Усовершенствование технологии производства хитозана для получения биологически активных препаратов

Бараковский, Иван Александрович

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Усовершенствование технологии производства хитозана для получения биологически активных препаратов
ВАК РФ 03.01.06, Биотехнология (в том числе бионанотехнологии)

Автореферат диссертации по теме "Усовершенствование технологии производства хитозана для получения биологически активных препаратов"

ГНУ «Всероссийский научно-исследовательский и технологический институт биологической промышленности» Российской академии сельскохозяйственных наук

На правах рукописи

БАРАНОВСКИЙ ИВАН АЛЕКСАНДРОВИЧ

УСОВЕРШЕНСТВОВАНИЕ ТЕХНОЛОГИИ ПРОИЗВОДСТВА ХИТОЗАНА ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫХ ПРЕПАРАТОВ.

03.01.06-биотсх1!оло1ия (в том числе биоманотсхнологии)

Автореферат диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Щелково-2010 г.-

004606703

ГНУ «Всероссийский научно-исследовательский н технологический инсттут биологической промышленности» Российской академии сельскохозяйственных наук

На правах рукописи

БАРАКОВСКИЙ ИВАН АЛЕКСАНДРОВИЧ

УСОВЕРШЕНСТВОВА1ШЕ ТЕХНОЛОГИИ ПРОИЗВОДСТВА ХИТОЗАНА ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫХ ПРЕПАРАТОВ.

03.0) .06-биогсхнолопш (в том числе бнопанотехнологии)

Автореферат диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Щелково - 2010 г.

Работа выполнена во Всероссийском научно-исследовательском и технологическом институте биологической промышленности Россельхозакадемии

Научный руководитель: доктор биологических наук

Гринь Светлана Анатольевна

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор

Клюкина Валентина Ивановна

доктор биологических наук, профессор Тихонов Игорь Владимирович

Ведущая организации: ГНУ «Всероссийский научно-исследовательский институт экспериментальной ветеринарии им. Я.Р.Коваленко» (ВИЭВ)

Защита состоится 18 июня 2010 г. в 10 часов на заседании диссертационного совета во Всероссийском научно-исследовательском и технологическом институте биологической промышленности: 141142, Московская область, Щелковский р-он, п/о Кашинцево, пос. Биокомбината, ВНИТИБП, тел./факс: 526-43-74; E-mail: vnitibp@mail.ru.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ВНИТИБП. Автореферат разослан 17 мая! 2010 года.

Ученый секретарь ,

диссертационного совета,

кандидат биологических наук 7у ЮД- Фролов

1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

1.1.Актуальность темы. Хитин был открыт в 1811 г. (H. Btaconnot, A. Odier), хитозан - в 1859 г. (С. Rouget), хотя свое нынешнее название получил в 1894 г. (F. Hoppc-Seyler). В первой половине XX века к хитину и его производным был проявлен заслуженный интерес, в частности к нему имели непосредственное отношение три Нобелевских лауреата: Е. Fisher (1903) синтезировал глюкозамин; Р. Karrer (1929) провел деградацию хитина с помощью хитиназ и, наконец, W.N. Naworht (1939) установил абсолютную конфигурацию глюкозамина. В России первые работы по хитину относятся к 1933 -1934 гг. (П.П. Шорыгин), хотя широкомасштабные исследования были начаты около 30 лет назад. Сегодня интерес к этим биополимерам небывало возрос. Чем больше ученые узнают о свойствах хитина и хитозана, тем шире сфера их практического использования. С каждым годом возникают совершенно новые h неожиданные направления. К числу основных направлений использования хитозана можно отнести медицину, ветеринарию, сельское хозяйство, косметологию и пищевую промышленность (А.И.Албулов, В.П.Варламов, A.B. Гринь и др., 2000-2009 гг.).

От способа получения хитозана и метода его контроля зависит его качество и стандартность (К.Г. Скрябин, Г.А. Вихорев, В.Г1. Варламов, 2002; В.М. Быкова, C.B. Немцев, 2002; А.И. Албулов и др., 2005).

Биологически активные вещества (БАВ), нссмсцифическис средства, которые производятся из компонентов различного природного происхождения (морепродукты, микроорганизмы, животные, растения и т.д.) используются в качестве подкормки для животных, птиц, насекомых и растений, оказывают стимулирующий иммунитет, антимикробное, сорбциопное, антиоксидантное воздействие, улучшают- качество обрабатываемого продукта и находят все более широкое применение в ветеринарии.

Биологически активные вещества, обладающие способностью воздействовать на иммунокомпетентные системы, делятся на экзогенные и эндогенные.

Подавляющее большинство первых - это вещества микробного происхождения (бактериального и грибкового). БАВ эндогенного происхождения условно разделяют на две группы: иммунорегуляторные пептиды и цитокины. Пептиды представляют собой в основном экстракты из органов иммунной системы (тимуса, селезенки) или продукты их жизнедеятельности (костного мозга). Под цитокинами понимают всю совокупность биологически активных белков, продуцируемых лимфоцитами и макрофагами: интерлейкины, моно-кины и интерфероны (Е.В. Крыжановская, 2008).

До настоящего времени данные связи между физико-химическими характеристиками хитозана и его биологическими свойствами носят разрозненный и не систематический характер (С.Н. Куликов, 2006).

Одним из основных направлений в промышленной биотехнологии является обеспечение животноводства и ветеринарии эффективными и качественными препаратами, в том числе диагностическими. Несмотря на то, что ветеринарная практика имеет в своем распоряжении большой набор диагностических препаратов, увеличение номенклатуры, улучшение качества и стандартизации диагностических тест-систем для практических лабораторий по-прежнему остается актуальной задачей (И.Н. Матвеева, 2008).

1.2.Цель и задачи работы. Целью настоящей работы является разработка и усовершенствование технологий получения хитозана и биологически активных добавок для производства диагностических и лечебных препаратов. Для достижения поставленной цели решались следующие задачи:

1. усовершенствовать технологию изготовления хитозана для использования его в качестве адъюванга;

2. разработать способ получения биологически активной добавки из перепелиных яиц;

3. провести исследования по увеличению выхода количества отрицательных и гипериммунных сывороток животных для изготовления иммуноферментных тест-систем с использованием хитозана и БАВ из перепелиного яйца;

4.провести исследования но изучению влияния хитозана на жизнеспособ-

ность цсркарий семейства &/гЫояотаИс/ае и создание на его основе защитных средств от церкариоза.

1.3.Научная новизна. Впервые разработан технологический процесс получения глюкозамина, путём солянокислого гидролиза хитина, оптимизированы отдельные стадии процесса его выделения и очистки.

Впервые разработан способ получения БАВ (пищевой добавки) из свежих перепелиных яиц (не более 7-ми суток хранения в стерильных условиях), размолотых со скорлупой до однородной гомогенной массы, фильтрованной, дио-фильно высушенной при отрицательном давлении не ниже 50 микрометров ртутного столба при начальной температуре минус 60-65 ОС в течение 48-ми ч, затем измельченной и расфасованной в желатиновые капсулы. Таким образом, высокотехнологичный способ получения из перепелиных яиц биологической пищевой добавки, в которой сохранены в течение 12-ти месяцев при температуре хранения 4-25 °С все природные качества свежего перепелиного яйца, обогащенного растворимым кальцием (Патент РФ № 2009105619/13 от 19.02.09).

Впервые для увеличения выхода сыворотки крови в качестве кормовой добавки для животных использовали хитозан и БАВ из перепелиных яиц и разработан способ получения отрицательных референс-еывороток (Патент № 2008132387/15 от 07.08.08 г.) и положительных сывороток крови для контроля качества иммуноферментных тест-систем, предназначенных для выявления специфических антител к вирусным рсспиратурным инфекциям в биологических жидкостях организма крупного рогатого скота (Патент № 2008132390/13 от 07.08.08 г.).

Впервые для создания высокоэффективных защитных средс тв от церкариоза (семейства 8'с1пх1о.';ота!!^ае) использован хитозан.

1.4. Практическая значимость работы.

1.Усовершенствованы процессы получения глюкозамина из хитина камчатского краба.

2.Подобраны эффективные формы хитозана в качестве адъюванта.

3.Разработан способ получения БАВ из перепелиного яйца.

4. Разработан способ получения лечебных гелей, содержащих хитозан,

ДБФ и ЭДТА.

1.5. На защиту выносятся:

1. Усовершенствование технологии изготовления хитозана для использования его в качестве адьюванта;

2. Способ получения биологически активной добавки из перепелиных яиц;

3. Исследования по использованию хитозана и биологически активной добавки из перепелиного яйца для увеличения выхода отрицательных и гипериммунных сывороток животных для иммуноферментных тест-систем;

4. Исследование по изучеиию влияния хитозана на жизнеспособность цер-карий семейства Schistosomatidae и создание на его основе защитных средств от церкариоза.

1.6. Апробация работы. Материалы диссертации докладывались:

- на заседаниях Ученого Совета Всероссийского научно-исследовательского и технологического института биологической промышленности, Щелково, 2006-2010 гг.;

-на Международной конференции, Краснодар, 2009г.;

-на Международной:научно-практической конференции, посвященной 40-летию Всероссийского научно-исследовательского и технологического института биологической промышленности, .Щелково, 2009г.

1.7. Публикации результатов исследований. По теме диссертации опубликованы 6 научных работ, в том числе 1 патент РФ, и 2 публикации в реферируемых журналах, рекомендованных ВАК РФ.

1.8. Внедрение. В 2006-2010 гг., изготовлены и паспортизированы по разработанной методике 113 кг низкомолекулярного хи тозана и экспериментальных серий БАВ из перепелиного яйца для производства биопрепаратов.

1.9. Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 134 страницах машинописного текста и включает введение, обзор литературы, материалы и методы исследований, собственные исследования, обсуждение

полученных результатов, выводы, список литературы и приложения. Диссертация иллюстрирована 17 таблицами и 24 рисунками. Список литературы содержит 275 источников, в том числе 145 зарубежных.

2. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ 2.1. Материалы и методы исследований

Исследования проводились в отделе получения биологически активных препаратов ГНУ «Всероссийский научно-исследовательский и технологический институт биологической промышленности».

В работе использовали: инактивированную вакцину против ротови-русной инфекции и колибактсриоза; культуру клеток СЛЭВ; питательные среды Игла и 199; мясо-пептоный агар; хитин; мелкодисперсный хитозан ; дистиллированную воду; алюмокалисвые квасцы; тсотропин; 10%-ный раствор нейтрального формалина; 12,5 М соляную кислоту; ЭДТА; дибутилфталат (ДБФ); 96%-ный этиловый спирт; активированный уголь с размером зерна 3 мм; КРС - 16-18 мес.; лабораторных животных (белые крысы и морские свинки): живые личинки трематод семейства Вск'Шоъотайдае-ТпсЪоЪ'йЬата хрр; лабораторное оборудование (реактор с кислотоустойчивым покрытием и механическим приводом; стеклянная емкость для кристаллизации; вакуумный фильтр; кислотосборник; предметные стекла; микроскоп БМ-51-2).

Для проверки адъювантных свойств хитозана исследования проводились на белых крысах. Контролем служили алюмокалисвые квасцы в общепринятых концентрациях. В качестве антигенов использовали инактивированные вакцины против ротавирусной инфекции и колибакгериоза. Ротавирусы выращивали на культуре клеток СПЭВ с использованием питательных сред Игла и 199, эшери-хии выращивали на мясо-псптонном агаре. Тигр вируса в вакцине был 7,0 Ьд ТЦДяи«, эшерихий - 5 млрд. микробных тел в 1 мл. инактивацию вирусов и бактерий проводили теотропином в конечной концентрации 0,2%. В инактивированные антигены вносили хитозан различных препаративных форм до конечной концентрации 0,25%, тщательно перемешивали и вводили в/м крысам в до-

зе 0,5 мл. Через 7 дней животных тотально обескровливали и в сыворотках крови определяли наличие антител к рогавирусу в РИГА, к эшерихиям - в РА.

Для оценки морфологических изменений в тканях крыс под воздействием вакцины с хитозаном до вакцинации, а также на 3- и 7-й дни после нее у крыс отбирали ткань с: места введения препаратов. Материал фиксировали в 10%-ном растворе нейтрального формалина.

Для оптимизации процесса получения пнокозамина из хитина в качестве сырья использовался хитин, изготовленный в отделе получения БАВ ВНИ-ТИБП из панциря камчатского краба с содержание влаги 5-7% и минеральных веществ 0,16%. Для гидролиза хитина применяли 12,5М соляную кислоту. Очистку получаемого продукта осуществляли 96%-ным этиловым спиртом и активизировали углем с размером зерна 3 мм.

При исследовании влияния хитозана на жизнеспособность церкарий семейства Schislosomatidae использовали живые личинки трематод - Trichobilhar-zia spp.

В качестве церкарицидных средств использовали хитозаны с различной молекулярной массой и его композиции в составе гелей.

Методика исследования заключалась в нанесении 5 мкл тестируемого вещества на дно лунки предметного стекла тонким слоем с последующим внесением 150 мкл воды с церкариями. Наблюдение за поведением церкарий проводилось с использованием микроскопа БМ-51-2 в течение 20 мин. Фиксировалось время потери плавательной активности (ППА) и гибели всех церкарий.

Статистическая обработка полученных результатов проводилась с помощью стандартных программ на ПЭВМ.

2.2 РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

2.2.1. Совершенствование технологии изготовления хитозана для использования его в качестве адъюванта

В основе процесса получения пнокозамина лежит метод химического гидролиза. Нами предложен новый менее энергоемкий способ выделения глюкозамина

из реакционной смеси, предусматривающий осуществление гидролиз хитина с помощью концентрированной соляной кислоты (соотношение хитин-кислота 1:3) в реакторе с кислотоустойчивым покрытием и механическим приводом при температуре 95 °С в течение 3 ч (рис. 1).

Загрузка

Рис.1.Принципиальная схема получения глюкозамина гидрохлорида из хитина камчатского краба Примечание:

I -реактор; 2-стешниая емкость; 3-вакуум- фильтр; 4-кислотосборник; 5-фильтр

После завершения процесса гидролиза реакционная смесь из реактора (1) перекачивалась насосом в емкость (2) для кристаллизации в течение 15 ч при комнатной температуре. Далее для более эффективного осаждения глюкозамина в гидролизаг добавляли 10% (от объема гидролизата) этилового спирта и полученная смесь выдерживалась в течение 3 ч при температуре 5°С. Выпавший темный осадок отделяли фильтрованием на вакуумном фильтре (3) (кислота направлялась на регенерацию) и переносили в емкость (4), добавляли этиловый спирт (соотношение хитин-спирт 1:2) и перемешивали в течение 10 мин., после чего фильтровали на вакуумном фильтре (5) для удаления примесей. Процесс промывки кристаллов глюкозамина повторяли дважды. Полученный технический продукт высушивали под вытяжкой при комнатной

температуре. Выход продукта составил 65-72%, чистота - 87-90%.

Для получения чистого препарата проводили дополнительную стадию очистки. Технический продукт растворяли в воде при перемешивании при температуре 85-90°С в соотношении (массы хитина и воды) 1:1,5. Затем добавляли активированный уголь (соотношение «о массе хитин-уголь 10:1) и перемешивали 10 мин. После этого полученный бесцветный или бледно-желтый раствор отправляли на лиофильную сушку.

Степень чистоты продукта была определена с использованием высокоэффективной обращено-фазовой хроматографии.

Результаты, которой показали, что введение этапа дополнительной очистки позволило получить 0(+)-глюкозамин со степенью чистоты 98% ,ири этом выход готового продукта составил 55-60%.

Таким образом, разработан технологический процесс получения глюко-замина, путем солянокислого гидролиза хитина, оптимизированы отдельные стадии процесса выделения и очистки. В результате получен глюкозамин гидрохлорид со степенью чистоты 98%, удовлетворяющий требованиям, предъявляемым к ветеринарным препаратам.

Кроме того, были проведены исследования по усовершенствованию технологии получения таких производных хитозана как глутамат, сукцинат, а также его низкомолекулярных форм с целью дальнейшего сравни тельного изучения их адъювантных свойств.

2.2.2. Способ получения биологически активной добавки из перепелиных яиц.

Получение биологически активной пищевой добавки из перепелиных яиц в качестве натуральных порошков из вязких жидкостей позволяет сохранить в течение года все качества свежего перепелиного яйца. Кроме того, в составе биологически активной пищевой добавки находится растворимый кальций из скорлупы яйца, который является ценной минеральной добавкой.

По качественному составу перепелиные яйца отличаются от куриных яиц по многим питательным веществам. Перепелиным яйцам издавна припи-

сывали лечебные свойства еще до нашей эры. В них содержится большое количество белков: разница от куриных яиц составляет поч ти 9% в основном за счет незаменимых аминокислот: трионина больше на 25%, гистидина - на 27%, лизина - на 22,5%; отмечается повышенное содержание минеральных веществ, в частности, железа в 2 раза, а также магния, кальция, фосфора и цинка, витаминов группы В. Рибофлавина в перепелином яйце в три раза больше чем в курином.

Нами разработан высокотсхнологичсский способ получения биологически активной пищевой добавки с длительным и максимальным сохранением всех качеств диетического перепелиного яйца, обогащенного растворимым кальцием из скорлупы самого яйца и с минимальным осеменением посторонней микрофлорой.

Способ получения препарата заключается в следующем. Свежие перепелиные яйца, не более 7 сут. хранения с момента их сбора при температуре 2-8 °С, инспектируют, удаляют яйца с поврежденной скорлупой, помещают в сетчатые лотки и моют в проточной питьевой воде при температуре 40°С, вынимают и выдерживают в лотках 20 мин. для удаления влаги, затем обрабатывают 70% спиртом-ректификатом методом погружения в емкость на 5-7 мин., вынимают, выдерживают 10 мин. и через шлюз, оборудованный бактерицидными лампами, подают в стерильную комнату для их переработки. В стерильном боксе яйцо вместе со скорлупой измельчают до однородной гомогенной массы, фильтруют, разливают в стерильные кюветы из нержавеющей стали для глубокой заморозки при температуре от минус 60-65 °С и высушивают в течение 48ч в лиофилизаторе при отрицательном давлении не ниже 50 мкм ртутного столба при температуре не выше 40°С. Полученная биологическая пищевая добавка из перепелиных яиц золотисто-желтого цвета, без постороннего запаха и привкуса, с незначительными комочками, легко измельчаемыми рукой. Высушенный продукт расфасовывают с помощью капсулятора в желатиновые капсулы по 0,2 г, затем капсулы расфасовывают в пластиковый флаконы.

Полученный концентрат из свежих перепелиных яиц путем сублимации при низкой температуре содержит комплекс незаменимых аминокислот, витаминов группы В и микроэлементов Са, Р, Mg, Fe, Zn.

Таким образом, высокотехнологичный способ получения из перепелиных яиц биологической пищевой добавки, в которой сохранены в течение 12 мсс. хранения при температуре от 4 до 25 °С все природные качества свежего перепелиного яйца, обогащенного растворимым кальцием. Готовый продукт легок в транспортировке, не .требует особых условий хранения и удобен при применении его в длительных экспедициях.

2.2.3. Использование хитозана и биологически активной добавки из перепелиного яйца дли увеличения выхода при получении отрицательных и гнпериммуниых сывороток животных.

2.2.3.1. Изучение адъювантных свойств различных форм хитозана

Специфическая профилактика инфекционных заболеваний сельскохозяйственных животных - одна из наиболее эффективных мер борьбы с ними. При конструировании противовирусных и антибактериальных вакцин вопрос использования эффективных адыовантов до настоящего времени остается актуальным. В связи с этим проведено изучение иммуностимулирующих свойств различных форм хитозана в системе in vivo.

Для проверки адъювантных свойств хитозана исследования проведены на белых крысах. В качестве антигенов использовали инактивироваиную вакцину против ротавирусной инфекции и колибактериоза, которую вводили внутримышечно крысам в дозе 0,5 мл. Через 7 дней животных тотально обескровливали и в сыворотках крови определяли наличие антител - к ротавирусу в РИГА, эшерихням - в РА. В качестве кошроля использовали алюмокалиевые квасцы в общепринятой концентрации.

Для оценки морфологических изменений в тканях крыс под воздействием вакцины с хитозаном до вакцинации, а также на 3- и 7-й дни после нее у крыс отбирали ткань с места введения препаратов. Материал фиксировали в 10% растворе нейтрального формалина.

Введение крысам вакцины с хитозаном показало, что на месте введения у животных не отмечено замешых макроскопических изменений, а при использовании алюмокалиевых квасцов наблюдалась воспалительная реакция. В таблицах 1 и 2 представлены результаты определения титров антител к вирусам и бактериям у крыс после использования различных адыовантов.

Таблица 1

Титры антител к ротавирусу у крыс с использованием различных

адыовантов

ЛУ6 Адыооак; 'Гпф антител к (ютавлрусу

Геометрический 1-ов2

1 Хитозан глутамат 1:16 4,0

2 Хитозан сукцинат 1:8 3.0

3 Хитозан высокомолекулярный ММ 495, степень леоп. 81% 1:8 3.0

4 Хитозан шпкомолскулярный ММ КО, степень дс-ац. 87% 1:16 4.0

5 Ан гш-сн (без адьюиантов) 1:8 3,0

6 Алюмокалиевые квасим 1:4 2.0

7 Контроль 1:2 1,0

Полученные результаты свидетельствуют о том, что наибольшей адыо-вантной активностью обладает хитозана сукцинат, хитозан низкомолекулярный и алюмокалиевые квасцы. Меньшей активностью обладают хитозана глутамат и хитозан высокомолекулярный.

Следующим этапом исследований явилось изучение морфологических изменений в тканях крыс под воздействием вакцины с хитозаном и алюмокалиевы-ми квасцами после вакцинации.

Характерно, что основные изменения в тканях крыс отмечены через 3 дня после вакцинации. На 7-й день разницы морфологических изменений в тканях крыс опытной и контрольной групп не обнаружено.

Таблица 2

Титры ант ител кэшерихиям у крыс с использованием различных адыовантов

№№ : Адыовант Ти гр антител к Е.соИ, К88 Тиф антител к Е.соН, А20

Геометрический 1-ОЙ Геометрический ЬЕ2

1 X птичий глугамат 1:32 5,0 1:64 6,0

2 Хитоззн сукцинат 1:32 5,0 1:128 7,0

3 Хитозан высокомолекулярным ММ 495, степень деац. 81% 1:32 5,0 1:32 5,0

4 Хиточан шгжомолс-кулярный ММ 80, степень деац. 87% 1:128 7,0 1:256 8,0

5 Антиген (без адыовантов) 1:8 3,0 1:2 1,0

6 АЛ10мок;ишспыс квасцы 1:64 6,0 1:128 7,0

7 Контроль 1:2 1,0 0 0

Полученные результаты свидетельствуют о том, что использование хигозана в качестве адъюванта вакцины способствует активному биосинтезу противовирусных и антибактериальных антител, а на месте введения отмечалась выраженная иммунологическая лимфоцитарно-макрофагальная реакция, свидетельствующая об активном иммунном ответе у животных.

Таким образом, использование хигозана в качестве стимулятора поствакцинального иммунитета оправдано и может широко использоваться в иммунологических исследованиях.

2.2.3.2. Получение отрицательных и гнпериммунпмх сывороток для изготовления иммуноферментных тест-систем от животных, получавших с кормом хнтозан и БАВ из перепелиного яйца

Дня уменьшения падежа животных, увеличения выхода отрицательной рсфе-ренс-сыворотки и стандартной положительной от КРС и морских ал шок, получавших в качестве подкормки мелкодисперсный хитозап и БАВ из перепелиного ,яйца крупному рогатому скоту в возрасте 16-18 мес. в качестве подкормки к рациону включали на сутки 2 г сухого хитозана (100 мл водного 2-х % раст вора) п 3 г БАВ из перепелиного яйца, а морским свинкам соот ветственно 0,21- и 0,3 г в т ечение 1 мес.

[В результате привесы у КРС и морских свинок, которым добавляли в рацион хитозан и БАВ из перепелиного яйца увеличивались за месяц исследований в среднем на 10% с лучшими клиническими показателями. Способ получения отрицательных г.референе-сывороток для контроля, качества иммуноферментнцх,тест-систем, предназначенных для выявления специфических антит ел к вирусным респи-рагурным инфекциям в биологических жидкостях КРС, включил от бор донорских сывороток крови животных и их титрование в иммуноферментном анализе. (ИФА). Затем для адсорбции и.последующего удаления специфических антител из сыворотки ее пропускали через иммуносорбент в замкнутом цикле, а в качестве пммуносор-бента использовали Вт СИ сефарозу 4В с иммобилизованным в се ст руктуре антигенами вируса, причем в качестве отрицательных рефсренс-еывороток отбирали сыворотки крови с оптической плотностью в диапазоне от 0,102 опт. ед. до оптической плотности меньше критической (ОП крит. - 0,1242) (Заявка на Патент РФ № 20081323287/15 от-7.08.08.).

Получение стандартной положительной сыворотки крови для контроля качества иммуноферментных тест-систем, предназначенных для выявления специфических антител к вирусным респиратурным инфекциям в биологических жидкостях КРС, включал отбор сывороток и их титрование. Затем специфические ант итела адсорбировали в замкнутом цикле путем пропускания сывороток через иммуносорбент Вг СИ сефарозу 4 В с иммобилизированными в ее структуре антигенами виру-

сов, вызывающих респираторные вирусные инфекции КРС с последующей элюцией специфических антител. В качестве положительных сывороток отбирали сыворотки с оптической плотностью в диапазоне от 0,949 до 1,309 опт. ед. (Положительное решение на заявку № 2008132390/13 от 07.08.08).

Применение отработанного метода экономически оправдано за счет сокращения сроков получения позитивных сывороток крови к вирусным респираторным инфекциям КРС и даст возможность повторно многократно использовать колонку с иммуносорбснтом.

Кроме того, использование животных-доноров, которым дополнительно в корм добавляли хитозан и БАВ из перепелиного яйца, позволил увеличить выход этих биопрепаратов.

2.2.4. Влияние хнтозана на жизнеспособность перкарин семейства Schistosomatidae и создание на его основе защитных средств от церкариоза

Церкариоз - паразитарное заболевание, вызванное внедрением церкарий (водных личинок -трематод) семейства Schistosomatidae в кожу человека. Церкариоз согласно Международной статистической классификации болезней классифицируется как церкариальпый дерматит. Это заболевание вызывают водные личинки трёх видов трематод семейства Schistosomatidae - Trichohilharzia szidati, Trichobil-harzia franki и BUharziella polonica. Окончательным хозяином для церкарии Trí-chobil-harzia sp. служат водоплавающие птицы, а человек выполняет роль неспеци-фичсского хозяина, в коже которого после внедрения они погибают, вызывая церкариальпый дерматит.

Наиболее перспективным направлением борьбы с церкариозом является разработка индивидуальных средств защиты людей от внедрения церкарии в кожу человека и предотвращение цистосомного дерматита. Разрабо тка и применение защитного крема, содержащего вещества способные подавлять жизнеспособность личинок- трематод может стать простым способом от церкариоза. В литературных источниках описаны церкарицидные свойства экстрактов лекарственных растений, но в основном это относится к представителям тропической флоры.

В последнее время накопилось значительное количество экспериментальных данных, указывающих на высокую биологическую активность хитозана. Установлена противовоспалительная, антибактериальная, противовирусная и анти-фунгальная активность, способность связываться с белками, « том числе с белками личинок трематод. На основе хитозана Moiyr быть созданы гели, используемые для получения препаратов, обладающих церкарисцидным действием. Носители на основе хитозана стабильны и нетоксичны для кожи.

В связи с этим изучали влияние хитозана на жизнеспособность церкарии семейства Schistosomatidae и создание на их основе защитных средств от цсркариша.

В качестве церкарицидных средств использовались различные концентрации хитозаны с различной молекулярной массой и его композиции в составе гелей.

Изучая действие различных концентраций хитозана с молекулярной массой 42,5 тыс. со степспыо деацитилирования на жизнеспособность церкарий, установили, что хитозан вызывает гибель всех церкарий при концентрации выше 0,0001%, а обездвиживание церкарий происходит при концентрациях хитозана на два порядка ниже.

В окончательный вариант церкариецидного геля кроме хитозана был включен ЭДТА, способный ингибировать сернновые протеазы, которые входят в состав секрета, выделяемого личинками трематод при контакте с кожей.

Исследования показали, что при одинаковой концентрации химических веществ в составе геля и крема, церкариецидное действие геля заметно быстрее вызывало гибель церкарий.

Для окончательных вариантов состава гелей с церкариецпдпыми свойствами были выбраны следующие компоненты: ЭДТА, хитозан и дибушлфталат (ДБФ), который обладает антигельминтными свойствами..

Из пяти комбинаций действующих веществ, наиболее эффективными оказались только два варианта ЭДТА+ДБФ и ЭДТА+ДБФ+хитозан, вызывающих обездвиживание церкарий в течение нескольких мни. и приводящих их к

гибели в течение 5 мин. Действие ЭДТА на жизнеспособность личинок трема-

год можно исключить, так как этот компонент добавлялся только в качестве ингибитора протеаз секрета желез внедрения.

Таким образом, наличие в защитном геле в качестве действующего вещества одного хитозана не приводит к быстрой гибели церкарий, а наличие в нем хитозана и ДБФ, приводит к высокой церкарисцидпости этого комплекса.

Наличие хитозана в присутствие ЭДТА и ДБФ усиливает церкариецидное действие лечебного геля. Проведенные исследования позволили создать эффективные средства защиты кожи человека от церкариоза на основе гелей содержащих хитозан, ДБФ и ЭДТА.

3. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

По результатам проведенных исследований составлено нормативно-техническая документация и заявки на Патент РФ: '

- технический регламент производства низкомолекулярного хитозана, утвержденный директором ВНИТИБП;

- способ получения БАВ из перепелиных яиц;

- способ изготовления лечебных гелей, содержащих хитозан, ДБФ и ЭДТА;

- способ получения стандартной положительной сыворотки крови для иммуноферментных тест-систем, предназначенных для выявления специфических антител к вирусным респираторным инфекциям крупного рогатого скота. Положи тельное решение на Патент № 2008132390/13 от 07.08.08.;

- способ получения отрицательных референс-сывороток иммуноферментных тест-систем, предназначенных для выявления специфических антител к вирусным респираторным инфекциям крупного рогатого скота. Заявка на Патент РФ № 2008132387/15 от 07.08.08..

4. ВЫВОДЫ м .

1. Усовершенствован технологический процесс получения хитозана, путем солянокислого гидролиза хитина, оптимизированы отдельные с тадии процесса выделения и очистки препарата.

2.Биологически активные вещества, получаемые из цельного свежего не1' -репслиного яйца после лиофилизации и расфасовки в желатиновые капсулы, сохраняет свои свойства без изменения при темпера туре от 4 до 25 0 С в течение 12-ти мес. хранения. Готовый продукт легок в транспортировке, не требует особых условий хранения и удобен при применении его в длительных экспедициях.

3. Иснользонанн^Атозана в качестве лдъювапта при изготовлении вакцин для животных способствует активному биосинтезу противовирусных и антибактериальных антител, а на месте введения отмечай ся выраженная иммунологическая лимфоцитарно-макрофагальная реакция, свидетельствующая об активном иммунном отчете.

4. Применение с кормом хитозана и биологически активных веществ из перепелиного яйца способствует увеличению выхода отрицательных рсфсренс-сывороток и стандартных положительных сывороток кроим животных при получении иммуноферменгных тест-систем, выявляющих специфические антитела к вирусным респираторным и бактериальным инфекциям крупного рога того скота. .; ;

5. Разработан и испытан препарат, содержащий хигозап и дпбутнлфталат, обладающий высокой церкариецидной активностью.

6. СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ.

1. Крыжаповская Е.В., Гринь A.B., Шинкарев С.М., Фролова М.А., Албулов А.И., Бондарева H.A., Хабаров В.Б., Еремец Н.К., Рахманина Е.В., Ба-раковский И.А.. Изучение антимикробного действия низкомолекулярных фракций хитозана на микобактерии /Журн. «Ветеринария и кормление» №6. -2008.-С.31-33.

2.Фролова М.А., Самуйленко Â.JI., Албулов А.И., Варламов В.П., Шинкарев С.М., Еремец Н.К., Гринь A.B.j Еремец В.И. Мищевцова А.Г., Бараков-ский И.А. Практические аспекты применения хитозана в ветеринарной практике// Труды Кубанского государственного аграрного университета. Серия: ветеринарные науки, Краснодар, 2009, №1 (ч.1.). -С. 300-302.

3. Матвеева И.Н., Кочиш И.И., Бондарева Н.А, Кузнецова C.B., Ере-Мад"н.К., Люлькова Л.С., Бараковский И.А., Салов Д.А., Рахманина Е.В. Способ получения стандартной положительной панели сывороток крови для контроля качества иммуноферментных тест-сис тем, предназначенных для выявления специфических антител к вирусным респираторным инфекциям в биологических жидкостях орг анизма крупного рогатого скота. Положительное решение па Патент № 2008132390/13 от 07.08.08.

4. Красочко П.А., Самуйленко А.Я., Албулов А.И., Еремец Н.К., Барановский И.А., Прудников B.C., Ломако Ю.В. Изучение адъювантных свойств различных форм хитозана // Научные основы производства ветеринарных биологических препаратов: Мат. Мсждунар. Юбилейн. научно-практич. конф. - Щелково,2009,- С. 460-465.

5. Левов А.Н., Бакулин A.B., Варламов В.П., Лопатин С.А., Албулов А.И., Фролова М.А., Гринь A.B., Бараковский И.А. Оптимизация процесса получения глюкозами из хитина камчатского краба // Научные основы производства ветеринарных биологических препаратов: Маг. Междунар. Юбилейн. научно-практич. конф. - Щелково,2009,-С.466-470.

6. Албулов А.И., Фролова М.А., Бараковский И.А. Влияние хитозана на жизнеспособность церкарий семейства SCHISTOSOMAT1DAE и создание на его основе защи тных средств от церкариоза // Научные основы производства ветеринарных биологических препаратов: Мат. Мсждунар. Юбилейн. научно-практич. конф. - Щелково,2009,-С. 483-489.

Отпечатано в ООО «Мещёра», М.О., г. Щёлково, ул. Свирская, 8а Тир. 100 экз., заказ № 198

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Бараковский, Иван Александрович

Список сокращений.

1. Общая характеристика работы.

1.1. Актуальность темы.

1.2. Цель и задачи работы.

1.3. Научная новизна.

1.4. Практическая значимость работы.

1.5. На защиту выносятся.

1.6. Апробация работы.

1.7. Публикации результатов исследований.

1.8. Внедрение.

1.9. Объем и структура диссертации.

2. Обзор литературы.

2.1. Промышленная технология изготовления Хитозана.

2.2. Диагностикумы, иммуноферментный анализ, получения отрицательных и положительных сывороток от животных.

2.3. Способы получения Хитозана.

2.4. Биологическая активность хитозана.

2.5. Применение низкомолекуляриого хитозана в медицине и ветеринарии

2.6. Биологически активные вещества (БАВ).

2.7. Иммуноферментный анализ для диагностики инфекционных болезней.

3. Собственные исследования

3.1. Материалы и методы исследований

4. Результаты исследований

4.1. Совершенствование технологии изготовления хитозана для использования его в качестве адыованта

4.2. Способ получения биологически активной добавки из перепелиных

4.3. Использование хитозана и биологически активной добавки из перепелиного яйца для увеличения выхода при получении отрицательных и гипериммунных сывороток животных

4.3.1. Изучение адъювантных свойств различных форм хитозана

4.3.2. Получение отрицательных и гипериммунных сывороток для изготовления иммуноферментных тест-систем от животных, получавших с кормом хитозан и БАВ из перепелиного яйца.

4.4. Влияние хитозана на жизнеспособность церкарий семейства БсЫбШ-эоша^ёае и создание на его основе защитных средств от церкариоза

4.5. Способ получения отрицательных референс-сывороток для контроля качества иммуноферментных тест-систем, предназначенных для выявления специфических антител к вирусным респираторным инфекциям в биологических жидкостях организма крупного рогатого скота

4.6. Способ получения стандартной положительной панели сывороток крови для контроля качества иммуноферментных тест-систем, предназначенных для выявления специфических антител к вирусным респираторным инфекциям в биологических жидкостях организма крупного рогатого ско

5. Практические предложения.

6. Выводы.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Усовершенствование технологии производства хитозана для получения биологически активных препаратов"

1.1. Актуальность темы. Хитин был открыт в 1811 г. (H. Braconnot, А. Odier), хитозан — в 1859 г. (С. Rouget), хотя свое нынешнее название получил в 1894 г. (F. Hoppe-Seyler). В первой половине XX в. к хитину и его производным был проявлен заслуженный интерес, в частности к нему имели непосредственное отношение три Нобелевских лауреата: Е. Fisher (1903) синтезировал глюкозамин; Р. Karrer (1929) провел деградацию хитина с помощью хитиназ и, наконец, W.N. Naworht (1939) установил абсолютную конфигурацию глюкозамина. В России первые работы по хитину относятся к 1933 — 1934 гг. (П.П. Шорыгин), хотя широкомасштабные исследования были начаты около 30 лет назад. Сегодня интерес к этим биополимерам небывало возрос. Чем больше ученые узнают о свойствах хитина и хитозана, тем шире сфера их практического использования. С каждым годом возникают совершенно новые и неожиданные направления. К числу основных направлений использования хитозана можно отнести медицину, ветеринарию, сельское хозяйство, косметологию и пищевую промышленность (А.И.Албулов, В.П.Варламов, A.B. Гринь и др., 2000-2009гг.).

От способа получения хитозана и метода его контроля зависит его качество и стандартность (К.Г. Скрябин, Г.А. Вихорев, В.П. Варламов, 2002; В.М. Быкова, C.B. Немцев, 2002; А.И. Албулов и др., 2005).

Биологически активные вещества (БАВ), неспецифические средства, которые производятся из компонентов различного природного происхождения (морепродукты, микроорганизмы, животные, растения и т.д.) используются в качестве подкормки для животных, птиц, насекомых и растений, оказывают стимулирующий иммунитет, антимикробное, сорбционное, антиоксидантное воздействие, улучшают качество обрабатываемого продукта и находят все более широкое применение в ветеринарии.

Биологически активные вещества, обладающие способностью воздействовать на иммунокомпетентные системы, делятся на экзогенные и эндогенные. Подавляющее большинство первых - это вещества микробного происхождения (бактериального и грибкового). БАВ эндогенного происхождения условно разделяют на две группы: иммунорегуляторные пептиды и ци-токины. Пептиды представляют собой в основном экстракты из органов иммунной системы (тимуса, селезенки) или продукты их жизнедеятельности (костного мозга). Под цитокинами понимают всю совокупность биологически активных белков, продуцируемых лимфоцитами и макрофагами: интер-лейкины, монокины и интерфероны (Е.В. Крыжановская, 2008).

Заключение Диссертация по теме "Биотехнология (в том числе бионанотехнологии)", Бараковский, Иван Александрович

6. Выводы

1. Усовершенствован технологический процесс получения хитозана, путем солянокислого гидролиза хитина, оптимизированы отдельные стадии процесса выделения и очистки препарата.

2. Биологически активные вещества, получаемые из цельного свежего перепелиного яйца после лиофилизации и расфасовки в желатиновые капсулы, сохраняет свои свойства без изменения при температуре от 4 до 25 0 С в течение 12-ти мес. хранения. Готовый продукт легок в транспортировке, не требует особых условий хранения и удобен при применении его в длительных экспедициях.

3. Использования хитозана в качестве адъюванта при изготовлении вакцин для животных способствует активному биосинтезу противовирусных и антибактериальных антител, а на месте введения отмечается выраженная иммунологическая лимфоцитарно-макрофагальная реакция, свидетельствующая об активном иммунном ответе.

4. Применение с кормом хитозана и биологически активных веществ из перепелиного яйца способствует увеличению выхода отрицательных референс-сывороток и стандартных положительных сывороток крови животных при получении иммуноферментных тест-систем, выявляющих специфические антитела к вирусным респираторным и бактериальным инфекциям крупного рогатого скота.

5. Разработан и испытан препарат, содержащий хитозан и дибутил-фталат, обладающий высокой церкариецидной активностью.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Бараковский, Иван Александрович, Щёлково

1. Авилов B.C., Салажов E.JL, Лебедев А.И. Условия получения диагностических сывороток к вирусам инфекционного ринотрахеита, парагриппа-3 и диареи крупного рогатого скота //Бюл. ВИЭВ. 1979. Т. 36. -С.6-9.

2. Агеев Е.П., Вихорева Г.А., Голуб М.А., Матушкина H.H. Транспортные свойства хитозановых пленок // Новые достижения в исследовании хитина и хитозана. Материалы 5 международной конференции. Под ред.: В.П. Варламова и др. М.: ВНИРО, 1999. - с. 205-206.

3. Амирбеков М, Юров К.П., Караваев Ю.Д., Степанова С.Н., Махмадшоев А. Опыт профилактики парагриппа-3 и хламидиоза ягнят. // Ветеринария 1992.№1. -С.34-36.

4. Астаханова JT.H., Брайнингер М.Г. Методы получения стандартных диагностических сывороток к респираторно-синцитиальному вирусу // Лаб. дело.-1975.-№ 12.-С.730-732.

5. Атамась В.А., Лаврова И.Г. // Изучение гуморальных поствакцинальных антител у крупного рогатого скота, иммунизированного живой и инактивированной вакцинами против инфекционного ринотрахеи-та//Инфекц. Инвазионные болезни с.х. жив. Одесса, 1982,21-25.

6. Атамась В.А., Лаврова И.Г. // Изучение хламидиоза и инфекционного ринотрахеита крупного рогатого скота.// Современные аспекты профилактики инфекц. болезней молодняка с 32-34.

7. Афошошкин В.Н. Разработка и применение ДНК-зонда для выявления геномной РНК вируса вирусной диареи крупного рогатого скота: Автореф. дис. канд. биол. наук. 2002.-20с.

8. Баженов К.С. Распространение вирусов парагриппа-3 и респираторно-синцитиальной инфекции среди телят на откорме в осенне-зимний период. //Бюлл. ВИЭВ. -1983.- Вып.50.- С. 6-8.

9. Березин В.Э., Воркунова Г.К., Мацеевич Г.Р., Зайдес В.М., // Применение метода иммунного («вестерн») блотинга для изучения вирусных антигенов и выявления антител к вирусным белкам. // Вопросы вирусологии.- 1987. №3.- С.317-323.

10. Биология вирусов животных: Учебник /Отв. редактор В.И. Агола, Феннер Ф., Мак-Ослен Б., Мисис С., Сэмбрук Дж., Уайт Д. -М.: Мир, 1977.-Т.1 и 2.-621с.

11. Биотехнология: Учебник /Отв. редактор Воронин Е.С. Санкт-Петербург: ГИОРД, 2005.-792с.

12. Блатун JI. А. Флегмоны и абсцессы — современные возможности лечения // Мед. Научно-практический журнал. Лечащий врач. Вып. 01. -2002. -с. 25-27.

13. Бостанджиева Р., Митов Б., Хараламбиев Х.Е. Иммунофлуоресцентное доказательство респираторно-синцитиальной вирусной инфекции у телят. //Вет. Мед. Науки. София, 1985. -ХХП. -№ 9.1. С.20-26.

14. Бостанджиева Р., Текерлеков М., Хараламбиев Х.Е. Показание на респираторно-синцитиальната вируса инфекция у телятам через реакция за связывание на комплемента. //Вет. Мед. Науки.- София. 1984. -XXI.- № 9. С.45-50.

15. Быков В.П. Состояние и перспективы развития производства хитина, хи-тозана и продуктов на их основе из панциря ракообразных // Материалы Пятой конф. «Новые перспективы в исследовании хитина и хитозана». — М.: ВНИРО. 1999. С. 15-17.

16. Быкова H.H. Разработка иммуноферментного анализа для индикации антигенов вируса парагриппа-3 крупного рогатого скота и антител к нему: Дис. к.б. н. Щелково, 1989.- 148 с.

17. Бычков A.B., Быкова В.М., Кривошеина Л.И. Применение «Хитина» в клинической практике // Современные перспективы в исследовании хитина и хитозана. Материалы 7 международной конференции. Под ред.: В.П. Варламова и др.- М.:ВНИРО, 2003 .-с. 156-157.

18. Бюллетень ВОЗ. Руководство по стандартизации диагностических препаратов, 2000г. 227с.

19. Васильев A.B., Непоклонова И.В., Иммуноферментный метод в диагностике вирусных инфекций//Ветеринария. 1982.№ 8. - С. 63-65.

20. Васильев A.B., Осидзе Н.Г., Сюрин В.Н. РНГА в серодиагностике респираторно-синцитиальной инфекции крупного рогатого скота // Ветеринария. 1988.№10. - С.32-34.

21. Вирусология: Учебник / Под. ред. Б. Филдса, Д. Найпа. М.: Мир, 1989.-Т.2. С.41-42.,473-480.

22. Вспышка острого респираторного заболевания телят, вызванная респираторно-синцитиальным и аденовирусами.// Муравьев В.Н., Усманова

23. Г.В., Беляев В.М., Басов В.И. Теоретические основы профилактики инфекционных и инвазионных болезней животных. РЖ Ветеринария 1986 №7 С. 11-13.

24. Гаврилова Е.М. Гомогенный иммуноферментный анализ /Методы иммуноферментного анализа в биологии и медициие: Сб. .тр./Моск. НИИ вакцин и сывороток им. И.И.Мечникова; Научн., ред. Н.В. Цветкова. М.: Моск. НИИВС, 1983. - С. 25-36.

25. Генчев Г. Энзоотии респираторных заболеваний телят с признаками рес-пираторно-синцитиального вируса // XXI Всемирный вет. Конгресс.- М., 1979.-Т.З. С.101.

26. Герасименко Д.В. Ферментативное получение низкомолекулярного хитозана и изучение его антибактериальных свойств // Дисс. на соискание ученой степени к. биол. наук. Щелково, 2005. -133с.

27. Герасименко Д.В., Авдиенко И.Д., Банникова Г.Е., Ильина A.B. и др. Антибактериальная активность низкомолекулярного хитозана //Материалы 7 международной конференции. Под ред.: В.П. Варламова и др. М.: ВНИРО, 2003. -с. 233-239.

28. Герман Г.П., Чернохвостова C.B., Борисова И.В., Холчев Н.В. // Количественное определение уровня иммуноглобулинов. Сообщ. 1. Исследование сывороток здоровых взрослых людей и детей Ж. микробиологии.-1971.№ 12.-С. 6267.

29. Глотов А.Г. Диагностика инфекционного ринотрахеита крупного рогатого скота методом молекулярной гибридизации и особенности эпизоотического процесса заболевания в современных условиях: Автореф. дис. докт. вет. наук. Новосибирск, 1999.- 39с.

30. Глотов Г.П. Обнаружение ДНК вируса инфекционного ринотрахеита крупного рогатого скота в тройничном ганглии латентно инфицированных телят методом молекулярной гибридизации // Актуальные вопросы ветеринарии. -Новосибирск.- 1997.- С-51-52.

31. Глотов Г.П., Сергеев А.Н. // Частота выявления вируса инфекционного ринотрахеита крупного рогатого скота в пробахпатологического материала от больных телят методом молекулярной гибридизации. Актуальные вопр. ветеринарии. Новосибирск.-1997.- С.47-49.

32. Глотов Г.П., Шкиль H.A., Сергеев А.Н., Глотова Т.И., Никитина Е.Б., Гоппе В.А., Нефедченко A.B., Некрасова Н.В.//Вирусные и ассоциированные вирусно-бактериальные респираторные болезни крупного рогатого скота. Новосибирск.-2004.-С.З-25.

33. Гуненков В.В., Халенев Г.А., Сюрин В.Н. Вирусные и хламидозойные респираторные и кишечные инфекции крупного рогатого скота //Итоги науки и техники ВИНИТИ АН СССР. Сер. Животноводство и ветеринария. М. -1975. - Т. 8. - С. 5-131.

34. Гуненков В.В., Халенев Г.А., Сюрин В.Н. Респираторно-синцитиальная вирусная инфекция. //Животноводство и ветеринария. М., 1975.Т.№ 8. - С.70-76.

35. Дубинская A.M., Добротворская А.Е. Применение хитина и его производных в медицине // Химико- фармацевтический журнал.- Т.23, №5.-1989. -с. 623-628.

36. Еремеев Г.В., Чалкина О.М. Новый метод очистки и концентрации вируса гриппа типа А //Грипп и острые катары верхних дыхательных путей: Тр. объединенной научной сессии АМН СССР 25-28 июня 1952 г., Отв. ред. М.П.Чумаков. М.: АМН СССР, 1953. С. 43-53.

37. Заявка 1-208347 Япония. МКИ С 04 В 14/30, С 04 В 14/3 б.Твердеющаякомпозиция/ИтоМ. (Япония). -№63-34673; Заявл. 16.02.88; Опубл. 22.08.89.

38. Заявка 1-294627 Япония. МКИ А 61 К 31/73. Препарат для лечения заболеваний печени / Хирамори Т., Нисимура Т. (Япония). №63-126165; Заявл. 24.05.88; Опубл. 28.11.89.

39. Заявка 2-41301 Япония, МКИ С 08 В 37/08. Способ получения водорастворимого хитозана / Иноуэ Т. (Япония). №63-191933; Заявл. 30.07.88; Опубл. 9.02.90.

40. Заявка 2-48508 Япония. МКИ А 01 63/00, С 08 В 37/08. Физиологически активный промотор / Аонума Т. (Япония). №63-199720; Заявл. 10.08.88; Опубл. 19.02.90.

41. Заявка 469304 Япония. МКИ А 01 43/16. Ингибитор роста болезнетворных бактерий рода Пзапшп /Такаси Н., Окусона К. (Япония). №2-180558; Заявл. 10.07.90; Опубл. 4.03.92.

42. Заявка 59-27826 Япония. МКИ А 61 К 31/715, А 61 К 35/56. Противоопухолевый препарат / Судзуки С., Отава И., Хасимото К. (Япония). -№57-137929; Заявл. 10.08.82; Опубл. 14.02.84.

43. Заявка 59-27827 Япония. МКИ А 61 К 31/715; А 61 К 35/65. Противомикробный препарат / Судзуки С., Огава И., Хасимото К., Окура Я., Судзуки С. (Япония). №57-137929; Заявл. 10.08.82; Опубл. 14.02.84.

44. Заявка 59-46223 Япония. МКИ А 61 К 31/73, 31/63.Противомикробные препараты / Такамуцо Т., Китао Е., Кохати К. (Япония). №57-150398;

45. Заявка 61-268626 Япония. МКИ А 61 К 31/715. Противомикробные препараты / Судзуки С., Судзуки М., Катаяма X. (Япония). №60-109854; Заявл. 22.05.85; Опубл. 28.11.86.

46. Заявка 62-43129 Япония. МКИ С 08 В 37/08, А 61 Ь 15/01. Губчатый хитин / Мотосуги К., Ямагути Я., Кибунэ К. (Япония). №62-19496; Заявл. 28.01.87; Опубл. 2.08.88.

47. Заявка 62-59207 Япония. МКИ А 61 К 9/52, А 61 К 9/16. Липосомы, содержащие олигомеры хитина или хитозана / Судзуки С., Судзуки М., Катаяма X. (Япония). №60-100036; Заявл. 10.05.85; Опубл. 19.02.90.

48. Заявка 63-2924 Япония. МКИ А 61 К 9/12, А 61 К 9/10. Средство противэпидермофитии / Морита И. (Япония). №61-145944; Заявл. 20.06.86; Опубл. 7.01.88.

49. Заявка 56-133344 Япония. МКИ С 08 Ь 5/08, С 08 Ь 89/00. Новые композиционные материалы / Косуги А., Като К., Фунахаян Н. (Япония).- №55-36712; Заявл. 21.03.80; Опубл. 19.10.81.

50. Заявка 64-61429 Япония. МКИ А 61 К 47/00. Противораковый препарат / Хакигава А. (Япония). №62-216168; Заявл. 29.08.87; Опубл. 8.03.89.

51. Кильдеева Н.Р., Бабак В.Г., Вихорева Г.А., Агеев Е.П. и др. Новый подход к созданию материалов с контролируемым выделением лекарственного вещества. Вестник МГУ. Химия. -Т41, № 6. -2000. с. 423425.

52. Иванов B.C. Некоторые принципы стандартизации технологии комбинированного применения антирабических вакцин и антител. // Новые перспективы в исслед. хитина и хитозана. М., 1999. -С. 144-146.

53. Иванов B.C., Кузнецов П.П., Школьников Е.Э. Состояние и перспективы борьбы с бешенством животных и человека.// Вестник РАСХН.- 2000. N 2. -С. 63-65.

54. Иванов B.C., Майджи О.В. Изучение условий хранения вируса ИРТ, репродуцированного в монослое перевиваемых клеток ПТ-80 на микроносителях. // Тр. ВИЭВ/ Всерос. НИИ эксперим. ветеринарии, 2003; Т.73.-С. 173175.

55. Иванов B.C. Школьников Е.Э. Экстренная профилактика бешенства Опыты на крысах и мышах. Пробл. инфекц. и инваз. болезней в животноводстве на соврем, этапе. -М., 1999. -С. 134-136.

56. Игудин Л.И., Маркман Г.А., Лобань С.А., Позина И.М., Мигунова В.Н.// Полиэтиленгликоли и их использование в биологии и медицине // ЖМЭИ.- 1984.-№4.- С. 17-21.

57. Ильина A.B., Варламов В.П. Влияние степени ацетилирования на ферментативный гидролиз хитозана препаратом целловиридин Г20х // Прикладная биохимия и микробиология. 2003. - Т.39. - №3. - С.23 7-277.

58. Ильина A.B., Варламов В.П., Мелентьев A.M., Актуганов Г.Э. Деполимеризация хитозана хитинолитическим комплексом бактерии рода Bacillus sp. 739 // Прикладная биохимия и микробиология. 2001. Т. 37. № 2. С. 160-163.

59. Ильина A.B., Ткачева Ю.В., Варламов В.П. Деполимеризация низкомолекулярного хитозана ферментным препаратом Целловиридин Г20Х // Прикладная биохимия и микробиология. 2002. Т. 38. № 2. С. 132-135.

60. Иммунологическая диагностика вирусных инфекций/ Под ред. Т.В. Перадзе и П. Халонена. М.: Медицина, 1985. - 302с.

61. Иммунология / Под ред. У. Пола. М.: Мир, 1987. - Т. I. - 476 с.

62. Ипгибирование репродукции вируса ИРТ КРС апротинином: Тез. докл. Междунар. Конф. Владимир.-1997.-С.93-94. Белоусова Р.В., Ларионова Н.И.

63. Испытание сухого эритроцитарного диагностикума РС-инфекции крупного рогатого скота/ Метревели Г.Д., Борисович Ю.Ф., Чистова З.Я.и др.//Сб. науч. тр. ВГНКИ ветпрепаратов.-1983.- С.57-60.

64. Кочкина З.М., Чирков С.Н. Влияние производных хитозана на репродукцию колифагов Т2 и Т7 //Микробиология.-2000.-Т69.-№ 2.-С.257-260.

65. Кривицкая В.З., Соминина A.A., Власов Г.П., Суховецкая В.Ф., Голованов А.К. Возрастные особенности сайт-направленного иммунитета при респираторно-синцигиальной вирусной инфекции// Вопросы вирусологии- 49, № 4.-С.25-29.

66. Крыжановская E.B. Биологически активные вещества в ветеринарии // Диссертация на соискание уч. степени доктора биологических наук.- Щелково, 2008.- с.5-13.

67. Кузнецов П.А. Разработка способа разделения хитозана на низкомолекулярные фракции и изучение их биологических свойств // Диссертация на соискание уч. степени кандидата биологических наук.- Щелково, 2008.- с.32-41.

68. Куликов С.Н. Индукторы болезнеустойчивости на основе хитозана для защиты от грибных и вирусных болезней // Диссертация на соискание уч. степени кандидата биологических наук.- Щелково, 2006.- с.23-32.

69. Куприна Е.Э., Водолажская C.B. Способы получения и активации хитина и хитозана // Хитин и хитозан: Получение, свойства и применение / Под ред. К.Г. Скрябина, Г.А. Вихоревой, В.П. Варламова. -М.: Наука. 2002. С. 44-63.

70. Лабораторная диагностика респираторно-синцитиальной инфекции: Методические рекомендации /Лещинская Н.П., Покровская Е.П., Юрлова Т.И. и др. / Под ред. Я. С. Шварцмана; НИИ эпидемиологии, микробиологии и инфекц. болезней. Алма-Ата, 1985. - 43с.

71. Лебедев Л.И., Авилов C.B. О некоторых биологических свойствах респираторно-синцитиального вируса. //Актуальные вопросы вет. вирусологии; Тез. докл. 5-й Всесоюзн. Науч. Конф.- Казань, 1980.- С.83-84.

72. Лещинская Н.П. Вакцинация против респираторно-синцитиальной инфекции // Вопросы вирусологии —1986. Т.31. № 5. С.517-527.

73. Лещинская Н.П., Камферин Л.Е. Ресгшраторно-синцитиальная вирусная инфекция //Медицина и здравоохранение: Сер. Эпидемиология, вирусология и инфекционные заболевания. — М., 1986. С.77.

74. Малахов Ю.А., Панин А.П., Соболева Г.Л. Лептоспироз животных.-Ярославль, 2000.-583С.

75. Манько В.М., Петров Р.В., Хаитов P.M. Иммуномодуляция: история, тенденции развития, современное состояние и перспективы // Иммунология. 2002. №3, том 23.- С. 132-136.

76. Марквичева Е.А. Хитозан и его производные в биоинкапсулировании // Вкн.: Хитин и хитозан: получение, свойства и применение. Под ред.: К.Г. Скрябина, Г.А. Вихоревой, В.П. Варламова. -М.: Наука, 2002. -с.315-327.

77. Маслова Г.В. Теория и практика получения хитина электрохимическим способом // Хитин и хитозан: Получение, свойства и применение / Под ред. К.Г. Скрябина, Г.А. Вихоревой, В.П. Варламова. -М.: Наука. 2002. С. 24-43.

78. Матвеева И.Н. Промышленные технологии изготовления компонентов моно- и комплексных диагностикумов инфекциоиных заболеваний животных // Диссертация на соискание ученой степени доктора биологических наук.-Щелково,2008.-с.48-59.

79. Мелентьев А.И., Актуганов Г.Э. Выделение, очистка и характеристика хитиназы Bacillus sp. 739 // Прикладная биохимия и микробиология. 1999. Т. 35. -№ 6. С. 624-628.

80. Метлин А.Е., Назаров H.A., Рыбаков С.С., Михайлина Н.М., Груздев К.Н., Чепуркин A.B., Егоров A.A. Диагностика бешенства животных с использованием реакции иммунофлюоресценции// Ветеринария.- 2006, №2.-С.20-23.

81. Методы лабораторной диагностики вирусных болезней животных: Справочник /Сюрин В.Н., Белоусова Р.В., Соловьев Б.В., Фомина Н.В. -М.: Агропромиздат, 1986. 351с.

82. Метревели Г.Д. Биологические свойства вируса и серологическая диагностика PC-инфекции крупного рогатого скота: Автореф. дис. канд. биол. наук. —М.,1989.- 19 с.

83. Метревели Г.Д. Реакция непрямой гемагглютинации (РНГА) в диагностике респираторно-синцитиальной инфекции крупного рогатого скота. //Сб. науч.тр. ВГНКИ ветпрепаратов. М., 1983. - С.99-100.

84. Метревели Г.Д., ГуненковВ.В. Современная диагностика залог успешной борьбы с PC-инфекцией крупного рогатого скота //Тез. докл. Всесоюзн. науч. конф. по проблемам эпизоотологии. - Казань, 1983. -94с.

85. Мышкина JI.A., Петухова Т.Е., Левина О.И., Рабинович 0.3., Левчук Т.Н., Кивман Г.Я. Ранозаживляющие покрытия на основе хитозанколлагенового комплекса // 2 Российск. нац.конгресс "Человек и лекарство". 1992.- с.229.

86. Надточей Г.А., Валихов А.Ф., Зудилина З.Ф. Биофизические свойства вируса парагриппа-3 крупного рогатого скота //Бюл. ШЭВ. 1972. - Вып. 14.-С. 35-38.

87. Насибов С.М., Гамзазаде А.И., Рогожин C.B., Андрианова И.П., Рабовский A.B., Морозова A.A. Влияние модификации поверхности активированных угольных волокон на сорбцию липопротеинов // Хим,-фарм. ж. Т.22, №1. -1988. - с.84-89.

88. Науменков В.И. Применение иммунопероксидазного метода для индикации вирусных антигенов в культуре клеток //Ветеринария. 1984. №7.-С. 70-71.

89. Недосеков В.В. Разработка и совершенствование средств и методов оценки эффективности вакцин против бешенства//Автореф. дис. канд. вет. наук. Покров, 1998.- 24с.

90. Панина Я.С., Васюкова Н.И., Озерецковская O.JI. Ингибирование активности каталазы клубней картофеля салициловой и янтарной кислотами //Доклады Академии Наук. 2004. - Т.397. - С.307-311.

91. Пат. 02076712 Cl 19971227. Средство, обладающее антикоагулянтной и антитромбической активностью. / Дрозд H.H., Макаров В.А., Шера И., Башков Г.В., Гальбрайх Л.С., Вихорева Г.А., Горбачева И.Н. Опубл. 27.12.1997.

92. Пат. 02196587 Cl 20030120. Способ лечения деструктивной формы панкреатита. / Большаков И.Н., Насибов С.М., Приходько А.А, Винник Ю.С., Зыкова Л.Д., Бичурина Т.Б. Заявл 10.08.2001. Опубл. 20.01.2003.

93. Пат. 02225712 Cl 20040320. Средство для терминальной анестезии. / Арзамасцев А.П., Кацнель Е.М., Лапенко В.Л., Николаевский В.А., Никитский A.C., Сливкин А.И. Заявл. 20.09.2002. Опубл. 20.03.2004.

94. Пат. 02228758 Cl 0040520. Способ мембранного диализа гнойно-воспалительных заболеваний. / Винник Ю.С., Якимов C.B. , Карапетян Г.Э., Большаков И.Н., Кухарская Л.К. Заявл. 17.02.2003. Опубл. 20.05.2004.

95. Перминов П.А., Кильдеева Н.Р., Тимофеева Л.М., Абронин И.А., Бабак

96. B.Г., Никоноров В.В. Структурообразование в растворах хитозана в присутствии сшивающего реагента при получении биологически активных полимерных материалов // Химия и химическая технология. Известия вузов. Т. 50, Вып. 3. - 2007 - с. 53-56.

97. Пириева Д.А., Чигалейчик А.Г., Тиунова H.A., Рылкин С.С. Физиолого-биохимические свойства Actinomyces kurssanovii активного продуцента хитиназы //Микробиология. 1977. Т. 46. №4. С. 661-665.

98. Плиско Е.А., Нудьга Л.А., Данилов С.Н. Хитин и его химические превращения // Успехи химии. Т.46, №6. - 1977. -с. 1470-1478.

99. Показатели циркулирующего интерферона при различных вирусных заболеваниях /Лаврухина Л.А., Ершов Ф.И., Крылов В.Ф., Князева Л.Д., Белостоцкая O.A., Лопатина O.A. // Вопросы вирусологии.- 1989.№2. -С.244-247.

100. Полимеразная цепная реакция (ПЦР) при диагностике лептоспироза: Сб. науч. тр./ ВГНКИ / Отв. Ред. Панин А.Н.- М.: ВГНКИ , 2001. С. 6874. Викторова Е.В.

101. Получение и сравнительная оценка пероксидазных коньюгатов на основе чистых антител и FaB-фрагмента IgG /С.С. Маренникова, H.A. Хабахпашева, Н.Н.Мальцева, Е.Е.Ефремова //ЖМЭИ. -1982. № 9.1. C. 99-103.

102. Разработка тест-системы для выявления патогенных лептоспир методом ПЦР: Тез. Докл. Пятой Всерос. Научно-практ. Конф. 19-21октября 2004 г. М.:2004,- С. 209- 211. Брюсова М.Б.

103. Роговина С.З. Химическая модификация природных полисахаридов целлюлозы, хитина и хитозана в твердой фазе под действием сдвиговых деформаций: Дисс. Доктора хим. наук. Москва. 2003. 163с.

104. Самойлова H.A., Рыженков В.Е., Ямсков И.А. Хитозансодержащий ги-полипидемический энтеросорбент // Новые перспективы в исследовании хитина и хитозана. Материалы 5 международной конференции. Под ред.: В.П. Варламова и др.- М.: ВНИРО, 1999. — с.191-193.

105. Сео С.Б., Рю Ч.С., Ким Х.Б., Ан Г.В., Джо Б.К., Каджиучи Т. Получение многофункционального низкомолекулярного хитозана и его применение в косметике // Косметическая химия. 2003. № 1. С. 26-30.

106. Тагер A.A. // Физико-химия полимеров. М.: Химия, 1968. - 536с.

107. Терещенко В.Г. Применение фитохитодеза в кардиологической реанимации // Фитотерапия и лазеротерапия в XXI веке. Материалы научной конференции. Черноголовка, 1999. с. 86-88.

108. Тесленко А.Я., Попов В.Г. Хитин и его производные в биотехнологии // Обзор, информ. Гл. управл. микробиол. пром-сти при Сов. М-ов СССР.- М., 1982.-40 с.

109. Тиунова H.A. Хитинолитические ферменты микроорганизмов // Успехи биологической химии. 1989. Т. 30. С. 199-219.

110. Усманов Т.И., Рашидова С.Ш., Ашуров Н.Ш., Султанов А.Ж., Исследование микроструктуры цепи хитозанов методом ЯМР- спектроскопии // Материалы Пятой конференции «Новые перспективы в исследовании хитина и хитозана».- М. ВНИРО, 1999. С.263-265.

111. Халенев Г.А., Гуненков В.В. Респираторно-синцитиальная, реовирусная и риновирусная инфекция крупного рогатого скота //Лекция 15-я. Моск. вет. академия.-1977 - С.3-9.

112. Халенев Г.А. Разработка методов производства диагностикумов и усовершенствование лабораторной диагностики вирусной диареи и респираторно-синцитиальной инфекции крупного рогатого скота: Дис. канд. вет. наук. —М., 1976.- 270с.

113. Халенев Г.А., Гуненков В.В. Комплексная диагностика респираторно-синцитиальной инфекции молодняка крупного рогатого скота в двух хозяйствах. //Проблемы молекулярной биологии и патологии: Сб. науч. тр./Моск. Вет. академия.- 1975.Т.80.- С. 193-199.

114. Червинец В.М., Комаров Б.А. Способ лечения хронического гастрита, язвенной болезни желудка и двенадцатиперстной кишки. Патент РФ №2150271. Приоритет от 13.10.1999.

115. Чирков С.Н. Противовирусные свойства хитозана // Хитин и хитозан: получение, свойства и применение / Под ред. К.Г. Скрябина, Г.А. Вихоревой, В.П. Варламова. М.: Наука, 2002. - С.327-338.

116. Чирков С.Н., Сургучёва H.A., Гамзазаде А.И., Поспешны Г. Сравнительная эффективность производных хитозана при подавлении вирусной инфекции растений // Доклады Академии Наук. 1998. - Т.360. -№2. -С.271-273.

117. Шинкарев С.М. Разработка и усовершенствование промышленных технологий получения препаратов на основе хитозана для лечения и профилактики болезней животных // Диссертация на соискание уч. степени кандидата биологических наук.- Щелково, 2001. — с. 12.

118. Adair В.М., Bradford H.E.L, McNulty M.S., Foster J.C. Cytotoxic interactions between bovine alveolar macrophages. // Vet. Immunology and Immunopath. 1999.- V.67.-P.285-294.

119. Benhamou N., Theriault G. Treatment with chitosan enhances resistance of tomato plants to the crown and root rot pathogen Fiisarium oxysporum f. sp. Ra-dicis-lycopersici //Physiol. Mol. Plant Pathol. 1992. - V.41. - P.33-52.

120. Berger J., Reist M., Mayer J.M., Felt O., Peppas N.A., Gumy R. Structure and interactions in covalently and ionically crosslinked chitosan hydrogels for biomedical applications // Eur. J. Pharm. Biopharm. 2004. V. 57. - P. 19-34.

121. Berger J., Reist M., Mayer J.M., Felt O., Gurny R. Structure and interactions in chitosan hydrogels formed by complexation or aggregation for biomedical applications // Eur. J. Pharm. Biopharm. 2004. V. 57. №1. P. 35-52.

122. Bhaskara Reddy M.V., Arul J., Angers P., Couture L. Chitosan treatment of wheat seeds induces resistance to Fusarium graminearum and improves seed quality//J. Agric. Food Chem. 1999. - V.47. - №3. - P.1208-1216.

123. Brurberg M.B., Eijsink G.H., Haandrikman F.J., Chitinase B from S.marcescens BJL 200 is exported to the periplasm without processing // Microbiol. 1994. V.141. №2. P.123-131.

124. Brugnerotto L, Lizardi J., Goycoolea F.M., Argiielles-Monal W., Desbri-eres J. An infrared investigation in relation with chitin and chitosan characterization // Polymer. 2001. V. 42. P. 3569-3580.

125. Cachi Prof.T. Gradual release of anti-caner drugs using chitosan // Techno Japan. -Y.22, №5. -1989. -P. 1100.

126. Cauchie H-M. Chitin production by arthropods in the hydrosphere // Hy-drobiologia. 2002.-V. 470. - N. 1/3.- P. 63-95.

127. Chatelet C., Damour O., Domard A. Influence of the degree of acetyla-tion on some biological properties of chitosan films // Biomaterials.- 2001.-V.22.-N.3.P. 261-268.

128. Chitin Handbook / Eds. Muzzarelli R.A.A., Peter M.G. Grottammare: Atec Edizioni. 1999. P. 534.

129. Choi J.J., Klosterman S.J., Hadwiger L.A. A Comparison of the effects of DNA-damaging agents and biotic elicitors on the induction of plant defense genes, nuclear distortion, and cell death // Plant Physiol. 2001. - V. 125. - P.752- 762.

130. Day R.B., Okada M., Ito Y., Tsukada K., Zaghouani H., Shibuya N., Sta-cey G. Binding site for chitin oligosaccharides in the soybean plasma membrane // Plant Physiol. 2001. -V.126. -№3. -P. 1162-1173.

131. Domard A. Some physicochemical and structural basis for applicabilityof chitin and chitosan. 11 Proc. 2nd Asia Pacific Symposium "Chitin and chitosan" / Ed. F.Stevens, M.S. Rao, S.Chandrkrchang. Bangkok, Thailand, 1996.- P. 1-12.

132. Domszny J.G., Roberts G.A.F. Evaluation of infared spectroscopic techniques for analysing chitosan. // Macromol. Chem. -V. 186, № 8. -1985. P. 16711677.

133. Dutkicwicz Y., Szosland L., Kukharka M. Structure-bioactivity relationship of chitin derivatives. The effect of solid chitin derivatives on blood coagulation // J. Bioact. and Compat. Polym. V.5, №3. - 1990. - P.293-304.

134. Dutkicwicz Y., Yudkicwicz L., Kukharka M. Some properties of chito-san-heparin complex // 33rd IUPAC Int. Symp. Macromol. Montreal. - 8-13 July 1990.-BoolcAbstr.-P.326.

135. Fukuda H., Kikuchi Y. Polyelectrolyte Complexes of Sodium Dextran Sulfate with Chitosan // Macromol. Chem. V.l 18, №10. - 1977. - P.2895- 2899.

136. Ghaouth A.E., Arul J., Grenier J., Benhamou N., Asselin A., Belanger R. Effect of chitosan on cucumber plants: supression of Pythhim aphanidermatum and induction of defense reactions // Phytopathology. 1994. - V.84. - №3. - P.313-320.

137. Hadwiger L.A., Beckman J.M. Chitosan as a component of Pea-Fusarium interactions // Plant Physiol. 1980. - V.66. - P.205-211.

138. Hadwiger L.A., Ogawa T., Kuyama H. Chitosan polymer sizes effective in inducing phytoalexin accumulation and fungal suppression are verified with synthesized oligomers // Mol. Plant Microbe Interact. 1994. - V.7. - №4. P.531-533.

139. Heterogeneous N-deacetylation of chitin in alkaline solution / K. L.B . Chang, G. Tsai, J. Lee, W.R. Fu 11 Carbohydr. Res. 1997. V. 303. - P. 327-332.

140. Houe H. Epidemiological features and economical importance of bovine viral diarrhoea virus infections // Vet.Microbiol.-1999.-V.64.-P.89-109.

141. Hsu S., Whu S.W., Tsai C.L., Wu Y.H., Chen H.W., Hsieh K.H. Chito-san as scaffold materials: effects of molecular weight and degree of deacetylation // J. Polymer Research. 2004. V. 11. P. 141-147.

142. Huang M., Khor E., Lim L.Y. Uptake and cytotoxicity of chitosan molecules and nanoparticles: effects of molecular weight and degree of deacetylation // Pharmaceutical Research. 2004. V. 21. № 2. P. 344-353.

143. Huang Y.T., Wertz G.W. The genome of respiratory syncytial virus is a negative stranded RNA that codes for at least seven mRNA species // J. Virol. -1982.-v.43 .P. 150-157.

144. Hirano S., Noishiki Y. The blood compability of chitosan and N-acylchitosan // J. Biomed. Mater. Res. V.19, №14. - 1985. -P.413-417.

145. Iseli B., Boiler T., Neuhaus J.M. // In: Chitin Enzymology. R.A.A. Muz-zarelli, Italy, ed. Atec Edizioni. 1996. V. 2. - P. 135-142.

146. Ito Y., Kaku H., Shibuya N. Identification of a high-affinity binding protein for N-acetylchitooligosaccharide elicitor in the plasma membrane of suspension-cultured rice cells by affinity labeling // Plant J. 1997. - V.12. - №2. -P.347-356.

147. Jia Z., Shen D., Xu W. Synthesis and antibacterial activities of quaternary ammonium salt of chitosan // Carbohydr. Res.-2001.-V.333. P. 1-6.

148. Juang R-S., Shao H-J. A simplified equilibrium model for sorption of heavy metal ions from aqueous solutions on chitosan // Water Research.- 2002.-V.36.- N.12.- P.2999-3008.

149. Kaifu K., Komai T. Wetting characterstics and blood clothing on surfaces of acylated chitins // J. Biomed. Mater. Res. V.16, №6. - 1982. - P.757-766.

150. Kawashima Y., Kasai A. Preparation of a prolonged release tablets of aspirin with chitosan // Chem. and Pharm. Bull. V.33, №5. - 1985. - P.2107- 2113.

151. Kauss H., Jeblick W., Domard A. The degrees of polymerization and N-acetylation of chitosan determine its ability to elicit callose formation in suspension cells and protoplast of Catharanthus rosens II Planta. 1989. - V.178. - P.385-392.

152. Kea-Yong K., Dong-Sun M. Wound covering material from chitosan-N-vinylpyrrolidone copolymer // YUPAC 32th Int.Symp.Macromol., Kyoto. 1988. -P.105.

153. Kendra D.F., Hadwiger L.A. Characterisation of the smallest chitosan oligomer that is maximally antifungal to Fusarium solani and elicits pisatin formation in Pisum sativum II Experimental Mycology. 1984. - V.8. - P.276-281.

154. Kikuchi Y., Kubota N. Permeability control of poly electrolyte complex membrane Including chitosan derivative as component II Bull. Chem. Soc. Jap. -V.61, №8. -1988. -P.2943-2974.

155. Kim H.J., Chen F., Wang X., Rajapakse N.C. Effect of chitosan on the biological properties of sweet basil (Ocimum basilicum L.) // J. Agric. Food Chem. 2005. - V.53. - №9. - P.3696-3701.

156. Khan T.A., Peh K.K., Ch'ng H.S. / Reporting degree of deacetylationvalues of chitosan: the influence of analytical methods // Pharm. Pharm. Sci. -2002.-V.5.-№3.-P.205-212.

157. Khan W., Prithiviraj B., Smith D.L. Chitosan and chitin oligomers increase phenylalanine ammonia-lyase and tyrosine ammonia-lyase activities in soybean leaves // J. Plant Physiol. 2003. - 160. - №8. - P.859-863.

158. Kochanska B., Kedzia A. Suscebility of Candida, Geotrichum and Rho-dotorula to chitosan ascorbat // Chitosan in Pharmacy and Chemistry. Eds.: R.A.A.Muzzarelli, C. Muzzarelli. Atec. Italy. -2002. -P. 165-170.

159. Koga D., Mitsutomi M., Kono M. et al. // Exs.' 1999. V. 87. - P. 111123.

160. Koping-Hoggard ML, Mel'nikova Y.S., Varum K.M., Lindman B., Ar-tursson P. Relationship between the physical shape and the efficiency of oligomeric chitosan as a gene delivery system in vitro and in vivo II J. Gene Med. -2003.-V.5.-№2.-P. 130-141.

161. Kuchitsu K., Kikuyama M., Shibuya N. N-acetylchitooligosaccharides, biotic elicitor for phytoalexin production, induce transien membrane depolarization in suspension-cultured rice cells // Protoplasma. 1993. V.174. -P.79-81.

162. Kukiyama M., Kuchitsu K., Shibuya N. Membrane depolarization induced by N-acetylchitooligosaccharide elicitor in suspension-cultured rice cells // Plant Cell Physiol. 1997. - V.38. №8. - P.902-909.

163. Kumara G., Bristowa J.F., Smith P.J., Payne G.F. Enzymatic gelation of the natural polymer chitosan// Polymer.- 2000.- V.41.-N.6.-P.2157-2168.

164. Kumar A.B.V., Gowda L.R., Tharanthan R.N. Non-specific depolymeri-zation of chitozan by pronase and characterization of the resultanr products // Eur. J. Biochem. -V. 271.-2004. -P. 713-723.

165. Kuprina E., Batchische E. Electrochemical method for obtaining water-soluble oligomers of chitin // Book of abstracts of 10th International Conference on Chitin & Chitosan, 6-9 September 2006. Le Corum-Montpellier France, 2006. - P. 84.

166. KuritaK. Chitin and chitosan: functional biopolymers from marine Crustaceans // Marine Biotech. 2006. V. 8. - P. 203-226.

167. Kurita K., Sannan T., Iwakura Y. Studies on chitin. 4. Evidence for formation of block and random copolymers of N-acetyl-D-glucosamine and D- glucosamine by hetero- and homogeneous hydrolysis // Macromol. Chem. 1977. V. 178.-N12.-P.3197-3202.

168. Lamarque G., Chaussard G., Domard A. Thermodynamic aspects of the heterogeneous deacetylation of beta-chitin: Reactionn mechanisms // Biomacro-molecules. 2007. V. 8,- N 6.- P. 1942-1950.

169. Latlief.S.L. Effects of chitin and its derivatives as coagulation aid // J. Appl.Polym.Sci.-V.27.-1982.-P.4467-4470.

170. Lim S.H., Fludson S.M. Review of chitosan and its derivatives as antimicrobial agents and their uses as textile chemicals // J. Macromol. Sci. 2003. V. 43.№2.P.223-269.

171. Lim S.H., Hudson S.M. Application of a fiber-reactive chitosan derivative o cotton fabric as an antimicrobial textile finish // Carbohydr. Polym.2004.V.56.P.227-234.

172. Lin H., Wang H., Xue C., Ye M. Preparation of chitosan oligomers by immobilized papain // Enzyme and Microbial Technology. 2002. - V.31. - P.588-592.

173. Lin W., Hu X., Zhang W., Rogers W.J., Cai W. Hydrogen peroxide mediates defence responses induced by chitosans of different molecular weights in rice // J. Plant Physiol. 2005. - V.162. - №8. - P.937-944.

174. Liu X.F., GuanY.L., Yang D.Z., Li Z., Yao K.D. Antibacterial action of chitosan and carboxymethylated chitosan // J.Appl. Polym. Sci. -V. 79. -2001. P. 1324-1335.

175. Malewska-Bartcsak M., Zetany T. Badania nad wykorzystanien chitosanu z kryla arttyczeniu medycznym // Pr. Inct. wtok. №31. -1981. - P.87-102.

176. Majeti N.V., Kumar R. A review of chitin and chitosan applications // Reactive & Functional Polymers.-2000.- V.46.- N.I.- P. 1-27.

177. Martin H.T. Indirect haemagglutination test for the detection and assay of antibody to bovine respiratory syncytial virus //Vet. Rec. -1983. -v.l 13. N. 3.P.290-293.

178. Mima S., Miya M., Iwamoto R., Yoshikawa S. Highly deacetylated chitosan and its properties // J. Appl. Polym. Sci. 1983. -V. 28. N 6. - P. 1909-1917.

179. Miyasakl S., Ihii R., Nadai T. The use of chitin and chitosan as a drug carriers // Chem. and Pharm.Bull. V.91, №10. - 1981. - P.3067-3069.

180. Moorjani M.N., Achuta V., Khasim D.I. // J. Food Sci. Technol. 1975. V.12.-P.187-190.

181. Muzzarelli R.A.A. The discovery of chitin a > 570 Megayear old polymer/An: Chitosan in pharmacy and chemistry / Ed. R.A.A Muzzarelli, C. Muzzarelli. Atec. Italy, 2002.-P. 1-8.

182. Muzzarelli R.A.A. Chitin. 1977. Oxford: Pergamon Press. P.309.

183. Muzzarelli R.A.A., Muzzarelli С., Tarsi R., Miliani M., Gabbanelli F., Cartolari M. Fungistatic activity of modified chitosans against Saprolegnia parasitica //Biomacromolecules. -V.2. -2001. -P. 165-169.

184. Muzzarelli R.A.A., Tanfani F. N-permethylation of chitosan and the preparation of N-trimethylchitosan iodide // Carbohydr.Polym. V.5, №4. - 1985. -P.297-307.

185. Okazaki K., Kato F., Watanabe N. Purification and properties of two chitinases from Streptomyces sp. J-13-3 // Biosci. Biotech. Biochem. 1995. V.59. №8.P.1586-1587.

186. Onsoyen E., Skaugrud O. Metal recovery using chitosan // J. Chem. fechnol. Biotechnol. 1990. V. 49. № 4. P. 395-404.

187. Ottoy M.H., Varum K.M., Smidsrod O. Compositional heterogeneity of heterogeneously deacetylated chitosans // Carbohydr. Polym. 1996. V. 29. -Nl.-P. 17-24.

188. Pat. 4066735 US С 01 F 11/46.

189. Pat. 6391318. Vaccine compositions including chitosan for intranasal administration and use thereof. // Ilium Lisbeth, Chatfield Steven Neville. Заявл. 01.06.1998,опубл.21.05.2002.

190. Pat. 6306835. Biocidal chitosan derivatives. / Daly, William H., Manus-zak-Guerrini, Melissa А. Заявл. 16.09.1998, опубл. 23.10.2001.

191. Pat. 6492350. Chitin oligosaccharides and/or chitosan oligosaccharides for preventing or treating common cold or treating pain. / Konno, Allen I., Gauthier, Jay H., Matahira, Yoshiharu. Заявл. 12.01.2001. Опубл. 10.12.2001.

192. Pat.4, 952, 618 USA. CL A 61 15/00, C 08 L 1/00. Hydrocolloidal adge-sive composition / Olsen Roger A. (USA). №189614; 3.05.88; 28.08.90

193. Payne G.F., Raghavan S.R. Chitosan: a soft interconnect for hierarchical assembly of nano-scale components // Soft Matter. 2007. V. 3. - P. 497-652.

194. Pearce R.B., Ride J.P. Chitin and related compounds as elicitor of the lignification response in wounded wheat leaves // Physiological Plant Pathology. -1982.-V.20.-P.119-123.

195. Percot A., Chaussard G., Sorlier P. et al. Overall consideration on the evolution of the study of chitosan properties // Advances in Chitin Science. Vol. VII / Ed. by I. Boucher, K. Jamieson, A. Retnakaran. Montreal, 2004. P. 1-6.

196. Pettersen H., Sannes A., Holme H.K., Kristensen A.H., Domish M, Smidsrod O. Thermal depolymerization of chitosan salts // In: Advan. Chitin Sci. / Ed M.G. Peter, A. Domard, R.A.A. Muzzarelli. Potsdam. Germany. 1999. P. 422428.

197. Pospieszny H., Struszczyk H., Cajza M. Biological activity of Aspergil-/ws-degraded chitosan // Chitin Enzymology / Ed. R.A.A.Muzzarelli. Atec Edizioni, 1996. V.2. - P. 385-389.

198. Potgieter L.N.D., Aldrida P.L. Use of the indirect fluorescent antebudy test in the detection of bovine respiratory syncytial virus antibodies in Bovine serum. //Amer. J. Vet. Res. -1977. -v.38. N 9.- P. 1341-1343.

199. Rabbea E.I., Badawy M.E.-T., Stevens C.V., Smagghe G., Steurbaut W. Chitosan as antimicrobal agent: applications and mode of action // Biomacro-molecules. -V. 4, №6. -2003. -P. 1457-1465.

200. Reed L.J., Muench H.A. A simple method of astimating 50 percent endpoints // Am. J. Hyg. -1938.-v.27.-P.493-497.

201. Reetarani S.P., Ghormade V., Deshpande M.V. Chitinolytic enzymes: an exploration (Review) // Enz. Microb. Technology. 2000. V. 26. P. 473-483.

202. Rhoades J., Roller S. Antimicrobal actions of degraded and native chitosan against spoilage organisms in laboratory media and foods // Appl. Environ. Mi-crobiol.-V.66,№ 1 .-2000.-P.80-86.

203. Robertus J.D., Monzingo A.F. // Exs. 1999. V. 87. - P. 125-135.

204. Roby D., Gadelle A., Toppan A. Chitin oligosaccharides as elicitors of chitinase activity in melon plants // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1987. -V.143. - №3. - P.885-892.

205. Roller S., Covill N. The antifungal properties of chitosan in laboratory media and apple juice // Int. J. Food Microbiol. -V. 47, № 1-2. -1999. -P 67-77.

206. Sandvik T. Laboratory diagnostic investigations for bovine viral diarrhoea virus infections in cattle Vet. Microbiol.1999.-64.-P.123-134.

207. Sashiwa H., Saimoto H., Shigemasa Y., Ogawa R., Tokura S. Distribution of the acetamide group in partially deacetylated chitins // Carb. Polymers. -1991. V.16. -P.291-296.

208. SavardT., Beaulieu C., Boucher I., Champagne C.P. Antimicrobal action of hydrolyzed chitosan against spoilage yeasts and lactic acid bacteria of fermented vegetables // J. Food Prot. -V. 65, № 5. -2002. -P. 828-833.

209. Sawayanagi Y., Nambu N. Use of chitosan for substained-release prepo-rations of water-soluble drugs // Chem. and Pharm. Bull.- V.30, №11.- 1982.1. P.4213-4216.

210. Sirica A.E., Woodman R.G. Aggregation of leucomic cells In vitro by chitosan and derivatives // Fed. Proceed.- V.29, №2. 1970. - P. 396-411.

211. Singla A.K., Chawla M. Chitosan: some pharmaceutical and biological aspects an update // J. Pharm Pharmocol. 2001. V. 53. №8. P. 1047-1067.

212. Shahabuddin M., Vinetz J.M. // Exs. 1999. V. 87. - P. 223-234.

213. Shibuya N., Kaku H., Kuchitsu K., Maliarik M.J. Identification of a novel high-affinity binding site for N-acetylchitooligosaccharide elicitor in the membrane fraction from suspension-cultured rice cells // FEBS Lett. 1993. - 329. - №12. - P.75-78.

214. Stevens W.F., Win N.N., Ng H. et al. // Advances in chitin science, 7th ICCC, Lyon, 1997.-P.40-47.

215. Stoyachenko LA., Varlamov V.A., Davankov V.A. Chitinases of Strep-tomyces kurssanovii: purification and some properties // Carbohydr. Polym. 1994. V. 24. №1. P. 47-54.

216. Struszczyk M.H., Pospieszny H., Schanzenbach D., Peter M.G. Progress on chemistry and application of chitin and its derivatives. // Ed. Struszchyk H. Lodz: Polish Chitin Society. 1998. - V.5. - P.71-77.

217. Suzuki K., Mikami T., Okawa Y. Antitumor effect of N- hexaacetylchi-tohexaoze and chitohexose // Carbohydr. Res. -V.151. 1986. - P. 403-408.

218. Tan-Tian R., Ynoue K., Mashida Y., Sannad T., Nagai T. Chitin and chi-tosan derivatives for directly compressed tablets of water-soluble drug // J. Pharm. Sci. and Technol. V.48, №4. - 1988. - P.318-321.

219. Thongngam M., McClements D.J. Characterization of interactions between chitosan and an anionic surfactant // J.Agric. Food Chem. 2004. V. 52. № 4. P. 987-991.

220. Toinmeraas K., Varum K.M., Christensen B.E., Smidsrad O. Preparation and characterization of oligosaccharides produced by nitrous acid depolymerization of chitosans // Carbohydr. Res. 2001. V. 333. P. 137-144.

221. Tolaimate A., Desbrie'res J., Rhazi M., Alagui A., Vincendon M., Vot-tero P. On the influence of deacetylation process on the physicochemical characteristics of chitosan from squid chitin // Polymer.- 2001.-V.41.- N.7.- P. 2463-2469.

222. Tsai G.J., Zhang S.L., Shieh P.L. Antimicrobal activity of a low- molecular-weight chitosan obtained from cellulase digestion of chitosan // J. Food Prot. -V. 67,№2.-2004.-P.396-398.

223. Tsai G.J., Hwang S.P. In vitro and in vivo antibacterial activity if shrimp chitosan against some intestinal bacteris // Fisheries Sci. -V. 70. -2004. -P.675-681.

224. Tsai G.J., Su W.H., Chen H.C., Pan C.L. Antimicrobal activity of shrimp chitin and chitosan from differenttreatments of fish preservation // Fisheries Science. -V. 68, № 1. -2002. -P. 170-177.

225. Tsezos, M., Voiesky, B. Biotechnology and Bioengineering. 1981.23.-P.583-604.

226. Tsezos, M., Voiesky, B. Biotechnology and Bioengineering. 1982.24.-P.385-401.

227. Ura W.H., Doszi J., Keknan P.B. Antacid and antiulker properties of the polysaccharide chitosan in the rat // Proc. Soc.Exptl. Biol. Med. V.115, №4. -1964.-P.1108-1112.

228. Wan J., Zhang S., Stacey G. Activation of a mitogen-activated protein kinase pathway in Arabidopsis by chitin // Molecular Plant Pathology. 2004. - V.5. -№2. P.125-135.

229. Xie W., Xu P., Wang W., Liu Q. Preparation of water-soluble chitosan derivatives and their antibacterial activity // J. Appl. Polym. Sci. 2002. V. 85. P. 1357-1361.

230. Yamada A., Shibuya N., Kodama O., Akatsuka T. Induction of phy-toalexin formation in suspension-cultured rice cells by N-acetylchitooligosaccharides // Biosci. Biotech. Biochem. 1993. - V.57. - №3. -P.405-409.

231. Yang F., Cui X., Yang X. Interaction of low-molecular-weight chitosan with mimic membrane studied by electrochemical methods and surface plasmon resonance //Biophys. Chem. -V. 99, №1. -2002. -P. 99-106.

232. Yi H., Wu L.Q., Bentley W.E., Ghodssi R., Rubloff G.W., Culver J.N., Payne G.F. Biofabrication with chitosan // Biomacromolecules. 2005. V. 6. - P. 2881-2894.

233. Yoon H.G., ICim H.Y., Hong B.S. et al. // Biosci. Biotechnol. Biochem. 2001.- V. 65. P. 802-809.

234. Young D.H., Kohle H., Kauss H. Effect of chitosan on membrane permeability of suspension-cultured Glycine max and Phaseolus vulgaris cells // Plant Physiol. 1982. - Y.70. - P. 1449-1454.

235. Zhang H., Du Y., Yu X., Mitsutomi M., Aiba S. Preparation of chitooli-gosaccharides from chitosan by a complex enzyme // Carbohydrate Research. -1999. V.320. - P.257-260.

236. Zhang H., Neay S.H. In vitro degradation of chitosan by a commertial enzyme preparation effect of molecular weight and degree of deacetilation // Biomaterials. 2001. V. 22. P.1653-1658.

237. Zhang M., Haga A., Sekiguchi H., Hirano S. Structure of insect chitin isolated from beetle larva cuticle and silkworm (Bombyx mori ) pupa exuvia 11 Int. J. Biological Macromolecules.- 2000.-V.27,-N.l .-P. 99-105.

238. Zhang M., Tan T., Yuan H., Rui C. Insecticidal and fungicidal activities of chitosan and oligo-chitosan // J. Bioact. Compat. Polym. -V. 18. -2003. -P.391-400.

Информация о работе

Бараковский, Иван Александрович
кандидата биологических наук
Щёлково, 2010
ВАК 03.01.06

Диссертация

Усовершенствование технологии производства хитозана для получения биологически активных препаратов - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы