Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Клетки и кровеносные сосуды дермы человека в онтогенезе

ВАК РФ 03.03.04, Клеточная биология, цитология, гистология

Автореферат диссертации по теме "Клетки и кровеносные сосуды дермы человека в онтогенезе"

На правах рукописи

ПЕТРОВ ВАДИМ ВИТАЛЬЕВИЧ

КЛЕТКИ И КРОВЕНОСНЫЕ СОСУДЫ ДЕРМЫ ЧЕЛОВЕКА В

ОНТОГЕНЕЗЕ

03.03.04 - клеточная биология, цитология, гистология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

3 ПАР 2015

Казань — 2015

005559855

005559855

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Чувашский государственный университет имени И.Н. Ульянова»

Научный руководитель:

доктор медицинских наук, профессор Гунин Андрей Германович

Официальные оппоненты:

Яглов Валентин Васильевич — доктор медицинских наук, профессор, зав. лабораторией развития эндокринной системы Федерального государственного научного бюджетного учреждения «Научно-исследовательский институт морфологии человека».

Гумерова Аниса Азатовна — доктор медицинских наук, профессор кафедры морфологии и общей патологии Федерального государственного автономного учреждения высшего профессионального образования "Казанский (Приволжский) федеральный университет".

Ведущая организация:

Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Первый Московский государственный медицинский университет имени И.М. Сеченова» Министерства здравоохранения Российской Федерации.

Защита состоится 17 апреля 2015 года в 10 часов на заседании диссертационного совета Д 208.034.01 при ГБОУ ВПО «Казанский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации (420012. г. Казань, ул. Бутлерова, 49).

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке ГБОУ ВПО «Казанский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации (420012, г. Казань, ул. Бутлерова, 49 б) и на сайте: уулулу.к^ти.kcn.ru.

Автореферат разослан «_»_2015 года.

Ученый секретарь диссертационного советя

доктор медицинских наук, профессор

Зубаирова Л. Д.

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность. Проблема возрастных изменений в различных органах и тканях является одним из самых актуальных и приоритетных для современной медицины и биологии. Эта актуальность обусловлена в первую очередь существенным увеличением рисков развития различных видов патологий. С одной стороны, это может быть связано с уменьшением эффективности функционирования иммунной системы с возрастом, а с другой угасанием в большинстве клеточных типов процессов пролиферации и синтетической активности (Zouboulis et al., 2008).

В рамках этой проблемы несомненный интерес, в частности для дерматологии и косметологии, представляют вопросы возрастных изменений кожи. Причем, несмотря на кажущуюся хорошую изученность возможности современной медицины свидетельствует о том, что до настоящего времени мы не можем полноценно предотвратить появление признаков старения кожи (Sanz-Jaka et al., 2009). Для преодоления проблемы старения кожи необходимо знать закономерности, лежащие в основе этих изменений, в то время как таких сведений до настоящего времени явно недостаточно (Carlos López-Otín et al., 2013). На протяжении жизни кожа человека претерпевает комплекс морфофункциональных изменений. Главное место среди них занимают изменения в состоянии межклеточного вещества дермы, где происходит ферментативное разрушение и замедление синтеза новых коллагеновых и эластических волокон, уменьшение содержания гиалуроновой кислоты и протеогликанов, вместе с тем в дерме происходит изменение архитектоники волокон и накопление фрагментированных коллагеновых и эластических волокон (Kohl et al., 2011; Naylor et al., 2011; Nguyen, Eklouh-Molinier et al., 2014). Различные волокна и аморфный компонент соединительной ткани, как и ферменты, участвующие в их разрушении, являются продуктами жизнедеятельности клеток, локализованных в дерме, поэтому вполне очевидно, что изменения в составе

межклеточного вещества напрямую связаны с изменениями в клеточном составе дермы. Однако возрастные изменения клеточной популяции дермы практически не охарактеризованы. Более того данные по этому вопросу порой имеют противоречивый характер (Bentov et al., 2014). Так, к настоящему времени остаются неизвестны фенотипические особенности, функциональная и пролиферативная активность дермальных фибробластов в возрастном аспекте (Khavkin, Ellis, 2011). Кроме фибробластов, в дерме присутствуют клетки костномозговой природы, такие как лейкоциты, тучные клетки, натуральные киллеры, гематопоэтические стволовые клетки и другие (Rijken, Bruijnzeel, 2009; Vukmanovic-Stejic et al., 2011; Wang et al., 2012). Изменения в содержании и функциональной активности всех этих клеток изучены в основном на моделях индуцированного старения кожи, в то время как физиологические возрастные изменения остаются мало исследованными (Cho et al., 2009; Kim et al., 2009; Rijken, Bruijnzeel-Koomen, 2011). Так, имеются противоречивые сведения о возрастных изменениях содержания тучных клеток в дерме человека с фетального периода до глубокой старости (Enerback, Wingren, 1980; Gilchrest et al., 1982; Montagna, Carlisle, 1990). A сведения о возрастных изменениях популяции эозинофилов в дерме человека в литературе вообще отсутствуют.

Одним из факторов, обеспечивающим нормальное функционирование любого органа, в том числе и кожи, является кровоснабжение. Однако ситуация с состоянием сосудистого обеспечения кожи в возрастном аспекте не совсем ясна. Большая часть данных о возрастном снижении кровоснабжения кожи получена без использования иммуногистохимических методов, кроме того все работы в этой области охватывают какой-либо один период жизни (Coolen et al., 2010), а количественного исследования сосудистого обеспечения дермы человека от эмбрионального периода до глубокой старости не было проведено. Поэтому изучение особенностей кровеносной системы кожи способствует установлению неисследованных механизмов, лежащих в основе возрастных изменений (Lee et al., 2010).

Недостаточная изученность различных аспектов функционирования кожи во многом связана с недостаточной информативностью классических морфологических подходов, которые не всегда позволяют адекватно выявлять различные типы клеток, однако с появлением методов иммуногистохимии появилась возможность корректно идентифицировать любые клетки и обозначить их функциональное состояние. Вышеизложенное убедительно показывает целесообразность и научную значимость исследования морфологической структуры кожи человека при старении.

Исходя из этого, целью настоящей работы явилось иммуногистохимическое изучение клеточного состава дермы человека и структурных характеристик ее кровеносных сосудов в онтогенезе.

В соответствии с целью были определены следующие задачи:

1. Исследовать количество фибробластов в дерме человека в онтогенезе и их пролиферативную активность на основании экспрессии ядерного антигена пролиферирующих клеток (РСИА).

2. Иммуногистоимически исследовать возрастные изменения количества клеток, содержащих общелейкоцитарный антиген СВ45, в дерме человека.

3. Иммуногистоимически на основании экспрессии триптазы исследовать состояние популяции тучных клеток в дерме кожи человека в онтогенезе.

4. Иммуногистоимически на основании наличия главного основного белка (МВР) изучить возрастные изменения содержания эозинофилов в дерме человека.

5. Иммуногистоимически на основании иммунореактивности к фактору Виллебранда и белку межклеточных контактов эндотелиальных клеток СБ31 исследовать количество кровеносных сосудов в дерме кожи человека в онтогенезе.

Научная новизна. Впервые выявлены изменения клеточного состава дермы человека с 22 недель внутриутробного развития до 85 лет, которые

заключаются в том, что происходит нелинейное уменьшение содержания фибробластов дермы на протяжении жизни. Выявлены критические возрастные периоды, в которых отмечается резкое падение численности фибробластов дермы, к ним относят 30-40 недель неонатального периода, а также период между 11 и 20 годами жизни.

Новыми являются данные об изменении морфологии фибробластов в онтогенезе. Безусловной новизной обладают сведения о возрастных изменениях дермы, которые потенциально могут влиять на снижение числа фибробластов, включающие уменьшение количества пролиферирующих клеток дермы человека в онтогенезе, начиная с внутриутробного периода.

Приоритетными следует признать сведения о том, что количество СБ45 положительных клеток в коже человека увеличивает с возрастом, причем увеличение их количества взаимосвязано с уменьшением общей численности фибробластов и их пролиферативной активностью.

Впервые получены данные о неуклонном и постепенном увеличении числа тучных клеток и изменении их морфологии в дерме человека в онтогенезе, а также впервые обнаружено полное отсутствие эозинофилов в коже здорового человека.

Впервые доказано, что возрастное уменьшение количества фибробластов дермы зависит от степени ее кровоснабжения. Впервые, иммуногистохимически, получены новые знания об уменьшении численности кровеносных сосудов при старении кожи.

Научно-практическая значимость. Результаты данной работы существенно расширяют наши знания о комплексных изменениях в дерме человека в онтогенезе. Впервые раскрыты новые механизмы, приводящие к возрастным изменениям в коже человека. Полученные данные могут быть полезными для разработки клинических подходов в профилактике и терапии возрастных изменений кожи. Практическая значимость настоящей работы заключается в использовании полученных данных при проведении научных исследований в гистологии, патологической анатомии и геронтологии. Они

дополняют существующие данные в области возрастной гистологии и могут быть использованы при чтении лекций и проведении практических занятий на медицинских и биологических факультетах вузов. Основные положения, выносимые на защиту.

1. Снижение численности фибробластов в дерме человека в онтогенезе обусловлено снижением их пролиферативной активности, увеличением численности С045-положительных и тучных клеток, а также уменьшением количества кровеносных сосудов. Апробация работы. Результаты работы, отражающие основные положения диссертации представлялись на ежегодных итоговых конференциях медицинского факультета Чувашского государственного университета им. И.Н. Ульянова (2010-2014), международной научной конференции «Актуальные проблемы психологии и медицины в условиях модернизации образования и здравоохранения» (Чебоксары, 2012), VIII международной заочной научно-практической конференции «Научная дискуссия: инновации в современном мире» (Москва, 2013), The 8th European Congress of Biogerontology joint with the 2nd International RESOLVE Meeting «Healthy Ageing and Regenerative Medicine» (Israel, 2013), научной конференции «Фундаментальные проблемы геронтологии и гериатрии», посвященной 20-летию со дня основания Геронтологического общества при Российской академии наук (Санкт-Петербург, 2014).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 12 печатных работ, из них 2 в зарубежных и 4 в отечественных ведущих рецензируемых научных журналах и изданиях, рекомендованных ВАК для защиты кандидатских и докторских диссертации, 6 тезисов докладов Международных и Всероссийских конференций и конгрессов.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, результатов исследования, обсуждения и выводов. Объем диссертации 137 страницы машинописного текста. Работа содержит 60 рисунков. Список

цитированной литературы содержит 8 отечественных и 186 зарубежных источников.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Объектом исследования служила кожа, полученная при аутопсии, нижней части передней поверхности шеи (верхний угол стандартного разреза кожи при аутопсии) у плодов человека, умерших антенатально на сроке 20-40 недель беременности, а также у людей, умерших от различных причин в возрасте от 1 дня до 85 лет.

Для подсчета численности клеток был использован 518 кусочек кожи (200 женщин и 318 мужчин), во всех кусочках вычислялось количество фибробластов. Для исследования численности PCNA положительных клеток было использовано 139 кусочков кожи (35 женщин и 104 мужчин). Для исследования численности CD45 положительных клеток было использовано 151 кусочков кожи (62 женщин и 89 мужчин). Для подсчета количества тучных клеток было использовано 156 кусочков кожи (46 женщин и 110 мужчин). Для подсчета количества эозинофилов было использовано 46 кусочков кожи. Для определения численности сосудов, эндотелий которых экспрессирует антиген CD31 было использовано 85 кусочков кожи (32 женщин и 53 мужчин). Для подсчета количества сосудов, эндотелий которых экспрессирует фактор Виллебранда было использовано 92 кусочков кожи (35 женщин и 57 мужчин).

Все случаи группировались по возрастному принципу. Для антенатального периода были выбраны 10 недельные промежутки: 20-30 недель беременности (группа 1), 31-40 недель беременности (группа 2). Для постнатального периода все случаи группировались по 10 годичным интервалам: 1-10 лет (группа 3), 11-20 лет (группа 4), 21-30 лет (группа 5), 31-40 лет (группа 6), 41-50 лет (группа 7), 51-60 лет (группа 8), 61-70 лет (группа 9), 71 до 85 лет (группа 10).

При определении численности сосудов, эндотелий которых положительно окрашивается на фактор Виллебранда и антиген CD31 все

случаи группировались по следующему возрастному принципу: 20-40 недель беременности (группа 1), 1-20 лет (группа 2), 20-40 лет (группа 3), 40-60 лет (группа 4), 60-85 лет (группа 5).

Методы исследования

1. Непрямой иммуногистохимический метод.

Данным методом при помощи антител, конъюгированных с пероксидазой (DakoCytomation, Glostrup, Denmark), выявлялись антигены, характерные для определенного типа клеток, такие как ядерный антиген пролиферирующих клеток (Polyclonal rabbit anti-PCNA antibody) (AHP1419, AbD Serotec, Oxford, UK), антиген CD45 (monoclonal mouse anti-human CD45; M 0701, DakoCytomation, Glostrup, Denmark), триптаза тучных клеток человека (monoclonal mouse anti-human mast cell tryptase; M 7052; DakoCytomation, Glostrup, Denmark), антиген МБР (основного (щелочного) белка эозинофилов) двух разных производителей (1. monoclonal mouse antihuman eosinophil major basic protein (CBL419, Chemicon International, Inc, Billerica, MA, USA); 2. monoclonal mouse anti-human eosinophil major basic protein (sc-59164, Santa Cruz Biotechnology Inc., Santa Cruz, CA, USA), фактор Виллебранда (monoclonal mouse anti-human vWF; sc-59164, Santa Cruz Biotechnology Inc., Santa Cruz, CA, USA), антиген CD31 (monoclonal mouse anti-human CD31; CBL419, Chemicon International, Inc, Billerica, MA, USA).

2. Окрашивание гематоксилином и эозином

Данным методом определялась численность фибробластов. Также после завершения основного протокола постановки иммуногистохимических реакций производилось окрашивание гематоксилином.

Количественную оценку результатов исследования проводили с использованием системы компьютерного анализа микроскопических изображений, состоящей из светового микроскопа Olympus СХ-21, цифровой камеры Olympus Camedia 4040z, персонального компьютера с операционной системой «Windows 7» и программы Sigma Scan Pro 5.0 software (SPSS Inc.,

Chicago, IL, USA) согласно основным принципам стереологии в морфометрии.

При помощи светового микроскопа находились участки дермы без волосяных фолликулов, которые фотографировались при увеличении объектива 40х (Gunin AG et all, 2004; Gunin AG et all, 2005). Затем полученные снимки переносились на компьютер и при помощи программного обеспечения вычислялась площадь сфотографированных участков и подсчитывалось общее количество иммуннопозитивных клеток, а также фибробластов. Как минимум 10 случайно выбранных срезов фотографировались у каждого человека и 3-5 полей зрения были сфотографированы в каждом срезе.

В каждой группе рассчитывались средние арифметические величины (М) и их стандартные ошибки (ш). Достоверность влияния возраста или пола на исследуемые параметры кожи оценивалась с помощью однофакторного дисперсионного анализа. Взаимосвязи между возрастом и параметрами кожи оценивались с применением непараметрического рангового корреляционного анализа Спирмена. Корреляционный анализ выполнялся без разделения данных на возрастные группы. Достоверными считали отличия при р<0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Настоящее исследование показало, что численность фибробластов в дерме прогрессивно снижается с возрастом (рисунок 1). Возрастное уменьшение количества этих клеток, возможно, является наиболее существенным для появления признаков старения кожи. Фибробласты продуцируют все компоненты межклеточного вещества, включая коллагеновые и эластические волокна, аморфный компонент (Lorenz et al., 2008). Уменьшение численности фибробластов, скорее всего, приводит к нарушению обновления межклеточного вещества дермы. Хорошо известно, что именно изменения в состоянии межклеточного вещества дермы связаны с появлением признаков стареющей кожи. Уменьшение численности фибробластов в дерме, наблюдаемые в возрастном аспекте, также может

быть обусловлено снижением скорости обновления этой клеточной популяции или менее активным образованием новых фибробластов из малодифференцированных предшественников (Naru et al., 2009; Zouboulis et al., 2008). Кроме того, снижение численности фибробластов в дерме в процессе старения может быть вызвано активацией апоптоза (Kim, Park et al., 2009; Mammone et al., 2006). Были также описаны изменения в множестве других функциональных параметров фибробластов с возрастом (Fisher et al., 2008; Simpson et al., 2010; Varani et al., 2006).

л

S 5

I t »i I à 1

8000 -7000 SOOO -5000 4000 3000 2000 1000 О

ÎM

3 4 5 S 7 8 Возрастные грушш

[il Шт. r~f—I Iii! SÄ! ïîsfc

N 1 с- 1 • 1 ■ча< ; о J с: : ! X Ш .........

9 10

Рисунок 1 - Данные по численности фибробластов в дерме людей различного возраста (М±т). Разделение на возрастные группы указано в тексте, п - количество случаев. р<0,001 - однофакторный дисперсионный анализ.

В полном спектре возрастных периодов настоящее исследование показало уменьшение численности PCNA-положительных фибробластов в дерме (рисунок 2,3). PCNA является компонентом ДНК-полимеразы, которая необходима для синтеза и репарации ДНК Этот белок присутствует в клетках, находящихся в Gl, S, G2 и М-периодах клеточного цикла (Prives,

ОоШ&есЦ, 2008). Следовательно, РСЫА может рассматриваться в качестве маркера пролиферирующих клеток или клеток, находящихся в клеточном цикле, а не в ОО-периоде (Оишп е1 а1., 2005). Этот факт позволяет заключить, что одной из причин возрастного уменьшения численности фибробластов в дерме является снижение их пролиферативного потенциала.

8000

Возрастные группы

- PCNA-положительные клетки

- фибробласты

Рисунок 2 - Данные по численности фибробластов и PCNA-положительных клеток в дерме людей различного возраста (М±ш). р<0,001 -однофакторный дисперсионный анализ.

äS s

л г

s Я

j ¡e

| i

% 5-

ь <*

3 4

г:

О

40 30 20 -10

Й-*-'

Ш

ri-,

+1

1 23456789 10 Возрастные группы

Рисунок 3 - Данные о процентном отношении PCNA-положительных клеток к количеству фибробластов в дерме людей различного возраста (М±т). р<0,001 - однофакторный дисперсионный анализ.

Результаты настоящего исследования демонстрируют, что в дерме человека с 20 недель беременности и до 85 лет присутствуют тучные клетки, количество которых увеличивается с возрастом (рисунок 4,5). Была также обнаружена отрицательная корреляционная взаимосвязь между увеличением количества тучных клеток и уменьшением численности РСИА+ фибробластов. Следовательно, можно предположить, что уменьшение численности фибробластов и их пролиферативного ггула обусловлено деятельностью тучных клеток. Механизмы этих взаимоотношений не ясны. Можно предположить, что данный эффект обусловлен секреторными продуктами тучных клеток. Тучные клетки являются источником высокотоксичных веществ, которые способны оказывать влияние на синтез белков, необходимых для прохождения клеток по клеточному циклу, а также приводить к нарушению функций и к гибели фибробластов (ОПАНап е1 а1., 2011;Ыау1оге1а1„ 2011).

5 »

§

6

£

500 -| 450 -400 350 g 300 -250 -j

150 100 i SO J 0

;fc 2

Возрастные группы

9 10

Рисунок 4 — Данные по численности тучных клеток в дерме людей различного возраста (М±т). р<0,001 - однофакторный дисперсионный анализ.

25% п

50% -

1

s _

— &

s i.

з ""

3

15%

10% -

5%

0%

Возрастные группы

10

Рисунок 5 - Данные о процентном отношении тучных клеток к количеству фибробластов в дерме людей различного возраста (М±ш). р<0,001 - однофакторный дисперсионный анализ.

Наши результаты показали практически полное отсутствие эозинофилов в дерме здорового человека независимо от возраста. Другие исследователи также отметили, что в норме в дерме человека имеется очень незначительное количество эозинофилов (Steigleder, Inderwisch, 1975; Leiferman et al., 1989). Вместе с тем имеется множество заболеваний кожи, в патогенезе которых эозинофилам отводится немаловажная роль (Steigleder, Inderwisch, 1975). Эозинофилия в дерме также продемонстрирована после ультрафиолетового облучения (Leiferman et al., 1989).

Исследование показало, что в дерме человека, начиная с антенатального периода и до глубокой старости, выявляются CD45+ клетки. Их численность увеличивается с возрастом (рисунок 6,7).

Возможно, это явление обусловлено воспалительными процессами, происходящими в коже на протяжении жизни. Эти воспалительные процессы вызваны различными эндогенными и экзогенными факторами, такими как ультрафиолетовое облучение, изменения температуры и влажности окружающей среды, компонентами пищи, токсическими метаболитами, образующимися в ходе обмена веществ. Клетки эпидермиса, фибробласты дермы, клетки сосудов, вовлеченные в воспалительный процесс, продуцируют факторы, привлекающие в очаг воспаления лейкоциты, макрофаги, тучные клетки (Levakov et al., 2012; Wolf et al., 2012). Лейкоциты, макрофаги, находящиеся в воспалительном очаге, активируются и начинают вырабатывать множество биологически активных веществ, среди которых также имеются факторы, способствующие привлечению новых лейкоцитов и других клеток костномозгового происхождения (Hwang et al., 2011). В результате в дерме появляется много клеток костномозгового происхождения. С течением времени воспалительные процессы в дерме повторяются, что, возможно, и приводит к возрастному увеличению клеток костномозговой природы.

Наша работа выявила взаимосвязь между увеличением количества CD45+ клеток и снижением количества фибробластов в дерме с возрастом.

Исследование также обнаружило отрицательную корреляционную взаимосвязь между увеличением количества СБ45+ клеток и уменьшением численности РСЫА+ фибробластов. Следовательно, можно предположить, что уменьшение численности фибробластов и их пролиферативного потенциала обусловлено деятельностью клеток костномозговой природы. (Яукеп & а1„ 2009; Уиктажтс-^ю е! а1„ 2011).

1000 Т

и. о

| 300 -

Возрастные группы

Рисунок 6 — Данные по численности СВ45-положительных клеток в дерме людей различного возраста (М±т). р<0,001 - однофакторный дисперсионный анализ.

3 _

г -

я у

и 3-

2 <2

5 1 _

с

и

40% 35% 30% 25% 20% 15% 10% 5% 0%

Возрастные группы

Рисунок 7 - Данные о процентном отношении С045-положительных клеток к количеству фибробластов в дерме людей различного возраста (М±т). р<0,001 - однофакторный дисперсионный анализ.

Наши результаты показали, что фактор Виллебранда и С 031 выявляются в материале всех возрастных групп. Интенсивность окрашивания эндотелия на СВ31 не имела возрастных изменений, а степень окрашивания эндотелия на фактор Виллебранда несколько возрастала с прогрессированием возраста. Можно предположить, что существует возрастная регуляция синтеза и секреции фактора Виллебранда. Механизмы этой регуляционной системы к настоящему времени абсолютно не ясны. Подсчет количества сосудов в дерме показал, что численность сосудов, выявляемых как с помощью антител к фактору Виллебранда, так и с применением антител к СБ31, планомерно уменьшается с возрастом (Рисунок 8,9).

81

щ Ши Ali У " Г—! ■ц

шйя

§||§щ| riK »щ ¡и

щи «¡iiil1 111

«л ч ■efmi^KHoc»; 21-40 w! 6135 яе;

Рисунок 8 — Данные по численности кровеносных сосудов с положительной окраской эндотелия на антиген CD31 в дерме людей различного возраста (М±т). р<0,001 - однофакторный дисперсионный анализ.

I?

II

S§

i" ä

2(iK» недйЯЬ

ШШ

mm

.iXsfiS il-M ля

Рисунок 9 — Данные по численности кровеносных сосудов с положительной окраской эндотелия на фактор Виллебранда в дерме людей различного возраста (М±ш). р<0,001 - однофакторный дисперсионный анализ.

Максимальное количество сосудов содержится в дерме плодов человека, а минимальное - у людей в возрасте 61-85 лет. Следует отметить, что оба примененных метода дают практически одинаковые результаты по численности сосудов, что делает проведенную работу более достоверной.

В настоящее время известен эффект фактора Виллебранда по торможению ангиогенеза (Ьио е1 а1., 2012). Поэтому возможно, что возрастание уровня фактора Виллебранда способствует уменьшению интенсивности ангиогенеза в коже с возрастом. Кроме того, фактор Виллебранда поддерживает воспалительную реакцию, цитотоксические продукты которой оказывают негативное влияние на ангиогенез (НП^шЬег е1 а1., 2013). Однако детальные механизмы выявленных изменений требуют дальнейшего изучения.

Корреляционный анализ показал наличие тесной корреляционной положительной взаимосвязи между численностью фибробластов и количеством кровеносных сосудов дермы. Следовательно, одним из заключений, которые можно сделать на основании результатов этого анализа, является то, что возрастное ухудшение кровоснабжения дермы вносит весомый вклад в снижение общей численности фибробластов в дерме и пролиферативного пула этих клеток. Таким образом, настоящая работа показывает новый механизм, который приводит к возрастному уменьшению численности фибробластов в дерме. Возможно, что этот факт должен быть ключевым в клинических подходах к профилактике и терапии возрастных изменений кожи, так как без адекватного кровоснабжения невозможно добиться нормального регенераторного потенциала ткани.

В исследовании использованы кусочки кожи, полученные от плодов мужского и женского пола, мужчин и женщин. Было интересно проверить значение пола для возрастных изменений параметров дермы. Для этого был выполнен однофакторный дисперсионный анализ, где в качестве фактора использована половая принадлежность. Результаты этого анализа не выявили

достоверного (р<0,05) влияния пола на изменения и общего числа, и числа

РСЫА позитивных фибробластов в дерме.

ВЫВОДЫ

1. Численность С045-позитивных клеток в дерме человека увеличивается с течением жизни. Возрастное увеличение количества С045-позитивных клеток в дерме коррелирует как с уменьшением общей численности фибробластов, так и падением количества РСЫА-положительных фибробластов.

2. Число тучных клеток в дерме человека увеличивается с течением жизни. Возрастное увеличение числа тучных клеток в дерме коррелирует с уменьшением общей численности и количества пролиферирующих фибробластов.

3. В дерме кожи человека имеются единичные эозинофилы, содержание которых не имеет возрастных особенностей.

4. Численность кровеносных сосудов дермы уменьшается с увеличением возраста. Также изменяется их расположение в дерме, в молодом возрасте они равномерно распределены по всему объему дермы, начиная с 21 лет увеличивается количество сосудов под эпидермисом и уменьшаться по мере приближения к гиподерме. Уменьшение количества кровеносных сосудов коррелирует с уменьшением, как общего количества фибробластов, так и снижением их пролиферации.

5. Общая численность фибробластов в дерме человека прогрессивно снижается с возрастом. Количество РСЫА-позитивных фибробластов дермы, отражающих пролиферативную активность, также достоверно снижается в онтогенезе. Возрастное уменьшение количества фибробластов в дерме отчасти обусловлено снижением скорости их пролиферации.

Практические рекомендации

1. Полученные знания об уменьшении численности фибробластов и снижении их пролиферативной активности, использовать в клинических подходах к профилактике и терапии возрастных изменений кожи.

2. Учитывать полученные результаты настоящей работы об увеличении количества СБ45-положительных и тучных клеток, уменьшении уровня васкуляризации, а также данные о практически полном отсутствии эозинофилов в дерме здорового человека, при чтении лекций и проведении практических занятий на кафедрах гистологии медицинских и биологических факультетах Вузов.

Список работ, опубликованных по теме диссертации:

1. Васильева, О.В. Пролиферация фибробластов кожи в процессе физиологического старения / О.В. Васильева, В.В. Петров, Н.К. Корнилова, А.Г. Гунин // Клиническая и экспериментальная медицина. Сборник научных трудов. Чебоксары. - 2010. - С. 30-31

2. Gunin, A.G. Age-related changes in proliferation, the numbers of mast cells, eosinophils, and cd45-positive cells in human dermis / A.G. Gunin, N.K. Kornilova, O.V. Vasilieva, V.V. Petrov // J Gerontol A Biol Sei Med Sci.-2011. - Vol. 66. - № 4. - P. 385-392.

3. Гунин, А.Г. Возрастные изменения численности и пролиферации фибробластов в коже человека / А.Г. Гунин, Н.К. Корнилова, В.В. Петров, О.В. Васильева // Успехи геронтологии. - 2011. - Т. 24. - № 1. - С. 43-47

4. Петров, В.В. Тучные клетки, эозинофилы, СБ45-положительные клетки в коже человека при физиологическом старении / В.В. Петров, О.В. Васильева, Н.К. Корнилова, А.Г. Гунин // Морфология в теории и практике: сб. материалов и тезисов (к 90-летию со дня рождения Д.С.Гордон). — Чебоксары: Изд-во Чуваш, ун-та, 2012. — С. 248-250.

5. Петров, B.B. Влияние тучных клеток в дерме на процесс старения кожи человека / В.В. Петров, О.В. Васильева, А.Г. Гунин // Актуальные проблемы психологии и медицины в условиях модернизации образования и здравоохранения. Материалы международной научной конференции, - Чебоксары 15-16 ноября 2012. — С.205-208.

6. Петров, В.В. Возрастные изменения содержания CD4S+ клеток в дерме человека / В.В. Петров, О.В. Васильева, Н.К. Корнилова, А.Г. Гунин // Успехи геронтологии. - 2013. - Т. 3. - № 3. - С. 598-603.

7. Петров, В.В. Возрастные изменения числа тучных клеток и эозпнофилов в коже человека / В.В. Петров, О.В. Васильева, Н.К. Корнилова, А.Г. Гунин // Онтогенез. - 2013. - Т. 44. - № 3. - С. 179185.

8. Петров, В.В. Степень активности трансмембранного лиганда DLL4 н его взаимодействие с фибробластами в коже человека в процессе старения / В.В. Петров, О.В. Васильева, H.H. Голубцова, А.Г. Гунин // "Научная дискуссия: инновации в современном мире": материалы VIH международной заочной научно-практической конференции. Часть И. (15 января 2013 г.). Москва: Изд. «Международный центр науки и образования», 2013. — С. 182-185

9. Vasilieva, O.V. Age-related changes in the number of vessels positively stained with CD31 and vWF antigens in human dermis / O.V. Vasilieva, V.V. Petrov, N.N. Golubtzova, A.G. Gunin // The 8th European Congress of Biogerontology joint with the 2nd International RESOLVE Meeting, Beer Sheva-Dead Sea, Israel, March 10-13, 2013. -P. 89.

10.Гунин, А.Г. Кровеносные сосуды в дерме человека в процессе старения / А.Г. Гунин, В.В. Петров, О.В. Васильева, H.H. Голубцова // Успехи геронтологии. -2014. - Т. 27. -№ 1. - С, 54-61

11.Gunin, A.G. Age-related changes in angiogenesis in human dermis / A.G. Gunin, V.V. Petrov, N.N. Golubtzova, O.V. Vasilieva, N.K. Kornilova // Experimental Gerontology.-2014.-Vol. 55.-P. 143-151.

12. Голубцова, H.H. Возрастные изменения факторов ангиогенеза и пролиферации в коже человека / H.H. Голубцова, В.В. Петров, О.В. Васильева, А.Г. Гунин // Материалы научной конференции «Фундаментальные проблемы геронтологии и гериатрии» посвященный 20-летию со дня основания Геронтологического общества при Российской академии наук, 5-9 июня, г. Санкт-Петербург, Успехи геронтологии. 2014. - Т. 27. - №2. - С. 30

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

CD - Cluster of Differentiation, кластер дифференцировки PCNA — proliferating cell nuclear antigen, ядерный антиген пролиферирующих клеток

MBP — Major Basic Protein, главный основной (щелочной) белок VWF —von Willebrand factor, фактор Виллебранда

Подписано в печать 16.02.2015. Формат 60x84 1/16. Бумага офсетная. Печать оперативная. Усл. печ. л. 1,0. Тираж 100 экз. Заказ № 143.

Типография Чувашского госуниверситета. 428015, Чебоксары, Московский проспект, 15