Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Основные хромосомные белки и структура суперкомпактного хроматина сперматозоидов

ВАК РФ 03.00.25, Гистология, цитология, клеточная биология

Автореферат диссертации по теме "Основные хромосомные белки и структура суперкомпактного хроматина сперматозоидов"

тг . и З./З

, О -

ИНСТИТУТ ЦИТОЛОГИИ РОССИЙСКОЙ АКАДЕМИИ НАУК -:-1

На правах рукописи УДК 547.963.3:576.312.3

БЕЛ О КОПЫТОВА Ирина Анатольевна

ОСНОВНЫЕ ХРОМОСОМНЫЕ БЕЛКИ И СТРУКТУРА СУПЕРКОМПАКТНОГО ХРОМАТИНА СПЕРМАТОЗОИДОВ

Специальность: 03.00.25 — Клеточная биология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

САНКТ-ПЕТЕРБУРГ 1992

Работа выполнена в лаборатории биохимических основ репродукции клеток Института цитологии Российской академии наук.

Научные руководители: доктор биологических наук, профессор В. И. Воробьев; кандидат биологических наук И. А. Заленская.

Официальные оппоненты: доктор медицинских наук, профессор В. С. Гайцхоки; доктор биологических наук С. Н. Борхсениус.

Ведущее учреждение — Биолого-почвенный факультет Санкт-Петербургского государственного университета.

на заседании Специализированного совета Д.002.73.01 при Институте цитологии РАН по адресу: 194064, С.-Петербург. Тихорецкий пр., 4.

С диссертацией можно' ознакомиться в библиотеке Института цитологии РАН.

Защита состоится « /3

1992 г. в

часов

Автореферат разослан

1992 года.

Ученый секретарь Специализированного совета, доктор биологических наук

Л. Н. Писарева

© Институт цитологии РАН, 1992

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность GRSB.'ClSJHfe! • При ' ПОЛОВОМ раЗМНОЖвНИИ рЯЗВИТШ

ясного организма начинается о оплодотворения, т.е. слияния лукскоя и женской гамэт. Одной из интереснейших проблем биологии является вопрос о "долях участия" мужской и ганской гамет в эазвитии нового организма.

До последнего времени большинство исследователей считало, тго основные функции в регуляции эмбрионального развития зыполняются яйцеклеткой, тогда как задача спермия состоит в том, ?тойы обеспечить сохранность второго гаплоидного генома и Поставить его в яйцеклетку (Poccia, i78&>. Однако результаты экспериментов по пересадке ядер у мышея, полученные независимо в разных лабораториях, позволили изменить устоявшиеся представления о Функциональном неравенстве гэмет. Было установлено, что эба^генома играют важные и взаимодополняющие роли в развитии зародыша (Surani et ai.F 19ав), Проведенные на мышах генетические исследования с использованием теста на комплементацию показали, что у некоторых хромосом Функционирующей является либо только отцовская, либо только материнская хроматида. tsciter, 1787; Hewlett, 1990). Предполагается, что обнаруженная функциональная разница между гомологичными аллелями является результатом имеющей место в сперматогенезе и оогенезе гамет-специФическои модификации определенных участков хроматина -геномного импринтинга (Surani, 1991).

Яйцеклетка, сохраняющая к моменту ' оплодотворения как вуклвосомную структуру хроматина, так и большой объем цитоплазмы, имеет многообразные возможности • для хранения эпигенетической информации (Chandley, 19(ЗА; Иаввагшлп, 19В7). Иначе ОбСТОИТ ДвЛО с мужскими гаметами. Известно, что в процессе сперматогенеза почти у всех организмов происходит кардинальная реорганизация ядра, связанная с полной или частичной заменой гистонов протаминами или спермийспециФичэскими , белками и компакгизациея

хроматина (Dixon and Oliva, 1791). БОЛЬШИНСТВО ИССЛеД0ВаТвЛ9Й

считает, что упаковка ДНК в процессе сперматогенеза должна приводить к полному стиранию всей эпигенетической информации

(Poccia, 1786; Rialey, 1980).

В связи с этим интересным представляется выяснить, каким образом в суперкомпактном хроматине сперматозоидов может- осушрст-

вляться хранение эпигенетической информации, иначе говоря, что в хроматине сперматозоидов может служить молекулярной основой геномного импринтинга.

Ц ели и задачи исследования. В КаЧвСТВв ОбЪвКТа ИССЛОДОВаНИЯ

был выбран суперкомпактный хроматин млекопитающих и моллюсков, содержащий в качестве основного белкового компонента протамины (млекопитающие) или спермий-специФические белки (моллюски). Цель работы состояла в том, чтобы выявить в хроматине такого типа структурные неоднородности, которые могли бы нести эпигенетическую информацию.

Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:

1.Изучить структуру хроматина сдармдав мидии Грзя <кл.Двустворчатые моллюски), содержащего 80* высокоосновных сдармий-специфических белков и 20"/. гистонов.

2.Выявить наличие корреляций между изменением ДНК-свЯзы-вающих свойств и относительного содержания протаминов в.хроматине сперматозоидов человека и нарушениями Фертильности.

3.Разработать метод выделения ядерных экстрактов из сперматозоидов млекопитающих и провести анализ полученных экстрактов с далью выявления транс-регуляторных белков.

Научная ноаизна раВоты. РабОТЭ СОДОрЖИГ НОВЬЮ ДЭННЫв, СВИДЗ-

тельствующие о том, что субклассы спермии-специфических белков различаются по Функциям в структурной организации хроматина сперматозоида.

Обнаружена корреляция между снижением относительного содержания протамина Р2 в хроматине сперматозоидов человека, уменьшением его эффинности к ДНК и нарушениями Фертильности.

Показано, что в суперкомпактом хроматине, основным белковым компонентом которого являются-' сдармии-сдацифичаские белки, небольшие участки сохраняют периодическую нуклеосомную структуру..

Впервые в ядерных экстрактах из зрелых , сперматозоидов млекопитающих■были выявлены белки, специфически взаимодействующие с октамеряой последовательностью лтаслллт. Сделано предположение о том, что обнаруженные белки представляют собой идентифицированные ранее октамар-саязывающие белки асъ-1, ась-г и 0с1-з/4.

Подученные данные о различиях в свойствах субклассов протаминов и сшрмии-специфичаских белков, а также о существовании в сушркомпаюном хроматине сперматозоидов транс-регуляторных

Факторов и "мозаики" из коротких нуклеосомных блоков позволяют сделать вывод о том, что в ядро сперматозоида имеются • разнообразные сложно организованные ДНК-белковые комплексы, способные нести эпигенетическую информацию.

Практическая ценность работы заКЛЮЧаеТСЯ В ТОМ, ЧТО

выявленная зависимость между нарушениями Фертильности у человека и изменением относительного содержания протамина Р2 в обшрм основном белке сперматозоидов представляет потенциальную возможность для создания простого и надежного метода диагностики. Алсовация равоты. Материалы диссертации докладьшались на

Annual Symposium on Cell Biology (Boston, 1791), НЭ 7l>1 European Testis Workshop (Elmau, 1992), а ТЭГОКе НбОДНОКрЭТНО НЭ СеМИНЭрЭХ

в Институте цитожти.

публикации. По теме диссертации опубликовано 4 работы. os-ьем работы. Диссертация изложена на 90 стр. машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, результатов собственных исследований, обсуждения, выводов и списка литературы, содержащего 175 публикаций. Диссертация иллюстрирована 15 рисунками и 1 - таблицей.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ В работе были использованы зрелые сперматозоиды, содержащие в качество основного белкового компонента хроматина протамины (млекопитающие - Homo sapiens, Bos taurus) и спермиасгоциФические белки (МОЛЛЮСК Crenomytilus grayanus, КЛ.В1 val vi а) .

Выделение ядер из сперматозоидов ПРОВОДИЛИ, ИНКубИруЯ очищенные ГОЛОВКИ (Maruchige et alt, 19В7) 40 МИН При 4°В буфере, содержащем Г/. Тритона Х-100.

Выделение основных Селков из ядед сперматозоидов ' ПРОВОДИЛИ,

добавляя Hei до 0,25 N. Белки из экстракта осаждали ацетоном, собирали центрифугированием и высушивали под вакуумом.

Выделение белковых экстрактов из ядер сперматозоидов МЛВКО-

питающих проводили ПО методу Шраибера (Schreiber et al., 1909) С модификациями. Выделенные ядра суспендировали в буфере, содержащем 20 мМ Трис-нс1 pH 7,9, 2 мМ ЭДТА, 20 мМ дитиотройтол (ДТТ), 1 мМ ФенилметилсульФонил Фторид, 400 мМ Nací. Экстракцию проводили в течение ночи, после чего суспензию центрифугировали 20 мин при 14000 об/мин. Полученный ядерный экстракт хранили при -70°С.

РСваДотка спермиев 1У. петилтриметилатчония бромидом 1СТЛВ> .

Осадок спермиев промывали 10 мМ Трис-нс1 рн 8,0 и инкубировали 1 чао при 37°С в 8 М мочевине - 10 мМ ДТТ. Белки отделяли от ДНК добавлением катионного детергента СТАВ до lv..

Обработка ядер микрококковой нуклеазой. ЯЛра ИНКубИрОВа^И ОТ 10 ДО'60 МИН при 37°С С микрококковой Нуклеазои (Boeringer, 40 ад/мг ДНЮ■ Посла окончания инкубации пробы центрифугировали, осадок лизировали в б мМ Трис-нсп рЫ 7,5-10 мМ ЭДТА и затем осаждали центрифугированием, получая супэрнатант, содержащий растворимые Фрагменты хроматина.

Солевое- Фракционирований ^роматина. ОсаДОК, ПОЛУЧвННЫЙ П0СЛ8

отделения растворимых Фрагментов хроматина, суспендировали в ЮмМ Трис-нсг рн 7,5, содержащем 0,6 М Naci или 0,2 М cada. Инкубацию проводили 20 мин при 4°С. Пробы осаждали 15 мин при 5000 об/мин. Быдаленив ¿нк проводили по Маниатасу (Маниатис.и др., 1887).

ЭлектооФор^тический диализ ДНК ПрОБОДШШ В ГОрИЗОНТЭЛЬНОМ

блоке 2•/. агарозного геля в 40 мМ 1рис-ацетатном буфере, рН 7,,7, содержащем 2 мМ ЭДТА.

Опаеда/чение соотношения суОФракци^ роотьминоа,. СОДЭрЖЗНШ

протаминов в каждой пробе оправляли сканированием протаминовой Области канщого геля на денситометре ELSCRIPT 3 (Hirschmann-Geratebau). Содержание белка (комплекса Амидовьш черный - белою определяли по площадям соответствующих пиков на анализаторе изображений Magiscan 2ar с использованием оригинальной версии

Gold Fitting Program (SBTOp С.СТЭХОВ, НвОПубЛИКОВЗНО).

Приготовление зонлэ. ХИМИЧ9СКИ СИНТвЗИрОВаННЫЙ (Gene Assembler) ОЛИГОНУКЛбОТВД (22 П.О.) Ш8ЮЩИИ В ЦЗНТр9 ОКГаМврНЫЯ

сайт атвсааат, метили, используя в качестве метки с^-агРзА1Р, в реакции переноса г-фосфата AIP на 5' -ОН конец ДНК и отжигали о двукратным избытком комплиментарной цепи.

Специфическое связыиаииа вьагментоэ ДНК'. £ ядарными белками

проводили по методу Шефнера iBcbaffnar et ai., хчкв).

Орлкая проводили, используя метод ультрафиолетовых ДНК-белковых сшивок (Jost and s*iuz, i4<»ti, с последующим анализом белковой СВвСИ В 10* ПААГ ПО метод» Лэмли <Laemmly, 1<?70> . - V ^giiPHTPBtoRea аШйсйьщшааа комплексов проводили в вертикальных блоках 4* полиакриламидаого геля «соотношение акриланиц: бис-

акриламид - 29:1' в 10 мМ Трис-боратном буфере рН 8,3, содержащем 1 кМ ЭДТА.

При статистической оСраОотке полученных данных ВЫЧИСЛЯЛИ

стандартную ошибку т и доверительный интервал 1р по Формуле: 1р'=тх4р, где tp - критерия Стьюдента при р<0,05 (Кравцова, 1976).

РЕЗУЛЬТАТЫ

1. Изучение структуры хроматина стармиев мидии Грэя.

При обработке ядер спермиев мидии Грзя микрококковоя нуклеазой выход хроматина в лизирующия буфер составил около з%. Для сравнения, при такой же обработке ядер спермиев морского ежа во Фракцию растворимых Фрагментов переходит около 80% хроматина.

ЭлектроФоротическия. анализ ДНК, выделенной из Фракции растворимых Фрагментов, показал, что в раствор переходят дискретные частицы, соответствующие по подвижности мононуклэосо-ке, дануклэосома, тринуклеосомо и т.д. (Рис.1). ЭлвктроФорвтичес-кий анализ в уксусно-мочевинной системе белков из Фракции растворимых Фрагментов показал присутствие только коровых гистонов (Рис.2). Нуклеосомныя повтор в этих областях составил'204 п.о., а размер нуклеосомных Фрагментов не превышал 5 нуклеосом.

ЕГЖ5ГЗ

ГЯГ=ЯЯ В

¿4! I- -И

!1" 1

Я'»']

Я

:; ) ■ 1

-I

Д

ЦГ-З М

екя ср

б

а

в

г

ПЯЛУЛЯШ

Рис.1.(схема) Электрофорез фрягментов ДНК, полученных а результате обработки -чдор спермиев мидии Грэя микрококковой

а. - фракция растворимых фрагментов хромлтина; 0 — осадок

юсл*' удаления растворимых Фрагментов; э - дополнительный выход »лстроримых Фрагментов поело обработки хроматина О.8 М МаС1} г -гополнительный выход растворимых фрагментов • после оОраОотки :роматинэ О. 3 М СаС1 ?; СР - коровая частица; М - мононуклеосома.

Низкий выход растворимых Фрагментов- мог объясняться либо малой доступностью ДНИ для действия нуклеазы, либо стерическими препятствиями для высвобождения Фрагментированной ДНК. Как видно на рис.1, электрофореграмма ДНК, выделенной из осадка хроматина, оставшегося посла отделения растворимых Фрагментов, выглядит смазанной и не содержит дискретных полос. Однако размер минимальных Фрагментов ДНК соответствует ДНК коровой частииу. Это свидетельствовало о том, что ДНК доступна нуклеазе, однако выход ее Фрагментов затруднен, очевидно из-за взаимодействия с балками.

Солевое Фракционирование хроматина. БЫЛИ ПОДОбрЭНЫ УСЛОВИЯ

для частичной диссоциации белков хроматина спермиев мидии Грзя> обработка осадка, оставшегося после отделения растворимых Фрагментов хроматина, 10 мМ Трис-ны рН'7,5, содержащим 0,6 М Nací ИЛИ 0,2 М CaCl2.

а 0 в где + i

- - - - - Hlsp гистоны

ркчя - ШЯЛ - S2

--- — .— - SI

Рис. 2. (схима) Электрофорез" основных Селков хроматина спермиеа мидии Грэя в системе уксусная кислота-мочевина.

а - Белки из Фракции растворимых Фрагментов» о - дополни-, тельный выход Селков при обработке хроматина О. В М NaCl; в - осадок после NaCl -оБраОотки; г - дополнительный выход Белков при оОраБотке хроматина 0.2 М CaCl 2) д - осадок после CaCl2-о0раВотки| ■ - оОщнй Овлок.

При обработке осадка буфером, содержащим 0,6 М Nací, из хроматина частично удалялся 0елок si (Рис.2). При зтом проиоходало дополнительное высвобождение растворимых Фрагментов хроматина «до зх от всего хроматина». ЭлектроФоретическия анализ показал, что шсвобсзджоу.зся Фрагменты невелики по размеру и соответствуют коровой часг»а» и мононуклеосоме, выход даукдэоссм

очень мал <Рис.1). Ядро при подобной обработке сохраняло своп

Структуру. ПО-ВИДИМОМУ, гГелок S1 может свл}ыватк линкерные участки увух ¿лиуко расположенных нуклеосом или находиться в области соеуинения ну клеосомного сГлока с не имекзил1м периодической структуры участком хроматина.

При обработке осадка буфером, содержащим 0,2 М caci», из хроматина полностью удалялся белок si, частично белок 32 и гистон Hlsp <Рис.2>. Дополнительный выход растворимых Фрагментов составил около юг. от всего хроматина.

ЭлектроФоретический анализ ДНК показал, что дополнительное (по сравнению с обработкой 0,6 М Nacn снятие белков - и и Hisp - приводит к высвобождению гетерогенного набора Фрагментов, соответствующих по подвижности коровой частице, мононуклеосоме, дянуклеосоме и т.д. (Рис.1). При этом происходила необратимая декондонсация ядер и разворачивание ' хроматина. Можно

ПреДПОЛОЖИТЬ, ЧТО S2-t/елок выполняет, в хроматине спермиев ту ж» функцию. . что и протамины» т.е. связывается с участками ДНК. которые расположены межуу нуклеосожыми блоками, и формирует высокснасышэнный. ДНК -протаминовыД комплекс.

Результаты двумерного электрофореза растворимых . Фрагментов хроматина показали, что Фрагменты, дополнительно высвобождающиеся после кальциевой обработки хроматина, не содержат гистона Hlsp.

ПО-ВИДИМОМУ, гистон Hlsp может принимать участие <5 формировании структур высшего порхука.

При дополнительных обработках осадка микрококковой нуклвазой и солями выход растворимых Фрагментов был, как правило, незначительным и не превышал 17.. Суммарный выход Фрагментированного хроматина составляет, таким образом, около 15у..

ЭлектроФоретический анализ показал, что в осадке", полученном после кальциевой обработки и содержащем разрушенные ядра, остаются длинные оЮООп.о.> Фрагменты ДНК (Рис._1>, Бй-белок и небольшое количество гистонов: зквимолярные количества коровых гистонов и гистон Hlsp (Рис.2>. Это подтверждает предположение

(Tsanev et al., 1787) О ТОМ, ЧТО в суперкомпактном хроматин» znepMamojouyoü могут суи&ствовать особые нуклеосомич устойчивые к чуклеауным odработкам.

2. СуВФракционный состав протаминов в сперматозоидах человека в норме и пей нарушениях »ертильноети.

Из существующих морфологических -данных следует, что в ряде случаев нефертильность сопровождается изменениями в размерах и структуре ядер сперматозоидов txatz et ai., 19в<ь». . Ядра аномальных клеток имеют большие размеры и сферическую Форму (Lalonde et al., 19ВВ). ПО ДЭННЫМ ЗДеКТрОННОЙ МИКрОСКОПИИ, хроматин таких сперматозоидов имеет меньшую плотность (Baiiachey

et al., 1987; Chandley, 1907) . Мы ПРЕДПОЛОЖИЛИ, ЧТО СраВНИТвЛЬНЫЙ анализ субФракдионного состава протаминов в нормальных и аномальных сперматозоидах позволит выявить возможные различия в ДНК-связывающих свойствах двух классов протаминов.

Выделанные ядра сперматозоидов 'обрабатывали <1> 0.25 n hci , что позволяло полностью экстрагировать протамины из хроматина

(Eusse et al., 198Ы И (2) рЭСТВОрОМ 1'/. СТАВ, ПрИ'.ЗТОМ СПОСОбе обработки протамины отделялись ОТ ДНК ке ПОЛНОСТЬЮ (Belokopytova

et al., 1992).

Таблица 1. Относительное содержание протаминов НР1 . НР2 и НРЭ в хроматине сперматозоидов -человека в норме и при Бесплодии.

ОБРАБОТКА НС1 • ОБРАБОТКА СТАВ

ПРОТАМИНЫ ---

а б а б

норма бесплодие норма бесплодие

Р1 50-1. S 60-1. S 65-1. S 58-1, , S

Р2 37-1. 0 28-1, . 0 22-1, . è 29-1 . s .

РЗ 13*1. 0 12-1. 0 ' 13-1. о 13±1. 0

Примечания;

Число исследованных образцов i л .— N=50i 6 - М*£0, Во вс«х случаях Р<0.OS

ЭлоктроФорез полученных белковых экстрактов проводили в' системе, содержащей уксусную КИСЛОТУ И мочевину (Panyim and ch«ikley, 1969j. При этом протамины чолоЬока разделялись на три электроФоротически различимые подоракции« протамин НР1 и две субФракции протамиыа Р2 (НР2 и НРЗ>. Результаты анализа денсигограмм здоктроФореграмм белковых экстрактов приведены в Табл.1. . v Сравнение денситограмм, полученных при .обработке разными способами двух аликвот Фвртильных сперматозоидов (Рис.3>,

показывает, что содержание протаминов НР1 и НРЗ в экстрактах не изменяется, тогда как содержание протэмина НР2 в солянокислом экстракте значительно выше, чем -в экстракте, полученном при обработке ядер 1 у. СТАВ. Этот результат свидетельствует о том, что в норме обработка ядер 1'/. СТАВ позволяет отделить от ДНК протамины НР1 и НРЗ полностью, а протамин Н?2 - частично.

Полученные Данные ПОЗВОЛЯЮТ ПрвДПОЛОЖИТЬ, ЧТО & нормв проталин НР2 oc/Ua^aem. ¿ольиим с роусгъбом к ДНК. и.ем прояюмин НР1.

Сравнительный анализ результатов, полученных при обработке 0.25N нс1 и 1"/. СТАВ неФертильных сперматозоидов, показывает, что относительное содержание субклассов протаминов НР1, НР2 и НРЗ в разных экстрактах достоверно не различается. Этот результат свидетельствует о том, что при нарушениях Фвртильности обработка ix СТАВ позволяет полностью отделить от ДНК как протамин НР1, так и протамины НР2 и НРЗ. Полученные данные позволяют предположить,

ЧТО при наруи&нихх ферпшАьносгтш. у прогтихминоб КР2 и НРЗ снижаете А аффинность ДНК.

Рис. 3. Денситограммы

электрофореграмм протаминов человека, экстрагированных разными способами из двух аликэот фер-тильных И НеферТИЛЬНЫХ

сперматозоидов. А - обработка О.23 N НС1| В -обработка IX СТАВ.

Сравнительный анализ относительного содержания субфракц»« протаминов в солянокислом экстракте из нормальных и нооортильных сперматозоидов свидетельствуат о тем, ЧТО при нарушениях аертил-ноепш иумх?нх*?п1сл coofnnouMHU» с^Kf¡fpcttfu.ua npomojUiHoAt увеличивается

- Ю -

относительное содержание протамина НР1 и/или уменьшается относительное содержание цротамина НР2 в общем основном белко спермиев.

Уменьпешю сродства протамина НР2 к ДНК может быть связано с изменениями в первичной структуре белка, при этом трансляционный продукт может утрачивать некоторые важные регуляторные мотивы, а также терять основные аминокислоты и накапливать нейтральные

(Bunick ct al., 1990).

Крскэ этого, уменьшение сродства протамина НР2 к ДНК может' быть результатом нарушении на посттрансляцконном уровне. Известно, что протамины класса Р2 синтезируются в виде предшественника и нуждаются в процессинг© (McKay et al-, 1986; Yelick et al., 19В7>. Нарушения на уровне процэссинга могут давать белок с измененной длинои и м-концевыми аминокислотами и, как следствие этого, с измененной стабильностью и способностью связываться с ДНК

(Ganda et al., 1989).

Измененный протамин НР2 в процессе сперматогенеза может вытесняться ч ДНК протамином НР1, имеющим большую, аФокшость к ДНК. Наблюдаемое изменение соотношения субФрзкций протаминов при нарушениях Фортильности может являться следствием вытеснения протамином НР1 измененного протамина НР2.

На основании полученных результатов и литературных данных можно сделать заключение ó том, что при частичном вытеснении протамином НР1 измененного протамина НР2 нарушается нормальное течение компактизэцш хроматина в .процессе сперматогенеза. Можно цредположигь, что для завершения процесса компактизации и' обеспечения нормальной Фертильности протамин НР2 должен связаться с ДНК (возможно, с определенными последовательностями) в строго определенных соотношениях.

Полученные результаты могут свидетельствовать о том, что два класса протаминов <Р1 и Р2> связываются с ДНК не одинаковым образом и, возможно, выполняют в хроматине сперматозоидов различные биологические Функции.

3. Выявление транскрипционных Факторов в ядерном экстракте из эрелшх сперматоэоидор быка.

Разработанный нами метод выделения ядерных экстрактов из сперматозоидов млекопитающих позволял получить экстракты с достаточно высокой концентрацией белка (2-5 мкг/мкл), при этом не происходило загрязнения экстракта протакинами.

Ядерные экстракты из зрелых сперматозоидов тестировали на наличие в них специфических ДНК-связывающих белков, используя н качестве зонда меченую октамерную последовательность atgcaaat.

Выбор зонда объяснялся тем, .что октамерная последовательность atgcaaat, идентифицированная в качестве Функционального элемента целого ряда гонов, является сайтом связывания для группы

белков (Oct-l, Oct-6/SCIP, 0ct-2A, 0ct-2B, miniOct—2, Oct-3/4) ,

принадлежащих к классу pou-доменных белков (Зслмвг, 19911. Предполагается, что рои-доменные белки могут играть ключевую роль в регуляции эмбрионального развития (Rosen-feld, 1991; Staudt et

al., 1991).

При введении в инкубационную смесь ядерного экстракта было выявлено несколько ДНК-белковых комплексов (Рис.4). Обнаруженные зоны комплексов имели определен.гул экспериментально воспроизводимую эдектроФоретическую подвижность по отношению к свободному Фрагменту ДНК <Rf>.

О.З ÍOct-lJ —

0.4 {Oct—2} — 0.5 {Oct—3/4}—

FF —

ттш

¡¡■пита яи&аа

Г-ИИВИ

вййза

р' Г"**''' Uii .I г. <я

o P г

Рис.4. (схема) Ретардация (ядернып экстракт из сперматозоидов Выка).

а - в отсутствии конкурента; б - 1000-крдтный изОыток . конкурента; в - 10-хратнып избыток специфического конкурента? г -в присутствии днтител против Оелкд Oct—i. По вертикали указаны Rf специфических ДНЬС-Селхсвых комплексов, в схоСках — соответствующие окт&мер-связывающие Оелки. FF — свободный фрагмент.

Специфичность, с0рлзуюц,ич'ся ЛНК7Релковы^ комплексов ПрОЬОрЯ-

лась в экспериментах по конкурентному связыванию.

<1>При дсбааяен:^ к реакционное смеси ЮСО-кратного избытка несшцидаоскоа конкурентной ДНК (ДНК Фага х иди poiума> / poiy(dT>) ко исчезали три ДНК-селковых комплекса« мажсрпиа ?;амп~

леке с Rf=0.3 и два минорных комплекса с Rf=0,5 и 0,6 (Рис.4).

(2)При добавлении к реакционной смеси 10-кратного избытка специфической конкурентной ДНК (немеченый октануклеотидный Фрагмент) на радиоазтограмме исчезали комплексы с rf=0,3; 0,5 и 0,6 (Рис.4).

В результате проведенного исследования можно сделать заключение о том, что в ядерных экстрактах из сперматозоидов быка присутствует три 'болка, которые специфически свяываются с-регуляторной октакернои последовательностью.

Сравнительный анализ злектроФоретической подвижности специфических комплексов, образуемых ядерным экстрактом из сперматозоидов и ядерным экстрактом из клеток HeLa (содержит универсальный октамер-связывающий белок oct-n, показал, что мажорный комплекс совпадает по подвижности с комплексом ДНК-oct-i из клеток HeLa. Это дает основания предполагать, что один из трех октамер-связывэюших белков, выявленных нами в ядерном экстракте из сперматотидов, представляет собой белок oct-i.

(3> При проведении предварительной инкубации ядерного экстракта с антителами против белка oct-l (были любезно предоставлены Н.В.Томилиным) на радиоавтограмме полностью исчезал мажорный ксмплокс с Rf,=o,з, интенсивность комплексов с Rf=0,5 и 0,6 при этом такие была значительно снижена (Рис.4). Подавление образования мажорного комплекса антителами против белка oct-i также говорит в пользу того, что обнаруженный нами транс-действующий Фактор представляет собой белок oct-i. Наличие ■ перекрестной реакции с двумя другими белками свидетельствует о том, что 0.5- и 0.6-комплэксы образованы белками, принадлежащими к семейству гои-докенных регуляторных белков сг.к. для получения антител использовался рои-домен-содрркащии фрагмент белка oct-n .

ОпределениЕ? молекулярнсп пассы специфических ДНК-связывающих

селков. Разделение реакционной смесИ» ос5лученной после окончания ДНК-связывания ультрафиолетовым свотом, в 10"/. ПААГ в присутствии sds с последующей окраской Кумасси голубым (для идентификации зон маркера молекулярных масс) и экспонированном позволило выявить три ДНК-белковых комплекса (Рис.5). Молекулярные узйсы этих комплексов составили 110 кД, 85 кД и 55 кД. С учетом того, что олиго-нуклеотид, состопдля из 22 п.о., искажает молекулярный шс белка примерно на 15-20 кД (Jo*t and s.-ii!". i99i), молекулярные массы

октамер-связываклцих белков, присутствующих в ядерном экстракте из сперматозоидов, составили "95, 70 и 40 кД. Эти величины близки к молекулярным массам октамер-связываицих белков ос!-1 (90 кД>,

1991).

Рис. 3. (схема). Электрофорез ДНК-ВалкоБЫч комплексов в 10Х ПААГ в присутствии 503.

(а)мархер молекулярных масс (окраска Кумасси голубым); (в)специфические Велок-октамерные комплексы в ядерном экстракта иэ сперматозоидов Оыка ' (в скобках указаны приблизительные мол. массы комплексов).

1аким odpayoii, полученные ¡анние nojtoAkum предположить, что <5 с¡¡перколпахтном хроматине cnepjxmoyoufoë лилкопитаюимх присущ- . cmâyHm три октамер-с&лцгёаюиих &влкси Oct—lf Oct-2 и Oet-3/4.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Результаты проведанных исследования свидетельствуют' о том, что супвркомпактньш хроматин сперматозоидов представляет собой сложно организованную структуру имеющую иногообразныз возможности для хранения эпигенетической информации.

Имеющиеся в литературе данные о существовании нуклэосом в суперкомпактном хроматине сперматозоидов (Ousse and Chevallier, 19B0S ftvranova et al. , 1984) 1! рЗЗуЛЬТаТЫ, ПОЛуЧвННЫе НЭМИ При

обработке микрококковоа нуклзазоа ядер сперматозоидов (одии Грэя, позволяют сделать вывод о .том, что в плотно упакованном хроматина, содэркгг;еп спзрмкйспзциФичесютэ болш или протамины, НСбОЛЬШИЭ участки ДНК сохраняют нуклзосонную структуру.

Можно предположить, что присутствие в оушркомпактном хроматине нуклеосомных блоков , а тати® характер га рэ определения в ядре сперматозоида может поста важную регуляторную информацию.

Обнаруженное повышенное сродство протаиина Р2 к ДНК, а также существований и молэкулэ этого бэлна мотива ерхх и потенциальной возможности образовывать структуры типа "цинковых пзльозв" (Hscht, i97o>, зарактерныа для ДНК-связызоющих регуляторных бел-

Oct-2 (65 кД> и Oct—3/4 (35 кД) (Schaier,

I

94 kD — + СЯ2В1 — {110 kD>

кто» — ÎB3 kD} — <53 kD}

67 kD — ЕЯЕЖЯ SSfitei

43 kD — 30 kD —

a в

ков, может приводить к возникновению структурных различий между Р1- и Р2-связанными участками хроматина сперматозоидов. Следствием этого может быть разница в темпах декондонсации Р1- и Р2- связанных участков хроматина при реорганизации мужского пронуклеуса и, в результате, возникновение различия в расположении нуклеосом и регуляторных белков в разных участках отцовского хроматина.

Полученные результаты позволяют также предположить, что субклассы спермии-специФичесюл белков различаются по их Функциям' в упаковке ДНК. Так, в исследованном нами хроматине сперматозоидов мидии Грэя белок 32, по-видимому, упаковывает ДНК подобно протамину Р1, образуя ДНК-белковые структуры длиной более . 1000 п.о., низкомолекулярныи белок взаимодействует с ДНК в области соединения нуклеосомных блоков и ДНК-Б2 участков, а гистон Н1вР Формирует петельные структуры.•

Можно предположить, что при деконденсации мужского пронукле-уса с подобным типом структуры хроматина участки ДНК, связанные с различными слермий-сшциФическими белками, будут деконденсиро-ваться различным образом, что, как уже было сказано, может привести к возникновению различий в расположении нуклеосом и регуляторных белков в связанных с разными в-белками участках хроматина.

Полученные рэзулвтаты дают основания предполагать, что некоторая часть транскрипционных Факторов, регулирующих экспрессию генов в раннем развитии млекопитающих может иметь отцовское происхождение, т.е. связываться с ДНК в процессе сперматогенеза и/ или не вытесняться при смене гистонов протаминами (или промежу-" точными белками). Активация или инактивация этих транс-регулятор-ных Факторов на ранних этапах эмбрионального развития может приводить к координированной активации или репрессии целых ансамблей генов.

Кроме того, данные о возможном участии октамер-связывающих белков В регуляции репликации СУпггигег еЪ а! . , 1990) ПОЗВОЛЯЮТ предположить, что гамет-специфическое распределение этих Факторов в хроматине сперматозоида и ооцита может приводить к различиям в порядке репликации аллельных генов и таким образом регулировать уровень их экспрессии.

Присутствие в суперкомпактном хроматине нескольких субклэс-сов основных хромосомных белков, различающихся по ДНК-связывающим свойствам и выполняемым Функциям, а также наличие транскрип-

- is -

ционлых Факторов и "мозаики" из коротких нуклеосомных блоков свидетельствует о том, что ядро сперматозоида представляет собой сложную структуру, способную нести значительный объем эпигенетической информации.

вывода

1. Установлено, что около 15'/. хроматина спермиев мидии Грэя • имеет нуклеосомную структуру. Короткие нуклеосомные участки <до 5 нуклеосом с нуклеоссмным повтором 204 п.о.) перемежаются с, участками ДНК, не имеющими периодической структуры и находящимися в комплексе с s-белками. Спермин-специФические белки <si, S2 и nisp> различаются по Функциям в упаковке ДНК сперматозоида. .

2. В норме два субкласса протаминов человека отличаются по сродству к ДНК! протамины субкласса Р2 - НР2 и НРЗ - имеют большее сродство к ДНК, чем протамин НР1.

3. При некоторых Формах нарушении Фертильности изменяется относительное содержание субфракций протаминов в общем основном белке и снижается сродство протамина НР2 к ДНК.

4. В ядерных экстрактах из спермэтозоидрв быка обнаружены окгамер-связывающие белки, предположительно представляющие собой транс-регуляторные Факторы oct-i, Oct-2 и oct-3/4.

Список работ. опубликованных по теме диссертации»

1.Zalenskaya I., Belokopytova I., Tuturova К., Kostyleva E., Zalensky A. Relationship between sperra chromatin structure and composition of the cromosomal proteins //Ini Abstracts of the Annual Symposium on Cell Biology — Boston, USA - 1991.

2.Vorob * ev V., Belokopytova I., Kostyleva E. The human male infertility may be due to the mutation within the protamine P2 gene //Ini Abstracts of the 7th European Testis Norkshop -Elmcu, Germany - 1992

3.Belokopytova I., Kostyleva E. , Tomilin A, Vorob'ev V. The human male infertility may be due, to the reduction of the protamine P2 contents in sperm chromatin //Mol.Reprod. and Oevel.- 1992 -v.33 - N4 - p.

А.Белокопытова И., Костылава E., Томилин А., Воробьев В. Мужская неФвртильность человека может быть обусловлена мутациями в гена протамина Р2 //Цитология <в печати)