛ тех же объектов при экзогенной и эндогенной тромбинемии. 3) Исследовать влияние гепарина на сдвиги ПОЛ плазмы, тромбоцитов, эритроцитов, провоцируемые тромбинемией. 4) Изучить влияние про-оксиданта (свинца) на гемокоагуляционные сдвиги, в обычных условиях и на фоне введения антиоксидантов. 5) Изучить влияние антиоксидантов на коагуляционный и тромбоцитарный гемостаз в условиях экзогенной и эндогенной тромбинемии и выживаемость животных при введении токсичных доз тромбопластина. 6) Изучить влияние тромбинемии на ПОЛ в тромбоцитах и эритроцитах. 7) Изучить влияние тромбинемии на морфофункциональное состояние тромбоцитов. 8) Изучить влияние антиоксидантов на агрегационную активность, высвобождение факторов Р4 и Р9, морфологию тромбоцитов при тромбинемии. 9) Исследовать влияние антиоксидантов на антитромбиновую, антиагрегационную и громбопластическую активности эндотелия аорты крыс. 10) Изучить влияние антиоксидантов на состояние мембранных фосфолипидов эритроцитов и тромбоцитов и сопоставить его с тромбопластической активностью изучаемых клеток. 11) Оценить в сравнении влияние антиоксидантов и гепарина на сдвиги ПОЛ, вызываемые тромбинемией.

Научная новизна. Впервые установлено, что контакт тромбина с кровью, в том числе и освобожденной от фибриногена, активирует в ней свободнорадикальные процессы. Эффект тромбина на ПОЛ реализуется через тромбоциты, эритроциты и эндотелиальные клетки.

Впервые установлено, что рост ПОЛ, вызываемый тромбинемией, стимулирует агрегацию, реакцию высвобождения и потребление тромбоцитов, что ограничивается предварительным введением антиоксидантов.

Впервые установлено, что антиоксиданты ограничивают деструкцию тромбоцитов при гипертромбинемии, ослабляя дополнительный приток в кровь тромбопластических субстанций.

Показано, что активация свободнорадикальных процессов, сопровождаясь изменением фосфолипидного состава клеточных мембран, вызывает рост тромбопластической активности тромбоцитов, эритроцитов и эндотелиоцитов и увеличивает их вклад в тромбиногенез.

Впервые установлено, что торможение ПОЛ повышает антитром-биновую активность эндотелия сосудов, и снижает его ангиагрегаци-онные свойства.

Впервые установлено, что активация ПОЛ в изучаемых клетках крови при троми.тсмии является механизмом /силсная тромииногене-за. Совместное применение антикоагулянтов и антиоксидантов более эффективно чем их раздельное введение разрывает замкнутый цикл "тромбинемия-*активация ПОЛ в клетках крови—>тромбинемия".

Практическая ценность работы. В процессе выполнения исследований разработаны : 1.Способ определения суммарного содержания фибринмономеров и продуктов деградации фибрина в плазме крови (Авторское свидетельство N 1779693). На авторское свидетельство получен патент № 1779693 от 12.01.1994 г.; 2. Способ количественного определения общей коагуляционной активности тромбоцитов (Авторское свидетельство N 2061953). На авторское свидетельство получен патент № 2061953 от 10.06.1996 г.

Материалы исследований использованы для написания монографий "Витамины и здоровье женщины" (Красноярск, 1991, авторы -А.Ш.Бышевский, В.Н.Кожевников), "Биохимические сдвиги в диагностике патологических состояний (с элементами патохимии)" (Новосибирск, 1993, авторы А.Ш.Бышевский, С.Л.Галян), "Витамины в профилактике тромбогеморрагических осложнений" (Тюмень, 1995, соавторы - А.Ш.Бышевский, В.А.Полякова, С.Л.Галян, А.М.Мкртумян),-"Тромбоциты" (Тюмень, 1996, соавторы - А.Ш.Бышевский, С.Л.Галян, И.А.Дементьева, А.А.Нелаева).

Полученные данные использованы при составлении инструкции по клиническому испытанию ВИТАКОМПЛЕКСА к заявке в Фармакологический Комитет МЗРФ.

Результаты работы внедрены в практическую деятельность ряда клинических учреждений г.Тюмени.

Апробация и публикации. Основные положения диссертации доложены на Всесоюзных конференциях "Клиническая витаминоло-гия"(Москва, 1991); "Физиология и патология перекисного окисления липидов, гемостаза и иммуногенеза" (Полтава, 1991, 1993); Зональной научно-практической конференции "Здоровье человека и экологические проблемы" (Киров, 1991); Региональной конференции биохимиков Урала, Западной Сибири и Поволжья (Тюмень, 1992); Всесоюзной научной конференции "Тромбоцит - как связующее звено гемостаза" (Москва, 1992); Международном симпозиуме "Биологически активные добавки к пище - нугрицевтики - и их использование с профилактической и лечебной целью при наиболее распространенных заболеваниях" (Тюмень, 1995); Всероссийской конференции "Актуальные вопросы службы крови и трансфузиологии" (Санкт-Петербург, 1995); 9-ой Европейской конференции по гемореологии (Сиена, 1995); Меж-

дународном симпозиуме "Медицина и охрана здоровья" (Тюмень, 1996, 1997).

По материалам диссертации опубликовано 40 печатных работ.

Структура и объем работы. Диссертация изложена на 229 страницах машинописи и состоит из введения, обзора литературы, описания ::~-.:льзован;:-:\ 2-..столов исследования, главы с изложением собственных исследований, обсуждения, выводов и списка использованной литературы. Работа иллюстрирована 50 таблицами, 10 рисунками, 2 фотографиями. Библиографический указатель включает 332 работы отечественных и зарубежных авторов.

Оснор-гые положения, выносимые на защиту :

1) Тромбинемня вне зависимости от причины развития сопровождается активацией ПОЛ, что не связано с непосредственным воздействием тромбина на плазмокоагуляцию, но реализуется при участии тромбоцитов, эритроцитов и эндотелиоцитов.

2) Интенсификация ПОЛ способствует повышению тромбо-тического потенциала клеток. Это проявляется ростом агрегационной и секреторной активности тромбоцитов, снижением антитромбиновой активности эндотелия и увеличением тромбопластической активности тромбоцитов, эндотелиоцитов и эритроцитов.

3) Тромбинемия и ПОЛ взаимозависимы. Активация ПОЛ в условиях тромбинемии служит механизмом ее усиления за счет роста про-коагулянтной активности клеток крови

4) Антиоксиданты и антикоагулянты, воздействующие на два звена замкнутого цикла "тромбинемия —рост ПОЛ крови —» тромбинемия ->■ ..." при совместном использовании более эффективно, чем при введении порознь, ограничивают последствия тромбинемии.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ. В исследованиях использовано 1890 белых крыс массой 120±20 г. Внутри экспериментальных групп (10-12 особей) было равное число самцов и самок. Животные содержались на смешанном рационе, сбалансированном по белкам, жирам и углеводам, приготовляемом в виде консистентной массы. Во всех случаях витамины-антиоксиданты вводили в суточную порцию рациона. Суточная доза для каждого из них определялась как произведение суточной потребности крысы на отношение суточной лечебной дозы для человека к его суточной потребности [А.Ш.Бышевский, 1965; В.В.Баканская, 1980] и составляла для витамина А - 0,18 мг, витамина Е - 0,15 мг, витамина С - 45 мг, витамина Р -20 мг на 100 г массы животного. Лечебные дозы для официнальных поливитаминов рассчитывали по витамину А. Дозы и способы введения препаратов тромбина, тромбопластина, гепарина и ацетата свинца приведены в соответствующих разделах.

Все болезненные манипуляции проводили, подвергая животных наркозу диэтиловым эфиром. Пробы крови отбирали из яремной вены, куда осуществляли и инъекции. Образцы крови для гемокоагулоло-гических исследований стабилизировали 3,8% раствором цитрата натрия (9:1) или этим же раствором, содержащим 1,3% е-аминокапроновой кислоты. Отбор проб, их последующая обработка, в том числе получение богатой и бедной тромооцитами плазмы, соответствовали требованиям, принятым для гемокоагулологических исследований TB.n.Banvna и соавт.. 19R01.

Состояние гемокоагуляции оценивали по следующим тестам: 1) активированное время рекальцификации /АВР/; 2) активированное частичное тромбопластиновое время /АЧТВ/; 3) тромбопластиновое время /ТПВ/; 4) содержание ангитромбина III /АТ-Ш/; 5) содержание фибриногена /ФГ/ в плазме крови; 6) этаноловый тест /ЭТ/; 7) содержание продуктов деградации фибриногена/фибрина /ПДФ/.

АВР, АЧТВ, ТПВ изучали согласно описанию Г.Н.Детинкиной и соавт. [1984а, б]. Содержание АТ-Ш исследовали по Hensen, Loeliger в модификации К.М.Бишевского [В.П.Балуда и соавт., 1980], оценивая результат с помощью калибровочной кривой, используя для ее построения пулированную плазму интактных крыс. Уровень фибриногена определяли методом прямой спектрофотометрии [А.Ш.Бышевский, В.С.Мохнатов, 1969], этаноловый тест - как описано у В.П.Балуда и соавт. [1980], содержание ПДФ - по Nanniga et Luest [1967] в модификации А.Ш.Бышевского и соавт. [1989].

Выделение и отмывку цельных эритроцитов для опытов in vitro и исследования в них состояния ПОЛ, а также определение тромбопла-стической активности интактных и гемолизированных эритроцитов проводили согласно описаниям И.Я.Ашкинази [1977].

Подсчет количества тромбоцитов осуществляли согласно унифицированному методу подсчета в камере с использованием фазово-контрастной микроскопии [В.В.Меньшиков и соавт., 1987].

Запись агрегатограмм производили на агрегометре "БиохимМак", применяя в качестве индуктора АДФ в конечной концентрации 2x10"5 моль/л. Оценивая агрегацию, изучали следующие параметры : МА -максимальная степень агрегации; Т - время достижения максимальной степени агрегации; 1/2 Т - время достижения 1/2 от максимальной агрегации; tg а - начальная скорость агрегации, выражающаяся тангенсом угла наклона кривой в первые секунды агрегации [АШ.Бышевский и соавт., 1996].

Выделение и отмывку тромбоцитов для постановки опытов in vitro и оценки состояния ПОЛ проводили согласно описанию А.Б.Самаль и соавт. [1990]. Активность тромбоцитарных факторов Р4 и Р9, а также реакцию высвобождения исследовали по разнице содержания назван-

ных факторов в бедной и богатой тромбоцитами плазме [Г.Х.Довгялло, В.Л.Крыжановский, 1973].

Содержание основных фракций фосфолипидов в мембранах тромбоцитов и эритроцитов определяли методом тонкослойной хроматографии на пластинках "Силуфол" с последующим извлечением фракций и определением неорганического фосфата [Э.Шталь, 1965; В.И.Крылов и соавт., 1975].

Перекисное окисление липидов /ПОЛ/ и антиоксидантную активность исследовали в сыворотке, бедной и богатой тромбоцитами плазме, эритроцитах, тромбоцитах и клеточной смеси эритроциты-С ыwl целью в даиных объектах определяли: 1) общее количество липидов [С.Н.Ельдецова, 1990]; 2) уровень сопряженных диеновых конъюгатов, являющихся первичными продуктами перекис-ного окисления [В.Н.Ушкалова, Г.Д.Кадочникова, 1987]; 3) ТБК-активные продукты, т.е. продукты, реагирующие с 2-тиобарбитуровой кислотой, преимущественно являющиеся вторичными метаболитами перекисного окисления [В.Н.Ушкалова и соавт., 1987]; 4) период индукции, характеризующий медленную стадию ПОЛ; 5) скорость окисления, характеризующую быструю стадию ПОЛ. Совокупность 4 и 5 показателей отражает уровень антиоксидантной активности [В.Н.Ушкалова, Н.В.Ионидис, 1986].

В работе использованы коммерческие препараты отечественных и зарубежных фирм: тромбин и фибриноген (Каунас); тромбопластин (Киров); АДФ, гепарин (Reanal); каолин, гемокоагулологические наборы "Multifibren", "Neothromtin", "Pathromtin", "Calcium-Tromboplastin" (Behring); витамины А, Е, С, Р и поливитаминные препараты "Компли-вит", "Гендевит", "Аэровит", "Глютамевит", "Ундевит" отечественного производства. Все использованные химические реактивы имели квалификацию "х.ч.".

Полученные цифровые данные подвергнуты математической обработке методом вариационной статистики для малых рядов наблюдений. Достоверность различий определена по таблицам Стьюдента-Фишера.

Детали постановки отдельных экспериментов приведены в соответствующих разделах главы "Результаты исследований".

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Сдвиги гемостаза и перекисного окисления липидов крови при первичном индуцировании или блокаде одного из процессов.

Влияние тромбинемии на перекисное окисление липидов. В связи с тем, что нарастание гемостатического потенциала неизменно связано с появлением в кровотоке тромбина [Б.А.Кудряшов, 1975], на начальных

этапах исследования изучали влияние тромбинемии на состояние ПОЛ плазмы и эритроцитов.

Для исключения зависимости трактовки результатов от возможных побочных эффектов, связанных с введением индукторов свертывания крови непосредственно в кровоток, предварительно оценили эффект тромбина на ПОЛ крови в экспериментах in vitro. С этой целью взвесь тромбина, растворенного в 0,14 М растворе NaCl, инкубировали в нарастающих концентрациях с богатой тромбоцитами плазмой крови /PRP/ и взвесью отмытых эритроцитов крыс (15 мин, 37° С).

Введение тромбина (активность 15 с) в конечной концентрации 0,01 мг/мл вызвало рост содержания ДК и ТБК-активных продуктов, сопровождающийся увеличением скорости окисления липидов и падением антиоксидантного потенциала в PRP и эритроцитах (табл.1). Увеличение концентрации тромбина в 5 и 10 раз (0,1 мг/мл - максимальная конечная концентрация тромбина, не вызывающая свертывания PRP в тех же условиях инкубации) вызвало еще более заметные сдвиги, выраженность которых зависела от нарастания уровня прокоагулянта в среде инкубации.

Таблица 1. Интенсивность ПОЛ в PRP и эритроцитах после инкубации их с тромбином in vitro

Инкубируемые ДК, А/мг ТБК, ед/мг ПИ, мин/мл СО,мм3/мл в

системы мин

PRP

Контроль 0,138+0,001 0,84+0,03 52,1±1,6 0,49±0,02

TP-min 0,146+0,002* 0,92±0,02* 48,2±2,3 0,82+0,01*

TP-mid 0,156+0,004* 0,94+0,01* 46,3±1,4* 0,72±0,03*

TP-max 0,164+0,002* 0,98±0,02* 46,7±2,4* 0,64+0,04*

Эритроциты

Контроль 0,178+0,002 0,82±0,01 68,0+1,2 0,37±0,01

TP-min 0,178+0,003 0,94+0,02* 42,0+2,3* 0,87±0,02*

TP-mid 0,179+0,001 1,00+0,01* 40,0±1,4* 1,21±0,01*

TP-max 0,182+0,002 1,02±0,01* 32,0±1,8* 1,59+0,03*

Примечания :ТР-тромбин; min, mid, max - конечная концентрация тромбина в инкубируемых средах ( 0,01, 0,05 и 0,1 мг/мл); здесь и в последующих таблицах: знак "*" обозначает достоверные отличия по отношению к контролю (Р<0,05), ДК -содержание диеновых конъюгатов, ТБК - содержание продуктов, реагирующих с тиобарбитуровой кислотой, ПИ - время поглощения экспериментальной системой 25 мм кислорода, СО - скорость окисления.

Чтобы исключить вклад препаратов тромбина и тромбопластина как источников субстратов пероксидации в интенсификацию свобод-норадикальных процессов, мы исследовали показатели ПОЛ в инкубационной среде, содержащей 0,14 М забуференный раствор NaCl. Как выяснилось, собственно тромбин, как и тромбопластин, не обнаружи-

вают прооксидантной активности, вне зависимости от конечной концентрации в растворе. Из этого следует, что, во-первых, кровь содержит субстраты, посредством которых тромбинемия модифицирует ПОЛ, а во-вторых, что по крайней мере часть этих субстратов связана с клеточными структурами (случай с эритроцитами).

Далее изучили блияния тромбинемии на состояние ПОЛ крови in vivo, индуцируя гемогтатические реакции введением в яремную вену белых крыс взвесей коммерческих препаратов тромбина или тромбо-пластина (0,2 мл/100 г массы).

Таблица 2. Гемокоагуляция у крыс после инъекции взвеси тромбина в яремную вену

Показатели После инъекции тромбина через

0,5 ч 1ч Зч 6ч

АВР, с 68,9+1,2* 71,3±1,6* 43,5+0,7 47,1+0,8

(39,7+0,5) (41,4+1,1) (37,9±0,3) (42,9+0,7)

АЧТВ, с 56,1+3,3* 51,2±2,1* 30,1+1,0 33,4+1,1

(29,2+0,8) (31,0±0,8) (32,1 ±0,9) (30,8+1,1)

ФГ, г/л 1,2+0,05* 0,9±0,08* 2,3+0,06* 2,5±0,07

(2,5±0,03) (2,7+0,04) (2,8+0,05) (2,7+0,06)

ПДФ, мг% 19,6+2,1* 21,9+1,8* 15,0±1,2 16,7±0,9*

(12,6+2,0) (11,4±2,1) (13,5+1,6) (12,3+1,2)

ЭТ, % 83,3 100 27,7 27,7

(0.0) (3.3) (0.0) (0.0)

Примечание. В этой таблице и последующих в скобках приведены данные у контрольных крыс

Таблица 3. Интенсивность ПОЛ в Р№ и эритроцитах крыс после введения

тромбина

Интервал, ч ДК, А/мг ТБК, ед./мг ПИ, мин/мл СО, мм3/ мл в мин

0,5 PRP 0,07+0,01* (0,04+0,01) 1,40±0,08* (1,03±0,01) 21,0±0,3* (47,3+3,7) 2,04+0,2* (0,81±0,3)

Э 0,05±0,01* (0,02+0,01) 0,72±0,05 (0,64±0,07) 20,1±1,6* (28,0+1,7) 1,47±0,2* (0,98±0,3)

1,0 PRP 0,05±0,02 (0,04±0,02) 1,73+0,04* (1,44±0,07) 29,6±1,7* (19,8+0,4) 1,37±0,1* (0,86±0,2)

Э 0,04+0,01 (0,02±0,01) 0,76±0,05* (0,62+0,02) 18,6±1,3* (29,1+0,9) 1,53±0,1* (1,01±0,2)

Примечание. Э - здесь и далее - эритроциты.

Введение тромбина (1 мг/мл) уже к 0,5 ч вызвало выраженную коагулопагию потребления, характерную для П-Ш стадии ДВС - удлинение АВР (на 42,3%) и АЧТВ (на 47,9%), гипофибриногенемия, рост частоты положительных паракоагуляционных проб. Позднее выраже-

ность сдвигов ослаблялась, но их направленность сохранялась до конца наблюдений (табл. 2).

Одновременно активировались своооднорадикальные процессы -как в Р11Р, так и в эритроцитах выявился рост содержания ДК и ТБК, повышение скорости окисления, снижение периода индукции (табл. 3). Наибольшая выраженность сдвигов отмечалась спустя 0,5 и 1 ч после воздействия, совпадая по времени с максимальными отклонениями от

'Ы '•оагл'лолоп!'".-.. :::•: - .

Гемокоагуляционные изменения, вызванные внутривенным введением взвеси тканевого тромбопластина оказались аналогичными -выраженная гипокоагуляция, вызванная потреблением факторов свертывания на фоне роста ПДФ и продуктов паракоагуляции. Это сопровождалось интенсификацией ПОЛ в РКР и эритроцитах - увеличилось содержание ДК и ТБК, выросла скорость окисления при укорочении периода индукции (табл.4). Учитывая, что тромбопластин, попадая в кровоток, имеет единственный безальтернативный механизм участия в свертывающем каскаде [Б.И.Кузник, З.С.Баркаган, 1991], становится очевидным, что его эффект на ПОЛ реализовался через образование тромбина.

Таблица 4. Интенсивность ПОЛ в РЯР и эритроцитах крыс после введения тромбопластина

Интервал, ч ДК, А/мг ТБК, ед./мг ПИ, мин/мл СО, мм / мл в мин

0,5 РЯР 0,0610,01* (0,03+0,01) 1,50+0,06* (1,10+0,01) 23,010,2* (49,2+3,1) 2,13+0,3* (0,79+0,2)

Э 0,0510,01* (0,02+0,01) 0,6910,02* (0,6110,03) 19,011,4* (29,5+1,7) 1,57±0,3* (0,89±0,2)

1,0 РЯР 0,0610,01* (0,03+0,01) 1,6910,03* (1,39+0,06) 30,0+1,5* (20,0+0,3) 1,43+0,3* (0,7910,3)

э 0,05+0,02 (0,02+0,01) 0,78+0,04* (0,6010,03) 19,3+1,1* (27,1+0,6) 1,63+0,2* (0,9710,3)

В следующей серии исследований тромбинемию моделировали различными по этиопатогенезу воздействиями (травматический токсикоз, каловый перитонит, гетерогемотрансфузия), ускоряющими мем-бранодеструкцию и выброс в сосудистое русло активаторов тромбино-генеза (эндогенная тромбинемия).

Травматический токсикоз вызывали наложением на 12 ч сдавливающей лигатуры на бедро задней конечности животного, отбирая пробы крови через 0,5 ч после снятия лигатуры. Создаваемая таким образом модель синдрома длительного раздавливания предполагала развитие ДВС за счет массивной цитодеструкции, поступления в кровоток тромбопласгических субстанций, протеаз, истощения пулов про-

и антикоагулянтов, ухудшения микрогемореологии и выраженной токсемии [Н.А.Горбунова и соавт, 1991].

Таблица 5. Состояние гемокоагуляции и ПОЛ крови у крыс при травматическом

токсикозе.

Исследуемые показатели Интактный контроль Опыт

АВР, с 46,4±1,4 60,811,9*

АЧТВ ,с 30,6+1,8 30,0+1,2

АТ-Ш 135,3±17,0 92,313,2*

ФГ, г/л 2,95±0,33 5,15+0,38*

ПДФ, мг% 7,32+0,59 6,37+0,34

ЭТ, % 0.0 20,0

ДК,А/мг Р11Р 0,04±0,01 0,19+0,09*

Э 0,14±0,05 0,39+0,03*

ТБК, ед/мг РЛР 0,26+0,05 0,56±0,05*

Э 0,84+0,12 1,2310,19

ПИ, мин/мл РЯР 57,7+0,34 30,410,40*

Э 59,7+9,43 21,212,33*

СО, мм1 /мл в мин РЯР 0,96+0,02 1,0810,40

Э 1,1810,15 1,29±0,Ю

Воздействие вызвало выраженные сдвиги гемокоагуляции, характеризующиеся вторичной гипокоагулемией (диссоциация АВР и АЧТВ) на фоне потребления антитромбина III с признаками ДВС (рост положительных паракоагуляционных проб, табл. 5). Выявилась и активация свободнорадикальных процессов - прирост содержания первичных и вторичных продуктов пероксидации сопровождался истощением антиоксидантного звена в РЯР и эритроцитах (укорочение периода индукции и рост скорости окисления).

Далее в качестве тромбининдуцирующего воздействия использовали гетерогемотрансфузию (кровь человека, внутривенно, 0,5 мл/100 г массы), инициирующую плазмокоагуляцию и донорскими клетками как источниками тромбопластина, и разрушающимися клетками реципиента в связи с образованием мембранолитических комплексов [Б.И.Кузник и соавт., 1989].

Введение чужеродной крови вызвало тенденцию к гипокоагуля-ции с потреблением антитромбина-Ш и признаками внутрисосудистого свертывания крови (увеличение уровня ПДФ и частоты положительных паракоагуляционных тестов). Как и ранее в исследуемых фракциях крови активировались процессы липопероксидации - выросло содержание диеновых конъюгатов и ТБК-активных продуктов, что сопровождалось снижением периода индукции и ростом скорости окисления.

Таблица 6. Состояние гемокоагуляции и ПОЛ крови крыс при каловом перитоните.

Исследуемые показатели Интактный контроль Опыт

АВР, с 46,4+1,4 63,8±4,9*

АЧТВ, с 30,6+1,8 29,6+0,6

АТ-Ш, % 135,0±12,0 96,9±3,2*

ФГ, г/л 2,95+0,33 4,16+0,42*

ПДФ, мг% 7,32+0,58 7,51 ±0,52

ЭТ, % 0,0 20,0

Д1С, А/'мг ГЯР 0,04+0,01 0,41+0,12*

э 0,14+0,05 0,27±0,01*

ТБК, ед/мг РЯР 0,26+0,12 1,65+0,13*

Э 0,84+0,12 1,58±0,05*

ПИ, мин/мл РЯР 57,7+0,34 12,7±0,13*

Э 59,7+9,44 18,2+1,28*

СО,мм^ /мл в мин РЯР 0,96+0,02 1,72±0,14*

Э 1,18+0,15 1,27±0,32

Однонаправленные изменения гемостаза и ПОЛ обнаружены и при моделировании инфекционно-септического процесса - калового перитонита, сопровождающегося активацией калликреин-кининовой системы и системы комплемента, вызывающих мембранодеструкцию [А.П.Момоти соавт., 1991]. Воздействие, создаваемое внутрибрюшин-ной инъекцией взвеси каловых масс (0,5 мг/100 г массы) с отбором проб крови через 12 ч вызвало гипокоагулемию потребления (удлинение АВР, снижение активности антитромоина-Ш, положительные этаноловые тесты) при одновременной интенсификации ПОЛ в РЯР и эритроцитах (табл.6).

Таким образом, тромбинемия, независимо от инициирующей ее причины сопровождается активацией свободнорадикальных процессов в крови, интенсивность которых до известных пределов пропорциональна степени тромбинемии. Для подтверждения этого факта мы изучили влияние гепарина на активацию ПОЛ крови тромбином. Его преимущество перед другими антикоагулянтами связано с практически полной индифферентностью по отношению к свободнорадикальным процессам [С.Н.Ельдецова, 1990], что отвечало задачам исследования. Дозы гепарина выбирали такие, которые при внутривенном введении вызывали не менее, чем трехкратное удлинение времени рекальцифи-кации [Е.И.Чазов, 1966].

Убедившись, что инкубация гепарина в конечных концентрациях 2 и 10 ЕД/мл крови с РЯР и взвесью отмытых эритроцитов не вызывает достоверных сдвигов ПОЛ в исследуемых субстратах, мы провели следующий эксперимент : РИР и взвесь эритроцитов инкубировали 10 мин при 37°С с раствором гепарина (10 ЕД/мл) или 0,14 М №С1 (контроль),

после чего вносили в смесь раствор тромбина (0,1 мг/мл, активность 15 с), и спустя 1 ч оценивали состояние ПОЛ.

Введение тромбина заметно активировало ПОЛ - уровень ДК в PRP и эритроцитах увеличился соответственно на 40 и 41%, а ТБК - на 33 и 31%, сократился период индукции, выросла скорость окисления (табл. 7). Предварительное внесение гепарина предупредило сдвиги, вызываемые тромбином, сохранив показатели на исходном уровне.

Таблица 7. Влияние гепарина на сдвиги ПОЛ в PRP и эритроцитах, вызываемые

тромбином in vitro

Инкубируемые системы ДК, А/мг ТБК, ед/мг ПИ, мин/мл СО, мм" /мл в мин

PRP

Контроль 0,083+0,002 0,92±0,02 85,6±2.2 0,49±0,02

Тромбин 0,117+0,004* 1,22±0,03* 54,6+1,4* 0,82±0,04*

Гепарин и тромбин 0,091+0,001* 0,86+0,03 85,0±3,1 0,53±0,01

Эритроциты

Контроль 0,039+0,003 0.64+0,01 72,3±1,6 0,37±0,03

Тромбин 0.055+0,002* 0,84+0,02* 45.0+2.2* 0,77+0,01 *

Гепарин и тромбин 0,043+0,001 0,57±0,04 84,0±2,1 * 0,44+0,02

Таким образом, эффект гепарина на ПОЛ крови реализуется лишь в условиях избыточной концентрации тромбина. Это подтвердилось в опытах in vivo, приступая к которым предварительно исследовали сдвиги гемостаза и ПОЛ при введении гепарина (30 ЕД/100 г массы) в яремную вену животных.

Гепаринизация вызвала стойкий гипокоагуляционный эффект, нивелирующийся лишь к концу наблюдений (3,5 ч), однако, одновременное изучение параметров ПОЛ не выявило достоверных различий между контрольной и опытной группами.

Далее моделировали экзогенную тромбинемию, вводя в яремную вену крыс взвесь коммерческого препарата тромбопластина (активность 14 с, 2 мг/100 г массы). За 5 мин до этого части животных в ту же вену инъецировали раствор гепарина (30 ЕД/100 г массы), а части - в том же объеме 0,9% раствор NaCl.

Развившаяся через 0,5 ч вторичная гипокоагулемия потребления, вызванная инъекцией тромбопластина была заметно ослаблена предварительным введением гепарина, а спустя 1 ч степень отличия коагуля-ционных показателей у гепаринизированных животных от интактного контроля составила лишь 25% по АВР и 22% по ТПВ, что соответственно на 35% и 5% меньше, чем у крыс, не получивших гепарин (табл. 8). Рост уровня первичных и вторичных продуктов ПОЛ, равно как и истощение антиоксидантного потенциала, индуцируемые тромбинеми-ей, также ограничивались предварительным введением гепарина.

Таблица 8. Влияние гепарина на сдвиги гемокоагуляции и ПОЛ крови, вызываемые экзогенной тромбинемией.

Показатели Контроль Тромбопластин Гепарин и тромбо-пластнн

через 0,5 ч

АВР, с 52,0+3,1 97.216,1* 87,011.2*

ТПВ, с 18,5±0,4 27.411.2* 23.212,1

ДК, A/MrPRP 0,044+0,002 0,167+0,010* 0,12210,003*

Э 0,051+0,003 0,145+0.005* 0,080+0.003*

ТБК, ед/мг PRP 0,07+0,01 0.29+0,01* 0,1110.01*

Э 0,15+0,01 0,35+0,01* 0,1410,01

через 1 ч

АВР, с 52,0±3,1 83.513,3* 67,114,1

ТПВ, с 18,5+0,4 23.511,2* 22,012,3

ДК, A/MrPRP 0,044+0,002 0,192 ±0,004* 0,085+0,002*

Э 0,051+0,003 0,129+0,003* 0,10810,004*

ТБК, ед/мг PRP 0,07±0,01 0.27+0,01* 0,1210.01*

Э 0,15+0,01 0.27+0,01* 0,1610.01

В заключение этой части работы мы исследовали эффект гепарина при ложной лапаротомии - состоянии, сопровождающимся поступлением в кровоток тканевых инициаторов тромбиногенеза [В.М.Шафер, 1989]. При этом, части животных на 3-й день после оперативного вмешательства (срок, характеризующий максимальное напряжение гемокоагуляции) внутривенно вводили раствор гепарина (30 ЕД/100 г массы), а остальным - такой же объем 0,9% раствора NaCl, производя отбор проб крови через 1 ч.

Лапаротомия вызвала гиперкоагуляцию (по АВР и АЧТВ) с признаками ДВС (рост ПДФ, положительные паракоагуляционные пробы) при одновременной интенсификации ПОЛ в PRP и эритроцитах. Предварительное введение гепарина ослабило и гемокоагуляционные сдвиги, и рост свободнорадикальных процессов.

Таким образом, гепарин, вещество инертное по отношению к сво-боднорадикальным процессам, тормозит их активацию при состояниях, сопровождающихся появлением в крови избытка тромбина, что подтверждает центральную роль последнего во взаимосвязи между активацией свертывания и ПОЛ крови.

Влияние прооксидантов на гемостаз. В рассматриваемой ниже серии опытов изучали влияние первично индуцируемой пероксидации липидов на состояние плазмокоагуляции, выбрав в качестве проокси-данта ионы свинца, блокирующие SH-группы активного центра ферментов антиоксидантной защиты [ВОЗ.Свинец, 1980].

Как следует из данных табл. 9, 10-дневное введение в состав суточного рациона животных ацетата свинца (5 мг/100 г массы) привело к росту концентрации ДК и ТБК, повышению скорости окисления и

сокращению периода индукции в РЯР и эритроцитах, что сопровождалось рассогласованием показателей общей свертывающей активности (удлинение АЧТВ, укорочение АВР) и компенсаторной активацией ан-титромбинового звена (ДВС 1-Н стадии). Двукратное увеличение дозы препарата усугубило сдвиги гемокоагуляции и ПОЛ, что свидетельствует о дозозависимости эффектов.

Таблица 9. Гемокоагуляция и ПОЛ крови у крыс, получавших ацетат свинца

Показатели Контроль Вводили свинец

АВР, с 34,8±0,7 29,4±1,2*

АЧТВ, с 52,0±2,2 61,3±2,0*

ФГ, г/л 4.2±0,4 4,2+0,3

AT- III, % 123,0±9,3 158,0±5,4*

ДК, А/мг PRP 0,110+0,005 0,340±0,001*

Э 0,100+0,055 0,210+0,001*

ТБК, ед/мг PRP 0,91+0,03 1,41±0,0б*

Э 1,03+0,04 1,44±0,03*

ПИ, мин/мл PRP 46,5±0,1 24,0±0,1*

Э 51,0±1,8 28,0±0,1*

СО,мм3 /мл в мин PRP 0,65±0,08 1,28±0,07*

Э 0,99+0,05 0,88+0,09

Подобная зависимость показателей выявилась и в опытах in vitro -введение в PRP ацетата свинца в конечной концентрации 0,2 мг/мл после 1 ч инкубации (37°С) активировало ее свертывающую активность на фоне значительного усиления ПОЛ.

Чтобы убедиться в том, что взаимодействие прооксидантов с кровью или ее отдельными фракциями вторично сказывается на состоянии гемостаза, мы рассмотрели влияние антиоксидантов на гемокоагуля-цию при состояниях, сопровождающихся ростом ПОЛ крови. Заметим, что составляющие компоненты использованных на данном этапе работы официнальных поливитаминных препаратов и витаминоком-плекса А, Е, С, Р существенно не влияют на свертывающую активность крови и проявляют такой же эффект в совокупности [С.Л.Галян и со-авт., 1989].

Прежде всего исследовали влияние антиоксидантов на гемокоагу-ляцию при первичном индуцировании ПОЛ прооксидантами, используя вышеописанную модель свинцовой интоксикации. При этом часть животных в составе рациона получала дополнительно препарат "Компливит" в дозе, адекватной лечебной.

Введение в рацион "Компливита" не только ограничило активацию ПОЛ в PRP и эритроцитах, но и ослабило гемокоагуляционные сдвиги, вызываемые свинцом (табл. 10). Из того, что "Компливит" при свинцовой интоксикации лимитирует активацию ПОЛ, а в условиях

нормы не изменяет свертываемости крови, следует, что эффект препарата на гемостаз реализовался за счет его антиоксидантного действия. Таким образом, первичный рост ПОЛ крови приводит к активации свертывания, которая, через ускоренное образование тромбина индуцирует свободнорадикальные процессы.

Таблица 10. Влияние "Компливита" на гемокоагуляцшо и ПОЛ у крыс при свинцовой интоксикации.

Показатели Контроль Вводили Ком-пливит Вводили свинец Вводили Ком-пливит и свинец

АВР, с 35,1±1,1 34,8+2,3 30,5±1,5* 33,3+1,9

АЧТВ, с 51,7±2,5 52,3+3,1 59,1+2,7* 53,1+4,2

АТ-Ш, % 113,0+8,1 112,0+7,4 134,0+3,1"" 114,0±5,3

ФГ, г/л 3,9+0,4 4.2+0,7 3,8+0,4 4.0±0.3

ДК, А/мг РЯР 0.120+0,001 0,070+0,01* 0,340+0,01 * 0.270±0,02*

э 0,110+0,035 0,080+0.01 0.220+0,01* 0,180±0.09*

ТБК ,ед/мг РЛР 0,89+0,03 0,70+0,02* 1,43+0,07* 1,26+0.07*

Э 1,04+0,05 0.87±0,03* 1,44±0,03* 1.36+0,03*

ПИ, мин/мл РЯР 47.2+0,1 64,3+1,2* 23,8+0,2* 32,0+0,1*

Э 50.0+0,1 69,7+1,4* 27,8±0,1* 38,0±0,1*

СО, мм3 /мл в мин РИ> 0,61+0,03 0,49±0,04* 1,28+0,07* 0,98+0,09*

Э 0,99+0,05 0,72+0.06* 1,32+0,06* 1,11+0,02*

Таблица 11. Влияние витаминов А, Е, С, Р на гемокоагуляцшо и ПОЛ у крыс при введении тромбопласгина.

Показатели Контроль Тромбопластин Тромбопластин на фоне А, Е, С, Р

АВР, с 39,5±0,7 69,3+0,5* 48,7±0,4*

АЧТВ, с 28,3+0,2 95,7±1,5* 61,4±0,8*

АТ-Ш, % 77,0±0,9 67,0±1,5* 87,2+2,2*

ФГ, г/л 3,4+0,3 0,9+0,2* 1,1+0,2*

ЭТ, % 0,0 83,3 0,0

ДК, А/мг РЯР 0,040±0,001 0,060±0,001* 0,050+0,010*

Э 0,040±0,001 0,030+0,010 0,050+0,010

ТБК, ед/мг РЛР 1,04±0,01 1,40+0,08* 1,03±0,02

Э 0,71 ±0,06 0,65+0,04 0,84±0,08

ПИ, мин/мл РЯР 49,5±3,8 20,6±2,3* 37,6+7,4

Э 20,0±1,6 26,6+8,0 24,7±4,2

СО,мм3 /мл в мин РИР 0,76±0,07 2,02+0,25* 1,11+0,35

э 1,46±0,18 1,30±0,10 1,38+0,52

Далее изучили возможность коррекции гемостаза антиоксиданта-ми при моделировании тромбинемии, воспроизводимой введением в

яремную вену крыс взвеси коммерческого тромбопластина (активность 14 с, 2 мг/100 г массы). Предварительно часть животных в течение 12 дней получала в составе суточного рациона лечебные дозы витаминов А, Е, С и Р.

Введение тромбопластина вызвало через 0,5 ч коагулопатию потребления - удлинение АВР и АЧТВ, снижение уровня фибриногена, рост частоты положительных паракоагуляционных проб. У витаминизированных крыс выраженность сдвигов была заметно ослаблена -прирост АВР уменьшился на 53%, АЧТВ - на 121%, отсутствовали положительные паракоагуляционные тесты, а падения активности антитромбина III не произошло (табл. 11). Одновременно ограничился вторичный подъем ПОЛ крови. Сходные результаты были обнаружены и через 1 ч, следовательно, антиоксиданты сократили и период нормализации гемостатических сдвигов.

Учитывая это, а также исходя из того, что гипертромбинемия нередко приводит к развитию тромбогеморрагических осложнений, тяжесть которых зависит от выраженности коагуляционных сдвигов и степени повреждения органных структур [Д.Д.Зербино, Л.Л.Лукасевич, 1989], мы далее исследовали возможность антиоксидантов ограничивать летальность животных от тромбогеморрагий, возникающих при введении взвеси тканевого тромбопластина в дозе 1Х>зо [Б.А.Кудряшов, 1960]. Часть животных в течение 12 дней получала лечебные дозы одного из поливитаминных комплексов, а на 13-й день всем крысам вводили в кровоток взвесь тромбопластина (4 мг/100 г массы, активность 14 с), учитывая исходы - гибель или выживание - на протяжении 24 ч.

Таблица 12. Влияние предварительной витаминизации на толерантность крыс к

тромбопластину

Группы животных Всего крыс Выжили Погибли Частота гибели, % к контролю

Контроль 31 14 17 100

Вводили поливитамины:

Гендевит 48 41 7 26.6

Аэровит 50 40 10 36,5

Глютамевит 50 34 16 47,2

Ундевит 50 37 13 47,4

А, Е, С, Р 42 26 16 78,4

Вводили поливитамины:

Контроль 30 15 15 100

Компливиг 31 18 13 83,8

Предварительная витаминизация существенно снизила частоту гибели животных при введении им индуктора тромбиногенеза, вызывающего ДВС (табл. 12). Следовательно, ограничение гипероксидации,

ÍJ ¿¡».. y^iiv L> o .i j . Í/Í. ti. i. o.,

мые им гемокоагуляционные сдвиги, что проявляется снижением частоты связанных с ними летальных исходов.

ДК, А/мг

ИК ТП ТП+Вит ТП+Г ТП+Вит+Г

ТБК, ед/мг

0,4

ИК ТП ТП+Вит ТП+Г ТП+Вит+Г

Рисунок 1. Влияние раздельного и сочетанного введения витаминов А, Е, С, Р и гепарина на содержание продуктов ПОЛ в эритроцитах крыс при экзогенной тромбо-

пластинемии

Примечание: здесь и далее - ИК - интактный контроль; ТП - вводился тромбопла-стин; ТП+Вит - вводился ТП на фоне витаминов; ТП+Г - вводился ТП на фоне гепарина; ТП+Вит+Г - вводился ТП на фоне витаминов и гепарина

Обнаружилось также, что введение препарата "Компливит" в рацион животных, подвергающихся свинцовой интоксикации, оказывает сходный эффект при нагрузке их тромбопластином в дозе ЬЛЭзо -частота гибели снизилась на 34,5%. Сравнение влияния "Компливита" на выживаемость крыс при тромбопластинемии с сочетанным воздействием свинца и без него, показывает, что эффективность препарата была почти в два раза выше в первом случае. Это свидетельствует о том, что чем выраженнее тромбинемия и вызываемая ею интенсифика-

ция свободнорадикальных процессов, тем нагляднее проявляется защитное действие антиоксидантов.

Поскольку, гипероксидация липидов крови является промежуточным звеном в цепи тромбининдуцируемых реакций, ограничение последствий, вызываемых тромбинемией можно осуществлять различными путями. В связи с этим, мы изучили в сравнении влияние антикоагулянтов, антиоксидантов и их сочетания на ПОЛ в PRP и эритроцитах при тромбинемии, вызываемой внутривенным введением взвеси тканевого тромбопластина (2 мг/100 г массы, активность 14

с).

При рассмотрении диаграмм на рис. 1, видно, что воздействие на два звена замкнутого цикла "тромбинемия—»рост ПОЛ крови->-тромбинемия" позволяет более эффективно ограничивать прирост ПОЛ, а, следовательно, и интенсивность вторичного усиления гемоста-тических реакций.

Сравнительная оценка вклада тромбоцитов и эритроцитов в активацию ПОЛ тромбином. В вышеописанных экспериментах в качестве субстратов использовались PRP и взвеси отмытых эритроцитов. Если в последнем случае очевидно, что сами клетки отвечали на воздействие тромбина активацией ПОЛ, то в первом этот эффект мог опосредоваться компонентами плазмы. В связи с этим мы изучили реакцию плазмы крови, освобожденной от клеток, на введение тромбина (0,1 мг/мл, активность 15 с) in vitro (37°С, экспозиция 15 мин).

Как оказалось (табл. 13), инкубация тромбина с бесклеточной плазмой не изменяет содержания первичных и вторичных продуктов ПОЛ, недостоверно сокращает период индукции и в малой степени (на 16,3%) повышает скорость окисления. Следовательно, эффект на ПОЛ тромбин реализует не через освобожденную от клеток плазму. Это тем более очевидно, если учитывать, что инкубация тромбина с дефибри-нированной плазмой (сывороткой) при аналогичных условиях инкубации выявила схожие результаты.

Таблица 13. Влияние тромбина на состояние ПОЛ бесклеточной плазмы крови in

vitro

Показатели Плазма без клеток Плазма без клеток + тромбин

ДК, А/мг 0,035+0,002 0,040+0,001

ТБК, ед/мг 1,08+0,08 1,08+0.09

ПИ, мин/мл 65,0±6,8 54,0±2,1

СО, мм3 /мл в мин 0,61+0,03 0,71+0,04*

Далее мы провели опыты с выделенными из 0,5 мл крови эритроцитами и тромбоцитами, исследовав ПОЛ после инкубации их с раствором тромбина. Обнаружилось, что по сравнению с бесклеточной

плазмой в эритроцитах выше содержание первичных продуктов ПОЛ и скорость окисления. Инкубация их с тромбином увеличила содержание ДК (на 11,1%), сократила период индукции (на 42,3%) и повысила скорость окисления (на 15,8%), т.е. тромбин активировал в эритроцитах ПОЛ (табл. 14).

В тромбоцитах заметно выше, чем в эритроцитах оказалось со-^срлчы!!!! С 11р * С Б ГТО^Т «3 р £»ЗС») ? КОрОЧ^ ПСрИОД ИИДуК-

ции при такой же как в эритроцитах скорости окисления. Реакция тромбоцитов на добавление тромбина была аналогичной реакции эритроцитов - рост содержания ДК (на 44%; и ТБК (на 9%), укорочение периода индукции (на 30%).

Таблица 14. Влияние тромбина (0,05 мг в пробе) на состояние ПОЛ в эритроцитах и тромбоцитах in vitro (инкубация 15 мин)

Показатели Эритроциты Эритроциты + тромбин Тромбоциты Тромбоциты + тромбин

ДК, А/мг 0,080+0.002 0.090+0.003* 0.090±0.002 0.130±0,01*

ТБК, ед/мг 0,80+0.05 0,92+0,06 2,46±0,04 2.68±0,07*

ПИ, мин/мл 52,1+3,2 30,1+3,3* 46.2±2,1 32,3+2.0*

СО, mmj /мл в мин 0,90+0,01 1,07±0,02* 0,87±0,08 0,94+0,01

Примечание: знак "*"- достоверно относительно данных из соседней левой строки

%

Рисунок 2. Степень изменения показателей ПОЛ при инкубации с тромбином эритроцитов (Э), тромбоцитов (Т) и их смеси (Э+Т)

Изучение влияния тромбина на ПОЛ в смеси эритроциты-тромбоциты, полученной из того же объема крови при сохранении условий инкубации и дозы тромбина, показало, что клеточная смесь обнаруживает ДК и ТБК в количестве, составляющем сумму таковых для отдельно взятых эритроцитов и тромбоцитов. Величина периода индукции также увеличивалась, а скорость окисления оказалась ниже,

чем в каждом виде клеток порознь. После инкубации с тромбином интенсивность ПОЛ в смеси возросла заметно в большей степени, чем при инкубации тромбина с отдельно взятыми клетками (рис. 2). Следовательно, тромбинемия усиливает и процессы межклеточных взаимодействий, что позволяет ускорить активацию ПОЛ и увеличить его интенсивность.

Для уточнения представления о разной способности тех и других клеток реагировать на тромбин, мы провели опыты с их возрастающим количеством в заданном объеме - в ряд пробирок, содержащих по 1 мл дефибринированной бесклеточной плазмы и 1 мг тромбина (активность 15 с) добавляли возрастающие количества эритроцитов или тромбоцитов, оценивая ПОЛ по истечении 15 мин (табл. 15).

Таблица 15. Влияние количества эритроцитов и тромбоцитов на состояние ПОЛ в плазме, свободной от клеток при тромбинемии in vitro

Концентрация ДК, АУмг ТБК, ед/мг ПИ, мин/мл СО, мм3/ мл в

клеток мин

Эритроциты

0,0 0.004±0.000 0,06+0,00 26,1 ±1.9 1,12±0,02

0,1 0,008+0,001* 0,10+0,01* 28,2±2,1 1,02±0,02*

0,3 0,029+0,001* 0,38+0.02* 32,3 ±3,2 0,99+0.01*

0,5 0,048+0,002* 0,46+0,02* 54,2+4,6* 0,82±0,01*

1,0 0,092+0,100* 0,92+0,03* 80,4+7,3* 0,74±0,09*

Тромбоциты

0,05 0,072+0,009* 1,18±0,06 24,1±2.0 1,11+0.01

0,1 0,121+0,012* 1,28+0,05* 30,1±2,3 1,00+0,01*

0,3 0,182+0,017* 1,41+0,06* 30,5±2.2 0,94+0,01*

0,5 0,200+0,023* 2,36+0,07* 42,0±2,9* 0,72+0,01 *

1,0 0,234+0,031* 3,73+0,08* 54,1+3,2* 0,68±0,01*

Примечание. Экспериментальная смесь содержит 1 мл дефибринированной бесклеточной плазмы и 1 мг тромбина; за единицу количества клеток принято их содержание в 1 мл исследуемой плазмы.

Оказалось, что при 10-кратном увеличении содержания тромбоцитов прирост уровней ДК и ТБК был выраженнее, чем в случае с эритроцитами соответственно в 2,5 и 4,1 раза, а период индукции при максимальной концентрации тромбоцитов был в 1,5 раза короче, чем при максимальной концентрации эритроцитов. Таким образом, тромбоциты значительно активнее реагируют на тромбин активацией ПОЛ (что особенно наглядно проявляется при их малой концентрации), являясь, по всей вероятности, основными инициаторами усиления тромбинза-висимых сдвигов ПОЛ крови.

Далее мы более подробно изучили роль отдельных клеточных структур в усилении тромбиногенеза через активацию ПОЛ крови.

Роль тромбоцитов во взаимосвязи гемостаза и ПОЛ крови.

Предположив, что интенсификация свободнорадикальных процессов под действием тромбина инициирует в тромбоцитах цепь реакций, приводящих к проявлению их гемостатической активности, мы прежде всего изучили влияние экзогенной тромботастинемии на состояние ПОЛ в тромбоцитах и их АДФ-зависимую агрегацию.

Введение в яремную вену белых крыс тромбопластина в дозах,

БьШлЬ^х^ЦЦ!-!». ¿ч^ыГуЛОГ.ыТиЮ ПОХрСоЛ^НЦл у2 1\1Г/ , ^О Г УШ^'Л»!, акТ^ьНОСТЬ

15 с) активировало ПОЛ в тромбоцитах - уже спустя 15 мин после воздействия уровень ДК вырос на 97,8%, а ТБК - на 126%; сократился период индукции при росхе скорости окисления. Пик изменений, пришелся на период 0,5 - 3 ч, а к 6-му часу сохранялась наиболее высокая концентрация первичных и вторичных продуктов пероксидации (табл. 16).

Таблица 16. Влияние экзогенной тромбопластинемш на состояние ПОЛ в тромбоцитах

Показатели ДК, А/мг ТБК, ед/мг ПИ, мин/мл СО, мм"1 / мл в мин

Исходные 0,138+0,006 0,66+0.01 52,0±0,4 0,7210.07

ТП - 0,25 ч 0.27310,015* 1,4110,03* 40,010.2* 0,9410,07

ТП - 0,5 ч 0,36810,007* 1,6310,06* 27,010,2* 1,10+0,11*

ТП - 1 ч 0,312+0,021* 1,86+0,09* 32,0±0.1* 0,9810,07*

ТП-Зч 0,407+0,022* 1,7510,01* 18,010,1* 1.2110,11*

ТП-бч 0,427+0.025* 1,9110,08* 20,010,2* 1,1210,20*

ТП - 24 ч 0,21910,007* 1,3810.05* 46,010,4* 1,00+0,11

Примечание : ТП - тромбопластин, цифры в левой колонке обоз-

начают время после введения тромбопластина 160 т -

Рисунок 3. Влияние экзогенной тромбопластинемии на количество тромбоцитов (КТ, тыс/10"5л) и агрегационную активность (МА, %)

Одновременно, уже через 0,5 ч наблюдалась выраженная тромбо-цитопения потребления, сопровождающаяся подавлением агрегацион-ной функции. Выброс более молодых форм скомпенсировал уменыпе-

ние количества клеток лишь к 6-му часу, однако их способность к агрегации оставалась сниженной даже к 24 ч (рис. 3).

Подавление реакции тромбоцитов на индуктор агрегации свидетельствует об истощении механизмов адекватного клеточного ответа после избыточной активации. Отметим, что, максимальные изменения выявились в интервале времени между 0,5 и 3 ч, что указывает на параллелизм сдвигов ПОЛ в тромбоцитах и их функциональных способ-

—V-----• —- ...........- - • ••--—•

дантов на изменения агрегационной активности и реакцию высвобождения тромбоцитов при тромбинемии, используя ту же модель, что и в предыдущем опыте. Часть крыс предварительно получала 12 дней в составе рациона витамины А, Е, С, Р.

Как оказалось, введение антиоксидантов снижает в тромбоцитах уровень ДК и ТБК и удлиняет период индукции. Последствия воздействия тромбопластинемии на состояние ПОЛ в тромбоцитах, и гемо-коагуляционные сдвиги также заметно ослаблялись предварительной витаминизацией. В то же время, витаминизация ограничила развитие тромбоцитопении потребления, вызванное тромбопластинемией:- в контроле число тромбоцитов через 0,5 ч снизилось более, чем в 10 раз, а в опыте - лишь в 2,9 раза (рис. 4).

тыс./мкл

Hex 0,5 ч 1ч 6 ч 24 ч

Рисунок 4. Влияние антиоксидантов на содержание тромбоцитов в крови крыс в разные сроки после введения тромбопластина. Примечание: ТП - показатели крыс, не получавших витамины; ТП+Вит - показатели крыс, получавших витамины.

Исследование агрегатограмм выявило, что через 0,5 ч после воздействия в контроле резко угнеталась агрегационная активность -начальная скорость агрегации упала на 70,5%, а степень агрегации - на 90,6%. Гипоагрегабельность выявлялась до конца наблюдений - если показатели Т и 1/2 Т нормализовались к 6-му часу, то МА к 24 ч оста-

валась сниженной на 33,8%, а а - на 10%, т.е., скорость и интенсивность процесса не достигали исходного уровня (табл. 17). У крыс, получавших витамины спустя 0,5 ч скорость агрегации упала лишь на 15,6%, достоверно не отличаясь от исходных значений, а МА уменьшилась на 17,6% (в 5,1 раза меньше, чем в контроле). К 3-му часу все показатели достигли первоначальных величин.

"ллца 17. Влияние антиоксидантов на показатели агрегатограмм при экзогенной тромбопластинемии

Показатели МА, % Т, с 1/2 Т, с а

Исходные 59,1 + 1,6 51,0±4,3 90,8+2,6 96,0+1,5 20,0+0,4 20.2+1,6 4,85+0,13 5,74±0,88

ТП - 0,5 ч 5,5+2,4* 42,0+9,1 38,7+0,4* 44,5+2,0* 14,4+0,3* 14,5+1,0* 1,43+0,05* 4.84+0,75

ТП-Зч 33,1±9,6* 57,6±4,3 68,0+4,9* 95.5+4,6 26,3+1,8* 20,7+0,3 1,49±0,17* 5.51+0,49

ТП-бч 41,0+3,1* 57,2+3,1 91,0+3,5 108.5±6.8* 22,7+0,7 25,0+0.8 3,57+0,29* 4,61 ±0.15

ТП - 24 ч 39,1+3,7* 50,3+2,5 92,5±6,2 109,0±4,9* 21,6±0,2 24,0+0,9 3,56+0,31* 4,19±0,32

Примечания : в верхней строке - крысы не получали витамины, в нижней - получали; "*" - достоверно по сравнению с соответствующими показателями до воздействия; МА - максимальная степень светопро-пуекания, Т - время достижения МА, 1/2 Т - время достижения 1/2 МА, tg а - начальная скорость агрегации

Таким образом, ограничение ангиоксидантами свободнорадика-льных процессов в тромбоцитах снижает их активацию, агрегацию и потребление. Это подтвердило исследование реакции высвобождения из тромбоцитов факторов Р4 и Р9 в момент наибольшего напряжения гемостаза - через 0,5 ч после введения тромбопластина.

Тромбопластинемия уменьшила вклад тромбоцитов в антигепариновую активность плазмы, что говорит о свершившемся высвобождении фактора Р4 из клеток. Об этом же свидетельствует и удлинение на 44% времени свертывания РРР (табл. 18). У витаминизированных животных исходный уровень фактора Р4 в тромбоцитах был ниже на 16%, но при тромбопластинемии его вклад в общую антигепариновую активность плазмы даже увеличился на 26%, т.е., реакция высвобождения' была выражена в меньшей степени. Ослабление при этом прироста г РРР подчеркивает ускоренное расходование фактора Р4 у невитами-низированных животных как отражение общей реакции потребления прокоагулянтов.

Таблица 18. Влияние антиоксидантов на высвобождение фактора Р4 из тромбоцитов при экзогенной тромбопластинемии

Показатели Тромбопластин не вводили Тромбопластин вводили

Контроль Опыт Контроль Опыт

t PRP, с 40,0+1,6 37,4±1,6 72,0+1,8* 51,8±8,3

t РРР, с 75,8+4,3 54,2+3,5* 121,4±5,1* 85,2+2.2*

К,% 47.211.2 31,0+1,4* 44,5+0.6* 39,3±2,2*

Примечания : t РРР и t PRP- время свертыьаииь бедной и бохатой тромбоцитами плазм в системе, содержащей плазму, раствор гепарина и раствор тромбина; K=(t РРР -1 PRP /1 РРР) х 100%; знак "*" - отличия достоверны между 2-й и 1 -й, 3-й и 1-й к 4-й и 2-й колонками.

Усиление реакции высвобождения при тромбопластинемии отмечалась и при исследовании тромбоцитарного фибринстабилизирую-щего фактора - вклад тромбоцитов невитаминизированных животных в создание фибриназной активности плазмы после воздействия снизился на 7,6%, что свидетельствует об их повышенном потреблении и усилении реакции высвобождения. Витаминизация компенсировала обозначенные сдвиги.

Влияние антиоксидантов на морфологию тромбоцитов при тромбинемии (электронная микроскопия). Учитывая, что активация тромбоцитов, предполагает морфологическую перестройку внутриклеточных структур [В.К.Вашкинель, М.Н.Петров, 1982], представлялось интересным изучить структурные характеристики тромбоцитов в условиях гипертромбинемии и возможность их модификации предварительным введением антиоксидантов. Для создания острого ДВС-синдрома коммерческий препарат тромбопластина вводили в дозе LD50. Пробы крови у выживших животных, часть которых предварительно получала комплекс витаминов А, Е, С, Р, отбирали спустя 0,5, 3 и 24 ч, после чего выделенные тромбоциты фиксировали по описанию В.П.Балуда и соавт. [1980]. Все электронномикроскопические исследования проводились в лаборатории кафедры патологической анатомии медицинской академии им. И.М.Сеченова.

Введение тромбопластина контрольным животным привело к массовому разрушению кровяных пластинок - уже спустя 0,5 ч в микропрепаратах обнаруживались лишь единичные тени клеток и остатки элементов цитозоля при полном отсутствии цельных тромбоцитов, что можно было расценить как результат избыточной активации, потребления и последующей элиминации поврежденных цитотоксическими комплексами клеток (признак, характерный для острого течения ДВС крови). К 3-му часу опыта среди большей части разрушенных тромбоцитов выявлялись отдельные опустошенные клетки с единичными плохо сохраненными а-гранулами. Плазмолемма у этих клеток была сохранена. Через 24 ч общая структура тромбоцитов восстанавлива-

лась, характеризуясь наличием внутриклеточных органелл, компар-тментализированных цитоплазматической мембраной от внешней среды. Вместе с тем, в большинстве своем клетки оказались дегранулиро-ванными с признаками активации (разнообразие форм, наличие псевдоподий).

У крыс, получавших антиоксиданты, спустя 0,5 ч после введения тромбопластина наблюдалась активация тромбоцитов .- их форма от эллипсоидной (дискоциты) изменялась до округлой, в большей степени с псевдоподиями (сфсроциты и сфероэхиноциты). Структура клеток была полностью сохранена. Через 3 ч среди активированных клеток обнаруживались тромбоцитарные агрегаты. Уменьшалось количество электронно-плотных телец за счет их дегрануляции при сохранении общей структуры тромбоцитов. К концу наблюдений выявлялись лишь признаки активации, а состояние внутриклеточных структур (соотношение электронно-плотных телец, а-гранул и лизосом) было близко к норме.

Таким образом, использование блокаторов ПОЛ способствует сохранению нормальной морфологической структуры клеток в условиях гипертромбинемии, уменьшая, тем самым, вклад тромбоцитов в усиление тромбиногенеза. Последнее, как известно, во многом определяется активностью пластиночного фактора Р3 [З.С.Баркаган и соавт., 1988], в связи с чем далее мы исследовали влияние антиоксидантов (витаминов А, Е, С, Р) на тромбопластическую активность и фосфо-липидный спектр тромбоцитов.

Определяя общую тромбопластическую активность /ТПА/, клетки разрушали осмотическим шоком, центрифугировали (1500 g 20 мин), ресуспендировали осадок в 0,14 M NaCl, после чего в системе АЧТВ определяли ТПА. В той же системе изучали ТПА цельных тромбоцитов, с той лишь разницей, что клетки не подвергали разрушению. Стандартизация тромбоцитемии (147,5 х 10%) позволила оценить и вклад нативных тромбоцитов в общую (после цитолиза) ТПА, который выражали в процентах и обозначали как тромбопластический индекс цельных тромбоцитов /ТИЦТ/.

Как видно из табл. 19, у контрольных животных цельные тромбоциты укоротили время образования сгустка на 15,5%, а разрушенные -на 30,5%. На фоне введения антиоксидантов существенно снизилась ТПА лизированных клеток, а эффект нативных не отличался от контроля. Следовательно, рост ПОЛ индуцирует общую тромбопластическую активность, что реализуется наиболее выражение при мем-бранодеструкции.

Таблица 19. Влияние антиоксидантов нз тр^'-^иластичеспчо активность тромбоцитов

Показатели Витамины не получали Получали витамины

Разрушенные клетки

АЧТВ, с 69,5+1.1 77,0+2,1*

Степень отклонения от 50,5x1,3 23,5x2,2*

контроля,%

Цельные клетки

АЧТВ, с 24,5x2,3 84,1+2,1

Степень отклонения от 15,5+1,4 15,9+2,4

контроля, %

ТИЦТ, % 50.8+3.6 67,7+4,3*

Примечание: достоверность указана по отношению к показателям

из левой колонки.

Описанные изменения ТПА тромбоцитов, исходя из современных понятий о природе "неполного" тромбопластина, могут рассматриваться как изменения липидной составляющей мембран [2\уаа1, 1982]. Это обосновало необходимость исследования фосфолипидного спектра мембран тромбоцитов на фоне витаминизации в обычных условиях и при тромбинемии (табл. 20).

Введение витаминов А, Е, С, Р существенно не повлияло на общее содержание определявшихся липидов (в пересчете на единицу объема тромбоцитарной массы) и количество фосфолипидов, однако, изменило соотношение фосфолипидных фракций - снизились уровни фосфа-тидилсерина (ФС), фосфатидилхолина (ФХ) и лизоформ (ЛФХ) при росте содержания фосфатидилэтаноламина (ФЭА), сфингомиелина (СМ) и суммарного содержания легкоокксляемых фракций (ФС+ФЭА -35% против 33% в контроле). Это позволяет предполагать, что уменьшение тромбопластической активности тромбоцитов на фоне антиоксидантов может быть связано со снижением уровня ФС, которому приписывается основной вклад в формирование ТПА [Д.М.Зубаиров, В.Н.Тимербаев, 1991]. Прирост же суммарного содержания легкоокис-ляемых фракций и снижение лизоформ свидетельствуют о том, что витаминизация ограничивает липидную перестройку мембран, вызванную протекающими на обычном уровне процессами ПОЛ и, вероятно, снижает активность фосфолипазы А2, подтверждением чему служит снижение агрегабельности тромбоцитов на фоне антиоксидантов.

Вызываемая через 0,5 ч после внутривенного введения взвеси тромбопластина (2 мг/100 г массы, активность 15 с) активация свобод-норадикальных процессов в тромбоцитах привела к почти 4-кратному снижению уровня фосфолипидов при росте содержания лизоформ и падении уровня ФХ (табл. 20). У витаминизированных животных снижение уровня фосфолипидов заметно ограничилось, причем суммарное

содержание ФС и ФЭА было на 4,5% (Р< 0,05) выше, чем в контроле. Процент лизоформ также не достигал показателя у невитаминизиро-ванных животных.

Таблица 20. Влияние антиоксидантов на фосфолипидный спектр мембран тромбоцитов при тромбинемии

Исследуемые Интактцый кон- Вводили ТП Вводили ТП и

показатели троль витамины

Общие липиды, мг/мл суб- 7.40±0.05 4,18±0,06* 6.27±0,10*

страта

Общие фосфолипиды, мг/мл субстрата 4,26±0,04 1,44+0,04* 2,06±0,06*

Фосфатидилхолин, % 34,0±1.2 13,0+2.2* 26.0+3,1*

Фосфатидилсерин, % 27,1+2,6 16,8+3,1 * 6.2+1.1*

Фосфатидилэтаноламин, % 6.7±0,4 18.0+2,4* ЗЗ.Ш.5*

Сфингомиелин, % 22.9±1,2 28,4±1,3* 16.5+3.3*

Лизофосфатидилхолин, % 9.3+1 Л 23.8+1.2* 18.2±1.1*

Примечание : ТП - тромбопластин

Таким образом, тромбинемия через активацию ПОЛ вызывает количественную и качественную перестройку фосфолипидов мембран тромбоцитов, приводящую к росту ТПА, что ослабляется предварительным введением антиоксидантов.

Влияние антиоксидантов на агрегацию тромбоцитов при эндогенной тромбинемии. Для индуцирования тромбиногенеза в следующей серии опытов использовали кровоизвлечение и адреналинемию -известно, что кровопотеря вызывает рост ТПА плазмы крови [О.А.Терсенов, 1989], а катехоламины инициируют внутренний путь образования протромбиназы, являясь, кроме того, проагрегантами [МеМа е.а., 1989]. Часть животных, в течение 12 дней до воздействия получала витаминокомплекс А, Е, С, Р.

Спустя 1 ч после кровоизвлечения (25-30% от объема циркулирующей крови) в тромбоцитах повысилось содержание ДК (на 30%), ТБК-активных продуктов (на 18%), сократился период индукции, возросла скорость окисления. В динамике сдвиги нарастали в течение 6 часов и не достигали исходных цифр к концу наблюдений. Предварительное введение витаминов заметно ограничило прирост уровня продуктов пероксидации, удлинило период индукции и снизило скорость окисления.

Число тромбоцитов после кровопотери снижалось особенно вы-раженно к 3-му часу, и отчасти восстанавливалось через 6 ч. На фоне антиоксидантов к 6-му часу исходный уровень полностью восстановился (табл. 21).

Таблица 21. Влияние шгиоксидантоь на кол»*___-о -- ч______-

ви крыс, подвергшихся кровопотере.

Интервал, ч Без витаминов На фоне витаминов

Исходные показатели 555±9 649+45

Через 1 ч 433±8 437117

Через 3 ч 337+6 41319*

Через 6 ч 469+7 622134

Через 24 ч 610+49 508122

Наряду с тромбоцитопенией в контроле наблюдалось кратковременное снижение (через 3 ч) агрегационной активности - уменьшение МА, укорочение Т и 1/2Т (табл. 22). Витаминизация активировала аг-регационную функцию за весь период наблюдений. Последнее свидетельствует о том, что антиоксиданты снижают готовность тромбоцитов к агрегации - видимо, поэтому относительно слабая тромбинемия после кровоизвлечения не снизила агрегационную активность на фоне антиоксидантов, а, наоборот, повысила.

Таблица 22 Влияние антиоксидантов на агрегацию тромбоцитов после кроволоте-

ри.

Интервал, ч МА, % Г, с 1/2 Т, с tga

Исходные показатели 47,7±2,8 (55,311,4) 96,0+2,6 (90,8+1,5) 20,211,6 (20,010,4) 5,74+0,88 (4,85+0,13)

Через 1 ч 70,811,0* (53,414,4) 101,612,1 (79,714,1*) 16,210,7* (17,7+0,5*) 8,8210,28* (5,8510,49*)

Через 3 ч 58,113,0* (49,612,1*) 86,8+3,6* (77,016,7*) 17,5+0,6* (17,4±0,6*) 6,8310,52 (5,5810,51)

Через 6 ч 50,1+3,5 (54,614,9) 70,8+1,7* (88,411,5) 19,610,7 (20,6+0,9) 5,3310,54 (5,8010,70)

Через 24 ч 79,311,8* (74,6+1,5*) 94,8+3,1 (88,2+2,9) 16,610,6* (15,810.2*) 9,6810,28* (10,810,31*)

Адреналина гидротартрат вводили подкожно (0,18% раствор, 0,1 мл/100 г массы), спустя 1,3, 6 и 24 ч отбирали пробы крови.

Воздействие вызвало в контроле потребление тромбоцитов спустя 1 ч, чего не наблюдалось на фоне витаминов. Снижение агрегационной функции сменилось у контрольных животных гиперагрегабельностью к 3-му часу, сохраняющейся до конца исследований (табл. 23). Степень падения агрегационной активности на фоне антиоксидантов через 1 ч составила 13,4%, что в 3,2 раза меньше, чем в контроле. В динамике агрегабельность тромбоцитов витаминизированных крыс также была выше, чем в контроле. Параллельное исследование состояния ПОЛ выявило его активацию в тромбоцитах у невитаминизированных животных, что ослаблялось введением антиоксидантов.

Таблица 23. Влияние антиоксидантов на агрегацию тромбоцитов при адреналнне-

мии

Интервал, ч МА, % Т, с 1/2 Т, с ^ а

Исходные по- 50,7±4,3 96,6+1,5 20,2+1,6 5,74±0,88

казатели (51,7+1,4) (90.8±2,6) (20,0±0.4) (4.85±0.13)

Через 1 ч 43,9+2,8 83,0±1,7* 18,9±1,0 4,65±0,46

(29,7±2.5*) (65.0+5,8*) (17.2±0,7*) (3.38±0,34*)

Через 3 ч 71,2+3,4* 95,2±5,8 22,б±1,0 6,50+0,44

(63,4±2,3*) (85,3+4,5) (18.5+0,6) (6,83±0.37*)

Через 6 ч 82,7±1,3* 82,2±1,8* 17,7+0,6 9,26±0,55*'

(77,5+1,8*) (88,0±5,5) 18,5+0,5 (8.08±0,42*)

Через 24 ч 58,2+3,0 98,3+7,1 16,4±0,3* 7,15±0,55*

(59.8+2.0*) (87,6±2,2) (16.2+0,7*) (7,37±0,48*)

Таким образом, тромбинемия активирует тромбоциты, их вовлечение в гемостатические реакции, потребление и отсроченное восстановление функции, что ограничивается введением антиоксидантов. Это позволяет заключить, что инициация тромбинзависимых реакций тромбоцитов протекает при непосредственном участии внутриклеточных свободнорадикальных процессов.

Влияние прооксиданта на сдвиги ПОЛ и агрегационную активность тромбоцитов. Установив, что введение прооксидантов сопровождается гиперкоагуляцией, и учитывая роль тромбоцитов в активации ПОЛ тромбином, мы изучили далее агрегационную функцию кровяных пластинок при 10- и 30-дневной свинцовой интоксикации (дозы ацетата свинца и способ введения описаны выше). Часть животных в течение 12 дней предварительно получала витамины А, Е, С, Р.

МА, %

10 дней 30 дней

Рисунок 5. Влияние антиоксидантов на агрегационную активность (МА) тромбоцитов крыс на фоне свинцовой интоксикации Примечание: ИК - интактный контроль; РЬ - свинец вводили контрольным животным; РЬ+Вит - свинец вводили витаминизированным животным

Введение свинца значительно активировало ПОЛ в тромбоцитах, причем степень прироста показателей в динамике возрастала - особенно заметно изменился уровень ДК и ТБК спустя 30 дней (соответственно в 3,8 и 4,3 раза). Интенсификация ПОЛ ускорила вовлечение в гемостаз тромбоцитов - хотя их количество не подвергалось достоверным изменениям, агрегационная функция оказалась сниженной - через 10 дней МА упала на 21,9%, через 30 - на 22,9% (рис. 5).

У предварительно витаминизированных животных показатель достигал исходных значений, также, как величины Т, 1/2 Т, tg а и показатели состояния ПОЛ. Следовательно, и в условиях пер-вичноиндуцирумой гипероксидации антиоксиданты ограничивают нарушения функциональной активности тромбоцитов.

Влияние гепарина на интенсивность ПОЛ в тромбоцитах при тромбинемии. В заключение этой части работы изучили влияние гепарина на сдвиги ПОЛ в тромбоцитах при тромбинемии и сравнили его эффект с таковым при введении антиоксидантов.

Внутривенное введение гепарина интактным животным (30 ЕД/100 г массы) при выраженном гипокоагулемическом эффекте' не отразилось на содержании первичных и вторичных продуктов ПОЛ в тромбоцитах. По иному его эффект проявился в условиях экзогенной тромбопластинемии (2 мг/100 г, активность 15 с). Внутривенное введение тромбопластина значительно активировало ПОЛ в тромбоцитах -уровень ДК вырос спустя 0,5 ч в 5,5, а ТБК - в 5,2 раза (табл. 24). Сходные отличия наблюдались через 1 ч. Предварительное - за 5 мин до воздействия - введение гепарина существенно ослабило названные сдвиги: концентрация ДК и ТБК-активных продуктов спустя 0,5 ч увеличилась соответственно лишь в 2,3 и 1,2 раза, а через 1 ч - в 1,7 и 1,1 раза. Таким образом, предваряющая тромбопластинемию гепариниза-ция ограничивает пероксидные сдвиги в тромбоцитах, а, следовательно, тормозит их активацию и вовлечение в гемостатические реакции.

Таблица 24. Влияние гепарина на ПОЛ в тромбоцитах при экзогенной тромбопластинемии

Исследуемые Контроль Вводили тромбо- Вводили тромбо-

показатели пластин пластин и гепарин

Через 0,5 ч

ДК, А/мг 0,04410,003 0,241+0,002* 0,10310,003*

ТБК, ед/мг 0,7410,03 3,84+0,06* 0,9210,10*

Через 1ч

ДК, А/мг 0.044+0,003 0.302+0.006* 0.35110,008*

ТБК, ед/мг 0,74+0,03 0,76+0,05 0,8710,06

[ I

ДК, А/мг

ТБК, ед/мг

ИК ТП Ш+Вет ТГН-Г ТГН-Вит+Г

Рисунок 6. Влияние раздельного и сочетанного введения витаминов и гепарина на уровень продуктов ПОЛ в тромбоцитах при тромбопластинемии

Сравнительный анализ сдвигов ПОЛ в тромбоцитах у крыс, подвергшихся предварительной гепаринизации и/или витаминизации (витамины А, Е, С, Р, схема обычная) показал следующее. Гипертром-бинемия уменьшает в динамике антиокислительный потенциал клеток, созданный экзогенными антиоксидантами. Ограничение степени тром-бинемии гепарином, напротив, уменьшает в динамике прирост ДК и ТБК-активных продуктов (рис. 6). Это свидетельствует в пользу сочетанного применения антиоксидантов и антикоагулянтов - пул первых в динамике истощается и зависит от степени тромбинемии, а гепарин имеет ряд физиологически неблагоприятных эффектов на тромбоциты [М.В.Балуда, 1996].

Итак, тромбоциты реагируют на тромбинемию активацией ПОЛ. В свою очередь, липопероксидация активирует тромбиногенез, что позволяет ввести в замкнутую цепь промежуточное звено : "тромбинемия-» активация ПОЛ в тромбоцитах—»тромбинемия".

Роль сосудистой стенки во взаимосвязи между гемостазом и ПОЛ.

Принимая во внимание тот факт, что интенсификация свободно-радикальных процессов оказывает влияние и на состояние эндотели-альных мембран, несущих тромбопластическую и антитромбиновую активность [Johnsen е.а., 1983; Rosenberg, 1984], и на скорость синтеза эндоперекисей простагландинов [А.Б.Самаль и соавт., 1990], в сле-:;•:'•;<—н про- и антикоагулянтную активность сосудистой стенки при создании антиоксидантного фона.

Влияние антиоксидантов на тромбопластическую активность эндотелия аорты крыс. Учитывая, что большинство модельных систем, используемых для изучения гемостатических параметров сосудистой стенки [В.П.Балуда и соавт., 1983; В.В.Удути соавт., 1989], оказались неприемлимыми при работе с крысами в силу конституционных особенностей последних, мы создали экспериментальную модель, описание которой приводим ниже.

Наркотизированных животных декапитировали и выделяли участок аорты от устья до бифуркации. На 0,5 см выше бифуркации в сосуд вводили канюлю (игла для подкожных инъекций), которую фиксировали лигатурой и, отмерив по шаблону в направлении сердца участок длиной 1,7 см, отсекали его. Второй разрез производили ниже места введения канюли. Выделенный таким образом участок сосуда, фиксированный лигатурой к канюле, немедленно в течение 10-15 с отмывали снаружи физиологическим раствором NaCl, подсушивали на фильтровальной бумаге и закрепляли в вертикальном положении на штативе. Соединив шприц с иглой, тотчас же пропускали через сосуд с целью отмывки 4 мл 0,9% NaCl. Скорость перфузии здесь и в дальнейшем использовали постоянную (0,7 мл/мин) с учетом необходимости достаточного по времени взаимодействия интимы и перфузата с одной стороны и для исключения травматизации сосуда - с другой [И.Ю.Сергеев и соавт., 1989]. После отмывания от форменных элементов крови приступали к перфузии исследуемых сред. Так как эндотелий сосудов обладает активностью "полного" и "неполного" тромбо-пластина, для их дифференцировки использовали тесты АЧТВ (избыток фактора Р3) и ТПВ (избыток фактора III), а общую тромбопластическую активность оценивали по изменениям теста АВР. В качестве субстратной плазмы использовали пулированную донорскую РРР.

В первой серии опытов животных, часть которых по обычной схеме получала витамины А, Е, С, Р, умертвляли, выделяли сосуды и после их отмывки перфузировали 2 мл теплого (37°С) 0,9% раствора NaCl. В этих условиях в перфузат могли диффундировать тромбопла-стические субстанции, экспрессированные на поверхности эндотелия, обращенной в просвет сосуда.

Как следует из данных табл. 25, в перфузате обнаружили ТПА -степень укорочения времени образования сгустка в системе АВР составила 13,3%. Насыщение субстратной плазмы избытком фактора Р3 также выявило ТПА перфузага в системе АЧТВ - время коагуляции ускорилось на 18,3%. Последнее свидетельствует о присутствии в перфу-затах "полного" тромбопластина, так как присутствие "неполного" не могло при насыщении системы его аналогом повлиять на конечный результат. Прирост ТПА наблюдался и в тесте ТПВ, следовательно, ин-гактный эндотелий сосудов обладает тромбопластической активностью "полного" и "неполного" тромбопластинов, экспрессированных на поверхности клеток.

Таблица 25. Влияние антиоксидантов на тромбопластическую активность интакт-ного эндотелия аорты крыс

Исследуемые пока- Исходные ве- Витамины не по- Витамины по-

затели личины лучали лучали

АВР, с 80,0+0,8 69,4+1,3* 74,3+1,4*

(13.3%) (7.1%)

АЧТВ, с 71,0+1,5 58,3+1,3* 54,5±0,7*

(18,3%) (22,5%)

ТПВ, с 55,0+1,1 41,5±0,7* 52,5+1,5

(24.5%) (4.5%)

Примечание: в скобках - степень отличия от исходных величин.

У витаминизированных животных прирост общей ТПА перфузата оказался в 2 раза ниже, чем у невитаминизированных. Дифференци-ровка тестами АЧТВ и ТПВ показала, что это объясняется значительным (на 20%) снижением вклада "неполного" тромбопластина по сравнению с контролем. Тенденция же к росту активности фактора III лишь подтверждает сказанное.

Далее оценили ТПА разрушенных эндотелиальных клеток. Деэн-дотелизацию вызывали осмотическим шоком, пропуская через аорту после ее отмывки 2 мл дистиллированной воды [И.Ю.Сергеев и соавт., 1989]. Во всех описанных выше тест-системах 0,9% раствор №С1 заменяли в контроле дистиллированной водой.

Деэндотелизация вызвала рост ТПА перфузата, связанный с активностью "полного" тромбопластина (табл. 26). Введение антиоксидантов ограничило прирост общей ТПА перфузата (9,3% против 16,7% в контроле), в то время как активность "неполного" тромбопластина не проявлялась. Изменения тестов АВР и АЧТВ свидетельствуют о том, что это объясняется сниженной по сравнению с интактными животными активностью фактора III.

Таблица 26. Влияние антиоксидантов на тромбопластическую активность разрушенного эндотелия аорты крыс

Исследуемые пока- Исходные ве- Витамины не по- Витамины

затели личины лучали получали

АВР, с 86,0±1,1 71,6+2,1* 78,0±1,8*

(16,7%) (9,3%)

АЧТВ, с 96,0+1,2 77,4x1,4* 81,8±1,2*

(19,3%) (14,7%)

ТПВ, с 56.0+0.6 56.6+0.4 55,8+0.6

(1,1%) (1,4%)

Примечания: те же, что к таблице 25.

Таким образом, торможение ПОЛ в клетках эндотелия аорты сопровождается снижением их тромбопластической активности, что проявляется как в нативных условиях, так и при цитолизе.

Известно, что антиоксиданты повышают уровень антитромбина-III в плазме крови и препятствуют его потреблению при тромбинемии [С.Л.Галян, 1993]. Для ответа на вопрос - не связано ли это с его повышенным синтезом в эндотелии, мы далее изучили влияние антиоксидантов на антитромбиновую активность аорты крыс, используя вышеописанный метод перфузии. Сосуды, после предварительной отмывки перфузировали 2 мл раствора тромбина (0,05 мг/мл 0,9% ИаС1). исследуя активность перфузата в системе тромбинового времени (ТВ).

Таблица 27. Влияние антиоксидантов на антитромбиновую активность эндотелия

аорты крыс

Исследуемые показатели Исходные величины Витамины не получали Витамины получали

ТВ, с 55,0±0,7 80,6±2,4* (46,5%) 93,5+3,5* (70,0%)

Примечания: те же, что к табл. 25.

Оказалось, что, у невитаминизированных животных исходное время образования сгустка удлинилось на 46,5% (табл. 27). Это свидетельствует о том, что часть тромбина, находящегося в перфузате, в процессе элюирования инактивировалась или связывалась с экспонированными на эндотелии антикоагулянтами. На фоне антиоксидантов антитромбиновая активность была заметно выше - 70%, что в 1,5 раза больше, чем у контрольных крыс. Следовательно, ограничение ПОЛ ускоряет синтез или ослабляет потребление антикоагулянтов, связанных с эндотелием сосудов.

Далее мы изучили влияние антиоксидантов на антиагрегацион-ную активность аорты крыс, использовав в качестве перфузата пули-рованную РИР с исследованием ее АДФ-агрегации до и после перфу-зирования. Таким образом, субстратные тромбоциты были поставлены

в одинаковые условия и степень изменения их количества и качества зависела лишь от характера взаимодействия с интимой исследуемых сосудов.

Перфузирование субстратной плазмы через сосуды контрольных животных вызвало снижение количества тромбоцитов на выходе, что позволяет считать это проявлением их адгезии к компонентам интимы. Процент адгезировавшихся клеток составил 23,3±7,2%, что достоверно не имеет отличий от аналогичного показателя витаминизированных животных (28,7+3,6%).

Степень снижения показателя МА после перфузии сосудов неви-таминизированных крыс составила 38% по сравнению с исходной величиной (табл. 28). Одновременно значительно удлинилось время агрегации, особенно ее начального этапа, и скорость. В целом, это свидетельствует о том, что интима аорты обладает существенной антиагре-гационной активностью. Сосуды витаминизированных животных также обнаружили антиагрегационную активность, но менее выраженную - снижение МА оказалось на 40% меньше, в контроле. Не столь выра-женно было и удлинение временных и скоростных параметров агрега-тограмм.

Таблица 28. Влияние антиоксидантов на антиагрегационную активность эндотелия

аорты крыс

Исследуемые показатели До перфузии Витамины не получали Витамины получали

Количество Тц, тыс./мкл 300±15 230+35* 214+18*

МА, % 92,0±4,1 57,1+4,1 * 71.4+3,9*

Т, с 91,0+5,1 130,3±4,6* 111,5+4.6*

1/2 Т, с 10,4±0,8 19,3+2.3* 15.1+1,4*

8,5+0.6 3,3+0,4* 4,6±0,3*

Примечание: Тц - тромбоциты

Таким образом, антиоксиданты в некоторой степени снижают антиагрегационную активность интимы аорты, что представляется нам вполне объяснимым - торможение пероксидных реакций в клетках эндотелия уменьшает синтез простациклина, приводя к снижению анти-агрегационной активности сосудов. В то же время, обнаружение роста антитромбиновой и падения тромбопластической активностей эндотелия позволяют думать о достаточности их суммарного эффекта для торможения реакций взаимодействия "тромбоцит-сосудистая стенка" и уменьшения потребности в высоком антиагрегационном потенциале сосудов.

Роль эритроцитов во взаимосвязи между гемостазом и ПОЛ.

Влияние тромбинемии на ПОЛ в эритроцитах. Сопоставление данных вышеописанных опытных моделей свидетельствуют о том, что любое воздействие, приводящее к тромбинемии, параллельно активирует в клетках ПОЛ. В табл. 29 представлены интенсивные сдвиги показателей ПОЛ эритроцитов (% от контроля) при следующих состояниях :1. Инкубации взвеси отмытых клеток in vitro с тромбином; 2. Экзогенной тромбинемии; 3. Экзогенной тромбопластинемии; 4. Гетего гемотрансфузии; 5. Экспериментальном перитоните; 6. Травматическом токсикозе. ,

Таблица 29. Интенсивность сдвигов показателей ПОЛ в эритроцитах при тромбинемии различной этиологии (в % к контролю)

Эксперименталь ные состояния ДК ТЕК ПИ СО

1 102.0 124,0 47,0 429,0

2 250.0 122.5 61,8 151,5

3 250.0 130,0 71,2 168,0

4 775,0 467,6 95,5 106.5

5 192,8 188,0 30.5 107.6

6 278,6 146,4 35,6 109.3

Как видно (табл. 29), тромбинемия неизменно приводила к накоплению первичных и вторичных продуктов ПОЛ, росту скорости окисления и снижению периода индукции. Выявлено также, что предваряющее тромбинемию раздельное или совместное введение антикоагулянта гепарина и витаминов-антиоксидантов тормозит развитие гипероксидации липидов эритроцитарных мембран как в условиях in vitro, так и in vivo. Все это однозначно указывает на зависимость состояния ПОЛ эритроцитов от степени тромбинемии.

Известно, что участие эритроцитов в гемостазе определяется, прежде всего, их тромбопластической активностью, носителями которой являются мембранные фосфолипиды [Д.М.Зубаиров и соавт., 1983]. Естественно, поэтому, что воздействия, влияющие на состояние мембранных структур (в частности - рост ПОЛ) являются потенциальными модификаторами ТПА клеток. Учитывая это, мы изучили влияние антиоксидантов (витаминов А, Е, С, Р) на тромбопластическую активность эритроцитов, которую исследовали в тесте АЧТВ.

Как выяснилось, ТПА цельных эритроцитов у витаминизированных животных оказалась на 6,1% ниже, чем в контроле (табл. 30). Дальнейшее исследование показало, что и гемолизированные эритроциты крыс, получавших антиоксиданты имеют более низкую ТПА, чем в контроле.

Таблица 30. Влияние антиоксидантов на тромбопластическую активность цельных и разрушенных эритроцитов.

Показатели Витамины не Витамины

получали получали

Разрушенные клетки

АЧТВ, с 62.5+0,4 64.6±0.3*

Степень отклонения ^ 35.4

от контроля, %

Цельные клетки

АЧТВ, с 76,6±1,2 82,7+1,0*

Степень отклонения 23,4 17,3

от контроля, %

Примечание: достоверность указана по отношению к показателям

из левой колонки; время рекальцификации в контроле - 100,0+1,5 с

Таким образом, активация ПОЛ повышает и общую ТПА (разрушенные эритроциты), и индуцирует экспрессию на поверхность клеток тромбопластически активных фосфолипидов.

Учитывая зависимость ТПА от физико-химического состава мембран, в заключение изучили влияние антиоксидантов на фо-сфолипидный спектр мембран эритроцитов при тромбинемии.

Предварительная витаминизация, как и в случае с тромбоцитами не оказала выраженного влияния на уровень общих липидов и мембранных фосфолипидов в частности. В то же время заметно изменился состав фосфолипидных фракций - снизилось содержание ФС и СМ на фоне роста уровня ФЭ и ФХ. Свидетельством торможения ПОЛ в исследуемых объектах стало уменьшение процента лизоформ и увеличение суммарного содержания легкоокисляемых фракций (ФС+ФЭА). Выявляемая параллель между падением ТПА и снижением уровня ФС и суммы ФС+ФЭА, если следовать данным литературы [Д.М.Зубаиров, 1991], дает право объяснять уменьшение прокоагу-лянтного потенциала клеток на фоне введения антиоксидантов.

Тромбинемию вызывали внутривенным введением взвеси тканевого тромбопластина ( 2 мг/100 г массы активность 15 с) с отбором проб через 0,5 ч. Воздействие оказало выраженный эффект на липид-ную составляющую мембран эритроцитов - у контрольных животных в 1,9 раза упал уровень общих липидов и на 31% - фосфолипидов (табл. 41). На фоне общего падения фосфолипидов изменился их фракционный состав - снизилось содержание ФХ, ФС и ФС+ФЭА при росте ЛФХ, СМ и ФЭА. Таким образом, тромбинемия вызвала изменения, характерные для гипероксидации.

У витаминизированных крыс содержание общих липидов снизилось лишь на 25%, а фосфолипидов - не изменилось, что свидетельствует о защите мембранных структур от повреждений, вызываемых рос-

том ПОЛ. Не наблюдался прирост лизоформ, а суммарное содержание ФС+ФЭА оказалось даже выше, чем в контроле.

Таблица 31. Влияние антиоксидантов на фосфолипидный спектр мембран эритроцитов при тромбинемии

Исследуемые Интактный кон- Вводили ТП Вводили ТП

показатели троль и витамины

Общие липиды, 9,32+0,15 4,95±0,12* 6,65+0,21*

мг/мл субстрата

Общие фосфолипиды, мг/мл субстрата 4,53±0,11 3,13+0,06* 4,51+0,12*

Фосфатидилхолин, % 33,4+0.5 30,9+0.3* 32,9±0,5*

Фосфатидилсерин, % 20.2+0,6 12.3+1,3* 18.5+0,8

Фосфатидилэтаноламин, % 11,9±1,2 16,7+2,3* 15,5+1.7

Сфингомиелин, % 24,9±1,8 29,6±2,6* 24,7+1,4

Лизофосфатидилхолин, % 9,4±0,3 10,3+0,3* 8.2+0.5

Примечание: ТП - тромбопластин

Таким образом, эффект тромбинемии, индуцирующей прокоагу-лянтный потенциал посредством модификации мембранных структур, оказался значительно ослабленным под влиянием антиоксидантов. Заметим для сравнения, что степень изменения фосфолипидного спектра мембран под влиянием одного и того же агента (тромбина) в тромбоцитах оказалась на 35% больше, чем в эритроцитах. Это подтверждает выявленный ранее факт более эффективного вовлечения кровяных пластинок в гемостаз, нежели эритроцитов.

6. ВЫВОДЫ

1. Тромбинемия независимо от ее происхождения инициирует ускорение свободнорадикальных процессов в крови. Непосредственным индуктором ПОЛ в условиях активации гемостаза является тромбин, эффект которого на ПОЛ реализуется через клетки крови - тромбоциты, эритроциты, эндотелиоциты.

2. Гепарин непосредственно не влияет на свободнорадикальное окисление липидов крови, но ограничивает сдвиги ПОЛ, провоцируемые экзогенной или эндогенной тромбинемией.

3. Первичная инициация свободнорадикальных процессов путем введения животным прооксиданта (свинца) в дозах, вызывающих нарушение обмена порфиринов, сопровождается ускорением тромбино-генеза.

4. Поливитаминный препарат "Компливит" не влияет на состояние гемокоагуляции здоровых животных, но ограничивает развитие гипер-коагуляционных сдвигов за счет угнетения ПОЛ и повышения антиок-сидантного потенциала.

5. Ограничение активации ПОЛ при экзогенной тромбинемии предварительным введением вигаминов-антиоксидантов А, Е, С и Р или содержащих их поливитаминных официнальных препаратов снижает выраженность гемокоагуляционных сдвигов, ускоряет восстановление нормокоагулемии и уменьшает частоту гибели животных.

6. Тромбоциты интенсивнее других изученных клеток реагируют на воздействие тромбина ускорением ПОЛ, что сопровождается повышением их агрегабельности и реакции высвобождения с последующим угнетением функционального потенциала клеток и признаками деструкции.

7. Рост антиоксидантного фона при введении витаминов А, Е, С и Р, не влияя на активацию тромбоцитов здоровых животных, ограничивает их активацию, последующее истощение и деструкцию при тромбинемии, и ускоряет восстановление исходного состояния клеток.

8. Модификация фосфолипидного спектра мембран тромбоцитов и эритроцитов при инициации ПОЛ сопровождается ростом тромбо-пластической активности цельных и разрушенных клеток, повышая их вклад в тромбиногенез.

9. Интенсификация свободнорадикальных процессов повышает тромбопластическую активность эндотелиоцитов и снижает их анти-тромбиновый потенциал, что одновременно сопровождается ростом антиагрегационной активности клеток.

Наши выводы, вытекающие из фактически полученных данных, подтверждая представления о существовании замкнутого цикла "тромбинемия—»активация ПОЛ в клетках крови—Угромбинемия", указывают на необходимость дальнейшего изучения возможности одновременного воздействия на оба звена этого цикла. В связи с этим, мы считаем целесообразным сравнить в условиях эксперимента и клиники эффективность применения при состояниях с повышенной свертываемостью крови антиоксидантов и прямых антикоагулянтов, вводимых порознь и одновременно.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ :

1. Влияние препарата Декамевит на гемокоагуляцию в эксперименте // Механизмы регуляции гемостаза на уровне молекулярных взаимодействий : Сб. науч. тр. - Свердловск, 1988. - С. 59-65 (соавт.: С.Л.Галян, С.А.Ральченко).

2. Применение комплекса витаминов А, Е, С, Р для профилактики гемокоагуляционных нарушений при кровопотере // Научно-технический прогресс, здоровье сельского населения, прикладные и фундаментальные проблемы биологии и медицины : Тез. докл. конф. -

Полтава, 1989. - С. 24-25 (соавт.: В.М.Шафер, Г.П.Примаков, Т.М.Копусова).

3. Влияние комплекса витаминов-антиоксидантов на сдвиги, воз-рш:?к!ш«е п"" э^^енн^"; ^п^чб^пластинемии // Биоантиоксидант: Тез. докл. 3-й Всесоюз. конф. - М., 1989. - Т.2. - С. 250-251 (соавт.: СЛ.Галян, В.М.Шафер, С.Н.Ибрагимова).

4. Влияние витаминов А, Е, С, Р и гР на свертываемость крови при экспериментальной тромбопластинемии // Вопр. питания. - 1989. -№6. - С. 50-52 (соавт.: А.Ш.Бышевский. С.Л.Галян. В.М.ШаЛео).

5. Витаминные комплексы в профилактике коагулопатий (экспериментальные и клинические наблюдения) // Актуальные проблемы фармации Западной Сибири и Урала : Сб. науч. тр. - Свердловск, 1989. - С. 20-24 (соавт.: С.Л.Галян, В.М.Шафер, С.А.Ральченко).

6. Гемокоагуляционные сдвиги при операционной травме и экзогенной тромбопластинемии на фоне витаминизации // Вопр. мед. химии. - 1990. - №2. - С. 41-45 (соавт.: А.Ш.Бышевский, С.Л.Галян,

B.М.Шафер, С.Н.Ибрагимова).

7. Поливитаминные комплексы в профилактике гемокоагуляцион-ных осложнений при оперативных вмешательствах и микросатурнизме // Прогресс и безопасность : Материалы Всесоюз. конф. - Тюмень, 1990. - С. 61-62 (соавт.: А.Ш.Бышевский, С.Л.Галян, С.А.Ральченко, И.А.Мухачева).

8. К механизму противосвертывающего действия витаминов с ан-тиоксидантными свойствами // Клин, витаминология : Тез. докл. Всесоюз. конф.-М., 1991.-С. 24.

9. О влиянии комплекса витаминов А, Е, С, Р и РР на гемокоагу-ляцию и функциональное состояние мембран эритроцитов // Физиология и патология гемостаза : Тез. Всесоюзн. конф. - Полтава, 1991. - С. 113-114 (соавт.: А.Ш.Бышевский, С.Л.Галян, В.М.Шафер и др.).

10. Влияние свинцовой интоксикации на гемокоагуляцию и радикальные процессы // Здоровье человека и экологические проблемы : Тез. зональн. научно-практ. конф. - Киров, 1991. - С. 36 (соавт.:

C.Л.Галян, С.Н.Ельдецова, А.М.Мкртумян и др.).

11. Диагностическое и прогностическое значение некоторых коа-гуляционных показателей в хирургической практике // Клинико-лабораторная диагностика предтромбоза и тромботических состояний : Сб. науч. тр. - С-Петербург, 1991. - С. 92-96 (соавт.: А.Ш.Бышевский, С.Л.Галян, С.А.Ральченко и др.).

12. Влияние поливитаминных препаратов на свертываемость крови при экспериментальной гиперкоагулемии // Вопросы питания. -1992. - № 1. . С. 48-52 (соавт.: АШБышевский, С.ЛГалян, С.А.Ральченко).

13. Витамины в профилактике ДВС-синдрома различного происхождения // Физиология и патология перекисного окисления липидов,

гемостаза и иммуногенеза : Полтава, 1992. - С. 78 (соавт.: С.Н.Ельдецова, И.В.Селиванова, О.В.Галенко и др.).

14. О механизмах защитного действия витаминов А, Е, С, Р при тромбинемии // Там же. - С. 79 (соавт.: И.В.Селиванова, С.Л.Галян).

15. О протективном влиянии комбинации витаминов при тромбинемии // Физические нагрузки в клинике и спорте : Межвуз. сб. - Тюмень, 1992. - ч.2 - С. 133-143 (соавт.: А.Ш.Бышевскнй, Г.С.Соловьев, С.Л.Галян).

16. Влияние комбинации витаминов А, Е, С, Р на гемокоагуляци-онные свойства эритроцитов и агрегацию тромбоцитов при тромбинемии // Укр. биохкм. журкал. - 1992. - т. 64. - №2. - С. г.5-91 (с.-т.:

A.Ш.Бышевский, С.Л.Галян, С.Н.Ельдецова и др.).

17. Влияние витаминов А, Е, С, Р на интенсивность внутрисосуди-стого свертывания крови в эксперименте // Бюлл. эксп. биол. и мед. -1992. - №9. - С. 262-265 (соавт.: А.Ш.Бышевский, С.Л.Галян, С.В.Соловьев и др.).

18. Коррекция гемостаза витаминами А, Е, С, Р при оперативном вмешательстве // В сб.: Обмен веществ в норме и патологии. - Тюмень, 1992. - С. 93 (соавт.: С.Л.Галян, В.А.Усольцева, И.В.Селиванова и др.).

19. Изменения коагуляционной активности крови под влиянием витаминов у родильниц после операции кесарева сечения // Там же. -С. 91 (соавт.: Т.В.Соболь, В.А.Полякова, С.Л.Галян и др.).

20. Состояние гемокоагуляции у беременных, рожениц и родильниц на фоне витаминов-антиоксидантов // Там же. - С. 75 (соавт.:

B.А.Полякова, Т.В.Соболь, В.Н.Кожевников и др.).

21. О коррекции морфофункциональных свойств тромбоцитов в эксперименте // Физиология и патология перекисного окисления липи-дов, гемостаза и иммуногенеза : Полтава, 1993. - С. 162 (соавт.:

C.Л.Галян, И.В.Селиванова, С.Н.Ельдецова и др.).

22. Коррекция ультраструктурных изменений микроциркулятор-ного русла легкого, альвеолоцитов и тромбоцитов при ДВС // В сб.: III съезд анатомов, гистологов, эмбриологов Российской федерации, -Тюмень, 1994. - С. 186-187 (соавт.: Г.С.Соловьев, А.Ш.Бышевский, С.Л.Галян).

23. Связь между тромбинемией и свободнорадикальными процессами в крови // Укр. биохим. журнал. - 1994. - т.66. - №5. - С. 58-64 (соавт.: А.Ш.Бышевский, С.Л.Галян, С.Н.Ельдецова и др.).

24. Коррекция функций тромбоцитов при ДВС-синдроме // В сб.: Совершенствование физического воспитания школьников и студентов. - Тюмень, 1994. - С. 170 (соавт.: И.В.Селиванова).

25. О защитном действии витаминов А, Е, С, Р на структурные образования внутренних органов при тромбинемии // Там же. - С. 74-77 (соавг.: Г.С.Соловьев).

26. Влияние витаминов-антиоксидантов на внутреннее тромбопла-стинообразование тромбоцитов // В сб.: Актуальные проблемы фармации. - Тюмень, 1994. - С. 183-184 (соавт.: Г.С.Соловьев, А.Ш.Бышевский, С.Л.Галян).

27. Неспецифическая профилактика гемокоагуляциокных сдвигов витаминами // В кн.: Материалы межународного симпозиума "Биологически активные добавки к пище - нутрицевтики - и их использование с профилактической и лечебной целью при наиболее распространенных заболеваниях". - Тюмень, 1995. - С. 31-32 (соавт.: А.Ш.Бышевский, С.Л.Галян, В.А.Полякова и др.).

28. Влияние Витакомплекса на гемокоагуляцию // Там же. - С. 3233 (соавт.: А.Ш.Бышевский, С.Л.Галян, С.Н.Ельдецова и др.).

29. Витамины А, Е, С, Р в профилактике ДВС-синдрома // Там же.

- С. 33-35 (соавт.: А.Ш.Бышевский, С.Л.Галян, К.В.Горбатиков и др.).

30. Prevention of the syndrome of DIC with vitamins A, E, С and P (A, E, С, P combination) // 9-th European conf. on Haemorheology. - Clin. Haemorheology. - 1995. - v.15. - №3. - P. 586 (A.Sh.Byshevsky, S.L.Galyan, I.A.Zarubina e.a.).

31. Профилактика тромбогеморрагий витаминами-антиоксидантами //В кн.: Актуальные вопросы службы крови и гранс-фузиологии. - С-Петербург, 1995. - С. 125-126 (соавт.: А.Ш.Бышевский, С.Л.Галян, К.В.Горбатиков и др.).

' 32. Роль тромбоцитов в защитном эффекте сочетания витаминов А, Е, С и Р при тромбинемии II Гематология и трансфузиология. - 1995.

- т. 40. - № 5. - С. 9-11 (соавт.: А.Ш.Бышевский, С.Л.Галян, И.В.Селиванова и др.).

33. Витамины в профилактике тромбогеморрагических осложнений // Методические рекомендации : Тюмень, 1995. - 80 с. (соавт.: А.Ш.Бышевский, С.Л.Галян, В.А.Полякова и др.).

34. Влияние модифицированного препарата "Компливит" на гемокоагуляцию // Вопросы питания. - 1995. - №4. - С.30-32 (соавт.: И.В.Селиванова, С.Н.Ельдецова, С.Л.Галян и др.).

35. Тромбоциты (состав, функции, биомедицинское значение).: Тюмень, 1996. - 250 с. (соавт.: А.Ш.Бышевский, СЛ.Галян, И.А.Дементьева и др.).

36. Об эффективности антиоксидантов в профилактике тромбогеморрагий // Медико-биологический вестник им. Я.Д.Витебского. -1996. - №2. - С. 23-24 (соавт.: АЖБышевский, С.ЛГалян, С.Н.Ельдецова и др.).

37. Влияние витаминизации на тромбопластическую и антитром-биновую активность сосудистой стенки в эксперименте // Там же. - С. 27 (соавт.: С.Л.Галян).

38. Витамины-антиоксиданты снижают угрозу тромбоза // Медицина и охрана здоровья : Тез. междунар. симпозиума. - Тюмень, 1996. -С. 19 (соавт.: А.Ш.Бышевский, С.Л.Галян, И.А.Дементьева и др.).

39. Коррекция функционального состояния тромбоцитов // Науч. вестник ТГУ, Биология. - 1997. - т.2. - С. 42-50 (соавт.: А.Ш.Бышевский, С.Л.Галян, А.А.Вакулин и др.).

40. Влияние аспирина на гемокоагуляционные сдвиги, вызванные тромбинемией на фоне введения вигаминов-антиоксидантов // Вопр. мед. химии. - 1997. - №4 (соавт.: А.Ш.Бышевский, С.Л.Галян, А.А.Вакулин и др.).

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

АВР - активированное время

рекальцификации АДФ - аденозиндифосфат AT-III - анп;тром5г:1 III АЧТВ - активированное частичное тромбопластиновое время ДВС - диссеминированное внутрисосудистое

свертывание ДК - диеновые конъюгаты ЛФХ - лизофосфатидилхолин ПДФ - продукты деградации фибрина ПИ - период индукции ПОЛ - перекисное окисление липидов СМ - сфингомиелин СО - скорость окисления ТБК - продукты, реагирующие

с тиобарбитуровой кислотой ТВ - тромбиновое время ТП - тромбопластин ТПА - тромбопластическая активность ТПВ - тромбопластиновое время ФГ - фибриноген ФС - фосфатидилсерин ФХ - фосфатидилхолин ФЭА - фосфатидилэтаноламин Э- эритроциты ЭТ - этаноловый тест Pg - простагландины РРР - бедная тромбоцитами плазма PRP - богатая тромбоцитами плазма