Морфологические характеристики инфекции, вызываемой штаммом ЕР-2 вируса оспы коров у куриных эмбрионов и мышей

Виноградов, Илья Викторович

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Морфологические характеристики инфекции, вызываемой штаммом ЕР-2 вируса оспы коров у куриных эмбрионов и мышей
ВАК РФ 03.00.06, Вирусология

Автореферат диссертации по теме "Морфологические характеристики инфекции, вызываемой штаммом ЕР-2 вируса оспы коров у куриных эмбрионов и мышей"

На правах рукописи

ВиноградовИл ья Викторович

МОРФОЛОГИЧЕСКИЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ ИНФЕКЦИИ, ВЫЗЫВАЕМОЙ ШТАММОМ ЕР-2 ВИРУСА ОСПЫ КОРОВ У КУРИНЫХ ЭМБРИОНОВ И МЫШЕЙ

03.00.06—вирусология 03.00.25 - гистология, цитология, клеточная биология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Кольцове - 2004

Работа выполнена в Научно-исследовательском институте молекулярной биологии Государственного научного центра вирусологии и биотехнологии «Вектор» МЗ РФ

Научный руководитель

доктор биологических наук Рябчикова Е.И.

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор Сергеев А.Н. доктор биологических наук, профессор Бгатова Н.П.

Ведущая организация

Государственное учреждение Научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии имени почетного академика Н.Ф.Гамалеи, РАМН

Защита состоится «11 » НОМЕРА 2004 года вЭ'Ра с о в на заседании диссертационного совета Д 208.020.01 при Государственном научном центре вирусологии и биотехнологии «Вектор» МЗ РФ по адресу: 6300559, Новосибирская область, Кольцово, ГНЦ ВБ «Вектор».

С диссертацией можно ознакомится в библиотеке Государственного научного центра вирусологии и биотехнологии «Вектор» МЗ РФ.

Автореферат разослан 2004 г

Ученый секретарь диссертационного совета

Малыгин Э.Г.

-—Ü ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Вирус оспы коров у человека обычно вызывает местное поражение покровных тканей с благоприятным прогнозом и выздоровлением, однако возможны осложнения, особенно у невакцинированных и людей с подавленным иммунитетом Потенциально наиболее опасными для человека являются природные малоизученные и неизученные изоляты вируса оспы коров (ВОК). Между тем, биологические свойства природных изолятов изучены недостаточно, публикации, посвященные их исследованию, единичны, а работы, описывающие экспериментальную инфекцию у животных, в реферируемой литературе отсутствуют.

Адекватные представления о размножении вируса и особенностях патологических изменений в инфицированном организме необходимы не только для понимания механизмов развития вирусной инфекции, но и для разработки экспериментальных моделей животных для испытаний противовирусных препаратов. Опубликованные экспериментальные исследования инфекции, вызванной ВОК, выполнены с использованием прототипного штамма Брайтон. На основе полученных результатов создана модель для испытания препаратов против ортопоксвирусов при аэрозольном и интраназальном заражении мышей. Между тем, опубликованные результаты о характере патологических изменений внутренних органов и особенностях репродукции ВОК могут не соответствовать таковым при инфекции природными изолятами. Штамм Брайтон используется в вирусологической практике с 1937 г., и его биологические свойства могли измениться в ходе пассажей.

Цель и задачи исследования. Целью настоящего исследования являлось изучение инфекции, вызываемой штаммом ЕР-2 ВОК в различных биологических системах микроскопическими и вирусологическими методами.

В процессе исследования решали следующие задачи: - исследование морфологических особенностей репликации штамма ЕР-2 ВОК в культурах клеток Vero, CV-1 и ФЭК; в клетках хорион-аллантоисной оболочки и печени куриных эмбрионов; клетках органов мышей;

рос. национальная!

КИвЛИОТЕКА 1

¿ГЯЕМ

- изучение морфологии оспин, вызываемых штаммом ЕР-2 ВОК на хорион-аллантоисной оболочке куриных эмбрионов (ХАО КЭ),

- идентификация клеток-мишеней, поддерживающих репродукцию штамма ЕР-2 ВОК у куриных эмбрионов и мышей;

- изучение динамики изменений внутренних органов мышей при интраперитонеальном и интраназальном заражении разными дозами штамма ЕР-2 ВОК.

Научная новизна н практическая значимость работы. Впервые описаны ультраструктурные параметры репликации природного изолята ВОК в культурах клеток, клетках куриных эмбрионов и мышей. Определен спектр клеток-мишеней для штамма ЕР-2 ВОК у куриных эмбрионов и мышей при интраназальном и интраперитонеальном заражении. Впервые показано размножение ВОК в адипоцитах, поперечно-полосатых мышечных клетках, миосателлитах, ретикулярных и шванновских клетках мышей. Показана неспособность штамма ЕР-2 ВОК размножаться в клетках макрофагального ряда мышей.

Впервые для природного изоляга ВОК приведена детальная морфологическая характеристика оспины на ХАО КЭ. Изучено развитие инфекции у мышей, зараженных интраперитонеально и интраназально, природным изолятом ЕР-2 ВОК, и выявлена зависимость исхода инфекции от возраста мышей. Впервые дана патогистологическая характеристика изменений внутренних органов мышей при инфекции природным изолятом ВОК в Динамике инфекции. Показан локальный характер размножения изолята ЕР-2 ВОК в органах мышей при интраперитонеальном и интраназальном заражении.

Полученные результаты могут быть использованы при разработке учебно-методических материалов по вирусологии и патоморфологии, а также служить основой для разработки экспериментальных моделей для изучения эффективности препаратов против ортопоксвирусов. Положения, выносимые на защиту.

1. Причиной гибели молодых мышей, зараженных высокими дозами штамма ЕР-2 вируса оспы коров, является перитонит, вызванный массивным размножением вируса в тканях, граничащих с перитонеальной полостью.

2. Генерализация инфекции отсутствует при интраназальном и интраперитонеальном заражении мышей штаммом ЕР-2 вируса оспы коров.

3. Неспособность штамма ЕР-2 инфицировать макрофаги и продуцировать 1 необходимое количество внеклеточного «одетого» вируса может быть

причиной, препятствующей генерализации инфекции

Апробация работы. Материалы настоящей диссертации представлены на следующих конференциях: XIIth International Congress of Virology (Paris, 2002); XIV Научной конференции-конкурсе молодых ученых ГНЦ ВБ «Вектор» (Кольцове, 2003); XX Российской конференции по электронной микросколии (Черноголовка, 2004); международной конференции «Развитие международного сотрудничества в области изучения инфекционных заболеваний» («Сосновка», Новосибирская обл., 2004).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 5 печатных работ.

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 173 листах машинописного текста, включая 5 таблиц и 89 рисунков, и состоит из ведения, обзора литературы, материалов и методов, результатов и обсуждения, заключения, выводов, приложения и списка использованной литературы, содержащего 177 источников

Вклад автора. Экспериментальные данные, представленные в диссертации получены лично диссертантом в соавторстве с к.б.н. Кочневой Г.В. и д.м.н. Малковой Е.М

Перечень сокращений, используемых в автореферате. ВОК - вирус оспы коров, ВЭ — вирус эктромелии, и/п — интраперитонеально (-е), и/з — интраназально (-е), КЭ - куриный эмбрион, ОПВ - ортопоксвирусы, ХАО -хорион-аллантоисная оболочка, ЦГ1Д — цитопатическое действие, ЭПР — эндоплазматический ретикулум.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

1. Ультраструктурные параметры репликации штамма ЕР-2 ВОК

Репликация представителей рода ортопоксвирусов в зараженных клетках проходит ряд стадий, детально описанных для ВОВ и практически неотличимых для других ОПВ. В данном разделе приводится описание сборки частиц штамма ЕР-2 ВОК в обобщенном виде на основании анализа результатов электронно-микроскопических исследований инфицированных культур клеток, куриных эмбрионов и мышей. Отмечены особенности репродукции штамма в клетках разного типа. Проведенное исследование показывает, что штамм ЕР-2 ВОК проходит в клетках те же стадии сборки и созревания, что и ВОВ. Данное обстоятельство в очередной раз подтверждает схожесть или, даже возможно, идентичность стадий морфогенеза всех ОПВ.

Репликация штамма ЕР-2 ВОК начинается с появления в цитоплазме зараженных клеток вироплазмы, которая представляет собой округлые или овальные локусы гранулярно-фибриллярного вещества средней электронной плотности, не отграниченные мембранами от цитоплазмы. На периферии вироплазмы, а также в прилежащих участках цитоплазмы наблюдали начальные стадии сборки вирионов: формирование небольших сегментов вирусной оболочки в виде мембранных полумесяцев, на внешней стороне которых локализовались шипики (спикулы); мембранные сегменты увеличивались в размерах постепенно замыкаясь, и формируя незрелые сферические вирионы диаметром около 310 нм. На следующей стадии морфогенеза внутри вириона формировался нуклеоид, который постепенно увеличивался в размерах, приобретая двояковогнутую форму и смещаясь к центру частицы. В местах вогнутости нуклеоида образовывались овальные латеральные тела. По мере созревания нуклеоида и латеральных тел с поверхности оболочки вириона исчезали спикулы. .Вирусные частицы немного уменьшались в размерах и уплощались, приобретая типичную для ОПВ кирпичеобразную или овальную форму. Зрелые вирионы штамма ЕР-2 ВОК имели размеры ~285х200х180 нм.

В цитоплазме зараженных штаммом ЕР-2 ВОК клеток зрелые и незрелые вирионы располагаются как диффузно, так и скоплениями различной величины. Основная часть вирусного потомства высвобождалась из клеток после их разрушения. При репликации штамма ЕР-2 ВОК в цитоплазме зараженных клеток регистрировались редкие зрелые вирусные частицы «одетые» двумя дополнительными мембранами, сформированными из комплекса Гольджи. Внеклеточная «одетая» форма зрелого вируса встречалась гораздо реже внутриклеточной; ассоциированный с клетками зрелый «одетый» вирус обнаружить не удалось. Специального исследования проникновения штамма ЕР-2 ВОК в клетку не проводили, однако анализ изученных препаратов показывает, что данный вирус способен поникать в клетки путем рецептивного эндоцитоза.

Репликация штамма ЕР-2 ВОК сопровождалась появлением в цитоплазме зараженных клеток вирус-специфических структур, непосредственно не связанных с формированием вирионов. Наиболее характерной такой структурой для ВОК являются включения А-типа. В зараженных данным штаммом клетках включения А-типа имели округлую форму и размеры, достигающие 8,98±0,97 мкм (круглые сечения) и 8,31±1,20х10.69х±1,60 мкм (овальные сечения). Штамм ЕР-2 ВОК продуцировал включения трех вариантов: без вирусных частиц (А"); с вирусными частицами в один или несколько слоев по периферии (А1); содержащие зрелые вирионы по всему объему матрикса (А+). При некрозе клеток включения А-типа попадали в межклеточное пространство, где сохраняли форму и содержимое, что подтверждает предположение о том, что включения А-типа выполняют функцию сохранения зрелого потомства ВОК в окружающей среде. Обнаруженное нами формирование штаммом ЕР-2 ВОК всех трех возможных вариантов включений указывает либо на генетическую неоднородность штамма, либо на сложные, механизмы образования включений А-типа. Возможно, для погружения вглубь включения зрелых вирионов необходимы не один, как считается в литературе (Amano and Tagaya, 1981; McKelvey et al., 1992), а несколько факторов.

В цитоплазме зараженных штаммом ЕР-2 ВОК клеток (преимущественно в эпителиоцитах хориона КЭ и фибробластах мышей) встречались свободные вирусные нуклеоиды, зачастую лежащие скоплениями. Они были крупнее, чем нуклеоиды вирионов и не имели двояковогнутой формы. Механизмы образования свободных нуклеоидов не выяснены. Репликация вируса в эпителиоцитах хориона КЭ сопровождалась появлением в цитоплазме зараженных клеток не описанных ранее включений округлой, неправильной или овальной формы, содержащих полости разных размеров. Включения были образованы гранулярным материалом высокой электронной плотности, по периферии могли содержать более плотные глыбки.

В цитоплазме большинства клеток, зараженных штаммом ЕР-2 ВОК, выявлялся еще один тип включений: трубчатые полые структуры диаметром ~22 нм. Эти трубочки были разной протяженности и изгибались по всей длине, переплетаясь друг с другом и формируя своеобразную сеть. Скорее всего,

данные структуры связаны с формированием мембранных полумесяцев, возможно, являясь дополнительными образованиями. Можно также предположить, что эти структуры являются дефектными оболочками, которым не хватает каких-то вирусных белков.

В зараженных фибробластах различных органов и в ретикулярных клетках селезенки мышей были обнаружены необычные структуры, располагавшиеся в цитоплазме рядом с вирусными фабриками. Они представляли собой ровные незамкнутые профили, ограниченные электронно-плотными двойными мембранами, толщиной около 65 нм и длиной до 950 нм. Внутри визуализировался двухконтурный стержень, между которым и внешними мембранами с обеих сторон располагалось ячеистое содержимое. Природа этих структур на данный момент не установлена.

2. Особенности репликации штамма ЕР-2 ВОК в клеточных культурах

Заражение штаммом ЕР-2 ВОК клеточных культур приводило к визуальному повреждению монослоя. В перевиваемой культуре клеток CV-1 первые признаки поражения проявлялись уже через 2 ч после заражения дозой 10 БОЕ: часть клеток округлялась и отграничивалась от остального монослоя, формируя видимые очаги поражения, а затем отделялась от поверхности подложки. Через 4 ч ЦПД было 80%, через 6 ч - 100% (практически все клетки округлялись и отделялись от дна лунки). В перевиваемой культуре Vero через 9 ч после заражения дозой 10 БОЕ штамма ЕР-2 ВОК ЦПД было 100%, и также выражалось в округлении клеток и отделении их от общей клеточной массы и поверхности подложки.

В первичной культуре клеток ФЭК, зараженной штаммом ЕР-2 ВОК, ЦПД зависело от срока инкубации и инфицирующей дозы. При дозе 0,01 БОЕ через 10 ч после заражения ЦПД было незначительным, через 23 ч ЦПД было около 50%, через 46 ч - 100%. При дозе 0,001 БОЕ через 23 ч ЦПД было около 25%, через 46 ч - 50%, через 70 ч - 75%. В культуре клеток ФЭК ЦПД выражалось в формировании клеточных конгломератов-сплетений, в которых фибробласты переплетались отростками.

На ультраструктурном уровне в зараженных клетках всех трех культур происходили уменьшение электронной плотности цитоплазмы и ядра, вакуолизация и разрушение органелл, расширение цистерн ЭПР и перинуклеарного пространства.

В зараженных клетках культур CV-1, Vero и ФЭК наблюдали морфологические признаки репликации штамма ЕР-2 ВОК, описанные в разделе 1. Содержание вируса в зараженных клетках всех культур было невелико. В клеточных культурах Vero и ФЭК регистрировали включения варианта А. В цитоплазме зараженных клеток культуры ФЭК наблюдали трубчатые структуры, описанные в разделе I, и скопления вирусных частиц с неправильной структурой.

3. Особенности инфекции штамма ЕР-2 ВОК на ХАО КЭ

Штамм ЕР-2 ВОК вызывал через 48 ч после заражения дозой 10 ООЕ формирование на ХАО КЭ видимых невооруженным глазом мелких выпуклых оспин. Оспины приобретали геморрагичный характер, свойственный оспинам, индуцируемым ВОК через 72 ч. Особенностью оспин, вызванных штаммом ЕР-2 ВОК, являлось наличие геморрагического шлейфа («хвоста»), часто наблюдаемого визуально через 72 ч инкубации, который был крупной веной, переполненной эритроцитами.

Формообразующими факторами для оспин, индуцированных штаммом ЕР-2 ВОК, являлись размножение вируса, пролиферация эпителия и воспалительно-клеточная реакция. Оспина была образована эпителием хориона и подлежащей мезенхимой. При светооптическом изучении • наиболее выраженные патологические изменения наблюдались в центре оспины, по направлению к периферии их интенсивность снижалась. Основные морфомедрические параметры оспин через 48 и 72 ч поле заражения приведены в таблице (табл. I).

Таблица L Морфометрические характеристики оспин в различные сроки после заражения штаммом ЕР-2 вируса оспы коров (М ± SM)

Время после Диаметр оспины (мм) Диаметр зоны некроза 1 Общая толщина

заражения. (мм) ! ( оспины (мм)

48 ч 0,97±0ДЗ 1 0.35+0.14 | 0,43±0 08

72 ч 1,30+0,21 0,54+0.26 | 0.38±0,09

В оспине количество слоев эпителия хориона возрастало до 6-14 слоев через 48 ч, и до 8-16 слоев - через 72 ч после заражения. Увеличение толщины эпителиального пласта обусловлено пролиферацией эпителиальных клеток, индуцируемой вирусным ростовым фактором (Fonscca et ah, 1999). В центре оспины формировалась зона некроза, которая увеличивалась в течение инфекции.

Строение эпителия аллантоиса заметно не изменялось в течение всего периода инфекции. Под зоной оспины количество слоев достигало 2-3, клетки могли приобретать призматическую форму. При ультраструктурном изучении признаки репликации штамма ЕР-2 ВОК в эпителии аллантоиса не отмечены.

При электронно-микроскопическом изучении на границе между интактным эпителием хориона и оспиной наблюдали незараженные эпителиоциты, имеющие заметные патологические изменения свойственные зараженным клеткам исследованных культур. Основная часть зараженных эпителиоцитов находилась в центре оспины, где слой зараженных клеток был наиболее толстым и образовывал верхнюю границу оспины На периферии

оспины слой зараженных клеток мог располагаться под слоем незаряженных клеток. Патологические изменения большинства зараженных клеток были аналогичны изменениям незараженных клеток переходной зоны. Морфологические характеристики размножения штамма ЕР-2 ВОК в клетках эпителия хориона соответствовали описанным в разделе 1. Многие зараженные клетки, расположенные в глубоких слоях эпителия хориона центральной части оспины, некротизировались.

Базальная мембрана эпителия хориона в зоне оспины через 48 ч после заражения сохранялась на значительном протяжении, через 72 ч она фрагментировалась и практически исчезала. Происходила потеря межклеточных контактов; часть клеток отделялась от эпителиального пласта и попадала через разрушенную базальную мембрану в мезенхиму. В некоторых участках оспины клетки крови, вышедшие из сосудов мезенхимы, регистрировались в толще эпителия хориона.

В мезенхиме оспины наблюдалось переполнение кровеносных сосудов в зоне оспины кровью, их просветы расширялись, регистрировались кровоизлияния в соединительную ткань. В ряде случаев наблюдали разрушение стенок кровеносных сосудов. В процессе развития оспины значительно увеличивалась толщина мезенхимы, достигая максимума через 48 ч; позднее ее толщина уменьшалась. В мезенхиме оспины на обоих сроках наблюдались фибробласты, эритроциты, нейтрофилы, лимфоциты, эндотелиоциты, а через 72 ч после заражения регистрировались отделившиеся от общего эпителиального пласта клетки эпителия хориона. Признаков репликации штамма ЕР-2 в нейтрофилах, лимфоцитах и клетках эндотелия ХАО КЭ не выявлено.

Через 48 ч после заражения в фибробластах наблюдали четкие морфологические признаки репликации ВОК. Размеры вирусных фабрик и скоплений вирионов в фибробластах были меньше, чем в эпителиоцитах хориона, включения А-типа в этот период инфекции практически не регистрировали. Через 72 ч в фибробластах увеличивались размеры вирусных фабрик и скоплений вирионов, появлялись небольшие включения А-типа (вариант А"). Некоторые зараженные клетки разрушались.

Воспалительная реакция на размножение штамма ЕР-2 ВОК в ХАО КЭ была слабой, формирование оспины сопровождалось незначительной воспалительно-клеточной (нейтрофильной) инфильтрацией.

4. Особенности репликации штамма ЕР-2 ВОК в органах куриных' эмбрионов

Ультраструктурное исследование образцов, выявило репликацию штамма ЕР-2 ВОК в клетках печени эмбрионов через 72 ч после заражения дозами 3,7х102 и 3,7х103 БОЕ. Очаги инфекции представляли собой компактные скопления просветленных клеток и локализовались вокруг сосудов. Признаки репликации вируса регистрировались в гепатоцитах, эндотелиоцитах, клетках фибробластоидного ряда и малодифференцированных клетках, расположенных около сосудов. Структура цитоплазмы и ядра зараженных гепатоцитов заметно

не изменялись. В отличие от других клеток, зараженных штаммом ЕР-2 ВОК, в гепатоцитах не выявлялось крупных вакуолей. Патологические изменения инфицированных фибробластов были аналогичны таковым в клетках ХАО КЭ. Сходные изменения наблюдали в зараженных эндотелиоцитах.

Морфологические параметры репликации штамма ЕР-2 ВОК в клетках печени куриных эмбрионов не отличались от описанных в разделе 1. Вирусные фабрики и скопления вирионов лежали в цитоплазме компактно, что может быть связанно с высокой плотностью цигоплазматического матрикса. В некоторых клетках содержалось значительное количество морфологически дефектных вирионов.

Для выявления размножения штамма ЕР-2 ВОК в других органах, куриных эмбрионов заражали дозами 10' и 105 БОЕ и инкубировали 24, 48 и 72 ч. Размножение вируса удалось обнаружить только в печени КЭ. Ультраструктурное исследование сердца, желудочно-кишечного тракта, скелетной мускулатуры, головного мозга, селезенки, почки и кожи всех эмбрионов не выявило в них признаков репликации штамма ЕР-2 ВОК.

5. Исследование инфекции, вызываемой штаммом ЕР-2 ВОК и штаммом К-1 вируса эктромелии при интраперитонеальном заражении мышей

В ходе экспериментов беспородных белых мышей массой 10- 14г (возраст —23-30 суток), зараженных штаммом ЕР-2 ВОК в дозах 104, 105 и 106 Б0Е/0,1мл, наблюдали в течение 14 дней. На протяжении всего периода наблюдения мыши оставались активными и внешне здоровыми, признаков заболевания не регистрировалось. На вскрыши состояние внутренних органов не отличалось от такового у контрольных животных.

Заражение в ходе эксперимента штаммом ЕР-2 ВОК более молодых беспородных белых мышей (масса 7-9г, возраст —18-23 суток) в дозе 107 и 106 БОЕДЦмл, привело к гибели всех инфицированных животных в течение четырех и шести суток соответственно. У мышей наблюдали пониженную активность, взъерошенную шерсть, вялость, коньюктивит. На вскрытии печень имела бордовый цвет, селезенка была небольшая, бледная и обескровленная. У большинства мышей присутствовал выпот в брюшную полость, часто геморрагичный, что позволяет предположить воспаление тканей перитонеальной полости (перитонит).

В группе мышей, зараженных дозой 10э БОЕ/0,1мл, были зарегистрированы единичные случаи падежа на 5-11 сут. после заражения, большинство животных оставались живыми на протяжении 14 сут. Начиная с 6 суток, у некоторых мышей проявлялись отмеченные выше признаки болезни, которые исчезали к 11 сут. Вышеописанные патологические изменения органов наблюдали только у отдельных животных на 4-8 сут. У мышей, умерщвленных на 11 и 14 сут. после заражения, органы имели вид, неотличимый от такового у контрольных животных. Очевидно, заражение мышей штаммом ЕР-2 ВОК в дозе 105 БОЕ/0,1мл вызывает заболевание, заканчивающееся выздоровлением животных.

Сравнение биологической концентрации вируса в смывах с перитонеальной полости и в гомогенизированной брюшной стенке мышей обеих групп показало более активное размножение штамма ЕР-2 ВОК у молодых мышей. Следует упомянуть, что у всех мышей, зараженных штаммом ЕР-2 ВОК, на безволосых участках кожи не регистрировали характерных высыпаний (оспин), свойственных эктромелии у мышей.

Таким образом, интраперитонеальное заражение мышей штаммом ЕР-2 ВОК приводит к летальному заболеванию только при высоких дозах вируса (106 и 10' БОЕ/О,1мл) и только при заражении молодых (7-9 г) мышей.

5.1. Светооптическое изучение органов мышей

Лейкоцитарную формулу подсчитывали на мазках крови в различные сроки после заражения у молодых животных (7-9 г; дозы 104, 10" и 106 БОЕ/О,1мл). Заметных отличий лейкоцитарного состава крови в динамике инфекции по сравнению с контролем не обнаружено. В селезенке молодых мышей, зараженных дозами 10 и 107 Б0Е/0,1мл, начиная с 3 сут. после заражения, наблюдали нарушение архитектоники органа, расширение просветов сосудов, снижение количества эритроцитов в красной пульпе, субкапсуляриые мелкоочаговые некрозы красной пульпы, а также скопления лимфоцитов с явлениями кариорексиса и кариопикноза в фолликулах белой пульпы. Ультраструктурное исследование этих участков выявило апоптоз лимфоидных клеток с характерной конденсацией ядерного хроматина, В селезенке некоторых особей, зараженных дозой 105 Б0Е/0,1мл, на 4 и 6 сут. были найдены патологические изменения, аналогичные описанным выше; на 814 сут. строение селезенки было схоже с таковым контрольных мышей.

В печени всех зараженных штаммом ЕР-2 ВОК мышей выраженных гистопатологических нарушений не обнаружено.

У молодых беспородных белых мышей на полутонких срезах тканей, граничащих с местом введения штамма ЕР-2 ВОК (брыжейка и брюшная стенка), регистрировали крупные очаги поражения, характеризующиеся нейтрофильной инфильтрацией и обширными кровоизлияниями под мезотелий, отложениями фибрина и очаговыми некрозами, начиная с 2 сут. после заражения. Клетки мезотелия разрушались и слущивались, сохраняясь на базальной мембране только в виде фрагментов. Результаты светооптического исследования подтверждают развитие перитонита у мышей, зараженных штаммом ЕР-2 ВОК. В брюшной стенке некоторых мышей регистрировали отек соединительной ткани между мышечными клетками. В некоторых адипоцитах и фибробластах выявлялись включения А-типа. Патологические изменения брыжейки и брюшной стенки у мышей массой 10-14 г, зараженных дозами (104,105,10б Б0Е/0,1 мл) визуально не определялись.

В ходе иммуногистохимического исследования выявление инфицированных клеток на срезах проводили поликлональными антителами человека. Визуализацию антигенов проводили с помощью полиспецифичных биотинилированных вторичных антител, конъюгированных с иммунопероксидазой. Изучение селезенки молодых мышей, инфицированных

штаммом ЕР-2 ВОК в дозах 107 и 106 БОЕ/0,1мл выявило вирусные антигены на 3 и 4 сут. после заражения в небольших скоплениях соединительно-тканных клеток, разбросанных по всему органу (в основном на периферии органа) Общее количество специфически окрашенных клеток было невелико. Интенсивная положительная реакция, свидетельствующая о высоком содержании вирусных антигенов, наблюдалась в клетках капсулы селезенки и в клетках брыжейки. Следует отметить, что не прослеживалось связи между локализацией инфицированных клеток и лимфоидных клеток с явлениями апоптоза. В печени специфически окрашенные клетки обнаружены на были, что говорит об отсутствии размножения вируса в этом органе.

Очевидно, попавший в перитонеальную полость вирус инфицирует близлежащие ткани (брыжейка, брюшная стенка, капсула селезенки). Затем инфекция распространяется от капсулы селезенки к центру, что объясняет наличие большего количества метки на периферии селезенки по сравнению с центром. Следует подчеркнуть, что специфическая метка не была обнаружена ни в одном гепатоците печени, несмотря на то, что в брыжейке, непосредственно прилегающей к печени, отмечено большое количество вирусного антигена. Дальнейшее распространение вируса от тканей перитонеальной полости, по-видимому, зависит от чувствительности клеток определенного типа к штамму ЕР-2 ВОК: клетки селезенки поддерживают его репликацию, а клетки печени - нет

Положительным контролем при иммуногистохимическом выявлении ортопоксвирусных антигенов служили срезы селезенки и печени мышей, инфицированных 50 БОЕ/0,1мл штамма К-1 ВЭ. В селезенке мышей, зараженных данным штаммом, наблюдали интенсивную окраску клеток, лежащих по всей строме органа, в том числе и в фолликулах белой пульпы. В печени зараженных ВЭ мышей окрашивались гепатоциты и клетки Купффера, располагавшиеся очагами разных размеров в паренхиме органа.

5.2. Ультраструктурное изучение органов мышей

При ультраструктурном изучении локализация зараженных клеток совпадала с участками интенсивной окраски при иммунногистохимическом анализе. В селезенке молодых мышей, зараженных штаммом ЕР-2, вирус выявляли на 4-6 сут. после заражения в фибробластах, гладкомышечных, эндотелиальных и ретикулярных клетках. В макрофагах селезенки признаков репликации вируса не наблюдали. Инфицированные клетки располагались небольшими очагами в красной пульпе органа, наибольшее число очагов было вблизи капсулы селезенки. Штамм К-1 ВЭ в селезенке реплицировался в макрофагах, фибробластах, эндотелиальных и ретикулярных клетках. Следует отметить, что число клеток, зараженных штаммом К-1 ВЭ, в селезенке было несравнимо больше, чем при заражении штаммом ЕР-2 ВОК, несмотря на существенно меньшую инфицирующую дозу.

В печени всех мышей, зараженных штаммом ЕР-2 ВОК, вне зависимости от возраста и инфицирующей дозы, признаки размножения вируса и заметные патологические изменения отсутствовали на протяжении всего периода

инфекции. Напротив, штамм К-1 ВЭ активно размножался в гепатоцитах, клетках Купффера, а также в эндотелиоцитах кровеносных и лимфатических капилляров печени.

В брыжейке молодых мышей признаки репликации штамма ЕР-2 ВОК наблюдались в клетках мезотелия перитонеальной выстилки, фибробластах, адвентициальных клетках, адипоцитах (жировых клетках), гладкомышечных и эндотелиальных клетках стенки кровеносных сосудов и эндотелиальных клетках лимфатических сосудов. В брюшной стенке размножение вируса происходило в вышеперечисленных типах клеток, а также в миосателлитах и поперечно-полосатых мышечных клетках. Вирус реплицировался в фибробластоидных клетках, формирующих периневрий; иногда вирус наблюдали в эндоневрии, однако убедительных ультраструктурных доказательств проникновения вируса в нервные волокна нет. Изучение макрофагальных клеток брыжейки и брюшной стенки, а также перитонеальных макрофагов, полученных путем смыва со стенок перитонеальной полости, не выявило размножение в них штамма ЕР-2 ВОК.

В фибробластах, адипоцитах, миосателлитах и поперечно-полосатых мышечных клетках вирус интенсивно реплицировался, формируя массивные скопления вирусных частиц и крупные включения А-типа трех вариантов. В мезотелиальных, гладкомышечных и эндотелиальных клетках вирусных частиц было немного, включения А-типа были небольшие.

Штамм К-1 ВЭ в брыжейке и брюшной стенке мышей размножался в фибробластах, макрофагах, миосателлитах, мезотелиальных, эндотелиальных и адвентициальных клетках. При изучении смывов со стенок перитонеальной полости было обнаружено активное размножение вируса 'эктромелии в перитонеальных макрофагах.

Анализ полученных результатов показывает, что в изученных органах мышей зараженные штаммом ЕР-2 ВОК клетки располагались очагами, с которыми были связаны основные патологические изменения. Особенностью штамма ЕР-2 ВОК является способность размножаться в различных типах клеток, в том числе и в высокодифференцированных. Набор клеток-мишеней для вируса эктромелии также включал в себя высокодифференцированные клетки, но был несколько иным, что, возможно, связано с различиями в наборе рецепторов для ВОК и ВЭ. Принципиально важным является отсутствие признаков репликации штамма ЕР-2 во всех изученных клетках макрофагального ряда, тогда как ВЭ активно размножался в макрофагальных клетках.

6. Исследование интраназальной инфекции, вызываемой штаммом ЕР-2 ВОК у молодых мышей линии BALB/ C

На вскрытии мышей линии БЛЬБ/С (масса 8-9 г), и/н зараженных дозой 2х105 БОЕ/20мкл штамма ЕР-2 ВОК выраженных патологических изменений в легких, печени, селезенке и почке не найдено. В воздухоносных путях мышей патологические изменения наблюдали с 7 сут. после заражения: в

обонятельной и респираторной областях носовой полости, в трахее, в главных бронхах вблизи бифуркации трахеи, а также в крупном бронхе легкого

Наиболее выраженные изменения происходили в носовой полости, которая является местом аппликации вируса. Очаги поражения характеризовались пролиферацией эпителия, утолщением подлежащей соединительной ткани; просветлением цитоплазмы, вакуолизацией и некрозом эпителиальных и соединительно-тканных клеток. Регистрировали кровоизлияния в полость носа. В эпителии трахеи и главных бронхов участки патологических изменений были четко отграничены по краю интактными эпителиальными клетками. Пролиферация эпителия трахеи и главных бронхов была выражена меньше, чем в носовой полости; количество слоев эпителия увеличивалось редко. В пораженных участках наблюдали дистрофию и некроз эпителиальных и подлежащих соединительно-тканных клеток. Подлежащий гладкомышечный слой трахеи и бронхов сохранял нормальное строение. Большинство очагов поражения воздухоносных путей были инфильтрированы нейтрофилами, макрофагами и редкими лимфоцитами.

В легких мышей линии BALB/C, зараженных штаммом ЕР-2 ВОК, на 5 сут. наблюдали небольшие участки лейкоцитарной инфильфации, которая возрастала на 7 сут. и сохранялась до конца наблюдения. В респираторной зоне наблюдали плотное заполнение эритроцитами сосудов микроциркуляторного русла, в сосудах венозного русла - лейкостаз. В альвеолах немного утолщались септы и регистрировался дистелектаз. В ряде легочных долей регистрировали области эмфиземы. В эпителии бронхов и бронхиол, а также в прилежащей ткани не наблюдалось заметных патологических изменений на протяжении всего эксперимента. Удалось обнаружить лишь один небольшой очаг поражения в стенке крупного бронха через 7 сут. после заражения. В очаге эпителий терял упорядоченную структуру и частично разрушался, наблюдалась его умеренная инфильтрация лейкоцитами, регистрировался отек прилежащей соединительной ткани.

У мышей линии BALB/C, зараженных и/н штаммом Брайтон ВОК, развивается тяжелое поражение дыхательной системы, приводящее к гибели (Martinez et al., 2000). Полученные нами данные свидетельствуют о том, что штамм ЕР-2 ВОК вызывает у мышей линии BALB/C патологические изменения существенно меньшей степени, сосредоточенные в основном в зоне аппликации вируса в носовой полости

Иммуногистохимическое исследование печени, селезенки и легких не выявило специфического окрашивания клеток на всех сроках у и/н зараженных мышей линии BALB/C, что говорит об отсутствии репродукции вируса в этих органах. Вероятно, воспалительная реакция в легких обусловлена общей реакцией органов дыхания на заражение, либо носила неспецифический характер.

Ультраструктурный анализ выявил репликацию штамма ЕР-2 ВОК в клетках носовой полости, трахеи, верхних отделов главных бронхов, а также в небольшом участке крупного бронха у одного животного. Изучение большого количества срезов легких остальных мышей на всех сроках после заражения не

выявило признаков репликации вируса в клетках этого органа. Не удалось обнаружить размножение вируса и в клетках обонятельных луковиц, переднего мозга, тимуса, печени и селезенки животных, в клетках воздухоносных путей которых размножение вируса было выявлено при электронно-микроскопическом исследовании.

Воспалительная реакция в органах, где клетки были заражены только вирусом (трахея и бронхи) была умеренной. Сильная воспалительная реакция в носовой полости может быть объяснена наличием бактерий палочковидной формы, которые были выявлены в очагах некроза эпителиальных клеток на поздних сроках инфекции.

В эпителии респираторной зоны носовой полости вирус размножался в мерцательных, вставочных, базальных и бокаловидных клетках; в эпителии обонятельной зоны - в базальных и поддерживающих клетках. В обонятельных клетках вирус не размножался. В эпителии трахеи и крупных бронхов морфологические признаки репродукции вируса наблюдались в мерцательных, вставочных и бокаловидных клетках. В расположенной под эпителием рыхлой соединительной ткани носовой полости и трахеи вирус инфицировал фибробластоидные клетки, гладкомышечные и эндогелиальные клетки стенок сосудов. Следует отметить, что вирус размножался в клетках фибробластоидного происхождения, формирующих периневрий. Некоторое количество вирионов обнаруживали в эндоневрии. Удалось зарегистрировать признаки репликации вируса в шванновских клетках, при этом вирус не проникал в нервные волокна. У мышей той же линии, зараженных и/н штаммом Брайтон ВОК, вирус размножался в вышеперечисленных клетках, однако репликация в шванновских клетках" не отмечена. Штамм ЕР-2 ВОК не реплицировался в альвеолоцитах и макрофагальных клетках (альвеолярных и тканевых макрофагах), в отличие от штамма Брайтон, размножение которого наблюдали в клетках выстилки альвеолярных септ и макрофагах (Martinez et al., 2000). Ультраструктурные параметры репродукция штамма ЕР-2 в клетках органов дыхания соответствовали описанию, приведенному в разделе 1.

При и/н введении штамма ЕР-2 ВОК мышам линии BALB/C количество зараженных клеток резко уменьшалось по мере продвижения вглубь воздухоносных путей: вирус интенсивно реплицировался в носовой полости, слабее - в трахее, и редко проникал в прилегающие к трахее главные бронхи. То есть, факт заражения клеток определялся не их типом, а попаданием вирусной суспензии на тот или иной участок слизистой воздухоносных путей. В клетках печени, селезенки, обонятельных луковиц, переднего мозга и тимуса животных размножение вирус не было обнаружено. Изучение и/н инфекции мышей линии BALB/C штаммом ЕР-2 ВОК показывает, что репликация вируса локализуется в клетках, расположенных в местах аппликации вируса (воздухоносные пути).

выводы

1. Ультраструктурные характеристики сборки и созревания вирионов штамма ЕР-2 вируса оспы коров в клетках культур (Vero, CV-1, ФЭК), куриных эмбриоИов' и мышей аналогичны описанным для других ортопоксвирусов. Особенностью штамма ЕР-2 является формирование крайне малого числа зрелых «одетых» вирионов.

2. У куриных эмбрионов штамм ЕР-2 вируса оспы коров размножается в клетках эпителия хориона, фибробластах мезенхимы, а также в эндотелиоцитах и гепатоцитах печени. Оспины, индуцированные на ХАО штаммом ЕР-2, характеризуются накоплением дочернего вируса в клетках, пролиферацией эпителия хориона, незначительной воспалительно-клеточной инфильтрацией и нарушением кровотока.

3. Исход инфекции у беспородных белых мышей, зараженных интраперитонеально штаммом ЕР-2 вируса оспы коров, зависит от возраста животных (при заражении равной дозой мыши массой 7-9 г болеют и погибают, а у мышей массой 10-14 г визуальные признаки заболевания отсутствуют). Инфекция у мышей, зараженных интраназально и интраперитонеально, носит локальный характер.

4. У мышей штамм ЕР-2 вируса оспы коров размножается в фибробластах, эндотелиальных, адвентациальных, и гладкомышечных клетках. При интраперитонеальном заражении вирус также размножается в миосателлитах, мезотелиальных, жировых и поперечно-полосатых мышечных клетках. При интраназальном заражении размножение вируса регистрируется в мерцательных, вставочных, банальных, бокаловидных, поддерживающих клетках воздухоносных путей и в шванновских клетках нервов.

5. Область патологических изменений, вызванных размножением штаммом ЕР-2 ВОК, определяется местом аппликации вирусной суспензии (перитонеальная полость и прилегающие ткани при интраперитонеальном введении; эпителий и подлежащая соединительная ткань носовой полости, трахеи и бронхов при интраназальном введении).

Основные результаты диссертации опубликованы в следующих работах:

1. Kochneva G., Vinogradov I., Malkova E., Marennikova S., Ryabchikova E. Study of Age-depend Susceptibility of the mice to Cowpox Virus. Poster Session. - XIIth International Congress ofVirology. - Paris. - 2002. - P. 460.

2. Виноградов И.В., Кочнева Г.В., Малкова Е.М., Щелкунов С.Н., Рябчикова Е.И. Экспериментальная инфекция, вызываемая штаммом ЕР-2 вируса оспы коров у мышей разного возраста. // Вопросы вирусологии. -2003.-№5.-С. 34-38. ' ' '

3.' Ryabchikova E., Timoshenko О., Vinogradov I. Use of electron microscopy for the identification of vital agents. In: Medical aspects of chemical and biological terrorism — biological terrorism and traumatism (Ed. Monov A., Dishovsky C). Publishing House of the Union of Scientists in Bulgaria. -Sofia. - 2004. - P. 53-84.

4. Виноградов И.В., Кочнева Г.В., Рябчикова Е.И. Ультраструктурное изучение репродукции изолята ЕР-2 вируса оспы коров, выделенного от слона. - тезисы XX Российской конференции по электронной микроскопии. - Черноголовка. - 2004. - С. 216.

5. Рябчикова Е.И. Виноградов И.В. Тимошенко О.В., Кочнева Г.В., Гуськов А.А. Изучение особенностей репродукции вирусов оспы коров и натуральной оспы in vitro и in ovo. - тезисы международной конференции «Развитие международного сотрудничества в области изучения инфекционных заболеваний». - «Сосновка», Новосибирская область. - 2004. - С. 125.

Подписано в печать 17.09.2004 Формат 60x84 1/16 Заказ №98 Бумага офсетная, 80 гр/м2

Печ.л. 1 Тираж 100

Отпечатано на полиграфическом участке издательского отдела Института катализа им. Г.К. Борескова СО РАН 630090, Новосибирск, пр. Академика Лаврентьева, 5

8 í О 5

РНБ Русский фонд

2005-4 16149

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Виноградов, Илья Викторович

ОГЛАВЛЕНИЕ.

СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ СОКРАЩЕНИЙ.

I. ВВЕДЕНИЕ.

II. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1. Общая характеристика поксвирусов.

2. Репликативный цикл ортопоксвирусов.

3. Морфофункциональные изменения в зараженных ортопоксвирусами клетках.

4. Особенности взаимодействия ортопоксвирусов с клетками in vitro.

5. Репликация ортопоксвирусов на хорион-аллантоисной оболочке и в печени куриных эмбрионов (in ovo).

6. Характеристика поксвирусной инфекции у животных и человека.

7. Особенности инфекции, вызываемой вирусом оспы коров, у людей и животных.

8. Особенности течения инфекции, вызываемой вирусом оспы коров, у мышей.

III. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

1. Материалы.

2. Заражение клеточных культур.

3. Заражение куриных эмбрионов.

4. Заражение мышей.

5. Определение биологической концентрации вируса в органах и тканях инфицированных мышей.

6. Светооптические исследования.

7. Электронно-микроскопические исследования.

IV. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

1. Ультраструктурные параметры репликации штамма ЕР-2 ВОК.

2. Особенности репликации штамма ЕР-2 ВОК в клеточных культурах.

3. Особенности инфекции штамма ЕР-2 ВОК на ХАО КЭ.

4. Особенности репликации штамма ЕР-2 ВОК в органах куриных эмбрионов.

5. Исследование инфекции, вызываемой штаммом ЕР-2 ВОК и штаммом К-1 вируса эктромелии при интраперитонеальном заражении мышей.

5.1. Светооптическое изучение органов мышей.

5.2. Ультраструктурное изучение органов мышей.

6. Исследование интраназальной инфекции, вызываемой штаммом ЕР-2 ВОК у молодых мышей линии BALB/C.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Морфологические характеристики инфекции, вызываемой штаммом ЕР-2 вируса оспы коров у куриных эмбрионов и мышей"

Актуальность проблемы. Одной из наиболее значимых проблем вирусологии является исследование биологических свойств возбудителей неизвестных и вновь возникающих инфекций, в том числе новых природных изолятов известных вирусов. К разряду таких инфекций относятся и ортопоксвирусные. Опасность заражения людей ортопоксвирусами сохраняется по сей день, несмотря на то, что в 1980 году Всемирная Организация Здравоохранения подписала свидетельство о глобальной ликвидации натуральной оспы на земном шаре. Периодически публикуются сообщения о вспышках заболеваний у людей, вызванных вирусами осповакцины, оспы обезьян, оспы буйволов и оспы коров в различных странах (Онищенко и др., 2001; Damaso et al., 2000; Маренникова и Щелкунов, 1998; Baxby et al., 1994). Вирус натуральной оспы, представитель рода Ортопоксвирусов, рассматривается зарубежными и отечественными экспертами в качестве одного из наиболее вероятных объектов применения в биотеррористических акциях (Онищенко и др., 2000; Henderson, 1999). Существование природного резервуара вируса оспы коров в популяциях диких грызунов и прекращение оспопрививания обуславливают рост количества заболеваний оспой коров, особенно среди не прошедшего вакцинацию населения. Опубликованные данные свидетельствуют, что чаще всего люди заражаются от кошек и диких грызунов (Stewart et al., 2000; Hawranek et al., 2003; Schupp et al., 2001; Lawn et al., 2003; Feuerstein et al., 2000).

Вирус оспы коров у человека обычно вызывает местное поражение покровных тканей с благоприятным прогнозом и выздоровлением (Stolz et al., 1996; Lawn et al., 2003; Schupp et al., 2001), однако возможны осложнения (Маренникова и Щелкунов, 1998; Baxby et al, 1994), особенно у невакцинированных и людей с подавленным иммунитетом. Потенциально наиболее опасными для человека являются природные малоизученные и неизученные изоляты вируса оспы коров (ВОК). Между тем, биологические свойства природных изолятов изучены недостаточно, публикации, посвященные их исследованию, единичны (Baxby and Ghaboosi, 1977; Колосова и др., 2003), а работы, посвященные изучению экспериментальной инфекции у животных, в реферируемой литературе отсутствуют.

Адекватные представления о размножении вируса и особенностях патологических изменений в инфицированном организме необходимы не только для понимания механизмов развития вирусной инфекции, но и для разработки экспериментальных моделей животных для испытаний противовирусных препаратов. Опубликованные экспериментальные исследования инфекции, вызванной ВОК, выполнены с использованием прототипного штамма Брайтон. На основе полученных результатов создана модель для испытания препаратов против ортопоксвирусов при аэрозольном и интраназальном заражении мышей (Bray et al., 2000; Bray et al., 2002; Martinez et al., 2000; Ferrier et al., 2002). Между тем, опубликованные результаты о характере патологических изменений внутренних органов и особенностях репродукции ВОК могут не соответствовать таковым при инфекции природными изолятами. Штамм Брайтон используется в вирусологической практике с 1937 г. (Downie, 1939), и его биологические свойства могли измениться в ходе пассажей.

В процессе исследования решали следующие задачи: - исследование морфологических особенностей репликации штамма ЕР-2 ВОК в культурах клеток Vero, CV-1 и ФЭК; в клетках хорионаллантоисной оболочки и печени куриных эмбрионов; клетках органов мышей;

- изучение морфологии оспин, вызываемых штаммом ЕР-2 ВОК на хорион-аллантоисной оболочке куриных эмбрионов (ХАО КЭ);

- идентификация клеток-мишеней, поддерживающих репродукцию штамма ЕР-2 ВОК у куриных эмбрионов и мышей;

Научная новизна и практическая значимость работы. Впервые описаны ультраструктурные параметры репликации природного изолята ВОК в культурах клеток, клетках куриных эмбрионов и мышей. Определен спектр клеток-мишеней для штамма ЕР-2 ВОК у куриных эмбрионов и мышей при интраназальном и интраперитонеальном заражении. Впервые показано размножение ВОК в адипоцитах, поперечно-полосатых мышечных клетках, миосателлитах, ретикулярных и шванновских клетках мышей. Показана неспособность штамма ЕР-2 ВОК размножаться в клетках макрофагального ряда мышей, в отличие от вируса эктромелии.

Впервые для природного изолята ВОК приведена детальная морфологическая характеристика оспины на ХАО КЭ. Впервые изучено развитие инфекции у мышей, зараженных интраперитонеально и интраназально природным изолятом ЕР-2 ВОК, и выявлена зависимость исхода инфекции от возраста мышей. Впервые дана патогистологическая характеристика изменений внутренних органов мышей в динамике инфекции. Показан локальный характер размножения изолята ЕР-2 ВОК в органах мышей при интраперитонеальном и интраназальном заражении.

Положения, выносимые на защиту.

3. Неспособность штамма ЕР-2 инфицировать макрофаги и продуцировать необходимое количество внеклеточного «одетого» вируса может быть причиной, препятствующей генерализации инфекции.

I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Заключение Диссертация по теме "Вирусология", Виноградов, Илья Викторович

VI. ВЫВОДЫ

1. Ультраструктурные характеристики сборки и созревания вирионов штамма ЕР-2 вируса оспы коров в клетках культур (Vero, CV-1, ФЭК), куриных эмбрионов и мышей аналогичны описанным для других ортопоксвирусов. Особенностью штамма ЕР-2 является формирование крайне малого числа зрелых «одетых» вирионов.

4. У мышей штамм ЕР-2 вируса оспы коров размножается в фибробластах, эндотелиальных, адвентициальных, и гладкомышечных клетках. При интраперитонеальном заражении вирус также размножается в миосателлитах, мезотелиальных, жировых и поперечно-полосатых мышечных клетках. При интраназальном заражении размножение вируса регистрируется в мерцательных, вставочных, базальных, бокаловидных, поддерживающих клетках воздухоносных путей и в шванновских клетках нервов.

Область патологических изменений, вызванных размножением штаммом ЕР-2 ВОК, определяется местом аппликации вирусной суспензии (перитонеальная полость и прилегающие ткани при интраперитонеальном введении; эпителий и подлежащая соединительная ткань носовой полости, трахеи и бронхов при интраназальном введении).

V. ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Штамм ЕР-2 ВОК в различных клетках клеточных культур, куриных эмбрионов и мышей имеет идентичные параметры морфогенеза и вызывает сходные цитопатологические изменения. Особенностью репродукции штамма ЕР-2 в различных биологических системах является образование крайне небольшого количества «одетого» зрелого вируса и формирование 3-х вариантов включений А-типа.

Штамм ЕР-2 ВОК на ХАО КЭ, в условиях несформировавшегося иммунитета, вызывает формирование оспины, сопровождающееся интенсивной пролиферацией эпителия хориона, нарушением кровотока и незначительной воспалительно-клеточной инфильтрацией. Подобные изменения на ХАО описаны в оспинах, индуцированных прототипным штаммом Брайтон ВОК (Palumbo et al., 1989; Chua et al., 1990; Fredrickson et al., 1992). Штамм ЕР-2 ВОК у КЭ на ХАО размножался в эпителиоцитах хориона и фибробластах мезенхимы; в печени - в гепатоцитах, эндотелиоцитах и фибробластоидных клетках.

Тяжелое заболевание с летальным исходом развивалось только у молодых мышей (7-9 г), и/п зараженных высокими дозами штамма ЕР-2 ВОК; при этом причиной гибели было развитие выраженных патологических изменений в перитонеальной полости (перитонит). У мышей массой 10-14 г размножение штамма ЕР-2 ВОК было выявлено вирусологически, однако животные выздоравливали или вовсе не болели. Основные патологические изменения в зараженных тканях мышей характеризовались некрозами, вакуолизацией клеток, появлением вирус-специфических включений А-типа и нарушением кровотока. Воспалительная инфильтрация зон размножения вируса была умеренной.

При изучении и/п и и/н инфекции у мышей была обнаружена способность штамма ЕР-2 ВОК реплицироваться в фибробластах, эндотелиальных, адвентициальных, и гладкомышечных клетках. При и/п заражении вирус также размножался в миосателлитах, мезотелиальных, жировых и поперечно-полосатых мышечных клетках. При и/н заражении размножение вируса регистрировали в мерцательных, вставочных, базальных и бокаловидных клетках (респираторная зона носа, эпителий трахеи и бронхов), базальных и поддерживающих клетках (обонятельная зона носа), шванновских клетках нервов. При этом вирус размножался непосредственно по месту и/п и и/н введения или в участках, прямо контактировавших с ним, формируя ограниченные очаги. В клетках органов, удаленных от места аппликации, репродукция вируса отсутствовала. Таким образом, инфекция, вызываемая и/п и и/н введением штамма ЕР-2 ВОК мышам, носила локальный характер. Штамм Брайтон, и/н веденный мышам линии BALB/C, вызывал тяжелую генерализованную инфекцию, с гибелью животных (Martinez et al., 2000; Ferrier et al., 2002).

Из опубликованной литературы известно, что нарушение развития локальной воспалительной реакции на инфицированные клетки характерно для летальных вирусных инфекций (Salazar-Mather et al, 2000; Ryabchikova et al, 1999). Анализ полученных результатов позволяет полагать, что у молодых s мышей массой 7-9 г при высоких дозах (101 и 10 БОЕ/О, 1мл) воспалительная реакция в зонах репродукции вируса была недостаточна для подавления инфекции. У молодых мышей при меньших дозах (10 и 105 БОЕ/О, 1мл) и при всех дозах у мышей массой 10-14 г защитные механизмы организма были способны справиться с заболеванием, и животные выздоравливали.

Анализ полученных данных позволяет предположить, что локальный характер репродукции штамма ЕР-2 ВОК может быть отчасти обусловлен формированием очень малого числа внеклеточных «одетых» вирионов, ответственных за диссеминацию ортопоксвирусной инфекции (Blasco and Moss, 1992).

Другим фактором, обеспечивающим генерализацию вирусной инфекции, является заражение макрофагальных клеток (Lancaster et al., 1966). В частности, показано, что утрата способности размножаться в макрофагах приводит к резкому снижению вирулентности вируса эктромелии (Kochneva et al., 1994). Проведенное исследование показало неспособность штамма ЕР-2 ВОК размножаться в клетках макрофагального ряда (тканевые, альвеолярные и перитонеальные макрофаги, клетки Купффера). Очевидно, это свойство штамма ЕР-2 ВОК может в значительной мере определять локальный характер инфекции.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Виноградов, Илья Викторович, Кольцово

1. Быковский А.Ф., Ершов Ф.И., Кармышева В.Я., Блюмкин В.Н., Миронова JI.J1. Атлас вирусной цитопатологии. М: Медицина, 1975. - С. 21-23, 27.

2. Леннет Э., Шмидт Н. Лабораторная диагностика вирусных и риккетсиозных заболеваний. М: Медицина, 1974. - С. 92-93.

3. Мальцева Н.Н. Экспресс-диагностика заболеваний, вызываемых ортопокс-и некоторыми герпес вирусами. Дисс. докт. М., 1980.

4. Маренникова С.С., Щелкунов С.Н. Патогенные для человека ортопоксвирусы. М: КМК Scientific Press Ltd, 1998. 386с.

5. Маренникова С.С., Шелухина Э.М. Возможный источник «белых диких» (whitepox) поксвирусов. // Вопр. Вирусол. 1978. - № 3. - С. 327-328.

6. Мосс В. Репликация поксвирусов. / Вирусология (Под ред. Филдс Б. И Найп Д). Т. 3. - М: Мир, - 1989. - С. 246-275.

7. Ю.Оншценко Г.Г., Марков В.И., Устюшин В.Н., Борисевич С.В., Кузнецова

8. Г.И. Логинова С.Я., Бережной A.M., Васильев Н.Г., Максимов В.А., Махлай А.А. Выделение и идентификация вируса осповакцины, вызвавшего ятрогенную вакцинацию у детей в г. Владивосток. // Журн. Микробиол. 2001. - № 2. - С. 40-45.

9. П.Онищенко Г. Г., Сандахчиев Л. С., Нетесов С. В., Щелкунов С. В.• Биотерроризм как национальная и глобальная угроза // Журн. Микробиол. 2000. - № 6. - С. 83-85.

10. Рябчикова Е.И., Стрельцов В.В., Петров B.C. Субмикроскопические изменения хорион-аллантоисной оболочки куриных эмбрионов при заражении их вирусом осповакцины. // Вопр. Вирусол. 1990. - № 6. - С. 506-509.

11. Сафронов П.Ф. Секвенирование и анализ организации генома вируса оспы коров штамм GRI-90. Дисс. Канд. Кольцово, 2004.

12. Слепушкин А.Н. Семейство Poxviridae. В «Общая и частная вирусология».- Т. 2. М: Медицина, - 1982. - С. 340-374.

13. Стенко М.И. Кровь. / Справочник по клиническим лабораторным методам исследования (Под ред. Кост Е.А.). М: Медицина, - 1975 - С. 43.

14. Стрельцов В.В. Ультраструктурный анализ оспинообразования на ХАО РКЭ для генетически различных вариантов вируса осповакцины. Тез. конф. Вторая отраслевая конференция-конкурс молодых ученых 25-27• апреля 1990 года. Кольцово. 1990. - С. 41-42.

15. Струков А.И., Серов В.В. Патологическая анатомия. М: Медицина, -1985. - С. 447-449.

16. Шелухина Э.М. Биология и экология ортопоксвирусов, патогенных для человека. Дисс. докт. М., 1980.

17. Шелухина Э.М., Маренникова С.С. Генерализованная оспа обезьян у крольчат и белых мышей при пероральном заражении. // Вопр. Вирусол. -1975.-№6.-С. 703-705.

18. Уикли Б. Электронная микроскопия для начинающих. М: «Мир». - 1975. - С. 287-288.

19. Alcami A., Smith G.L. Vaccinia, cowpox, and camelpox viruses encode soluble gamma interferon receptors with novel broad species specificity. // J. Virol. -1995. Vol. 69(8). - P. 4633-4639.

20. Ali A.N., Turner P.C., Brooks M.A., Moyer R.W. The SPI-1 gene of rabbitpox virus determines host range and is required for hemorrhagic pock formation. // Virology. 1994. - Vol. 202(1). - P. 305-314.

21. Amano H., Tagaya I. Isolation of cowpox virus clones deficient in production of type A inclusions: relationship to the production of diffusible LS antigen. // J. Gen. Virol. 1981. - Vol. 54(1). - P. 203-207.

22. Baxby D. Variability in the characteristics of pocks produced on the chick chorioallantois by white pock mutants of cowpox and other poxviruses. // J. Hyg. Camb. 1969. - Vol. 67. - P. 637-647.

23. Baxby D. Laboratory characteristics of British and Dutch strains of cowpox virus. // Zbl. Vet. Med. Bd. 1975. - Vol. 22(6). - P. 480-487.

24. Baxby D., Bennett M., Getty B. Human cowpox 1969-1993: a review based on 54 cases. // Br. J. Dermatol. 1994. - Vol. 131(5). - P. 598-607.

25. Baxby D., Ghaboosi B. Laboratory characteristics of poxviruses isolated from captive elephants in Germany // J. Gen. Virol. 1977. - Vol. 37. - P. 407-414.

26. Begon M., Hazel S.M., Baxby D., Bown K., Cavanagh R., Chantrey J., Jones Т., Bennett M. Transmission dynamics of a zoonotic pathogen within andbetween wildlife host species. // Proc. R. Soc. Lond. B. 1999. - Vol. 266. - P. 1939-1945.

27. Begon M., Hazel S.M., Telfer S., Bown K., Carslake D., Cavanagh R., Chanrtey L., Jones Т., Bennett M. Rodents, cowpox virus and islands: densities, numbers and thresholds. // J. Anim. Ecol. 2003. - Vol. 72. - P. 343-355.

28. Bennett M. Cowpox in cats. // In. Pract. 1989. - Vol. 11(6). - P. 244-247.

29. Bennett M., Gaskell C.J., Baxby D., Gaskell R.M., Kelly D.F. Feline cowpox virus infection. // J. Smal. Anim. Pract. 1990. - Vol. 31. - P. 167-173.

30. Bennett M., Gaskell R.M., Gaskell C.J., Baxby D., Kelly D.F. Studies on poxvirus infection in cats. // Arch. Virol. 1989. - Vol. 104(1-2). - P. 19-33.

31. Betakova Т., Wolffe E.J., Moss B. The vaccinia virus A14.5L gene encodes a hydrophobic 53-amino-acid virion membrane protein that enhances virulence in mice and is conserved among vertebrate poxviruses. // J. Virol. 2000. - Vol. 74(9). - P. 4085-4092.

32. Biel S.S., Gelderblom H.R. Diagnostic electron microscopy is still a timely and rewarding method. // J. Clin. Virol. 1999. - Vol. 13(1-2). - P. 105-119.

33. Biel S.S., Gelderblom H.R. Electron microscopy of viruses. / In: Virus culture -a practical approach. (Ed. Cann A.J.) Oxford University Press. - 1999. - P. 111-147.

34. Blackford S., Roberts D.L., Thomas P.D. Cowpox infection causing a generalized eruption in a patient with atopic dermatitis. // Br. J. Dermatol. -1993. Vol. 129(5). - P. 628-629.

35. Blasco R., Moss B. Role of cell-associated enveloped vaccinia virus in cell-to-cell spread. // J. Virol. 1992. - Vol. 66(7). - P. 4170-4179.

36. Boulanger D., Smith Т., Skinner M.A. Morphogenesis and release of fowlpox virus. //J. Gen. Virol. 2000. - Vol. 81. - P. 675-687.

37. Bray M., Martinez M., Smee D.F., Kefauver D., Thompson E., Huggins J.W. Cidofovir protects mice against lethal aerosol or intranasal cowpox virus challenge. //J. Infect. Dis. 2000. - Vol. 181. - P. 10-19.

38. Bray M., Martinez M., Kefauver D., West M., Roy C. Treatment of aerosolized cowpox virus infection in mice with aerosolized cidofovir. // Antivir. Res. -2002. Vol. 54. - P. 129-142.

39. Brooks M.A., Ali A.N., Turner P.C., Moyer R.W. A rabbitpox virus serpin gene controls host range by inhibiting apoptosis in restrictive cells. // J. Virol. 1995. -Vol. 69(12).-P. 7688-7698.

40. Buller R.M.L., Chakrabarti S., Moss В., Fredrickson T. Cell proliferative response to vaccinia virus is mediated by VGF. // Virology. 1988. - Vol. 164. -P. 182-192.

41. Buller R.M.L., Palumbo G.J. Poxvirus pathogenesis. // Microbiol. Rev. 1991. -Vol. 55(1).-P. 80-122.

42. Buller R.M.L., Wallace G.D. Ectromelia (mousepox) virus. // Dev. Vet. Virol. -1988.-Vol. 6.-P. 63-82.

43. Carfi A., Smith C.A., Smolak P.J., McCrew J., Wiley D.C. Structure of a soluble secreted chemokine inhibitor vCCI (p35) from cowpox virus. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1999. - Vol. 96(22). - P. 12379-12383.

44. Chantrey J., Meyer H., Baxby D., Begon M., Bown K.J., Hazel S.M., Jones Т., Mantgomery W.I., Bennett M. Cowpox: reservoir hosts and geographic range. // Epidemiol. Infect. 1999. - Vol. 122(3). - P. 455-460.

45. Chua T.P., Smith C.E., Reith R.W., Williamson J.D. Inflammatory responses and the generation of chemoattractant activity in cowpox virus-infected tissues. // Immunology. 1990. - Vol. 69. - P. 202-208.

46. Chung C.S., Hsiao J.C., Chang Y.S., Chang W. A27L protein mediates vaccinia virus interaction with cell surface heparan sulfate. // J. Virol. 1998. - Vol. 72(2).-P. 1577-1578.

47. Cudmore S., Reckmann I., Griffiths G., Way M. Vaccinia virus: a model system for actin-membrane interactions. // J. Cell. Sci. 1996. - Vol. 109(7). -P. 1739-1747.

48. Cuff S., Ruby J. Evasion of apoptosis by DNA viruses. // Immunol, and Cel. Biol. 1996. - Vol. 74. - P. 527-537.

49. Dales S., Kajioka R. The cycle of multiplication of vaccinia virus in Earle's strain L cells. 1. Uptake and penetration. // Virology. 1964. - Vol. 24. - P. 278294.

50. Dales S. and Mosbach E. H. Vaccinia as a model for membrane biogenesis. // Virology. 1968. - Vol. 35(4). - P. 564-583.

51. Damaso C.R.A., Esposito J.J., Condit R.C., Moussatche N. An emergent poxviruse from humans and cattle in Rio de Janeiro State: Contagalo vims may derive from Brazilian smallpox vaccine. // Virology. 2000. - Vol. 277. - P. 439-449.

52. Dick E.J., Kittell C.L., Meyer H., Farrar P.L., Ropp S.L., Esposito J.J., Buller R.M.L., Neubauer H., Kang Y.H., McKee A.E. Mousepox outbreak in a laboratory mouse colony. // Lab. Anim. Sci. 1996. - Vol. 46(6). - P. 602-611.

53. Domber E., Holowczak J.A. Vaccinia virus proteins on the plasma membranes of infected cells. IV. Studies employing L cells infected with ultraviolet-irradiated vaccinia virions. // Virology. 1986. - Vol. 152(2). - P. 331-342.

54. Doms R. W., Blumenthal R., Moss B. Fusion of intra- and extracellular forms of vaccinia virus with the cell membrane. // J. Virol. 1990. - Vol. 64(10). - P. 4884-4892.

55. Downie A.W. A study of the lesions produced experimentally by cowpox virus. // J. Path. Bacteriol. 1939. - Vol. 48(2). - P. 361-379. (Цит. по Маренникова и Щелкунов, 1998).

56. Fenner F. Adventures with poxviruses of vertebrates. // FEMS Microbiol. Rev. -2000.-Vol. 24.-P. 123-133.

57. Fenner F. Poxviruses / In: Fields Virology, Third Edition. (Ed.: Fields B.N. et al.). Philadelphia: Lippincott-Raven Publishers. - 1996. - P. 2675-2699.

58. Feore S.M., Bennett M., Chantrey J., Jones Т., Baxby D., Begon M. The effect of cowpox virus infection on fecundity in bank voles and wood mice. // Proc. R. Soc. Lond. B. 1997. - Vol. 264. - P. 1457-1461.

59. Ferrier A., Crance J.M., Garin D. P43 a model for cowpox virus pathogenesis and immunity based on intranasal infection of BALB/C mice. / Abstract of papers. XIV Annual poxvirus workshop. New York. - 2002. - P. 137.

60. Feuerstein-Kadgien В., Korn K. Cowpox infection. // N. Engl. J. Med. 2003. -Vol. 348(5).-P. 415.

61. Feuerstein В., Jurgens M., Schnetz E., Fartasch M., Simon J.M. Cowpox/catpox infection two case reports. // Der. Hautarzd. - 2000. - Vol. 51(11). - P. 852856.

62. Fonseca F.G.D., Silva R.L.A., Marques J.T., Ferreira P.C.P., Kroon E.G. The genome of cowpox virus contains a gene related to those encoding the epidermal growth factor alpha and vaccinia growth factor. // Virus Genes. -1999,- Vol. 18(2).-P. 151-160.

63. Fonseca F.G., Lanna M.C.S., Campos M.A.S., Kitajima E.W., Peres J.N., Golgher R.R., Ferreira P.C.P., Kroon E.G. Morphological and molecular characterisation of the poxvirus BeAn 58058. // Arch. Virol. 1998. - Vol. 143. -P. 1171-1186.

64. Fredrickson T.N., Sechler J.M., Palumbo G.J., Albert J., Khairallah L.H., Buller R.M. Acute inflammatory response to cowpox virus infection of the chorioallantoic membrane of the chick embryo. // Virology. 1992. - Vol. 187(2).-P. 693-704.

65. Gaskell R.M., Gaskell C.J., Evans R.J., Dennis P.E., Bennett A.M., Udall N.D., Voyle C., Hill T.J. Natural and experimental pox virus infection in the domestic cat. //Vet. Rec. 1983. - Vol. 112(8). - P. 164-170.

66. Gillet G., Brun G. Viral inhibition of apoptosis. // Trend. Microbiol. 1996. -Vol. 4(8). - P. 312-317.

67. Griffiths G., Roos N., Schleich S., Locker J.K. Structure and assembly of intracellular mature vaccinia virus: thin-section analyses. // J. Virol. 2001a. -Vol. 75(22).-P. 11056-11070.

68. Griffiths G., Wepf R., Wendt Т., Locker J.K., Cyrklaff M., Roos N. Structure and assembly of intracellular mature vaccinia virus: isolated-particle analyses. // J. Virol. 20016. - Vol. 75(22). - P. 11034-11055.

69. Grimley P.M., Rosenblum E.N., Mims S J., Moss B. Interruption by rifampin of an early stage in vaccinia virus morphogenesis: accumulation of membranes which are precursors of virus envelopes. // J. Virol. 1970. - Vol. 6(4). - P. 519533.

70. Haig D.M. Subversion and piracy: DNA viruses and immune evasion. // Res. Vet. Sci. 2001. - Vol. 70. - P. 205-219.

71. Haig D.M. Poxvirus interference with the host cytokine response. // Vet. Immunol, and Immunopath. 1998. - Vol. 63. - P. 149-156.

72. Hanson D., Diven D.G. Molluscum contagiosum. // Dermatol. Online. J. -2003.-Vol. 9(2). P. 2.

73. Hawranek Т., Tritscher M, Muss W.H., Jecel J., Nowotny N., Kolodziejek J., Emberger M., Schaeppi H., Hintner H. Feline Orthopoxvirus infection transmitted from cat to human. // J. Am. Acad. Dermatol. 2003. - Vol. 49(3). -P. 513-518.

74. Hazel S.M., Bennett M., Chantrey J., Bown K., Cavanagh R., Jones T.R., Baxby D., Begon M. A longitudinal study of on endemic disease in its wildlife reservoir: cowpox and wild rodents. // Epidemiol Infect. 2000. - Vol. 124(3). -P. 551-562.

75. Hazelton P.R., Gelderblom H.R. Electron microscopy for rapid diagnosis of emerging infectious agents. // Emerg. Infect. Dis. 2003. - Vol. 9(3). - P. 294303.

76. Helbert D. Smallpox and alastrim. Use of the chick embryo to distinguish between the viruses of variola major and variola minor. // Lancet. 1957. - Vol. 272. - P. 1012-1014.

77. Henderson D.A. The looming threat of bioterrorism // Science. 1999. - Vol. 283. - P. 1279-1282.

78. Herrera E., Lorenzo M.M., Blasco R., Isaacs S.N. Functional analysis of vaccinia virus B5R protein: essential role in virus envelopment is independent of a large portion of the extracellular domain. // J. Virol. 1998. - Vol. 72(1). -P. 294-302.

79. Hinrichs V., Van den Poel H., Van den Ingh T.S. Necrotizing pneumonia in a cat caused by an orthopox virus. // J. Сотр. Pathol. 1999. - Vol. 121(2). - P. 191-196.

80. Hiramatsu Y., Uno F., Yoshida M., Hatano Y., Nii S. Poxvirus virions: their surface ultrastructure and interaction with the surface membrane of host cells. // J. Electron. Microsc. 1999. - Vol. 48(6). - P. 937-946.

81. Hoare C.M., Bennett M. Cowpox in the cat. // Vet. Annu. 1985. - Vol. 25. - P. 348-351.

82. Hsiao J.C., Chung C.S., Chang W. Vaccinia virus envelope D8L protein binds to cell surface chondroitin sulfate and mediates the adsorption of intracellular mature virions to cells. //J. Virol. 1999. - Vol. 73(10). - P. 8750-8761.

83. Jackson D.C., Ada G.L., Tha Hla R. Cytotoxic T cells recognize very early, minor changes in ectromelia virus-infected target cells. // Aust. J. Exp. Biol. Med. Sci. 1976. - Vol. 54. - P. 349-363. (Цит. no Buller and Palumbo, 1991).

84. Jacoby R.O., Bhatt P.N., Mousepox in inbred mice innately resistant or susceptible to lethal infection with ectomelia virus. I. Clinical responses. II. Pathogenesis. // Lab. Anim. Sci. 1987. - Vol. 37. - P. 9-22.

85. Janeczko R.A., Rodriguez J.F., Esteban M. Studies on the mechanism of entry of vaccinia virus in animal cells. // Arch. Virol. 1987. - Vol. 92. - P. 135-150.

86. Kajioka R., Siminovitch L., Dales S. The cycle of multiplication of vaccinia virus in Earless strain L cells. 2. Initiation of DNA synthesis and morphogenesis. // Virology. 1964. - Vol. 24. - P. 295-309.

87. Karupian G., Buller R.M.L., Rooijen N.V., Duarte C.J., Chen J. Different roles for CD4+ and CD8+ T lymphocytes and Macrophage subsets in the control of a generalized virus infection. // J. Virol. 1996. - Vol. 70(12). - P. 8301-8309.

88. Kit S., Dubbs D.R. Biochemistry of vaccinia-infected mouse fibroblasts (strain L-M). I. Effects on nucleic acid and protein synthesis. // Virology. -1962. Vol. 18.-P. 274-285.

89. Kochneva G.V., Urmanov I.H., Ryabchikova E.I., Streltsov V.V., Serpintsky O.I. Fine mechanisms of ectromelia virus thymidine kinase-negative mutants avirulence. // Virus Res. 1994. - Vol. 34(1). - P. 49-61.

90. Lancaster M.C., Boulter E.A., Westwood J.C., Randies J. Experimental respiratory infection with poxviruses, II: pathological studies. // Br. J. Exp. Pathol. 1966. - Vol. 47(5). - P. 466-471.

91. Lawn S.D., Planche Т., Riley P., Holwill S., Silman N., Bewley K., Rice P., Wansbrough-Jones M.H. A black necrotic ulcer. // The Lancet. 2003. - Vol. 361.-P. 1518.

92. Loeb W.F., Bannerman R.M., Rininger B.F., Johnson A.J. Hematologic Diseases. / In: Pathology of Laboratory Animals. (Ed. Benirschke K. et al.). -Vol. 1. New York: Springer-Verlag. - 1978. - P. 912-920.

93. Marchal J. Infectious ectromelia. A hitherto undescribed virus disease of mice. //J. Path. Bacteriol. 1930. - Vol. 33. - P. 713-728.

94. Marennikova S.S., Maltseva N.N., Korneeva V.I., Garanina N. Outbreak of pox disease among carnivora (felidae) and edentata. // J. Infect. Dis. 1977. -Vol. 135(3).-P. 358-366.

95. Martland M.F., Poulton G.J., Done R.A. Three cases of cowpox infection of domestic cats. // Vet. Rec. 1985. - Vol. 117(10). - P. 231-233.

96. Mazzone H.M., Wray G. and Engler W.F. The High voltage electron microscope in virology. // Adv. Virus. Res. 1985. - Vol. 30. - P. 43-82.

97. Meyer H., Neubauer H., Pfeffer M. Amplification of "Variola virus-specific" sequences in German Cowpox Virus Isolates. // J. Vet. Med. 2002. -Vol. 49. - P. 17-19.

98. Miller C.G., Shchelkunov S.N., Kotwal G.J. The cowpox virus-encoded homolog of the vaccinia virus complement control protein is an inflammation modulatory protein. // Virology. 1997. - Vol. 229(1). - P. 126-33.

99. Morgan С. Vaccinia virus reexamined: development and release. // Virology. 1976. - Vol. 73(1). - P. 43-58.

100. Moss B. Poxviridae: The viruses and their replication / In: Fields Virology. Third Edition. (Ed.: Fields B.N. et al.). Philadelphia: Lippincott-Raven Publishers. - 1996a. - P. 2637-2659.

101. Moss B. Genetically engineered poxviruses for recombinant gene expression, vaccination, and safety. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 19966. -Vol. 93.-P. 11341-11348.

102. Mullbacher A., Ron Tha Hla, Museteanu C., Simon M.M. Perforin is essential for control of ectromelia virus but not related poxviruses in mice. // J. Virol. 1999. - Vol. 73(2). - P. 1665-1667.

103. Muller G., Wlliamson J.D. Poxviridae. / In: Animal virus structure. Perspectives in Medical Virology. (Ed. Nermut M.V. and Steven A.C.). Vol. 3. - Amsterdam-New York-Oxford: Elsevier. - 1987. - P. 421-433.

104. Natuk R.J., Holowczak J.A. Vaccinia virus proteins on the plasma membrane of infected cells. III. Infection of peritoneal macrophages. // Virology. 1985. - Vol. 147(2). - P. 354-372.

105. Characterization of vaccinia virus intracellular cores: implications for viral uncoating and core structure. // J. Virol. 2000. - Vol. 74(8). - P. 3525-3536.

106. Payne L.G. The existence of an envelope on extracellular cowpox virus and its antigenic relationship to the vaccinia envelope. // Arch. Virol. 1986. - Vol. 90(1-2).-P. 125-133.

107. Payne L.G. Characterization of vaccinia virus glycoproteins by monoclonalmantibody preparations. // Virology. 1992. - Vol. 187. - P. 251-260.

108. Pogo B.G.T., Dales S. Biogenesis of poxviruses: further evidence for inhibition of host and virus DNA synthesis by a component of the invading inoculum particle. // Virology. 1974. - Vol. 58. - P. 377-386.

109. Ray C.A., Pickup D.J. The mode of death of pig kidney cells infected with cowpox virus is governed by the expression of the crmA gene. // Virology. -1996. Vol. 217(1). - P. 384-391.

110. Rayne B.J., Lewis H.B., Murchison Т.Е., Hart E.A. Hematology of1.boratory Animal. / In: Handbook of Laboratory Animal Science. (Ed. Melby E.C. and Altman Jr.N.H). Vol. 3. - Cleveland: CRC Press. - 1976. - P. 381461.

111. Reith R.W., Williamson J.D. Pathogenesis of vaccinia and cowpox infections. / Abstract of papers. Xlth Poxvirus and Iridovirus meeting. Toledo, ^ Spain. - 1996. - P. 98. (Цит. по Маренникова и Щелкунов, 1998).

112. Renatus M., Zhou О., Stennicke H.R., Snipas S.J., Turk D., Bankston L.A., Liddington R.C., Salvesen G.S. Crystal structure of the apoptotic suppressor GrmA in its cleaved form. // Structur. Fold. 2000. - Vol. 8(7). - P. 789-797.

113. Risco C., Carrascosa J.L. Visualization of viral assembly in the infected cell. // Histol. Histopethol. 1999. - Vol. 14. - P. 905-926.

114. Ryabchikova E.I., Kolesnikova L.V., Netesov S.V. Animal pathology of filoviral infections. // Curr. Top. Microbiol. Immunol. 1999. - Vol. 235. - P. 143-171.

115. Salazar-Mather T.P., Hamilton T.A., Biron C.A. A chemokine-to-cytokine-to-chemokine cascade critical in antiviral defense. // J. Clin. Invest. 2000. -Vol. 105(7).-P. 985-993.

116. Sanderson C.M., Hollinshead M., Smith G.L. The vaccinia virus A27L protein is needed for the microtubule-dependent transport of intracellular mature virus particles. // J. Gen. Virol. 2000. - Vol. 81. - P. 47-58.

117. Sanderson C.M., Way M., Smith G.L. Virus-induced cell motility. // J. Virol. 1998. - Vol. 72(2). - P. 1235-1243.

118. Saraiva M., Alcami A. CrmE, a novel soluble tumor necrosis factor receptor encoded by poxviruses. // J. Virol. 2001. - Vol. 75(1). - P. 226-233.

119. Schmelz M., Sodeik В., Ericsson M., Wolffe E.J., Shida H., Hiller G., Griffiths G. Assembly of vaccinia virus: the second wrapping cisterna is derived from the trans Golgi network. // J. Virol. 1994. - Vol. 68(1). - P. 130147.

120. Schupp P., Pfeffer M., Meyer H., Burck G., Kolmel K., Neumann C. Cowpox virus in a 12-year-old boy: rapid identification by an orthopoxvirus-specific polymerase chain reaction. // Br. J. Dermatol. 2001. - Vol. 145. - P. 146-150.

121. Smee D.F., Bailey K.W., Wong M.H., Sidwell R.W. Intranasal treatment of cowpox virus respiratory infection in mice with cidofovir. // Antivir. Res. -2000.-Vol. 47.-P. 171-177.

122. Smee D.F., Bailey K.W., Wong M.H., Sidwell R.W. Effects of cidofovir on the pathogenesis of as lethal vaccinia virus respiratory infection in mice. // Antivir. Res. 2001. - Vol. 52. - P. 55-62.

123. Smee D.F., Bailey K.W., Sidwell R.W. Treatment of lethal cowpox virus respiratory infection in mice with 2-amino-7-(l,3-dihydroxy-2-propoxy)methyl.purine and its orally active diacetate ester prodrug. // Antivir. Res. 2002a. - Vol. 54. - P. 113-120.

124. Smee D.F., Sidwell R.W. A review of compounds exhibiting anti-orthopoxvirus activity in animal models. // Antivir. Res. 2003. - Vol. 57. - P. 41-52.

125. Smee D.F., Sidwell R.W., Kefauver D., Bray M., Huggins J.W. Characterization of wild-type and cidofovir-resistant strains of camelpox, cowpox, monkeypox, and vaccinia viruses. // Antimicrobial. Agent. Chemother.- 20026. V. 46(5). - P. 1329-1335.

126. Smith G.L., Vanderplasschen A. Extracellular enveloped vaccinia virus. Entry, egress, and evasion. // Adv. Exp. Med. Biol. 1998. - Vol. 440. - P. 395414.

127. Smith V.P., Bryant N.A., Alcami A. Ectromelia, vaccinia and cowpoxviruses encode secreted interleukin-18-binding proteins. // J. Gen. Virol.- 2000. Vol. 81(5). - P. 1223-1230.

128. Sodeik В., Krijnse-Locker J. Assembly of vaccinia virus revisited: de novo membrane synthesis or acquisition from the host? // TRENDS Microbiol. -2002.-Vol. 10(1).-P. 15-24.

129. Soekawa M., Moriguchi R., Morita C., Kitamura Т., Tanaka Y. Electron-microscopical observation on the development of vaccinia, cowpox and monkeypox viruses in pig skin. // Zbl. Bakt. Hyg., I. Abt. Orig. A. 1977. -Vol. 237(4). - P. 425-443.

130. Spehner D., Gillard S., Drillien R., Kirn A. A cowpox virus gene required for multiplication in Chines hamster ovary cells. // J. Virol. 1988. - Vol. 62.• P. 1297-1304.

131. Stagles M.J., Watson A.A., Boyd J.F., More I.A., McSeveney D. The histopathology and electron microscopy of a human monkeypox lesion. // Trans. Roy. Soc. Trop. Med. Hyg. 1985. - Vol. 79. - P. 192-202.

132. Stannard L.M., Marais D., Kow D., Dumbell K.R. Evidence for incomplete replication of a penguin poxvirus in cells of mammalian origin. // J. Gen. Virol.• 1998.-Vol. 79.-P. 1637-1646.

133. Stern W., Dales S. Biogenesis of vaccinia: isolation and characterization of a surface component that elicits antibody suppressing infectivity and cell-cell fusion. // Virology. 1976a. - Vol. 75. - P. 232-241.

134. Stern W., Dales S. Biogenesis of vaccinia: relationship of the envelope to virus assembly. // Virology. 19766. - Vol. 75. - P. 242-255.

135. Stern R.J., Thompson J.P., Moyer R.W. Attenuation of B5R mutants ofrabbitpox virus in vivo is related to impaired growth and not an enhanced host inflammatory response. // Virology. 1997. - Vol. 233. - P. 118-129.

136. Stewart K.J., Telfer S., Bown K.J., White M.I. Cowpox infection: not yet consigned to history. // British. J. Plast. Surg. 2000. - Vol. 53(4). - P. 348-350.

137. Stolz N., Gotz A., Thomas P., Ruzicka Т., Suss R., Landthaler M., Mahnel H., Czerny C.P. Characteristic but unfamiliar the cowpox infection, transmitted by a domestic cat. // Dermatology. - 1996. - Vol. 193(2). - P. 140* 143.

138. Sutton J.S., Burnett J.W. Ultrastructural changes in dermal and epidermal cells of skin infected with molluscum contagiosum virus. // J. Ultrastruct. Res. -1969.-Vol. 26.-P. 177-196.

139. Telfer S., Bennett M., Bown K., Cavanagh R., Crespin L., Hazel S., Jones Т., Begon M. The effects of cowpox virus on survival in natural rodent populations: increases and decreases. // J. Anim. Ecol. 2002. - Vol. 71. - P. 558-568.

140. Tsutsui K., Uxo F., Akatsuka K., Nii S. Electron microscopic study on vaccinia virus release. // Arch. Virol. 1983. - Vol. 75. - P. 213-218.

141. Turner P.C., Moyer R.W. Poxvirus immune modulators: functional insights from animal models. // Virus Res. 2002. Vol. 88. - P. 35-53.

142. Vafai A., Rouhandeh H. Analysis of Yaba tumor poxvirus-induced proteins in infected cells by two-dimensional gel electrophoresis. // Virology. 1982. -Vol. 120. - P. 65-76.

143. Van den Broek M.F., Muller U., Huang S., Aguet. M., Zinkernagel R. M. Antiviral defense in mice lacking both alpha/beta and gamma interferon receptors. // J. Virol. 1995. - Vol. 69(8). - P. 4792-4796.

144. Vanderplasschen A., Hollishead M., Smith G.L. Intracellular and extracellular vaccinia virions enter cells by different mechanisms. // J. Gen. Virol. 1998. - Vol. 79. - P. 877-887.

145. Virus Taxonomy. / Seventh report of the international committee on taxonomy of viruses. (Ed. Van Regenmortel et al.). San Diego et al.:• Academic press. 2000. - P. 137-157.

146. Verlinde J.D. Koepokken bij de mens. // Tschr. Diergeneesk. 1951. - Bd. 76(9). - S. 334-342.

147. Vestey J.P., Yirrell D.L., Aldridge R.D. Cowpox/catpox infection. // Br. J. Dermatol. 1991. - Vol. 124(1). - P. 74-78.

148. Wallace G.D., Buller R.M.L. Kinetics of ectromelia virus (mousepox) 9 transmission and clinical response in C57BL/6J, BALB/cByJ and AKR/J inbredmice. 11 Lab. Anim. Sci. 1985. - Vol. 35. - P. 41-46.

149. Wesrwood J.C.N., Harris W.J., Zwartouw H.T., Titmuss D.H.J., Appleyard G. Studies on the structure of vaccinia virus. // J. Gen. Virol. 1964. - Vol. 34. -P. 67-78.

150. Wienecke R., Wolff H., Schaller M., Meyer H., Plewig G. Cowpox virus infection in an 11-year-old girl. // J. Am. Acad. Dermatol. 2000. - Vol. 42(5 pt2.. P. 892-894.

151. Wolfs T.F.W., Wagenaar J.A., Niesters H.G.M., Osterhaus D.M.E. Rat-to-human transmission of cowpox infection. // Emerg. Infect. Dis. 2002. - Vol. 8(12). - P. 1495-1496.

152. Zaucha G.M., Jahrling P.B., Geisbert T.W., Swearengen J.R., Hensley L. The pathology of experimental aerosolized monkeypox virus infection in cynomolgus monkeys (Macaca fascicular is). 11 Lab. Invest. 2001. - Vol. 81.1. P. 1581-1600.Ф

Информация о работе

Виноградов, Илья Викторович
кандидата биологических наук
Кольцово, 2004
ВАК 03.00.06

Диссертация

Морфологические характеристики инфекции, вызываемой штаммом ЕР-2 вируса оспы коров у куриных эмбрионов и мышей - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы