Бесплатный автореферат и диссертация по сельскому хозяйству на тему

Молекулярно-биологическая характеристика бактерий семейства Pasteurellaceae и частота их выявления при респираторных болезнях крупного рогатого скота

ВАК РФ 06.02.02, Кормление сельскохозяйственных животных и технология кормов

Автореферат диссертации по теме "Молекулярно-биологическая характеристика бактерий семейства Pasteurellaceae и частота их выявления при респираторных болезнях крупного рогатого скота"

На правах рукописи

ТЕРЕНТЬЕВА ТАТЬЯНА ЕВГЕНЬЕВНА

МОЛЕКУЛЯРНО-БИОЛОГИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА БАКТЕРИЙ СЕМЕЙСТВА РАБТЕиЯЕЬЬА СЕЛЕ И ЧАСТОТА ИХ ВЫЯВЛЕНИЯ ПРИ РЕСПИРАТОРНЫХ БОЛЕЗНЯХ КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА

06.02.02 -ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата ветеринарных наук

2 8 АВГ 2014

005551961

Новосибирск - 2014

005551961

Работа выполнена в Государственном научном учреждении Институт экспериментальной ветеринарии Сибири и Дальнего Востока Российской академии сельскохозяйственных наук

Научный руководитель: доктор ветеринарных наук, профессор

Глотов Александр Гаврилович

Официальные оппоненты: Луницын Василий Герасимович,

доктор ветеринарных наук, профессор, ГНУ Всероссийский научно-исследовательский институт пантового оленеводства Россельхоз-академии, директор

Вольф Виктор Теодорович,

кандидат ветеринарных наук, доцент, ФГБОУ ВПО «Новосибирский государственный аграрный университет», доцент кафедры

Ведущая организация: ГНУ Краснодарский научно-исследовательский

ветеринарный институт Россельхозакадемии

Защита состоится г. в « -го » часов на заседании дис-

сертационного совета Д.006.04^.01., созданного на базе ГНУ Институт экспериментальной ветеринарии Сибири и Дальнего Востока Россельхозакадемии по адресу: 630501, Новосибирская область, Новосибирский район, п. Краснообск, ГНУ ИВСиДВ, а/я 8, тел./факс (383) 348-44-62, E-mail: dis.ievsidv@list.ru

С диссертацией можно ознакомиться в Сибирской научной сельскохозяйственной библиотеке Россельхозакадемии и на сайте ИЭВСиДВ: www.ievsidv.ru: автореферат размещен на сайте ВАК РФ: www.vak2.ed.gov.ru

Автореферат разослан « » 2014 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, канд. ветеринар, наук

Г.М. Стеблева

1 ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. В условиях интенсификации молочного животноводства большое значение приобретают респираторные болезни, приводящие к снижению экономической эффективности данной отрасли. В возникновении бронхопневмоний у крупного рогатого скота (КРС) большую роль играют представители семейства Pasteurellaceae: грамотрицательные, факультативно анаэробные палочкообразные бактерии, являющиеся комменсальными обитателями поверхности слизистых оболочек верхнего респираторного тракта животных, способные вызывать вторичные инфекционные болезни. Семейство включает 6 родов (М.А. Сидоров, 1983, 1995; Р. Kuhnert, 2008; S.B. Shivachandra, 2011), но наибольшую роль в патологии животных играют представители родов Мапп-heimia и Pasteurella, а именно виды: М. haemolytica AI и P. multocida. Последняя включает 5 капсульных серотипов, но патологию легких у телят чаще вызывают А и D серотипы (М.А. Сидоров, 1983; С.И Джупина, A.A. Колосов, 1992; Э.А. Шегидевич, 1993; S.M. Dabo, 2008). Эти болезни не имеют выраженной сезонности и регистрируются чаще у молодняка 1-6-месячного возраста на фоне стрессов, вирусных инфекций и неудовлетворительных условий кормления и содержания, болеют и взрослые животные (Э.А. Шегидевич, 1993; J. Van Donkersgoed, 1993).

В настоящее время актуальным является изучение распространения и частоты проявления данной патологии у КРС, а также идентификация и определение таксономической принадлежности возбудителей с целью оптимизации противоэпизоотических мероприятий.

Степень разработанности проблемы. На момент начала работы исследований по молекулярной биологии бактерий семейства Pasteurellaceae в нашей стране было недостаточно. Изучению эпизоотологии и разработке средств и методов диагностики пастереллезов сельскохозяйственных животных были посвящены работы М.А. Сидорова (1972-1982), Э.А. Шегидевича (19822005), С.И. Джупины, A.A. Колосова (1986-1997) и других. Метод серологической типизации пастерелл, основанный на различиях по капсульному или соматическому антигену не дает точной информации о таксономической принадлежности бактерий и не нашел применения в нашей стране (М.А. Сидоров, 1983, 1995). Поэтому вопрос типизации выделенных культур бактерий остается открытым. Наиболее перспективными в данном направлении являются молекулярные методы, в том числе полимеразная цепная реакция (ПЦР).

В последние годы для выявления Pasteurella multocida разработаны ПЦР-тест-системы на гены: psl (C.W. Lee et al., 2000); kmt (K.M. Townsend et al., 1998); 16S pPHK-23S pPHK (J.K. Miflin et al., 2001), Pm0762 и Pml231 (D.Liu et al., 2004). Для выявления генома Mannheimia haemolytica используют праймеры на гены HP, Lkt, Lkt2, 16S (С. Ewers, 2006; T.W. Alexander et al., 2008).

В доступной отечественной литературе нам удалось найти только одну работу М.А. Шибаева (2009) посвященную разработке тест-системы для выявления бактерий Р. multocida и М. haemolytica с помощью ПЦР в Центральном Федеральном округе (ЦФО) РФ.

з

Таким образом, возникла необходимость разработки новых, более эффективных методов типирования, основанных на выявлении фрагментов генома бактерии Р. тикосЫа и М. \memolytica, в частности, полимеразной цепной реакции, которая позволяет обнаруживать и идентифицировать микроорганизмы непосредственно в пробах биологического материала, смешанных или чистых культурах.

Цель и задачи исследований. Целью работы являлась биологическая характеристика бактерий семейства РахгеигеНасеае, разработка способа их генетической типизации с помощью ДНК-технологий и изучение частоты выявления у крупного рогатого скота в хозяйствах по производству молока при вспышках респираторных болезней.

Для достижения указанной цели были поставлены следующие задачи:

1. Изучить распространение болезней крупного рогатого скота, протекающих с участием бактерий сем. Ра$1еиге11асеае, в молочных хозяйствах Сибири с наличием импортного скота. Изучить основные культурально-морфологические, биохимические и патогенные свойства бактерий, выделенных при вспышках респираторных болезней.

2. Разработать способ генетической типизации бактерий семейства Ра$-ГеигеНасеае на основе мультиплексной ПЦР, определить ее чувствительность и специфичность, а также - влияние сроков хранения проб биоматериала от животных при различных температурах на пригодность к исследованию в ПЦР

3. Провести генотипирование выделенных и охарактеризованных культур бактерий с помощью мультиплексной ПЦР, определить ее эффективность на различных этапах бактериологической диагностики. Изучить частоту выявления различных генотипов бактерий в производственных условиях у больных животных. Определить экономическую эффективность ПЦР.

Научная новизна работы. Установлено широкое распространение болезней КРС, протекающих с участием бактерий сем. Раз(еиге11асеае и их ведущая роль в этиологии массовых респираторных заболеваний телят в хозяйствах Сибири с интенсивным типом ведения молочного животноводства, особенно с наличием завозного скота. При помощи общепринятых методов бактериологической диагностики выделены и охарактеризованы 67 культур бактерий. Разработан метод одновременного выявления и дифференциации геномов пяти серо-типов Р. тикосЫа и М. Иаето1уНса А1 с помощью мультиплексной ПЦР, показана его высокая диагностическая и экономическая эффективность. Определено место ПЦР в системе бактериологической диагностики пастереллезов КРС. Новизной обладают также данные по определению влияния сроков хранения генетического материала бактерий на пригодность к исследованию в ПЦР. Полученные данные свидетельствуют об отсутствии циркуляции бактерий Р. тико-сШа генотипов В, Е и Р среди крупного рогатого скота в Сибири.

Теоретическая и практическая значимость работы. Результаты исследований представляют теоретическую и практическую ценность, так как дают возможность расширить научные знания относительно роли различных генотипов бактерий сем. РазгеигеНасеае в этиологии респираторных болезней КРС на молочных комплексах, особенно с наличием импортного скота. Они могут быть

использованы при дальнейшем изучении эпизоотологии, патогенеза болезней, вызываемых этими бактериями и смешанных вирусно-бактериальных инфекций, протекающих по синергетическому типу. Результаты создают перспективы использования мультиплексной ПЦР для экспресс-диагностики и генотипиро-вания бактерий сем. Ра$1еиге11асеае с целью объективной комплексной оценки эпизоотической ситуации и оптимизации противоэпизоотических мероприятий на крупных молочных комплексах, в том числе - для решения вопроса о специфической профилактике болезней. Кроме того, они расширяют научные знания относительно циркуляции различных генотипов бактерий среди высокопродуктивных животных. Использование мультиплексной ПЦР может быть полезным в дальнейшем при изучении длительности функционирования генов вирулентности бактерий сем. РаБ1еиге11асеае.

Методология и методы исследования. Методологическая основа исследований - анализ и синтез информации по изучению распространения болезней, вызываемых бактериями сем. Раз1еиге11асеае в Сибири, представленной в отечественных и зарубежных источниках литературы, а также полученной в экспериментальных условиях. Для достижения поставленной цели изучены основные культурально-морфологические, биохимические и патогенные свойства бактерий, выделенных при вспышках респираторных болезней, разработан метод генетической типизации культур бактерий сем. Ра$1еиге11асеае, с помощью мультиплексной ПЦР.

В работе использованы следующие методы исследований: бактериологический, молекулярно-генетический.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Результаты изучения распространения болезней крупного рогатого скота, протекающих с участием бактерий сем. Раз1еиге11асеае в хозяйствах региона Сибири с интенсивным типом ведения молочного животноводства, наличием импортного скота и без него, характеристика выделенных культур.

2. Результаты разработки и применения мультиплексной ПЦР в экспериментальных и производственных условиях для изучения частоты выявления и генотипирования бактерий Р. ти1гос1с1а и М. каето1уйса.

Степень достоверности и апробация результатов. Достоверность результатов подтверждается большим объемом исследований, проведенных в динамике с 2010 по 2013 гг., анализом ветеринарной отчетности по регионам Сибири, изучением частоты выявления различных генотипов бактерий в экспериментальных и производственных условиях, а также статистической обработкой полученных цифровых данных.

Материалы диссертационной работы доложены на международных научно-практических конференциях: «Актуальные проблемы современной ветеринарии» (Краснодар, 2011), «Аграрная наука - с.-х. производству Сибири, Монголии, Казахстана и Болгарии» (Петропавловск, 2012), «Научные основы производства и обеспечения качества биологических препаратов для АПК» (Щелково, 2012), «Новейшие направления развития аграрной науки в работах молодых ученых» (Краснообск, 2012) и на международной выставке «Агрорусь 2013» (Санкт-Петербург, 2013).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 9 научных работ, в том числе 3 - в журналах, рекомендованных ВАК Минобрнауки Российской Федерации («Российский ветеринарный журнал», «Сибирский вестник сельскохозяйственной науки»).

Внедрение полученных результатов. Материалы диссертации использованы при разработке методического пособия «Болезни крупного рогатого скота, вызываемые бактериями семейства Раз(еиге11асеае», утвержденного подсекцией «Инфекционная патология животных в регионе Сибири и Дальнего Востока» отделения ветеринарной медицины Россельхозакадемии (протокол № 2 от 22 апреля 2013 г.).

Результаты работы используются в учебном процессе для студентов 45 курсов по специальности «Ветеринария» в ФГОУ ВПО «Красноярский государственный аграрный университет», а также при разработке новых лекций для студентов 2 курса, обучающихся по специальности 110501 - ветеринарно-санитарная экспертиза, направление подготовки 62- бакалавриат в ФГОУ ВПО «Новосибирский государственный аграрный университет», внедрены в практику отдела бактериологии ФГБУ «Новосибирская МВЛ» и использованы при проведении совещаний и семинаров со специалистами Ужурского района Красноярского края.

Структура и объем работы. Диссертация изложена на 134 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, собственных исследований, обсуждения, выводов, практических предложений, списка литературы, списка сокращений и приложения. Работа иллюстрирована 13 рисунками и 15 таблицами. Список литературы включает 294 источника, в том числе 184 зарубежных.

2 СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ 2.1 Материалы и методы

Работа выполнена в 2010-2013 гг. в лаборатории биотехнологии - диагностический центр Государственного научного учреждения Институт экспериментальной ветеринарии Сибири и Дальнего Востока Россельхозакадемии. Отдельные исследования также частично выполнены в рамках соглашения № 8792 между Министерством образования и науки РФ, Россельхозакадемией и ГНУ ИЭВСиДВ Россельхозакадемии о предоставлении гранта в форме субсидии.

При изучении эпизоотической ситуации использовали данные ветеринарной отчетности, материалы диссертационных работ Ю.Н. Зайцева (2007), К.В. Войтовой (2011), а также результаты собственных исследований. Вычисляли средний процент проб, содержащих бактерии или их геномы, от общего количества проб, поступивших из хозяйств с наличием вспышек респираторных болезней.

Штаммы и культуры бактерий. Использовали референтные штаммы: Р. ти1!ос1с1а «1231» (серотип А), «681» (В), «Т80» (О) и М. Иаето1уНса А1 -«16», полученные из коллекции культур микроорганизмов ВИЭВ им. Я.Р. Ко-

валенко (Москва), культуры Р. multocida «СР-57», «АГМ» (серотип А); «JI-33», «К-35» (серотип D), выделенные в ГНУ ИЭВСиДВ Россельхозакадемии, а также 67 культур бактерий, выделенных нами.

При определении специфичности ПЦР использовали культуры бактерий Salmonella typhimurium, Salmonella dublin, а также E.coli, полученные из коллекции культур микроорганизмов ВИЭВ им. Я.Р. Коваленко (Москва).

Искусственные питательные среды. В работе использовали питательный агар для культивирования микроорганизмов (ГРМ-агар), кровяной мясо-пептонный агар (КМПА), агар Хотгингера с добавлением 10% сыворотки крови лошади, набор сред Гисса, содержащих углеводы: глюкозу, сахарозу, лактозу, мальтозу и многоатомный спирт (маннит) производства ФГУН «Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии», г. Обо-ленск.

Пробы биологического материала для исследования отбирали от животных различных половозрастных групп, не подвергавшихся лечению антибактериальными препаратами, не позднее 4 часов после их гибели или вынужденного убоя. Материал замораживали однократно и транспортировали в лабораторию в термосе со льдом в течение 12 часов, не подвергая повторному оттаиванию и замораживанию. В лаборатории проводили бактериологические исследования, патогенность выделенных бактерий определяли на 187 беспородных белых мышах массой 18-20 г.

Праймеры для мультиплексной ПЦР. Поиск синтетических олигонук-леотидных праймеров осуществляли на основе анализа полных геномов штаммов P. multocida «РМ70», HN06, 36950, 3480, Р1059 и М. haemolytica AI, представленных в базе данных GenBank

(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/GenBank/GenBankSearch.html), при помощи пакета программного обеспечения «Lasergen». Полученные последовательности нескольких пар праймеров дополнительно тестировали на специфичность с помощью моделирования ПЦР в программе "Vector NTI Suite" с последовательностями геномов семейств Pasteurellaceae и Enterobacteriaceae из базы данных GenBank.

Химический синтез праймеров осуществляли амидофосфитным методом на автоматическом синтезаторе ASM-102U, концентрацию в маточном растворе определяли спектрометрическим методом.

ПЦР проводили на амплификаторе марки «Терцик». Продукты ПЦР анализировали методом электрофореза в 2% - ном агарозном геле в стандартном Трис-боратном буфере при напряжении 10 В/см. Результаты электрофореза учитывали, просматривая гель в ультрафиолетовом свете с длиной волны 254 нм на приборе «Трансиллюминатор-UVT-l».

Выделение ДНК бактерий проводили при помощи набора «Рибо-преп» (ООО «Интерлабсервис», Москва). Исследовали суспензии внутренних органов животных, выделенных культур бактерий, внутренних органов мышей после постановки биопробы и культур, реизолированных от мышей.

Проверка чувствительности и специфичности ПЦР. Для определения чувствительности реакции контрольный штамм «1231» P. multocida титровали

методом 10-кратных разведений до 10"7 КОЕ/мл, каждое разведение исследовали в ПЦР. Испытания специфичности ПЦР проводили с использованием панели контрольных образцов, предварительно охарактеризованных бактериологическими методами: S. dublin, S. typhimurium, Е. coli, в концентрации!О8 КОЕ/мл.

Для изучения эффективности ПЦР в производственных условиях исследовали 260 проб биоматериала от больных животных из 14 хозяйств трех регионов Сибири, в том числе: 161 пробу легких, 54 - бронхиальных лимфоузлов и 45 — селезенки.

Изучение пригодности выделенных культур бактерий и их ДНК для исследования в ПЦР. Суспензии внутренних органов животных, а также выделенные ДНК хранили при температуре минус 18°С в пластиковых пробирках в течение 6 мес. Культуры бактерий выращивали на агаре Хоттингера с добавлением 10% сыворотки крови лошади и хранили в пробирках при температуре +4°С. Пробы извлекали через каждые 30 дней и исследовали в ПЦР.

Подробные методики исследований приведены по мере изложения материалов собственных исследований в начале соответствующих подразделов.

Математические расчеты. Достоверность результатов подтверждали путем статистической обработки с использованием программы «Microsoft excel», входящей в пакет программ «Microsoft Office 7,0». Экономическую эффективность определяли согласно «Методическим рекомендациям по определению экономической эффективности ветеринарных мероприятий», утвержденным ГУВ МСХ и ПРФ 21.02.1997 г. Для определения эффективности метода ПЦР на различных этапах бактериологической диагностики расчитывали коэффициент (к) совпадения результатов (J.L.FIeiss, 1981).

Личное участие. Работа выполнена соискателем самостоятельно, участие соавторов отражено в совместно изданных научных статьях. Автор выражает глубокую благодарность за помощь в выполнении некоторых разделов диссертации заведующей лабораторией вирусологии ГНУ ИЭВСиДВ Россельхозака-демии, д-ру биол. наук, профессору Т.И. Глотовой, старшему научному сотруднику, канд. биол. наук О.В. Семеновой, старшим научным сотрудникам лаборатории биотехнологии - диагностический центр, канд. ветеринар, наук А.В. Нефедченко и канд. ветеринар, наук К.В. Войтовой. Дизайн праймеров был осуществлен совместно с научным сотрудником ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор» Ро-спотребнадзора А.Н. Шиковым.

2.2 Результаты исследований

2.2.1 Частота выделения бактерий сем. Pasteurellaceae на молочных

комплексах

Исследования проводили в трех регионах Сибири, в два из которых ввозился скот из других стран. Анализ данных ветеринарной отчетности за 20032013 гг. показал, что пастереллез молодняка КРС регистрировался во всех обследованных регионах и чаще протекал в виде эндогенной инфекции (рис. 1),

однако дифференциация выделенных культур бактерий на роды и виды не проводилась.

70%

О 1 '—1—1—■—1—■—"—■—1—■—1 " 1 "

2003 2004 2005 2006 2007 2008 2009 2010 2011 2012 2013

ГОДЫ

Рисунок 1 - Частота выделения бактерий сем. Ра81еиге11асеае при респираторных болезнях КРС в молочных хозяйствах в период с 2003 по 2013 гг. (% положительных проб от числа исследованных)

В 2003-2006 гг. бактерии сем. РаягеигеНасеае выделяли от телят в животноводческих хозяйствах с частотой 30-35% от числа исследованных проб. С 2007 по 2010 гг. отмечали повышение частоты выделения бактерий до 70%, что связано, на наш взгляд, с интенсификацией молочного животноводства и завозом импортного скота в некоторые хозяйства. Начиная с 2011 до 2013 гг. количество положительных проб снизилось с 60,4 до 50,1%.

Наши исследования, проведенные в 2010-2013 гг., показали, что частота выделения бактерий сем. Ра$1еиге11асеае, относящихся к разным родам, между регионами была разной. Так, частота выделения Р. ти1юс!с]а в регионе 1 от животных всех возрастов в среднем составила 56,3%. Ее чаще изолировали от телят до 30 дн. (38,7%) и в возрасте 6-мес. (71,4%), а М. Ъаето1уйса - от взрослых животных (52,4%). Частота выделения бактерий Р. ти1юс1с1а в регионе 2 в среднем составила 60,6%. В возрастной группе телят до 30 дн. эти показатели составили 48,7%, а у телят до 6-мес. - 68,4%. М. каето1уПса также чаще присутствовала в биоматериале от взрослых животных (20,5%) и телят до 30-ти дней (46,3%). В регионе 3 бактерии Р. тикоЫа выделяли только от телят до 6-ти мес. (7,5%), а М. 1шето1уПса - 13,5%.

2.2.2 Культурально-морфологические признаки, биохимические и

патогенные свойства бактерий сем. РаъХеигеИасеае, выделенных от животных при вспышках респираторных болезней на молочных комплексах

Выделенные культуры пастерелл по культурально-морфологическим признакам не различались, окрашивались по Грамму отрицательно, располагались изолированно, реже парами и короткими цепочками. В мазках-отпечатках из органов животных, свежевыделенных агаровых культур, окрашенных по Рома-

новскому-Гимзе, выявляли короткие, эллипсоидные, коккоовоидные палочки с выраженной биполярностью окрашивания. Капсулу обнаруживали у большинства свежевыделенных культур и у всех референтных штаммов Р. тиЫоайа при окрашивании тушью по методу Бурри-Гисса, также встречались и безкапсуль-ные особи, особенно у культур, подвергшихся длительному хранению.

Все выделенные культуры росли одинаково на кровяном и сывороточном агаре. По характеру роста на плотных питательных средах более 70% культур Р. тикос1<]а образовывали обширные студневидные колонии слизистой консистенции (М-формы, мукоидные), а 30% культур образовывали шероховатые колонии (Я-формы).

Культуры Р. тиИоЫс!а существенно не различались по биохимическим свойствам между собой и в сравнении с референтными штаммами. Все они ферментировали глюкозу, сахарозу, мальтозу, многоатомный спирт маннит, не ферментировали лактозу и не вызывали гемолиз эритроцитов на кровяном МПА, что соответствует биохимическим свойствам бактерии Р. тикосИа. Все культуры бактерии ферментировали глюкозу, мальтозу, сахарозу с образованием кислоты без газа, а культуры М. Иаето1уИса ферментировали с образованием пузырьков газа в среде и вызывали гемолиз эритроцитов на кровяном МПА.

При определении патогенности выделенных культур у павших белых мышей регистрировали септико-токсические изменения, протекающие по одному типу, но с разной интенсивностью. Бактерии в основном реизолировали из легких. В мазках-отпечатках из легких, печени и селезенки наблюдали многочисленные очаговые и рассеянные скопления пастерелл.

Более половины (50,9%) выделенных культур Р. ти11ос16а были высоко патогенными, т.к. вызывали гибель белых мышей в течение первых суток после заражения. У культур М. каетсАуйса этот показатель составил 41,5%. К числу слабопатогенных отнесли 38,5% Р. тикоайа и 51,8% М. каето1уйса. Количество непатогенных культур составило 8,9% и 3,9% соответственно.

Возможно, высокая патогенность части культур была обусловлена выделением их из легких больных животных в острой стадии бронхопневмонии, когда у культур бактерий присутствовала капсула и функционировал капсульный ген КгШ. Наличие слабопатогенных (38,5%) и не патогенных культур Р. тикера (10,6%) может быть связано с отсутствием капсулы или выделением других представителей сем. РшеигеЦасеае, циркулирующих среди животных.

2.2.3 Разработка мультиплексной ПЦР для выявления и дифференциации бактерий сем. РаяГеигеНасеае, выделенных от крупного рогатого скота

2.2.3.1 Подбор праймеров для постановки ПЦР

Данный раздел был выполнен совместно с науч. сотр. ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор» Роспотребнадзора А.Н. Шиковым.

Были рассчитаны и синтезированы специфические олигонуклеотидные праймеры для детекции генома бактерий рода Р. тикосгс/а пяти серотипов (А,

В, D, E, F) и М. haemolytica А1 методом мультиплексной ПЦР с электрофорез-ной детекцией продуктов амплификации. Окончательный выбор праймеров основывался на следующих критериях: высокий индекс сходства фрагмента и ДНК различных штаммов бактерий, высокая температура отжига (GC- метод), большая длина консенсусов, отсутствие гетеродуплексов.

Исследование каждой пробы проводили в 2 этапа. В первом этапе использовали видоспецифичные праймеры для выявления Pasteurella multocida (F 266292, R 477-456) размер фрагмента 211 п.н. и капсульных серогрупп: A (F9267-9288 - R9803-9824) размер фрагмента 564 п.н., D (F3306-3328 - R3661-3643 размер фрагмента 355 п.н. и Mannheimia haemolytica (F 312-334, R 438-420) размер фрагмента 126 п.н.

На втором этапе проводили генотипирование серогрупп: В (F12541-12564, R12708-12687) размер фрагмента 167 п.н., F (367п.н. F2885-2905, R3142-3120) размер фрагмента 257 п.н. и Е (F4539-4556, R4896-4872) размер фрагмента 357 п.н.

Режим амплификации, чувствительность и специфичность праймеров. С целью отработки оптимального режима амплификации использовали три различных схемы проведения реакции.

Схема 1. денатурация при 95°С - 5 мин. Далее 35 циклов по схеме: денатурация при 95°С - 60 сек., отжиг при 50°С - 60 сек., синтез при 72°С - 90 сек. Синтез в последнем цикле при 72°С — 5 мин.

Схема 2. денатурация при 95°С - 5 мин. Далее 40 циклов по схеме: денатурация при 95°С - 15 сек., отжиг при 53°С - 20 сек., синтез при 72°С - 40 сек. Синтез в последнем цикле при 72°С — 5 мин.

Схема 3. денатурация при 95°С - 5 мин. Далее 40 циклов по схеме: денатурация при 95°С - 15 сек., отжиг при 57°С - 60 сек., синтез при 72°С - 40 сек. Синтез в последнем цикле при 72°С - 4 мин.

Для повышения чувствительности, специфичности и скорости анализа оптимизировали следующие параметры ПЦР: концентрации dNTP, ионов Mg и праймеров, количество вносимого раствора ДНК, а также использованная ДНК-полимераза. Дополнительно для улучшения визуализации продуктов реакции были повышены в 2 раза концентрации dNTP и праймеров.

Оптимальной оказалась схема 3, в результате которой амплифицирова-лись все контрольные штаммы бактерий и не наблюдалось образования неспецифических продуктов амплификации с отрицательными контролями. Чувствительность выявления P. multocida составила 104 КОЕ/мл, а М. haemolytica -103 КОЕ/мл. Результаты представлены на рисунках 2 и 3.

Таким образом, оптимальный режим времени для проведения ПЦР состоял из следующих циклов: денатурация при 95°С - 5 мин. Далее 40 циклов по схеме: денатурация при 95°С - 15 сек., отжиг при 57°С - 20 сек., синтез при 72°С - 40 сек. Синтез в последнем цикле при 72°С - 5 мин.

564 ггр. А /стр. Г)

Лир.».

м I,.

Рисунок 2 - Электрофореграмма продуктов ПЦР для выявления видов Р. тиНоШа и М. Иаето1уйса и генотипирования Р. тикоЫа серотипов А, Б на первом этапе

Обозначения: 1 и 12 - маркер молекулярного веса 100 Ьр (цифрами обозначены длины ампликонов, п.н.); 2 - Р. тикосШа штамм 681 (серотип В); 3 - Р. тиЫоШа штамм 1231 (се-ротип А); 4- Р. тиЬосШа штамм Т80 (серотип О); 5 - М. Ъаето1уйса штамм 16; 6 - культура Р. тиЫоШа «СР-57» (серотип А); 7 - культура Р. тиПоМа «АГМ» (серотип А); 8 - культура Р. тиЫоаАа «К-35» (серотип О); 9 - культура М. Иаето1уЧса «КБ-52»; 10 - отрицательный контроль ПЦР; 11 - положительный контроль ПЦР.

I Д 3 4 .1 6 7 8 1 10 П 12

ыазыэве з'- - 1. ■

(* ■ ГГ|> г.

£^257 мр. Г р—167 ггр в

Рисунок 3 - Электрофореграмма продуктов ПЦР для генотипирования вида Р. тико&с!а серогрупп В, Е и Р на втором этапе

Обозначения: 1 и 12 - маркер молекулярного веса 100 Ьр (цифрами обозначены длины ампликонов, п.н.); 2 - Р. тиНоЫс1а штамм 681 (серотип В); 3-6 - отрицательные результаты генотипирования выделенных культур Р. тикоШа серотипов В, Е и Е; 7-9 - отрицательные результаты исследования проб от животных на Р. тиНоШа серотипов В, Б и Е; 10 - отрицательный контроль ПЦР; 11 - положительный контроль ПЦР.

2.2.3.2 Влияние сроков хранения культур бактерий и их ДНК на пригодность к исследованию в ПЦР

Результаты показали, что хранение суспензий из внутренних органов животных и выращенных колоний бактерий при температуре минус 18°С обеспечивает сохранность материала в течение 3-6 мес. (срок наблюдения). Наиболее пригодным материалом для исследований в ПЦР оказались пробы легких больных животных.

ДНК, выделенная из легких телят, мышей, суспензии культур, выделенных из этих органов, сохраняла активность в течение 6-ти месяцев. Таким образом, оптимальным режимом хранения выделенной ДНК бактерий рода Рах-1еиге11а является минус 18°С в течение 6 месяцев вне зависимости от вида исследуемого материала.

2.2.3.3 Типирование культур Р. multocida, выделенных от крупного рогатого скота при помощи мультиплексной ПЦР

По результатам ПЦР все исследованные культуры были отнесены к роду Р. multocida. При субгенотипировании 67,2% культур бактерии отнесли к генотипу А, а 26,8% - D; 5,9% культур, выделенных из легких крупного рогатого скота, содержали генетический материал двух генотипов. Среди исследованных культур не выявили генотипы В, Е и F.

Таким образом, типирование в ПЦР по гену Kmt 67 охарактеризованных бактериологическими методами культур бактерии Р. multocida, прошедших не менее 3-4 пассажей на искусственных питательных средах и хранящихся при температуре +4°С подтвердило их родовую принадлежность. Однако исследование в ПЦР тех же культур, прошедших 5-8 и более пассажей на искусственных питательных средах дало отрицательный результат. Возможно, это связано со снижением или утратой функционирования капсульного гена, на который были синтезированы использованные в работе праймеры, что косвенно подтверждается отсутствием или низкой патогенностью 10,9% исследованных культур при заражении белых мышей. Полученные данные могут быть полезными при изучении функционирования генов патогенности бактерий и сохранения вирулентных свойств в лабораторных условиях. В связи с этим для выявления и типирования необходимо исследовать свежие суспензии внутренних органов животных или культуры бактерий на уровне 3-4 пассажей. Наши результаты согласуются с данными Э.А. Шегидевича (1993), показавшего, что длительное пассирование культур пастерелл приводит к потере их вирулентности.

2.2.3.4 Эффективность мультиплексной ПЦР на различных этапах

бактериологической диагностики болезней, вызванных Р. multocida

Теоретически, с помощью ПЦР возможно выявление бактерий сем. Pas-teurellaceae на всех этапах бактериологической диагностики: в суспензии внутренних органов животных и белых мышей, а также культур, выделенных на искусственных питательных средах и реизолированных из органов белых мышей. В связи с этим целью данного раздела было изучение эффективности мультиплексной ПЦР на этапах бактериологической диагностики.

Результаты, представленные на рисунке 4, показали, что при первичном исследовании биоматериала от больных животных в ПЦР выявили в среднем 49,2% положительных проб, а на искусственных питательных средах выделили 60,4% культур (Р> 0,005, к=0,76). От белых мышей реизолировали патогенные культуры бактерии в 52,3% случаев, что было подтверждено повторным исследованием в ПЦР (к=1). Разница между первичным и повторным исследованиями в ПЦР недостоверна (Р> 0,005, к=1).

I l

5 \

Рисунок 4 - Эффективность ГПДР на этапах бактериологической диагностики болезней, вызванных Р. тШосШа

Таким образом, мультиплексная ПЦР, разработанная и апробированная нами, эффективна на всех этапах бактериологической диагностики болезней, вызванных Р. тиПосИа, у крупного рогатого скота.

Разница между количеством выделенных культур и первичными результатами ПЦР составила 11,2%, что можно объяснить ростом авирулентных (без-капсульных) культур бактерий, либо бактерий других родов, но имеющих сходную морфологию и биохимические свойства. Разница между результатами выделения бактерии на искусственных питательных средах и определением па-тогенности на белых мышах составила в среднем 8,1%, что косвенно подтверждает наличие непатогенных бактерий на этапе их выделения на искусственных питательных средах. Разница между первичным и повторным исследованием в ПЦР составила 3,1%, что можно объяснить погрешностью метода, либо техническими причинами.

2.2.4 Частота выявления бактерий сем. РаягеигеНасеае при помощи мультиплексной ПЦР у больных животных в производственных условиях

Целью данного раздела было изучение частоты выявления ДНК бактерий различных генотипов Раз1еиге11а тиИос1с!а и МаппИеШа Иаето1уНса, в пробах биоматериала от больных животных, с помощью мультиплексной ПЦР. Полученные результаты исследований (табл. 1) показали, что у больных животных на молочных комплексах в основном присутствуют два генотипа Р. тиНосШа -АиЭ, а также М. Ъаето1уйса - А1. Геном Р. тикоШа А чаще выявляли у телят до 1 месяца (34,7%) и у телят от 1 до 6 мес. (65,6%), а Р. тиЫоШа О в 4,2 и 7% случаев соответственно. У взрослых животных этот показатель составил 6,6 и 5%, соответственно. М. Иаето1уйса выявляли в пробах биоматериала от 25% взрослых животных, 6,9% телят до 1 месяца и 7% телят от 1 до 6 мес., что свидетельствует об участии данных генотипов бактерий в этиологии респираторных болезней. В пробах от больных животных нам не удалось выявить ДНК бактерий Р. тикера серотипов В, Е и Б.

|б0,4 л| ^ Выявлено ДНК бактерий в П[

■ Выделено культур бактерий н питательных средах

■ Выявлено патогенных культу; бактерий для мышей

Реизолнрованно патогенных i бактерий из внутренних оргаь

МЫШЕЙ

■ Выявлено ДНК бактерий в пр органов мышей

Таблица 1 - Частота выявления ДНК различных генотипов бактерий семейства Ра51еиге11асеае от больных животных с помощью мультиплексной ПЦР

п=260

Половозрастная группа животных Исследовано проб биоматериала Выявлено положительных проб Результаты генотипирования проб/ % выявления

Р. multocida М. haemolytica Al

А D

Телята до 1 месяца 72 33 25/34,7 3/4,2 5/6,9

Телята от 1 до 6 мес. 128 102 84/65,6 9/7 9/7

Нетели, первотелки, коровы 60 22 4/6,6 3/5 15/25

Всего 260 157 113/43,5 15/5,7 29/11,2

Наши результаты согласуются с данными отечественных и зарубежных авторов, о том что Р. multocida А чаще выделятся при респираторных болезнях телят (Э.А. Шегидевич, 1993; М.А. Шибаев, 2009; F.J. Blanco-Viera et al., 1995; С. Ewers et al., 2006; Т. Autio et al., 2007; S. Nikunen et al., 2007).

P. multocida серотипа А присутствовала в 55,2% проб легких, 37% бронхиальных лимфоузлов и иногда в селезенке (8,8%), что может быть связано с септической формой болезни. Геном Р. multocida серотипа D выявляли в легких (7,5%) и лимфоузлах (5,5%). Геном М. haemolytica выявляли в легких - 14,3%, в 11,1% проб бронхиальных лимфатических узлов, с признаками острых респираторных болезней.

2.2.5 Экономическая эффективность мультиплексной ПЦР

Целью настоящего раздела являлось определение экономической эффективности ПЦР в сравнении с традиционным бактериологическим методом. В результате сумма затрат на проведение исследований 10 проб биоматериала методом ПЦР составила: 0,6 + 180 + 200 + 25 + 15 + 3 + 20 + 408,9 = 852,5 руб. Сумма затрат на проведение бактериологических исследований 10 проб составила: 17 + 84 + 600+408,9 = 1109,9 руб.

Таким образом, метод ПЦР при диагностике пастереллезов экономически эффективнее бактериологического метода (1109,9 / 852,5) в 1,3 раза. Данный метод исследований дает возможность проведения экспертизы в течение 2 рабочих дней, а бактериологический - до 5 суток.

Резюмируя полученные данные, можно сделать вывод, что разработанная мультиплексная ПЦР обладает высокой чувствительностью и специфичностью и может эффективно использоваться в комплексе диагностических мероприятий, а также служить основным методом типизации бактерий семейства Pas-teurellaceae.

3 выводы

1. Установлено широкое распространение болезней крупного рогатого скота, протекающих с участием бактерий семейства Ра.ч1еиге11асеае в молочных хозяйствах Сибири. Частота их выделения от больных животных варьировала от 56,3 до 70%. Максимальные показатели частоты выделения бактерий получены при исследовании проб биоматериала из крупных молочных комплексов с интенсивным типом ведения животноводства. Бактериологические исследования не давали возможности генотипической дифференциации возбудителей.

2. При помощи бактериологических исследований установлено, что 50,9% выделенных культур Р. тикос1с1а и 41,5% М. Иаето1уИса были высоко патогенными для белых мышей. К числу слабопатогенных отнесены 38,5% Р. тиИоЫс1а и 51,8% М. 1гаето1уйса. Количество непатогенных культур составило 8,9% и 3,9%, соответственно.

3. Разработан метод мультиплексной ПЦР, позволяющий проводить одновременную идентификацию бактерий родов Раз1еиге11а и МаппИеШа, а также выявлять пять серотипов Р. тиНосйа: А, В, Д Е, Р и основной генотип М. Наето1уйса - А1 в выделенных культурах и пробах биоматериала от больных животных в концентрациях: 104 и 103 КОЕ/мл соответственно. Реакция специфична данным бактериям.

4. ПЦР эффективна на всех этапах бактериологической диагностики болезней, вызванных Р. тиПоЫ<За у крупного рогатого скота. При первичном исследовании биоматериала от больных животных в ПЦР выявляли 49,2% положительных проб, а на искусственных питательных средах 60,4% культур (Р> 0,005, к=0,76). От белых мышей реизолировали патогенные культуры бактерии в 52,3% случаев, что было подтверждено повторным исследованием в ПЦР (к=1). Культуры бактерии сохраняют капсульный ген на протяжении 3-4-х пассажей, а материал, хранящийся при температуре минус 18 градусов пригоден к исследованию в течение 6-ти месяцев.

5. По данным мультиплексной ПЦР преобладающим генотипом Р. тиНоЫс1а, циркулирующим среди крупного рогатого скота на молочных комплексах Сибири, являлся генотип А, выявление которого в среднем составило 43,5%. Геном этого возбудителя присутствовал в пробах от больных телят до 1 месяца (34,7%), телят 1-6 месяцев (65,6%) и взрослых животных (6,6%). Генотип Б выявляли в среднем в 5,7% исследованных проб. Два генотипа бактерии содержали 5,9% проб. Циркуляция генотипов В, Е и Г среди животных обследованных хозяйств не установлена. М. Иаето1уИса выявляли в среднем в 11,2% случаев. Наиболее восприимчивой категорией животных к этому возбудителю являются нетели и первотелки (25%), а также телята 1-6-месячного возраста (6,9-7%% положительных проб).

6. Метод мультиплексной ПЦР экономически целесообразен. Длительность генотипирования 10 проб биоматериала составляла 2 рабочих дня, а для исследования бактериологическими методами требовалось 5 суток. Использо-

вание мультиплексной ПЦР в 1,3 раза эффективнее бактериологического метода, а по срокам постановки превосходит в 2,5 раза.

4 ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

1. В крупных хозяйствах молочного направления во время вспышек респираторных болезней крупного рогатого скота, необходимо проводить комплекс диагностических исследований с целью расшифровки этиологической структуры инфекционной патологии и установления роли генотипов бактерий Р. multocida и М. haemolytica, наличие циркуляции которых необходимо учитывать при разработке противоэпизоотических мероприятий.

2. Для диагностики болезни использовать мультиплексную ПЦР в качестве метода быстрого выявления и типизации бактерий в пробах биоматериала от больных животных, а также культур бактерий, выделенных на искусственных питательных средах.

3. Предложен, комиссионно апробирован, одобрен ученым советом и утвержден директором ГНУ ИЭВСиДВ Россельхозакадемии опытный образец «Тест-системы для выявления и дифференциации бактерий Pasteurella multocida серотипов А, D, В, Е, F и Mannheimia haemolytica AI с помощью мультиплексной ПЦР» (акт комиссионных испытаний от 06.03.2014).

5 СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Глотов, А.Г. Особенности проявления легочного пастереллеза молодняка КРС в хозяйствах по производству молока / А.Г. Глотов, Т.И. Глотова, Т.Е. Терентьева, К.В. Войтова, Ю.Н. Зайцев, В.В. Разумовская,

B.П. Путинцев // Сибирский вестник сельскохозяйственной науки. - № 2. -2012.-С. 55-61.

2. Глотова, Т.И. Пастереллез крупного рогатого скота на молочных комплексах: частота выделения и характеристика культур / Т.И. Глотова, А.Г. Глотов, Т.Е. Терентьева, О.В. Кунгурцева, К.В. Войтова // Российский ветеринарный журнал. Сельскохозяйственные животные. - № 3. - 2012. -

C. 32-35.

3. Глотов, А.Г. Типирование культур бактерий Pasteurella multocida, выделенных от крупного рогатого скота, при помощи ПЦР / А.Г. Глотов, Т.И. Глотова, Т.Е. Терентьева, A.B. Нефедченко // Сибирский вестник сельскохозяйственной науки. - № 2. - 2013. - С. 88-92.

4. Глотова, Т.И. Частота выделения и типизация бактерий сем. Pasteurel-laceae от крупного рогатого скота в Сибири / Т.И. Глотова, А.Г. Глотов, Т.Е. Терентьева, A.B. Нефедченко, О.В. Кунгурцева // Актуальные проблемы современной ветеринарии: матер, международ, науч.-практ. конф. - Краснодар, 2011.-С. 58-59.

5. Глотов, А.Г. Выявление вирусов инфекционного ринотрахеита, вирусной диареи-болезни слизистых оболочек, респираторно-синцитиальной инфек-

ции крупного рогатого скота и бактерий семейства Pasteurellaceae в пробах биоматериала от животных в Сибири / А.Г. Глотов, Т.И. Глотова, A.B. Нефед-ченко, О.В. Семенова, К.В. Войтова, Т.Е. Терентьева // Научные основы производства и обеспечения качества биологических препаратов для АПК: матер, междунар. науч.-практ. конф. - Щелково, 2012. - С. 160-165.

6. Терентьева, Т.Е. Распространение и выделение бактерий сем .Pasteurellaceae от крупного рогатого скота в Сибири / Т.Е. Терентьева, Т.И. Глотова, А.Г. Глотов // Тр. V Междунар. науч.-практ. конф. молодых учёных, посвящ. 10-летию ее проведения. - Краснообск, 2012. - С. 133-135.

7. Нефедченко, A.B. Применение ПЦР для генотипирования бактерии Pasteurella multocida, выделенной от крупного рогатого скота / A.B. Нефедченко, А.Г. Глотов, Т.И. Глотова, Т.Е. Терентьева, А.Н. Шиков, О.В. Семенова, К.В. Войтова, A.A. Никонова // Международный научно-исследовательский журнал. - 2013. - №9 (16). - Ч. 3. - С. 37-39.

8. Терентьева, Т.Е. Выделение бактерий рода Pasteurella от крупного рогатого скота при вспышках респираторных болезней / Т.Е. Терентьева, А.Г. Глотов, Т.И. Глотова // Сб. научных докладов XVI междунар. науч.-практ. конф. «Аграрная наука - сельскохозяйственному производству Монголии, Сибирского региона, Казахстана и Болгарии: матер, междунар. конф. -Уланбаатар 2013.-С. 182-183.

9. Терентьева, Т.Е. Патогенность и генотип культур Pasteurella multocida, выделенных от крупного рогатого скота / Т.Е. Терентьева, Т.И. Глотова, А.Г. Глотов // Агрорусь 2013: сб. междунар. выставки. - Санкт-Петербург, 2013.-С. 107-108.

Подписано в печать 18.05.2014 г. Формат 60 х 84 '/„.

Объем 1,5уч. изд. л.; 1,25 усл. печ. л. Тираж 120 экз. Заказ 34

Отпечатано в типографии «Ареал» 630058, г. Новосибирск, ул. Русская ,41