Технология переработки восковой моли, изучение противотуберкулезных свойств хитозана и взаимодействия с липолитическими ферментами

Останина, Екатерина Сергеевна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Технология переработки восковой моли, изучение противотуберкулезных свойств хитозана и взаимодействия с липолитическими ферментами
ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "Технология переработки восковой моли, изучение противотуберкулезных свойств хитозана и взаимодействия с липолитическими ферментами"

На правах рукописи

ОСТАНИНА ЕКАТЕРИНА СЕРГЕЕВНА

ТЕХНОЛОГИЯ ПЕРЕРАБОТКИ ВОСКОВОЙ МОЛИ, ИЗУЧЕНИЕ

ПРОТИВОТУБЕРКУЛЕЗНЫХ СВОЙСТВ ХИТОЗАНА И ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ С ЛИПОЛИТИЧЕСКИМИ ФЕРМЕНТАМИ

Специальность 03 00 23 - биотехнология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

ооз

Щелково-2007

003161954

Работа выполнена в Центре «Биоинженерия» Российской Академии Наук Научный руководитель:

доктор химических наук, профессор Валерий Петрович Варламов

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор Галина Ивановна Воробьёва доктор биологических наук Наталия Ивановна Васюкова

Ведущая организация: Всероссийский научно-исследовательский

институт рыбного хозяйства и океанографии

Защита диссертации состоится «9» ноября 2007 г в 10 часов на заседании диссертационного совета Д 006 069 01 во Всероссийском научно-исследовательском и технологическом институте биологической промышленности РАСХН по адресу 141142, Московская область, г Щелково, пос Биокомбинат, ВНИТИБП

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ВНИТИБП РАСХН Автореферат разослан «8» октября 2007 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук

Ю Д. Фролов

1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы Одним из важнейших достижений мирового биотехнологического прогресса в области изыскания новых перспективных веществ за последние годы стало получение, изучение и внедрение в практику биополимеров хитина, хитозана и их производных [Muzzarelli R А , Peter M , Varum К M, Domard A., Албулов A И., Вихорева Г А., Нудьга Л А и др ] Расширение областей применения данных биополимеров обуславливает поиск новых перспективных источников хитина и хитозана Как известно, в покровах насекомых до 50% занимает полимер хитин, наряду с белками придающий прочность экзоскелету Таким образом, кутикулу насекомых, в том числе, и кутикулу личинок восковой моли Gallería melloneïla L в большом количестве паразитирующих в пчелиных ульях, можно рассматривать как источник различных биологически активных веществ Особый интерес представляет ферментный комплекс восковой моли для борьбы с туберкулезом [Мечников И И, Метальников С И, Mankiewicz Е, Wlodawer Р , Анненков ГА]

Принимая во внимание уникальные свойства хитина и хитозана, в последние годы значительно возрос интерес к изучению и практическому применению этих природных полимеров во многих областях, в том числе ветеринарии и медицине Нарушение липидного метаболизма в организме человека может привести к развитию таких заболеваний как атеросклероз, диабет, ожирение и др [Arias MA] Это определило интерес к изучению молекулярного механизма действия липолитических ферментов и поиску соединений, влияющих на липидный обмен Хитозан благодаря уникальной структуре и положительному заряду является полифункциональным соединением, обладающим целым рядом уникальных свойств высокой совместимостью с животными тканями, биодеградируемостью, отсутствием токсичности и др, что определяет перспективы его использования в качестве ингибитора липолитических ферментов [Sumiyoshi M, Mhurchu С ]

По данным многах исследователей хитозан обладает антимикробным эффектом в отношении многих патогенных микроорганизмов [Tsai G -J, Vaara M, Savard T ] Однако данных о чувствительности к хитозану возбудителей

туберкулеза на сегодняшний день нет Изучение противотуберкулезных свойств ферментативно полученных образцов хитозана с низкой молекулярной массой и сравнение их с действием высокомолекулярных полимеров на клетки микобактерий позволит провести сравнительный анализ и сделать некоторые обобщения практического характера связанного с использованием хитозана в медицине и ветеринарии для борьбы с туберкулезом

Цель и задачи исследования. Цель настоящей работы - разработка биотехнологической схемы переработки личинок восковой моли с получением таких биологически активных веществ, как экстракт, хитин-меланиновой комплекс и хитозан Изучение

противотуберкулезных свойств хитозана и его взаимодействия с липолитическими ферментами

Для достижения поставленной цели были определены основные задачи

❖ разработать технологию переработки восковой моли с учетом особенностей сырья и определить оптимальные параметры на каждой стадии обработки,

❖ согласно выбранным оптимальным параметрам осуществить комплексную переработку личинок восковой моли с получением интересующих биологически активных веществ,

♦♦♦ исследовать противотуберкулезные свойства хитозана с различной молекулярной массой,

❖ изучить взаимодействие хитозана с липолитическими ферментами, Научная новизна работы. Обосновано использование личинок восковой

моли для получения различных биологически активных веществ Впервые разработана комплексная технологическая схема переработки кутикулы личинок восковой моли с получением хитин-меланинового комплекса и хитозана Определены основные оптимальные параметры проведения каждой стадии

Показано, что хитозан обладает антибактериальной активностью в отношении микроорганизмов рода Mycobacterium Хитозан с низкой молекулярной массой обладает наибольшей антибактериальной активностью С увеличением молекулярной массы антибактериальный эффект хитозана

снижается Установлена прямая зависимость гибели клеток микобактерий от времени взаимодействия с хитозаном

Впервые показано, что хитозан является конкурентным ингибитором липолитических ферментов Найдены кинетические константы ингибирования липаз Ингибирование липолитической активности происходит за счет гидрофобных взаимодействий между хитозаном и липазами, вклад электростатических взаимодействий в комплексообразование ингибитора с липолитическими ферментами незначителен

Практическая значимость работы Разработана технологическая схема переработки кутикулы личинок восковой моли с получением хитин-меланинового комплекса и хитозана Предложены оптимальные параметры для осуществления каждой стадии переработки кутикулы Данная технология была апробирована в условиях производства на ЗАО «Биопрогресс» и проведена наработка хитозана для испытаний в медицине, пищевой промышленности и сельском хозяйстве.

Показано, что хитозан обладает, как минимум, бактериостатическим действием по отношению к возбудителям туберкулеза М bovis и М avium и может быть рекомендован для профилактики туберкулеза в промышленных птицеводческих и животноводческих хозяйствах

Показано, что низкомолекулярный хитозан является конкурентным ингибитором липаз, в том числе, и панкреатической липазы Данный результат может иметь практическое значение при создании препаратов для лечения и профилактики нарушений липидного метаболизма в организме человека, приводящего к развитию таких заболеваний как атеросклероз, диабет, ожирение

Апробация работы. Основные положения работы были представлены на 8-й Международной научной конференции «Современные перспективы в исследовании хитина и хитозана» (Казань, 2006), Международной научно-практической конференции "Разработка противотуберкулезных терапевтических агентов нового поколения Проблемы, подходы, перспективы" (Химки, 2006), Международной конференции «Генетика микроорганизмов и биотехнология»

(Москва-Пущино, 2006), 4-м съезде биотехнологов России (Пущино, 2006), 6-й Международной научной конференции «Фитотерапия, биологически активные вещества естественного происхождения в современной медицине» (Черноголовка, 2006), Международной научно-практической конференции «Научные основы производства ветеринарных биологических препаратов» (Щелково, 2006), 3-м Международном симпозиуме «Проблемы биохимии, радиационной и космической биологии» (Дубна, 2007), Международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов - 2007» (Москва, 2007), VIII International Conference of the European Chitin Society (Antalya, Turkey, 2007)

Личный вклад соискателя. Изучение противотуберкулезной активности хитозана проводили совместно с ВНИТИБП РАСХН (г Щелково) Остальные исследования выполнены автором самостоятельно

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 14 работ, в том числе 3 статьи

Структура и объём диссертации. Диссертация состоит из введения, литературного обзора, методической части, раздела с обсуждением экспериментальных результатов, выводов, списка литературы и приложения Работа изложена на 142 страницах машинописного текста, содержит 21 таблицу и 17 рисунков, библиографию из 250 наименований, из них 203 на иностранном языке

Благодарности. Автор выражает глубокую признательность д х н,

профессору! Г И Яковлеву |(ИМБ, РАН) за содействие в проведении работы Автор благодарит за поддержку д.м н., профессора Г.А Анненкова и сотрудников лаборатории инженерии ферментов, Центра «Биоинженерия» РАН А В Ильину, С А Лопатина, А Н Левова

2. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ 2.1 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Для исследований использовали крабовый высокомолекулярный хитозан производства ЗАО «Биопрогресс», г Щелково

Личинки восковой моли Galleria mellonella L предоставлены совхозом «Московский» (г Москва)

Атипичный штамм Mycobacterium smesmatis 134-S был предоставлен В А Андрюшиной (Центр «Биоинженерия» РАН, г Москва) Штаммы Mycobacterium avium и Mycobacterium bovis из коллекции ННЦ «ИЭКВМ», г Харьков

Схема оптимизации процессов переработки личинок восковой моли включала следующие стадии. депротеинирование, обесцвечивание, деацетилирование, ферментативный гидролиз

Измерение вязкости растворов хитозана проводили вязкозиметрически Рассчитывали величину характеристической вязкости (г|) Молекулярную массу хитозана (Мг|) рассчитывали по уравнению Марка-Хаувинка

Степень деацетилирования хитозана (СД) определяли методом кондуктометрического титрования

Фракционирование низкомолекулярного хитозана проводили методом дробной экстракции в системе этиловый спирт - вода

Средневесовую молекулярную массу (Mw), среднечисловую молекулярную массу (Мп), значения полидисперсности (Ip = Mw/Mn), массу в пике (Мр) хитозана определяли методом гель-проникающей ВЭЖХ на приборе «Sykam» (Германия) с использованием тандема колонок Ultrahydrogel 250 и Ultrahydrogel 500 (Waters Chromatography, США) Контроль и анализ хроматограмм осуществляли с помощью программы «Мультихром» версия 1 6 (ЗАО «Амперсенд», Россия)

Липолитическую активность используя в качестве субстрата паранитрофенил пальмитат, определяли спектрофотометрически

Липолитическую активность в гетерогенной среде определяли путем титрования жирных кислот, образовавшихся при гидролизе оливкового масла

Константы ингибирования липаз определяли по методу Диксона из сравнения зависимостей в обратных координатах скорости реакции от концентрации субстрата, в отсутствии и в присутствии ингибитора

Фракционирования экстракта из восковой моли проводили при помощи хроматографии низкого давления При гидрофобной хроматографии экстракт

наносили на колонку (1,2x3 см) с сорбентом (бутил-тойоперл) уравновешенную 0,05 М Na-фосфатным буфером (pH 7 3), содержащим 0,9 М Na2SC>4 Белки элюировали в ступенчатом градиенте концентрации 0,3 и 0,1 М Na2S04

Металл-хелат аффинная хроматография СМХАХ) На тандем колонок с №(П)-ИДК-агарозой (1x4см) и Си(П)-ИДК агарозой (1,4x3см), уравновешенных 0,05 М Na-фосфатным буфером (pH 7 3) содержащим 0,2 М NaCl, наносили фракцию, полученную после гидрофобной хроматографии После элюции балластных белков 0,05 М Na-фосфатным буфером (pH 7 3) содержащим 0,2 М NaCl колонки разъединяли Элюцию белков с колонки, заряженной ионами меди, проводили последовательным добавлением 0,05 М и 0,25 М имидазола

Электрофорез в денатурирующих условиях в 12%-ном полиакриламидном геле проводили по методу Леммли на приборе Mmi Protein II («Bio-Rad», США)

Антибактериальную активность хитозана в отношении клеток микобактерий оценивали путем подсчета жизнеспособных колоний на чашках Петри при внесении в питательную среду хитозана в различных концентрациях

Определение прочности связывания хитозана с поверхностью клеточной стенки М smegmatis определяли в супернатанте с помощью колориметрического метода при длине волны 565 нм на спектрофотометре «Specol-11» («Carl Zeiss Jena», Германия)

Для определения минимальной ингибирующей концентрации (МИК) каждый образец хитозана титровали методом двукратных серийных разведений в полистирольных планшетах - ряд из 12 лунок Начиная со второй лунки, вносили по 100 мкл стерильного изотонического раствора NaCl В каждую лунку ряда вносили 10 мкл микробной суспензии Смесь разведенных образцов хитозана с клетками М smegmatis инкубировали в течение 4 часов при 37°С, и делали высев на чашки Петри с МПА После инкубации учитывали наличие или отсутствие роста клеток М smegmatis

Статистический анализ проводили с использованием стандартных математических методов в компьютерной программе «Microsoft-Excel»

2.2 ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

2.2.1 Получение хитина и низкомолекулярного хитозана из кутикулы

В состав кутикулы восковой моли входит небольшое количество минеральных веществ, что позволило нам исключить стадию деминерализации из схемы переработки Известно, что пигмент меланин, ковалентно связанный с белками кутикулы, оказывает значительное влияние на свойства хитозана Это и определило необходимость включения дополнительной стадии обесцвечивания в схему переработки кутикулы восковой моли

При разработке технологической схемы получения хитина и хитозана из кутикулы восковой моли нами была проведена оптимизация каждой стадии обработки с целью подбора оптимальных параметров процесса

Для выделения чистого хитина из кутикулы личинок восковой моли были подобраны оптимальные условия одновременного щелочного

восковой моли Galleria mellonella L

Депротеинирование

45 т

30 т

5 -0 --

О I I I I I I I I 1 1 I 1 I- I 0,25 1 3 7 11 15 20 концентрация NaOH, %

20 40 60 80 Температура,'

80 100

Рис.1. Влияние концентрации щелочи (а), температуры (б), и времени (в) на выход хитин-меланинового комплекса (1) (ХМК) и белок-меланинового комплекса (2) (БМК)

10 30 90 150 Время, мин

гидролиза белков кутикулы, а также меланиновых пигментов, связанных с белками

Нами были определены концентрационные, температурные и временные параметры процесса депротеинирования (рис 1)

Повышение концентрации щелочи с 0,25 до 3% приводило к увеличению количества удаляемого белок-меланинового комплекса (БМК) с 7 до 21% Дальнейшее увеличение концентрации №ОН в 5-6 раз приводило к снижению выхода БМК Снижение выхода объясняется частичным щелочным гидролизом белка в комплексе При повышении температуры свыше 50°С выход хитин-меланинового комплекса (ХМК) и БМК значительно снижался Это можно объяснить частичным гидролизом и деацетилированием хитина в щелочных условиях, и частичным удалением меланинов из ХМК

При изучении влияния продолжительности процесса, было установлено, что наибольший выход ХМК достигался в первые 20 минут (43%) Увеличение времени в 7-9 раз приводило к снижению выхода ХМК в среднем на 30% Выход БМК достигал максимума (24%) при гидролизе в течение 2 часов

В результате оптимизации процесса депротеинирования мы определили основные условия проведения процесса концентрация щелочи -2-3%, температура - 45-50°С, продолжительность - 1,5-2 ч. Выход ХМК и БМК при данных условиях составлял 25-30% и 20-25%, соответственно

Обесцвечивание

На стадии депротеинирования даже при использовании жестких условий (I >80°С, Сыаон >10%) нам удалось максимально освободиться лишь от 25% белков и пигментов Цвет полученного ХМК варьировал от темно-бежевого до коричневого Это обусловлено довольно прочной связью меланинов с полисахаридами и белками в кутикуле насекомого Для получения неокрашенного хитина мы ввели в технологию переработки кутикулы дополнительную стадию обесцвечивания сильным окислителем - перекисью водорода

Оптимизацию процесса обесцвечивания проводили в зависимости от концентрации реагента (табл.1), температуры и продолжительности процесса

Таблица 1

Влияние концентрации перекиси водорода на характеристики ХМК

Сн202, Выход Выход СД, м. Мт|,

% ХМК,% хитозана,% % дл/г кДа

0.5 70 49 83 6.4 678

2 64 52 87 5.5 552

4 61 54 89 4.2 428

6 58 57 89 3.7 354

8 56 56 91 4.8 470

10 55 58 92 -

Определение Мт^ и других физико-химических характеристик ХМК после стадии обесцвечивания затруднительно в виду его ограниченной растворимости в слабокислых водных растворах. В этой связи мы проводили также деацетилирование 15 % суспензии ХМК (45% ИаОН, 125°С, 2 ч )

Показано, что при повышении концентрации Н202 происходило незначительное снижение выхода ХМК (на 10-15%) с изменением цвета от коричневого (0,5% Н2Ог) до светло-бежевого (10% Н202), при визуальной оценке Это косвенно свидетельствовало о том, что под действием окислителя происходило разрушение не самого меланина, а хромофорных групп пигмента Изменение концентрации Н202 также незначительно влияло на выход хитозана и его СД после деацетилирования Однако при обесцвечивании проходил процесс деструкции полимера Увеличение концентрации Н202 (до 6%) приводило к снижению молекулярной массы (в 2 раза) При использовании концентрации Н202 выше 6% наблюдали резкое увеличение вязкости хитозана (с 3,5 до 5,5 дл/г)

Нами показано несущественное влияние температуры процесса на выход хитин-меланинового комплекса и хитозана Повышение температуры обесцвечивания незначительно влияло на значение СД, но приводило к существенному уменьшению вязкости и Мг) хитозана после

деацетшгарования Снижение Мг| в 2 раза при повышении температуры с 22 до 40°С можно объяснить гидролизующими свойствами перекиси водорода Интересно отметить, что дальнейшее увеличение температуры не приводило к более существенному гидролизу ХМК

Изменение продолжительности процесса обесцвечивания не приводило к значительным изменениям выхода ХМК и хитозана, при последующем деацетилировании, и составившего 65-70% и 40-45%, соответственно Продолжительность процесса практически не влияла и на СД полученного хитозана Однако на данной стадии одновременно протекала реакция деструкции хитозана, что приводило к снижению Мг|

В результате оптимизации процесса обесцвечивания мы определили основные условия концентрация Н2Оо - 2-4 %, температура - 40-45°С, продолжительность -1ч Выход полимера при данных условиях после обесцвечивания составлял 70%, после стадии деацетшгарования - около 40%, СД в среднем 85-89% и молекулярная масса - 350кДа

Деацетилирование Оптимизацию процесса деацетилирования с целью получения хитозана, растворимого в водных растворах (рН 4-6), осуществляли в щелочных условиях в зависимости от концентрации щелочи (табл.3), температуры (табл 4) и продолжительности процесса

Использование концентраций №ОН ниже 35% приводило к образованию полимеров со СД ниже 50%, нерастворимых при рН 3-5 (табл 2)

Таблица 2

Влияние концентрации щелочи на характеристики хитозана

№ОН, Выход СД, Мт1,

% хитозана, % % кДа

30 46 47 _

35 49 51 _

40 40 71 1 143

45 44 87 44?

50 43 87 380

55 48 89 351

Увеличение концентрации щелочи свыше 40% способствовало увеличению СД в 2 раза, уменьшению вязкости в 1,5-2 раза и молекулярной массы - в 3 раза Полученные результаты можно объяснить тем, что при концентрации ЫаОН 40% происходило деацетилирование не только аморфных, но и кристаллических участков полимера, за счет диффузии гидроксида натрия ближе к поверхности или внутрь макромолекулы, что напрямую зависело от концентрации щелочи Увеличение концентрации щелочи выше 50% незначительно сказывалось на выходе, СД и вязкости полимера

Применение в процессе деацетилирования температур ниже 100°С позволяло получать плохо растворимый хитозан с низкой СД (до 70%), высокой вязкостью и молекулярной массой (табл 3)

Таблица 3

Влияние температуры деацетилирования на характеристики хитозана

т,°с Выход сд,% Мл,

хитозана, % кДа

60 38 69 1825

80 46 72 1469

100 44 74 1 104

120 45 81 674

140 42 84 439

Повышение температуры свыше 100°С значительно облегчало протекание процесса деацетилирования, приводя к увеличению СД на 15-20% и снижению вязкости в 2,5 раза При подборе оптимального времени мы ориентировались на значения СД, которые в первые 1-1,5 ч увеличивались на 4-5% и в дальнейшем незначительно росли Параллельно интенсивно проходила деструкция полимера, которая сказывалась на снижении вязкости и Мт] полимера В течение 4 часов гидролиза Мг) полимера снижалась в 2,5 раза

На основе полученных результатов по оптимизации стадии деацетилирования мы предлагаем следующие условия концентрация ЫаОН -45-50%, температура - 125-130°С, продолжительность -2ч

Проведение процесса деацетилирования в вышеописанных условиях способствовало получению продукта светло-бежевого цвета со следующими физико-химическими свойствами высокой СД (83-86%), молекулярной массой (400-500кДа)

Ферментативный гидролиз

Проведено изучение гидролиза хитозана восковой моли с помощью трех ферментных препаратов разной субстратной специфичности хитинолитического комплекса ферментов Streptomyces kurssanovn, промышленного ферментного целлюлолитического препарата Целловиридин Г20х на основе штамма Trichoderma viride и протеолитического фермента папаина (ЕС 3 4 22 2) из латекса дынного дерева (Carica papaya L)

Гидролиз хитозана проводили в оптимальных условиях для каждого препарата с использованием фермент-субстратного соотношения - 1/400 (весовое отношение содержания белка в препарате к весу субстрата) Наиболее эффективно гидролиз проходил под действием комплекса S kurssanovn, при этом получали хитозан с высокой СД, низкими значениями вязкости и молекулярной массы При использовании препарата Целловиридин, неспецифичного к данному субстрату, получали образцы с более низкой СД, высокой вязкостью и молекулярной массой Выход гидролизатов менее 50% в случае использования первых двух ферментных комплексов можно объяснить тем, что при гидролизе комплексом S kurssanovn получали полимеры с высокой СД (89%) и, следовательно, лучшей растворимостью при рН 5-6, что, возможно, приводило к ощутимым потерям низкомолекулярных фракций (<10кДа) в процессе диализа А при гидролизе комплексом Т viride причиной, скорее всего, было образование большого количества моносахаров, которые также теряются при диализе Для образцов, гидролизованных в течение Зч, определяли основные физико-химические показатели (табл 4)

Таблица 4

Характеристика высоко- (ВМХз) и низкомолекулярного (НМХз) хитозана

Образцы Выход,% СД,% Mw, кДа Мп, кДа IP

ВМХз - 89 247 161 1,53

НМХз, полученный

гидролизом под действием

S kurssanovn 53 89 7,6 4,0 1,8

Целловиридин Г20х 51 83 96,4 54,7 1,76

Папаин 66 86 176,3 142,1 1,24

Молекулярную массу полученных в результате гидролиза образцов хитозана определяли методом гель-проникающей высокоэффективной жидкостной хроматографии Индексы полидисперсности (1р) не превышали значений 1,2-1,8, что свидетельствует об относительной однородности полученных гидролизатов по молекулярной массе

2.2.2 Изучение противотуберкулезных свойств хитозана Подбор концентрации хитозана оказывающей антибактериальное действие на клетки М. smegmatis

Для подбора концентрации хитозана, оказывающей антибактериальное воздействие на клетки М зте^аШ были проведено изучение антибактериальной активности хитозана с Мт] 7 кДа в концентрациях 0,01, 0,05, 0,1, 0,5 и 1% Оптимальную концентрацию определяли по интенсивности зон лизиса клеток М ьте^рпаШ вокруг лунок с хитозаном Наилучшим антибактериальным эффектом обладал хитозан в концентрациях 0,1%-1% В этом случае зоны роста микобактерий были полностью прозрачными

Исследование зависимости гибели бактериальных клеток от Мч хитозана Процент гибели клеток М smegmatls после 60 мин экспозиции с хитозаном варьировал от 0 до 76% в зависимости от Мл хитозана (рис 2)

И 96 177 4 8.5 24 396

ММ,кДа ММ, кДа

Рис.2. Влияние хитозана с различной ММ на гибель клеток М 8те%таШ (% от общего количества клеток) а - крабовый хитозан, б - хитозан из восковой моли

Наименьшей чувствительностью штамм М smegmatis обладал к

высокомолекулярным образцам хитозана с Мп 96 и 177 кДа В случае их

действия гибель клеток микобактерий составляла 29 и 13%, соответственно Высокомолекулярный крабовый хитозан с М,, 396 кДа в концентрации 0,1% не обладал антибактериальным действием Максимальной активностью в отношении клеток микобактерий обладали низкомолекулярные хитозаны с М,, 4-11 кДа, процент гибели клеток достигал 76%

Образцы хитозана, имеющие отрицательный заряд, такие как, N -сукцинил хитозан, сульфат хитозан, карбоксиметил хитозан антибактериальной активностью не обладали

Гибель клеток М. этедтайз в зависимости от времени взаимодействия с хитозаном Для изучения зависимости гибели клеток микобактерий от времени взаимодействия с крабовым хитозаном Ц от 4 и 24 кДа и СД 85% и хитозаном из восковой моли с М^ 11 кДа и СД 89% пробы отбирали через 10, 30, 60 и 120 минут (рис 3) Показано, что достаточно 10 мин контакта с хитозаном, чтобы от 38 до 60% клеток потеряли жизнеспособность В этом эксперименте подтверждена более высокая чувствительность клеток микобактерий к действию низкомолекулярных хитозана

Рис.3. Гибель бактерий М smegmatls (% от общего количества клеток) при взаимодействии с хитозанами в зависимости от времени экспозиции (мин),

1-хитозан М^ 4 кДа,

2- хитозан М,, 11 кДа,

3- хитозан М-г, 24 кДа

Определение прочности связывания хитозана с клетками M.smegmatis

Для определения прочности связывания хитозана с клетками

Мвте^аия использовали трехкратную отмывку бактерий предварительно

проинкубированных с хитозаном (МТ1 4 кДа, СД 85%), смесью из 0,1 М

ацетатного буфера (рН 6,8) содержащего 0,5 М №С1 Данные этого опыта

О 10 30 60 120

Время экспозиции, мин

показали, что воздействие хлорида натрия не оказывает существенного влияния на связывание хитозана с микобактериями Выживаемость клеток осталась без изменений В результате колориметрических исследований было показано, что количество хитозана в супернатанте было минимальным, то есть практически весь хитозан остался связанным с микобактериями Таким образом, можно сделать вывод, что хитозан в силу своей поликатионной природы, прочно связан с внешней мембраной микобактерий электростатическими и другими силами

Определение минимальной ингибирующей концентрации хитозана Нами была определена минимальная ингибирующая концентрация (МИК) всех изучаемых образцов хитозана (табл 5)

Таблица 5

Определение МИК хитозана в зависимости от МГ|, (в %)

Тест культура Mq хитозана

4 кДа 7 кДа 11 кДа 24 кДа 96 кДа 396 кДа

М smegmatis 9-10"4% 1,7 10 "3% 2,5-10"3% 5-10"2% 0,1 % >1%

Из таблицы видно, что хитозан с М^ 96 кДа ингибировал рост клеток М smegmatis в концентрации 0,1 % Результаты исследований показали, что хитозан с Mq 396 кДа в исходной концентрации 1% не угнетал рост клеток микобактерий Антибактериальная эффективность низкомолекулярных образцов хитозана при воздействии на культуру М smegmatis составляла 0,001-0,005%

Противотуберкулезная активность хитозана

Учитывая разницу строения клеточной стенки и генома атипичных и патогенных микобактерий, было проведено изучение влияния нескольких низкомолекулярных образцов хитозана на патогенные штаммы М avium и М bovis Хитозаны с 58 и 87 кДа (СД 80% и 84%, соответственно) в концентрации 0,1% полностью подавляли рост клеток М avium Клетки М bovis менее чувствительны к действию хитозанов с М^ 58 и 87 кДа в концентрации 0,1% (40% и 50% гибели клеток, соответственно) К хитозану с Mr, 38 кДа бактерии М avium оказались менее чувствительны Процент гибели

клеток составил 25% А в случае взаимодействия с хитозаном клеток М bovis (М,, 38 кДа) в концентрации 0,1% рост бактерий практически не угнетался

Снижение антибактериальной активности хитозана с М^ 38 кДа можно объяснить невысокой СД (78%) С увеличением СД количество NH2 групп хитозана увеличивается, следовательно, хитозан с большей СД обладает большим положительным зарядом С целью проверки антибактериального действия на патогенные штаммы полимера с отрицательным зарядом, клетки М bovis и М avium подвергли обработке N-сукцинил хитозаном с М^ 380 кДа Результаты исследования показали, что N-сукцинил хитозан не обладает антимикробными свойствами в отношении микобактерий Следовательно, введение отрицательно заряженных групп в молекулу хитозана ведет фактически к утрате антибактериальных свойств

Результаты проведенных исследований свидетельствуют о том, что хитозан обладает, как минимум, бактериостатическим действием по отношению к возбудителям туберкулеза и может быть рекомендован для профилактики туберкулеза в промышленных птицеводческих и животноводческих хозяйствах

2.2.3 Изучение свойств экстракта выделенного из восковой моли

С целью выделения фактора ответственного за противотуберкулезную активность, было проведено фракционирование экстракта полученного из личинок восковой моли (табл 6)

Во всех фракциях, полученных на различных стадиях очистки, определяли степень антибактериальной активности в отношении М smegmatis, а также специфическую липолитическую активность, предполагая, что за антибактериальную активность ответственны гидролитические ферменты

Экстракт получали в результате гомогенизации личинок восковой моли в изотоническом растворе NaCl Липидная фракция экстракта, полученная в процессе экстракции этилацетатом, антибактериальной активностью не обладала Водная составляющая экстракта, проявляющая антибактериальную активность, была подвержена дробному сульфат аммонийному высаливанию

Таблица 6

Фракционирование экстракта выделенного из восковой моли

Стадии очистки V, мл Белок, мг Ауд., ед./мл АЕ Выход Очистка Аантиб., %

Экстракт без липидов 11 15,4 0,053 0,84 100 1 14

45% сульфат аммонийный высол 10 3,9 0,061 0,24 29 1,2 9

Гидрофобная хроматография на бутил-тойоперл 9 0,68 0,165 0,11 13 3 21

МХАХ на тандеме №(Н)-ИДК Си(11)-ИДК -агарозе 8 0,3 1,36 0,38 45 29 38

Максимальной антибактериальной и липолитической активностями обладала материя, выделяемая 45% насыщением сульфатом аммония Эта фракция была подвержена хроматографической очистки Первая стадия очистки была проведена на колонке с гидрофобным сорбентом бутил-тойоперл После нанесения и промывания уравновешивающим буфером белки элюировали в ступенчатом градиенте концентрации 0,3 и 0,1 М сульфата натрия Материя с максимальной липолитической и антибактериальной активностью, элюировалась на гидрофобной колонке в буфере с сульфатом натрия в концентрации 0,1 М Учитывая, что одностадийное фракционирование редко позволяет получить высокую степень очистки, мы планировали проведение следующей стадии очистки - металл-хелат аффинной хроматографии Белки с максимальной антибактериальной и липолитической активностями не обладали сродством к иммобилизованным ионам Ni(II), но сорбировались на Си(П)-ИДК-агарозе и элюировались при добавлении в буфер 0,05 М имидазола Учитывая, что на №(П)-ИДК колонке сорбировалась часть балластных белков, вторую стадию хроматографической очистки было решено проводить в тандеме колонок на №(П)-ИДК-Си(11)-ИДК агарозе, в режиме online Для предотвращения ионообменных взаимодействий в буфер добавляли 0,2 М NaCl После нанесения белка и промывания, колонки рассоединяли С

Си(П)-ИДК колонки элюцию проводили последовательным добавлением 0,05

М и 0,25 М имидазола Фракция элюированная в буфере с добавлением 0,05 М имидазола обладала максимальной липолитической и антибактериальной активностью

В результате проведенного фракционирования не удалось получить фракцию, содержащую индивидуальный белок, обладающую противотуберкулезной активностью Однако была получена фракция с высокой степенью очистки, содержащая набор белков с различными молекулярными массами и обладающая антибактериальной активностью в отношении М smegmatis После двух хроматографических стадий очистки -гидрофобной и металл-хелат аффинной удельная липолитическая активность возрастала в 29 раз

2.2.4 Ингибирование активности липолитических ферментов хитозаном в гомогенных водных растворах

Изучение взаимодействия низкомолекулярного хитозана с липазой из Candida rugosa и липазой из проростков пшеницы проводили в водных растворах, используя паранитрофенил пальмитат в качестве субстрата

В результате изучения влияния молекулярной массы хитозана (5-94 кДа) на степень ингибирования активности липазы из С rugosa, было показано, что максимальное снижение активности наблюдалось при действии хитозана с молекулярной массой 6 кДа и менее В дальнейших исследованиях мы использовали хитозан и его модификации с М^ 5-6 кДа

Учитывая, что в растворах молекула липазы имеет две конформации и, предполагая, что ингибиторы липаз взаимодействуют преимущественно, если не исключительно, с открытой формой фермента и что любые переходы между этими двумя конформациями фермента в растворе являются медленными, была проведена оптимизация условий проведения ферментативной реакции

Было оценено оптимальное время преинкубации фермента и ингибитора перед началом ферментативной реакции и влияние рН на степень ферментативной активности (рис 4)

0,005

0,004 g

0,003 g

0,002 S к

0,001

14,5 9,5 4,5

5,5

4,5 > o

2,5 1,5

10 30 60 120 Время, мин

5 5,5 6 6,5 7 7,5 8 8,5 pH

Рис.4. Зависимость ферментативной активности липазы С rugosa (1) и проростков пшеницы (2) от времени преинкубации с хитозаном при рН 6,7 и 30°С (а) и от рН реакционной смеси при 30°С (б)

Время преинкубации варьировали от 5 до 120 мин Степень ингибирования липаз зависела от времени преинкубации вплоть до 30 мин, после чего оставалась примерно постоянной Максимальную активность липаз определяли в реакционной смеси при значениях рН 6,7

ммоль

Рис.5. Графики зависимостей в обратных координатах начальных скоростей гидролиза паранитрофенил пальмитата липазой С rugosa (а) и проростков пшеницы (б) от концентрации субстрата в отсутствии (1) и в присутствии хитозана (2) при рН 6,7 и 30°С

Проекция прямых на ось абсцисс позволила определить конкурентный тип ингибирования липаз хитозаном (рис 5) Эффективность гидролазного действия растительной липазы, выражаемая бимолекулярной константой

кса,/Км, в 33 раза ниже, чем для липазы из С rugosa (табл.7) Это обусловлено различиями в величинах как kcat, так и Км Величина констант ингибирования (К,) грибной и растительной липаз хитозаном близки между собой и равны 1,4 10"3 М и 0,9 10"3 М, соответственно

Таблица 7

Кинетические константы гидролиза паранитрофенил пальмитата липазой С rugosa и проростков пшеницы и константы ингибирования липаз хитозаном

Источник липазы Kcat, сек Км, моль Kcat/KM, моль"''сек"' К„ моль

Candida rugosa 2,0 6 10"4 3,3 10"3 1,4 10"3

Зародыши пшеницы 0,5 5 Ю-3 1,0 Ю-2 0,9 10"3

С целью выяснения вклада электростатических взаимодействий при образовании комплексов был проведен расчет числа аминогрупп хитозана, образующих ионную пару с отрицательно заряженной группой белка К,, ю-3 моль

Рис.6. Зависимость в логарифмических координатах величин Ki липазы С rugosa (1) и проростков пшеницы (2) хитозаном от концентрации хлорида натрия

0,05

ОД

0,3

[№С1],моль

Величина п, численно равная тангенсу угла наклона прямых 1 или 2 к оси абсцисс на рис 6 , имела значение 0,44 для липазы С rugosa и 0,28 для липазы проростков пшеницы Низкие значения величины п свидетельствует о незначительном вкладе в свободную энергию комплексообразования электростатических взаимодействий зарядов хитозана и белка.

С целью дополнительного подтверждения этого заключения мы определили К, грибной и растительной липаз низкомолекулярным N-сукцинил

хитозаном Рассчитанные константы ингибирования липазы С rugosa и проростков пшеницы N-сукцинил хитозаном найдены равными 2,0 10"3 М и 1,410"3 М, соответственно Близость значений К, липаз хитозаном со свободными аминогруппами и N-сукцинил хитозаном подтверждает вывод о незначительной роли электростатических взаимодействий при комплексообразовании ингибитора с липолитическими ферментами

2.2.5 Ингибирование активности липолитических ферментов хитозаном в гетерогенных растворах, на границе раздела фаз

Изучение ингибирования низкомолекулярным хитозаном липолитической активности в гетерогенной фазе, на границе масло-вода было проведено на трех липазах - свиной панкреатической липазе, липазе из С rugosa и липазе из проростков пшеницы Было показано, что хитозан является конкурентным ингибитором липолитических ферментов Низкомолекулярный хитозан ингибирует липолитическую активность с константами ингибирования К, в пределах 70-160 мкМ, в зависимости от ингибируемого фермента Увеличение констант ингибирования хитозаном растительной и грибной липаз по сравнению с константами, найденными при гидролизе водорастворимого субстрата, подтверждает данные о том, что при нахождении липолитических ферментов в зоне раздела фаз, липид - вода, эффективность связывания с ингибитором существенно увеличивается за счет значительного преобладания открытой конформации фермента

В качестве ингибитора липолитической активности был изучен и глюкозамин Эффективность ингибирующего действия глюкозамина оказалась на три порядка ниже, в случае ингибирования панкреатической липазы и на два порядка ниже, в случае ингибирования растительной и грибной липаз Константы ингибирования липаз глюкозамином составили 10-40 мМ Это связано с участием в комплексообразовании с липазами только одного единственного звена глюкозамина

Данный вывод подтверждают найденные значения свободной энергии, Д G комплексообразования Вклад свободной энергии, Л G в комплексообразование между липазами и глюкозамином составил -2,32

ккал/моль для панкреатической липазы, -2,41 ккал/моль для липазы из проростков пшеницы и -2,7 ккал/моль для липазы из С rugosa Найденным константам ингибирования липаз низкомолекулярным хитозаном со свободными аминогруппами соответствуют значениям A G от -5,0 до -5,8 ккал/моль Разница в значениях свободной энергии комплексообразования с липазами глюкозамина и хитозана составляет два раза, что вероятнее всего свидетельствует о том, что при гидрофобном взаимодействии происходит связывание как минимум двух звеньев хитозана с липолитическими ферментами, а в случае взаимодействия с глюкозамином, связывается одно единственное звено

ВЫВОДЫ

1 Разработана технологическая схема переработки кутикулы личинок восковой моли Gallería mellonella с получением хитин-меланинового комплекса и хитозана различной молекулярной массы Определены оптимальные условия для каждой стадии схемы переработки

2 Показано, что хитозан обладает противотуберкулезной активностью Низкомолекулярные образцы хитозана проявляют максимальную антибактериальную активность С увеличением молекулярной массы противотуберкулезный эффект хитозана снижается Установлено, что достаточно 10 минут взаимодействия клеток микобактерий с хитозаном, чтобы наблюдался антибактериальный эффект Введение отрицательно заряженных групп в молекулу хитозана ведет к утрате противотуберкулезных свойств

3 Проведено последовательное фракционирование экстракта выделенного из восковой моли После двух хроматографических стадий очистки -гидрофобной и металл-хелат аффинной удельная липолитическая активность возрастает в 29 раз С увеличением липолитической активности в результате последовательного фракционирования экстракта возрастает и антибактериальная активность, в отношении атипичного штамма М smegmatis

4 Установлено, что хитозан является эффективным конкурентным ингибитором липолитических ферментов, как в гомогенных водных

растворах, так и на границе раздела фаз Кинетические константы ингибирования липаз хитозаном составили 70-160 мкМ

ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ По разработанной технологической схеме переработки кутикулы личинок восковой моли, в условиях производства на ЗАО «Биопрогресс», осуществлена наработка хитозана для испытаний в медицине, пищевой промышленности и сельском хозяйстве

Список работ, опубликованных по материалам диссертации

1. Останина Е.С., Лопатин С А., Варламов В П Получение хитина и хитозана из восковой моли, Gallería mellonella // Биотехнология -2007 -№ 3 -С 38-45

2 Албулов А И, Шмидт Е В , Варламов В П, Останина Е.С., Голуб Ю С , Голуб О Ю, Кржижановская Е В. Противотуберкулезная активность хитозана // Ветеринария и кормление -2007 -№4-С 10-12.

3 Останина Е.С., Варламов В П .¡Яковлев Г И |Ингибирование активности липаз низкомолекулярным хитозаном // Прикладная биохимия и микробиология -2007 -Т 43 -№ 6 -С 738-743

4 Останина. Е.С. Ингибирование липаз низкомолекулярным хитозаном // Мат 8-ой Международной конференции «Современные перспективы в исследовании хитина и хитозана» Казань, 2006 -С 375-377

5 Анненков Г А, Варламов В П, Останина Е.С., Пузанов В А., Клепиков H H «Липазная концепция» лечения туберкулеза человека // Мат Международной научно-практической конференции «Разработка противотуберкулезных терапевтических агентов нового поколения Проблемы, подходы, перспективы» Химки, 2006 -С 10

6 Останина Е.С. Кинетика ингибирования низкомолекулярным хитозаном активности липаз // Мат Международной школы - конференции «Генетика микроорганизмов и биотехнология» Москва-Пущино, 2006 -С 153-155

7 Останина Е.С., Анненков Г А, Варламов В П Изучение восковой моли (Gallería mellonella) в качестве источника хитозана и препарата с противотуберкулезным действием // Мат 6-ой Международной научной конференции «Фитотерапия, биологически активные вещества естественного происхождения в современной медицине» Черноголовка, 2006 -С 193-194

8 Останина Е.С. Исследование взаимодействия липолитических ферментов с низкомолекулярным хитозаном // Мат 4-го съезда биотехнологов России Пущино, 2006.-С 188-189

9 Останина Е.С., Анненков Г А , Варламов В П, Албулов А И Перспективы создания противотуберкулезных препаратов на основе восковой моли, Gallería mellonella // Мат Международной научно-практической конференции «Научные основы производства ветеринарных биологических препаратов» Щелково, 2006 -С 145-147

10 Останина Е.С. Ингибирование липолитической активности низкомолекулярным хитозаном // Мат 3-го Международного симпозиума «Проблемы биохимии, радиационной и космической биологии» Дубна, 2007 -С 56-57

11 Останина Е.С. Изучение восковой моли в качестве источника хитина и хитозана // Тез XIX-ой зимней научной школы-конференции «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии» Москва, 2007 -С 72

12 Останина Е.С. Антибактериальная активность низкомолекулярных хитозанов в отношении Mycobacterium smegmatis II Мат XIV-ой Международной научной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов» Москва, 2007 -С 10-11

13 Ostanina E.S., Varlamov V.P, Yakovlev GL Lipase Inhibition by low molecular weight chitosan from the great wax moth, Galleria mellonella // 8th International Conference of the European Chitm Society / Ed KM Varum Antalya, Turkey, 2007 -P 168

14 Велешко A H, Розанов К В , Велешко И Е, Кулюхин С А, Лопатин С А, Левов А Н, Останина Е.С. Комплексообразование урана (VI) препаратами из природных биополимеров // Мат XVIII-ro Менделеевского съезда по общей и прикладной химии Москва, 2007 -С 159

Подписано в печать 02 10 2007 г Исполнено 03 10 2007 г Печать трафаретная

Заказ № 804 Тираж 100 экз

Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш , 36 (495) 975-78-56 www autoreferat ru

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Останина, Екатерина Сергеевна

ВВЕДЕНИЕ.

Список используемых сокращений

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Природные полисахариды хитин и хитозан: строение, 10 физико-химические свойства

1.2. Области применения

1.3. Основные источники хитина и хитозана

1.3.1. Ракообразные (Crustacea).

1.3.2. Грибы (Fungi).

1.3.3. Насекомые {Insecto).

1.3.4. Нетрадиционные источники.

1.4. Получение хитина и хитозана из насекомых.

1.5. Антимикробные пептиды насекомых.

1.5.1. Перспективы применения антимикобных пептидов насекомых.

1.5.2. «Липазная концепция» лечения туберкулеза.

1.6. Антибактериальная активность хитозана

1.7. Липолитические ферменты

1.7.1. Области применения липолитических ферментов

2. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

2.1. Материалы и методы

3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

3.1. Получение хитина и низкомолекулярного хитозана из кутикулы восковой моли Gallería mellonella L.

3.1.1. Депротеинирование

3.1.2. Обесцвечивание

3.1.3. Деацетилирование

3.1.4. Ферментативный гидролиз

3.2. Изучение противотуберкулезных свойств хитозана.

3.2.1. Подбор концентрации хитозана

3.2.2. Изучение зависимости гибели клеток М. smegmatis от Мг| хитозана

3.2.3. Изучение зависимости гибели клеток М. smegmatis от времени взаимодействия с хитозаном

3.2.4. Определение прочности связывания хитозана с клетками М. smegmatis

3.2.5. Определение МИК хитозана

3.2.6. Изучение антибактериальных свойств производных хитозана

3.2.7. Противотуберкулезная активность хитозана

3.3. Изучение свойств экстракта выделенного из восковой моли Gallería mellonella

3.3.1. Изучение зависимости гибели клеток М. smegmatis от времени взаимодействия с экстрактом

3.3.2. Фракционирование экстракта выделенного из восковой моли

3.4. Изучение взаимодействия хитозана с липолитическими ферментами

3.4.1. Ингибирование активности липолитических ферментов хитозаном в гомогенных водных растворах

3.4.2. Ингибирование активности липолитических ферментов хитозаном в гетерогенных растворах, на границе раздела фаз

ВЫВОДЫ

Введение Диссертация по биологии, на тему "Технология переработки восковой моли, изучение противотуберкулезных свойств хитозана и взаимодействия с липолитическими ферментами"

Одним из важнейших достижений мирового биотехнологического прогресса в области изыскания новых перспективных веществ за последние годы стало получение, изучение и внедрение в практику биополимеров хитина, хитозана и их производных. Уникальная структура хитозана обуславливают проявление целого ряда привлекательных свойств этого поликатиона, основными из которых являются - гипоаллергенность, биодеградируемость, биосовместимость, а также широкие антимикробные свойства.

Актуальность темы. На сегодняшний день основными источниками для получения хитина и хитозана являются панцири ракообразных (крабы, креветки, криль). Технология переработки включает постадийное удаление сопутствующих веществ с использованием химических и ферментативных способов обработки. Расширение областей применения данных биополимеров обуславливает поиск новых перспективных источников хитина. Как известно, в покровах насекомых до 50% занимает полимер хитин, наряду с белками придающий прочность экзоскелету. Таким образом, кутикулу насекомых можно рассматривать как источник различных биологически активных веществ, в том числе и хитина, с возможностью выделения в отдельном виде или в виде комплексов. Благодаря традиционно развитому пчеловодству в нашей стране в качестве источника биологически активных веществ можно предложить кутикулу личинок восковой моли - Gallería mellonella L, в большом количестве паразитирующих в пчелиных ульях.

Принимая во внимание уникальные свойства хитина и хитозана, в последние годы значительно возросло изучение этих природных полимеров. На сегодняшний день известно более 200 областей применения хитина и хитозана, в том числе и в медицине. Нарушение липидного метаболизма в организме человека может привести к развитию таких заболеваний как атеросклероз, диабет, ожирение и др. Это определило интерес к изучению молекулярного механизма действия липолитических ферментов и поиску соединений, влияющих на липидный обмен. Хитозан благодаря уникальной структуре и положительному заряду является полифункциональным соединением, обладающим целым рядом уникальных свойств: высокой совместимостью с животными тканями, биодеградируемостью, отсутствием токсичности и др. что открывает перспективы его использования в качестве ингибитора липолитических ферментов.

По данным многих исследователей хитозан обладает антимикробным эффектом в отношении многих патогенных микроорганизмов. Однако данных о чувствительности к хитозану возбудителей туберкулеза на сегодняшний день нет. Изучение противотуберкулезных свойств ферментативно полученных препаратов с низкой молекулярной массой и сравнение их с действием высокомолекулярных хитозанов на клетках микобактерий позволит провести сравнительный анализ и сделать некоторые обобщения практического характера связанного с использованием хитозана в медицине и ветеринарии для борьбы с туберкулезом.

Целью настоящей работы разработка биотехнологической схемы переработки личинок восковой моли с получением таких биологически активных веществ, как экстракт, хитин-меланиновой комплекс и хитозан. Изучение противотуберкулезных свойств хитозана и его взаимодействия с липолитическими ферментами.

Для достижения поставленной цели были определены следующие основные задачи:

1. Разработать технологию переработки восковой моли с учетом особенностей сырья и определить оптимальные параметры на каждой стадии обработки;

2. Согласно выбранным оптимальным параметрам осуществить комплексную переработку кутикулы личинок восковой моли с получением интересующих биологически активных веществ;

3. Исследовать противотуберкулезные свойства хитозана с различной молекулярной массой;

4. Изучить взаимодействие хитозана с липолитическими ферментами;

Научная новизна работы. Обосновано использование личинок восковой моли для получения различных биологически активных веществ. Впервые разработана комплексная технологическая схема переработки кутикулы личинок восковой моли с получением хитин-меланинового комплекса и хитозана. Определены основные оптимальные параметры переработки кутикулы восковой моли на каждой стадии обработки. Учитывая особенность сырья, обоснована необходимость включения стадии обесцвечивания в технологию переработки с целью более полного удаления пигмента.

Показано, что хитозан обладает антибактериальной активностью в отношении микроорганизмов рода Mycobacterium. Хитозан с низкой молекулярной массой обладает наибольшей антибактериальной активностью. С увеличением молекулярной массы антибактериальный эффект хитозана снижается. Установлена прямая зависимость гибели клеток микобактерий от времени взаимодействия с хитозаном.

Впервые показано, что хитозан является конкурентным ингибитором липолитических ферментов. Найдены кинетические константы ингибирования липаз. Ингибирование липолитической активности происходит за счет гидрофобных взаимодействий между хитозаном и липазами, вклад электростатических взаимодействий в комплексообразование ингибитора с липолитическими ферментами незначителен.

Практическая значимость работы. Разработана комплексная схема переработки кутикулы личинок восковой моли с получением таких биологически активных веществ как экстракт, хитин и низкомолекулярный хитозан-меланиновый комплекс. Предложены оптимальные параметры для осуществления каждой стадии переработки кутикулы.

Показано, что хитозан обладает, как минимум, бактериостатическим действием по отношению к возбудителям туберкулеза М. bovis и М. avium и может быть рекомендован для профилактики туберкулеза в промышленных птицеводческих и животноводческих хозяйствах.

Показано, что низкомолекулярный хитозан является конкурентным ингибитором липаз, в том числе, и панкреатической липазы. Данный результат может иметь практическое значение при создании препаратов для лечения и профилактики нарушений липидного метаболизма приводящего к развитию таких заболеваний как атеросклероз, диабет, ожирение в организме человека

Апробация результатов работы. Материалы диссертации доложены и обсуждены на 8-й Международной научной конференции «Современные перспективы в исследовании хитина и хитозана» (Казань, 2006), Международной научно-практической конференции "Разработка противотуберкулезных терапевтических агентов нового поколения. Проблемы, подходы, перспективы" (Химки, 2006), Международной школе -конференции «Генетика микроорганизмов и биотехнология» (Москва-Пущино, 2006), 4-м съезде биотехнологов России (Пущино, 2006), 6-й Международной научной конференции «Фитотерапия, биологически активные вещества естественного происхождения в современной медицине» (Черноголовка, 2006), Международной научно-практической конференции «Научные основы производства ветеринарных биологических препаратов» (Щелково, 2006), 3-м Международном симпозиуме «Проблемы биохимии, радиационной и космической биологии» (Дубна, 2007), Международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов - 2007» (Москва, 2007), VIII International Conference of the European Chitin Society

Antalya, Turkey, 2007).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 14 печатных работ, в том числе 3 статьи.

Структура и объем диссертации. Диссертация содержит введение, обзор литературы, методическую часть, раздел с обсуждением экспериментальных результатов, выводы, список литературы и приложение. Работа изложена на 142 страницах машинописного текста, содержит 21 таблицу и 17 рисунков, библиографию из 250 наименований, из них 203 на иностранном языке.

Заключение Диссертация по теме "Биотехнология", Останина, Екатерина Сергеевна

выводы

1. Разработана технологическая схема переработки кутикулы личинок восковой моли Gallería mellonella с получением хитин-меланинового комплекса и хитозана различной молекулярной массы. Определены оптимальные условия для каждой стадии схемы переработки.

2. Показано, что хитозан обладает противотуберкулезной активностью. Низкомолекулярные образцы хитозана проявляют максимальную антибактериальную активность. С увеличением молекулярной массы противотуберкулезный эффект хитозана снижается. Установлено, что достаточно 10 минут взаимодействия клеток микобактерий с хитозаном, чтобы наблюдался антибактериальный эффект. Введение отрицательно заряженных групп в молекулу хитозана ведет к утрате противотуберкулезных свойств.

3. Проведено последовательное фракционирование экстракта выделенного из восковой моли. После двух хроматографических стадий очистки -гидрофобной и металл-хелат аффинной удельная липолитическая активность возрастает в 29 раз. С увеличением липолитической активности в результате последовательного фракционирования экстракта возрастает и антибактериальная активность, в отношении атипичного штамма М. smegmatis.

4. Установлено, что хитозан является эффективным конкурентным ингибитором липолитических ферментов, как в гомогенных водных растворах, так и на границе раздела фаз. Кинетические константы ингибирования липаз хитозаном составили 70-160 мкМ.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Останина, Екатерина Сергеевна, Щёлково

1. Muzzarelli R.A.A. Chitin. Oxford: Pergamon Press., 1977. P.309.

2. Cauchie H-M. Chitin production by arthropods in the hydrosphere // Hydrobiologia. 2002. - V.470. - №1/3. - P.63-95.

3. Majeti N.V., Kumar R. A review of chitin and chitosan applications // Reactive & Functional Polymers. 2000. - V.46. - №1. - P. 1-27.

4. Tolaimate A., Desbrie'res J., Rhazi M., Alagui A., Vincendon M., Vottero P. On the influence of deacetylation process on the physicochemical characteristics of chitosan from squid chitin // Polymer. 2001. - V.4. - №7. -P.2463-2469.

5. Zhang M., Haga A., Sekiguchi H., Hirano S. Structure of insect chitin isolated from beetle larva cuticle and silkworm (Bombyx mori) pupa exuvia // Int. J. Biological Macromolecules. 2000.-V.27. - №.1. - P.99-105.

6. Muzzarelli R.A.A. The discovery of chitin a > 570 Mega year old polymer // In: Chitosan in pharmacy and chemistry / Ed. R.A.A Muzzarelli, C. Muzzarelli. Atec, Italy, 2002. P. 1-8.

7. Тиунова H.A. Хитинолитические ферменты микроорганизмов // Успехи биологической химии. 1989. - Т.30. - №4 - С. 199-219

8. Kumar G., Bristowa J.F., Smith P.J., Payne G.F. Enzymatic gelation of the natural polymer chitosan // Polymer. 2000. - V.41. - №6. - P.2157-2168.

9. Juang R-S., Shao H-J. A simplified equilibrium model for sorption of heavy metal ions from aqueous solutions on chitosan // Water Research -2002. V.36. - №12. - P.2999-3008.

10. Lim S.H., Hudson S.M. Application of a fiber-reactive chitosan derivative to cotton fabric as a zero-salt dyeing auxiliary // Color. Technol. -2004. V.120. - №8 - P.108-113.

11. Smith J., Wood E., Dornish M. Effect of chitosan on epithelial cell tight junctions // Pharmaceutical Research. 2004. - V.21. - №1. - P.43-49.

12. Hejazi R., Amiji M. Chitosan based gastrointestinal delivery systems

13. J. Control Release. 2003. - V.89. - №2. - P. 151-165.

14. Sarasam A.R, Krishnaswamy R.K, Madihally S.V. Blending chitosan with polycaprolactone: effects on physicochemical and antibacterial properties // Biomacromolecules. 2006. - V.7. - №4. p.i 131—1138.

15. Chen R., Okamoto H., Danjo K. Particale design using a 4-fluid-nozzle spray-drying technique for sustained release of acetaminophen // Chem. Pharm. Bull. 2006. V. 54. № 7. P. 948 953

16. Okamoto H., Danjo K. Local and systemic delivery of high-molecular weight drugs by powder inhalation // Yakugaku Zasshi. 2007. - V.127. - №4. - P.643-653.

17. Kato Y., Onishi H., Machida Y. Application of chitin and chitosan derivatives in the pharmaceutical field // Curr. Pharm. Biotechnol. 2003. - V.4. - №5. -P.303-309.

18. Smith J., Wood E., Dornish M. Effect of chitosan on epithelial cell tight junctions // Pharmaceutical Reseach. 2004. - V.21. - №1. - P.43-49.

19. Xie W., Xu P., Wang W., Liu Q. Preparation of water-soluble chitosan derivatives and their antibacterial activity // J. Appl. Polym. Sci. 2002. - V.85. -№8. - P.1357-1361.

20. Cho Y-W., Cho Y-N., Chung S-H., Yoo G., Ko S-W. Water-soluble chitin as a wound healing accelerator // Biomaterials. 1999. - V.20. - №22. - P.2139-2145.

21. Liu H., Mao J., Yao K., Yang G., Cui L., Cao Y. A study on a chitosan gelatin-hyaluronic acid scaffold as artificial skin in vitro and its tissue engineering applications // J. Biomater. Sci. Polym. Ed. 2003. - V.14. - №1. -P.25-40.

22. Ishak R.A., Awad G.A., Mortada N.D., Nour S.A. Preparation, in vitro and in vivo evaluation of stomach-apecific metronidozol-loaded alginate beads as local anti-Helicobacterpylori therapy // J. Control Release. 2007. - V.3. - №1. - P. 134140.

23. Jagur-Grodzinski J. Biomedical application of functional polymers // Reactive & Functional Polymers. 1999. - V.39. - №2. - P.99-138.

24. Ikinci G., Senel S., Akincibay H., Kas S., Ercis S., Wilson C.G., Hincal A.A. Effect of chitosan on a periodontal pathogen Porphyromonas gingivalis II Int. J. Pharm. 2007. - V.253. - №1-2. - P. 121-127.

25. Vongchan P., Sajomsang W., Subyen D., Kongtawelerta P. Anticoagulant activity of a sulfated chitosan // Carbohydrate Research. -2002. V.337. - №3. - P.1233-1236.

26. Ilium L. Chitosan and its use as a pharmaceutical excipient // Pharmaceutical Pesearch. 1998. - V.15. - №9. - P. 1326-1331.

27. Furda I. Multifunctional fat absorption and blood cholesterol reducing formulation comprising chitosan. US Patent 5736532, 1998.

28. Sumiyoshi M., Kimura Y. Low molecular weight chitosan inhibits obesity induced by feeding a high-fat diet long-term in mice // J. Pharm. Pharmacol. -2006. V.58. - №2. - P.201-207.

29. Ni Mhurchu C., Dunshea-Mooij C.A., Bennett D., Rodgers A. Chitosan for overweight or obesity // Cochrane Database Syst. Rev. 2005. - V.20. - №3. - P.93-99.

30. Rhoades J., Roller S. Antimicrobial actions of degraded and native chitosan against spoilage organisms in laboratory media and foods // Applied and environmental microbiology. 2000. - V.66. - №1. - P.80-86.

31. Gil G., del Monaco S., Cerrutti P., Galvagno M. Selective antimicrobial activity of chitosan on beer spoilage bacteria and brewing yeasts // Biotechnol Lett. 2004. - V.26. - №7. - P.569-574.

32. Tsai G.J., Tsai M.T., Lee J.M., Zhong M.Z. Effects of chitosan and a low-molecular-weight chitosan on Bacillus cereus and application in the preservation ofcooked rice. // J. Food Prot. 2006. - V.69. - №9. - P.2168-2175.

33. Богданов В.Д., Сафронова Т.М. Структурообразователи и рыбные композиции. М.: ВНИРО, 1993. 177с.

34. Сафронова Т.М. Применение хитозана в производстве пищевых продуктов приведено в «Хитин и хитозан. Получение, свойства и применение» / Под. ред. Скрябина К.Г., Вихоревой Г.А., Варламова В.П. -М: Наука, 2002. С. 346-359.

35. Албулов А.И., Самуйленко А.Я., Фролова M.A. «Хитин и хитозан. Получение, свойства и применение» / Под. ред. Скрябина К.Г., Вихоревой Г.А., Варламова В.П. М: Наука, 2002. - С. 360-363.

36. Gain В. Natural products gain flavor // Chemical week. 1996. - V.158. -№48. - P.35-36.

37. Zechendorf B. Sustainable development: how can biotechnology contribute? // Trends in Biotechnology. 1999. - V.I7. - №6. - P.219-225.

38. Davidson K. «Plant growth regulators derived from chitin». US Patent 4964894,2006.

39. Surguchova N.A., Varitsev Yu.A., Chirkov S.N. The inhibition of systemic viral infections in potato and tomato plants by chitosan treatment // J. Russ. Phytopathol. Soc. 2000. - V.47. - №3. - P.59-62.

40. Pospieszny H. Antiviroid activity of chitosan // Crop Protection. 1997. -V.16. - №2. - P. 105-106.

41. Немцев C.B. Комплексная технология хитина и хитозана из панциря ракообразных. М.: ВНИРО, 2006. 134с.

42. Vincent J.V. Arthropod cuticle: a natural composite shell system // Composites: Part A. 2002. - V.33. - №10. - P.1311-1315.

43. Stankiewicz В., Mastalerz M., Hof C. J., Bierstedt A., Flannery M.B., Derek E. G., Evershed B. Biodégradation of the chitin-protein complex in crustacean cuticle // Org. Geochem. 1998. - V.28. -№2. - P.67-76.

44. Антарктический криль: Справочник. / Под. ред. В.М. Быковой. М: ВНИРО, 2001.-207с.

45. Мезенова О.Я., Лысова А.С., Григорьева Е.В. Гаммарус балтийский -потенциальный источник получения хитина и хитозана // Мат. VII Международной конф. «Современные перспективы в исследовании хитина и хитозана». М.: ВНИРО, 2003. - С.32-33.

46. Феофилова Е.П. Применение хитозана в производстве пищевых продуктов приведено в «Хитин и хитозан. Получение, свойства и применение» / Под. ред. Скрябина К.Г., Вихоревой Г.А., Варламова В.П. -М: Наука, 2002. С.91-110.

47. Lipke P. N., Ovalle R. Cell Wall Architecture in Yeast: New Structure and New Challenges // Journal of Bacteriology. 1998. - V.180. - №15. - P.3735-3740.

48. Унрод В.И., Солодовник T.B. Хитин- и хитозансодержащиекомплексы из мицелиальных грибов: получение, свойства, применение // Биополимеры и клетка. 2001. - Т. 17. - №6. - С.526-533.

49. Тесленко А.Я., Воеводина И.Н., Галкин А.В., Львова Е.Б., Никифорова Т.А., Николаев СВ., Михайлов Б.В., Козлов В.П. Патент № 2043995. Россия, 1995.

50. Pochanavanich P., Suntornsuk W. Fungal chitosan production and its characterization // Letters in Applied Microbiology. 2002. - V.35. - №1. -P.17-21.

51. Hamodrakas S.J., Willis J.H., Iconomidou V.A. A structural model of the chitin-binding domain of cuticle proteins // Insect biochemistry and molecular biology. 2002. - V.32. - №11. - P.1577-1583.

52. Tellam R.L., Eisemann C. Chitin is only a minor component of the peritrophic matrix from larvae of Lucilia cuprina // Insect biochemistry and molecular biology. 2000. - V.30. - №12. - P.l 189-1201.

53. Шовен P. Физиология насекомых. Перевод с фран. В.В. Хвостовой / Под. ред. Е.Н. Павловского.-М: Ин. Лит-ры, 1953. 494с.

54. Тыщенко В.П. Физиология насекомых. Уч. Пособие.-М: Высш.шк, 1986.- 303с.

55. Харсун А.И. Биохимия насекомых. Кишинев: Карта, 1976. С.170-181.

56. Курченко В.П., Кукулянская Т.А., Новиков Д.А. Физико-химические и биологические свойства меланиновых пигментов // Мат. VII Международной конф. «Современные перспективы в исследовании хитина и хитозана». М.: ВНИРО, 2003. - С.23-31.

57. Бриттон Г. Биохимия природных пигментов. М: Мир, 1986. 436с.

58. Riley P.A. Melanin // Int. Biochem. Cell Biol. 1997. - V.29. - №11. -P.1235-1239.

59. Kayser H., Palivan C.G. Stable free radicals in insect cuticles: electron spin resonance spectroscopy reveals differences between melanization and sclerotization // Arch. Biochem. Biophys. 2006. - V.453. - №2. - P.l79-187.

60. Бышнева Л.Н., Сенчук В.В. Влияние меланинов на перекисноеокисление липидов // Прикладная биохимия и микробиология. 2001. -Т.37. - №1. - С.105-109.

61. Барабой В.А. Структура, биосинтез меланинов, их биологическая роль и перспективы применения // Успехи современной биологии. 2001. -Т.121. - №1. - С.36-46.

62. Горбунова Н.П. Альгология: Уч. пособие для вузов по спец. «Ботаника» М.: Высш.шк., 1991. - 256с.

63. Николаев В.А., Харвуд Д.М. Морфология, таксономия и система классификации центрических диатомовых водорослей. СПб.: Наука, 2002.- 118с.

64. Ерофеев Н.С. Основы биологии дробянок, водорослей, грибов и лишайников: Уч. пособие. Саранск: Из-во Мордов. ун-та, 2001. - 172с.

65. Place A.R. The biochemical basis and ecological significance of chitin digestion // In: Chitin Enzymology / Ed. R.A.A. Muzzarelli. Atec, Italy, 1996. -V.2. P.39-54.

66. Немцев СВ., Зуева О.Ю., Исмаилов В .Я., Варламов В.П. Кутикула жуков станет новым источником хитина и хитозана // Мат. VII конф. «Современные перспективы в исследовании хитина и хитозана».-М: ВНИРО, 2003. С.36-42.

67. Немцев C.B., Зуева О.Ю., Хисматуллин Р.Г., Хисматуллин М.Р., Лариков В.В., Варламов В.П. Хитозан из подмора пчел новый продукт пчел // Пчеловодство. - 2001. - №5. - С.50-51.

68. Немцев C.B., Зуева О.Ю., Хисматуллин М.Р., Албулов А.И., Варламов В.П. Получение хитина и хитозана из медоносных пчел // Прикладная биохимия и микробиология. 2004. - Т.40. - №1. - С.46-50.

69. Быков В.П., Быкова В.М., Головкова Г. Н. Хитин и хитозан из биомассы личинок мух. // Тез. 4-ой Всерос. конф. "Производство и применение хитина и хитозана". М: ВНИРО, 1995.- С. 10-12.

70. Шыш С.И., Винокурова Г.В. Способ получения хитина и способ получения хитозана. Патент № 2139887. Россия, 1996.

71. Кузин Б.А., Бабиевский К.К., Прохоренко Г.К., Кузин А.Б. Способ получения хитозана. Патент № 2067588. Россия, 1996.

72. Struszczyk М.Н., Hahlweg R., Peter M.G. Comparative analysis of chitosans from Insects and Crustacean // In: Advan.Chitin Sci. / Ed. M.G. Peter, A. Domard, R.A.A. Muzzarelli. Potsdam. Germany, 2000. V4. - P.40-49.

73. Boman H.G. Peptide antibiotics: holy or heretic grails of innate immunity? // Scand. J Immunol. 1996. - V.43. - №5. - P.475-482.

74. Holak T.A., Engstrom A., Kraulis P.J., Lindeberg G. The solution conformation of the antibacterial peptide cecropin A: a nuclear magnetic resonance and dynamical simulated annealing study // Biochemistry. 1988. - V.27. - №20. -P.7620-7629.

75. Boman H.G., Hultmark D. Cell-free immunity in insects // Annu. Rev. Microbiol. 1987. - V.41. - P.103-126.

76. Boman H.G., Faye I., Gudmundsson G.H., Lee J.Y., Lidholm D.A. Cell-free immunity in Cecropia. A model system for antibacterial proteins // Eur. J. Biochem. -1991. V.201. -№1. - P.23-31.

77. Vizioli J., Salzet M. Antimicrobial peptides versus parasitic infections? // Trends Parasitol. 2002. - V.18. - №11. - P.475-486.

78. Cociancich S., Dupont A., Hegy G., Lanot R. Novel inducible antibacterial peptides from a hemipteran insect, the sap-sucking bug Pyrrhocoris apterus II Biochem. J. 1994. - V.300. - №2. - 561-515.

79. Fehlbaum P., Bulet P. Structure-activity analysis of thanatin, a 21-residue inducible insect defense peptide with sequence homology to frog skin antimicrobial peptides // Proc. Natl. Acad. Sci. USA.- 1996. V.93. - №3. - P.1221-1225.

80. Bulet P., Stocklin R. Insect antimicrobial peptides: structures, properties and gene regulation // Protein Pept. Lett. 2005. - V.12. - №1. - P.3-11.

81. Hultmark D. Insect immunology. Ancient relationships // Nature; 1994. -V.367.-№6459.-P.l 16-127.

82. Otvos L. Antibacterial peptides isolated from insects // J. Pept. Sci. -2000. V.6.-№10.-P.497-511.

83. Jovanovic D., Skodric-Trifunovic V., Markovic-Denic L., Stevic R. Clinical and epidemiological evaluation of tuberculosis // Int. J Tuberc. Lung Dis. 2007. -V. 11. -№6. - P.647-651.

84. Goicoechea H.C., Olivieri A.C. Simultaneous determination of rifampicin, isoniazid and pyrazinamide in tablet preparations by multivariate spectrophotometric calibration // J. Pharm. Biomedical Analysis. 1999. - V.20. -№4. - P.681-686.

85. Andries K., Verhasselt P, Guillemont J, Gohlmann HW. A diaiylquinoline drug active on the ATP synthase of Mycobacterium tuberculosis II Science. 2005. - V.307. - №5707. - P.223-227.

86. Jarosz J. Simultaneous induction of protective immunity and selective synthesis of hemolymph lysozyme protein in larvae of Galleria mellonella И Biol. Zbl. 1979. - V.98. - №4 - P.459-471.

87. Dunphy G.B. Virulence of Candida albicans mytants toward larval Galleria mellonella// Can. J. Microbiol. 2003. - V.49. - №8. - P.514-524.

88. Гилмур Д. Метаболизм насекомых. М: Мир, 1968. 229с.

89. Хоменко А.Г., Авербах М.М., Александрова А.В. Туберкулез органов дыхания. М.: Медицина. 1998. 189с.

90. Анненков Г.А. «Липазная концепция» лечения туберкулеза человека. М.: Адамант.- 2006. 52с.

91. Mankiewicz Е. The action of lipidolytic enzymes of larvae of Galleria mellonella on virulent Mycobacterium tuberculosis II Canad. J. Med. Sciences. -1952. V.76. - P.295-329.

92. Wlodawer P., Branska J. Lipolytic activity of the fat body of the waxmoth larvae // Acta Bioch. Polonica. 1965.-V.12.-№l.-P.23-47.

93. Wlodawer P., Lagwinska E., Baranska J. Esterification of fatty acids in the wax moth haemolymph and its possible role in lipid transport. // J. Insect Physiol. 1966. V.12. - №5. - P.547-560.

94. Анненков Г.А., Клепиков H.H., Мартынова Л.П., Пузанов В.А. О возможности применения природных липаз и эстераз для ингибирования Mycobacterium tuberculosis II Проблемы туберкулеза и болезней легких. -2004. №6. - С.52-56.

95. Raetz C.R., Reynolds С.М., Trent M.S., Bishop R.E. Lipid A Modification Systems in Gram-negative bacteria. // Annu. Rev. Biochem. 2007. - V.76. -P.295-329.

96. Ehrt S, Schnappinger D. Mycobacterium tuberculosis virulence: lipids inside and out // Nat. Med. 2007. - V.13. - №.3. - P.284-295.

97. Lim S.H., Hudson S.M. Review of chitosan and its derivatives as antimicrobial agents and their uses as textile chemicals // J. Macromol. Sci. 2003. -V.43. - №2. - P.223-269.

98. Liu X.F., Guan Y.L., Yang D.Z., Li Z., Yao K.D. Antibacterial action of chitosan and carboxymethylated chitosan // J. Appl. Polym. Sci. 2001. - V.79. - №9. -P. 1324-1335.

99. Smith J., Wood E., Dornish M. Effect of chitosan on epithelial cell tightjunctions // Pharmaceutical Research. 2004. - V.21. - №1. - P.43-49.

100. Muzzarelli R.A.A., Muzzarelli C, Tarsi R., Miliani M., Gabbanelli F.,Cartolari M. Fungistatic activity of modified chitosans against Saprolegnia parasitica II Biomacromolecules. 2001. - V.2. - № 1. - P. 165-169.

101. Senel S., Ikinci G., Kas S., Yousefi-Rad A., Sargon M.F., Hincal A.A. Chitosan films and hydrogels of chlorhexidine gluconate for oral mucosal delivery // Int. J. Pharm. 2000. - V.193. - №2. - P.197-203.

102. Sosa M.A., Fazely F., Koch J.A., Vercellotti S.V., Ruprecht R.M N-carboxymethylchitosan-N, O-sulfate as an anti-HIV-1 agent // Biochem. Biophys.Res. Commun. -1991. V. 174. - №2. - P.489-496.

103. Roller S., Covill N. The antifungal properties of chitosan in laboratory media and apple juice // Int. J. Food. Microbiol. 1999. - V.47. - №1-2. - P.67-77.

104. Rabea E.I., Badawy M. E.-T., Stevens C.V., Smagghe G., Steurbaut W. Chitosan as antimicrobial agent: applications and mode of action // Biomacromolecules. 2003. - V.4. - №6. - P.1457-1465.

105. Chung Y.C., Wang H.L., Chen Y.M., Li S.L. Effect of abiotic factors on the antibacterial activity of chitosan against waterborne pathogens // Bioresour. Technol. 2003. - V.88. - №3. - P.179-184.

106. No H.K., Park N.Y., Lee S.H., Meyers S.P. Antibacterial activity of chitosans and chitosan oligomers with different molecular weights // Int. J. Food. Microbiol.-2002.-V.74.-№l-2.-P.65-72.

107. Alsarra I.A., Betigeri S.S., Zhang H., Evans B.A., Neau S.H. Molecular weight and degree of deacetylation effects on lipase-loaded chitosan bead characteristics // Biomaterials. 2002. - V.23. - №17. - P.3637-3644.

108. Sano H., Shibasaki K., Matsukubo T., Takaesu Y. Effect of molecular mass and degree of deacetylation of chitosan on adsorption of Streptococcus sobrinus 6715 to saliva treated hydroxyapatite // Bull. Tokyo Dent. Coll. 2002. - V.43. - №2. -P.75-82.

109. Kumar A.B.V., Varadaraj M.C., Lalitha R.G., Tharanathan R.N. Low molecular weight chitosans: preparation with the aid of papain and characterization //

110. Biochim. Biophys. Acta. 2004. - V.1670. - №1. - P.137-146.

111. Feofilova E.P., Mar'in A.P., Tereshina V.M., Nemsev D.M., Kozlov V.P. Role of components of cell walls in metal uptake by Aspergillus niger II Res. Environ. Biotech.-2000.-V.3.-P.61-69

112. Cuero R.G. Antimicrobial action of exogenous chitosan // EXS. 1999. -V.87.-P.315-333.

113. Sorlier P., Denuziere A., Viton C, Domard A. Relation between the degree of acetylation and electrostatic properties of chitin and chitosan // Biomacromolecules. 2001. - V.2. - № 3. - P.765-772.

114. Tsai G.-J., Hwang S.-P. In vitro and in vivo antibacterial activity of shrimp chitosan against some intestinal bacteria // Fisheries Sci. 2004. - V.70. - № 5 - P.675-681.

115. MacLaughlin F.C., Mumper R.J., Wang J., Tagliaferri J.M., Gill I.,Hinchcliffe M., Rolland A.P. Chitosan and depolimerized chitosan oligomers as condensing carriers for in vivo plasmid delivery // J. Control. Release. 1998. -V.56. - №1-3. - P.259-272.

116. Tang Z.H., Hou C.L., Chen Q.Q. Experimental study on bacteriostatic of chitosan and sodium hyaluronate // Zhongguo. Xiu. Fu. Chong. Jian. Wai. Ke. Za.

117. Zhi. 2002. - V.l 6. - №4. - P.259-261.

118. Felt O., Carrel A., Baehni P., Buri P., Gurny R. Chitosan as tear substitute: a wetting agent endowed with antimicrobial efficacy // J. Ocul. Pharmacol. Ther. -2000. V.16. - №3. - P.261-270.

119. Jia Z., Shen D., Xu W. Synthesis and antibacterial activities of quaternary ammonium salt of chitosan // Carbohydr. Res. 2001. - V.333. - №1. - P. 1-6.

120. Meyer H., Butte W., Schlaak M. Influence of chitosan on bacterial growth// Chitosan in Pharmacy and Chemistry. Eds.: R.A.A. Muzzarelli, C. Muzzarelli. Atec.Italy.2002.-P. 157-163.

121. Vaara M. Agents that increase the permeability of the outer membrane // Microbiol. Rev. 1992. - V.56. - № 3. - P.395-411.

122. Savard Т., Beaulieu C, Boucher Г, Champagne C.P. Antimicrobial action of hydrolyzed chitosan against spoilage yeasts and lactic acid bacteria of fermented vegetables //J. Food Prot. 2002. - V.65. - №5. - P.828-833.

123. Kaambre Т., Tougu V., Kaambre P., Vija H., Sikk P. Hydrolysis of emulsified mixtures of triacylglycerols by pancreatic lipase // Biochim Biophys Acta. 1999. - V.12. - №1. - P. 97-106.

124. Hostacka A. Characteristics of strains of Acinetobacter spp. after culture in various media //.Epidemiol Mikrobiol Imunol. 2003. - V.52. - №2. - P.72-75.

125. Wang T., Chen T. Lipase prodaction by Acinetobacter radioresistens in a batch fill-and-draw culture // Appl. Biochem. Biotechnol. 2005. - V.73. - №2-3. -P. 183-194.

126. Dupuis C., Corre C. Lipase and Esterase Activities of Propionibacterium freudenreichii subsp. Freudenreichii II Appl Environ Microbiol. 1993. - V.59. -№12. - P.4004-4009.

127. Allen D.K., Tao B.Y. Kinetic characterization of enhanced lipase activity on oil bodies // Bioprocess Biosyst Eng. 2007. - V.30. - №2. - P. 1344-1350.

128. Hasan F., Shah A., Hameed A. Purification and characterization of a mesophilic lipase from Bacillus subtilis FH5 stable at high temperature and pH // Acta Biol. Hung. 2007. - V.58. - №1. - P.l 15-132.

129. Shu Z.Y., Yang J.K., Yan J.K. Purification and characterization of a lipase from Aspergillus niger F044 // Sheng Wu Gong Cheng Xue Bao. 2007. - V.23. -№1. - P.96-100.

130. Aloulou A, Rodriguez J A, Puccinelli D, Mouz N, Leclaire J, Leblond Y, Carriere F. Purification and biochemical characterization of the LIP2 lipase from Yarrowia lipolytica II Biochim. Biophys. Acta. 2007. - V. 1771. - №2. - P.28-37.

131. Nawani N, Khurana J, Kaur J. A thermostable lipolytic enzyme from a thermophilic Bacillus sp.: purification and characterization I I Mol. Cell Biochem. -2006. -V.290.- №1-2. -P.17-22.

132. Fujino S, Akiyama D, Akaboshi S, Fujita T, Watanabe Y, Tamai Y. Purification and characterization of phospholipase B from Candida utilis. II Biosci. Biotechnol. Biochem. 2006. - V.70. - №2. - P.377-386.

133. Sarda L, Desnuelle P. Action of pancreatic lipase on emulsified esters. //

134. Biochim.Biophys. Acta. 1993. - V.37. - №7. - P. 1608-1633.

135. Brady L., Brzozowski A.M., Derewenda L.S., Dodson E., Dodson G.A serine protease triad forms the catalytic centre of a triacylglycerol lipase. // Nature. 1990. - V.343. - №34. - P.767-770.

136. Van Tilbeurgh H., Sarda L., Verger R., Cambillau C. Structure of the pancreatic lipase-procolipase complex. // Nature. 1992. - V.359. - №6. - P. 159162.

137. Derewenda U., Brzozowski A.M., Lawson D.M., Derewenda Z.S. Catalysis at the Interface: The anatomy of a conformational change in a triglyceride lipase. //Biochemistry. 1992. - V.31. - №5. - P.1532-1541.

138. Brzozowski A.M., Derewenda U., Derewenda Z.S., Dodson G.G. A model for interfacial activation in lipases from the structure of a fungal lipase-inhibitor complex. //Nature. 1991. - V.351. - №6326. - P.491-494.

139. Noble M.E., Cleasby A., Johnson L.N., Frenken L.G.J., Egmond M.R. The crystal structure of triacylglycerol lipase from Pseudomonas glumae reveals a partially redundant catalytic aspartate. // FEBS Lett. 1993. - V.331.- №1-2. P.123-128.

140. Uppenberg J., Patkar S., Bergfors T., Jones T.A. Crystallization and preliminary X-ray studies of lipase from Candida Antarctica II Mol. Biol. 1994.- V.235. №2. - P.790-792.

141. Jaeger K.E. Ransac S., Koch H.B., Ferrato F. Dijkstra B.W. Topological characterization and modeling of the 3D structure of lipase from Pseudomonas aeruginosa II FEBS Lett. 1993. - V.332. - №1-2. - P.143-149.

142. Nardini M., Lang D.A., Liebeton K., Jaeger K.E., Dijkstr B.W. Crystal structure of Pseudomonas aeruginosa lipase in the open conformation. // J. Biol. Chem. 2000. - V.275. -№40. - P.31219-31225.

143. Hjorth A., Carriere F., Cudrey C., Woldike H., Boel E., Lawson D.M., Verger R. A structural domain (the lid) found in pancreatic lipases is absent in the guinea pig (phospho) lipase // Biochemistry. 1993. - V.32. -№18. - P.4702-4707.

144. Jennens M.L., Lowe M.E. A surface loop covering the active site of human pancreatic lipase influences interfacial activation and lipid binding // J. Biol., Chem. 1994. - V.269. - №41. - P.25470-25474.

145. Mensink R.P., Katan M.B. Effect of dietary trans fatty acids on the high-density and low-density lipoprotein cholesterol levels in healthy subjects // Eng. J. Merd. 1990. - V.323. - №7. - P.439-445.

146. Rousseau D., Marangoni A.G. Tailoring the textural attributes of butter fat/canola oil blends via Rhizopus arrhizus lipase-calalyzed iterification. I. Compositional modification 11 J. Agric. Food. Chem. 1998. - V.46. - №12. -P.2368-2374.

147. Forssell P., Kervinen R., Lappi M., Linko P. Effect of enzymatic iterefication on the melting point of tallow-rapeseed oil (LEAR) mixture // J. Am. Oil. Chem. Soc. 1992. - V.69. - №1. - P.126-129.

148. Basheer S., Mogi K., Nakajima M. Interesterification kinetics of triglycerides and fatty acids with modified lipase in n-hexane // J.Am. Oil. Chem. Soc. 1995. - V.72. - №3. - P.511-518.

149. Mohamed H.M., Bloomer S., Hammadi K. Modification of fats by lipase interesterification. Changes in triglyceride structure // Fat. Sci. Technol. 1993. -V.95. - №2. - P.428-431.

150. Bracco U. Effect of triglyceride structure on fat absorption // J. Am. Clin. Nutr. 1994. - V.60. - №6. - P. 1002-1009.

151. Kennedy J.P. Srtructured lipids: fats for the future // Food Technol. 1991. -V.45. - №2. - P.76-83.

152. Schmid U. Highly selective synthesis of l,3-olcoyl-2 palmitoylglycerol by lipase catalysis // Biotechnol. Bioeng. 1999. - V.64. - №6. - P.678-684.

153. Quinlan P., Moore S. Modification of triglycerides by lipases: processtechnology and its application to the production of nutritionally improved fats // INFORM 1990. - V.4. - P.580-585.

154. Haraldsson G.G. Using biotechnology to modify marine lipids // INFORM. 1992. - V.3. - P.626-629.

155. Sridhar R., Lakshminarayana G., Incorporation of eicosapentaenoic and docosahexacnoic acids into groundnut oil by lipase-catalyzed ester interchange // J.Am. Oil. Chem. Soc. 1992. - V.69. -№11.- P. 1041-1044.

156. Diks R.M.M., Lee M.J. Production of very low saturate oil based on the specificity of Geotrichum candidum lipase // J. Am. Oil. Chem. Soc. 1999. -V.76. - P.455-462.

157. Valfson. E.N. Lipases: their structure, biochemistry and application. Cambridge: Cambridge University Press. 1994, P. 271-286.

158. Чешкова A.B., Лебедева В.И., Мельников Б.Н. Исследование деструкции воскообразных веществ хлопка под действием ферментов // Химия и химическая технология. 1995.- Т.38. - Вып. 4-5. - с.91-93.

159. Tanaka Y., Hirano J% Funada Т. Concentration of docosahexaenoic acid by gliceride by hydrolysis of fish oil with Candida cylindracea lipase // J. Am. Oil. Chem. Soc. 1992. - V.69. - P.1210-1214.

160. Shimada Y., Sugihaira A., Nakano H., Xuramoto Т., Nagao T. Purification of docosahexaenoic acid by selective esterification of fatty acids from tuna oil with Rhizopus delemar lipase // J. Am. Oil. Chem. Soc. 1997. - V.74. - P.97-101.

161. Monteiro J.B., Nascimento M.G., Ninow J.L. Lipase-catalyzed synthesis of monoacylglycerol in homogeneous system // Biotechnol. Lett. 2003. - V.25. -№8. - P.641-644.

162. Bomscheuer U., Stamatis H., Xenakis A.T., Yamane T. A comparison of different strategies for lipase-catalyzed synthesis of partial glycerides //

163. Biotechnol. Lett. 1994. - V.16. - P.679-702.

164. Van Ee J.H., Misset O., Baas E.J. Enzymes in detergency. New York: Marcel Dekker press. 1997. P.93-106.

165. Boel R., Christensen T. Novo Nordisk AS, USA Patent 5536661,1996

166. Fujita Y., Awaji H., Matsukura M., Hata K., Shimoto H. Recent advances in enzymic pitch control // Tappi J. 1992. - V.75. - P. 117-122.

167. Lankisch P.G. Enzyme treatment of exocrine pancreatic insufficiency in chronic pancreatitis // Digestion. 1993. - V.54. - №2. - P.21-29.

168. Wickler-Planquart C., Canaan S., Riviere M., Dupuis L. Expression in insect cells and purification of a catalytically active recombinant human gastric lipase // Protein Eng. 1996.-V.9. - №12. - P. 1225-1232.

169. Suzuki A., Mizumoto A., Sarr M.G., Dimagno E.P. Bacterial lipase and high-fat diets in canine exocrine pancreatic insufficiency: a new therapy of steatorrhea. // Gastroenterology. 1997. - V.l 12. №6. - P.2048-2055.

170. Zhi J., Melia G., Kosstwardy S.G., Min B. The influence of orlistat on the pharmacokinetics and pharmacodynamics of glyburidc in healthy volunteers // J. Clin. Pharmacol. 1995. - V.35. - №5. - P.521-525.

171. Schwizer W., Asal K., Kreiss C., Mettraux C., Burovicka J. Role of lipase in the regulation of upper gastrointestinal function in humans // Am. J. Physiol.1997. V.273. - №3. - P.612-620.

172. Hildebrand P., Petrig C., Burckhardt P., Ketterer S. Hydrolysis of dietary fat by pancreatic lipase stimulates cholecystokinin release // Gastroenterology.1998. V.l 14. - №1. - P.l 123-1129.

173. Finer N. Drug treatments for obesity // Lancet. 2007. - V.6. - №369. - P.71-77.

174. Souri E., Jalalizadeh H., Kebriaee-Zadeh A., Zadehvakili B. HPLC analysis of orlistat and its application to drug quality control studies // Chem. Pharm. Bull. -2007. V.55. - №2. - P.251-254.

175. Singh A, Sarkar SR, Gaber LW, Perazella MA. Acute oxalate nephropathy associated with orlistat, a gastrointestinal lipase inhibitor. // Am. J, Kidney Dis.2007.-V.49.-№1.- 153-157.

176. Padwal R.S., Majumdar S.R. Drug treatments for obesity: orlistat, sibutramine, and rimonabant. // Lancet. 2007. - V.6. - №369. - P.71-77.

177. Gao C, Whitcombe M.J., Vulfson E.N. Enzymatic synthesis of dimeric and trimeric sugar-fatty acid esters // Enzym. Microb. Technol. 1999. - V.25. -№2. - P.264-270.

178. Riva S. Enzymatic modification of sugar moieties of natural glycosides // J. Mol. Cat. B; Enzymatic. 2002. - V. 19. - №3. - P.43-54

179. Colombo D., Ronchetii F., Seala A., Toma L. Bioactive glycoglycerolipid analogues: an expeditious enzymatic approach to mono- and diesters of 2-0-(3-D-galactosylglycerol // Tetrahedron: Asymmetry. 1998. - V.9. - P.2113-2119.

180. Nishino H., Colombo D., Ronchetii F., Scala A., Toma L. Chemoenzymatic synthesis and antitumor promoting activity of 6- and 3-esters of 2-0- P -D-Glycosylglycerol // Bioorg. Med. Chem. 1999. - V.7. - P. 18671871.

181. Bousquet M.P., Willemot R.M., Monsan P., Boures E. Lipase-catalyzed a-butylglucoside lactate synthesis in organic solvent for dermo-cosmetic application // J. Biotechnol. 1999. - V.68. - P.61-69.

182. Manjon A., lborra J.L., Arocas A. Short chain flavour ester synthesis by immobilized lipase in organic media // Biotechnol. Lett. 1991. - V.13. - №3 -P.339-344.

183. Claon P.A., Akoh C.C. Effect of reaction parameters on sp435 lipase-catalyzed synthesis of citronellyl acetate in organic solvent // Enzyme Microb. Technol. 1994. - V.16. - P.835-838.

184. Buchalska E., Plenkicwiez J. Synthesis of optically active aminooxy alcohols. // J. Mol.Cat. B.: Enzymatic.-2001.-V.l 1. №3. - P.255-263.

185. Hegemann K., Schimanski H., Haweler U., Haufe G. Selectivity of C. rugosa lipase in. simultaneous separation of skeletal isomers, dcsymmetrization, and kinetic racemate cleavage of 9 oxobicyclononanediols // Telrahedron Lett. 2003.- V.44. Р.2225-2229.

186. Ghanem A., Aboul-Enein H.Y. Application of lipase in kinetic resolution! of racemates // Chirality. 2005. - V.l7. - № 1. - P. 1-15.

187. Dordick J.S. Enzymatic and chemoenzymatic approaches to polymer synthesis //Trends. Biotechnol. 1992. - V.10. - P.287-293.

188. Martin B.D., Ampofo S.A., Linhardt R.J., Dordick F.S. Biocatalytic synthesis of sugar containing poly(acrylate)-based hydrogeles // Macromolecules.- 1992.-V.25.-P.7081-7085.

189. Ильина A.B., Татаринова Н.Ю., Тихонов B.E., Варламов В.П. // Прикл. биохимия и микробиология. 2000. - Т.36. - №2. - С. 173-177.

190. Ilyina А.V., Tatarinova N.Yu., Varlamov V.P. The preparation of low-molecular-weight chitosan using chitinolytic complex from Streptomyces kurssanoviill Process Biochemistry. 1999. - V.34. - № 9. - P.875-878.

191. Ильина A.B., Ткачева Ю.В., Варламов В.П. Деполимеризация высокомолекулярного хитозана ферментным препаратом Целловиридин Г20х. //Прикл. биохимия и микробиология. -2002. -Т.37. -№1. -С.132-135.

192. Hung Т.Н., Giridhaz R., Chiou S.H., Wen-Teng W. Binary immobilization of Candida rugosa lipase on chitosan // J. Mol. Cat. B: Enzymatic. 2003. - V.26. -№1. - P.69-78.

193. Kido Y., Hiramoto S., Murao M., Horio Y., Miyazaki Т., Kodama Т., Nakabou Y. Epsilon-polylysine inhibits pancreatic lipase activity and suppresses postprandial hypertriacylglyceridemia in rats // J. Nutr. 2003 - V.133. - №1. -P.l 887-1891.

194. Келети Т. Основы ферментативной кинетики. М.: Мир, 1994 С.183-188.

195. Yakovlev G.I., Mitkevich V.A., Struminskaya N. К., Varlamov V.P., Makarov A.A. Low molecular weigh chitosan is an efficient inhibitor of ribonucleases.// Biochem. Biophys. Res. Commun. 2007 - V.357. - №3. -P.584-588.

196. Spector T. Refinement of the coomassie blue method of protein quantitation. // Anal. Biochem. 1978. - V.86. - №1. - P. 141-146.

197. Wang W., Bo S., Li S., Qin W. Determination of the Mark-Houwink equation for chitosans with different degree of deacetylation // Int. J. Biol. Macromol. -1991. V.13. - №5. - P.281-285.

198. Твердохлебова И.И. Конформация макромолекул (вискозиметрический метод оценки). М.: Химия, 1981. - 281с.

199. Laemmli U.K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. // Nature. 1970. - V.227. -№7. - P.680-685.

200. Быкова B.M., Немцев C.B. «Хитин и хитозан. Получение, свойства и применение» / Под. ред. Скрябина К.Г., Вихоревой Г.А., Варламова В.П.-М: Наука, 2002. С.7-23.

201. Percot A., Viton С, Domard A. Optimization of chitin extraction from shrimp shells // Biomacromolecules. 2003. - V.4. - №1. - P. 12-18.

202. Неклюдов А.Д., Иванкин A.H., Бердутина A.B. Свойства и применение белковых гидролизатов // Прикладная биохимия и микробиология. 2000. -Т.36. - №5 - С.525-534.

203. Лях СП. Микробный меланиногенез и его функции. М.: Наука. 1981. 274с.

204. Brooks R.E., Moore S.B. Alkaline hydrogen peroxide bleaching of cellulose // Cellulose. 2000. - V.7. - №3. - P.263-286.

205. Немцев С.В., Ильина С.М., Шинкарев С.М., Албулов А.И., Варламов В.П. Получение низкомолекулярного водорастворимого хитозана // Биотехнология.- 2001.- №6.-С.37-42.

206. Vachoud L., Zydowicz N., Domard A. Physicochemical behaviour of chitin gels // Carbohydrate Research. 2000. - V.326. - №4. - P.295-304.

207. Chatelet C, Damour O., Domard A. Influence of the degree of acetylation on some biological properties of chitosan films // Biomaterials. 2001. - V.22.-№3.-Р.261-268.

208. Chang К. L., Tsai G., Lee J., Fu W.-R. Heterogeneous N-deacetylation of chitin in alkaline solution // Carbohydrate Research. 1997. - V.303. - №3. -P.327-332.

209. Yang B.Y., Montgomery R. Degree of acetylation of heteropolysaccharides // Carbohydrate Research. 2000. - V.323. - №4. -P.156-162.

210. Стояченко И.А., Варламов В.П. Очистка и некоторые свойства хитиназ из Streptomyces kurssanovii II Биотехнология. 1993. - №2. - С.29-36.

211. Новиков В.Ю., Мухин В.А. Деполимеризация хитозана под действием ферментов гепатопакреаса камчатского краба Paralithodes camtschaticus // Прикладная биохимия и микробиология. 2003. - Т.39. - №5. - С.530-535.

212. Azarkan М., Moussaoui A., Wuytswinkel D., Dehon G., Looze Y. Fractionation and purification of the enzymes stored in the latex of Carica papaya II Journal of Chromatography B. 2003. - V.790. - №1. - P.229-238.

213. Cox R.A., Cook G.M. Growth regulation in the mycobacterial cell // Curr. Mol. Med. 2007. - V.7. - №3. - P.231-245.

214. Chung Y.C., Su Y.P., Chen C.C., Jia G., Wang H.L., Wu J.C., Lin J.G.Relationship between antibacterial activity of chitosan and surface characteristics ofcell wall // Acta. Pharmacol. Sin. 2004. - V.25. - №7. - P.932-939.

215. Кочкина 3.M., Поспешный Г., Чирков С.Н. // Прикладная биохимия и микробиология . 1996. - Т.32. - №.2. - С.247-250.

216. Akira I. // Chitin Handbook / Ed. R.A.A. Muzzarelli, M.G. Grottammare: Atec, 1997. P.l03—108.

217. Mak P., Chmiel D., Gasek G.J. Antibacterial peptides of the moth Galleriamellonella // Acta Biohim. Pol. 2001. - V.48. - №4. - P.l 191-1195.

218. Hoffmann D., Hultmark D., Boman H.G. Insect immunity: Galleria mellonella and other Lepidoptera have cecropin-p9-like factors active against gram negative bacteria// Insect Biochem. -1981. V.l 1. - №5. - P.537-548.

219. Fröbius A.C., Kanost M.R., Götz P., Vilcinskas A. Isolation and characterization of novel inducible serine protease inhibitors from larval hemolymph of the greater wax moth Galleria mellonella // Eur. J. Biochem. 2000.- V.267. №7. - P.2046-2053.

220. Arias M.A., Sánchez A.M., Alonso-Fernández A., García-Río F. Atrial fibrillation, obesity, and obstructive sleep apnea // Arch. Intern. Med. 2007. -V.23. - №167. - P.1552-1553.

221. Sumiyoshi M., Kimura Y. Low molecular weight chitosan inhibits obesity induced by feeding a high-fat diet long-term in mice // J Pharm. Pharmacol. 2006.- V.58. №.2. - P.201-207.

222. Ni Mhurchu C., Dunshea-Mooij C.A., Bennett D., Rodgers A. Chitosan for overweight or obesity // Cochrane Database Syst. Rev. 2005. - V.20. - №3. -P.5563-5669.

223. Kotsovolou S., Chiou A., Vergu R. Bis-2-oxo amide triacylglycerol analogues: a novel class of potent human gastric lipase inhibitors. // J. Org. Chem.- 2001. V.66. - №3. - P.962-967.

224. Zhao H.L., Kim Y.S. Determination of the kinetic properties of platycodin D for the inhibition of pancreatic lipase using a 1,2-diglyceride-based colorimetric assay. // Arch. Pharm. Res. 2004. - V.27. - №3. - P.968-972.

225. Han L., Kimura Y., Kawashima M. Anti-obesity effects in rodents of dietary teasaponin, a lipase inhibitor // Int. J. Obes. Relat. Metab. Disord. 2001. - V.25. -№3. - P. 1459-1464.

226. Eisenreich W., Kupfer E., Stohler P. Biosynthetic origin of a branched chain analogue of the lipase inhibitor, lipstatin // J. Med. Chem. 2001. - V.46. - №19. -P.4209-4212.

227. Drent M.L. Larsson I., William-Olsson T. Orlistat a lipase inhibitor, in thetreatment of human obesity: a multiple dose study I I Int. J. Obes. Relat. Metab. Disord. 1995.-V.19. - №4. - P.221-226.

228. Tsujita T., Takaichi H., Takaku T., Hiraki J. Inhibition of lipase activities by basic polysaccharide // J Lipid Res. 2007. - V.48. - №.2. - P.358-365.

229. Pernas M.A., Lopez C., Rua M.L. Influence of the conformational flexibility on the kinetics and dimerisation process of two Candida rugosa lipase isoenzymes //FEBS Letters. 2001. - V.501. - №1. - P.87-91.

230. Pereira E.B., Castro H.F., De Moraes F.F. Kinetic studies of lipase from Candida rugosa: a comparative study between free and immobilized enzyme onto porous chitosan beads // Appl. Biochem. Biotechnol. 2001. - V.93. - №3. -P.739-752.

231. Grochulski P., Li Y., Schrag I. Two conformational states of Candida rugosa lipase // Protein Science. 1994. - V.3. - №1. - P.82-91.

232. Rossner S., Sjostrom L., Noack R. Weight loss, weight maintenance, and improved cardiovascular risk factors after 2 years treatment with orlistat for obesity // Obesity Reseach. 2000. - V. - 8. - № 1. - P.49-61.

233. Pace D., Blother S., Guerciolini R. Short-term orlistat treatment does not affect mineral balance and bone turnover in obese men // J. Nutr. 2001. - V.131. -№6. - P. 1694-1699.

Информация о работе

Останина, Екатерина Сергеевна
кандидата биологических наук
Щёлково, 2007
ВАК 03.00.23

Диссертация

Технология переработки восковой моли, изучение противотуберкулезных свойств хитозана и взаимодействия с липолитическими ферментами - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы