Разработка технологии получения хитозан-меланинового комплекса из подмора пчел и его применение для молодняка сельскохозяйственных животных

Погарская, Наталья Владимировна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Разработка технологии получения хитозан-меланинового комплекса из подмора пчел и его применение для молодняка сельскохозяйственных животных
ВАК РФ 03.01.06, Биотехнология (в том числе бионанотехнологии)

Автореферат диссертации по теме "Разработка технологии получения хитозан-меланинового комплекса из подмора пчел и его применение для молодняка сельскохозяйственных животных"

На правах рукописи

л Л

ИИ4Ь00115

Погарская Наталья Владимировна

РАЗРАБОТКА ТЕХНОЛОГИИ ПОЛУЧЕНИЯ ХИТОЗАН-МЕЛАНИНОВОГО КОМПЛЕКСА ИЗ ПОДМОРА ПЧЕЛ И ЕГО ПРИМЕНЕНИЕ ДЛЯ МОЛОДНЯКА СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННЫХ ЖИВОТНЫХ

03.01.06 - биотехнология (в том числе бионанотехнологии)

Автореферат

диссертации на соискание учёной степени кандидата биологических наук

1 АПР 2010

Саратов-2010 г

004600115

Диссертация выполнена в Государственном научном учреждении «Ставропольский научно-исследовательский институт животноводства и кормопроизводства» Россельхозакадемии

Научный руководитель: доктор биологических наук

Селионова Марина Ивановна

Официальные оппоненты: доктор химических наук, профессор

Птичкина Наталия Михайловна

доктор биологических наук, профессор Маннапов Альфир Габдуллович

Ведущая организация: Государственное научное учреждение

Всероссийский государственный научно-исследовательский институт животноводства Россельхозакадемии

Защита диссертации состоится 29 апреля 2010 года в 12 часов на заседании диссертационного совета Д 220.061.04 при ФГОУ ВПО «Саратовский государственный аграрный университет им. Н.И. Вавилова» по адресу: 410005, г. Саратов, ул. Соколовая, 335, диссертационный зал.

- С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГОУ ВПО «Саратовский ГАУ» по адресу: 410005, г. Саратов, ул. Соколовая, 335.

Автореферат диссертации разослан 26 марта 2010 года и размещён на официальном сайте университета www.sgau.ru

Отзывы на автореферат направлять по адресу: 410012, г. Саратов, Театральная пл., 1, ФГОУ ВПО «Саратовский ГАУ», ученому секретарю диссертационного совета.

Ученый секретарь диссертационного совета доктор биологических наук, профессор

Л.В. Карпунина

Общая характеристика работы

Актуальность темы. Уникальные свойства хитина и хитозана открывают большие перспективы для их применения в быту, медицине, ветеринарии, косметологии, фармацевтической промышленности.

Эти природные полимеры имеют ряд важных свойств, как, например, высокую биологическую активность, совместимость с тканями человека, животных и растений, оказывают иммуностимулирующее, противоопухолевое, бак-териостатическое, ранозаживляющее действие. Они не загрязняют окружающую среду, так как полностью разлагаются ферментами микроорганизмов, а также снижают воздействие болезнетворных микроорганизмов, адсорбируясь на стенках желудочно-кишечного тракта человека и животных (Фомичев, 2004).

Повышенное внимание к свойствам хитина и его производного - хитозана, возникшее более трех десятилетий назад, является актуальным и в настоящее время. Несмотря на многочисленные исследования свойств (Варламов, 2002; Немцев, 2006; МиггагеШ, 1997), возможности применения хитозанов и их производных в различных отраслях деятельности человека далеко не исчерпаны. Их число и направленность действия непрерывно возрастают по мере дальнейшего изучения свойств этих биополимеров.

Актуальным является использование наиболее перспективного сырьевого источника, а именно - подмора пчел, для выделения хитина, хитозана и сопутствующего ему ценного биологически активного вещества - меланина, и разработка на его основе технологии получения препаратов с максимальным сохранением комплекса природных соединений (Комаров, 2003). За счет широкого распространения пчеловодства в нашей стране - по состоянию на 2005 г. в РФ во всех категориях хозяйств имелось 5,5 млн. пчелиных семей, существует возможность получать хитиновое сырьё (подмор пчел) в значительных масштабах (от 6 до 10 тысяч тонн в год). Весьма мало изученным является влияние комплексного воздействия хитозана и меланина на молодняк с.-х. животных в качестве биологически активной добавки, предотвращающей или смягчающей протекание желудочно-кишечных заболеваний.

Цель - разработка технологии получения хитозан-меланинового комплекса и меланина из побочного продукта пчеловодства - подмора пчел с последующей разработкой на их основе нового биологически активного препарата для профилактики заболеваний и дисфункций желудочно-кишечного тракта молодняка сельскохозяйственных животных.

Задачи исследования:

1. Разработать рациональную технологию получения хитозан-меланинового комплекса из подмора пчёл, обеспечивающую более высокий выход хитозана и меланина.

2. Изучить физико-химические характеристики, токсичность хитозан-меланинового комплекса.

3. Разработать рецептуру экспериментального комплексного препарата с полифункциональными свойствами на основе хитозан-меланинового комплекса с включением сухих экстрактов фитосборов.

4. Провести исследования биологической эффективности хитозан-меланинового комплекса и комплексного экспериментального препарата на его основе при выпаивании их молодняку сельскохозяйственных животных.

5. Определить рациональные сроки и оптимальные дозы выпаивания хи-тозан-меланинового комплекса и комплексного препарата на его основе для молодняка различных видов сельскохозяйственных животных.

6. Определить экономическую эффективность, экологическую безопасность хитозан-меланинового комплекса и комплексного препарата на его основе при применении его в ветеринарии.

Научная новизна. Разработана малостадийная, экологически безопасная технология получения хитозан-меланинового комплекса (ХМК) из подмора пчёл, позволяющая с наименьшими энергетическими затратами при использовании 10% р-ра NaOH, 78-82 °С, экспозиции 1,5-2,0 ч в стадии депротеиниро-вания и 30% р-ра NaOH, 90-95 °С, 1,5-2,0 ч - в стадии дезацетилирования выделить 22,4% ХМК и 6,4% меланина от исходного сырья. При этом хитозан имеет степень дезацетилирования 82-89%, меланин содержит Т10,7спин активных парамагнитных центров на 1 г сухого вещества, что подтверждает высокую биологическую активность полученных веществ. Новизна предложенных технологических решений подтверждена патентом на изобретение № 2382051, приоритет от 21.07.2010, опубл. 20.02.2010 г.

Впервые получены ИК-характеристики, изучен микроэлементный состав, определен класс токсичности ХМК.

Установлено, что использование ХМК снижает в кишечнике молодняка с.-х. животных количество бактерий рода Escherichia coli, Proteus, Citrobacter, предупреждает возникновение желудочно-кишечных заболеваний, повышает неспецифическую резистентность организма животных, сохранность и живую массу в раннем возрасте. Предложена рецептура нового комплексного препарата на основе ХМК с включением экстрактов фитосборов.

Практическая значимость работы. Получены экспериментальные данные по оптимизации стадий технологии получения хитозан-меланинового комплекса, открывающие перспективы его использования в животноводстве. Разработана рецептура препарата на его основе с использованием экстрактов фитосборов. Для производства хитозан-меланинового комплекса из подмора пчел разработаны ТУ на ХМК, утвержденные Министерством сельского хозяйства и центром стандартизации и метрологии Ставропольского края.

Разработаны Методические указания и временная инструкция по применению хитозан-меланинового комплекса на молодняке сельскохозяйственных животных, утвержденные на ученом совете ГНУ Ставропольского НИИ животноводства и кормопроизводства (протокол № 4 от 4 мая 2009 года) и секции кормления Отделения зоотехнии Россельхозакадемии (протокол № 3 от 3 ноября 2009 года). Результаты диссертационной работы используются в производственной деятельности хозяйств Ставропольского края: ЗАО «им. Кирова» Труновского района, СПК колхозе «Новомарьевский» Шпаковского района, опытной станции ГНУ Ставропольского НИИ животноводства и кормопроизводства (СНИИЖК) и подтверждены актами о внедрении.

Работа выполнена согласно Государственному тематическому плану научных исследований ГНУ СНИИЖК в лаборатории биологически активных веществ отдела биотехнологии по заданию 06.03.02.02: «Разработать новые препараты биологически активных веществ, пробиотиков и способы регуляции биосинтеза основных компонентов животноводческой продукции, обеспечивающие повышение продуктивности и резистентности сельскохозяйственных животных и улучшения биологической полноценности продукции» - № Госрегистрации 15070.4003005276,06.8.002.6.

Основные положения, выносимые на защиту:

- разработаная малостадийная, экологически безопасная технология получения биологически активных веществ из подмора пчёл, обеспечивает выход хитозан-меланинового комплекса - 22,4% и меланина - 6,4%;

- ХМК стабилен, однороден по составу, не токсичен, не содержит патогенной микрофлоры; хитозан имеет степень дезацетилирования - 82-89%, меланин - 1-10|7спин активных парамагнитных центров на 1 г сухого вещества;

- применение хитозан-меланинового комплекса на молодняке с.-х. животных в дозе 15 мг/кг живой массы 2 раза в день снижает содержание в кишечнике бактерий рода Е. coli, Proteus, Citrobacter на 37,9-68,9%, предупреждает возникновение желудочно-кишечных заболеваний в 6,7-20,0% случаев, повышает естественную резистентность, сохранность животных на 9,4-50% и их живую массу в раннем возрасте на 5,1-41,7%;

- использование ХМК и экспериментального препарата на его основе в животноводстве экономически выгодно, и позволяет получить дополнительную продукцию за счет лучшей сохранности и развития молодняка с.-х. животных.

Апробация работы. Результаты работы представлены на: V Международной конференции «Актуальные вопросы зоотехнической науки и практики как основа улучшения продуктивных качеств и здоровья сельскохозяйственных животных» (23-24 ноября, Ставрополь, 2007 г.); IX Международной конференции «Современные перспективы в исследовании хитина и хитозана» (13-17 октября, Ставрополь, 2008 г.); Международной научно-практической конференции «Инновация в аграрном секторе Казахстана, посвящённая 75-летию академика К.С. Сабденова» (15-16 ноября, Казахстан, Алматы, 2008 г.); Юбилейной Международной 2-ой научно-практической конференции, посвященной 40-летию образования Северо-Кавказского НИИ животноводства «Научные основы повышения продуктивности сельскохозяйственных животных» (23-24 марта, Краснодар, 2009 г.). Результаты работы представлены на 3 международных выставках: Международной выставке-конгрессе Высокие технологии. Инновации. Инвестиции (22-25 сентября, Санкт- Петербург, 2008 г.); 2-й Биотехнологической выставке-ярмарке «РосБиоТех-2008» (5-7 ноября, Москва, 2008 г.); Международном салоне инноваций и инвестиций (26-28 августа, ВВЦ Москва, 2009 г.).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 8 работ, включая 1 патент на изобретение и 1 статья в журнале, рекомендованном ВАК РФ.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, 2 глав собственных исследований, вы-

водов, предложений производству, списка использованных литературных источников, приложений. Работа изложена на 164 страницах, содержит 21 рисунок, 29 таблиц. Библиографический список состоит из 139 наименований, в том числе 16 зарубежных.

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

Объект и методы исследований

Объектом исследований явился хитозан-меланиновый комплекс, полученный из подмора пчёл. В качестве сырьевого поставщика хитина и хитозана рассматривали медоносную пчелу, которая может обеспечить большую биомассу хитинсодержащего сырья. В качестве сырья сравнивались образцы пчелиного подмора, взятого после весенней ревизии ульев 2006 г (I), 2007 г. (II) и летней профилактической чистки 2007 г. (III).

Научно-производственные опыты по изучению эффективности полученного ХМК, а также ХМК в составе разработанного экспериментального препарата (ЭП) для профилактики желудочно-кишечных заболеваний молодняка с.-х. животных проводилось в хозяйствах и организациях Ставропольского края. Общая схема проведения исследований представлена на рисунке 1.

Для разработки технологии получения ХМК, подмор пчел исследовали с помощью общепринятых методик: определение влажности, определение содержания общего азота, белка, липидов, макро- и микроэлементного состава.

Аминокислотный состав полученного хитозан-меланинового комплекса исследовали методом ионообменной колоночной хроматографии на автоматическом аминокислотном анализаторе ААА-339М (Чехия) по ГОСТ 13496 21-87. ИК-спектры полученных образцов ХМК и меланина снимали на комплексе ИК-Фурье спектрометра Scimitar 800 с ИК приставкой Miracle в диапазоне волновых чисел 4000 - 500 см"1. Интерпретацию ИК-спектров проводили с помощью автоматизированных библиотек ИК-спектров Omnic, Varian, IR-Search Master. Степень дезацетилирования хитозана определяли с помощью полученного ИК-спектра по методу Бакстера. ЭПР-спектр ХМК, хитозана и меланина снимали на радиоспектрометре 3-см диапазона Е-3 фирмы «Varían» с частотой В4 - модуляции 100 кГц. Определение числа радикалов в образце проводили при зарегистрированном спектре ЭПР монокристалла двуводного хлорида меди с известным количеством парамагнитных центров, согласно с инструкцией для эксплуатации прибора.

Определение g-фактора наблюдаемого сигнала проводили при использовании в качестве стандарта порошка оксида магния, содержащего примесь ионов марганца.

Рис. 1. Общая схема исследований по получению ХМК и меланина, разработке препарата на основе ХМК и испытанию эффективности их воздействия на животных

Стерильность ХМК на контаминацию бактериальной и грибковой микрофлорой проверяли при нанесении препарата на питательные среды: мясопеп-тонный агар (МПА) и мясопептонный бульон (МПБ) по ГОСТ 28085-89 с последующим термостатированием. Определение острой токсичности полученно-

го ХМК проводили по ГОСТ 12.1.007-76 на лабораторных белых мышах. По результатам опыта определяли LD50 по формуле Кербера. Безвредность полученного биологически активного вещества определяли путём однократного введения максимально допустимой дозы раствора этого вещества внутрибрюшинно лабораторным животным (кроликам) согласно Методическим указаниям (МУ 2.1.5.720-98).

Для приготовления экспериментального препарата на основе ХМК использовали следующие готовые формы: глюкозу кристаллическую, лактозу мо-ногидратную, бифидумбактерин из Bifidobacterium bifidum, штаммы № 1, 791 или J1BA-3, содержащий не менее 5><108 живых бифидобактерий и 0,85 г лактозы, сухой, витамин С, сухой экстракт красавки, сухой экстракт коры дуба, сухой экстракт цветков ромашки аптечной, сухой экстракт корневища лапчатки прямостоячей.

Изучение эффективности ХМК в чистом виде, а также в составе разработанного экспериментального препарата для профилактики желудочно-кишечных заболеваний молодняка с.-х. животных проводили по схемам, представленным в таблице 1.

С целью изучения эффективности исследуемых препаратов на организм животных и выявления их влияния на общие процессы, протекающие в организме под их влиянием, проводили биохимические и иммунологические исследования крови опытных животных, определяли интенсивность их роста и развития.

Уровень гемоглобина и количество эритроцитов животных определяли с помощью фотоэлектрического эритрогемометра (МРТУ-24-1443161) по методу И.И. Сипко (1968). Подсчёт количества лейкоцитов проводили в камере Горяева по общепринятой методике. Уровень общего белка в сыворотке крови животных проводили рефрактометрическим методом на рефрактометре RL 140 (POLAND). Содержание белковых фракций в сыворотке крови определяли турбодиметрическим (нефелометрическим) способом по И.П. Кондрахину (2004). Фагоцитарную активность нейтрофилов, бактерицидную и лизоцимную активность сыворотки крови (БАСК, ЛАСК) исследовали в соответствии с Методическими рекомендациями по определению естественной резистентности животных (1987) с использованием соответственно тест-культур Staphylococcus aureus, Escherichia coli (серотип 02), Micrococcus lisodecticus. Концентрацию циркулирующих иммунных комплексов (ЦИК) определяли методом Дижона с помощью фотоэлектроколориметра "ФЭК-56М". Бактериологические исследования микрофлоры кишечника животных на присутствие и количество Е. coli, Proteus, Citrobacter проводили согласно Методическим указаниям по бактериологической диагностике колибактериоза (1991).

Таблица 1 - Схемы выпаивания ХМК и ЭП новорожденным телятам, по-

росятам, козлятам и поросятам в период отъема

Группа, препарат Количество, голов Схема применения препарата

новорожденные телята

Опытная I, ХМК 15 10 мг ХМК на кг живой массы 2 раза в сутки с интервалом 10 часов в течение 7 дней

Опытная II, ХМК 15 15 мг ХМК на кг живой массы 2 раза в сутки с интервалом 10 часов в течение 7 дней

Опытная III, ЭП 15 ЭП (по 15 мг ХМК) на кг живой массы 2 раза в сутки с интервалом 10 часов в течение 7 дней

Контрольная 15 -

новорожденные поросята

Опытная I, ХМК 15 10 мг ХМК на кг живой массы 2 раза в сутки с интервалом 10 часов в течение 7 дней

Опытная II, ХМК 15 15 мг ХМК на кг живой массы 2 раза в сутки с интервалом 10 часов в течение 7 дней

Опытная III, ЭП 15 ЭП (по 15 мг ХМК) на кг живой массы 2 раза в сутки с интервалом 10 часов в течение 7 дней

Контрольная 15 -

поросята в период отъема

Опытная I, ХМК 16 10 мг на кг живой массы 2 раза в день в течение 7 суток

Опытная II, ХМК 16 15 мг на кг живой массы 2 раза в день в течение 7 суток

Контрольная 16 -

новорожденные козлята ■

Опытная I, ХМК 10 10 мг на кг живой массы 2 раза в сутки с интервалом 10 часов в течение 7 дней

Опытная II, ХМК 10 15 мг на кг живой массы 2 раза в сутки с интервалом 10 часов в течение 7 дней

Опытная III, ЭП 10 ЭП (по 15 мг ХМК) на 1 кг живой массы 2 раза в сутки с интервалом 10 часов в течение 7 дней

Контрольная 10 -

Интенсивность роста и развития и живую массу молодняка опытных групп определяли путем индивидуального взвешивания через каждые 30 дней. Среднесуточный прирост определяли расчетным путем. Термометрию опытных животных проводили с помощью электронного термометра «ХАсгоМе» (Швеция) ректально. Полученные результаты обрабатывали на компьютере "Реп1шт-4" методами биометрической статистики с использованием пакета прикладных программ а?' и "ЕхеГ.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Разработка технологии получения хитозан-меланинового комплекса и меланина

В результате проведенных исследований установлено, что количество белка и минеральных веществ в исследованных образцах пчелиного подмора стабильно и не зависет от места происхождения, времени и года сбора, что позволило разработать общую технологию получения из него биологически активных веществ. Отсутствие липидов в исходном сырье дало возможность не проводить процесс обезжиривания.

Интенсифицирован процесс экстракции хитин-меланинового комплекса из пчелиного подмора увеличением степени его дисперсности. Установлено, что при влажности 4-6% происходит его наиболее эффективное измельчение до размера частиц 0,1-0,3 мм.

Для оптимизации параметров и количества промежуточных стадий технологического процесса были проведены многофакторные эксперименты с варьированием концентрации гидролизата, изменением пропорций реагентов, температуры и времени проведения реакций депротеинирования и дезацетили-рования. В качестве изучаемых факторов оптимизации были исследованы жидкостные модули (ЖМ) подмор : гидролизат - р-р NaOH (1:10, 1:25) и концентрации NaOH (3, 10 и 15%) для проведения реакции депротеинирования. При проведении дезацетилирования исследованы жидкостные модули 1:15 и 1:25, концентрации NaOH (30 и 50%), проведение реакции в жестких условиях при нагревании до температуры 94-98 °С - «горячий способ» и в мягких условиях при комнатной температуре не ниже 20-22 °С - «холодный способ» дезацетилирования (табл. 2). Впервые проведено получение ХМК из пчелиного подмора без разделения стадий депротеинирования и дезацетилирования при «горячем» и «холодном» способах дезацетилирования.

Таблица 2 - Характеристика ХМК из пчелиного подмора при его получении без разделения стадий депротеинирования и дезацетилирования и использовании «горячего» и «холодного» способов дезацетилирования

Способ дезацетилирования (ЖМ=1.25) Выход ХМК, % ОТ Шподм. Содержание общего азота в ХМК Меланин в ХМК, % от Шхмк Выход меланинов, % ОТ Шподм

горячий 22,4±0,1 3,9±0,2 7,1*±1,2 6,4*±0,3

холодный 20,7±0,1 5,1±0,3 10,4±1,6 3,9±0,3

В результате разработки технологического процесса получения ХМК было выделено еще одно биологически активное вещество - меланин, в качестве сопутствующего продукта. Меланин осаждали из гидролизатов, сохраненных после проведения «горячего» и «холодного» способа дезацетилирования, используя 33% соляную кислоту.

При получении меланина из отходов щелочного гидролиза пчелиного подмора использовали реакцию нейтрализации гидроксида натрия соляной кислотой, в результате которой образуется соль №С1 и вода. Таким образом, помимо получения ещё одного важного биологически активного вещества, в разработанной технологии отработана подготовка отходов производства к их экологически безвредному сливу.

В соответствии с поставленной целью и задачами, разработана технология получения хитозан-меланинового комплекса и меланина из подмора пчел, которая включает 6 стадий получения ХМК и 4 стадии получения меланина (рис. 2).

Пчелиный подмор Сушка до влажности 4-6%;

Измельчение до оазмеоа частиц 0,1-03 мм

Депротеинирование подмора }

10% о-о №ОН: ЖМ=1:10:1=78-82 °С: 1.5-2.0 ч *

^ -V -Щ -ч * » V'. '*$ ч ч . -» •»: Ч -Ь Хитин-меланиновый комплекс *

Дезацетилирование хитин-мелаппиового комплекса 30% р-р N3011; ЖМ=1:25; 1=90-95 °С; 1,5-2,0 часа 1 Гидролизат

к * * %

Осаждение меланина Концентрированная НС1, центрифугирование при 5000 об/мин; 15 мин

Хитозан-меланиновый комплекс

Меланин

Промывание хитозан-меланинового комплекса. Нейтральная реакция промывных вод

« * % * Промывание меланина. Нейтральная реакция промывных вод

■Ч * > Ч и .

Сушка готовых продуктов « 1=60-65 °С, до влажности

8-10%

Рис. 2. Схема проведения технологического процесса получения ХМК и меланина из подмора пчел

Наиболее оптимальным и экономически эффективным (табл. 3) представляется получение ХМК при использовании 30% ИаОН для проведения дезаце-тилирования при температуре 90-95 °С и ЖМ=1:25. Выход хитозан-меланино-вого комплекса при этом составляет 22-24% от исходного сырья (по сравнению с существующими 12% хитозана из других видов хитинсодержащего сырья). Общий выход меланина - 6,4% от его содержания в пчелином подморе.

Таблица 3 - Характеристика хитозан-меланинового комплекса при его получении «горячим» способом и различных начальных условиях

жм Выход ХМК, % Содержание азота, % Выход меланина, %

концентрация ЫаОН 30% при дезацетилировании

1:15 18,6±0,9 3,7±0,2 6,2±0,2

1:25 22,4±1,1 3,9±0,2 6,4*±0,2

концентрация ЫаОН 50% при дезацетилировании

1:15 20,2±1,0 3,6±0,2 6,3±0,2

1:25 19,0±0,9 3,7±0,2 6,1 ±0,2

Исследования полученных хитозан-меланинового комплекса и меланина

При проведении идентификации ИК-спектров экспериментальных образцов хитозан-меланинового комплекса регистрировались полосы поглощения сопряженных углеродных связей при 1650 см"1, карбоксильных - 1736 см"1 и 1712 см"1, гидроксильных - 3288 см"1 и 1170 см"1, валентных колебаний метальных и метиленовых групп в области 2900-2800 см"1, амидных групп в области 3460 см'1 и деформационных колебаний аминогруппы - 1600см'1, что подтвердило их групповую принадлежность к хитозану и меланинам животного происхождения (рис. 3).

Исследованные ИК-спектры полученных хитозан-меланинового комплекса и меланина и взятые из разных образцов, полученных в разное время, полностью совпадают, несмотря на применяемый в ИК-Фурье - спектроскопии метод микропроб, что свидетельствует об однородности получаемых веществ. Данные ИК-спектроскопии могут быть использованы для подтверждения подлинности препарата. Рассчитанная по соотношению величин полос поглощения аминогруппы и амидной группы степень дезацетилирования полученного хитозан-меланинового комплекса равна 82-89%.

а) б)

Рис. 3. ИК-спектр а) хитозан-меланинового комплекса; б) меланина, полученных из подмора пчел

Присутствие в структуре меланина неспаренных электронов было показано с

помощью спектроскопии электронного парамагнитного резонанса.

Снятый спектр ЭПР меланина, полученного из подмора пчёл (рис. 4), совпадает со спектрами меланинов другого природного происхождения, представленных в литературных источниках. Для определения фактора наблюдаемого сигнала в качестве стандарта использовали порошок оксида магния, содер-жа-щий примесь ионов марганца. Найденный §-фактор сигналов меланина составляет 2,0037. Рассчитанное количество парамагнитных центров составляет МО" на 1 г меланина.

Спектр ЭПР хитозан-меланинового комплекса зафиксировать не удалось, что может свидетельствовать о том, что при образовании комплекса с хитоза-ном, меланин расходует свои неподелённые электроны на образование связи. Снятый спектр ЭПР хитозана, освобождённого от меланина воздействием на него перекиси водорода, выглядит как большой бесструктурный синглет.

Полученный хитозан-меланиновый комплекс был исследован на острую токсичность, как препарат, который предполагается использовать в

3220 3240 3260

В, Гс

Рис. 4. Спектр ЭПР меланина, полученного из подмора пчел

ветеринарных целях при пероральном способе введения. Действие его, по существующим данным, основано на способности обволакивать стенки желудка и кишечника, препятствуя тем самым воздействию болезнетворных микроорганизмов. В соответствии с результатами исследований и по принятым классификациям, хитозан-меланиновый комплекс из подмора пчел является малотоксичным веществом и по ГОСТ 12.1.007-76 относится к 4 классу веществ по степени опасности и токсичности.

Методами бактериологического анализа не выявлено присутствие в комплексе и меланине микроорганизмов рода сальмонелл, протея, золотистого стафилококка, кишечной и синегнойной палочки, а также токсинообразующих анаэробов и дрожжей рода Candida. Поэтому хитозан-меланиновый комплекс, являясь биологически активным веществом, может быть использован в ветеринарии, как основа препаратов для лечения и профилактики желудочно-кишечных заболеваний различной этиологии, а также при изготовлении рано-заживляющих мазей.

Разработка рецептуры экспериментального препарата на основе хитозан-меланинового комплекса

Полученные данные позволили без ограничений использовать полученный ХМК в качестве биологически активного вещества и основы экспериментального препарата (ЭП), поддерживающего необходимый положительный бактериальный баланс кишечника молодняка с.-х. животных, способствующего снижению количества его условно-патогенной микрофлоры и повышающего общую резистентность организма на молодняке: поросятах, телятах и козлятах, что было подтверждено при проведении производственных экспериментов на животных.

Разработанная рецептура ЭП на основе ХМК с включением биологически активных веществ и культур микроорганизмов для профилактики заболеваний желудочно-кишечного тракта молодняка сельскохозяйственных животных, представлена в таблице 4.

Рассчитано количественное содержание ингредиентов препарата по всем компонентам сухого препарата и разбавителя на 1 день профилактического курса для одного животного, по разным видам животных. Разработаны методические указания и временная инструкция по применению хитозан-меланинового комплекса на молодняке с.-х. животных в качестве биологически активной кормовой добавки.

Производственные испытания эффективности хитозан-меланинового комплекса и экспериментального препарата на его основе

Установлено, что использование ХМК и экспериментального комплексного препарата на его основе способствовало снижению заболеваемости желудочно-кишечного тракта молодняка животных в ранний период жизни (табл. 5).

Учитывая, что основным путем микробного заражения является алимен-

тарный, было проведено изучение влияния применения хитозан-меланинового комплекса на микробный состав кала с целью установления содержания условно-патогенной микрофлоры в кишечнике телят.

Таблица 4 - Рецептура экспериментального комплексного препарата на основе хитозан-меланинового комплекса

№ п/п Наименование компонента, производитель Количество на 1 кг живой массы, г Соотношение компонен тов, %

1 Хитозан-меланиновый комплекс, опытные образцы лаборатории БАВ ГНУ СНИИЖК 0,015 1

2 Глюкоза кристаллическая («Профифарм», Москва) 0,25 20

3 Лактоза моногидратная («Профифарм», Москва) 0,12 9

4 Бифидумбактерин из Bifidobacterium bifidum, штаммы №1, 791 или ЛВА-3, содержащий не менее 5x108 живых бифидобактерий и 0,85 г лактозы, сухой (НПО «Аллерген», Ставрополь) 0,2 16

5 . Витамин С («МСД», Москва) 0,02 2

6 Сухой экстракт красавки («Фитоника», Краснодар) 0,02 1

7 Сухой экстракт коры дуба («Фитоника», Краснодар) 0,15 12

8 Сухой экстракт цветков ромашки аптечной (ООО «КиТ», Алтайский край, Бийск) 0,25 19

9 Сухой экстракт корневища лапчатки прямостоячей (ООО «КиТ», Алтайский край, Бийск) 0,255 20

Всего 1,28 100,0

Выявлено, что в кишечнике телят I, II опытных групп после выпойки препарата произошло снижение количества микроорганизмов E.coli соответственно на 68,9% и 43,2%, бактерий рода Proteus - 40,0 и 43,8% к Citrobacter -37,9% (I группа), в то время как в контрольной группе данные показатели снизились лишь на 20,4; 26,9 и 29,6% (табл. 6).

Анализ гематологических и биохимических показателей Крови телят (рис.;; 5) выявил проявление стимулирующего эффекта хитозан-меланинового комплекса на факторы неспецифической резистентности уже на 14 сутки после его использования. В крови животных опытных групп на 33,5% и 38,1% (Р<0,05) соответственно было меньше содержание лейкоцитов, чем у телят контрольной группы.

Таблица 5 - Эффективность применения хитозан-меланинового

комплекса и препарата на его основе для профилактики _заболеваний ЖКТ у телят, поросят и козлят_

Группы

Показатели контроль ная 1 опытная II опытная III опытная ЭП

10 мг ХМК 15 мг ХМК (12 мг ХМК)

новорожденные поросята (по 15 гол.)

Заболело, всего гол./ 5 4 3 1

% 33,3 26,6 20,0 6,7

из них пало, гол. 4 2 2 1

Сохранность, % 73,3 86,6 86,6 93,3

Профилактическая эффективность, %. 6,7 13,3 26,6

новорожденные козлята (по 10 гол.)

Заболело всего, гол. 6 3 3 1

% 60,0 27,2 30,0 10,0

в т.ч. от заболеваний ЖКТ, гол. 4 2 2 1

% 40,0 18,2 20,0 10,0

из них пало, гол. 5 2 3 0

в т.ч. от заболеваний ЖКТ 3 1 2 0

Сохранность, % 50,0 80,0 70,0 100,0

Профилактическая эффективность, %. _ 21,8 20,0 30,0

новорожденные телята (по 15 голов)

Заболело, гол. 4 2 2

% 57,1 28,5 28,5

в т. ч. легкой формой тяжелой формой 3 1 2 2 -

Период заболевания после рождения, 2,5 4,5 4,0

сут.

Продолжительность болезни, сут. 4,5 3,7 4,0 -

Профилактическая эффективность, %. 28,6 28,6 -

поросята в период отъема (по 16 голов)

Заболело, гол. 6 5 4 -

% 37,5 31,2 25,0 -

из них пало, гол. 3 2 1 -

Сохранность в 3-х мес., % 81,2 87,5 93,7 -

Профилактическая эффективность, %. - 6,3 12,5 -

В то же время телята опытных групп выделялись по увеличению в крови концентрации гемоглобина, общего белка, -^глобулинов. Разница в их пользу

по сравнению с контролем соответственно составляла по группам 4,0; 12,1%; 9,7; 10,5%; 27,7 (Р<0,05) и 34,9% (Р<0,05).

Таблица 6 - Влияние применения хитозан-меланинового комплекса

Микроорганизмы рода, 105 КОЕ*/г Контрольная Опытные

начало опыта через 29 дней I II

начало опыта через 29 дней начало опыта через 29 дней

E.coli 9,8±0,8 9 7,8±0,61 8,7±0,57 2,7±0,36 10,4±1,12 5,9±0,63

Proteus 5,2±0,52 3,8±0,59 5,9±0,49 3,6±0,44 4,8±0,43 2,7±0,29

Citrobacter 2,7±0,19 1,9±0,36 2,9±0,34 1,8±0,27 2,1±0,22 1,6±0,17

Примечание:* - КОЕ - колониеобразующие единицы.

s-^pi-г

лейкоциты

гемоглобин

общий белок

Y-глобулин

ЛАСК

ЦИК

□ I опытная (10мг/кг)

□ II опытная (20 мг/кг)

Рис. 5. Разница по биохимическим показателям крови новорожденных телят при применении ХМК и ЭП

Одновременно гуморальное звено иммунной системы отреагировало увеличением показателей лизоцимной и бактерицидной активности сыворотки крови, уровень которых повысился по сравнению с контролем на 4,4; 6,7%; и 29,8 (Р<0,05); 1,0%. Следует отметить десенсибилизирующее свойство хитозана, проявившееся существенным снижением в крови животных первой и второй опытных групп по сравнению с контролем циркулирующих иммунных комплексов (ЦИК) на 6,1% и 35,8% (Р<0,01).

Анализ биохимических показателей крови новорождённых поросят (рис. 6) выявил, что поросята опытных групп (I, II, III) превосходили животных контрольной группы по содержанию гемоглобина соответственно на 7,9, 14,6 и 15,8% (Р<0,05). По уровню общего белка, бактерицидной и лизоцимной активности сыворотки крови разница была также в пользу опытных групп и составила соответственно 14,2, 25,1 (Р<0,01) и 21,5% (Р<0,01); 11,7, 16,3 (Р<0,05) и 9,6%; 6,8, 11,1 и 8,1% (Р<0,05). Кроме того установлено, что у особей II и III опытных групп выявлено меньшее содержание лейкоцитов на 10,2, 16,8

и 14,0 % (Р<0,05). Достоверной разницы в концентрации белковых фракций сыворотки крови между группами не отмечено.

Аналогичные результаты получены при анализе эффективности применения ХМК поросятам в период их отъёма, являющегося стрессовым для молодняка.

лейко- гемо общий БАСК ЛАСК мшы_глобин_белок_

ИI опытная (10мг/кг) □ II опытная (15 мг/кг) □ ЭП

Рис. 6. Разница по биохимическим показателям крови новорожденных поросят при применении ХМК и ЭП

Выпаивание поросятам комплекса имело положительную тенденцию по изменению уровня общего белка, гамма-глобулинов, бактерицидной и лизоцимной активности сыворотки крови. Разница была в пользу опытных животных соответственно на 22,7 и 27,9% (Р<0,05); 31,9 (Р<0,01) и 21,2% (Р<0,05); 29,8 (Р<0,01) и 6,9%; 13,8 и 11,9% (Р<0,05) по сравнению с контролем (рис. 7).

ЗОтТ

лейко- гемо- общий ВДСК ЛАСК цты_глобин_белок_

13 I опытная (10мг/кг) ШII опытная (15 мг/кг) □ ЭП

Рис. 7. Разница по биохимическим показателям крови поросят в период отъема при применении ХМК

Анализ экспериментальных данных (рис. 8) показал, что у новорожденных козлят опытных групп достоверно повышалось содержание гемоглобина, лизо-цимная, бактерицидная активность сыворотки крови и фагоцитарная активность нейтрофилов в среднем соответственно на 11,4, 10,3, 35,4 и 56,3%.

Помимо положительного влияния на факторы неспецифической защиты организма выпойка ХМК и ЭП молодняку животных стимулировала увеличение живой массы и среднесуточных привесов в ранний период онтогенеза.

Так, у телят разница в пользу молодняка опытных групп по отношению к животным контрольной группы после использования препарата составила соответственно: через 30 дней 15,7 (Р<0,05); 8,6 (Р<0,05) %; и 7,0; 7,3 % и через 60 дней 6,05; 8,75 (Р<0,05); и 3,27; 8,09%.

°/о Козлята новорожденные

ОI опытная (10мг/кг) □ II опытная (15 мг/кг) □ ЭП

Рис. 8. Разница по биохимическим показателям крови новорожденных козлят при применении ХМК и ЭП

Молодняк опытных групп у новорожденных поросят на 30 день после выпаивания, по сравнению с аналогами из контрольной группы, имел больше живую массу на 3,3, 6,4 и 8,4% (Р<0,05). Тенденция сохранилась и в последующие периоды онтогенеза: разница в их пользу в 2-х и 3-х месячном возрасте в среднем составляла 2,7 и 4,7% (Р<0,05), что обусловлено большими среднесуточными привесами в среднем на 5,3%.

Использование ХМК, по-видимому, положительно повлияло на адаптацию поросят в стрессовый период отъёма, что о чём свидетельствует динамика их живой массы и среднесуточных привесов. Так, молодняк опытных групп уже на 30 день после стимуляции по сравнению с поросятами из контрольной группы имел больше живую массу на 1,9 и 2,4% (Р<0,05). Более заметная разница в пользу опытных групп отмечена в 3-х месячном возрасте соответственно на 4,8 и 3,6% (Р<0,01) за счет большей энергии роста поросят в среднем на 7,7% (Р<0,05).

Анализ динамики живой массы козлят до 2-х месячного возраста выявил, что применение хитозан-меланинового комплекса и экспериментального препарата на его основе оказывало стимулирующее влияние на рост козлят. В самый ранний период онтогенеза (до 20 дней) наибольшая разница отмечена между контрольными животными и козлятами II и III групп: на 25,6 и 18,1% (Р<0,01). В дальнейшем - в 40 дней и два месяца, животные опытных групп практически не отличались по живой массе между собой, достоверно (Р<0,01)

превосходя козлят из контрольной группы в среднем на 30,2% и 32,1%. При этом, во все учтенные периоды животные опытных групп отличались от контрольных значительно большими среднесуточными приростами, в среднем на 47,9,98,2 и 35,6% (Р<0,01).

Расчет экономической эффективности

Расчеты затрат на получение ХМК и меланина, учитывая применение лабораторного оборудования, которое было использовано при разработке способа получения ХМК, показали, что себестоимость 1г ХМК составляет 0,81 руб., а меланина - 0,93 руб.

Расчет экономической эффективности применения ХМК и ЭП, рекомендуемых для профилактики расстройств желудочно-кишечного тракта различной этиологии у молодняка с.-х. животных, возникающих в процессе их выращивания, показывает их применение экономически обоснованным и составляет дополнительную прибыль:

365,60 и 518,04 руб. на одного поросёнка при выпаивании ХМК и ЭП соответственно в новорождённом возрасте;

432,63 руб. на одного поросёнка при выпаивании ХМК при отъёме;

124,0 и 224,4 руб. на одного козлёнка при выпаивании ХМК и ЭП соответственно;

261,58 рубля на 1 телёнка.

При этом важно учитывать отсутствие расходов на лечение животных синтетическими препаратами (антибиотики, сульфаниламиды и т.д.) и, в связи с этим, повышение биогенной полноценности и биологической безопасности животноводческой продукции.

ВЫВОДЫ

1. Разработана рациональная, экологически безопасная технология получения хитозан-меланинового комплекса и меланина из подмора пчел, обеспечивающая выход хитозана 20,0-22,4% от исходного сырья, имеющего степень дез-ацетилирования 82-89%; выход меланина - 6,4% с количеством активных парамагнитных центров 1-1017спинна 1 г сухого вещества.

2. На основании исследований ИК- и ЭПР-спектров определены характеристики хитозан-меланинового комплекса и меланина для их стандартизации и подтверждения подлинности.

3. Токсикологические исследования позволили отнести хитозан-меланиновый комплекс к малотоксичным веществам и по ГОСТ 12.1.007-76 к 4 классу веществ по степени опасности и токсичности, соответствующему требованиям безопасности к кормовым добавкам. Микробиологические исследования не выявили присутствия в ХМК и меланине патогенной микрофлоры.

4. Обнаружено, что применение ХМК при выпойке их телятам приводит к значительному снижению количества бактерий рода Е. coli, Proteus, Citrobacter соответственно на 68,9; 40,0 и 37,9%, что обосновывает целесообразность его

использования для профилактики заболеваний желудочно-кишечного тракта молодняка крупного рогатого скота.

5. Экспериментально установлено, что оптимальной схемой применения ХМК является: доза 15 мг на 1 кг живой массы животного; кратность применения - 2 раза в сутки; продолжительность выпаивания - 10 дней, что позволяет снизить возникновение желудочно-кишечных расстройств у телят, поросят и козлят в раннем возрасте и повысить их сохранность соответственно на 28,6, 13,3 и 20,0%%.

6. Выявлено, что применение ХМК оказывает положительное влияние на гематологические показатели крови и уровень естественной резистентности молодняка с.-х. животных. Выявлено достоверное повышение на 10,5-27,9 % общего белка сыворотки крови, 11,4-12,1% гемоглобина, 6,7-13,8% лизоцим-ной, 16,3-35,4% бактерицидной и 56,3% фагоцитарной активности.

7. Обнаружено, что использование ХМК и препарата на его основе способствует увеличению среднесуточных привесов у телят, поросят и козлят на 8,7; 5,3 и 34,1% и увеличению их живой массы в раннем возрасте на 8,1; 3,6 и 30,2% соответственно.

8. Применение ХМК и ЭП для выпойки молодняка с.-х. животных является экономически обоснованным. Дополнительная прибыль составляет:365,60 и 518,04 руб. на одного поросёнка при выпаивании ХМК и ЭП соответственно в новорождённом возрасте; 432,63 руб. - при отъёме; 197,12 руб.; 124,0 и 222,4 руб. на одного козлёнка при выпаивании ХМК и ЭП и 261,58 руб. на одного телёнка в новорожденном возрасте соответственно.

Предложения производству

1. Научно-производственным лабораториям, малым предприятиям биологической промышленности использовать разработанную технологию получения хитозан-меланинового комплекса и меланина из подмора пчел и научно-техническую документацию.

2. Для профилактики желудочно-кишечных заболеваний, повышения естественной резистентности, сохранности и живой массы молодняка с.-х. животных проводить выпойку новорождённым животным и в период отъема хито-зан-меланиновым комплексом дозе 15 мг на 1 кг живой массы 2 раза в сутки в течение 10 дней.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Погарская, Н.В. Получение хитозан - меланинового комплекса из подмора пчел и определение его физико-химических и биологических характеристик / Н.В. Погарская, М.И. Селионова, В.В. Бинатова // Ветеринария и кормление. - 2008. - № 12. - С. 28-29.

2. Погарская, Н.В. Хитозан-меланиновый комплекс из подмора пчёл / Н.В. Погарская, М.И. Селионова // Пчеловодство. - 2008. - № 9. - С.46-47.

3. Селионова, М.И. Влияние хитозан-меланинового комплекса из подмора

пчел на резистентность и развитие поросят / М.И. Селионова, Н.В. Погарская, М.И. Коваленко И Свиноводство. - 2009. - № 3. - С. 28-32.

4. Патент № 2382051 РФ Способ получения хитозан-меланинового комплекса из подмора пчёл / М.И. Селионова, Н.В. Погарская. - Приоритет от 21.07.2008; опубл. 20.02.2010. - Бюл. № 5.

5. Погарская, Н.В. Получение хитозан-меланиновоо комплекса из подмора пчёл и его использование для профилактики дисбактериоза молодняка животных / Н.В. Погарская, М.И. Селионова // Современные перспективы в исследовании хитина и хитозана: материалы IX Междунар. конф. 13-17 окт. Ставрополь, 2008 г. Москва: Изд-во ВНИРО. - 2008. - С. 188-191.

6. Погарская, Н.В. Инновационные технологии получения хитозан - ме-ланинового комплекса и изучение его свойств на молодняке с.-х. животных / Н.В. Погарская, М.И. Селионова // Матер, междунар. научно-практич. конф.: Инновация в аграрном секторе Казахстана, посвящённая 75-летию академика К.С. Сабденова. Казахстан. Алматы. КазГАУ. - 2008. - Т. 1. - С. 373-379.

7. Селионова, М.И. О технологии получения хитозан-меланинового комплекса из подмора пчёл и его использование для профилактики дисбактериоза телят / М.И. Селионова, Н.В. Погарская // Актуальные вопросы зоотехнической науки и практики как основа улучшения продуктивных качеств и здоровья сельскохозяйственных животных: Сб. науч. трудов по материалам V Междунар. конф.( Ставрополь 23-24 ноября 2007 г.). - 2007. - Ставрополь: Изд-во Аргус. - С. 398-402.

8. Селионова, М.И. Использование хитозан-меланинового комплекса на поросятах разного возраста / М.И. Селионова, Н.В. Погарская, М.И. Коваленко // Научные основы повышения продуктивности сельскохозяйственных животных: Сб. науч. трудов юбилейной междунар. (2-ой) научно-практич. конф., посвященной 40-летию образования СКНИИЖ. Краснодар. - 2009. - Ч. 2. - С. 225-228.

Погарская Наталья Владимировна

Подл, в печать 22.03. 2010. Бумага офсетная. Формат 60/84 1/16 Зак. 042. Усл. изд. лист 1,0. Тираж 100 экз.

Цех оперативной полиграфии СНИИЖК г. Ставрополь, пер. Зоотехнический 15.

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Погарская, Наталья Владимировна

ВВЕДЕНИЕ

Глава 1. Обзор литературы

1.1. Актуальность применения биологически активных вёществ на основе хитозана в ветеринарии

1.2.Физико-химические свойства хитина и хитозана

1.3. Способы и источники получения хитина и хитозана

1.4. Биологически-активные препараты на основе хитозана и его производных

1.5. Меланины: источники, свойства, возможности использования

1.6. Использование препаратов на основе хитозана для лечения сельскохозяйственных животных

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

Глава 2. Объект и методы исследований

2.1. Теоретическое обоснование стадий технологии получения хитозан-меланинового комплекса из подмора пчёл

2.2. Теоретическое обоснование получения меланина, как сопутствующего продукта, при получении хитозан-меланинового комплекса

2.3. Теоретическое обоснование состава экспериментального комплексного препарата на основе хитозан-меланинового комплекса

2.4. Программа экспериментальных исследований

2.5. Разработка этапов получения хитин-меланинового, хитозан-меланинового комплексов и меланина

2.6. Использование общепринятых методик исследований полученных биологически активных веществ

2.7. Приготовление экспериментального комплексного препарата на основе хитозан-меланинового комплекса

2.8. Методики биохимических и иммунологических исследо ваний крови для определения общей резистентности молодняка животных

2.9. Методика математической обработки экспериментальных данных

Глава 3. Результаты исследований и их обсуждение

3.1. Проведение экспериментов по разработке технологии получения хитозан-меланинового комплекса и меланина

3.1.1. Подготовка и исследование рабочей массы из исходного сырья - пчелиного подмора

3.1.2. Получение хитин-меланинового комплекса из подготовленной рабочей массы

3.1.3. Получение хитозан-меланинового комплекса (оптимизация процесса)

3.1.4. Выделение меланина в качестве сопутствующего продукта

3.1.5. Определение физико-химических характеристик хитозан-меланинового комплекса и меланина

3.1.6. Исследование микробиологических и токсикологических характеристик хитозан-меланинового комплекса

3.1.7. Разработка состава экспериментального комплексного препарата на основе хитозан-меланинового комплекса

3.2.Производственные испытания эффективности хитозан-меланинового комплекса и экспериментального комплексного препарата на его основе

3.2.1. Результаты производственных испытаний эффективности выпаивания хитозан-меланинового комплекса на телятах

3.2.2. Результаты производственных испытаний эффективности выпаивания исследуемых препаратов на поросятах

3.2.3. Результаты производственных испытаний эффективности выпаивания исследуемых препаратов на козлятах 121 3.2.4. Экономическая эффективность использования хитозан-меланинового комплекса и комплексного препарата на его основе

Введение Диссертация по биологии, на тему "Разработка технологии получения хитозан-меланинового комплекса из подмора пчел и его применение для молодняка сельскохозяйственных животных"

Актуальность темы.

Уникальные свойства хитина и хитозана открывают большие перспективы для их применения в быту, медицине, ветеринарии, косметологии, фармацевтической промышленности.

Эти природные полимеры имеют ряд важных свойств, как, например, высокую биологическую активность, совместимость с тканями человека, животных и растений, оказывают иммуностимулирующее, противоопухолевое, бактериостатическое, ранозаживляющее действие. Они не загрязняют окружающую среду, так как полностью разлагаются ферментами микроорганизмов, а также снижают воздействие болезнетворных микроорганизмов, адсорбируясь на стенках желудочно-кишечного тракта человека и животных (Фомичев, 2004).

Повышенное внимание к свойствам хитина и его производного — хитозана, возникшее более трех десятилетий назад, является актуальным и в настоящее время. Несмотря на многочисленные исследования свойств (Варламов, 2002; Немцев, 2006; Muzzarelli, 1997), возможности применения хитозанов и их производных в различных отраслях деятельности человека далеко не исчерпаны. Их число и направленность действия непрерывно возрастают по мере дальнейшего изучения свойств этих биополимеров.

Актуальным является использование наиболее перспективного сырьевого источника, а именно - подмора пчел, для выделения хитина, хитозана и сопутствующего ему ценного биологически активного вещества - меланина, и разработка на его основе технологии получения препаратов с максимальным сохранением комплекса природных соединений (Комаров, 2003). За счет широкого распространения пчеловодства в нашей стране — по состоянию на 2005 г. в РФ во всех категориях хозяйств имелось 5,5 млн. пчелиных семей, существует возможность получать хитиновое сырьё (подмор пчел) в значительных масштабах (от 6 до 10 тысяч тонн в год). Весьма мало изученным является влияние комплексного воздействия хитозана и меланина на молодняк с.-х. животных в качестве биологически активной добавки, предотвращающей или смягчающей течение желудочно-кишечных заболеваний.

Цель работы — разработка технологии получения хитозан-меланинового комплекса и меланина из побочного продукта пчеловодства - подмора пчел с последующей разработкой на их основе нового биологически активного препарата для профилактики заболеваний и дисфункций желудочно-кишечного тракта молодняка сельскохозяйственных животных.

Задачи исследования:

2. Изучить физико-химические характеристики, токсичность хито-зан-меланинового комплекса.

5. Определить рациональные сроки и оптимальные дозы выпаивания хитозан-меланинового комплекса и комплексного препарата на его основе для молодняка различных видов сельскохозяйственных животных.

Научная новизна работы.

Разработана малостадийная, экологически безопасная технология получения хитозан-меланинового комплекса (ХМК) из подмора пчёл, позволяющая с наименьшими энергетическими затратами при использовании 10% р-ра NaOH, 78-82 °С, экспозиции 1,5-2,0 ч в стадии депротеинирова-ния и 30% р-ра NaOH, 90-95 °С, 1,5-2,0 ч - в стадии дезацетилирования выделить 22,4% ХМК и 6,4% меланина от исходного сырья. При этом хи-тозан имеет степень дезацетилирования 82-89%, меланин содержит

1 п

1-10 спин активных парамагнитных центров на 1 г сухого вещества, что подтверждает высокую биологическую активность полученных веществ. Новизна предложенных технологических решений подтверждена патентом на изобретение № 2382051, приоритет от 21.07.2010, опубл. 20.02.2010 г.

Впервые получены РЖ-характеристики, изучен микроэлементный состав, определен класс токсичности ХМК.

Научно-практическая значимость. Получены экспериментальные данные по оптимизации стадий технологии получения хитозан-меланинового комплекса, открывающие перспективы его использования в животноводстве. Разработана рецептура препарата на его основе с использованием экстрактов фитосборов. Для производства хитозан-меланинового комплекса из подмора пчел разработаны ТУ на ХМК, утвержденные Министерством сельского хозяйства и центром стандартизации и метрологии Ставропольского края.

Проведенные испытания хитозан-меланинового комплекса и экспериментального комплексного препарата на его на основе показали, что при выпаивании их молодняку сельскохозяйственных животных наблюдается эффект общего повышения сопротивляемости организма к неблагоприят ным факторам внешней среды, сопровождающийся значительным уменьшением количества кишечных расстройств, увеличением живой массы животных.

Разработаны Методические указания и временная инструкция по применению хитозан-меланинового комплекса на молодняке с.-х. животных, утвержденные на ученом совете ГНУ Ставропольского НИИ животноводства и кормопроизводства (протокол № 4 от 4 мая 2009 года) и секции кормления Отделения зоотехнии Россельхозакадемии (протокол № 3 от 3 ноября 2009 года). Результаты использованы в производственной деятельности хозяйств Ставропольского края: ЗАО «им. Кирова» Труновского района, СПК колхозе «Новомарьевский» Шпаковского района, опытной станции ГНУ Ставропольского НИИ животноводства и кормопроизводства (СНИИЖК) и подтверждены актами о внедрении.

Основные положения, выносимые на защиту: разработаная малостадийная, экологически безопасная технология получения биологически активных веществ из подмора пчёл, обеспечивает выход хитозан-меланинового комплекса — 22,4% и меланина - 6,4%;

ХМК стабилен, однороден по составу, не токсичен, не содержит патогенной микрофлоры; хитозан имеет степень дезацетилирования - 8217

89%, меланин — 110 спин активных парамагнитных центров на 1 г сухого вещества; применение хитозан-меланинового комплекса на молодняке с.-х. животных в дозе 15 мг/кг живой массы 2 раза в день снижает содержание в кишечнике бактерий рода Е. coli, Proteus, Citrobacter на 37,9-68,9%, предупреждает возникновение желудочно-кишечных заболеваний в 6,7-20,0% случаев, повышает естественную резистентность, сохранность животных на 9,4-50% и их живую массу в раннем возрасте на 5,1-41,7%;

- использование ХМК и экспериментального препарата на его основе в животноводстве экономически выгодно и позволяет получить дополнительную продукцию за счет лучшей сохранности и развития молодняка с.-х. животных.

IX Международной конференции «Современные перспективы в исследовании хитина и хитозана» (13-17 октября, Ставрополь, 2008 г.);

Международной научно-практической конференции «Инновация в аграрном секторе Казахстана, посвящённая 75-летию академика К.С. Саб-денова» (15-16 ноября, Казахстан, Алматы, 2008 г.);

Юбилейной Международной 2-ой научно-практической конференции, посвященной 40-летию образования СКНИИЖ «Научные основы повышения продуктивности сельскохозяйственных животных» (23-24 марта, Краснодар, 2009 г.).

Результаты работы представлены на 3 международных выставках: Международной выставке-конгрессе Высокие технологии. Инновации. Инвестиции (22-25 сентября, Санкт- Петербург, 2008 г.);

2-й Биотехнологической выставке-ярмарке «РосБиоТех-2008» (5-7 ноября, Москва, 2008 г.);

Международном салоне инноваций и инвестиций (26-28 августа, ВВЦ Москва, 2009 г.).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 8 работ, включая 1 патент на изобретение и 1 статью в журнале, рекомендованном ВАК РФ.

Объем и структура работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, 2 глав собственных исследований, выводов, предложений производству, списка использованных литературных источников, приложений. Работа изложена на 167 страницах, содержит 21 рисунок, 29 таблиц. Библиографический список состоит из 139 наименований, в том числе 16 зарубежных.

Заключение Диссертация по теме "Биотехнология (в том числе бионанотехнологии)", Погарская, Наталья Владимировна

ВЫВОДЫ

1. Разработана рациональная, экологически безопасная технология получения хитозан-меланинового комплекса и меланина из подмора пчел, обеспечивающая выход хитозана 20,0-22,4% от исходного сырья, имеющего степень дезацетилирования 82-89%; выход меланина - 6,4% с количеством активных парамагнитных центров Г1017спин на 1 г сухого вещества.

3. Токсикологические исследования позволили отнести хитозан-меланиновый комплекс к малотоксичным веществам и по ГОСТ 12.1.00776 к 4 классу веществ по степени опасности и токсичности, соответствующему требованиям безопасности к кормовым добавкам. Микробиологические исследования не выявили присутствия в ХМК и меланине патогенной микрофлоры.

4. Установлено, что применение ХМК при выпойке их телятам приводит к значительному снижению количества бактерий рода Е. coli, Proteus, Citrobacter соответственно на 68,9; 40,0 и 37,9%, что обосновывает целесообразность его использования для профилактики заболеваний желудочно-кишечного тракта молодняка крупного рогатого скота.

6. Установлено, что применение ХМК оказывало положительное влияние на гематологические показатели крови и уровень естественной резистентности молодняка с.-х. животных. Выявлено достоверное повышение на 10,5-27,9 % общего белка сыворотки крови, 11,4-12,1% гемоглобина, 6,7-13,8% лизоцимной, 16,3-35,4% бактерицидной и 56,3% фагоцитарной активности.

8. Применение ХМК и ЭП для выпойки молодняка с.-х. животных является экономически обоснованным. Дополнительная прибыль составля-ет:365,60 и 518,04 руб. на одного поросёнка при выпаивании ХМК и ЭП соответственно в новорождённом возрасте; 432,63 руб. — при отъёме; 197,12 руб.;124,0 и 222,4 руб. на одного козлёнка при выпаивании ХМК и ЭП и 261,58 руб. на одного телёнка в новорожденном возрасте соответственно.

ПРЕДЛОЖЕНИЯ ПРОИЗВОДСТВУ

1. Научно-производственным лабораториям, малым предприятиям биологической промышленности использовать разработанные технологию получения хитозан-меланинового комплекса и меланина из подмора пчел и научно-техническую документацию.

2. Для профилактики желудочно-кишечных заболеваний, повышения естественной резистентности, сохранности и живой массы молодняка с.-х. животных проводить выпойку новорождённым животным и в период отъема хитозан-меланиновым комплексом дозе 15 мг на 1 кг живой массы 2 раза в сутки в течение 10 дней.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Важнейшим направлением поиска в разработке новых препаратов в ветеринарии является разработка методов воздействия на организм животных для их лечения и профилактики заболеваний мягкими и одновременно действенными методами, которые дают возможность исключить применение химических препаратов, имеющих многочисленные побочные эффекты. Всё больший интерес в этом качестве привлекают биологически активные вещества, и среди них хитин и его производное хитозан. Эти природные полимеры относятся к полисахаридам и обладают иммуностимулирующими противоопухолевыми свойствами, оказывают бактериостатиче-ское, ранозаживляющее действие, не загрязняют окружающую среду.

В основном современные исследования в области хитина и хитозана направлены на изучение свойств и способов получения этих полимеров из панцирей различных видов крабовых и ракообразных.

Учитывая снижение в России общего объёма добычи данных ресурсов, сосредоточение их в основном на Дальнем Востоке, а также в силу некоторых особенностей такого сырья активно ведутся поиски новых источников получения хитина и хитозана. Одним из перспективных сырьевых поставщиков может стать медоносная пчела, которая в результате своего быстрого воспроизводства может обеспечить большую биомассу хитинсо-держащего сырья. Юг России является традиционной зоной пчеловодства. В данном регионе имеется достаточная сырьевая база для переработки (только в Ставропольском крае она составляет потенциально 2-3 тонны в год) и получения комплекса. Кроме того, пчелиный подмор, используемый в качестве сырья, содержит в себе уникальное сочетание биологически активных веществ - хитина и меланина.

Из всех природных пигментов меланины, по мнению исследователей, являются наиболее трудными для изучения. Тем не менее, доказано, что меланины оказывают неспецифическое воздействие на организм, обладают свойствами антиоксиданта, генопротектора, антимутагена, способностью сорбировать тяжёлые металлы. Обладая свойствами стабильных свободных радикалов, они являются модуляторами систем клеточного метаболизма, таких как фото- и радиопротекция, нейтрализуя продукты пере-кисного окисления липидов.

Анализ проведённых ранее исследований позволяет заключить, что при производстве хитина и хитозана из пчелиного подмора эффективность извлечения их может быть значительно повышена, а технология получения усовершенствована за счёт дополнительного высушивания и достаточного измельчения исходного сырья, а также за счёт сокращения количества стадий, необходимых для проведения технологического процесса.

Целью настоящей работы явилась разработка технологии получения хитозан-меланинового комплекса и меланина из побочного продукта пчеловодства - подмора пчел с последующей разработкой на их основе нового биологически активного препарата для профилактики заболеваний и дисфункций желудочно-кишечного тракта молодняка сельскохозяйственных животных.

Учитывая недостатки существующих технологий, нами предложена рациональная экологически безопасная технология, позволяющая повысить выход хитозан-меланинового комплекса до 22,4%, имеющего степень дезацетилирования 82-89% и получить выход меланина - 6,4%. При разработке технологии для установления оптимальных условий проведения реакций депротеинирования и дезацетилирования проводилось варьирование концентрационных, температурных, временных, жидкостномодульных параметров. Учитывалась рациональность использования общепринятых приемов и стадий технологического процесса получения хитозана из хи-тинсодержащего сырья. В результате исследований найдены условия максимального сохранения и извлечения меланина, растворённого в щелочной среде, в которой проводились реакции.

Основными отличительными признаками в разработанной технологии являются: сушка пчелиного подмора до состояния крошимости; более тонкое его измельчение, обеспечивающее увеличение активной поверхности; проведение реакций депротеинирования и дезацетилирования последовательно в одном сосуде, при неполном разделении стадий и выполнении выбранных оптимальных параметров проведения реакции; извлечение максимально возможного количества сопутствующего биологически активного вещества - меланина из всего использованного гидролизата таким образом, что отходы производства становятся экологически безвредными.

Интерпретация ИК-спектров экспериментальных образцов хитозан-меланинового комплекса и выделенных меланинов подтвердила их групповую принадлежность к полимерам - хитозану и меланинам животного происхождения. Данные ИК-спектроскопии могут быть использованы для подтверждения подлинности препарата. Присутствие в структуре меланина неспаренных электронов, подтверждающее его биологическую активность, было доказано с помощью спектроскопии электронного парамагнитного резонанса.

С целью обоснования возможности и эффективности использования ХМК в качестве основы ветеринарных препаратов для профилактики и лечения дисбактериозов молодняка с.-х. животных были проведены микробиологические исследования и определение острой токсичности. Действие комплекса основано на способности обволакивать стенки желудка и кишечника, препятствуя тем самым воздействию болезнетворных микроорганизмов. Установлено, что хитозан-меланиновый комплекс из подмора пчёл относится к 4 классу веществ по степени опасности и токсичности и может быть использован при выращивании молодняка с.-х. животных как основа препаратов для лечения и профилактики желудочно-кишечных заболеваний различной этиологии, для поддержания необходимого положительного бактериального баланса кишечника молодняка, снижения количества условно-патогенной микрофлоры желудочно-кишечного тракта и повышения общей резистентности организма. Микробиологическими тестами не выявлено контаминации комплекса патогенной микрофлорой.

В связи с имеющимися выраженными свойствами биологической активности и, опираясь на обнаруженный исследователями синергетический эффект, проявляющийся в более ярком терапевтическом воздействии хитозана в присутствии сухих экстрактов фитосборов, была разработана рецептура экспериментального комплексного препарата с использованием экстрактов фитосборов, применимого для молодняка с.-х. животных.

Эффективность применения хитозан-меланинового комплекса и экспериментального препарата на его основе была подтверждена в серии опытов на телятах, поросятах, козлятах. Применение ХМК приводило к снижению в кишечнике условно-патогенной микрофлоры, а именно микроорганизмов рода Е. Coli, Proteus, Citrobacter на 18-34%. Показателями неспецифической резистентности животных, определяемыми гематологическими и биохимическими исследованиями, обнаружилось, что при применении ХМК и ЭП происходило уменьшение содержания лейкоцитов, при одновременном повышении концентрации гемоглобина и общего белка в крови животных. Гуморальное звено иммунной системы отреагировало увеличением показателей лизоцимной и бактерицидной и фагоцитарной активности и одновременным снижением в крови животных опытных групп циркулирующих иммунных комплексов. При этом профилактическая эффективность применения препаратов составила от 12 до 30% в разных группах. Помимо этого наблюдалось повышение сохранности животных, выпойка ХМК и ЭП стимулировала увеличение живой массы и среднесуточных привесов в ранний период онтогенеза. Таким образом, обобщая данные проведенных исследований можно сделать заключение о том, что использование ХМК способствует нормализации желудочно-кишечной микрофлоры, активизации иммунных реакций, повышению защитных свойств организма, что оказывает благоприятное влияние на рост и развитие молодняка.

Расчет экономической эффективности показывают, что применение ХМК и ЭП, рекомендуемых нами для профилактики расстройств желудочно-кишечного тракта различной этиологии у молодняка с.-х. животных, возникающих в процессе их выращивания, экономически обосновано и составляет рассчитанную в работе дополнительную прибыль и обеспечивает: лучшую сохранность молодняка; увеличение энергии роста, оцениваемой по динамике изменения живой массы; увеличение дохода предприятия за счет повышения эффективности выращивания молодняка. При этом важно учитывать отсутствие расходов на лечение животных синтетическими препаратами (антибиотики, сульфаниламиды и т.д.) и, в связи с этим, повышение биогенной полноценности и биологической безопасности животноводческой продукции.

Дальнейшие исследования применения ХМК и ЭП на животных, установление величины и механизмов синергетического воздействия при комплексном применении ХМК будут иметь важное научное и практическое значение в медико-биологических исследованиях и ветеринарии.

138

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Погарская, Наталья Владимировна, Ставрополь

1. Арепьев, В.В. Использование биологически активных веществ (полизин, хитозан) в собаководстве / В.В. Арепьев, В.В. Баньковский, Л.Б. Мельникова // Доклады Российской академии сельскохозяйственных наук. 2002. - № 6. - С. 197-200.

2. Бакунин, В.А. Комплексный доклад о состоянии природной среды Челябинской области в 1966г. / В.А. Бакунин // Челябинск. 1997. - 95с.

3. Балткайс, Я.Я. Взаимодействие лекарственных веществ (фармако-терапевтические аспекты) / Я.Я. Балткайс, В.А. Фатеев // М.: Медицина. -1991.-304 с.

4. Белами Л. Инфракрасные спектры сложных молекул / Л. Белами. // М.: Наука. 1963. - 234с.

5. Берёзин, И.В. Иммобилизированные ферменты / И.В.Берёзин, Н.Л. Клячко, А.В. Левашов // Биотехнология в 8-ми томах, под ред. Н.С. Егорова; кн. 7. Москва. Высшая школа. 1987. - 159с.

6. Березов, Т.Т. Биологическая химия: / Т.Т. Березов, Б.Ф. Коровкин // Учебник под ред. акад. АМН СССР С.С. Дебова.2-е издание, перераб. и доп. М.: Медицина. 1990. - 528с.

7. Богословская, О.А. Сравнительное исследование ранозаживляю-щего действия веществ различной природы / О.А. Богословская, Т.А. Ло-баева, Т.А. Байтукалов // Естественные и технические науки. — 2007. — № 6 (32).-С. 91-99.

8. Большаков, И.Н. Связывание бактериального липополисахарида хитозаном в эксперименте / И.Н. Большаков, С.М. Насибов // Новые перспективы в исследовании хитина и хитозана: Матер. 5-й Междунар. конф. М.: Изд. ВНИРО. 1999. - С. 120-122.

9. Борщевская, М.И. Развитие представлений о биохимии и фармакологии меланиновых пигментов / Борщевская М.И., Васильева С.М. // Вопросы медицинской химии. 1999. - №1. — С. 24-35.

10. Бриттон, Т. Биохимия природных пигментов / Т. Бриттон // М.: Мир. 1986.-422с.

11. Быкова, В.М. Некоторые аспекты использования хитина и хитозана в качестве флокулянтов / В.М. Быкова, Е.А. Ежова, С.В. Немцев // Аграрная Россия. 2004. - № 5. - С. 30-31.

12. Васнев, В.А. Название / В.А. Васнев, А.И. Тарасов, Г.Д. Маркова // Высокомолекулярные соединения. 2003. - Т. 45 Б. - № 10. - С. 1791

13. Веротченко, М.А. Биопереработка свиного навоза основа получения хитина и хитозана / М.А. Веротченко, А.П. Терещенко, Ф.И. Злочев-ский // Аграрная Россия. - 2000. - № 5. - С. 57-59.

14. Ветеринарная рецептура с основами терапии и профилактики: // Справочник. Под. ред. И.Е. Мозгова. М.: Агропромиздат. 1988. - 384с.

15. Ветеринарная токсикология с основами экологии // Под ред М.Н. Аргунова. Изд. Лань. 2007. - С.-Петербург - Москва. - 415 с.

16. Виноградов, А.Ю. Биотехнология пигмента меланина / А.Ю. Виноградов, З.Н. Сидоренко // Московский международный конгресс. Биотехнология: состояние и перспективы развития. Москва. 2004. - С. 96.

17. Влияние скармливания хитозана и фитохитодеза на резистентность организма телят / А.И. Албулов, Е.В. Крапивина, К.В. Борода, И.В. Кривопушкина, Ю.Л. Талызина // Достижения науки и техники АПК. -2004.-№3.-С. 24-27.

18. Влияние хитозана на иммунную и эндокринную системы поросят / А.А. Буянов, В.Н. Видении, А.Н. Гречухин, В.Д. Нифантов // Ветеринария. 2004. - №2. - С. 47-51.

19. Гамзазаде, А.И. Некоторые особенности получения хитозана / А.И. Гамзазаде, С.М. Насибов, О.В. Лукин // Материалы Восьмой Международной конференции «Современные перспективы в исследовании хитозана». 2006. - М. - С. 175-179.

20. Гиттис, А.И. Практикум по органической химии. Органический синтез / С.С. Гитис А.И. Глаз, А.В. Иванов // М. Высшая школа. 1991. -302с.

21. Государственная Фармакопея СССР // XI изд. Вып. 1. - М.: изд.

22. МЗ СССР. 1987. - С. 254-272.

23. Государственная Фармакопея СССР // XI изд. Вып. 2. М.: изд. МЗ СССР. - 1987. - С. 135-164.

24. Данилов, С.Н. Изучение хитина. I. Действие на хитин кислот и щелочей / С.Н. Данилов, Е.А. Плиско, Б.П. Белоусов // Журнал общей химии. 1954. - Т. 24. - С. 1761-1769.

25. Дружинина, М.Ю. Фотозащитное действие меланина микробиологического происхождения / М.Ю. Дружинина, Г.Г Пухова, Н.М. Жданова // Украинский Биохимический Журнал. 1994. - № 3. - С.271-273.

26. Завгородняя, Ю.А. Характеристика свойств грибных меланинов / Ю.А. Завгородняя, А.В. Дёмин, А.В. Куронов // Вестник Московского Унта. 2001.-№ 3. - С. 39-43.

27. Зайцев, Т.Н. Математический анализ биологических данных / Т.Н. Зайцев // М.: Наука. 1991. - 184 с.

28. Ильин, Е.М. Лечебно-профилактические свойства низкомолекулярного хитозана при экспериментальном лучевом поражении / Е.М. Ильин, И.Е. Андрианова // Радиационная биология и Радиоэкология. 2004. -Т. 44.-№5.-С. 547-549.

29. Ильина, А.В. Деполимеризация высокомолекулярного хитозана ферментным препаратом Целловиридин Г20х / А.В. Ильина, Ю.В. Ткачева, В.П. Варламов // Прикладная биохимия и микробиология. — 2002. Т. 38. -№2.-С. 132-135.

30. Ильина, А.В. Характеристика и антибактериальная активность низкомолекулярного хитозана, полученного с помощью целлюлазы и хи-тиназы / А.В. Ильина, В.П. Варламов, А.П. Мелентьев // Прикладная биохимия и микробиология. 2001. - Т. 37. - № 2. - С. 160-163.

31. Ильина, А.В. Полиэлектролитные комплексы на основе хитозана (обзор) / А.В. Ильина, В.П. Варламов // Прикладная биохимия и микробиология. 2005. - Т. 41. - № 4. - С. 9-16.

32. Ильина, А.В. Энзимология синтеза и деградации хитина и хитозана / А.В. Ильина, В.П. Варламов // В книге: Хитин и хитозан. Под ред. К.Г. Скрябина, Г.А. Вихоревой, В.П. Варламова М.: Наука. 2002. - С. 79-90.

33. Ильина, А.В. Гидролиз хитозана в молочной кислоте / А.В. Ильина, В.П. Варламов // Прикладная биохимия и микробиология. — 2004. Т. 40. -№ 3. - С. 354-358.

34. Иммунологические методы / Под ред. Г. Фримеля // М.: Медицина,- 1987.-С. 118-119.

35. Кольман, Я. Наглядная биохимия / Я. Кольман, К.-Г. Рем. М: «Мир». 2000. - С. 46, 222.

36. Комаров Б.А. Почему хитозан полезен человеку? Новые достижения в исследовании хитина и хитозана / Б.А. Комаров // Материалы 6-й Международной конференции по хитозану. М.: Изд-во ВНИРО. 2003. -С. 187-195.

37. Кондрахин И.П. Методы ветеринарной клинической лабораторной диагностики: Справочник / И.П. Кондрахин, А.В. Архипов, В.И. Левченко и др. // М.: Колос. 2004. - С. 50-56.

38. Концепция-прогноз развития животноводства в России до 2010 года // М.: Россельхозакадемия. 2001. - С. 48-62.

39. Крапивина, Е.В. Влияние биологически активных препаратов на резистентность просят / Е.В. Крапивина // Ветеринария. — 2001. № 6. — С. 38-43.

40. Кретович, В.Л. Биохимия растений. / В.Л. Кретович // М.: Высшая Школа. 1986. - 517 с.

41. Кривцов, Н.И. Пчеловодство / Н.И. Кривцов, В.И. Лебедев, Г.М. Туников // М.: Колос. 1999. - С. 16-17.

42. Кунижев, С.М. Катализ в биотехнологии, химии и химических технологиях / С.М. Кунижев, С.Ф. Аполохова // Тезисный доклад Всероссийской конференции. Тверь. 2000. - С. 14-16.

43. Ларская, М.В. Название / М.В. Ларская // Материалы научной конференции «Фитотерапия, лазеротерапия, БАВЕГТ в 21 веке» (5 и 6 декабря 2000 г. Черноголовка). Изд-во РИО ИПХФ РАН. С. 84.

44. Лебедев, П.Т. Методы исследования кормов, органов и тканей животных. / П.Т. Лебедев, А.Т. Усович // М. Россельхозиздат. — 1976. — 389 с.

45. Лях, С.П. Микробный меланиногенез и его функции / С.П. Лях //1. М.: Наука.- 1981.-274 с.

46. Меланин из пчёл и чёрного чая / Кириленко Ю.К., Черкасова Е.И., Алексеева М.Ф., Кузнецова М.В. // Биоорганическая химия. 2008. - Т. 34. -№ 3. - С. 371-375.

47. Методические рекомендации по определению естественной резистентности организма овец // Ставрополь: ВНИИОК. 1987. - 69 с.

48. Немцев, С.В. Научное обоснование комплексной технологии хитина, хитозана из панциря промысловых ракообразных и продукции на их основе. С.В. Немцев // Автореф. . дис. доктора техн. наук. М. 2006. — 43 с.

49. Новиков, В.Ю. Деполимеризация хитозана под действием ферментов гепатопанкреаса камчатского краба Paralithodes camtshaticus / В.Ю. Новиков, В.А. Мухин // Прикладная биохимия и микробиология. 2002. -Т. 38.-№6.-С. 733-738.

50. Нудьга, Л. А. N-алкилирование хитозана / Л. А. Нудьга, Е. А. Плиско, С. Н. Данилов // Журнал общей химии. 1973. - Том XLIII. - С. 2756-2760.

51. Общая теория статистики / Учебное пособие под ред. А. А. Спирина, О.Э. Башиной // М.: «Финансы и статистка». 1998. - С. 124-139.

52. Определение качества кормов при их промышленном приготовлении / Методические рекомендации // Ставрополь: ВНИОК. 1989. - С. 17-23.

53. Отчёт о научно-исследовательской работе лаборатории биологически активных веществ отдела биотехнологии ГНУ СНИИЖК // Ставрополь. СНИИЖК. 2008. - 25 с.

54. Пат. 2067588 Российская Федерация МПК7 кл.С1. 6 С08В37/08 Способ получения хитозана / изобретатель, заявитель и патентообладатель Б.А. Кузин, К.К. Бабиевский, Г.К. Прохоренкова, А.Б. Кузин. № 5002906/04; заявл. 17.09.91; опубл. 10.10.96.

55. Пат. 2263681 Российская Федерация Способ получения водорастворимых производных хитозана / изобретатель А.Б. Шиповская, В.И. Фомина, Н.А. Солонина от 10.11.2005 г.

56. Пат. 200605 Российская Федерация, МПК , Способ получения низкомолекулярного хитозана для противолучевых препаратов / изобретатель В.П. Варламов, А.А. Ильина, Г.Е. Банникова и др. Опубл. 20.02.06 г.

57. Патент 2139887 Российская Федерация МПК7 кл. С1, 6 С08В37/08 Способ получения хитина и способ получения хитозана / изобретатель, заявитель и патентообладатель С.И. Шиш, Г.В. Винокурова. № 99104475/04; заявл. 15.03.99; опубл. 20.10.99.

58. Патент 2259783 Российская Федерация, МПК Способ получения смеси глюкозамина, олитгосахаридов хитозана и низкомолекулярного хитозана / изобретатель Ю.К. Кириленко, В.Г. Фролов, Р.А. Нагапетян; опубл. 10.09.2005г.

59. Пат. 2165253 С2 Российская Федерация, МПК7. Способ получения фитохитодезов / Трескунов К.А., Комаров Б.А. Опубл. 14.06.2001.

60. Патент 2073016. Российская Федерация, МПК7. Спопоб получения хитозана. Опубл.27.07.2006 г.

61. Первая пчеловодческая компания «Тенториум»: http://www.apma-vrn.ru/stat.htm (дата обращения: 18.07.2007).

62. Погарская, Н.В. Получение хитозан-меланинового комплекса из подмора пчел и определение его физико-химических и биологических характеристик / Н.В. Погарская, М.И. Селионова, В.В. Бинатова // Веткорм. -2008.-№6.-С. 28-29.

63. Получение и исследование биодеградируемости хитозановых пленок / Г.А. Вихорева, Н.Р. Кильдеева, М.Ю. Устинов, Ю.Н. Ночевкин // Химические волокна. 2003. - № 6. - С. 18-23.

64. Получение хитина и хитозана из медоносных пчёл / С.В. Немцев, О.Ю. Зуева, М.Р. Хисматуллин, А.И. Албулов, В.П. Варламов // Прикладная биохимия и микробиология. 2004. Т. 40. - № 1. - С. 46-50.

65. Природный полимер для формирования наночастиц / А.В. Ильина, В.П. Варламов, Ю.А. Ермаков и др. // Доклады академии наук. 2008. -Т. 421.-№2.-С. 199-201.

66. Пчела, как потенциальный источник хитозана / С.В. Немцев, О.Ю. Зуева, Р.Г. Хисматуллин, В.П. Варламов // Москва. Материалы 6 Международной конференции (Щелково, Московской обл. 22-24 окт. 2001г.). Центр «Биоинженерия» РАН. С. 198-202.

67. Рабинович, М.И. Ветеринарная фитотерапия / М.И. Рабинович // Изд. 2-е, доп. и перераб. М.: Росагропромиздат. 1988. - 174 с.

68. Раевских, В.М. Разработка химических основ рационального использования отходов культивирования гриба вешенка обыкновенная: Ав-тореф. дис. . канд. биол. наук: 03.00.16 / Алт. гос. ун-т. Барнаул. — 2002. -16 с.

69. Различные виды хитозана для ветеринарии и животноводства /

70. A.И. Албулов, А.Я. Самуйленко, С.М. Шинкарёв, М.А. Фролова // Аграрная Россия. 2004. - № 5. - С. 8 - 12.

71. Редиар — реальная альтернатива антибиотикам при лечении диарей молодняка животных // Зооиндустрия, Всероссийский информационно-рекламный бюллетень. — 2006. № 1. - С. 14-15.

72. Резистентность и интенсивность роста телят под влиянием хитозана / Ю.П. Фомичёв, Р.Г. Шайдуллина, Ю.Н. Фёдоров, Е.Н. Стрекозова,

73. B.А. Заболоцкий // Сельскохозяйственная биология. 2004. - № 2. - С. 8994.

74. Рогожкин, И.В. Структурообразование и растворимость высокомолекулярных хитина и хитозана / И.В. Рогожкин // Высокомолекулярные соединения. 1995. - Том (А) XXVI. - С. 6.

75. Российское хитиновое общество http://www.chitin.ru/history.htm (дата обращения: 18.07.2007).

76. Самохин, В.Т. Незаразные болезни животных проблема государственной важности // Ветеринария. — 1994. — №7. — С. 3-4.

77. Самохин, В.Т. Стратегия борьбы с незаразными болезнями животных / В.Т. Самохин, А.Г.Шахов, В.А. Антипов // Стратегия развития животноводства в России XXI века. М.: РАСХН. 2001. - Ч. 1. - С. 408413.

78. Сапего, В.И. Биологически активные вещества и естественная резистентность телят / В.И. Сапего, Е.В. Берник // Ветеринария. 2002. - № 5.-С. 44-46.

79. Селионова, М.И. Способ получения хитозан-меланинового комплекса из подмора пчёл / М.И. Селионова, Н.В. Погарская // Заявка на изобретение № 2008129931/04(037139). Дата подачи заявки 21.07.2008. Решение о выдаче патента на изобретение от 09.09.2009.

80. Сидоров, К.К. О классификации токсичности ядов при парентеральных способах введения. / К.К. Сидоров // Токсикология новых промышленных веществ. М.: Медицина. 1973. - 475 с.

81. Скорбина, Е.А. Разработка технологии получения и исследование биологической активности меланинсодержащих препаратов / Е.А. Скорбина // Дисс. . канд. биол. наук // Ставророль. СтГАУ. - 2005. - 139 с.

82. Спектрально-люминисцентные свойства плёнок меланина / В.П. Грищук, С.А. Давиденко, И.Д. Жолнер, А.Б. Вербицкий, М.В. Курик // Письма в ЖТФ. 2002. - Т.28. - Вып. 21. - С. 36-40.

83. Стрекозова, Е.Н. Теория и практика кормления / Е.Н. Стрекозова // Зоотехния. 2003. - № 6- С. 15.

84. Таирова, А.Р. Иммунобиохимический статус крупного рогатого скота в экологически неблагоприятном регионе Южного Урала и пути его коррекции / А.Р. Таирова // Автореф. дисс. . докт. биол. наук. Казань. -2001.-43 с.

85. Таирова, А.Р. Иммунологические свойства хитинового препарата / А.Р. Таирова, В.А. Молоканов // Ветеринария- 2002. № 1. - С. 45 - 48.

86. Таирова, А.Р. Использование хитозана для коррекции уровня тяжёлых металлов в продуктах убоя скота. / А.Р. Таирова. // Зоотехния. —2001.-№9. С. 27-29.

87. Технология лекарственных форм / Учебник в 2-х томах, под ред. Т.С. Кондратьевой // М.:Медицина. 1991. - Т. 1. - С. 443-473.

88. Технология лекарственных форм: Учебник в 2-х томах. / Под ред. Т.С. Кондратьевой // М.: Медицина. Т. 2. - 1991. - С. 92-134.

89. Технология получения хитина/хитозана из сушеного рачка гамма-руса с применением автоферментолиза / О.Я. Мезенова, А.С. Лысова, Е.В. Григорьева, С.М. Вильт // Известия Калининградского ГТУ. 2004. - №5.- С. 24-28.

90. Тихонов, В.Е. Определение терминов в области хитина и хитозана / В.Е. Тихонов // Материалы IX Междунар. конф. «Современные перспективы в исследовании хитина и хитозана» (Ставрополь, 13-17 окт. 2008 г.).- М.: Изд-во ВНИРО. 2008. С. - 42-47.

91. Топурия, Л.Ю. Применение хитозана для лечения эндометрита у коров / Л.Ю. Топурия // Молочное и мясное скотоводство. — 2006. — № 3. -С. 26-27.

92. Топурия, Л.Ю. Применение хитозана при диспепсии телят / Л.Ю. Топурия // Молочное и мясное скотоводство. — 2005. № 5. — С. 37-38.

93. Ульяничев, Е.М. Проблемы отрасли / Е.М. Ульяничев, Н.И. Кривцов // Пчеловодство. 2001. - № 1. - С. 3-5.

94. Урьяш, В.Ф. Химическая термодинамика биологически активных веществ и процессов с их участием / В.Ф. Урьяш // 2005. Дисс. . докт. хим. наук: Н. Новгород. НИИ химии НГУ им. Лобачевского.

95. Ш.Утеушев, P.P. Разработка технологии комплексной переработки панцирьсодержащего сырья из ракообразных Волго-Каспийского региона / P.P. Утеушев // 2006. Дисс. . канд. техн. наук. Москва. Астраханский государственный технический университет 147с.

96. Фармакология / В.Д. Соколов, М.И. Рабинович, Г.И. Горшков и др.; // Под ред. В.Д. Соколова. Изд. 2-е, испр. и доп. М.: Колос. 2000. -576 с.

97. Филимонова, И. Хитозан в кормлении несушек / И. Филимонова, Л. Попова, Р. Еригина // Птицеводство. № 3. - 2007. - С. 10-11.

98. Фомичёв, Ю.П. Влияние хитозана на выведение радионуклидов из организма телят / Ю.П. Фомичёв, Ю.Н. Пучков // Материалы 6-й Международной конференции «Новые достижения в исследовании хитина и хитозана». -М.- 2001. -С. 375-376.

99. Фомичёв, Ю.П. Сорбционно-детоксикоционные технологии в животноводстве и ветеринарной медицине / Ю.П. Фомичёв // Аграрная Россия. 2004.-№ 5. - С. 3-7.

100. Фомичёв, Ю.П., Толерантность тест-культур и кишечной микрофлоры животных и влияние хитозана на их устойчивость к кадмию / Ю.П. Фомичёв, Р.Г. Шайдуллина, О.А. Артемьева // Аграрная Россия. 2005. -№ 2. - С.181-187.

101. Физико-химические свойства хитин-меланинового и мелано-протеинового комплексов из подмора пчёл / В.П. Курченко, Т.А. Кукулян-ская, И.И. Азарко, О.Ю. Зуева и др.// Прикладная биохимия и микробиология. 2006. - Т. 42. - № 3. - С. 374-378.

102. Хитин и его производные контролируемой структуры / В.И. Горбач, Е.Л. Бердышев, Т.А. Кузнецова, И.А. Иванушко // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. Т. 137. - № 4. - С. 430-433.

103. Чернов, Г.А. Противолучевой эффект ионогенных полимеров / Г.А. Чернов, В.П. Евдаков, В.А. Кабанов // Бюллетень Радиационной Медицины. 1975. -№ 3. - С. 3-10.

104. Чирков, С.Н. Противовирусная активность хитозана / С.Н. Чирков // Прикладная биохимия и микробиология. 2002. — Т. 38. - № 1. - С. 5-13.

105. Чирков, С.Н. Противовирусные свойства хитозана / С.Н. Чирков // В книге: Хитин и хитозан. Под ред. Скрябина К. Г., Вихоревой Г.А., Варламова В.П. М.: Наука. 2002. - С. 327-338.

106. Экспериментальные методы химии высоких энегрий / под ред. проф. М.Я. Мельникова // Москва. Изд. Московского университета. 2009. -С. 112.

107. Эффективность применения энтеросорбентов при выращивании молодняка крупного рогатого скота в техногенных зонах России / Ю.П. Фомичёв, И.М. Донник, Ю.Н. Фёдоров Н.И. Стрекозов // Аграрная Россия. -2004.-№5.-С. 12-17.

108. Anthonsen, M.W. Solutions properties of chitosans: Conformation and chain stiffness of chitosan with different degrees of N — acetilation / M.W. Anthonsen, K.M. Verum, O. Stadstrwod // Carbohydrate Polymers. 1993. - V. 22.-P. 193-201.

109. Bull, A.T. Non-specific depolymerisatioh of chitosan by pronase and characterization of the result products / A.T. Bull // Arch. Biochemistry and Biophysics. 1970. - № 2. - P. 345.

110. Graziella Biagini. Wound management with N-carboxybutil chitosan / Graziella Biagini, Aldo Bertani e.t.c // Biomaterials. 1991. - Vol. - 12. April. -P. 281-285.

111. Isolation and characterization of chitin from bumblebee (Bombus tere-stris) / J. Majtan, R. Bilikova, J. Markovic, J. Grof // International Journal of Biological Macromolecules. 2007. - T. 40. - P. 237-241.

112. Lano, T.G. Free Radical / T.G. Lano, M. Rozanowska, T. Sarna // Biology & Medicine. 1999. - Vol. 26. - № 5/6. - P. 518-525.

113. Jia Zhichen, Synthesis and antibacterial Российская Федерация s of quaternary ammonium salt of chitosan / Zhichen Jia, Dondfeng shen, Weiliang Xu // Carbohydrate research. 2001. - P. 1-6.

114. Jolles, P. Chitin and Chitinases / P. Jolles and R.A. Muzzarelli // Edited by Birkhauser Verlag, ISBN 3764358157. 1999. - 276 p.

115. Lambert, C. Activity of biological polymers / C. Lambert, S.R. Sinclair, E.J. Land // Photochemical biochemistry. Photobiology. 1984. - №1. -P. 5-10.

116. Muzzarelli, R.A. Chitin / R.A. Muzzarelli // Oxford: Pergamon Press. 1977.-305 p.

117. Rinaudo, M. Characterisation of chitozan / M. Rinaudo, M. Milas, Le Dung P. Int // Jornal of Bio Macromoleculs. V. 15. - № 5. p. 281-285.

118. Schorigin, P.P. Uber die Acetylierung des Chitins / P.P. Schorigin, N.N. Makarova-Semljanskaja // Berichte. 1935. - V. 68. - P. 969-971.

119. Stepien, K. F A review of chitin and chitosan application / K. Stepien // Acta Polon Pharm. 1988. - № 5. - P. 435-440.

120. Zhichen, Jia Investigation of the structure formation of chitosan in solution by electron microscopie / Carbohydrate research. — 2001. — P. 16.

121. Jastrzebska M. Biocemistry and biology of melanins / M. Jastrzebska A. Kocot, J.K. Vijber // Journal of Photochemistry and Photobiology. 2002. -T. 66.-P. 201-206.

122. Hill, H. // Bio Essays. 1992. - V. 14. - № 1. - P. 49-56.

Информация о работе

Погарская, Наталья Владимировна
кандидата биологических наук
Ставрополь, 2010
ВАК 03.01.06

Диссертация

Разработка технологии получения хитозан-меланинового комплекса из подмора пчел и его применение для молодняка сельскохозяйственных животных - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы