Диагностика респираторно-синцитиальной инфекции крупного рогатого скота методом полимеразной цепной реакции

Войтова, Ксения Васильевна

Бесплатный автореферат и диссертация по сельскому хозяйству на тему
Диагностика респираторно-синцитиальной инфекции крупного рогатого скота методом полимеразной цепной реакции
ВАК РФ 06.02.02, Кормление сельскохозяйственных животных и технология кормов

Автореферат диссертации по теме "Диагностика респираторно-синцитиальной инфекции крупного рогатого скота методом полимеразной цепной реакции"

На правах рукописи

ВОИТОВА КСЕНИЯ ВАСИЛЬЕВНА

ДИАГНОСТИКА РЕСПИРАТОРНО-СИНЦИТИАЛЬНОЙ ИНФЕКЦИИ КРУПНОЙ^ РОГАТОГО СКОТА МЕТОДОМ ПОЛИМЕРАЗНОЙ ЦЕПНОЙ РЕАКЦИИ

06.02.02 - ветеринарная микробиология,

вирусология, эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата ветеринарных наук

1 2 МАЙ 2011

Новосибирск - 2011

4846487

Работа выполнена в Государственном научном учреждении Институт экспериментальной ветеринарии Сибири и Дальнего Востока Россельхоза-кадемии.

Научный руководитель:

Официальные оппоненты:

доктор ветеринарных наук, профессор Глотов Александр Гаврилович

доктор ветеринарных наук, профессор Храмцов Виктор Викторович,

кандидат ветеринарных наук Зайцев Юрий Николаевич

Ведущая организация:

ГНУ Всероссийский научно-исследовательский институт ветеринарной вирусологии и микробиологии Российской академии сельскохозяйственных наук

Защита состоится 1 г. в » часов на заседании

диссертационного совета Д.006.045.01. при Государственном научном учреждении Институт экспериментальной ветеринарии Сибири и Дальнего Востока Россельхозакадемии по адресу: 630501, Новосибирская область, Новосибирский район, п. Краснообск, ГНУ ИЭВСиДВ, а/я 8, тел/факс (383) 348-44-62.

С диссертацией можно ознакомиться в Сибирской научной сельскохозяйственной библиотеке Россельхозакадемии.

Автореферат разослан (<у/11 г.

Ученый секретарь диссертационного совета

Г.М. Стеблева

у, ВВЕДЕНИЕ

Актуальность темы. Респираторные болезни являются важной причиной экономического ущерба в молочном скотоводстве. Они приводят к падежу или снижению скорости роста животных, затратам на лечение, диагностические и профилактические мероприятия (Н.Н. Крюков и соавт., 1976; В.А. Мищенко и соавт., 2000; Н.Ю. Басова, 2002; О.Г. Петрова и соавт., 2002; К.П. Юров и соавт., 2003; А.Г. Глотов и соавт., 2008; Н.Р. Буду-лов, 2009; D.G. Bryson, 2000; К.А. Brogden et al., 2002).

Одним из этиологических агентов респираторных болезней является респираторно-синцитиальный вирус крупного рогатого скота (РСВ КРС), относящийся к семейству Paramyxoviridae, роду Pneumovirus. Респиратор-но-синцитиальная инфекция крупного рогатого скота (РСИ КРС) регистрируется во всех странах мира с интенсивным типом ведения животноводства (М. Elvander, 1996; L.E. Larsen, 2000; S. Hagglund, 2005; A.F. Antonis et al., 2010; B.W. Brodersen, 2010; C. Luzzago et al., 2010). Первые сообщения о ней в нашей стране относятся к 1975 году (В.В. Гуненков и соавт., 1975). Изучению болезни и разработке средств и методов диагностики были посвящены работы Г.А. Халенева (1976), А.В. Васильева и соавт. (1988), И.Я. Строгановой (1989), Т.М. Кочиш (2004), И.Н. Матвеевой (2008) и других исследователей.

В настоящее время актуальным является изучение эпизоотической ситуации по РСИ КРС в хозяйствах по производству молока, особенно с наличием импортированного скота, а также разработка эффективных методов диагностики болезни с целью совершенствования противоэпизоотических мероприятий.

Вирусологическая диагностика болезни малоэффективна, поэтому преимущество имеют молекулярные методы, в частности, полимеразная цепная реакция (ОТ-ПЦР) (E.J. Dubovi, 1993; J.-F. Valarcher et aL, 2007). Разработка ОТ-ПЦР для выявления РСВ КРС во многих странах началась в конце прошлого столетия. В литературе имеются сообщения о выявлении вируса в пробах биоматериала от больных животных (S. Vilcek et al., 1994; L.E. Larsen et al., 1999; V. Valentova et al., 2003; R.S. Almeida et al., 2005; M. Boxus et al., 2005; J.-F. Valarcher et al, 2007; E. Timsit et al., 2009; O. Angen et al, 2009).

На момент начала наших исследований в РФ законченных разработок в этом направлении не было.

Цель и задачи исследований. Целью работы являлась разработка по-лимеразной цепной реакции для диагностики респираторно-синцитиальной инфекции крупного рогатого скота и изучение ее диагностической и экономической эффективности.

Для достижения указанной цели были поставлены следующие задачи:

1. Изучить распространение респираторно-синцитиальной инфекции крупного рогатого скота в хозяйствах региона Сибири с учетом наличия в

них импортированного и местного скота по результатам серологических исследований;

2. Провести подбор праймеров и оптимальных параметров проведения диагностической ОТ-ПЦР, определить ее чувствительность и специфичность, а также - влияние сроков хранения вируссодержащей суспензии и выделенной РНК вируса при различных температурных режимах на пригодность к исследованию в ОТ-ПЦР;

3. Изучить диагностическую и экономическую эффективность ОТ-ПЦР в производственных условиях, установить частоту выявления PCB в моноварианте и в ассоциациях с бактериями семейства Pasteurellaceae.

Научная новизна. Показано широкое распространение РСИ КРС в хозяйствах региона Сибири с интенсивным типом ведения молочного животноводства. Разработана ОТ-ПЦР с праймерами на ген гликопротеина F, показана ее высокая эффективность при диагностике болезни в производственных условиях. Определены оптимальные сроки хранения вируссодержащей суспензии и выделенной РНК вируса при различных температурных режимах. Изучена частота выявления вируса в моноварианте и в ассоциациях с бактериями семейства Pasteurellaceae.

Теоретическая и практическая значимость работы. Полученные результаты создают перспективы использования ОТ-ПЦР в диагностике РСИ КРС в качестве основного вирусологического метода в комплексе с серологическими исследованиями, что будет способствовать оптимизации противоэпизоотических мероприятий.

Материалы диссертации представляют теоретическую и практическую ценность, так как дают возможность расширить научные знания относительно роли PCB в этиологии респираторных болезней крупного рогатого скота на крупных молочных комплексах. Они могут быть использованы при дальнейшем изучении эпизоотологии, патогенеза РСИ КРС и смешанных вирусно-бактериальных инфекций, протекающих по синергетическому типу.

Внедрение полученных результатов. Материалы диссертации использованы при разработке рекомендаций: «Респираторно-синцитиальная инфекция крупного рогатого скота», утвержденных подсекцией «Инфекционная патология животных в регионе Сибири и Дальнего Востока» отделения ветеринарной медицины Россельхозакадемии (протокол № 1 от 26.01.2010 г.)

Основные положения диссертационной работы использованы при разработке научно-технической документации на «Тест-систему для выявления вируса респираторно-синцитиальной инфекции крупного рогатого скота методом полимеразной цепной реакции» (Свидетельство о Госрегистрации № ПВР-1-8.9/02499).

логических препаратов», Щелково, 2009; II Сибирском ветеринарном конгрессе «Актуальные вопросы ветеринарной медицины», Новосибирск, 2010; XIV международной научно-практической конференции молодых учёных и специалистов «Молодость, талант, знания агропромышленному комплексу России», посвященной 80-летию УГАВМ, Троицк, 2009; VI международной научной конференции молодых ученых, посвященной 40-летию СО Россельхозакадемии, «Новейшие направления развития аграрной науки в работах молодых ученых», Краснообск, 2010; XIII международной научно-практической конференции «Аграрная наука - сельскохозяйственному производству Монголии, Сибири и Казахстана», Новосибирск, 2010; VII всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Молекулярная диагностика-2010», Москва, 2010 г.

Публикация результатов исследований. По теме диссертации опубликовано 10 научных работ, в том числе 3 - в журналах, рекомендованных ВАК Минобразования и науки Российской Федерации («Ветеринария», «Сибирский вестник сельскохозяйственной науки», «Вестник КрасГАУ»).

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 121 странице машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, собственных исследований, обсуждения, выводов, практических предложений, приложения. Работа иллюстрирована одним рисунком и 10 таблицами. Список литературы включает 246 источников, в том числе 188 зарубежных.

Основные положения, выносимые на защиту.

1. Результаты изучения распространения и характер проявления РСИ КРС в хозяйствах региона Сибири с интенсивным типом ведения молочного животноводства с наличием импортного скота и без него;

2. Результаты разработки и изучения эффективности полимеразной цепной реакции (ОТ-ПЦР) для диагностики РСИ КРС в производственных условиях.

2. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.1. Материалы и методы исследований

Работа выполнена в 2008-2011 гг. в лаборатории биотехнологии - диагностический центр ГНУ Институт экспериментальной ветеринарии Сибири и Дальнего Востока Россельхозакадемии.

Изучение эпизоотической ситуации по РСИ КРС в Сибири. В связи с тем, что плановые исследования на вирусные инфекции не предусмотрены нормативной документацией, при изучении распространения РСИ КРС использовали результаты собственных исследований.

Исследовали 538 проб сыворотки крови от телят до 6-месячного возраста, 584 пробы от нетелей, телок и коров. Постановку реакции непрямой гемагглютинации (РНГА) проводили с помощью набора для серодиагно-

стики респираторно-синцитиальной инфекции крупного рогатого скота (ООО «Агровет», Москва).

При изучении распространения болезни использовали серологический метод. Исследовали пробы сыворотки крови, отобранные от животных однократно. Высчитывали средний процент проб, содержащих антитела к вирусу, от числа поступивших из хозяйств с наличием или отсутствием вспышек респираторных болезней.

С целью установления сероконверсии к вирусу, свидетельствующей об его активной циркуляции, исследовали парные пробы сыворотки крови телят, нетелей и коров, отобранные с интервалом 30 дней. Полученные пробы хранили при минус 20°С и исследовали одновременно.

Исследования проводили в 27 хозяйствах трех регионов Сибири: Тюменской и Новосибирской областей и Красноярского края с наличием или отсутствием импортного скота.

Праймеры для ОТ-ПЦР. Поиск праймеров осуществляли на основе анализа полного генома штамма РСВ КРС А51908, представленного в базе данных GenBank (http://www.ncbi.nlrn.nih.gov/GenBank/GenBankSearch.html), при помощи пакета программного обеспечения "Lasergen", Alignment-serves и CLUSTAL. Праймеры для детекции кДНК были выбраны на последовательности района гена гликопротеина F, обладающего высокой консервативностью. Полученные последовательности нескольких пар праймеров дополнительно тестировали на специфичность с помощью моделирования ПЦР в программе "Vector NTI Suite" с последовательностями генома вируса парагриппа-3 (ПГ-3) КРС.

Окончательный выбор праймеров основывался на следующих критериях: высокий индекс сходства фрагмента и РНК различных штаммов вируса РСИ КРС, высокая температура отжига (GC-метод), большая длина консенсусов.

ОТ-ПЦР проводили на амплификаторе марки «Терцик». Продукты ОТ-ПЦР анализировали методом электрофореза в 2%-ном агарозном геле в стандартном Трис-боратном буфере при напряжении 10 В/см. Результаты электрофореза учитывали, просматривая гель в ультрафиолетовом свете с длиной волны 254 нм на приборе «Трансиллюминатор-UVT-l». Положительными считались пробы, дающие полосу фрагмента кДНК, соответствующую 381 п.н. Исследования проводили в трех повторностях.

Штаммы и изоляты вирусов. В работе использовали два штамма РСВ КРС: РС-Б № 3, представленный проф. Красочко П.А., и К-18, выделенный в ГНУ ИЭВСиДВ.

В опытах по изучению специфичности ОТ-ПЦР дополнительно использовали вирус ПГ-3 (штамм ПТК), вирус вирусной диареи-болезни слизистых оболочек (штамм ВК-1), вирус классической чумы свиней (вакцинный штамм), герпесвирус КРС 1-го типа (штамм Оренбург), аденовирус КРС 1 типа (штамм BV-10), риновирус КРС 1-го типа (штамм SD-1), неин-фицированные культуры клеток Vero и ТЭБ.

Выделение РНК и получение кДНК вируса. Выделение РНК вируса осуществляли стандартным способом с использованием коммерческого набора «Рибо-сорб» (ФГУН «Центральный НИИ эпидемиологии» Роспот-ребнадзора). Обратную транскрипцию для получения кДНК проводили при помощи коммерческого набора «Реверта-Ь» производства того же института. В пробирку, содержащую 9,5 мкл реакционной смеси: буфер для ОТ (50 шМ Тп5-НС1 [рН 8.3], 3 мМ М§С12, 75 шМ КС1, 10 мМ ОТТ), 0,1 мМ (ЮТР, 0,1 мкг праймера для ОТ), и 0,5 мкл ревертазы из набора «Реверта-Ь», добавляли 10 мкл РНК-пробы, осторожно перемешивали и помещали в термостат при 37°С на 30 минут. Затем добавляли 20 мкл ДНК-буфера, тщательно перемешивали и использовали для постановки ОТ-ПЦР.

Проверка чувствительности и специфичности ОТ-ПЦР. Для определения чувствительности реакции контрольный штамм вируса РСБ № 3 титровали методом 10-кратных разведений до 10~7 ТЦД50/мл, каждое разведение исследовали в ОТ-ПЦР. Испытания специфичности ОТ-ПЦР проводили с использованием панели контрольных образцов, предварительно охарактеризованных вирусологическими методами.

Для изучения эффективности ОТ-ПЦР в производственных условиях исследовали 273 пробы биоматериала. В том числе: 45 проб носовых выделений, 24 - трахеального и бронхиального экссудатов, 180 - бронхов и легких больных и вынужденно убитых с диагностической целью животных. Пробы биоматериала транспортировали в лабораторию в замороженном состоянии или в транспортной среде в течение не более 24 часов с момента их отбора. При отсутствии возможности доставки проб в течение указанного срока, их замораживали однократно и транспортировали в лабораторию в термосе со льдом.

Пробы органов и тканей перед исследованием растирали в отдельных фарфоровых ступках со стерильным песком, гомогенизировали и готовили 10%-ые суспензии на физиологическом растворе, после чего центрифугировали при 3000 об/мин в течение 15 мин. Полученные суспензии исследовали в ОТ-ПЦР. Смесь переносили в пластиковые пробирки емкостью 1,5 мл, центрифугировали при 3000 об/мин в течение 5 минут. Для выделения РНК использовали 100 мкл осветленного супернатанта. Густые пробы носовых выделений и экссудата разводили стерильным физиологическим раствором (примерно 1:5). Полученную суспензию тщательно перемешивали и центрифугировали при 3000 об/мин в течение 5 минут. Для выделения РНК использовали по 100 мкл осветленного супернатанта.

Изучение влияния сроков хранения при различных температурных режимах на пригодность РНК вируса к исследованию в ОТ-ПЦР. Полученные суспензии внутренних органов, а также выделенной РНК, фасовали в пластиковые пробирки, помещали на длительное хранение при плюс 4°С и минус 18°С. Срок наблюдения составлял 12 месяцев. Через каждые 30 дней пробы извлекали и подвергали исследованию в ОТ-ПЦР.

Бактериологические исследования. Выделение и типизацию бактерий сем. Pasteurellaceae проводили согласно методическим указаниям по лабораторной диагностике пастереллезов животных и птиц (Москва, 1992).

Экономическую эффективность лечебно-профилактических мероприятий определяли согласно методическим рекомендациям по определению экономической эффективности ветеринарных мероприятий, утвержденным ГУВ МСХ и П РФ 21.02.1997 г. Дополнительно использовали методические рекомендации по оценки социально-экономической эффективности применения метода биочип-диагностики во фтизиатрии (Москва, 2009).

Математические расчеты. Достоверность результатов подтверждали путем статистической обработки и определения различий средних значений с помощью критерия Стьюдента. Результаты считали достоверными при Р<0,05. Для обработки полученных данных использовали программу «Microsoft Excel», входящую в пакет программ «Microsoft Office 7.0».

Подробные методики исследований приведены по мере изложения материалов собственных исследований в начале соответствующих подразделов.

Личное участие. Работа выполнена соискателем самостоятельно, участие соавторов отражено в совместно изданных научных статьях. В выполнении отдельных этапов работы принимали участие: д.б.н., профессор Т.И. Глотова, с.н.с. О.В. Кунгурцева, с.н.с., к.в.н. С.В. Котенева и А.В. Нефедченко, которым автор выражает глубокую благодарность.

2.2. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

2.2.1. Распространение и характер проявления РСИ КРС в хозяйствах региона Сибири

Результаты исследований показали, что в настоящее время РСИ КРС имеет широкое распространение в хозяйствах с интенсивным типом ведения животноводства региона Сибири. Однако инфицированность животных по различным административным территориям несколько различается.

Так, серопозитивность животных к вирусу составила в среднем по Тюменской области 66,6%, Новосибирской - 43,8; по Красноярскому краю - 38,4%.

По результатам обследования хозяйств Новосибирской области установили, что у 92,6% телят до 30-дневного возраста отсутствовали колост-ральные антитела к вирусу. Серопозитивность телят 1-6-месячного возраста составила 25,5%, а средние титры антител - 2,1±0,33 lg2, телят от 6 месяцев и старше - 50,0% (2,4±0,67 lg2), телок - 66,7% (5,2±0,14 lg2), а коров и быков - 76,3% (4,5±0,09 lg2). Средние титры антител у животных всех половозрастных групп составили 3,02±0,47 lg2.

Инфицированность животных вирусом была выше в хозяйствах Тюменской области, что, возможно, связано с интенсивным типом ведения

животноводства (с высокой молочной продуктивностью и концентрацией животных на единицу площади) и наличием импортного скота.

Серопозитивность телят до 30 дней составила 45,7%, а величина средних титров антител - 1,9±0,42 телят 1-6-месячного возраста - 29,9% (1,81±0,06 телок - 100% (5,4±0,43 1д2), нетелей - 82,6% (5,1 ±0,02 коров и быков - 86,7% (4,8±0,19 1§2). Величина средних титров антител у животных всех половозрастных групп составила 3,8±0,43

Более высокая инфицированность животных этого региона связана, вероятно, с более активной циркуляцией вируса среди телок и нетелей, завезенных в хозяйства по импорту (телки - 5,4±0,43 нетели -5,1±0,02 1&).

Особый интерес представляли три крупных хозяйства Красноярского края, куда не было ввоза импортного скота. Серопозитивность животных всех обследованных категорий составила в среднем 38,4%. В том числе: телят до 30 дней - 34,6% с величиной средних титров антител -2,5±0,72 1&, телят 1-6-месячного возраста 20,4% (1,5±0,03 lg2). Установлено, что 35,5% телят до 30 дней не имели колостральных антител. Серопозитивность коров составила 75%, однако титры антител к вирусу у них достигали значений 7,4±0,21 \%г, что было выше, чем у животных этой категории в хозяйствах Новосибирской и Тюменской областей (4,5±0,09 и 4,8±0,19 1§2 соответственно). Разница достоверна при Р<0,05.

Титры антител к вирусу у телят до одного месяца были также выше (2,5±0,72 1§2), чем у животных этих областей (0,9±0,57 и 1,9±0,42 соответственно). Это можно объяснить тем, что на момент исследований в данных хозяйствах регистрировали вспышки респираторных болезней среди телят до 6-месячного возраста и коров.

Таким образом, уровень серопозитивности к вирусу повышался с возрастом животных, а титры антител достоверно повышались к 12-ти месяцам и старше. Высокие титры антител к вирусу у коров, вероятно, являлись следствием его активной циркуляции среди этой категории животных, являющейся источником возбудителя для неимунных телят.

Сероконверсию (4 - 32-кратное повышение титров антител) к вирусу чаще выявляли у телят в возрасте 4-6 месяцев и коров. Однако уровень сероконверсии к вирусу РСИ в хозяйствах с наличием импортного скота был более высоким (до 256-кратного).

Течение болезни и характер клинических признаков условно разделили на три формы.

Первая - сверхострая форма инфекции характеризовалась угнетением животного, повышением температуры тела до 42°С, снижением молочной продуктивности у коров, выделением обильной пены из ротовой полости, хрипами, кашлем, конъюнктивитами и высокой летальностью.

На вскрытии регистрировали интерстициальную пневмонию вплоть до полного разрушения паренхимы, бронхиты, увеличение и геморрагическое воспаление легочных лимфоузлов и легочную или бронхиальную эмфизе-

му. Гибель животных наступала в течение нескольких дней, несмотря на проводимое лечение.

Вторая - острая форма, при которой у животных регистрировали бронхиты и интерстициальную бронхопневмонию. При всех клинических формах течение болезни осложнялось развитием вторичной микрофлоры (пастереллез) с выделением из легких павших и вынужденно убитых животных всех возрастов Mannheimia haemolytica и Pasteurella multocida. На вскрытии выявляли петехиальные кровоизлияния на миокарде и фибринозную бронхопневмонию.

В третьем случае болезнь у животных протекала субклинически.

В некоторых хозяйствах, неблагополучных по бронхопневмониям, произошло наслоение РСИ на хроническое течение сальмонеллеза и дип-лококковой септицемии у телят. Кроме этого у коров и телят регистрировали инфекционный ринотрахеит и вирусную диарею-болезнь слизистых оболочек, что было подтверждено вирусологическими и ретроспективными серологическими исследованиями. Однако уровень сероконверсии к вирусу РСИ в хозяйствах с наличием импортного скота был очень высоким (до 128-кратного), что на наш взгляд, свидетельствует о его ведущей роли в этиологии массовых вспышек респираторных болезней.

Таким образом, респираторно-синцитиальная инфекция крупного рогатого скота широко распространена в Сибири и носит энзоотический характер. На характер эпизоотической ситуации и проявления клинических признаков болезни влияет интенсификация молочного животноводства, концентрация животных на ограниченных территориях. Огромное значение имеет ввод новых животных в стадо, особенно поступающих по импорту. В крупных хозяйствах циркуляция вируса может быть непрерывной за счет транзитной инфекции у коров и телят, что обеспечивает постоянный риск возникновения повторных вспышек болезни.

2.2.2. Разработка ОТ-ПЦР для диагностики РСИ КРС

2.2.2.1. Подбор праймеров для постановки ПЦР

Для создания диагностической тест-системы осуществляли подбор специфических олигонуклеотидных праймеров, поиск которых проводили на основе анализа полного генома штамма вируса А51908, представленного в базе данных GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/GenBank/GenBank-Search.html). Праймеры для детекции кДНК были выбраны на последовательности района гена гликопротеина F. Полученные последовательности нескольких пар праймеров дополнительно тестировали на специфичность с помощью моделирования ПЦР в программе "Vector NTI Suite".

В результате были синтезированы олигонуклеотидные праймеры, комплементарные нуклеотидной последовательности 6308 - 6689 и 6309 — 6329 соответственно и фланкирующие последовательность гена гликопро-теина Б размером 381 пар оснований (и.о.).

2.2.2.2. Компоненты ПЦР

Реакционная смесь для проведения ПЦР содержит в 20 мкл: 2,5 мкл буфера для Тая ДНК-полимеразы (60 мМ Тпз-Нс1 (рН 8,5 при 25°С), 1,5 мМ 1^С12; 25 мМ КС1; Ю мМ 2-меркаптэтанола, 0,1% Тритон Х-100); 2,5 мкл 2,5мМ dNTP (смеси дезоксинуклеозидтрифосфатов); по 5 мкл каждого праймера с концентрацией 1мМ; 1,25 ед. активности термостабильной Тая ДНК-полимеразы; оставшийся объем занимает деионизованная вода. В смесь вносили кДНК в объеме 5 мкл. Поверх смеси наслаивали 2 капли минерального масла. Все манипуляции по приготовлению реакционной смеси осуществляли на тающем льду.

2.2.2.3. Отработка оптимального режима амплификации и проверка чувствительности ПЦР

С целью отработки оптимального режима амплификации в ПЦР рассматривали три различные схемы ее проведения. В качестве матрицы использовали штамм «РСБ №3» в разведениях 10"' - 10~7.

Схема 1.: денатурация при 95°С - 30 сек., отжиг при 60°С - 15 сек., синтез при 72°С - 45 сек. Далее 35 циклов по схеме: денатурация при 95°С - 30 сек., отжиг при 60°С - 15 сек., синтез при 72°С - 45 сек. Синтез в последнем цикле при 72°С - 2 минуты. В результате проведенной реакции все разведения вируса дали отрицательный результат.

Схема 2.: денатурация при 95°С - 30 сек., отжиг при 60°С - 30 сек., синтез при 72°С - 45 сек. Далее 40 циклов по схеме: денатурация при 95°С - 30 сек., отжиг при 60°С - 30 сек., синтез при 72°С - 45 сек. Синтез в последнем цикле при 72°С - 2 минуты. Чувствительность ОТ-ПЦР при данной схеме составила Ю^Ти^о/щ,.

Схема 3.: денатурация при 95°С - 30 сек., отжиг при 60°С - 30 сек., синтез при 72°С - 45 сек. Далее 35 циклов по схеме: денатурация при 95°С -30 сек., отжиг при 60°С — 30 сек., синтез при 72°С - 45 сек. Синтез в последнем цикле при 72°С - 2 минуты. В данном случае чувствительность составила 10"5 ТЦД50/ИЛ. Результаты исследований представлены в таблице 1.

Таблица 1 - Чувствительность ОТ-ПЦР с праймерами на ген гликопротеина Р

Результаты исследований в ОТ-ПЦР

Схема Разведения вируса, ТЦЦ 5(Уш1

10"' Ю~2 10"* 10" 10^ 10-'

1 - - - - - - -

2 + - - - - - -

3 + + + + + - -

Примечание: «+» - положительная проба; «-» - отрицательная проба.

Результаты показали, что наиболее оптимальным режимом проведения ОТ-ПЦР является схема № 3, обеспечивающая выявления РНК вируса в пределах разведения 1(Г5ТЦ Д5о/мл.

Таким образом, нами был отработан оптимальный режим времени для проведения ПЦР, состоящий из следующих циклов: денатурация при 95°С -30 сек., отжиг при 60°С - 30 сек, синтез при 72°С - 45 сек. Далее 35 циклов по схеме: денатурация при 95°С - 30 сек, отжиг при 60°С - 30 сек, синтез при 72°С - 45 сек. Синтез в последнем цикле при 72°С - 2 минуты.

2.2.2.4. Определение специфичности ОТ-ПЦР

Испытания специфичности ОТ-ПЦР проводили с использованием панели контрольных образцов, предварительно охарактеризованных вирусологическими методами. Результаты представлены в таблице 2.

Таблица 2 - Оценка специфичности ОТ-ПЦР для выявления респираторно-синци-тиального вируса крупного рогатого скота

Вирус (штамм, изолят) Результаты ПЦР

Респираторно-синцитиальный вирус КРС (РСБ № 3) +

Респираторно-синцитиальный вирус КРС (изолят К-18) +

Вирус ПГ-3 КРС (ПТК) -

Вирус ВД-БС КРС (ВК-1) -

Вирус классической чумы свиней (вакцинный штамм) -

Герпесвирус КРС 1-го типа (Оренбург) -

Аденовирус КРС 1 типа (BV-10) -

Риновирус КРС 1-го типа (SD-1) -

Неинфицированная культура клеток Vero -

Неинфицированная культура клеток ТЭБ -

Примечание: «+» - положительный результат,«-» - отрицательный результат.

Из данных таблицы 2 видно, что при проведении ОТ-ПЦР на матрице РНК близкородственного вируса ПГ-3 КРС, вирусов вирусной диареи, классической чумы свиней, инфекционного ринотрахеита, адено- и рино-вирусов, а также - нуклеиновых кислот, выделенных из неинфицирован-ных культур клеток Vero и ТЭБ, получены отрицательные результаты. Они подтверждают высокую специфичность реакции.

2.2.2.5. Влияние сроков хранения при различных температурных режимах на пригодность РНК вируса к исследованию в ОТ-ПЦР

Результаты проведенных исследований показали, что хранение ви-руссодержащих суспензий при минус 18°С обеспечивает сохранность материала, полученного из слизистой оболочки трахеи в течение двух месяцев, носовых выделений и бронхов - 4-х, бронхиального экссудата - 6-ти, а легких - 12 месяцев. Оптимальным режимом хранения выделенной РНК вируса является минус 18°С в течение 2-10 месяцев, в зависимости от вида исследуемого материала. Наиболее пригодным материалом для ис-

следований в ОТ-ПЦР являются пробы легких, бронхиального экссудата и бронхов.

2.2.3. Эффективность ОТ-ПЦР в производственных условиях

2.2.3.1. Частота выявления РНК вируса из проб биоматериала от животных при вспышках респираторных болезней

Целью данного раздела было изучение эффективности ОТ-ПЦР в производственных условиях при вспышках массовых респираторных болезней. Результаты исследования представлены в таблице 3.

Таблица 3 — Результаты выявления вируса РСИ КРС методом ПЦР в пробах биоматериала различного происхождения

№ п/п Вид биоматериала Количество исследованных проб Количество положительных проб Процент положительных проб от числа исследованных

1 Легкие 171 29 20

2 Лимфатические узлы 10 2 20

3 Носовые выделения 45 6 13,3

4 Экссудат из трахеи, бронхов, носовых синусов 24 11 45,8

5 Слизистая оболочка трахеи и бронхов 14 2 14,3

6 Бронхи 9 3 33,3

Всего: 273 51 19,4

Из данных таблицы 3 видно, что вирус чаще выявляли в пробах трахе-ального и бронхиального экссудатов (45,8%), бронхов (33,3%), легких и легочных лимфатических узлов (20%), слизистой трахеи и бронхов (14,3%), носовых выделений (13,3%) животных с наличием признаков острых респираторных болезней. Наиболее достоверное выявление генома вируса было при условии отбора проб биоматериала на ранних стадиях развития респираторных болезней и транспортировки их в лабораторию не дольше 24 часов с однократной заморозкой и оттаиванием, либо в контейнерах с транспортной средой в охлажденном виде.

2.2.3.2. Частота выявления РНК вируса у животных различных половозрастных групп

Исследовали 66 проб, полученных от телят до 1 месячного возраста, 137 - от телят в возрасте от 1-го до 6-ти месяцев, 3 - от телок, 5 - от нетелей и 62 - от коров. Результаты исследований представлены в таблице 4.

Таблица 4 - Частота выявления РСВ КРС у животных различных половозрастных ГРУ"П____

Половозрастная группа животных Количество исследованных проб биоматериала Выявлено положительных проб Процент положительных проб от числа исследованных

Телята от 10 дней до 1 месяца 66 3 4,5

Телята от 1 мес. до 6 мес. 137 27 19,7

Телки 3 0 0

Нетели 5 2 40,0

Коровы 62 10 16,1

Всего: 273 42 15,4

Из представленных данных видно, что наиболее часто вирус выявляли у телят до 6-месячного (19,7%), затем у коров при наличии признаков острых респираторных заболеваний, эмфизематозных поражений легких и интерстициальной бронхопневмонии (16,1%) и телят до 10-дневного возраста (4,5%), что свидетельствует об их восприимчивости к инфицированию вирусом.

Таким образом, к инфицированию вирусом восприимчивы все категории животных, однако его чаще выявляли у телят до 6-месячного возраста и коров. Наличие генома вируса в пробах биоматериала от телят до 10-дневного возраста свидетельствует, по нашему мнению, о вовлечении в эпизоотический процесс этой категории животных.

Вирус также обнаруживали у нетелей (40%). Однако незначительное количество проб биоматериала от них не позволяет достоверно судить о вовлечении этой категории животных в эпизоотический процесс.

2.2.3.3. Частота выявления генома РСВ КРС и бактерий семейства Pasteurellaceae в пробах биоматериала от больных и инфицированных животных

Важным аспектом патогенеза болезни является подавление неспецифических механизмов иммунной защиты респираторного тракта, а также инициация и усиление бактериальной колонизации легких после первичного размножения возбудителя (A.F.S. Antonis et al., 2003; S.J. Fach et al., 2010). Вирус может вызывать бронхиты, пневмонии и эмфиземы легких самостоятельно, но главным его свойством является иммуносупрессия и формирование предрасположенности к возникновению бактериальных пневмоний, в частности, легочного пастереллеза (Э.А. Шегидевич, 1984; A.M. Al Darraji et al., 1982; L.A. Babiuk et al., 1988; L.E. Larsen et al., 1999; L. Liu et al., 1999).

Целью наших исследований было изучение частоты выявления вируса в ассоциации с бактериями семейства Pasteurellaceae в пробах биоматериа-

ла от животных различных половозрастных групп при вспышках массовых респираторных болезней в хозяйствах региона Сибири. Диагноз на пасте-реллез подтверждался в лаборатории биотехнологии-диагностический центр, а также в Тюменской областной и Красноярской краевой ветеринарных лабораториях.

Результаты представлены в таблице 5.

Таблица 5 — Частота выявления РСВ КРС и бактерий семейства Рах1еиге!!асеае в пробах биоматериала от животных

п = 273

Вид возбудителя Выявлено положительных проб/% выявления Новосибирская область (15 хозяйств) Тюменская область (9 хозяйств) Красноярский край (3 хозяйства)

PCB КРС в 40/14,7 25/9,2 14/5,1 1/0,4

моновариаите

Pasteurellacae: 56/20,5 31/11,3 18/6,6 7/2,6

Р. multocida 25 /9,2 21/7,7 4/1,5 -

М. haemolytica 31/11,4 10/3,7 14/5,1 7/2,6

PCB + 27/9,9 5/1,8 21/7,7 1/0,4

Pasteurellacae:

Р. multocida 9/3,3 2/0,7 6/2,2 1/0,4

М. haemolytica 18/6,6 3/1,1 15/5,5

Всего проб: 273 123/45,1 61/22,3 53/19,4 9/3,3

Из представленных данных видно, что PCB КРС в моноварианте присутствовал в 40 (14,7%) пробах, полученных от больных животных из 27 хозяйств региона Сибири. Из них количество положительных проб составило по Новосибирской области 25 (9,2%), Тюменской области 14 (5,1%) и Красноярскому краю 1 (0,4%).

Выделение культур семейства Pasteurellacae в моноварианте составило 20,5% (56 проб), из них по Новосибирской области 11,3% (31 проба), Тюменской - 6,6 (18), Красноярскому краю - 2,6% (7 проб). Pasteurellae multocida присутствовала в 9,2% исследованных проб биоматериала, а Mannheimia haemolytica - 11,4%.

Выделение трех возбудителей в одной пробе биоматериала составило 9,9% от числа исследованных. Из них по Новосибирской области этот показатель составил 1,8%, Тюменской - 7,7 и Красноярскому краю -0,4%.

Более высокая частота выделения бактерий семейства Pasteurellacae в моноварианте (20,5%), чем PCB КРС (14,7%), на наш взгляд, связана с тем, что причиной возникновения вспышек «вторичного» пас-тереллеза в хозяйствах могли быть вирусы: прагриппа-3, инфекционного ринотрахеита, вирусной диареи-болезни слизистых оболочек, а также другие факторы, понижающие резистентность респираторного тракта

животных (стрессы, неудовлетворительные условия кормления и содержания животных).

Кроме этого большое значение может иметь несоблюдение правил отбора и транспортировки проб биоматериала в лабораторию, приводящее к инактивации вируса и получению ложноотрицательных результатов исследований. Поэтому истинную роль РСВ КРС в возникновении массовых вспышек респираторных болезней, в частности, пастереллеза крупного рогатого скота установить сложно.

2.2.3.4. Экономическая эффективность ОТ-ПЦР

Результаты наших исследований свидетельствуют о том, что ОТ-ПЦР, позволяет эффективно выявлять геном вируса в пробах биоматериала различного происхождения от больных и инфицированных животных.

В отличие от большинства вирусных инфекций выделение РСВ КРС в культурах клеток не является стандартной лабораторной процедурой. Поэтому ОТ-ПЦР наиболее пригодна для диагностики болезни.

В связи с этим целью настоящего раздела являлось определение экономической эффективности ОТ-ПЦР в сравнении с выделением вируса в культуре клеток, осуществляемым микрометодом.

Экономический анализ эффективности метода ПЦР в условиях диагностической лаборатории заключался в сравнительной оценке эффективности и требуемых денежных затрат на его проведение при сопоставлении с микрометодом выделения вируса в культуре клеток.

При подсчете принимали во внимание прямые затраты.

Составляющие прямых затрат при постановке ОТ-ПЦР:

1. расходы на синтез олигонуклеотидных праймеров (0,6 рубЛО проб);

2. расходы на приобретение набора для выделения РНК (180 рубЛО проб);

3. набор для проведения обратной транскрипции (ОТ) (180 руб./10 проб);

4. пластик (наконечники, пробирки типа Эппендорф, ПЦР-пробирки) 200 руб./10 проб;

5. tag-ДНК полимераза (17,5 руб./10 проб);

6. dNTP(15py6./10npo6);

7. агароза для электрофореза (3 руб./10 проб);

8. буферный раствор (20 руб./10 проб);

9. затраты рабочего времени на постановку реакции на 10 проб - 4 часа;

10. заработная плата с начислениями основных исполнителей (старший научный сотрудник - 11160 руб./мес., лаборант-исследователь -5196 руб./мес.).

При расчете брали 20 рабочих дней в мес., продолжительность работы - 8 часов. Итого 160 час.

11160 руб. за 160 час., а за 4 час. - 279 руб.

5196 руб. за 160 час., а за 4 час. - 129,9 руб.

Итого: 279 + 129,9 = 408,9 руб.

Сумма затрат на проведение исследований 10 проб составила:

0.6.+ 180 + 180 + 200 + 17,5 + 15 + 3 + 20 + 408,9 = 1025 руб.

Составляющие прямых затрат при выделении вируса в культуре клеток:

1. расходы на приобретение питательных сред и растворов (Версена, глютамина, трипсина) - 3600 руб./10 проб;

2. расходы на приобретение эмбриональной сыворотки - 300 руб./10 проб;

3. пластик (культуральные матрасы, планшеты 24-луночные, наконечники, фильтры) - 150 руб./10 проб;

4. расходы на получение специфической гипериммунной сыворотки крови - 300 руб./10 проб;

5. расходы на приобретение жидкого азота - 10 руб./10 проб;

6. Затраты рабочего времени на исследование 10 проб биоматериала -36 час.

7. заработная плата с начислениями основных исполнителей (старший научный сотрудник - 11160 руб./мес., лаборант-исследователь - 5196 руб./мес.).

При расчете брали 20 рабочих дней в мес., продолжительность работы - 8 часов. Итого 160 час.

11160 руб. за 160 час., а за 36 час. -2511 руб.

5196 руб. за 160 час., а за 36 час, - 1169,1 руб.

Итого: 2511+1169,1 =3680,1 руб.

Сумма затрат на проведение исследований 10 проб составила:

3600 + 300 + 150 + 300 + 10 + 3680,1 = 8040,1 руб.

Метод ОТ-ПЦР при диагностике РСИ КРС экономически эффективнее микрометода выделения вируса в культуре клеток (8040,1/ 1025) в 7,8 раза.

Данный метод дает возможность проведения анализа в течение 2 суток, а метод выделения вируса в культуре клеток занимает от 45 до 75 суток и более. Поэтому ОТ-ПЦР по срокам проведения в 22,5 — 37,5 раз быстрее.

Резюмируя полученные данные, можно сделать вывод, что разработанная и апробированная нами ОТ-ПЦР с праймерами на ген гликопро-теина F респираторно-синцитиального вируса крупного рогатого скота обладает высокой чувствительностью и специфичностью и может эффективно использоваться в комплексе диагностических мероприятий, а также служить основным вирусологическим методом диагностики болезни у животных различных половозрастных групп.

3. ВЫВОДЫ

1. Респираторно-синцитиальная инфекция крупного рогатого скота широко распространена в молочных хозяйствах Сибири и носит энзоотический характер. Серопозитивность животных к вирусу в среднем по трем административным территориям находилась в пределах 38,4-66,6%. У взрослого скота она достигала 76,3-86,7%, а у молодняка до 6 месяцев 20,4- 29,9%. В среднем у 54,3-92,6% телят до 30 дней отсутствовали коло-

стральные антитела к вирусу. Титры антител у телят достоверно повышались к возрасту 12 месяцев и старше, свидетельствуя о переболевании в возрасте 4-10 месяцев.

2. Средние титры антител к вирусу у животных в хозяйствах с наличием импортированного скота были выше, чем у животных без него. В период вспышек болезни циркуляция вируса среди животных разных половозрастных групп происходила более активно, особенно среди нетелей, завезенных по импорту, и коров (нетели - 5,4±0,43 lg2; коровы - 5,1±0,02 lg2). При вспышках болезни сероконверсию к вирусу чаще выявляли у телят в возрасте 4-6 месяцев и коров (4 - 32 кратное повышение титров антител). Уровень сероконверсии к вирусу РСИ в хозяйствах с наличием импортного скота был более высоким (до 256-кратного).

3. Диагностическая ОТ-ПЦР с праймерами, комплементарными последовательностям высоко консервативного гена гликопротеина F PCB КРС, обладала высокой чувствительностью и специфичностью. Она достоверно выявляла РНК исследованных штаммов вируса. В результате амплификации кДНК вируса синтезировался фрагмент 381 п.о. Чувствительность реакции составила 10 5 ТЦД50/МЛ Выделенная РНК, используемая в качестве положительного контроля ОТ-ПЦР, сохраняла свою активность в течение 2-10 месяцев при минус 18°С.

4. Методом ОТ-ПЦР установлено, что к инфицированию вирусом восприимчивы все половозрастные группы животных. В среднем вирус присутствовал в 15,4% исследованных проб биоматериала, полученных от крупного рогатого скота при вспышках болезни. Частота выявления генома вируса от телят до 6-месячного возраста составила 19,7%, а от коров 16,1% при наличии признаков острых респираторных заболеваний, эмфизематозных поражений легких и интерстициальной бронхопневмонии. Выявление генома вируса в 4,5% проб биоматериала от телят до 10-дневного возраста свидетельствовало о вовлечении их в эпизоотический процесс.

5. Вирус чаще выявляли в пробах трахеального и бронхиального экссудатов (45,8%), бронхов (33,3%), легких (20,0%), легочных лимфатических узлов (20,0%), слизистой трахеи и бронхов (14,3%), носовых выделений (13,3%) животных с наличием признаков острых респираторных болезней. Наиболее достоверное выявление генома вируса в пробах биоматериала происходило при их отборе на ранних стадиях развития респираторных болезней и транспортировке в лабораторию не дольше 24 часов с однократной заморозкой и оттаиванием, либо в контейнерах с транспортной средой в охлажденном виде.

6. PCB КРС в моноварианте присутствовал в 14,6%, Pasteurella multo-cida - в 9,2, а Mannheimia haemolytica - в 11,4% проб биоматериала от больных животных. Одновременное выделение трех возбудителей в одной пробе было равным 9,9%.

7. ОТ-ПЦР экономически эффективнее микрометода выделения вируса в культуре клеток в 7,8 раза, а по срокам постановки в 22,5-37,5 раза. Вре-

мя исследования 50 проб биоматериала составляло 48 часов, что по срокам постановки превосходило традиционный метод выделения вируса в 37,5 раз (45-75 суток и более).

4. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

1. В крупных хозяйствах молочного направления, неблагополучных по респираторным болезням крупного рогатого скота, необходимо проводить диагностические исследования с целью установления этиологической роли респираторно-синцитиального вируса согласно методическим рекомендациям «Респираторно-синцитиальная инфекция крупного рогатого скота», утвержденным подсекцией «Инфекционная патология животных в регионе Сибири и Дальнего Востока» отделения ветеринарной медицины Россель-хозакадемии (протокол № 1 от 26.01.2010 г.);

2. Для диагностики болезни использовать «Тест-систему для выявления вируса респираторно-синцитиальной инфекции крупного рогатого скота методом полимеразной цепной реакции» (Свидетельство о Госрегистрации № ПВР-1-8.9/02499) в комплексе с серологическими методами исследований.

5. СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Глотов, А.Г. Особенности эпизоотической ситуации по респираторно-синцитиальной инфекции крупного рогатого скота в хозяйствах по производству молока / А.Г. Глотов, Т.И. Глотова, C.B. Котенева, A.B. Нефедчеико, К.В. Войтова // Ветеринария. - 2010. - № 7. - С. 21-25.

2. Глотова, Т.И. Выделение и тииирование респираторно-синцитиального вируса крупного рогатого при помощи скота ОТ-ПЦР / Т.И. Глотова, О.В. Кунгурцева, А.Г. Глотов, И.Я. Строганова, К.В. Войтова, Т.В. Гальнбек // Сибирский вестник сельскохозяйственной науки. - 2010. - № 10 (214). - С. 5964.

3. Строганова, И.Я. Методы обнаружения и идентификации респиратор-но-синцитиального вируса крупного рогатого скота в культуре клеток / И.Я. Строганова, К.В. Войтова // Вестник КрасГАУ. - 2011. - № 3. - С. 128-133.

4. Войтова, К.В. Распространение РСИ КРС в молочно-товарных хозяйствах / К.В. Войтова, A.B. Нефедченко, C.B. Котенева, Т.И. Глотова, И.Я. Строганова, А.Г. Глотов// Научные основы производства биологических препаратов: материалы междунар. науч.-практ. конф., посвящ. 40-летию института (Щелково, 9-10 декабря, 2009), ВНИиТИБП - Щелково, 2009. - С. 242-245.

5. Глотов, А.Г. Выделение вируса респираторно-синцитиальной инфекции из проб биоматериала / А.Г. Глотов, К.В. Войтова, C.B. Котенева // Молодость, талант, знания агропромышленному комплексу России: материалы XIV междунар. науч.-практ, конф. молодых учёных и специалистов, посвящ. 80-летию академии: -Троицк, 2009.-С. 25-27.

6. Глотов, А.Г. Влияние условий хранения биоматериала на результаты ПЦР при респираторно-синцитиальной инфекции крупного рогатого скота / А.Г. Глотов,

C.B. Котенева, K.B. Войтова // Актуальные вопросы ветеринарии: материалы II Сибирского ветеринарного конгресса (25-26 февраля 2010). - Новосибирск, 2010. -С. 311-312.

7. Войтова, К.В. Частота выявления вируса респираторно-синцитиальной инфекции крупного рогатого скота в пробах биоматериала от крупного рогатого скота методом ПЦР / К.В. Войтова, А.Г. Глотов // Новейшие направления развития аграрной науки в работах молодых учёных: тр. IV междунар. науч. конф. молодых учёных (пос. Краснообск 22-23 апреля 2010). - Новосибирск, 2010. - С. 34-37.

8. Глотов, А.Г. Особенности диагностики респираторных болезней крупного рогатого скота, вызываемых РНК-содержащими вирусами / А.Г. Глотов, Т.Н. Глотова, К.В. Войтова, И.Я. Строганова // Аграрная наука - сельскохозяйственному производству Монголии, Сибири и Казахстана: XIII междунар. науч.-практ. конф. {Улаанбаатар, 6-7 июня 2010). - Новосибирск, 2010. - С. 85-90.

9. Глотов, А.Г. Использование ПЦР для индикации респираторно-сшщи-тиалыюго вируса крупного рогатого скота / А.Г. Глотов, Т.И. Глотова, К.В. Войтова, И.Я. Строганова И Там же. - С. 91-93.

10. Войтова, К.В. Применение метода ПЦР для изучения распространения рес-пираторно-синцитиапьной инфекции крупного рогатого скота в животноводческих хозяйствах Сибири / К.В. Войтова, Т.И. Глотова, И.Я. Строганова, А.Г. Глотов // Молекулярная диагностика - 2010: VII Всеросс. науч.-практ. конф. с международным участием (24-26 ноября 2010). - Москва, 2010. - С. 79-80.

2-О

Подписано в печать 06.04.2011 г. Формат 60x84 '/¡6 Объем 1 усл. п. л.; Заказ Na 22. Тираж 100 экз.

Отпечатано в ИЦ ГНУ СибНСХБ Россельхозакадемии 630501, Новосибирская обл., пос. Краснообск

Содержание диссертации, кандидата ветеринарных наук, Войтова, Ксения Васильевна

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ.

1 .ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1 Характеристика респираторно-синцитиальной инфекции крупного рогатого скота.

1.1.1. Историческая справка.

1.1.2. Характеристика возбудителя.

1.1.3. Структура и функционирование генома вируса.

1.1.4. Антигенные и генетические подгруппы вируса.

1.2. Эпизоотологические данные.

1.3. Особенности патогенеза, клинических признаков и патоморфоло-гических изменений при респираторно-синцитиальной инфекции крупного рогатого скота.

1.3.1. Патогенез.

1.3.2. Клинические признаки.

1.3.3. Патоморфологические изменения.

1.4. Диагностика респираторно-синцитиальной инфекции крупного рогатого скота.

1.4.1. Выделение вируса в культурах клеток.

1.4.2. Серологическая диагностика.

1.4.3. Разработка и применение полимеразой цепной реакции для диагностики РСИ КРС.

Введение Диссертация по сельскому хозяйству, на тему "Диагностика респираторно-синцитиальной инфекции крупного рогатого скота методом полимеразной цепной реакции"

Актуальность темы. В настоящее время в России возрастает удельный вес хозяйств, занимающихся производством молока. В некоторых из них в результате завоза высокопродуктивного скота молочных пород из других стран происходит сосредоточение большого числа животных на ограниченных территориях. Высокая молочная продуктивность коров часто сопровождается нарушением обмена веществ и другой патологией, приводящей, в частности, к рождению слабого молодняка, подверженного различным болезням (А.Г. Шахов и соавт., 2000; Ю.Н. Федоров, 2006).

Респираторные болезни крупного рогатого скота являются одной из наиболее важных причин экономического .ущерба в индустрии молочного скотоводства, приводя к падежу или снижению скорости роста больных животных, затратам на лечение, диагностические и профилактические мероприятия (Н.Н. Крюков и соавт., 1976; В.А. Мищенко и соавт., 2000; Н.Ю. Басова, 2002; К.П. Юров и соавт., 2003; А.Г. Глотов и соавт., 2008; Н.Р. Будулов, 2009; Б.О. Вгуэоп, 2000; К.А. Вк^еп & а1., 2002).

Одним из многих этиологических агентов респираторных болезней крупного рогатого скота является респираторно-синцитиальный вирус (РСВ КРС), относящийся к семейству Рагатухоу1Пс1ае, роду Рпеитоу1гт. Восприимчив скот всех возрастных групп, но чаще болеют телята с одного до шестимесячного возраста (А.Р.АпШшб е! а1., 2010; ВЖ Вгоёегзеп, 2010), однако болезнь может возникать у коров (М. ЕЬ/апс1ег, 1996). Вирус может вызывать бронхиты, интерстициальную пневмонию и эмфизему легких самостоятельно, но главным его свойством является иммуносу-прессия и формирование предрасположенности к возникновению бактериальных пневмоний, т.к. течение болезни часто осложняется условно-патогенной микрофлорой {РаБЫигеИа ярр.) или микоплазмами, что влияет на характер патологоанатомических изменений (Ь.Е. Ьагееп, 2000; Ь.В. СогЬеП et а1, 2007).

Болезнь регистрируется во всех странах мира с интенсивным типом ведения животноводства (T.R. Ames, 1993; L.E. Larsen, 2000; S. Hagglund, 2005; B.W. Brodersen, 2010; С. Luzzago et al., 2010). Первые сообщения о болезни в нашей стране относятся к 1975 году (В.В. Гуненков и соавт., 1975). Изучению болезни и разработке средств и методов диагностики были посвящены работы Г.А. Халенева (1976), A.B. Васильева и соавт. (1988), И.Я. Строгановой (1989) и других.

В настоящее время актуальным является изучение эпизоотической ситуации по респираторно-синцитиальной инфекции крупного рогатого скота (РСИ КРС) в хозяйствах по производству молока, особенно с наличием импортированного скота, а также разработка высокоэффективных методов диагностики болезни с целью совершенствования противоэпизо-отических мероприятий.

Вирус относится к числу нестойких и обладает слабой способностью к размножению в культурах клеток, поэтому вирусологическая диагностика болезни, малоэффективна (EJ. Dubovi, 1993; L.E. Larsen, 2000). В связи с этим преимущество имеют молекулярные методы исследования, в частности, полимеразная цепная реакция (ОТ-ПЦР) (S. Hagglund, 2005; J-F. Valarcher et al., 2007).

Разработка ОТ-ПЦР для выявления PCB КРС во многих странах началась в конце прошлого столетия. Чаще мишенями для амплификации являлись участки относительно или высоко консервативных генов, кодирующих протеины F или G вируса. Были разработаны различные варианты реакции, основанной на обратной транскрипции: в обычном электрофорез-ном формате, гнездовая ПЦР и ПЦР в режиме реального времени.

В литературе имеются сообщения о выявлении вируса при помощи ОТ-ПЦР в инфицированных культурах клеток1 (R. D. Oberst et al.,1993), а также пробах биоматериала от больных животных (S. Vilcek et al., 1994; L.E. Larsen et al,1999; V. Valentovä et al., 2003; R.S. Almeida et al., 2005;

М. Вохиэ ег а1., 2005; М. НакЪуеЫуап <А а1., 2005; № УакгсИег еЬ а1., 2007; О. Агщеп е1 а1., 2009; Е. Типвй et а1., 2009).

На момент начала наших исследований в РФ законченных разработок в этом направлении не было.

Дель и задачи исследований. Целью работы являлась разработка полимеразной цепной реакции для диагностики респираторно-синцитиальной инфекции крупного рогатого скота и изучение ее диагностической и экономической эффективности.

Для достижения указанной цели были поставлены следующие задачи:

1. Изучить распространение респираторно-синцитиальной инфекции крупного рогатого скота в хозяйствах региона Сибири с учетом наличия в них импортированного и местного скота по результатам серологических исследований;

3. Изучить диагностическую и экономическую эффективность ОТ-ПЦР в производственных условиях^: установить частоту выявления РСВ в моноварианте и в ассоциациях с бактериями семейства Pasteurellaceae.

Научная новизна. Показано широкое распространение РСИ КРС в хозяйствах региона Сибири с интенсивным типом ведения молочного животноводства. Разработана ОТ-ПЦР с праймерами на ген гликопротеина Б, показана ее высокая эффективность при диагностике болезни в производственных условиях. Определены оптимальные сроки хранения вируссодержащей суспензии и выделенной РНК вируса при различных температурных режимах. Изучена частота выявления вируса в моноварианте и в ассоциациях бактериями семейства Pasteure¡laceae.

Материалы диссертации представляют теоретическую и практическую ценность, так как дают возможность расширить научные знания относительно роли РСВ в этиологии респираторных болезней крупного рогатого скота на крупных молочных комплексах. Они могут быть использованы при дальнейшем изучении эпизоотологии, патогенеза РСИ КРС и смешанных вирусно-бактериальных инфекций, протекающих по синергетиче-скому типу.

Внедрение полученных результатов. Материалы диссертации использованы при разработке рекомендаций: «Респираторно-синцитиальная инфекция крупного рогатого скота», утвержденных подсекцией «Инфекционная патология животных в регионе Сибири и Дальнего Востока» от-* деления ветеринарной медицины Россельхозакадемии (протокол №1 от 26.01.2010 г.)

Апробация полученных результатов. Материалы диссертационной работы доложены на: международной научно-практической конференции, посвященной 40-летию ВНИиТИБП, «Научные основы производства биологических препаратов», Щелково, 2009; II Сибирском ветеринарном конгрессе «Актуальные вопросы ветеринарной медицины», Новосибирск, 2010; XIV международной научно-практической конференции молодых учёных и специалистов «Молодость, талант, знания агропромышленному комплексу России», посвященной 80-летию УГАВМ, Троицк, 2009; VI международной научной конференции молодых учёных, посвященной 40-летию СО Россельхозакадемии «Новейшие направления развития аграрной науки в работах молодых ученых», Краснообск, 2010; XIII Международной научно- практической конференции «Аграрная наука — сельскохозяйственному производству Монголии, Сибири и Казахстана», Новосибирск, 2010; VII всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Молекулярная диагностика — 2010», Москва, 2010г.

Публикация результатов исследований. По теме диссертации опубликовано 10 научных работ, в том числе 3 — в журналах, рекомендованных ВАК Минобразования и науки Российской Федерации («Ветеринария», «Сибирский вестник сельскохозяйственной науки», «Вестник Крас-ГАУ»).

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 120 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, собственных исследований, обсуждения, выводов, практических предложений, приложения. Работа иллюстрирована одним рисунком и 10 таблицами. Список литературы включает 246 источников, в том числе 188 зарубежных.

Заключение Диссертация по теме "Кормление сельскохозяйственных животных и технология кормов", Войтова, Ксения Васильевна

4. ВЫВОДЫ

1. Респираторно-синцитиальная инфекция крупного рогатого скота широко распространена в молочных хозяйствах Сибири и носит энзоотический характер, Серопозитивность животных к вирусу в среднем по трем административным территориям находилась в пределах 38,4-66,6%%. У взрослого скота она достигала 76,3-86,7%%, а у молодняка до 6 месяцев 20,4%- 29,9%%. В среднем у 54,3 -92,6% телят до 30 дней отсутствовали колостральные антитела к вирусу. Титры антител у телят достоверно повышались к возрасту 12 месяцев и старше, свидетельствуя о переболева-нии в возрасте 4-10 месяцев.

2. Средние титры антител к вирусу у животных в хозяйствах с наличием импортированного скота были выше, чем у животных без него. В период вспышек болезни циркуляция вируса среди, животных разных половозрастных групп, происходила более активно, особенно среди нетелей, завезенных по импорту, ,и коров (нетели — 5,4±0,43 lg2; коровы — 5,1±0,02 lg2). При вспышках болезни сероконверсию к вирусу чаще выявляли у телят в возрасте 4-6 месяцев и коров (4 - 32 кратное повышение титров антител). Уровень сероконверсии к вирусу РСИ в хозяйствах с наличием импортного скота был более высоким (до 256-кратного).

3. Диагностическая ОТ-ПЦР с праймерами, комплементарными последовательностям высоко консервативного гена гликопротеина F PCB КРС, обладала высокой чувствительностью и специфичностью. Она достоверно выявляла РНК исследованных штаммов вируса. В результате амплификации кДНК вируса синтезировался фрагмент 381 п.о. Чувствительность реакции составила 10"5 ТЦД5о/мл. Выделенная РНК, используемая в качестве положительного контроля ОТ-ПЦР, сохраняла свою активность в течение 2-10 месяцев при минус 18°С.

6. РСВ КРС в моноварианте присутствовал в 14,6%, РаяСеигеНа ти1-^с1с1а - в 9,2%, а Маппкетш каето1уйса — 11,4% проб биоматериала от больных животных. Одновременное выделение трех возбудителей в одной пробе было равным 9,9%.

7. ОТ-ПЦР экономически эффективнее микрометода выделения вируса в культуре клеток в 7,8 раза, а по срокам постановки в 22,5 - 37,5 раза. Время исследования 50 проб биоматериала составляло 48 часов, что по срокам постановки превосходило традиционный метод выделения вируса в 37,5 раз (45- 75 суток и более).

5. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

1. В крупных хозяйствах молочного направления, неблагополучных по респираторным болезням крупного рогатого скота, необходимо проводить диагностические исследования с целью установления этиологической роли респираторно-синцитиального вируса согласно методическим рекомендациям «Респираторно-синцитиальная инфекция крупного рогатого скота», утвержденным подсекцией «Инфекционная патология животных в регионе Сибири и Дальнего Востока» отделения ветеринарной медицины Россельхозакадемии (протокол № 1 от 26.01.2010 г.);

Библиография Диссертация по сельскому хозяйству, кандидата ветеринарных наук, Войтова, Ксения Васильевна, Новосибирск

1. Азаренко, B.C. Результаты серологических исследований на вирусные заболевания органов дыхания / B.C. Азаренко, В.А. Демидов, Т.П. Плавник // Ветеринарная наука — производству: труды БелНИВИ т. 9. Минск, 1973.-С. 12-16.

2. Архипов, Н.И. Патологоанатомическая диагностика вирусных болезней животных: справочное издание / Н.И. Архипов, С.Ф. Чевелев, Г.И. Брагин и др.. Москва: Колос, 1984. - 399 с.

3. Баженов, К.С. Распространение вирусов прагриппа-3 и респира-торно-синцитиальной инфекции среди телят на откорме в осенне-зимний период / К.С. Баженов // Бюллетень ВИЭВ. Москва, 1983. - Вып. 50. -С. 6 - 8.

4. Басова, Н.Ю. Респираторные болезни молодняка крупного рогатого скота инфекционной этиологии в условиях Северного Кавказа: автореф. дис. д-ра ветеринар, наук / Н.Ю. Басова. Краснодар, 2002. — 42 с.

5. Бостанджиева, Р. Чувствительност на клетьчните культури към го-вяждия респираторно-синцитиален вирус / Р. Бостанджиева //Вет. Мед. Науки,- 1986. — №2. С. 12-18.

6. Бостанджиева, Р. Культивирование и диагностика респираторно-синцитиального вируса крупного рогатого скота: автореф. дис. . канд. биол. наук / Р. Бостанджиева. София, 1987. - 27 с.

7. Будулов, Н.Р. Респираторные болезни крупного рогатого скота в Дагестане: автореф. дис. . д-ра ветеринар, наук / Н.Р. Будулов. Краснодар; 2009. - 43 с.

8. Васильев; A.B. PHFA в серодиагностике респираторно-синцитиальной инфекции крупного рогатого скота / A.B. Васильев, Н.Г. Осидзе, В.Н. Сюрин и др. // Ветеринария. 1988. - №10. - С. 33 - 34.

9. Воронин, Е.С. Вирусные респираторные инфекции крупного рогатого скота в промышленных комплексах / Е.С. Воронин, A.A. Конопаткин // Лекции для слушателей факультета повышения квалификации. — Москва, 1982. 29 с.

10. Генчев, Г. Энзоотии респираторных заболеваний телят с признаками респираторно-синцитиального вируса / Г. Генчев //21 Всемирный вет. конгресс. -Москва, 1979. т. 3.- 101 с.

11. Глотов, А.Г. Распространение вирусных респираторных болезней крупного рогатого скота / А.Г. Глотов, Т.И. Глотова, О.Г. Петрова и др. // Ветеринария. 2002. - №3. - С. 17 - 21.

12. Глотов, А.Г. Респираторные болезни телят вирусно-бактериальной этиологии / А.Г. Глотов, Т.И. Глотова // Рос. акад. с.-х. наук Сиб. отд-ние, Ин-т эксперимент. Ветеринарии Сибири и Дальнего Востока. Новосибирск: Агрос. - 2008. - 258 с.

13. Глотов, А.Г. Респираторно-синцитиальная инфекция крупного рогатого скота / А.Г. Глотов, Т.И. Глотова // Ветеринария. — 2009. — № 11.— С. 18-23.

14. Грязин, В.Н. Вирусные респираторные заболевания телят и меры борьбы с ними: автореф. дис. . канд. ветеринар, наук / В.Н. Грязин. — Новосибирск, 1983. 20 с.

15. Гуненков, В.В. Респираторно-синцитиальная инфекция/ В.В. Гу-ненков, Г.А. Халенев, В.Н. Сюрин // Животноводство и ветеринария т. 8 -Москва, 1975. С.70 - 76.

16. Джупина, С.И. Методы эпизоотологического исследования и теория эпизоотического процесса / С.И. Джупина Новосибирск: Наука. Сиб. отд-ние, 1991.- 142 с.

17. Казанцев, А.П. Справочник по инфекционным болезням / А.П. Казанцев, В.С. Матковский // 3-е изд., перераб. и доп. Москва: Медицина, 1986. - 350с.

18. Кочиш, Т.М. Разработка набора реагентов для определения уровня антител к респираторно-синцитиальному вирусу крупного рогатого скота в иммуноферментном анализе: автореф. дис. . канд. биол. наук / Т.М. Кочиш. Щелково, 2004. - 23 с.

19. Крюков, H.H. Вирусные респираторные болезни крупного рогатого скота / H.H. Крюков, З.Ф. Зудилина, С.И. Евдокимов // Ветеринария. — 1976. №6. — С. 111 - 113.

20. Мартынов, Ю.В. Выделение PCB от телят с респираторным синдромом: патогенез, лечение и профилактика болезней жвачных животных в Западной Сибири / Ю.В. Мартынов, М.И. Орлов // Омск. -1985. т- С. 22 24.

21. Матвеева, И.Н. Промышленные технологии изготовления компонентов моно- и комплексных диагностикумов инфекционных заболеваний животных: автореф. дис. . д-ра биол. наук / И.Н. Матвеева. Кащинцево, 2008.-24 с.

22. Матвеева, И.Н. Тест-система ИФА для определения антител к респираторно-синцитиальному вирусу крупного рогатого скота / И.Н. Матвеева, Д.П. Кузнецов, C.B. Кузнецова и др. // Ветеринария и кормление. 2006. - № 6. - С.28 - 29.

23. Матвеева, И.Н. Получение антигена респираторно-синцитиального вируса крупного рогатого скота для использования в ИФА / И.Н. Матвеева // Ветеринария. 2007. - № 11. - С. 49 - 51.

24. Метревели, Т.Д. Биологические свойства вируса и серологическая диагностика PC-инфекции крупного рогатого скота: автореф. дис. .канд. биол. наук / Г.Д. Метревели. Москва, 1989. — 19 с.

25. Метревели, Г.Д. Современная диагностика залог успешной борьбы с PC-инфекцией крупного рогатого скота / Т.Д. Метревели, В.В.Гуненков //Тез. докл. Всесоюзн. науч. конф. по проблемам эпизоотологии. -Казань, 1983. - С. 91 - 94 с.

26. Методические указания по лабораторной диагностике пастерел-лезов животных и птиц. Министерство сельского хозяйства. — Москва, 1992. - 16 с.

27. Методические рекомендации по оценки социально-экономической эффективности применения метода биочип-диагностики во фтизиатрии Министерство здравоохранения и социального развития Российской Федерации - Москва, 2009. - 22 с.

28. Мищенко, В.А. Особенности респираторных инфекций телят /

29. B.А. Мищенко, A.A. Гусев, О.И. Сухарев и др. // Ветеринария. 2000. - №9. - С. 5 - 6.

30. Мищенко, В.А. Проблема респираторных смешанных инфекций молодняка КРС / В.А. Мищенко // Актуальные проблемы инфекционной патологии животных: материалы междунар. науч.-практ. конф., 30-31 октября 2003 г. Владимир, 2003. - С.72 - 77.

31. Муравьев, В.Н. Изучение динамики эпизоотологического процесса при респираторно-кишечных заболеваниях телят /H.H. Муравьев, Г.В. Усма-нова, A.A. Бурдов // Сб. науч. тр. Москва: MB А, 1983. - С. 9 - 11.

32. Науменков, В.И. Вопросы этиологии и динамики эпизоотического процесса при вирусных пневмоэнтеритах телят / В.И. Науменко // Ветеринария. 1994. - №2. - С. 23 - 24.

33. Обухов, И.Л. Применение полимеразной цепной реакции в ветеринарии / И.Л. Обухов, А.Н. Панин // Аграрная Россия. — 2002. №2.1. C. 62 64.

34. Петрова, О.Г. Острые респираторные вирусные инфекции крупного рогатого скота в племенных хозяйствах среднего Урала и оптимизация системы противоэпизоотических мероприятий: автореф. дис. . д-ра ветеринар, наук / О.Г. Петрова. Москва, 2002. - 47 с.

35. Петрова, О.Г. Острые респираторные вирусные инфекции крупного рогатого скота в Свердловской области /О.Г. Петрова, А.Т. Татарчук, Н.Л. Сапожникова и др. // Ветеринария. — 2002. — № 2. — С. 11 15.

36. Природа, этиологическая структура, патогенез, диагностика массовых желудочно-кишечных заболеваний новорожденных телят и меры борьбы с ними / Э.А. Шегидевич и др. // Труды ВИЭВ. 2003. - №73. — С. 15 - 22.

37. Пыталев, П.Н. Эпизоотологический надзор за важнейшими инфекциями крупного рогатого скота; автореф. дис. . канд. ветеринар, наук / П.Н. Пыталев. Москва, 1996. - 21 с.

38. Саики, Р. Полимеразная цепная реакция / Р. Саики, У. Гиленстен, Г. Эрлих // Анализ генома. Методы; под ред. К. Дейвиса. Москва: Мир, 1990.-С. 176- 189.

39. Строганова, И.Я. Культивирование респираторно-синцитиального вируса крупного рогатого скота с целью получения диагностических препаратов: автореф. дис. . канд. ветеринар, наук / И.Я. Строганова. — Москва, 1988. -20 с.

40. Сюрин, В.Н. Частная ветеринарная вирусология: справочная книга /В.Н. Сюрин, Н.В. Фомина; отв. ред. АМЯрных. — Москва: Колос, 1979. 472 с:

41. Федоров, Ю.Н. Иммунный статус и инфекционные болезни новорожденных телят и поросят / Ю.Н. Федоров // Ветеринария. 2006. — №11. -С. 3-5.

42. Халенев, Г.А. Респираторно-синцитиальная, реовирусная и рино-вирусная инфекция крупного рогатого скота: лекция 15-я / Г.А. Халенев,

43. B.В. Гуненков // Моск. вет. академия. Москва, 1977. - С. 3 - 9.

44. Харламбиев, Х.Е. Изоляция респираторно-синцитиальния вируса от телят с респираторным заболеванием / Х.Е. Харламбиев, Р. Бостанджиева, Г.К. Георгиев, Б. Мигов // Вет. мед. науки. — 1984. №2 —1. C. 3 7.

45. Шаматава, Н. М. Пастереллез. /Н.М. Шаматава // Инфекционные болезни крупного рогатого скота. -М.: Колос. — 1974. С. 157 - 169.

46. Шахов, А.Г. Нарушение обмена веществ у стельных коров / А.Г. Шахов, В.Т. Самохин // Материалы круглого стола отд. ветеринар, медицины РАСХН. Москва, 2000. - С.10 - 14.

47. Шахов, А.Г. Этиология, терапия и профилактика болезней молодняка сельскохозяйственных животных / А.Г. Шахов, С.М. Сулейманов // Материалы коорд. совещ. Воронеж, 1995. - 12 с.

48. Шегидевич, Э.А. Роль пастерелл в респираторной патологии овец и крупного рогатого скота: автореферат дис. . д-ра ветеринар, наук / Э.А. Шегидевич. Москва, 1993. - 42 с.

49. Шкиль, Н.А. Экологический подход к обоснованию методов профилактики болезней молодняка / Н.А. Шкиль, М.Н. Шадрина и др. // Материалы науч.-практ. конф. — Томск, 2002. — С. 92 96.

50. Юров, К.П. Профилактика инфекционных болезней телят / К.П. Юров, А.Ф. Шуляк// Материалы науч.-практ. конф. — Новосибирск, 2001. — С. 9-10.

51. Ames, T. R. The epidemiology of BRSV infection / T.R. Ames // Veterinary Medicine. 1993. -Vol. 88. - P. 881 - 884.

52. Aim, K. Acute BRSV infection in young AI bulls: effect on sperm quality / K. Aim, E. Koskinen, S. Vahtiala, M. Andersson // Reprod Domest Anim. 2009. - Vol. 44. - P. 456 - 459.

53. Almeida, R.S. Detection of bovine respiratory syncytial virus in experimentally infected balb/c mice / R.S. Almeida , H.G. Domingues, L.T. Coswing, R.C.F. D'Arce, R.F. de Carvalho, C.W. Arns // Vet. Res. 2004. -Vol. 35.-P. 189- 197.

54. Almeida, R.S., BRSV subgroup B is circulating in Brazil. / R.S. Almeida, H.G. Domingues, F.R. Spliki, L.E. Larsen, S. Hâgglund, S. Belâk // The Veterinary Record — 2005.

55. Andrews, A.H. Respiratory disease. / A.H. Andrews, R. Blowey, H. Boyd, R. Eddy // Bovine Medicine: Diseases and Husbandry of Cattle. Blackwell Scientific Publications, Oxford: 2004. - P. 286 - 293.

56. Antonis, A.F.G. Vaccine-Induced Immunopathology during Bovine Respiratory Syncytial Virus Infection: Exploring the Parameters of Pathogenesis/ -A.F.G. Antonis, R.S. Schrijver, F. Daus // Journal of Virology. 2003. - Vol. 77. -P. 12067- 12073.

57. Atreya, P.L. The NS2 protein of human respiratory syncytial virus is a protein inhibitor of minigenome transcription and RNA replication / P.L. Atreya, M.E. Peeples, P.L. Collins // J. Virol. 1998. - Vol. 72. - P. 1452 - 1461.

58. Babiuk, L.A. Viral-bacterial synergistic interaction in respiratory disease. / L.A. Babiuk, M.J. Lawman, H.B. Ohmann // Advanced Virus Research — 1988.-Vol. 35.-P. 219 -249.

59. Baker, J.C. Seroepizootiologic study of bovine respiratory syncytial virus in a dairy herd /J.C. Baker, T.R Ames, R.J. Markham // American Journal of Veterinary Research 1986. - Vol. 47. - P. 240 -245.

60. Baker, J.C. Study on the etiologic role of bovine respiratory syncytial virus in pneumonia of dairy calves / J.C. Baker, R.E. Werdin, T.R. Ames, R.J.F. Markham, V.L. Larsen // JAVMA 1986. - Vol. 189. - P. 66 - 70.

61. Baker, J.C. The characteristics of respiratory syncytial viruses / J.C. Baker // Vet. Med. 1993. - Vol. 88. - P. 1190 - 1195.

62. Baker, J.C. Bovine respiratory syncytial virus/ J.C. Baker//Veterinary Clinics of North America Food Animal Practice. -1997. Vol. 13. - P. 425 -454.

63. Beaudeau, F. Spatial patterns of bovine corona virus and bovine respiratory syncytial virus in the Swedish beef cattle population / F. Beaudeau, C. Bjorkman, S. Alenius, J. Frossling // Acta. Vet. Scand. 2010. - Vol. 21. - P. 33.

64. Beaudeau, F. Associations between bovine coronavirus and bovine respiratory syncytial virus infections and animal performance in Swedish dairy herds / F. Beaudeau, A. Ohlson, U. Emanuelson // J. Dairy. Sci. — 2010. — Vol. 93.-P. 1523- 1533.

65. Belak, S. Application of the polymerase chain reaction (PCR) in veterinary diagnostic virology / S. Belak, A. Ballagi-Pordany // Veterinary Research Communications 1993a. - Vol. 17. - P. 55 - 72.

66. Belak, S. Experiences on the application of the polymerase chain reaction in a diagnostic laboratory / S. Belak, A. Ballagi-Pordany // Molecular and Cellular Probes. 1993b. - Vol. 7. - P. 241 - 248.

67. Belak, S. Molecular diagnosis of animal diseases: some experiences over the past decade / S. Belak, P. Thoren // Expert Review of Molecular Diagnostics-2001.-Vol. 1.-P. 434 443.

68. Belanger, F. Electron microscopic evidence for bridges between bovine respiratory syncytial virus particles / F. Belanger, L. Berthiaume, R. Alain, G. Lussier, M. Trudel // J. Gen. Virol. 1988. - Vol. 69. - P. 1421 - 1424.

69. E.B. Belknap // Vet. Med. 1993. - Vol. 88. - P. 886 - 887.

70. Belknap, E.B., Experimental respiratory syncytial virus infection in calves and lambs / E.B. Belknap, D.K. Ciszewski, J.C. Baker // Journal of Veterinary Diagnostic Investigation 1995. - Vol. 7. - P. 285 - 298.

71. Bengtsson, B. Respiratoriska virus projekt, panorama och be-hindlingsstrategier / B. Bengtsson, S. Viring //In: Veterinarmote, Uppsala, Sweden-2000.-P. 153 - 158.

72. Blount, R.E. Recovery of cytopathogenic agent from chimpanzees with coryza / R.E. Blount, Jr., J.A. Morris, R.E. Savage // Proceedings of the Society for Experimental Biology and Medicine 1956. - Vol. 92 - P. 544 - 549.

73. Bossert, B. Nonstructural proteins NS1 and NS2 of bovine respiratory syncytial virus bloc activation of interferon regulatory factor 3 / B. Bossert, S. Marozin,'K.-K. Conzelmann // J. Virol. 2003. - Vol. 77. - P. 8661 - 8668.

74. Boxus, M. Real Time RT-PCR for the detection and quantitation of bovine respiratory syncytial virus./ M. Boxus, C. Letellier, P. Kerkhofs // J. Virol. Methods. 2005. - Vol. 125. - P. 30.

75. Brodersen, B.W. Bovine respiratory syncytial virus. / B.W. Brodersen. // Vet Clin North Am Food Anim. Pract. 2010. - Vol. 26. - P. 323 - 333.

76. Brogden, K.A. Polymicrobial Diseases / K.A. Brogden, J.M. Guthmiller // J. Virol. 2002. - P. 328.

77. Bryson, D.G. Observations on outbreaks of respiratory disease in housed calves(l) Epidemiological, clinical and microbiological findings / Bryson, D.G., J.B. McFerran, H.J. Ball, S.D. Neill // The Veterinary Record 1978a. -Vol. 103.-P. 485-89.

78. Bryson, D.G. Observations on outbreaks of respiratory disease in housed calves(2) Pathological and microbiological findings / Bryson, D.G., J.B. McFerran, H.J. Ball, S.D. Neill // The Veterinary Record 1978b. - Vol. 103. -P. 503 -509.

79. Bryson, D.G. Respiratory syncytial virus pneumonia in young calves: clinical and pathologic findings / D.G. Bryson, M.S. McNulty, E.F. Logan, P.F. CushV/Am. J. Vet. Res. 1983. - Vol. 44. - P. 1648- 1655.

80. Bryson, D.C. Ultrastructural features of alveolar lesions in induced respiratory syncytial virus pneumonia of calves / D.C. Biyson, S. McConnell, M. McAliskey, M.S. McNulty // Vet. Pathol. 1991. - Vol. 28. - P. 286 - 292.

81. Biyson, D.G. Necropsy findings associated with BRSV pneumonia / D.G. Bryson//Vet. Med. 1993. - Vol. 88.- P. 894 - 899.

82. Bunt, A.A. Virus taxonomy, Eigth report of the International Committee on Taxonomy of Virus / A. A. Bunt, R.G. Milne, T. Sayaya, M. Verbeek, H.J. Vetten, H.J. Walsh, C.M. FWquet, M.A. Mayo, J. Maniloff, U. Desselberger // London. 2005 - P. 655 - 671.

83. Cane, P.A. Identification of variable domains of the attachment (G) protein of subgroup A respiratory syncytial virus / P.A. Cane, D.A. Matthews, C.R. Pringle//J. Gen. Virol. 1991. - Vol. 72.-P. 2091 - 2096.

84. Chang, J. Respiratory syncytial virus infection suppresses lung CD8+T-cell effector activity and peripheral CD8+T-cell memory in the respiratory tract / J. Chang, T.J. Braciale // Nat. Med. 2000. - Vol. 8. - P. 54 - 60.

85. Corbeil, L.B. Specificity of IgG and IgE antibody responses to Haemophilus somnus infection of calves / L.B. Corbeil, K.F. Arnold, R. Kimball, L. Berghaus, L.J. Gershwin // Vet Immunol Immunopathol. 2006. - Vol. 15. — P. 191 - 199.

86. Corbeil, L.B. Histophilus somni host-parasite relationships / L.B. Corbeil // Anim. Health. Res. Rev. 2007. - Vol. 8. - P. 151 - 160.

87. Deplanche, M. In vivo evidence for quasispecies distributions in the bovine respiratory syncytial virus genome / M. Deplanche, M. Lemaire, C. Mirandette, M. Bonnet, F. Schelcher, G. Meyer // J. Gen. Virol. 2007. -Vol. 88.-P. 1260- 1265.

88. Dubovi, E.J. Diagnosing BRSV infection: A laboratory perspective / E.J. Dubovi // Veterinary Medicine. 1993. - Vol. 88. - P. 888 - 893.

89. Elazhary, M.A.S.Y. A natural outbreak of bovine respiratory disease caused by bovine respiratory syncytial virus / M.A.S.Y. Elazhary, A. Silim, M. Morin // Cornell. Vet. 1982. - Vol. 72. - P. - 352 - 333.

90. Ellis, J.A. Fatal pneumonia in adult dairy cattle associated with active infection with bovine respiratory syncytial virus / J.A. Ellis, H. Plnlihen, K. West, E. Clark, K. Martin, D. Haines // Can. Vet. J. 1996. - Vol. 3. - P. 103 -105.

91. Ellis, J.A. Update on viral pathogenesis in BRD / J.A. Ellis // Anim. Health. Res. Rev. 2009. - Vol. 10. - P. 149 - 153.

92. Elvander, M. Severe respiratory disease in dairy cows caused by infection with bovine respiratory syncytial virus / M. Elvander // The Veterinary Record-1996.-Vol. 138.-P. 101 105.

93. Freymuth, F. Detection of respiratory syncytial vims by reverse transcription RCR and hybridization with a DNA enzyme immunoassay / F. Freymuth, G. Eugene, A. Varbret // J. Clin. Microbiol. 1995. - Vol. 33. -P. 3352 - 3355.

94. Furze, J.M. Antigenic heterogenicity of the attachment protein of bovine respiratory syncytial virus / J.M. Furze, G. Wertz, G. Taylor // J. Gen. Virol. 1994. - Vol. 75: - P. 363 - 370.

95. Furze, J.M. Antigenically distinct G glucoproteins of BRSV strains shape a high degree of genetic homogeneity /'J.M. Furze, S.R. Roberts, G.W. Wertz, G. Taylor// Virology. 1997. - Vol. 231. - P. 48 - 58.

96. Gaddum, R.M. Recognition of bovine respiratory syncytial virus protein by bovine CD8+T lymphocytes / R.M. Gaddum, R.S. Cook, J.M. Furze, S.A. Ellis, G. Taylor // Immunology 2003. - Vol. 108. - P. 220 - 229.

97. Gaffiiri, A. Serosurvey of roe deer, chamois and domestic sheep in the central Italian Alps / A. Gaffiiri, M. Giacometti, V.M. Tranquillo, S. Magnino, P. Cordioli, P. Lanfranchi // J Wildl Dis. 2006. - Vol. 42. - P. 685 -690.

98. Hall;, G.B; Respiratory • syncytial: .virus: and<i parainfluenzas 'virus-.' I':.

99. C.B. Hall:'//. New England Journal of Medicine — 2001.,— Vol; 344 P: 1917 -' 1928.

100. Himmes, S.R. Bovine respiratory syncytial virus fusion protein gene: sequence analysis of cDNA and expression using a baculovirus vector / S.R. Himes, L.G. Gershwin//J.Gen. Virol.- 1992.-Vol. 73.-P. 1563 1567.

101. Inaba, Y. Nomi virus, a virus isolated from an appearently new epizootic respiratory disease of cattle 7 Y. Inaba, Y. Tanaka, H. Ito, T. Omori, M. Matumoto // Japan. J. Microbiol. 1970. - Vol. 14. —P. 246 - 248:

102. Kargen, A. Recombinant respiratory syncytial virus with deletion of the G or SH genes: G and F proteins bind heparin / A. Kargen, U. Schmidt, U.J; Buchholz // J. Gen. Virol. 2001. - Vol. 82. - P. 631 - 640;

103. Kimman, T.G. Isotype specific ELISAs for the detection of antibodies to bovine respiratory syncytial virus / T.G. Kimman, F. Westenbrink, P.J. Straver,

104. D. Van Zaane, B.E. Schreuder//Res. Vet. Sci. -1987.-Vol. 43. -P. 180 187.

105. Kimman, T.G. Pathogenesis of natural acquired bovine respiratory syncytial virus infection in calves: morphologic and serologic findings / T.G. Kimman, P J. Straver, G.M. Zimmer // Am. J. Vet. Res. 1989. - Vol. 50. -P. 684 - 693.

106. Kingsbury, D.W. Paramyxoviridae and Their Replication. In: Fields Virology / D.W. Kingsbury // Ravens Press. New York 1990. - P. 945 - 962.

107. Kovarcik, K. Respiratory syncytial viruses: pathogenesis, immunology and disease prevention / K. Kovarcik // Vet. Med.-Czech. 1997. - Vol. 42. -P. 256-278.

108. Kovarcik, K. Isolation of bovine respiratory syncytial virus during an outbreak of acute respiratory disease in calves / K. Kovarcik // Vet. Med.-Czech. 1999. - Vol. 44. - P. 121 - 127.

109. Kovarcik, K. The development and application of an indirect ELISA test for the detection of antibodies to bovine respiratory syncytial virus in blood serum / K. Kovarcik // Vet. Med.-Czech. 2001. - Vol. 46. - P. 29 - 34.

110. Koves, B. Isolation of respiratory syncytial (RS) virus from coffle diseased with respiratory symptoms / B. Koves, A. Bartha // Acta. vet. Acad. Sei. hung. 1975. - Vol. 25. - P. 357 - 362.

111. Larsen, L.E. Extensive sequence divergence among bovine respiratory syncytial viruses isolated during recurrent outbreaks in closed herds / L.E. Larsen, K. Tjornehoj, B. Viuff // Journal of Clinical Microbiology 2000. - Vol. 38.-P. 4222-4227.

112. Larsen, L. E. Bovine Respiratory Syncytial Virus (BRSV): A review / L. E. Larsen // Acta. vet. scand. 2000. - Vol. 41. - P. 1 - 24.

113. Larsen, L.E. Bovine respiratory syncytial virus (BRSV) pneumonia in beef calf herds despite vaccination / L.E. Larsen, C. Tegtmeier, E. Pedersen // Acta. Veterinaria Scandinavia 2001. - Vol. 42. - P. 113 - 121.

114. Lehmkuhl, H.D. Characterization and identification of a bovine respiratory syncytial virus isolated from Young Calves / H.D. Lehmkuhl, P.M. Cough, D.E. Reed // An. J. veter. Res. 1979. - Vol. 40. - P. 124 - 126.

115. Lekeux, P. Respiratory syncytial virus pneumonia in Friesian calves: physiological findiags / P. Lekeux, J. Verhoeff, R. Hajer, H.J. Breukink // Res. in veter. Sc. 1985. - Vol. 39.

116. Lekeux, P. Bovine respiratory disease complex: an European perspective / P. Lekeux // Bov. Pract. 1995. - Vol. 29. - P. 71 - 75.

117. Luzzago, C. Bovine respiratory syncytial virus seroprevalence and risk factors in endemic daiiy cattle herds / C. Luzzago, V. Bronzo, S. Salvetti, M. Frigerio, N. Ferrari // Vet Res Commun. 2010. - Vol. 34. - P. 19 - 24.

118. Mallipeddi, S:K. Sequence variability of the glycoprotein gene of bovine respiratory syncytial virus / S.K. Mallipeddi, S.K. Samal // J. Gen. Virol. -1993. Vol. 74. - P. 2001 - 2004.

119. Mallipeddi, S.K. Mapping the domains on the phosphoprotein bovine respiratory syncytial virus required for N-P interaction using a two-hybrid system / S.K. Mallipeddi, B. Lupiani, S.K. Samal // J. Gen. Virol. 1996. - Vol. 77. -P. 1019- 1023.

120. Mcintosh, K. Respiratoiy Syncytial Viruses. In: Fields Virology / K. Mcintosh, R.M. Chanock // Raven Press. New York 1990. - P. 1045 - 1074.

121. Meyer, G. Human and bovine respiratory syncytial virus vaccine research and development / G. Meyer, M. Deplanche, F. Schelcher // Comp. Immunol. Microbiol. Infect. Dis. 2008. - Vol. 31. - P. 191 - 225.

122. Miller, A.L. Respiratory syncytial virus-induced chemokine production: linking viral replication to chemokine production in vitro and in vivo / A.L. Miller, T.L. Bowlin,N.W.Lukacs//J. Infect. Dis.-2004.-Vol. 189.-P. 1419-1430.

123. Morris, J.A. Recovery of cytopathogenic agent from chimpanzees with corysa / J.A. Morris, R.E. Blount, R.E. Savage // Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 1956. - Vol. 92. - P. 544 - 549.

124. Motha, M.X. Prevalence of IBR, PI 3, BRS and BCV infections in the dairy cattle population of New Zealand / M.X. Motha, M.F. Hansen // New Zealand Veterinaiy Journal 1998. - Vol. 46. - P. 239 - 240.

125. Openshaw, P.J. Immunopathogenesis of vaccine-enhanced RSV disease / P.J. Openshaw, F.J. Culley, W. Olszewska // Vaccine 2001. - Vol. 20. -P. 27-31.

126. Ortman, K. Use of antimicrobial drugs in Swedish dairy calves and replacement heifers / K. Ortman, C. Svensson // The Veterinary Record 2004. -Vol. 154.-P. 136- 140.

127. Paccaud, M.F. A respiratory syncytial virus of bovine origin / M.F. Paccaud, C. Jacquier // Arch. Ges. Virusforsch. 1970. - Vol. 303. — P. 27 - 42.

128. Pastey, M.K. Structural and sequence comparison of bovine respiratory syncytial virus fusion protein / M.K. Pastey, S.K. Samal // Virus Res. — 1993. Vol. 29. - P. 195 - 202.

129. Pastey, M.K. Nucleotide sequence analysis of the non-structural NS1 (1C) and NS2 (IB) protein genes of bovine respiratory syncytial virus / M.K. Pastey, S.K. Samal // Gen. Virol. 1995. - Vol. 76. - P. 193 - 197.

130. Pastey, M.K. Analysis of bovine respiratory syncytial virus envelope glycoproteins in cell fusion / M.K. Pastey, S.K. Samal // J. Gen. Virol. 1997. -Vol. 78.-P. 1885- 1889.

131. Patel, J.R. Evaluation of efficacy of an inactivated vaccine against bovine respiratory syncytial virus in calves with maternal antibodies / J.R. Patel, S.A. Didlick // American Journal of Veterinary Research 2004. — Vol. 65. -P. 417-421.

132. Paton, A.W. Rapid detection of respiratory syncytial virus in nasopharyngeal aspirates by reverse transcription and polymerase chain amplification-/ A.W. Paton, J.C. Paton, A.P. Collins // J. Clin. Microbiol. 1992. - Vol. 30. -P. 901 - 904.

133. Perino, L.J. A review of bovine respiratory disease vaccine field efficacy / L.J. Perino, B.D. Hunsaker // Bovine Practitioner — 1997. Vol. 31 -P. 59 - 66.

134. Pirie, H.M. Acute fatal pneumonia in calves due to respiratory syncytial virus / H.M. Pirie, L. Petrie, E.M. Allan, C.R. Pringle // Vet. Res. 1981. -Vol. 109.-P. 87-89.

135. Pospisil, L. Isolation and Identification of a Bovine Respiratory Syncytial Virus in Czechoslovekia / L. Pospisil, J. Menik, L. Valicek // Acta. Vet. Brno. 1978. - Vol. 47. - P. 79 - 86.

136. Prozzi, D. Antigenic and molecular analyses of the variability of bovine respiratory syncytial virus G glycoprotein / D. Prozzi, K. Walrayens, J.P. Langedijk, F. Daus, J.A. Kramps, J.J. Letesson // J. Gen. Virol. — 1997. Vol. 78.-P. 359-366.

137. Rudd, B.D. differential role for TLR3 in respiratory syncytial virus-induced chemokine expression / B.D. Rudd, E. Burstein, C.S. Duckett, X. Li, N.W. Lukacs // J. Virol. 2005. - Vol. 79. - P. 3350 - 3357.

138. Salt, J.S. Efficacy of a quadrivalent vaccine against respiratory diseases caused by BHV-1, PI3V, BVDV and BRSV in experimentally infected calves / J.S. Salt, S.J. Thevasagayam, A. Wiseman, A.R. Peters // Vet. J. 2007. -Vol. 174. -P. 616-626.

139. Samal, S.K. Molecular cloning and sequence analysis of bovine respiratory syncytial virus mRNA encoding the major nucleocapsid protein / S.K. Samal, M. Zamora, T.H. McPhillips, S.B. Mohanty // Vitology. 1991. - Vol. 180.-P. 453 -456.

140. Sausker, E.A. Seroprevalence of OHV-2, BVDV, BHV-1 and BRSV in ranch-raised bison {Bison bison) / E.A. Sausker, N.W. Dyer // J. Vet. Diagn. Invest. 2002. - Vol. 14. - P. 68 - 70.

141. Shanthalingam, S. Bighorn sheep fetal lung cell line for detection of respiratory viruses / S. Shanthalingam, C. Topliff, C.L. Kelling, S. Srikumaran // Can. J. Vet. Res. -2010.-Vol. 74. P. 75 - 77.

142. Smith, M.H. Isolation, characterization, and pathogenicity studies of a bovine respiratory syncytial virus / M.H. Smith, M.L. Frey, R.E. Dierks // Arch. Virol. 1975. - Vol. 47. - P. 237 - 247.

143. Stine, L.C. Sequence conservation in the attachment glycoprotein and antigenic diversity among bovine respiratory syncytial virus isolates / L.C. Stine, D.K. Hoppe, C.L. Kelling //Vet. Microbiol. 1997. - Vol. 54. - P. 201 - 221.

144. Stott, EJ. Respiratory syncytial virus: brief review / E.J. Stott, G. Taylor // Arch. Virol. 1985. - Vol. 84. - P. 1 - 52.

145. Taylor, G. Protective on the fusion protein of respiratory syncytial virus recognized by murine and bovine monoclonal antibodies / G. Taylor, E. J. Stott, J. Furze, J. Ford, P. Sopp // J. Gen. Virol. 1992. - Vol. 73. -P. 2217 - 2223.

146. Taylor, G. DNA vaccination« against respiratory syncytial virus in young calves / G. Taylor, G. Bruce, A.F. Barbet, S.G. Wyld, L.H. Thomas // Vaccine 2005.-Vol. 23.-P. 1242- 1250.

147. Teng, M.N. Identification of the respiratory syncytial virus proteins required for formation and passage of helper-dependent infectious particles / M.N. Teng, P.L. Collins // J: Virol: -1998. Voli 72'. - P;.5707 - 5716.

148. Teng, M.N. Altered growth characteristics of recombinant respiratory syncytial virus which do not produce NS2 protein / M.N. Teng, P.L. Collins // J. Virol. 1999. - Vol. 73. - P. 466 - 473.

149. Thomas, L.H. The possible role of respiratory syncytial virus and Pasteurella spp. in calf respiratory disease / L.H. Thomas, E.J. Stott, P.W. Jones, N.J. Jebbett, A.P. Collins // Vet. Rec. 1980; - Vol. 107. - P. 304 - 307.

150. Trudel, M. Comparison of caprine, human and bovine strains of respiratory syncytial vims / M. Trudel, F. Nadon, C. Belanger, I. Alain, C. Seguin, G. Lussier // Arch. Virol. 1989. - Vol. 107. - P. 141 - 149.

151. Uttenthal, A. Viral aetiology of enzootic pneumonia in Danish dairy herds: diagnostic tools and epidemiology / A. Uttenthal, N.P. Jensen, J.Y. Blom // The Veterinary Record 1996. - Vol. 139. - P. 114 - 117.

152. Valarcher, J.-R. Evolution of bovine respiratory syncytial virus / J.-R. Valarcher, R. Schelcher, H. Bourhy // J. Virol. 2000. - Vol. 74. -P. 10714- 10728.

153. Valarcher, J-R. Bovine Respiratory Syncytial Virus Infection; J-F. Valarcher, G. Taylor // Vet. Res. 2007. - Vol. 8. - P. 153 - 180.

154. Valentova, V. Detection of Bovine Respiratory Syncytial Virus in Cell Cultures by Nested RT-PCR and Use of the Method for Virus Identification in Clinical Samples / V. Valentova, K. Kovalik, I. Pikal // Acta Vet. Brno. -2003.-Vol. 72.-P. 115-122.

155. Valentova, V. Restriction enzyme analysis of RT-PCR amplicons as a rapid method for detection of genetic diversity among bovine respiratory syncytial virus isolates / V. Valentova, A.F. Antonis, K. Kovarcik // Vet. Microbiol.-2005.-P. 1 12.

156. Van der Poel, W.H.M. Respiratory syncytial virus infection in human begins and in cattle / W.H.M. Van der Poel, A. Brand, J.A. Kramps, J.T. Van Oirschot// J. Infect. Dis. 1994. - Vol. 29. - P. 215 - 228.

157. Verhoeff, J. Bovine respiratory syncytial virus infection young dairy cattle: clinical and haematological findinys / J. Vehoeff, M. Van der Ban, A.P.K.M.I. Nieuwstadt // Vet. Rec. 1984. - Vol. 114. - P. 9 - 12.

158. Vilcek, S. Development of Nested PCR Assays for Detection of Bovine Respiratory Syncytial Virus in Clinical Samples/ S. Vilcek, M. Elvander, A.

159. Bllagi-Pordany, S. Belak // Journal of Clinical Microbiology. 1994. - Vol. 32. -P. 2225-2231.

160. Viuff, B. Sites of replication of bovine respiratory syncytial virus in naturally infected calves as determined by in situ hybridization / B. Viuff, A. Ut-tenthal, C. Tegtmeier, S. Alexandersen // Vet. Pathol. 1996. - Vol. 33. -P. 383 -390.

161. Yaegashi, Gr Genetic and antigenic analyses of bovine respiratory syncytial virus detected in Japan / G. Yaegashi, Y. M. Seimiya, Y. Seki, H. Tsunemitsu // J. Vet. Med. Sci. 2005. - Vol. 67. - P. 145 - 150.

162. Ye§ilbag, K. Seroprevalence of bovine respiratory viruses in Northwestern Turkey / K. Ye§ilbag, B. Giingor // Trop Anim Health Prod. 2008. -Vol. 40.-P. 55-60.

163. Zimmer, G. Proteolytic activation of respiratory syncytial virus fusion protein / G. Zimmer, L. Budz, G. Herrler // J. Biol. Chem. 2001. - Vol. 276.-P. 31642-31650.

Информация о работе

Войтова, Ксения Васильевна
кандидата ветеринарных наук
Новосибирск, 2011
ВАК 06.02.02

Диссертация

Диагностика респираторно-синцитиальной инфекции крупного рогатого скота методом полимеразной цепной реакции - тема диссертации по сельскому хозяйству, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы