Роль тромбоцитов и эритроцитов в активации перекисного окисления липидов тромбином

Селиванова, Инна Витальевна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Роль тромбоцитов и эритроцитов в активации перекисного окисления липидов тромбином
ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Роль тромбоцитов и эритроцитов в активации перекисного окисления липидов тромбином"

МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РОССИЙСКОЙ Р Г Б О Д ФЕДЕРАЦИИ

л „г ,. ,ч ЧЕЛЯБИНСКИЙ МЕДИЦИНСКИЙ ИНСТИТУТ

На правах рукописи УДК 617-089.166-059:615.356-07:616.151.5 СЕЛИВАНОВА ИННА ВИТАЛЬЕВНА

Роль тромбоцитов и эритроцитов в активации перекисного окисления липидов тромбином

03.00.04 - Биологическая химия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Челябинск - 1994

Работа выполнена на кафедре биологической химии в Тюменском государственном медицинском институте

Научный руководитель: доктор медицинских наук,

профессор Бышевский А.Ш.

Официальные оппоненты:

' Док гор иед. наук Доктор мад. наук

профессор

ОЗИДЕНКЗ АЬ

профессор РЯЕИНИН В.Е.

Ведущая организация - Всероссийский Гематологический

на заседании специализированного совета К 084.04.01 при Челябинском медицинском институте ( 454092. г. Челябинск, ул. Воровского, 64).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Челябинского медицинского института.

Автореферат разослан " 1994 г.

Научный Центр (ВГНЦ). Москва

Защита состоится ".

Ученый секретарь специализированного совета, доктор медицинских наук

Л.В.Кривохижина

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Появляется осе больше данных о важной роли нарушений свободнорадикальных процессов в обеспечении гомеостаза организма /Н.Б. Бурлакова, 1976; Н.М. Эмануэль. 1984/ и вкладе активации перекисного окисления липидов (ПОЛ) в патогенез ряда патологических процессов ,/Безрукавникова и др., 1988; С.Л. Галян, 1993/. В частности, активация ПОЛ способствует развитию гиперкоагулемий, ведущих к ДВС /В.П. Мищенко, 1980/, а антиоксиданты уменьшают глубину гемокоагуля:;нонных сдвигов и ограничивает угрозу развития ДВС. Это показано на животных с каловым перитонитом /С.К. Ельдецова. 1990; С.А. Ральченко. 1991/, ДВС-синдромом, выззан-ным эндотоксином /УоьЫкаиа е а., 1986/. То же описано в клинике /КапоГэку е.а.. 1981/. Есть указания на прямую зависимость между гиперкоагулемией и активацией ПОЛ /А.Ш. Бышезский и др.. 1992; С.Л. Галян. 1993/.

Независимо от характера воздействия, вызвавшего гиперкоа-гулемию или ее крайнее проявление - ДВС, нарушения гемостаза включают как обязательный компонент ускоренное образование тромбина - фермента, осуществляющего собственно свертывание /Б.А. Кудряшов. 1975; Д.М. Зубаиров, 1978; А.Ш. Бышевский и др.. 1991/. Свертывание у человека и высших животных не минует образования тромбина. Следовательно, тромбинемия - фактор, сопутствующий всем гиперкоагулемнческим состояниям. Поэтому, мы могли допустить, что многократно выявленная связь между гиперкоагулемией к активацией ПОЛ может оказаться связью между тромбинемией и активацией ПОЛ. Если это верно, то важно установить механизм возникновения такой связи и выяснить через какие компоненты она обеспечивается. Изучение этих вопросов приблизит нас к объяснению установленного опытным путем позитивного эффекта применения антиоксидантов, не являющихся антикоагулянтами, в лечении гиперкоагулемических состояний и, воз можно, внесет некоторый вклад в изучение механизмов взаимоотношений между важными системами жизнеобеспечения - гемостазом ц свободнорадикальным окислением. Принимая во внимание та. что жирные кислоты в составе мембранных триглицеридов и фосфолипидов - наиболее атакуемые объекты свободных радикалов, целесообразно в первую очередь изучить взаимоотношения между тромбинемией и ПОЛ. Наибольший интерес в этом плане могут представлять тромбоциты - клетки с высокой коагулоактивностью и

интенсивными оксигеназными реакциями, ведущими к образованию гидроперекисей /И.С. Северина, 1994; Ciaro е.г.. 1977; Smith 1983/. Не исключено и участие эритроцитов в обеспечении этой связи, так как и они являются активным компонентом гемостаза /Б.И. Кузник. В.П. Скипетров, 1974; И Я. Ашкинази. 1977/.

Цель работы - установить, есть ли зависимость между гипер-тромбинемией и активацией ПОЛ, оценить роль тромбоцитов и эритроцитов в обеспечении.этой зависимости и определить ее направление (тромбинемия ПОЛ или ПОЛ —> тромбинемия ?).

Задачи исследований: 1. Изучить состояние ПОЛ в плазме, эритроцитах и тромбоцитах на различных экспериментальных моделях гиперкоагулемии. 2. Изучить состояние ПОЛ в тех же объектах при введении в кровоток тромбина или тромбопластина. 3. Оценить влияние антиоксидантов на глубину тромбинемии, ее гемокоагуляционные последствия и на состояние ПОЛ в плазме и тех же клетках крови. 4. Изучить влияние прооксиданта на гемокоагуляционные сдвиги, характерные для гипертромбинемии, и на ПОЛ в тех же клетках. 5. Изучить влияние тромбинемии на ПОЛ в эритроцитах и тромбоцитах in vitro.

Научая новизна. Впервые установлено,' что в бесклеточной плазме не изменяются показатели ПОЛ при контакте с тромбином, что уровень первичных и вторичных продуктов пероксидации растет при этом из-за изменения их содержания в тромбоцитах, и в меньшей степени - в эритроцитах. Впервые показано, что эритроциты и особенно тромбоциты реагируют на прямой контакт с тромбином активацией процессов ПОЛ. и снижением антиоксидантного потенциала и что активация ПОЛ в этих клетках ведет к ускорению тромбиногенеза, однако зависимость тромбинемия -> активация ПОЛ выражена в большей степени, чем зависимость активация ПОЛ —> активация тромбнногсисза.

Практическая ценность работы состоит в том, что ее результаты указывают на перспективность изучения коррекции состояний, протекающих с гипертромбинемией, одновременным назначением антикоагулянта и антиоксиданта.

В процессе исследований разработан способ суммарного определения фибринмономеров и продуктов деградации фибрина в плазме (Положительное решение патентной экспертизы от 3.07.1991, № 4891235/14/119697), использованный в нашей лаборатории, а также в биохимической лаборатории Тюменской ГКБ №2.

Апробации и публикации. Основные положения диссертации доложены на конференции гематологов "Физиология и патология гемостаза" (Чита, 1987), Всесоюзных научных конференциях "Тромбоцит - как связующее звено гемостаза" (Москва. !992) и "Физиология и патология ПОЛ. гемостаза и иммуногенеза" (Полтава, 1992, 1993), на регионарной научно-практической конференции "Медицинская реабилитация больных и инвалидов" (Тюмень, 1994) и заседаниях Тюменского отделения ВБО. По материалам диссертации опубликовано 7 печатных работ.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы. В опытах использованы 69-1 белые крысы (120±2ü г, по 6-12 особей в группе, равное число самцов и самок). Животных содержали на смешаном сбалансированном рационе, приготовляемом в виде консистентной массы. В суточную порцию рациона вводили исследуемые витамины в дозах, рассчитываемых как произведение суточной потребности крысы на отношение суточной лечебной дозы человека к его суточной потребности /В.В. Баканская, 1980/: витамин А - 600 ME, витамин Е - 0,15, витамин С - 45 и витамин Р - 20 мг/100 г массы. Ацетат свинца вводили с рационом (10 мг/100 г по свинцу).

Все болезненные манипуляции проводили под наркозом (диэтиловый эфир). Кровь брали из яремной вены, в нее же осуществляли инъекции. Для гемокозгулологических исследований кровь стабилизировали 3,8 % раствором цитрата натрия (1:9). Отбор крови и ее обработка соответствовали требованиям для гемокоагу-лологических исследований /Г.Н. Детинкина и соавт., 1984/.

Оценивая гемокоагуляцию определяли: 1. Активированное время рекальцификации и активированное частичное тромбоплас-тиновое время /Г.Н. Детинкина и соавт., 1984/. 2. Содержание фибриногена - прямой спектрофотометрией /А.Ш. Бышевский, B.C. Мохнатое. 1969/. 3. Этаноловый тест /В.П. Балуда и соавт., 1980/. 4. ПДФ - в модификации А.Ш. Бышевского и соавт. /1991/. 5. Использовали также разработанный нами метод определения суммы РКМФ и ПДФ /1991/. 6. Тромбопластическую активность интактных эритроцитов /И.Я. Ашкинази. 1977/. 7. Агрегацию тромбоцитов - на агрегометре "Биохиммак", индуктор -АДФ (0.01 мг/мл смеси) /В.П. Балуда и соавт.. 1980/. 8. Количество тромбоцитов - унифицированным методом /В. В. Меньшиков и соавт., 1987/.

ПОЛ и антиоксидантную активность исследовали в плазме, эритроцитах и тромбоцитах, определяя: 1. Общее количество липи-дов /С.Н. Ельдецова, 1990/. 2. Количество сопряженных диеновых конъюгатов /ДК/ /В.Н. Ушкалова. Г. Л. Кадочникова, 1987/Чпсрвичные продукты ПОЛ). 3. ТБК-активные продукты, (продукты, реагирующие с 2-тиобарбитуровой кислотой - преимущественно вторичные продукты перекисного окисления /В.К. Ушкалова с соавт.. 1987/. 4. Период индукции, (характеристика медленной стадии ПОЛ. 5. Скорость окисления (быстрая стадия ПОЛ). 5. Совокупность 4 и 5 показателей характеризует уровень антиок-сидантной активности /В.Н. Ушкалова. Н.В. Иоан.идис, 1987/. Для определения интенсивности флуоресценции (волна возбуждения 510 нм и волна флуоресценции 535 нм) использовали флуори-метр "Биан-130" и "Квант". Количество продуктов ПОЛ в пробе относили к содержанию липидов в бноматериале.

Способность эритроцитов к деформации устанавливали центрифугированием и эктацйтометрией /C.B. Соловьев, 1989; A.B. Белкин и соавт., 1991/.

Протопорфирин в эритроцитах определяли согласно описанию /A.A. Покровский 1969/.

В работе пспользованы коммерческие препараты тромбина и фибриногена (Каунас), тромбопластина (Киров), АДФ (Reana!), витаминов А, Е, С, Р, и химические реактивы квалификации х.ч.

Цифровые данные обрабатывали математически методом вариационной статистики для малых рядов наблюдений. Достоверность различий определяли по таблицам Стьюдента-Фишера.

Гемокоагуляция и ПОЛ пщ воздействиях, сопровождающихся тромбинемией. Первоначально изучили гемокоагуляцию и ПОЛ при введении тромбина или тромбопластина.

После введения тромбина (табл. ]) уже через 0,5 ч имеется гипокоагулемия - снижение общей свертывающей активности (удлинение АВР и АЧТВ), и потребление факторов свертывания (гипофибриногенемия, появление продуктов коагуляционного превращения фибриногена). То же наблюдается и через 3 ч, и почти исчезает через 6 ч.

ПОЛ в плазме и эритроцитах через 0,5 и 1 ч после инъекции тромбина активировано: увеличено содержание диеновых конъюгатов и ТБК-активных продуктов, сокращен период индукции и увеличена скорость окисления.

Таблица 1. Гемокоагуляция у крыс после введения тромбина (1 мг/мл. 0.2/100 г) (контроль - 0.14 и раствор >\'аС1)

Показатели После инъекции тромбина через

0.5 ч 1 ч 3 ч 6 ч

АВР, с 68.9±1.2* 71,3+1.6* 43,5+0.7 47.1 ±0.8

(39.7+0,5) (41,4+1.1) (37,9+0.3) (42.9±0,7)

АЧТВ, с 56.1+3.3* о 1,2±2,1 * 30,1±1.0 33,4+1.1

(29,2±0,8) (31,0±0.9) (32,1 ±0.9) (30,8+1,1)

ФГ, г/л 1.2+0.05* 0,9±0.08* 2,3±0,06* 2.5±0.07

<2,5±0.03) (2.7+0,04) (2,8±0.03) (2.7±0.06)

ПДФ. мг% 19.6±2.1* 21,9+1,8* 15.0+1,2 16,7±0,9*

(12.6±2.0) (11.4+2,1) (13,5+1,6) (3 2,3± 1.2)

ЭТ, % 83.3* 100* 27,7* 27.7*

(0.0) (3.3) (0.0) (0.0)

Примечание: в этой и последующих таблицах в скобках - данные у контрольных крыс; знак * - достоверные отличия.

Таблица 2. ПОЛ в плазме и эритроцитах после введения тромбина Интервал.ч Показатели

ДК. А/мг ТБК. ед./мг ПИ. мин/мл СО, мм3 на ___ ___мл/мин

0.5 П 0,07±0,01 * 1,40±0.08* 21,0±0,3* 2.04 ±0.2*

(0,04 ±0,01) (1,03+0,01) (47,3±3,7) (0 81±0,3)

Э 0.04 ±0,01* 0,72+0,05* 20,1±1,6* 1,47+0.2*

(0.02±0,01) (0,064±0,07) (28,±1,7) (0,98±0,3)

1.0 П 0,05±0,2* 1,73+0.04* 29,6±1,7* 1.37+0.2*

0.04+0,02) (1,41+0,07) (19,8±0,4) (0,86±0.2)

Э 0,05+0,01 0,76±0.05* 18,6+1,3* 1,53+0,3*

(0.02±0.01) (0,62±0,04) (29,1±0,9) 1,01±0,2)

Примечание: П и Э здесь и далее - плазма и эритроциты; ДК, ТБК, ПИ, СО здесь и далее - диеновые конъюгаты, ТБК-активные продукты, период индукции, скорость окисления соответственно.

Изменения при введении в вену тромбопластина (2 мг/100 г массы, активностью 14 с) были аналогичны - небольшие отличия касаются лишь степени выраженности: удлинены показатели общей свертывающей активности, появились признаки ускоренного внутрисосудистого свертывания с потреблением фибриногена. Следовательно, эффект тромбопластина реализован через гипертром-бинемню (табл. 3). Прослеживаются такие же признаки активации ПОЛ и угнетения антиоксидантной активности как при введении

тромбина: повышено в плазме и эритроцитах содержание диеновых конъюгатов и ТБК-активных продуктов, сокращен период индукции и увеличена скорость окисления (табл. 4).

Таблица 3. Гемокоагуляция у крыс после введения тромбопластина Показатели После инъекции тромбина через _ 0.5 ч 1 ч 3 ч 6 ч

АВР. с 58,9+1.3* 61,2±1,6* 41,3±0,5 42.1Ю.4

(38,6±0,5) (31,2±1,0) (38,7±0,2) (40,2±0,6)

АЧТВ. с 58.1+2,1* 49,2+1.2* 31.2+0.7 34,3±0.8

(31.2+0,7) (29.1 ±1,0) (33,2±0.8) (39.0И.1)

ФГ. г/л 1,3 ±0,04* 1.0+0,07* 2.4+0.05* 2.6±0.04

(2.6Ю.02) (2.9±0,02) (2.9±0,04) (2,8+0.05)

ПДФ. мг% 18,5±1,9* 19,7±1,4* 14,3±1,0 12.7±1.0*

(11,5+1,9) (12,2+2,1) (12,6±1,7) (11.9+1,6)

ЭТ, % 77,7 37,7 37,7 3,3

(0,0) (0.0) (3.3) (0.0)

Таблица 4. Состояние ПОЛ в плазме и эритроцитах у крыс после

введения тромбопластина

Интервал, ч Показатели

ДК, А/мг ТБК, ед./мг ПИ, мин/мл СО, мм3 на

мл/мин

0,5 ' П 0,06±0,01* 1,50±0,06* 23,0±0,2* 2,13+0,3*

(0,04+0,01) (1,10± 0,01) (49,2±3,1) (0,79+0,2)

Э 0,04±0,01 * 0,69±0,04* 19,0+1,4* 1,57±0,3*

(0,02±0,01) (0,61±0,03) (29,5+1,7) (0,89+0,2)

1,0 П 0,06±0,03* 1,69±0,03* 30,0±1,5* 1,43±0,3*

0,03±0,01) (1,39±0,06) (20,0±0,3) (0,79±0,3)

Э 0,05±0,02 0,78±0,04* 19,3±1,1* 1,63±0,4*

(0,02±0,01) (0,60±0,03) (27,1+0,6) (0,97±0.3)

В третьей серии экспериментов для индуцирования генерации тромбина использовали кровоизвлечение - 25-30 % от ОЦК. Предварительно определили, что изменения свертываемости максимальны на 30-й минуте после воздействия, что определило срок отбора крови.

Изменения при массивном кровоизвлечении (табл. 5) сходны с таковыми после введения тромбина или тромбопластина: удлинение АВР, АЧТВ и признаки потребления (снижение фибриноген-емии), активация тромбиногенеза (высокая частота положительно-

го ЭТ). В целом тромбинемия менее значительна, чем при введении тромбина (тромбопластина).

Таблица 5. Гемокоагуляция у крыс через 30 мин после

кровоизвлечения (25-30% от объема циркулирующей крови)_

_Показатели_Контроль_Опыт_

АВР, с 39.7±0,5 69,3±0,5*

АЧТВ, с 28,3+0.2 95.7+1,5*

ФГ. г/л 3,4+0.3 0,9+0,2*

ПДФ. мг% 15,6±2,8 16.7+2,6

ЭТ. % 0.0 83.3*

Таблица 6. ПО/1 в плазме и эритроцитах после кровоизвлечения

Показатели

ДК. А/мг ТБК, ед./мг ПИ, мин/мл СО, мм3 на мл/мин

П 0.06+0,01* !.40±0,01* 20,6+0,3* 2,02+0.3*

(0,04+0,01) (1,05+0.01) (48,5±3,8) (0,76±0,2)

Э 0,03±0,01 0.71+0,06* 20,0±1,6* 1,46±0,2

(0,03±0,01) (0,64±0,04) (26,2±3,0) (1,30±0,1)

ПОЛ после кровоизвлечения активировано менее заметно: ниже степень накопления продуктов ПОЛ, не изменена скорость окисления (табл. 6).

Затем а качестве фактора, активирующего тромбиногенез, использовали введение Декстрана-500 000 (0,1 г/100 г массы, 10%-й раствор), т.е. повышение" вязкости крови /A.M. Чернух, 1984/, ведущее к гипертромбинемии /З.С. Баркаган, 1988/. Через 1 ч брали пробы крови.

Таблица 7. Гемокоагуляция у крыс через I ч после инъекции _декстрана-500 000_

Показатели Контроль Опыт

АВР. с 53,6+1,6 58,2±2,7

АЧТВ. с 33.4±2,0 48,0±3,5*

ФГ. г/л 1,39±0,21 1,53±0,33

ПДФ, мг% 11,0±1,8 • 35.5±6,2*

ЭТ, % 0,0 • 16,7*

Судя по данным табл. 7 развилась гипокоагулемия менее значительная, чем при вышеописанных воздействиях (АВР удлинено

нс достоверно, потребление фибриногена не выявлено). О вторич-ности снижения обшей свертывающей активности говорит рост содержания ПДФ и частоты положительных ЭТ. Одновременно активировалось ПОЛ (табл. 8), причем сильнее, чел; при других воздействиях. Это связано, видимо, с гипоксемией. вызываемой повышенной вязкостью крови и нарушением микроциркуляции.

Таблица Б. ПОЛ через 1 ч после введения декстрана в кровоток

Показатели

ДК. А/мг ТБК. ед./ мг ПИ. мин/мл СО. мм3 на мл/мин

п 0.31+0.02* 4.40+0.16* 14.310,07* 2.1610.11*

(0.0410,01) (0,71+0,06) (57,8+0,34) (0.96+0.02)

э 0.41 ±0,01 3.84±0.21 * 11.8+0.08* 2,52+0,32*

(0.04±0.01) (0.7110.06) (20.011.6) (1.46±0.1)

Далее в качестве тромбингенерирующего воздействия применили гетерогемотрансфузию (кровь человека внутривенно, 0,5 мл/100 г). Инициатором гипертромбинемии здесь является активация плазмокоагуляции полным тромбопластином моноцитов и неполным - эритроцитов и тромбоцитов, а также опосредованно через образование мембранолитических комплексов /А.Ш. Бышев-ский и соавт., 1993/.

Таблица 9. Гемокоагуляция через 1 ч после гетерогемотрансфузии

Показатели Контроль Опыт

АВР, с 53,611,6 57,613.1

АЧТВ. с 33,412,0 38.213.2

ФГ, г/л 1,39+0,21 2,03+0,3

ПДФ, мг% 11,0+1,8 22,312,5

ЭТ, % 0,0 0,0

Гетерогемотрансфузия привела к сдвигу той же направленности, что и тромбинемия, хотя и менее выраженному: гипокоагуле-мия лишь как тенденция, фибриноген не потреблен, но вырос уровень ПДФ. Видимо, сравнительно малая выраженность сдвигов обусловлена небольшой дозой гетерогенной крови. Изменения ПОЛ у этих же животных аналогичны найденным при инъекции тромбина (троМбопластина).

Таким образом, в экспериментальных ситуациях, характеризующихся активацией свертывания крови, наблюдали такие же по направленности изменения ПОЛ и антиоксидан'тной активности, а плазме и эритроцитах, какие выявлены при тромбинемии, создаваемой инфузией тромбина. Это позволяет связывать тромбннемию и процессы пероксидации в исследуемых субстратах. Количественная характеристика этой связи затруднена, так как наряду с тромбик-емией в отдельных ситуациях имеют место и другие факторы, могущие обусловить активацию ПОЛ (например, гипоксия, при кро-вов.чятии или при повышении вязкости крови). Однако а сочетании с результатами опытов с введением только тромбина или тромбо-пластина, полученные данные позволяют усматривать прямую связь между тро.чбинемией и активацией ПОЛ.

В нашей лаборатории получены указания на то, что не исключена и обратная связь между ПОЛ и тромбиногенезом: на фоне гипероксидации можно ограничить тромбинемию антноксидантами. не изменяющими в условиях физиологической нормы свертывающей активности крови /С.Н. Едьдецова, 1990; В.Г. Соловьев, 1991: С.Л. Галян, 1993/. Возникло предположение о возможности замыкания своеобразного цикла (актйзация свертывания - активация ПОЛ - активация свертывания), который можно разорвать назначением антиоксидантоа.

Агрегационная активность тромбоцитов при тромбинемии и влияние на нее антиоксидантов. Чтобы выяснить, связана ли интенсификация ПОЛ а тромбоцитах с их активацией и, следовательно, с ускорением свертывания, изучили агрегацнонную активность тромбоцитов при тромбинемии. используя некоторые модели, описанные выше.

В одной из серии опытов часть животных в течение 12 дней получали комбинацию витаминов-антиоксидантов • А, Е, С и Р • которые не изменяют свертываемости крови у здоровых животных, ограничивая гемокоагуляциоиные сдвиги при тромбинемии /В.М. Шафер, 1989; В.Г. Соловьев, 1990/. Контрольные крысы дополнительно витаминов не получали. На 13-й день крысам обеих группы инъецировали тромбопластин и через 0,5, 3.. 6 и 24 ч отбирали пробы крови. У части крыс пробы крови отбирали до инъекции (по 6 крыс на каждом этапе).

Введение тромбопластина (табл. 10) вызывало быстрое потребление тромбоцитов в контроле: через 0,5 ч их количество упало

Таблица 10. Число тромбоцитов (тыс./мкл) и АА (максимальное светопропускание. %) после инъекции тромбопластина_

Контроль Опыт (крысы получали

Время после (витамины не вводили) витамины А. Е. С и Р)

инъекции, ч ТП АА ТП АА

Исходные 1075+23 59.1+1.6 1254±92 51.0+4.3

значения

0.5 103±7,6* 5.5±2.4* 436+69* 42.0+9.1

3.0 835+45* 33.1±9,6* 811+52* 57,6±4,3

6.0 1061±57 41,0+3.1* 994+47* 57.2±3,1

24.0 1482±30* 39.1+3.7* 1493±12* 50.3±2,5

Примечание: ТЦ - тромбоциты, АА - агрегационная активность.

на 90.4%, через 3 ч число тромбоцитов уже заметно повысилось, а через 6 сравнялось с исходным уровнем, превысив его через 24 ч. Одновременно падала агрегационная активность, не восстанавливаясь полностью до конца наблюдений.

На фоне антиоксидантов тромбоцитопения заметно ограничена. Агрегационная активность на фоне антиоксидантов упала через 0,5 ч всего на 15,8%, а позднее не отличалась от исходной.

Графический анализ агрегатограмм выявил, что время агрегации резко сокращалось после введения тромбопластина, восстанавливаясь к 6 ч. На фоне антиоксидантов степень сокращения менее значительна и восстановление выявилось уже к 3 ч. Скорость агрегации резко падала после введения тромбопластина и, постепенно восстанавливаясь, не нормализовалась и через 24 ч. На фоне антиоксидантов изменения скорости реакции не происходило.

Таким образом, тромбинемия вызывает наряду с выявленными ранее признаками вторичной гипокоагулемии, значительное потребление тромбоцитов со снижением их агрегационной активности. Введение антиоксидантов ограничивают эти изменения.

Как и ранее, введение тромбопластина сопровождалось активацией ПОЛ и угнетением антиоксидантного потенциала (рост содержания ДК и ТБК-активных продуктов в плазме и менее заметно - в эритроцитах, сокращение периода индукции и увеличение скорости окисления там же). На фоне антиоксидантов эти явления практически отсутствуют (повышено лишь содержание ДК в плазме). Следовательно, антиоксиданты снимают эффект тромбинемии на ПОЛ и одновременно ограничивают потребление тромбоцитов и падение их агрегационной активности.

Ограничение антиоксидантами реакции высвобождения, вызванной тромбинемией, косвенно указывает на инициирующую роль ПОЛ а активации тромбоцитов - об этом говорит параллелизм динамики снижения агрегационной активности и интенсивности ПОЛ. Интересно и то, что после назначения антиоксидантов уже до инъекции тромбопластина отмечено недостоверное ограничение агрегационной активности (табл. 10). Однако эта разница была достаточно заметной (13,7%) Поэтому мы увеличили число наблюдений до 12 в группе и нашли, что после введения антиоксидантов (12 дней) агрегаииониая активность составила у контрольных животных 55,4±1.5, а на фоне витаминизации - 47,8±1.3 (р<0.05). Таким образом, антиоксиданты снижают агрегационную активность тромбоцитов. Следовательно, степень их активации или готовность вступить в процессы первичного гемостаза и участвовать в усилении тромбиногенеза через реакцию высвобождения резко снижается. Это согласуется с тем, что при воздействии, вызвавшем тромбинемию (инъекция тромбопластина), меньше тромбоцитов потеряло способность к агрегации (табл. 10).

Число тромбоцитов (табл. 11} после кровоизвлечения снижалось, особенно через 3 ч (на 39,3%), в меньшей степени - через 6 ч. На фоне антиоксидантов к 6 ч восстановился исходный уровень. В целом степень тромбоцитопении была менее значительной, чем при введении тромбопластина в кровоток. Это свидетельствует (наряду с данными табл. 5) о меньшей степени активации тромбиногенеза.

Таблица 11. Число тромбоцитов (тыс./мкл) и АА (максимальное светопропускание. %) после кровоизвлечения_

Время после Контроль Опыт (крысы получали инъекции, ч (витамины не вводили) витамины А, Е, С и РР) _ТЦ_АА_ТЦ_АА

Исходные 1110±17 55,3+1.5 1298+90 47,7±2,8

значения

1 ч 865±16* 53,4±4,4 873±35* 70,8±1,0*

3,0 674±12* 49,б±5,1 * 826±19* 58,1±3,0*

6.0 " 991±13* 54,6+4.9 1243±69 50,1±35 .

24.0 1220±98 74,6±1,5* 1016±44 79,3±1,8*

Примечание: ТЦ - тромбоциты, АА - агрегационная активность.

Наряду с тромбоцитопенией после кровоизвлечения в контроле

наблюдали кратковременное снижение агрегаиионной активности (через 3 ч), а на фоне антиоксидантов - ее рост через I, 3 ч и к концу наблюдений. Это подтверждает, что актиоксиданты снижают готовность тромбоцитов к агрегации. Видимо, поэтому относительно слабая тромбикемия после кровоизвлечения не снизила агрегационной активности на фоне антиоксидантов - наоборот, она повысилась, т.е. выросла готовность к остановке кровопотерь

Выше сказано, что через 0.5 ч после кровоизвлечения активируется ПОЛ в плазме и зр^.троиитах. Представлялось интересным изучить этот процесс в динамике.

После кровоизвлечения в плазме и эритроцитах ПОЛ интенсифицировалось у контрольных и у получавших антиоксиданты-крыс (у последних менее выраженно). Разница отчасти сглаживается лишь к концу наблюдений (табл. 12).

Таблица 12. Влияние кровоизвлечения (25-30% от ОЦК) на ПОЛ в _плазме и эритроцитах крыс, получавших антиоксиданты_

Исследуемые показатели

1 ч

Без витаминов 3 ч 6 ч

24 ч

ДК. А/мг П 0,067+0.001 0,067+0,001 0,102+0.001 0,08210,001

Э 0,060±0,002 0,08310.001 0,13010,001 0,076±0,003

ТБК, ед/мг П 0,824±0,018 0,86410,007 1,55010,007 1,167+0,042

э 0,665±0,011 1,1310,006 1,768+0,009 1,145+0,040

ПИ, п 23,6±0,2 28,410,11 18,810,009 24,010,09

мин / мл э 31,2±0,3 22,410,09 15,8+0,011 25,8+0,10

СО, мм3 на П 1,283±0,020 1,22010,011 1,23010,007 1,13110,010

мл/'мнн э 1,16+0,015 1.65010,014 1,36+0,009 1,060+0,010

На фоне витаминов

ДК, А/мг П 0,04210,001 0,05910,001 0,096+0,002 0,07810,003

э 0,06610,002 0,08910,002 0,11910,001 0,073+0,002

ТБК, ед/мг П 0,51610,007 0,59510,007 1,448+0,011 0,97810,011

э 0,71910,005 0,9910,006 1,438+0,012 1,07510,009

ПИ, П 43,6+0,04 37,210,11 19,010,11 20,810,09

мин/ мл э 34.810,11 30,610,20 23,210,10 34,4+0,07

СО, мм3 на П 1,02510,009 0,89510,007 1,47010,009 1,31210,006

мл / мин э 0,8910,010 1,1610,004 1,68810,010 0,82010,005

Таким образом, и при сравнительно малой степени тромбоци-топении, сопровождающей кровоизвлечение, наряду с гемокоагуля-

ционными сдвигами и значительной активацией тромбоцитов ускоряется ПОЛ. Степень ускорения тем выше, чем заметнее тромбо-цитопения и изменения агрегаиионной активности тромбоцитов.

ПОЛ непосредственно в тромбоцитах после назначения антн-оксидантов несколько снизило уровень продуктов пероксидацик ь тромбоцитах, удлинило период индукции и снизило скорость окисления.

Изменения ПОЛ в тромбоцитах приводим в сопоставлении с данными по эритроцитам (рис. 1 и 2).

1 2

150

125 ]

100 75

25 ■г

1 2

Э 11ч

ТЗ ч

Т 6 ч

Т 24 ч

Рисунок 1. Сравнительное состояние ПОЛ в эритроцитах и тромбоцитах в разные сроки после кровоизвлечения в контроле. Э -эритроциты, Т - тромбоциты, 1 и 2 - ДК и ТБК-актизные продукты. Значение показателя в эритроцитах во всех случаях принимали за 100%.

. На рис. 1 видно, что уровень ДК и ТБК-активных продуктов на всех этапах опыта выше в тромбоцитах. Антиоксидантная активность не различалась столь существенно.

125 100 75 50 25 О

1 2

Т 1 ч

1 2

ТЗч

Т6 ч

1 2

Т 24 ч

Рисунок 2. Сравнительное состояние ПОЛ в эритроцитах и тромбоцитах в разные сроки после кровояззлечения на фойе анти-

оксидантов. Э - эритроциты, Т - тромбоциты, 1 и 2 • ДК и ТБК-активные продукты. Значение показателя в эритроцитах во всех случаях принимали за 100%.

Рис. 2 демонстрирует, что в 1-й час после кровопускания на фоне антиоксидантов в тромбоцитах содержание продуктов ПОД было ниже, чем в эритроцитах, а в последующем сравнялось. Эти данные не позволяют отдать предпочтение вкладу тех или других клеток в реализацию ускорения ПОЛ при тромбинемии. Возможно, на тромбинемию, вызываемую кровоизвлечением, накладывались эффекты гиповолемин. гипоксемии и изменения реологических свойств крови /А.М.Чернух и соавт., 1984/. В связи с этим провели опыты по изучению ПОЛ в тромбоцитах (наряду с гемокоагу-ляцией) при "чистой" тромбинемии, вызываемой введением тром-бопластина: две группы крыс (одна получала в течение 12 дней антиоксиданты) разделили на две подгруппы каждую. Одной из подгрупп ввели тромбопластин. другой - растворитель, отбирая пробы крови в динамике (табл. 13).

Таблица 13. Гемокоагуляция после введения тромбопластина

Интервал, ч АВР.с АЧТВ, с ФГ. г/л ПДФ, мг% ЭТ, %

Исх. 54,1±1,7 31,7±1,1 2,3±0,5 14,6+1,0 0,0

53.4Ю.8 32,1 ±1,0 2.4±0.3 12,5±0.9 0.0

0,25 48,1±1,0* 27,2±0,6* 1,9±0,7 16,8+0,9* 33,3*

49,2±],6 29,0±1,1* 2.1±0,4 13,8±1.0 27,7*

0,5 58,7±1,9 32,4±1,0 1,6±0,2 18,6+1,1* 100*

59,3±1,2* 33,2±1,5 1,9±0.2* 17,8±0,9* 50

1,0 65,6±1,б* 39,6±0,8* 1.3±0,1* 21.1+2.1* 100*

58,7±1,4* 35,3±0,7* 1,8±0,2* 16,3±1,8* 27,7*

3,0 67,311,9* 42,4±1,6* 0,9±0 05* 23,4±0,7* 90,5* .

59,6±1,6* 37,0±и* 1,7±0,1* 15,9±1,0* 33,3*

6,0 63,4±1,7* 39,6±2,0* 0,8±0,04* 22.1+2,1* 90,5*

56,1 ±0,9* 34,3±1,1 1,9±0,2 14,7±1,8* 27,7*

24 62,4±и* 36,6±1,7* 0,8±0,1 * 19,7+1,6* 50

54 ¿±1,8 32,0±1,2 2,1 ±0,2 13,0±1,0 0,0

Примечание: в первой строке - животные не получали витаминов, во второй - получали; достоверность указана при сравнении с соответствующим показателем до введения тромбопластина (Исх.).

Инъекция тромбопластина вызывала кратковременную гипер-коагулемию, сменившуюся гипокоагулемией потребления и признаками гипертромбинемии. Изменения сохранялись до конца наблюдений. На фоне антиоксидантов и гиперкоагулемия, и последующая гипокоагулемия менее выражены, а к 24 ч все показатели не отличались от исходных. Это подтвердило, что снижение свертываемости после введения тромбина или тромбопластина в вышеописанных опытах и в обсуждаемом является гипокоагулемией потребления, по-скольку в ранние сроки (через 0,25 ч) обнаруживалась гиперкоагулемия. Подтвердилось и ограничение гемокоагуляцион-ных сдвигов введением антиоксидантов. .

При анализе данных таблицы 14 выявлено: 1) содержание ДК и ТБК-активных продуктов в тромбоцитах ниже у крыс, получавших витамины, у них же длиннее период индукции; 2) содержание ДК выросло через 0,25 ч после инъекции тромбопластина у контрольных крыс на 28,9 % и продолжало расти до 6 ч наблюдений, резко снизившись, но не достигнув исходного к 24 ч. Период индукции на фоне антиоксидантов существенно продолжительнее на всем протяжении опытов, скорость окисления была ниже. При учете абсолютных значений показателей (табл. 14) ясно, что введение антиоксидантов заметно ограничивает в тромбоцитах активацию ПОЛ, вызываемую тромбинемией.

Сопоставим изменения гемокоагуляции и ПОЛ в динамике (табл. 13 и 14). В контроле пик изменений после введения тромбопластина приходится на интервал от 0,5 до 3 ч. На этот же период с расширением до 6 ч приходится пик накопления диеновых конъюгатов и ТБК-активных продуктов, изменений периода индукции и скорости окисления. У подопытных крыс пики активации ПОЛ совпадают с пиками коагуляционных сдвигов. Это подтверждает связь между обоими процессами. Так как тромбинемия создавалась искусственно и была заведомо первичной относительно активации ПОЛ, можно считать ее пусковым фактором в активации ПОЛ ь тромбоцитах. Тот факт, что антиоксиданты ограничивают эффект тромбинемии на гемокоагуляцию, свидетельствует, что активация ПОЛ способствует росту тромбинемии (возможно по механизму положительной обратной связи).

Влияние свинцовой интоксикации на состояние ПОЛ и гемо-коагуляцию. В этой части работы использовали свинец как проок-сидант, невлияющий непосредственно на гемокоагуляции, чтобы

Таблица 14. Процессы ПОЛ в тромбоцитах после введения тромбопластина на фоне антиоксидантов и без них

Контроль . Опыт Изменения в %% к

Исследуемые (без вита- (вводили исходному

показатели минов) витамины) к контролю к опыту

Исходные

, ДК, А/мг 0,138+0,06 0,101+0.004 - -

ТБК, ед/мг 0,662±0,008 0,492±0.028 - -

ПИ, мин/мл 52,0+0,04 68,0+0.06 - -

СО, мм3/мл/мин 0,72+0,07 0,72+0.011 - -

Через 0,25 ч

ДК. А/мг 0,273±0,015 0.194+0.007 97,8 92.1

ТБК, ед/мг 1.41 ±0,030 0,914±0.004 126 85.8

ПИ, мин/мл 40,0±0,02 52,0±0.04 -23,1 -23.5

СО. мм3/мл/мин 0,94±0.07 0.82±0.07 30 14

Через 0,5 ч

ДК. А/мг 0,368±0.007 0,235±0,060 166,7 132,7

ТБК, ед/мг 1.63Ю.06 1,25±0,044 162 154

ПИ, мин/мл 27,0±0,02 43,0+0,02 48 -37

СО, мм3/мл/мин 1,10±0.П 0,92±0,07 52 27

Через 1 ч

ДК. А/мг 0,312±0,021 0,290±0,033 126 187,1

ТБК, ед/мг 1,86±0,087 1.54+0,014 199 213

ПИ, мин/мл 32,0±0,03 32,0+0,02 -38 -52

СО, мм3/мл/мин 0,98±0,07 0.96±0,04 36 33

Через 3 ч

ДК, А/мг 0,407±0,025 0,238±0,003 194,9 135,6

ТБК, ед/мг 1,75±0,012 1,38+0,034 181 180

ПИ, мин/мл 18,0±0,11 34,0±0.03 -65 -50

СО, мм3/мл/мин 1,21±0,11 1,12±0,11 68 55

Через 6 ч

ДК, А/мг 0,42710,022 0,28110,004 209.4 178.2

ТБК, ед/мг 1,9110,08 1,60±0.06 207' 225

ПИ, мин/мл 20,0±0.2 41,010,07 -61 -39

СО, мм3/мл/мин 1,12±0,20 0,9410,08 55 30

Через 24 ч

ДК, А/мг 0,21910,007 0,18410,006 58.7 82.1

ТБК, ед/мг 1,38210,051 1,19310.042 122 142

ПИ, мин/мл 46,010,04 58,0+0,03 -11 -15

СО, мм3,/мл/мин 1,0010,11 0.8110.07 38 . 13

установить имеет ли место обратная связь: активация процессов ПОЛ -* гипертромбинемия. Свинец вводили в дозе, вызывающей у крыс признаки нарушения обмена порфиринов (специфический эффект свинца) уже через 10 дней /И.А. Мухаче-ва и соавт., 1992/.

Специфический токсический эффект свинца (прирост прото-порфирина в эритроцитах) выявлен на 10-й день, наряду с гипокоа-гулемией (удлинение АВР и АЧТВ) и признаками активации тром-биногенеза (рост ПДФ и частоты ЭТ) без потребления фибриногена и тромбоцитов. Агрегационная активность тромбоцитов снизилась под влиянием антиоксидантов (как и в других сериях опытов) и под влиянием свинца, что стало еще более заметным при одновременном введении антиоксидантов и свинца.

Таблица 15. Состояние ПОЛ в тромбоцитах и эритроцитах крыс,

получавших свинец и антиоксиданты порознь и совместно _(10 дней) _

Исследуемые Вводили:

показатели Контроль антиокси- свинец то и другое

данты

ДК. А/мг Э 0,21 ±0,02 0,18±0,01 0,59±0,06 0,28+0,02

Т 0,27±0,02 0,20±0,002 0,69±0,003 0,46±0,04

ТБК, ед/'мг Э 2,64+0,08 2,06±0,02 6,2+0,6 4,72+0,02

Т 2,72±0,02 2,40+0,02 6,2±0,16 4,60±0,04

ПИ, мин/мл Э 52+1,0 66±1,0 22±1,0 32+1,0

Т 44+1,0 52+1,0 22±1,0 33±1,0

СО, мм3 на Э 0,74+0,06 0,63±0,06 1,32±0,02 0,78+0,9

мл/мин Т 0,87±0,9 0,74+0,07 1,40+0,10 0,88+0.07

Примечание: Т и Э - тромбоциты и эритроциты соответственно.

Определение ПОЛ в тромбоцитах выявило, что клетки примерно одинаково реагировали активацией ПОЛ на введение проок-сиданта и антиоксидантов и оказались равно чувствительными к защитному действию антиоксидантов (табл. 15).

При 30-дневном введении свинца несколько углубились изменения свертываемости (удлинение показателей общей свертывающей активности, рост содержания ПДФ и частоты положительных ЭТ, гипофибриногенемия), снизилась агрегационная активность тромбоцитов. Антиоксиданты предупредили гемокоагуляционные сдвиги, вызываемые свинцом, уменьшили агрегационную актив-

ность тромбоцитов в контроле и их активацию при свинцовой интоксикации (табл. 16).

Таблица 16. Гемокоагуляция и содержание протопорфирин.а в эритроцитах крыс, получавших свинец и антиоксиданты порознь и сов_местно в течение 30 дней (по 6 крыс в группе)_

Показатели Контроль Вводили Вводили То и

(без добавок) антиоксиданты свинец другое

АВР, с 51,7+2.5 51.0±3.1 61.9+3.1* 52.0+1.1

АЧТВ. с 36,1±1.2 33.7±2,0 39.9+1.1* 33,2+1.7

ФГ, г/л 4,0+0.3 4.1+0.5 2.9+0.5* 4.1 ±0.4

ПДФ, мг% 14,1±1,1 12.1+0,6 18,9+0,7* 14,6+0.7

ЭТ, % 22,1 0.0 50.0* 22.2*

ТЦ. 896±21 911±22 899+16 901±23

тыс./мкл

АА, % 83,3±5,8 54.7+3,9* 64.7±4,9* 78,8±5.3

ППР, мкг% 20,1 ±3,2 19,9±1.9 43.8±4.7* 31.1+3.3*

Таблица 17. Состояние ПОЛ в тромбоцитах и эритроцитах крыс, получавших свинец и антиоксиданты порознь и совместно в течение 30 дней

Показатели Контроль Вводили Вводили То и

антиоксиданты свинец другое

ДК, к/иг Э 0,09±0,001 0.07+0.01* 0.37+0.02* 0,15±0,02*

Т 0.16Ю.02 0,11+0,02* 0.61 ±0.02* 0,19+0.04

ТБК, ед/мг Э 1,63±0,11 1,47±0,09* 4.0+0.00* 1.74+0,06

Т 1,84±0,12 1,63±0,9* 8.0±0,12* 2.11+0,08*

ПИ, Э 69,0±1,0 53,0±1,1* 30,1±2,4* 57,2+2.1*

мин/мл Т 53,1±2,1 59,7±1,6* 21.2+1.7* 47,1+2.4*

СО, мм3 на Э 0,81 ±0,04 0,75±0,07* 1.08±0,01 * 0.74±0,02*

ыл/мин Т 0,74±0,02 0,61 ±0,03* 1.20+0.03* 0.92+0,03*

Примечание: Э и Т - эритроциты и тромбоциты соответственно. .

Интенсивность ПОЛ с удлинением срока воздействия свинцом увеличилась в эритроцитах и особенно в тромбоцитах (табл. 17).

Видимо, свинец-прооксидант активирует ПОЛ в эритроцитах и тромбоцитах только при продолжительном введении, причем с удлинением сроков воздействия степень активации растет. Пока активация ПОЛ в тромбоцитах не отличается от таковой в эритроцитах, изменения гемокоагуляции слабо выражены - рассогласованность показателей общей свертывающей активности, небольшой

прирост ПДФ и ЭТ. По мере нарастания интоксикации и активации ПОЛ в тромбоцитах гемокоагуляционные сдвиги усиливаются -тромбинемия приводит к вторичной гипокоагулемии (ДВС II стадии) с высоким уровнем ПДФ и потреблением фибриногена.

На этом основанни можно полагать, что гипертромбинемия служит одновременно и инициатором активации ПОЛ в эритроцитах и тромбоцитах. Активируя тромбоциты и интенсифицируя ПОЛ в них, тромбин по обратной положительной связи ускоряет тром-биногенез. Первичная активация ПОЛ в клетках крови под воздействием прооксиданта также ускоряет тромбиногенез, однако слабее, чем при инициации процесса за счет первичной тромбинемии. Тем не менее, активация тромбиногенеза включает в качестве усиливающего звена активацию ПОЛ, причем, ведущую роль играет интенсификация ПОЛ в тромбоцитах: через реакцию высвобождения тромбоциты в этом случае резко усиливают тромбинообразсва-ние, а появляющиеся новые порции тромбина активируют ПОЛ.

Однако лишь опыты ¡п уИго могли более четко ответить на вопрос о роли клеток в эффекте ПОЛ на тромбиногенез. Предваряя эти опыты, мы изучили влияние тромбинемии на тромбопластичес-кую активность эритроцитов - фактор, участвующий в тромбинооб-разовзнии /Б.И. Кузник, В.П. Скипетров, 1974/.

Таблица 18. Тромбопластическая активность отмытых эритроцитов через 0,5 ч после инъекции взвеси тромбопластина на фоне анти-оксидантного комплекса и без него (по 6 крыс в группе)

Тромбопластическая Отклонение от Условия опыта активность эритро- контроля, % _цитов, ЕА/ мл_

Контроль 3 500 ± 58 -

Введен 700 -± 6* 80

тромбопластин

Антиоксиданты 2 100 ± 10* 40

Тромбопластин на 1 200 ± 16* 66

фоне антиоксидантов

Введение антиоксидантов ограничило степень снижения тром-бопластической активности эритроцитов при тромбинемии (табл. 18), т.е. ограничило их вклад в тромбиногенез. Это можно объяснить тем, что антиоксиданты лимитируют интенсивность ПОЛ в эритроцитах, повышая стабильность мембраны - предположение

согласуется с результатами оценки деформируемости эритроцитов в тех же условиях (табл. 19).

Таблица 19. Коэффициент деформируемости эритроцитов после инъекции тромбопластина на фоне антиоксидантов и без них (по 6

_крыс в группе)_

Пробы крови отбирали после инъекции тромбопластина _через:_

Крысы не получали антиоксидантов

Крысы получали антиоксиданты

Исходные данные • 0,5 ч 1,0 ч

3,0 ч

1,100±0.005 l,197±Q,011* 1.139±0.004* 1.135+0.002*

1,116+0,003* 1,169+0.003** 1.117+0.006 1.097+0.005**

Примечание: знак * - достоверные отличия от исходных данных у хрыс, неполучавших антиоксидантов; знак ** - от исходных данных у крыс, получавших антиоксиданты.

Видимо, антиоксиданты, ограничивая ПОЛ в эритроцитарных мембранах, уменьшают их вклад в процессы тромбиногенеза. Сопоставление вклада эритроцитов и тромбоцитов в активацию тромби-нообразования через ускорение ПОЛ оценивали in vitro.

Влияние тромбина ш ПОЛ g плазме, эритроцитах и тромбоцитах in vitro. В этой части работы мы уточняли роль эритроцитов и тромбоцитов в цикле тромбиисмия ■-» активация ПОЛ трскоигггмня и'т.д. Оказалось, что тромбин не изменяет в бесклеточной плазме содержание первичных и вторичных продуктов ПОЛ и ускоряет в малой степени окисление (на 16,3 %). Следовательно, эффект на ПОЛ тромбин реализует не через бесклеточную плазму (табл. 20).

Таблица 20. ПОЛ в плазме после инкубации с тромбином Исследуемые Плазма без Плазма без

показатели клеток Тромбин клеток + Тром-

бин

ДК, А/мг ТБК, ед/мг ПИ, мин/мл СО.мм3/мл/мин

0,03±0,001 1,18±0,08

65±6,8 0,61±0,010

0,00 0,00

0,04±0.001 1,18±0,09 54,0±2,1 0,71+0,010

Инкубация эритроцитов с тромбином повысила (на 11,1 %) содержание первичных продуктов ПОЛ, сократила ПИ и увеличила СО. т.е. тромбин инициирует пероксидацию в эритроцитах. В тромбоцитах те же, но более выраженные сдвиги (табл. 21).

Таблица 21. ПОЛ в эритроцитах и тромбоцитах после инкубации с

тромбином

Исследуемые показатели

Э + Тр

ТЦ

ТЦ + Тр

ДК, А/мг 0,08+0,002* 0,09±0,003 0,09+0,002*

ТБК, ед/мг 0,80±0,05* ПИ, мин/мл 52,1+3,2* СО.мм3/мл/мин 0,90±0.01 *

0,92±0,06 2,46±0,09* 30,1±3,3** 46,2±2,1* 1,07+0,014* 0,87+0,08*

0,13± 0,003** 2,68±0,07** 32,3±2,0** 0,94±0,003*

Примечание: 1) Э, Тр, ТЦ - эритроциты, тромбин и тромбоциты соответственно; 2) знак * - достоверно относительно данных в бесклеточной плазме без тромбина (табл. 20); знак ** - относительно данных из соседней (слева) строки.

123 12.3 123 123

ДК, ТБК, ПИ, СО, ммЗ

А/мг ед/мг мин/мл на мл/мин

Рисунок 3. Степень изменения показателен ПОЛ при инкубации с тромбином эритроцитов, тромбоцитов и их смеси (1 - эритроциты, 2 - тромбоциты, 3 - эритроциты и тромбоциты).

На рис. 3 видно, насколько интенсивнее изменилась активность процессов ПОЛ при контакте с тромбином смеси эритроциты-тромбоциты по сравнению с теми же клетками, взятыми порознь. Аналогичные результаты получены в бесклеточной плазме.

Итак, бесклеточная плазма не реагирует на контакт с тромбином активацией ПОЛ. Тот же процесс в эритроцитах и еще более в тромбоцитах весьма чувствителен к инкубации с тромбином.

Для уточнения представления о разной способности тех и других клеток реагировать на инкубацию с тромбином, мы провели опыты с возрастающим количеством эритроцитов или тромбоцитов в заданном объеме.

Таблица 22. Влияние количества эритроцитов и тромбоцитов на интенсивность индуцируемого тромбином ПОЛ в плазме, свободной

от клеток

Концентра- ДК. А/мг ТБК. ед/мг ПИ. СО. мма на

ция клеток липида липида мин / мл мл / мин

Эритроциты

- 0,0 0,004±0,0001 0.06±0.001 26.1+1,9 1,12±0,021

0,1 0,008±0,0003* 0.10+0.009* 28,2±2,1 1,02±0,019*

0,3 0,029±0,0013* 0,38±0,014* 32,3±3,2 0,99±0,012*

0,5 0,048±0,0021 * 0.46Ю.023* 54,2±4,6* 0,82±0,011 *

1,0 0,092±0,0101* 0,92±0,031 * 80,4+7,3* 0,74±0,009*

Тромбоциты

0,05 0,072±0,009 1,18±0,064 24,1±2,0 1,11±0.011

0,1 0,121±0,012* 1,28±0,053* 30,1±2,3* 1,00±0,008*

0,3 0,1820,017* 1,41±0,061 * 30.5+2,2 0,94+0.008*

0,5 0,200±0,023* 2.360.077* 42,0±2,9* 0,72+0.012*

1,0 0,234±0,031* 3,73+0,081* 54,1 ±3.2* 0.68±0.009*

Примечание: Экспериментальная смесь содержит 1 мл бескле-

точной плазмы + 1 мг тромбина, за едикицу количества клеток принято их содержание в 1 мл исследуемой плазмы.

При увеличении концентрации эритроцитов в 10 раз (от 0,1 до 1,0) концентрация ДК возросла в 23 раза. При росте содержания тромбоцитов в 10 раз, содержание ДК увеличилось в 58,5 раза или б 2,5 раза сильнее, чем в случае с эритроцитами. Прирост содержания ТБК-активных продуктов при 10-кратном увеличении концентрации тромбоцитов был выше, чем при внесении такого же количества эритроцитов в 1,4 раза. Период индукции при максимальной концентрации тромбоцитов был короче, чем при максимальной концентрации эритроцитов в 1,5 раза, а скорость окисления существенно не зависела от испытуемого фактора.

Из приведенных данных следует: 1. Рост содержания первичных н вторичных продуктов ПОЛ в бесклеточной плазме при до-

бавлении эритроцитов или тромбоцитов в присутствии тромбина не является следствием дополнительного внесения окисляемого субстрата,т.е. на тромбин реагирует не плазма, а клетки. 2. Тромбоциты "отзываются" на тромбин в 2-4 раза (ДК и ТБК соответственно) интенсивнее при идентичном увеличении содержания эритроцитов. Таким образом, интенсивность процессов ПОД в плазме -отражение их интенсивности в эритроцитах и тромбоцитах, активация процессов под действием тромбина реализуется интенсивнее через влияние на тромбоциты.

В заключение мы исключили связь эффекта тромбина на ПОЛ с его способностью катализировать коагуляционные превращения фибриногена: эффект тромбина на ПОЛ в плазме не зависел от наличия фибриногена.

В итоге можно заключить, что эффект тромбинемии на ПОЛ в тромбоцитах сводится, видимо, к ускоренному высвобождению арахидоновой кислоты : родоначальника ряда гидроперекисей, накопление которых сопровождается активацией тромбоцитов. Активация тромбоцитов ускоряет выход из них свойственных этим клеткам факторов плазмокоагуляции, которые активируют образование протромбиназы, а, следовательно, способствует росту тромбинемии. В итоге замыкается цикл: тромбиногенез ~> активация ПОЛ з тромбоцитах -» актпзацпя тромбоцитов -> реакция выспобогздепия —*■ активация трогабикагепеза.

' Относительно механизма активации ПОЛ в эритроцитах под влиянием тромбина сколько-нибудь четкого суждения высказать не представляется возможным, т.к. в доступной нам литературе мы не встретили соответствующих данных. Однако несомненна роль их роль в возникновении цикла трсмбппогснез —> активация ПОЛ —» тромбгтогенез.

6. ВЫВОДЫ

1. При разнообразных по происхождению нарушениях свертываемости крови, характеризующихся повышенным тромбинообразо-ванием, активируются процессы перекисного окисления липидов, что ведет к накоплению в плазме крови продуктов пероксидации. То же наблюдается при гипертромбинемии, создаваемой введением тромбина извне.

2. Предварительное повышение антиоксидантного потенциала за счет введения природных антиоксидантов' ограничивает активацию тромбиногенеза, вызываемую кровопотерей, введением дек-

страна или гетерогемотрансфузией, и уменьшает эффект тромбин-емин на ПОЛ.

3. Введение животным прооксиданта. не влияющего непосредственно на гемокоагуляцию (свинец), повышает активность ПОЛ в плазме, что сопровождается изменениями, характерными для ускоренного тромбинообразования.

4. Эффект тромбинемии на процессы ПОЛ в плазме реализуется через тромбоциты и в меньшей степени через эритроциты.

5. Активация процессов ПОЛ в тромбоцитах и эритроцитах повышает их вклад в тромбиногенез, способствуя замыканию цикла активации тромбинообразования —> активация ПОЛ в тромбоцитах и эритроцитах -> актизация протромбиназы —► ускорение тромбинообразования.

6. Представляется перспективным изучение эффекта коррекции гиперкоагулемии и ее последствий одновременным применением антикоагулянтов и антиоксидантов.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ

ДИССЕРТАЦИИ

1. Терсенов O.A., Бышевский А.Ш.. Михалева И.В.. Платонов Е.В., Нелепченко И.В. Тромбопластическая активность некоторых стабильных клеточных линий //Гематология и трансфузиология. -1989. - № 2. - С. 273 - 276.

2. Соловьев В.Г., Селиванова И.В., Галян С.Л. О механизмах защитного действия витаминов А, Е, С и Р при тромбинемии / / Физиология и патология ПОЛ. гемостаза и иммуногенеза. - Полтава, 1992. - С. 79.

3. Соловьев В.Г., Галян С.Л., Усольиева В.А.. Соболь Т.В., Ель-децова С.Н., Вакулин A.A., Селиванова И.В. Коррекция гемостаза витаминами А, Е, С и Р при оперативном вмешательстве // Обмен веществ в норме и патологии. - Тюмень. 1992. - С. 93.

4. Соловьев В.Г., Ельдецова С.Н., Шафер В.М.. Ральченко И В.. Вакулин В.А., Селиванова И.В., Мкртумян А.М., Галенко О.В., Галян С.Л., Соболь" Т.В., Полякова В.А. Витамины в профилактике ДВС-синдрома различного происхождения / / Физиология и пато-

. логия ПОЛ, гемостаза и иммуногенеза. - Полтава, 1992. - С. 78.

5. Соловьев В.Г., Галян С.Л., Селиванова И.В., Ельдецова С.Н.. Бышевский А.Ш. О коррекции морфофункциональных свойств тромбоцитов в эксперименте // Физиология и патология ПОЛ. гемостаза и иммуногенеза. - Полтава, 1993. - С. 50.

6. Бышевский А.Ш., Галян С.Л., Ельдецова С.Н., Селиванова И.В., Соловьев В.Г. О связи между тромбинемией и свободноради-кальными процессами в крови / / Укр. биохим. журнал. - 199_ -

7. Соловьев В.Г., Селиванова И.В. Коррекция функций тромбоцитов при ДВС-синдроме / /

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

АА - агрегационная активность

АВР - активированное время рекальцификации

АДФ - аденозиндифосфат

АОА - антиоксидантная активность

АЧТВ - активированное частичное тромбопластиновое время

ДВС - диссеминированное внутрисосуднстое свертывание

ДК - диеновые конъюгаты

ПДФ - продукты деградации фибриногена/фибрина

ПИ - период индукции

ПОЛ - перекисное окисление липидов