Разработка биотехнологических процессов получения биологически активных соединений из медоносных пчел и исследование их свойств

Зуева, Ольга Юрьевна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Разработка биотехнологических процессов получения биологически активных соединений из медоносных пчел и исследование их свойств
ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "Разработка биотехнологических процессов получения биологически активных соединений из медоносных пчел и исследование их свойств"

На правах рукописи

ЗУЕВА ОЛЬГА ЮРЬЕВНА

РАЗРАБОТКА БИОТЕХНОЛОГИЧЕСКИХ ПРОЦЕССОВ ПОЛУЧЕНИЯ БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫХ СОЕДИНЕНИЙ ИЗ МЕДОНОСНЫХ ПЧЕЛ И ИССЛЕДОВАНИЕ ИХ СВОЙСТВ

Специальность 03.00.23 - биотехнология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата технических наук

Щелково - 2004

Работа выполнена в Центре "Биоинженерия" РАН и во Всероссийском научно-исследовательском и технологическом институте биологической промышленности РАСХН

Научный руководитель:

доктор химическихнаук, профессор Валерий Петрович Варламов

Научный консультант:

доктор биологических наук Алексей Иванович Албулов

Официальные оппоненты:

доктор технических наук, профессор Любовь Вячеславовна Римарева

доктор технических наук, профессор Анна Юрьевна Кривова

Ведущая организация: Институт Элементоорганических соединений

им. А.Н. Несмеянова РАН

Защита диссертации состоится 16 декабря 2004 года в 10 часов на заседании диссертационного совета Д 006.069.01 во Всероссийском научно-исследовательском и технологическом институте биологической промышленности РАСХН по адресу: 141142, г. Щелково, Московская область, пос. Биокомбинат, ВНИТИБП.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ВНИТИБП РАСХН. Автореферат разослан 15 ноября 2004г.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук

Ю.Д. Фролов

Mf/S

twin 1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Полисахариды хитин и хитозан, а также их производные, считаются перспективными биоматериалами будущего. По некоторым оценкам, предполагаемый объем производства изделий из этих биополимеров в 2005г. составит около 2 млрд. долларов, из которых - 75% будет использовано в пищевой, косметической и фармацевтической промышленностях, биотехнологии, сельском хозяйстве. Уникальная структура макромолекулы хитозана и наличие положительного заряда обусловливают проявление ряда полезных свойств (антиоксидантные, радиопротекторные, иммуномодулирующие, пленкообразующие, противоопухолевые и др.), а также его низкую токсичность и способность к биодеградации.

Пигмент меланин представляет собой высокомолекулярный биополимер нерегулярной структуры, относящийся к классу конденсированных фенольных соединений, обусловливающих темную окраску покрова насекомых, волос и кожи человека, клеточной стенки грибов, растений и микроорганизмов. Наличие разнообразных функциональных групп, высокостабильных парамагнитных центров, сопряженной системы двойных связей в молекуле меланина обеспечивают разнообразное применение в качестве фото-, радиопротекторов и антиоксидантов в различных областях промышленности.

На сегодняшний день основным источником для получения хитина и хитозана являются панцири ракообразных (крабы, креветки, криль). Технология обработки включает постадийное удаление сопутствующих веществ с использованием химических и ферментативных способов обработки. Основными источниками для выделения меланинов являются чернильная сумка каракатицы микро- и макромицеты, грибы и дрожжи, темные

сорта винограда, проявляющие сходные биозащитные свойства с меланинами животного происхождения.

Расширение областей применения данных биополимеров обусловливает поиск новых перспективных и с хитина и меланина. Как известно, в

покровах насекомых до 50% занимает полимер хитин, наряду с белками придающий прочность экзоскелету. Вместе с хитином и белком в кутикуле присутствуют эумеланины, ковалентно связанные с остальными компонентами, обусловливающие окраску насекомого и некоторые защитные свойства. Таким образом, кутикулу насекомых можно рассматривать как источник различных биологически активных веществ, которые можно выделять в отдельном виде или в виде комплексов. Широкое развитие пчеловодства в нашей стране, наряду с традиционными пчелиными продуктами, позволяет использовать в качестве источника биологически активных веществ подмор пчел - медоносные пчелы Apis mellifera L, погибшие во время зимовки в улье. Согласно расчетам, сырьевая база подмора пчел может составить от 6 до 10 тыс. т в год.

Цель и задачи исследования. Цель настоящей работы - разработка биотехнологических процессов получения хитина, хитозана, меланина и их комплексов из подмора пчел, изучение некоторых физико-химических и биологических свойств данных полимеров.

Для достижения поставленной цели были определены основные задачи:

разработать технологию переработки подмора пчел с учетом особенностей сырья и определить оптимальные параметры на каждой стадии обработки;

согласно выбранным оптимальным параметрам осуществить комплексную переработку подмора пчел с получением интересующих биологически активных веществ;

♦ изучить основные физико-химические свойства промежуточных и основных продуктов, полученных на каждой стадии переработки;

исследовать некоторые биологические свойства низкомолекулярного хитозан-меланинового комплекса и водорастворимого меланина;

Научная новизна работы. Обосновано использование кутикулы пчел для получения различных биологически активных веществ. Разработана комплексная технологическая схема переработки пчелиного подмора с получением водорастворимого пигмента меланина и хитозан-меланинового комплекса различной молекулярной массы. Определены основные оптимальные параметры переработки пчелиного подмора на каждой стадии обработки. Учитывая особенность сырья, обоснована необходимость включения стадии обесцвечивания в технологию переработки с целью более полного удаления пигмента. При исследовании ферментативного гидролиза показано, что хитозан-меланиновый комплекс может гидролизоваться с использованием специфических и неспецифических ферментов. Показано, что, варьируя условиями ферментативного гидролиза, существует возможность получения хитозана с различной молекулярной массой и степенью деацетилирования в зависимости от целей использования. Исследованы антиоксидантные, генопротекторные и фотопротекторные свойства меланина и хитозан-меланинового комплекса из подмора пчел.

Впервые показана возможность использования кутикулы пчелы Apis mellifera L. для одновременного выделения меланиновых пигментов и комплекса хитозана с меланином с различной молекулярной массой и степенью деацетилирования.

Практическая значимость работы. Разработана комплексная схема переработки подмора пчел с получением таких биологически активных веществ, как водорастворимый меланин и хитозан-меланиновый комплекс. Предложены оптимальные параметры для осуществления каждой стадии. Разработана рецептура косметического крема на основе водорастворимого меланина и низкомолекулярного хитозана для обеспечения фотозащитного эффекта.

Апробация работы. Основные положения работы были представлены на VI Международной конференции "Новые достижения в исследовании хитина и

хитозана" (Москва—Щелково, 2001); I Международном конгрессе

"Биотехнология: состояние и перспективы развития" (Москва, 2002); VII Международной конференции "Современные перспективы в исследовании хитина и хитозана" (Санкт-Петербург—Репино, 2003); VII Asian apicultural association conference "Bees for New Asia" (Philippines, 2004); III Simposio Iberoamericano de Quitina (Cordoba, Espana, 2004).

Личный вклад соискателя. Исследование термических, антиоксидантных и генопротекторных свойств образцов проводили совместно с сотрудниками лаборатории прикладных проблем биохимии БГУ (Минск). Изучение фотопротекторных свойств биологически активных веществ в кремах осуществляли совместно с косметическим объединением "Свобода" (Москва). Остальные исследования выполнены автором самостоятельно.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 15 работ, в том числе 5 статей (одна статья в печати).

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, литературного обзора, раздела с обсуждением экспериментальных результатов, методической части, выводов, списка литературы и приложения. Работа изложена на 152 страницах машинописного текста, содержит 27 таблиц и 25 рисунков, библиографию из 158 наименований.

Автор выражает благодарность пчеловодческой компании «Тенториум» и лично президенту Хисматуллину Р.Г. за содействие в проведении работы.

2. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.1 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

В качестве сырья в работе использовали весенний подмор пчел,

предоставленный компанией ООО «Тенториум», г. Пермь. Объект исследования был получен из насекомых семейства медоносных пчел (Apis mellifera) среднерусской породы.

Схема оптимизации процессов переработки пчелиного подмора включала следующие стадии: водная экстракция, депротеинирование, обесцвечивание, деацетилирование, ферментативный гидролиз.

Измерение вязкости растворов хитозана проводили визкозиметрически. Рассчитывали величину характеристической вязкости ([т]]). Молекулярную массу хитозана (ММ) рассчитывали по уравнению Марка-Хаувинка.

Степень деацетилирования хитозана (СДА) определяли методом кондуктометрического титрования.

Определение суммарного количества белка проводили по методу Брэдфорда и с помощью аминокислотного анализа на анализаторе "Bюtroшk LC-3000" (Eppendorf-Biotronik, Германия).

С целью идентификации пигментов проводили качественные реакции с

Н202,КМп04,РеС1з.

Антиоксидантное действие меланинсодержащих продуктов исследовали на модельных системах перекисного окисления липидов и пероксидазного окисления аминобифенилов.

Способность меланиновых пигментов предотвращать повреждение ДНК фага X продуктами окисления бензидина определяли по изменению электрофоретической подвижности ДНК, модифицированной в процессе пероксидазного окисления аминобифенилов. Электрофорез ДНК вели в 0,9% агарозном геле в 0,1 М Трис-фосфатном буфере рН 8,0.

Фотопротекторные свойства полимеров исследовали при УФ-облучении образцов кремов, содержащих водорастворимый меланин и хитозан-меланиновый комплекс, в течение 24ч бактерицидным облучателем ОБН-150М.

2.2 ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

2.2.1. Разработка технологии получения биологически активных веществ

из подмора пчел

Содержание основных химических веществ в подморе пчел, приведенное в таблице 1, значительно отличается от состава панцирей ракообразных и клеточной стенки грибов. Поэтому технология переработки подмора пчел была модифицирована нами с учетом особенностей сырья.

Таблица 1

Характеристика подмора пчел

Белок, % Меланиновые пигменты, % Хитин, % Влажность, % Зола, %

35-45 30-40 23-32 8-10 3-4

В подморе пчел содержится небольшое количество минеральных веществ (3-4%), что позволило нам исключить стадию деминерализации из технологической схемы. Но присутствие большого количества пигмента меланина (до 40%), ковалентно связанного в кутикуле с белком склеротином, оказывало значительное влияние на свойства хитина и хитозана и обусловливало включение дополнительной стадии обесцвечивания.

При разработке технологической схемы получения биологически активных веществ из подмора пчел нами была проведена оптимизация каждой стадии обработки с целью подбора оптимальных параметров процесса.

Водная экстракция (ВЭ)

На долю меланиновых пигментов в кутикуле насекомого приходится от 20 до 40% химического состава (табл.1). Для создания комплексной технологии переработки подмора пчел с получением веществ различной природы, нами предложено включение стадии водной экстракции с целью выделения водорастворимой фракции меланина при условии сохранения нативной структуры полимера. Для улучшения процесса экстракции использовали измельченный подмор пчел, что позволило улучшить доступ реагента к сырью, а также увеличить выход продукта. Оптимизацию стадии водной экстракции проводили при температурах 20-100°С и продолжительности процесса 0,5-2ч. Полученные экстракты после фильтрации высушивали лиофильно и определяли выход меланина и нерастворимого остатка, а также содержание белка в образцах по методу Брэдфорда.

Показано, что полученные нами водные экстракты представляют собой меланопротеиновые комплексы с содержанием 2,5-5% белка (рис.1).

водной экстракции при температуре:

Рис.1. Изменение содержания белка в меланопротеиновом комплексе в зависимости от

продолжительности процесса

0,5 1 1,5 2

Время, ч.

1-20°С, 2-40°С, 3-60°С, 4-80°С, 5-100°С.

Выход меланинпротеинового комплекса на данной стадии составил 3035%, а выход обработанного подмора пчел - 50-55%. Установлено, что при повышении температуры от 20 до 80°С содержание белка в образцах монотонно снижалось. При температуре 100°С наблюдалась обратная тенденция, обусловленная разрушением структуры меланина с образованием дополнительных амино-амидных групп в полимере, приводящих к завышению результатов по белку.

Оптимальными условиями стадии водной экстракции являются: температура - 80°С и продолжительность - 1ч, которые позволили получить меланопротеиновый комплекс в количестве до 30% близкий к природной структуре.

Для выделения хитина из подмора пчел осуществляли депротеинирование с целью определения оптимальных условий одновременного щелочного гидролиза мышечных и кутикулярных белков, а также меланиновых пигментов, связанных с белками и не удаляющимися на стадии водной экстракции. Нами были определены концентрационные, температурные и временные параметры процесса депротеинирования (рис. 2).

Повышение концентрации NaOH от 0,25 до 3% приводило к увеличению количества удаляемого белок-меланинового комплекса (БМК) от 7 до 25%.

Депротеинирование (ЦП)

Рис.2. Влияние концентрации щелочи (А), температуры (Б) и времени (В) депротеинирования на выход хитин-меланинового комплекса (1) (ХМК) и белок-меланинового комплекса (2) (БМК).

Дальнейшее увеличение концентрации NaOH в 5-6 раз приводило к снижению его выхода на 25%. Последнее, возможно, объясняется частичным щелочным гидролизом самого белка в комплексе. При повышении температуры выходы ХМК и БМК значительно уменьшались. Это можно объяснить частичным гидролизом и деацетилированием хитина в щелочных условиях, и частичным удалением меланинов из ХМК. При исследовании влияния продолжительности процесса установлено, что наибольший выход ХМК достигался в первые 20 минут (52%). Увеличение времени в 8-9 раз не только не приводило к возрастанию выхода, а, напротив, к уменьшению в среднем на 30%. Выход БМК достигал максимума (22%) при гидролизе в течение 2,5ч.

В результате оптимизации процесса депротеинирования нами были определены оптимальные условия: концентрация щелочи - 2-3%; температура - 40-50°С; продолжительность - 1-1,5ч.

Используя такие параметры гидролиза можно одновременно выделять ХМК и БМК с максимально возможным сохранением природной структуры и

минимальными побочными эффектами. Выход ХМК и БМК при данных условиях составлял 25-30% и 15-25%, соответственно.

Обесцвечивание (ОБ)

На стадии депротеинирования даже при использовании жестких условий (1>800С,Сшш>10%) нам удалось максимально освободиться лишь от 25% белков и пигментов. Цвет полученного ХМК варьировал от темно-коричневого до черного. Это обусловлено довольно прочной связью меланинов с полисахаридами и белками в кутикуле насекомого. Для получения неокрашенного хитина мы ввели в технологию переработки подмора дополнительную стадию обесцвечивания перекисью водорода. Под действием перекиси водорода в щелочных условиях протекают две конкурирующие реакции: обесцвечивание материла под влиянием пергидроксил радикала и свободного кислорода, образующегося при разложении перекиси. Оптимизацию обесцвечивания проводили в зависимости от концентрации реагента (табл.2), температуры (табл.3) и продолжительности (табл.4). Определение ММ и других физико-химических характеристик ХМК после стадии обесцвечивания затруднительно в виду его ограниченной растворимости в слабокислых водных растворах. В это связи мы проводили также деацетилирование ХМК (С=15%, 50%КаОН, 130оС, 1,5ч).

Таблица 2

Влияние концентрации перекиси водорода на характеристики ХМК и ХзМК

СН202> Выход Выход СДА, И, ММ,

% ХМК,% ХзМК, % % дл/г кДа

0,5 85 45 88 6,1 623

2 78 49 89 5,3 521

4 77 51 90 4,4 416

6 75 50 91 3,5 316

8 74 56 91 5,5 520

10 71 54 92 - -

При повышении концентрации происходило незначительное

снижение выхода ХМК (на 10-14%) с изменением цвета от темно-коричневого

(0,5% Н2О2) до светло-серого (10% Н2О2) при визуальной оценке. Это косвенно свидетельствовало о том, что под действием окислителя происходило разрушение не самого меланина, а хромофорных групп пигмента. Концентрация Н2О2 также незначительно влияла на выход ХзМК и его СДА после деацетилирования. Однако при обесцвечивании интенсивно проходил процесс деструкции полимера. Увеличение концентрации Н2О2 (до 6%) приводило к заметному снижению ММ (в 2 раза). Но при использовании концентрации Н2О2 выше 6% наблюдалось резкое увеличение вязкости ХзМК (с 3,5 до 5,5 дл/г). Хитозан-меланиновый комплекс, после обработки 10%-ным раствором Н2О2, образовывал прозрачный устойчивый гель (рН 3,8), что затрудняло определение вязкости и молекулярной массы образца. Полученные результаты, скорее всего, можно объяснить явлением синерезиса, протекающим при низких значениях рН (2-4).

Наши эксперименты показали несущественное влияние температуры процесса на выход хитин- и хитозан-меланиновых комплексов (табл. 3).

Таблица 3

Влияние температуры процесса на выход и свойства ХМК и ХзМК

О т, с Выход ХМК,% Выход ХзМК, % СДА, % дл/г ММ, кДа

22 84 51 72 5,5 1020

40 80 54 80 4,5 592

60 79 53 81 4,1 518

80 76 51 80 3,8 500

Повышение температуры обесцвечивания незначительно влияло на

значение СДА, но приводило к существенному уменьшению вязкости и ММ

ХзМК после деацетилирования. Снижение ММ в 2 раза при повышении

температуры от 22 до 40°С можно объяснить гидролизующими свойствами

перекиси водорода. Интересно отметить, что дальнейшее увеличение

температуры не приводило к более существенному гидролизу ХМК.

Как показано в таблице 4, продолжительность обесцвечивания не

приводила к значительным изменениям выхода ХМК и ХзМК при

последующем деацетилировании и составляла 72-74 и 51-55%, соответственно.

Это, видимо, обусловлено бурным разложением перекиси водорода в процессе реакции с образованием радикалов и свободного кислорода, интенсифицированного в щелочных условиях и повышенных температурах, поэтому собственно реакция занимала не более 0,5-1ч.

Таблица 4

Влияние продолжительности процесса на выход и свойства ХМК и ХзМК

Время, ч Выход хмк,% Выход ХзМК, % СДА, % м. дл/г ММ, кДа

0,5 73 51 83 5,0 581

1 73 53 87 4,4 448

1,5 74 55 87 3,9 390

2 73 51 89 3,6 357

3 73 46 89 3,0 278

4 72 46 91 2,8 242

Также продолжительность процесса практически не влияла на СДА полученного ХзМК. Однако на данной стадии одновременно протекала реакция деструкции хитозана. В результате оптимизации процесса обесцвечивания мы определили основные условия: концентрация Н2О2 - 2-4 %; температура - 50 -55°С; продолжительность - 1ч. Выход полимера при данных условиях после обесцвечивания составлял 70-75%, после деацетилирования - около 50%, СДА в среднем 85-90% и молекулярная масса - 400кДа.

Деацетилирование(ДА)

Оптимизацию процесса деацетилирования с целью получения хитозана, растворимого в водных растворах (рН 4-6), осуществляли в щелочных условиях в зависимости от концентрации щелочи (табл.5), температуры (табл.6) и продолжительности (табл.7). Учитывая особенности сырья и жесткие условия процесса, можно утверждать, что на данной стадии также происходило удаление остаточных белков и пигментов, от которых невозможно было полностью освободиться на предыдущих стадиях. Условия процесса ДА в значительной степени влияют на физико-химические свойства хитозана.

Использование концентраций NaOH ниже 35% приводило к образованию полимеров с СДА ниже 50%, нерастворимых при рН 3-5 (табл.5). Увеличение концентрации щелочи выше 40% способствовало увеличению СДА в 2 раза, и уменьшению вязкости в 1,5-2 раза, а молекулярной массы - в 3 раза.

Таблица 5

Влияние концентрации щелочи на характеристики ХзМК

Выход СДА, М> ММ,

% ХзМК, % % дл/г кДа

30 60 43 - -

35 55 51 - -

40 43 73 9,1 1574

45 44 86 5,3 573

50 41 87 4,5 458

55 46 88 4,1 405

Полученные результаты можно объяснить тем, что при данной концентрации происходило деацетилирование не только аморфных, но и кристаллических участков полимера, за счет диффузии гидроксида натрия ближе к поверхности или внутрь макромолекулы, что напрямую зависело от концентрации щелочи. Увеличение концентрации щелочи выше 50% незначительно сказывалось на выходе, СДА и вязкости полимера.

Использование для деацетилирования температур ниже 100°С позволяло получать ХзМК с низкой СДА (до 70%), высокой вязкостью и ММ, которые обладали плохой растворимостью при рН 4-6 (табл.6).

Таблица 6

Влияние температуры деацетилирования на характеристики ХзМК

т,°с Выход ХзМК, % СДА, О, % м. дл/г ММ, кДа

60 34 66 10,4 2 539

80 43 70 9,2 1797

100 43 72 6,5 1 117

120 45 77 4,8 714

140 39 84 4,2 489

Повышение температуры свыше 100°С значительно облегчало процесс

деацетилирования, приводя к увеличению СДА на 15-20% и снижению

вязкости в 2 раза. Что касается деструкции полимера, то она была тем больше, чем выше температура процесса.

Анализируя полученные результаты можно отметить, что продолжительность процесса в интервале от 0,5 до 4ч не оказывала существенного влияния на выход хитозан-меланинового комплекса (табл.7).

Таблица 7

Влияние продолжительности деацетилирования на выход и свойства ХзМК

Время, ч Выход ХзМК,% СДА, О, % И. дл/г ММ, кДа

0,5 49 81 5,0 628

1 45 85 4,6 507

1,5 44 86 41,0 422

2 46 87 3,6 371

22,5 45 87 3,4 343

3 44 88 25,0 289

4 43 90 22,7 245

При выборе оптимального времени мы ориентировались на значение СДА, которое в первые 1-1,5ч увеличивалось на 4-5% и в дальнейшем незначительно росло. Параллельно интенсивно проходила деструкция полимера, которая сказывалась на снижении вязкости и ММ. В течение 4 ч гидролиза ММ полимера снижалась в 2,5 раза. Выбор оптимального времени деацетилирования зависит от направлений использования полимера.

На основе анализа результатов по оптимизации процесса деацетилирования мы предлагаем следующие условия: концентрация NaOH -45-50%; температура - 120-140°С; продолжительность - 1-1,5ч.

Проведение процесса деацетилирования в вышеописанных условиях способствовало получению продукта светло-серого цвета со следующими физико-химическими свойствами: высокой СДА (83-86%), молекулярной массой (400-500кДа). Однако, несмотря на применение таких жестких условий, нам не удалось полностью избавиться от пигмента, обусловливающего оттеночную окраску полисахарида. Это еще раз подтверждает особую

сложность получения чистого хитина и хитозана из данного сырья, по

сравнению с панцирями ракообразных. Принимая во внимание тот факт, что меланин обладает уникальными фото-, радиопротекторными и антиоксидантными свойствами и находит широкое применение, более целесообразно не добиваться полного удаления пигмента из комплекса ХМК. В результате можно получать продукты с новыми биологическими свойствами и расширять области применения данных соединений.

Ферментативный гидролиз (ФГ)

Цель эксперимента - изучение гидролиза пчелиного хитозана с помощью трех ферментных препаратов разной субстратной специфичности: хитинолитического комплекса ферментов Streptomyces kurssanovii, промышленного ферментного целлюлолитического препарата Целловиридин Г20х на основе штамма Trichoderma viride и протеолитического фермента папаина (ЕС 3.4.22.2) из латекса дынного дерева (Caricapapaya Ь).

Гидролиз ХзМК проводили в оптимальных условиях для каждого препарата с использованием фермент-субстратного соотношения (ФСС) - 1/500 (весовое отношение содержания белка в препарате к весу субстрата). Эффективность процесса определяли по накоплению образующихся восстанавливающих Сахаров, а именно ацетилглюкозамина (АГА). Для образцов, гидролизованных в течение Зч, определяли основные физико-химические показатели (табл. 8).

Таблица 8

Характеристика высоко- (ВХзМК) и низкомолекулярного (НХзМК)

хитозан-меланиновых комплексов

Образцы Выход, СДА, м, ММ,

% % дл/г кДа

ВХзМК - 86 4 427

Гидролиз НХзМК ферментами:

- S.kurssanovii 48 89 0,2 17,7

- ТММв 45 81 1,0 123

- папаин 73 86 2,5 252

Наиболее эффективно гидролиз проходил под действием комплекса

(на 96%), при этом получали с высокой СДА, низкой

вязкостью и ММ. При использовании препарата Целловиридин,

неспецифичного к данному субстрату, получали образцы с более низкой СДА, высокой вязкостью и ММ (эффективность гидролиза 71%). Выход гидролизатов менее 50% в случае использования первых двух ферментных комплексов можно объяснить тем, что при гидролизе комплексом Б.кишапоуИ получали полимеры с высокой СДА (89%) и, следовательно, лучшей растворимостью при рН 5-6, что, возможно, приводило к ощутимым потерям низкомолекулярных фракций (<10кДа) в процессе диализа. А при гидролизе комплексом причиной, скорее всего, было образование большого

количества моносахаров, которые также теряются при диализе. Именно этим можно объяснить относительно высокую молекулярную массу получаемого гидролизата (123кДа).

Так как ферментный комплекс S.kurssanovi является дорогим и мало доступным, то для гидролиза более предпочтительно использовать Целловиридин, предварительно оптимизировав условия проведения процесса. Использование фермента папаина менее целесообразно, так как этот фермент дороже Целловиридина и получение полимеров с заданными свойствами требует значительного увеличения количества фермента.

Оптимизацию ферментативного гидролиза 1% раствора хитозана (СДА 89%, ММ 460 кДа) в 0,2 М уксусной кислоте проводили под действием препарата Целловиридин в интервале рН 3,0-6,5, температур 25-75°С, продолжительности 0,5-24ч и ФСС 1/100-1/500. Эффективность гидролиза оценивали по количеству образующихся восстанавливающих Сахаров (АГА).

Величина рН является одним из основных параметров, от которого зависит не только действие фермента, но также и свойства полимера. Как известно, константа диссоциации аминогрупп хитозана выше этого

значения аминогруппы полимера депротонированны и хитозан осаждается в виде крупных хлопьев. Поэтому данный эксперимент ограничен значениями рН ниже 6,5. Максимум образования АГА приходился на интервал рН 5,0-6,0 (600800 мкмоль/гр.хитозана). При рН выше 6,0 процесс гидролиза замедлялся, что связано с ухудшением растворимости исходного полимера, и, как результат,

протеканием процесса в гетерогенной среде. При исследовании влияния температуры было показано, что гидролиз при 55-60°С приводил к образованию максимального количества АГА (600-650 мкмоль/гр.хитозана). Дальнейшее увеличение температуры приводило к резкому снижению количества восстанавливающих Сахаров из-за инактивации ферментов в препарате. Что касается влияния продолжительности процесса, то гидролиз интенсивно проходил в течение Зч (830 мкмоль/гр.хитозана) и при дальнейшем увеличении времени количество АГА незначительно возрастало (в 1,5 раза).

Выбор оптимальных значений ФСС зависит от конкретно поставленной задачи, о чем свидетельствуют результаты, представленные в таблице 9. Если необходимо получить низкомолекулярный ХзМК, растворимый при нейтральных рН, то целесообразно использовать соотношение 1/100. Но следует обратить внимание на низкие значения С ДА (65%), что, вероятно, объясняется интенсивным протеканием гидролиза, и, как следствие, образованием большого количества олигосахаридов и мономеров, которые теряются при диализе. Это подтверждает и низкий выход продукта.

Таблица 9

Характеристика высоко- и низкомолекулярного ХзМК

Фермент-субстратное соотношение Выход, % СДА, % [Л], дл/г ММ, кДа

1/1000 58 91 1,0 84

1/750 50 90 0,8 66

1/500 47 90 0,6 48

1/250 35 75 0,3 19

1/100 19 65 0,2 12

Увеличение ФСС в 2 раза (1/500) незначительно сказывалось на выходе продукта, но приводило к увеличению СДА на 15%, а ММ на 60%. Дальнейшее увеличение ФСС до 1/1000 обусловливало получение ХзМК с выходом более 50% и СДА выше 90%, но при этом резко возрастала ММ. Это определяло растворение образцов лишь в кислых водных растворах (рН 4-6), что сильно ограничивает дальнейшее их применение.

Оптимизируя процесс ферментативного гидролиза мы определили основные условия его проведения: рН - 5,5-6,0; температура - 55-60°С; продолжительность - 4-6 ч; фермент-субстратное соотношение -1/250-1/500.

Использование данных параметров позволяло получать низкомолекулярный ХзМК в виде порошка светло-кремового цвета, растворимого в нейтральных значениях рН. Выход полимера при данных условиях составил 45-50%, СДА -80- 90%, и ММ 20-50кДа.

На основе оптимизации стадий нами предложена технологическая схема комплексной переработки пчелиного подмора с получением биологически активных веществ и учетом особенностей сырья (рис. 3).

2.2.2. Физико-химические свойства продуктов

При реализации данной технологической схемы можно получать разнообразные продукты в виде отдельных веществ и комплексов, обладающих новыми свойствами, которые позволят использовать их в различных областях промышленности, биотехнологии и медицины (табл. 10).

Таблица 10

Характеристика промежуточных продуктсж технологии_

Стадии Продукты Выход, % Зола, % Влага, % Элементный состав, %

N С Н

вэ Меланин 35 4,5 9 7,9 39 7

Подмор пчел 60 2,8 7,6 17 51 7,5

ДО Белок-меланиновый комплекс 20 14 8 5,8 51 7,8

Хитин-меланиновый комплекс 21 1,2 9 9,8 48 6,9

ОБ Хитин-меланиновый комплекс 16 1,7 9 6,9 43 6,6

ДА Высокомолекулярный ХзМК 6 0,7 10 7,1 40 7,1

ФГ Низкомолекулярный ХзМК 4 0,2 10 7,0 39 6,8

При использовании данной технологии было получать до 35%

водорастворимого меланина и около 3-5% низкомолекулярного хитозан-

меланинового комплекса (НХзМК), которому было дано название «Пчелозан».

Рис. 3. Технологическая схема переработки подмора пчел

Содержание минеральных веществ и влажность в полученном ХзМК согласуется с требованиями ТУ на низкомолекулярный хитозан пищевой. Таким образом, исключение стадии деминерализации из общего процесса является оправданным. Используя оптимальные условия проведения технологического процесса, мы получили хитозансодержащие комплексы светло-серого цвета со следующими характеристиками:

хорошо растворимый при рН 4-6.

Для определения природы пигмента, полученного на стадии водной экстракции, мы проводили ряд качественных реакций: обесцвечивание 0,1% раствора пигмента 10%-ным раствором окисление под действием действие Спектр поглощения меланина и БМК обладал высокой

интенсивностью светопоглощения в УФ-диапазоне (от 220 нм) с последующим плавным снижением оптической плотности по мере увеличения длины волны, что характерно для природных меланинов. Высокое содержание азота у меланина (7,9) и БМК (5,8) по данным элементного анализа, а также присутствие белка в меланине (18%) подтверждали данные о меланопротеиновой природе пигмента. Приведенные результаты позволяют говорить о присутствии в молекуле пигмента хиноидных и фенольных структур и подтверждают литературные данные о его принадлежности к эумеланинам.

Результаты ЭПР-анализа показали наличие во всех полученных продуктах устойчивого ЭПР сигнала с g-фактором в области 2,0035-2,0038, близкого к g-фактору свободного электрона (2,0023), и шириной линии (АН) 5,4-7,5Гс, что свидетельствует о существовании стабильных свободных электронов в молекуле пигмента. Для сравнения использовали ЭПР-спектры крабового хитозана, которые показали отсутствие ЭПР сигнала. Дополнительная информация о структуре полимеров получена нами при проведении термогравиметрии (ТГ) и дифференциальной сканирующей калориметрии (ДСК), позволяющих оценить физические и химические превращения в полимере при повышении температуры. Установлено, что при температуре ниже 100°С происходила незначительная потеря массы во всех продуктах в

пределах 6-12% с эндотермическим эффектом, обусловленная, возможно, дегидратацией полимеров. Термолиз с экзотермическим эффектом меланинпротеинового комплекса протекал в интервале температур 350-480°, а хитинсодержащих продуктов - 300-500°С, при которых наблюдалась наибольшая потеря массы (85-90%)

2.2.3. Биологические свойства продуктов Антиоксидантные свойства меланисодержащих продуктов

Антиоксидантное действие меланина, БМК и ХзМК изучено на моделях перекисного окисления липидов (ПОЛ) (рис.4) и пероксидазного окисления аминобифенилов (рис.5).

и аскорбиновой кислотой in vitro

Как водорастворимый меланин, так и БМК эффективно подавляли

процесс накопления продуктов окисления (малонового диальдегида) при

индуцированном ПОЛ (рис. 4). В обоих случаях интенсивность ПОЛ снижалась

с увеличением концентрации ингибитора. Для меланина наблюдалось плавное

снижение концентрации ТБК-активных продуктов без максимумов и

минимумов. Но даже использование высоких концентраций меланинов

(Змг/мл) не позволяло полностью ингибировать ПОЛ. Повышение

концентрации БМК выше 0,2мг/мл способствовало интенсивному

ингибированию продуктов окисления. Увеличение концентрации БМК в 15 раз приводило к практически полному ингибированию ПОЛ.

Вероятнее всего, способность подавлять процесс индуцированного ПОЛ обусловлена хелатированием ионов Ре2+ с образованием неактивных комплексов и снижением их концентрации в среде, а также возможно прямое взаимодействие меланинов с образующимися свободными радикалами.

При исследовании антиоксидантного действия продуктов технологии по пероксидазному пути окисления в качестве окисляемых субстратов использовались: бензидин (БД) и его производные - о-дианизидин (о-ДА), тетраметилбензидин (ТМБД). Установлено, что эффективность пероксидазного окисления увеличивается в ряду: БД, о-ДА, ТМБД, т.е. при введении метальных заместителей. Антиокислительная активность меланинов определяется содержанием функциональных групп, парамагнитных центров и развитостью системы сопряженных двойных связей. Все ингибиторы показали хорошие антиоксидантные свойства, увеличивающиеся при повышении концентрации (рис. 5). Использование БМК в качестве ингибитора окисления о-ДА давало менее заметный эффект по сравнению с меланином. Для снижения степени повреждения на 50% в случае использования меланинов достаточно 0,08 мг/мл, а для БМК - 0,4 мг/мл. Это можно объяснить низкой долей содержания меланина в БМК по сравнению с водорастворимым меланином.

Нами было показано, что ХзМК также обладает антиоксидантными свойствами в концентрациях свыше 0,4мг/мл, которое можно объяснить инактивацией меланином радикальных промежуточных продуктов окисления, и действием самого хитозана, основанным на возможной сорбции исходных или промежуточных продуктов, что предотвращало окисление.

Генопротекторные свойства меланинсодержащих продуктов

Генопротекторное действие продуктов из подмора пчел исследовали в модельной системе метаболической активации бензидина по пероксидазному пути окисления. Способность меланиновых пигментов предотвращать

повреждение ДНК фага продуктами окисления оценивали по изменению электрофоретической подвижности ДНК на электрофорезе. В качестве ингибиторов использовались меланин и

Рис. 6. Элекгрофореграммы ДНК, модифицированной продуктами пероксидазного окисления бензидина: 1- нативная ДНК фага 2- ДНК, модифицированная продуктами окисления бензидина; 3-15 - то же в присутствии возрастающих концентраций меланина 2,7-3 52мкг/мл (А) и ХзМК 0,9-4000мкг/мл (Б)

Показано, в отсутствии ингибитора происходило повреждение ДНК промежуточными продуктами окисления с образованием сшивок ДНК, в результате чего она частично или полностью оставалась на старте (рис. 6, дорожка 2 А, Б). Низкие концентрации меланинов (до 20мкг/мл) не влияли на степень повреждения ДНК. Повышение концентрации выше 30 мкг/мл приводило к снижению повреждающего действия продуктов окисления на 50%, а полное ингабирование повреждения молекул ДНК, сопровождающееся восстановлением ее электрофоретической подвижности, достигалось при концентрации 156 мкг/мл. При использовании в качестве ингибитора ХзМК исчезновение полосы поврежденной ДНК происходило при концентрации 250 мкг/мл. При этом в ячейках геля наблюдалась люминесценция, усиливающаяся с повышением концентрации ингибитора (Б, дорожки 11-15). Очевидно, что это обусловлено взаимодействием ХзМК и ДНК с образованием комплекса, лишающего способности ДНК проникать в гель и защищающего ее от повреждающего действия продуктов окисления бензидина.

Фотопротекторные свойства меланинсодержащих продуктов

Фотопротекторное действие изучали на образцах крема, содержащих в

качестве добавки меланин и ХзМК в количестве 0,3%, которые подвергались

воздействию УФ-облучения (253нм) в течение 24 ч. Окислительные и

гидролитические процессы, происходящие в креме, регистрировали по изменению перекисного числа (ПЧ) (рис.7).

140

Рис. 7. Изменение перекисного

числа под действием УФ-обработки: 1. кремовая основа;

2- крем с ХзМК;

3- крем с меланином;

4- крем с ХзМК и меланином.

Длительность УФ обработки, ч

В качестве контроля использовали кремовую основу с повышенным содержанием жирных кислот, в которой происходили окислительные процессы под действием УФ (рис 7.). Наиболее интенсивные процессы проходили в течение первых 12 часов, обусловленные окислением жирных кислот с образованием перекисей и гидроперекисей, инициирующих цепные свободнорадикальные процессы, что приводило к порче продукта. Введение в рецептуру крема ХзМК (0,3%) не показало значительного эффекта в сравнении с контролем. При использовании крема с меланином наблюдалось снижение ПЧ в 2,3 раза за 12 ч и впоследствии еще на 28%. Фотопротекторное действие меланина обусловлено нейтрализацией свободных радикалов, образующихся в результате действия УФ. Однако внесение в рецептуру крема меланина вместе с ХзМК приводило к увеличение эффекта еще на 20%. В данном случае это можно объяснить эмульгирующими свойствами хитозана, способствующие более равномерному распределению меланина в кремовой основе. Дополнительно, возможно, происходило повышение растворимости меланина в водной фазе крема. Таким образом, совместное применение полисахарида и пигмента приводило не только к повышению антиоксидантных свойств последнего, но и влияло на физико-химические свойства крема.

выводы

1. Разработана технологическая схема комплексной переработки подмора из медоносных пчел (Apis mellifera) с получением водорастворимого меланина (до 35%) и хитозан-меланинового комплекса (до 4-6%) различной молекулярной массы. Оптимизирован технологический процесс и определены оптимальные условия для каждой стадии.

2. Обоснована возможность исключения из технологической схемы переработки стадии деминерализации из-за низкого содержания минеральных веществ в подморе пчел (3-4%), и показана необходимость включения стадии обесцвечивания меланиновых пигментов, влияющих на дальнейший процесс обработки и свойства полученных продуктов.

3. Показана возможность гидролиза высокомолекулярного ХзМК ферментными препаратами со специфической и неспецифической активностью. Гидролиз ХзМК промышленным препаратом Целловиридин Г20х в оптимальных условиях позволяет получать низкомолекулярные фрагменты (20-50кДа), хорошо растворимые в нейтральных водных растворах.

4. Установлено, что меланины и низкомолекулярный ХзМК обладают антиокислительной активностью, проявляющейся в способности предотвращать перекисное окисление липидов и пероксидазное окисление аминобифенилов. Ингибирующая активность меланинов снижалась в ряду субстратов: БД- о-ДА - ТМБД.

5. Показана способность меланинов, полученных на стадии водной экстракции при температурах 20-80°С, предотвращать повреждение ДНК фага \ продуктами окисления бензидина. Защитное действие обусловлено способностью меланинов дезактивировать свободные радикалы и активные формы кислорода, образующиеся при окислении, за счет присутствия неспаренных электронов в молекуле.

6. Разработана рецептура крема с добавлением меланина отдельно и совместно с ХзМК (0,3%) в качестве биологически активных веществ, предотвращающих окисление кремовой основы под действием УФ-облучения. Фотопротекторное действие меланина проявлялось в снижении перекисного числа в 2,3 раза по сравнению с контролем. Использование в рецептуре крема меланина с ХзМк увеличивало этот эффект еще на 20%.

Список работ, опубликованных по материалам диссертации

1. Немцев СВ., Зуева О.Ю., Хисматуллин Р.Г., Хисматуллин М.Р., Лариков В.В., Варламов В.П. Хитозан из подмора - новый продукт пчел. //Пчеловодство.-2001. - № 5- С.50-51.

2. Немцев СВ., Зуева О.Ю., Хисматуллин Р.Г., Хисматуллин М.Р., Лариков В.В., Варламов В.П. Пчела как потенциальный источник хитозана. // Материалы 6-ой Международной конф. "Новые достижения в исследовании хитина и хитозана".-М: ВНИРО, 2001. -С39-42.

3. Varlamov V.P., Nemtsey S.V., Zueva O.Yu., Khismatullin M.R., Khismatullin

R.G. Production of chitin and chitosan from bees // 5th Asia Pacific Chitin -Chitosan Symposium & Exhibition / Ed. K.Suchiva. Thailand, 2002,- P.59.

4. Nemtsev S.V., Zueva O.Yu., Khismatoulline R.G., Khismatoulline M.R, Varlamov V.P. Bees as potential source of chitosan // Proc.5 Int. Conf. of EUCHIS-02 /Ed. K.M. Varum. Trondheim, Norway, 2002. P.31.

5. Зуева О.Ю., Немцев СВ., Варламов В.П., Хисматуллин М.Р., Хисматуллин Р.Г., Албулов А.И. Получение хитозана из пчел // Материалы 1-го Международного конгресса "Биотехнология: состояние и перспективы развития".- М: ЗАО «ПИК «Максима», 2002.-С. 390.

6. Немцев СВ., Зуева О.Ю., Исмаилов ВЛ., Варламов В.П. Кутикула жуков станет новым источником хитина и хитозана // Материалы 7-ой Международной конф. "Современные перспективы в исследовании хитина и хитозана".- М: ВНИРО, 2003. -С.36-38.

7. Герасименко Д.В.,Авдиенко И.Д., Банникова Г.Е., Ильина А.В., Зуева О.Ю., Варламов В. П. Антибактериальная активность низкомолекулярного хитозана // Мат. 7-ой Международной конф. "Современные перспективы в исследовании хитина и хитозана".-М: ВНИРО, 2003.-С233-238.

8. Кукулянская Т.А., Буга СВ., Курченко В.П., Зуева О.Ю. Структурные особенности и антиоксидантная активность хитин-меланинового комплекса и меланиновых пигментов из пчел // Материалы 7-ой Международной конф. "Современные перспективы в исследовании хитина и хитозана".-М: ВНИРО, 2003.-С327-330.

9. Зуева О.Ю., Немцев СВ., Ильина А.В., Хисматуллин Р.Г., Хисматуллин М.Р., Варламов В.П. Ферментный гидролиз пчелиного хитозана // Материалы 7-ой Международной конф. "Современные перспективы в исследовании хитина и хитозана".- М: ВНИРО, 2003. - С. 390-394.

10.KhismatoullinR.G., Nemtsev S.V., Zueva O.Yu., Varlamov V.P. Bees as a potential sources of chitosan and melanin //7 Asian apicultural association conference and 10th BEENET symposium and technofora "In: Bees for New Asia" / Ed. E.N. Camaya, CR. Cervacia. Philippines, 2004.- P. 359-360.

11. Ильина А.В., Зуева О.Ю., Лопатин СА., Варламов В.П. Ферментативный гидролиз альфа-хитина // Прикладная биохимия и микробиология.-2004.-Т.40.-№1.-С 42-45.

12.Немцев СВ., Зуева О.Ю., Хисматуллин М.Р., Албулов А.И., Варламов В.П. Получение хитина и хитозана из медоносных пчел // Прикладная биохимия и микробиология. -2004. -Т.40.-№ 1 .-С.46-50.

13.Герасименко Д.В., Авдиенко И.Д., Банникова Г.Е., Зуева О.Ю., Варламов В.П. Антибактериальная активность водорастворимых низкомолекулярных хитозанов в отношении различных микроорганизмов // Прикладная биохимия и микробиология.-2004,- Т.40.-№3.-С 301-306.

14.Varlamov V.P., Zueva O.Yu., Kukulyanskaya T.A., Kurchenko V.P. Chitin,

chitosan and melanin from bees // III simposio Iberoamericano de Quitina / Ed. F.M. Goycoolea, W.V.A. Monal, A. Campa. Cordoba, Espana, 2004. -P.51.

15.Курченко В.П., Кукулянская Т.А, Азарко И.И., Зуева О.Ю., Хисматуллин Р.Г., Варламов В.П. Физико-химические свойства хитин-меланинового и меланопротеинового комплексов из подмора пчёл // Прикладная биохимия и микробиология (в печати).

$21649

РНБ Русский фонд

2005-4 20964

Напечатано с готового оригинал-макета

Издательство ООО "МАКС Пресс" Лицензия ИДЫ 00510 отО 1.12.99 г. Подписано к печати 12.11.2004 г. Формат 60x90 1/16. Усл.печл. 1,75. Тираж 110 экз. Заказ 497. Тел. 939-3890,939-3891,928-1042. Тел/Факс 939-3891. 119992, ГСП-2, Москва, Ленинские горы, МГУ им. М.В. Ломоносова, 2-й учебный корпус, 627 к.

Содержание диссертации, кандидата технических наук, Зуева, Ольга Юрьевна

Введение.

1. Обзор литературы.

1.1. Природные полисахариды хитин и хитозан: строение, физико-химические свойства.

1.2. Области применения.

1.3. Основные источники хитина и хитозана.

1.3.1. Ракообразные (<Crustacea).

1.3.2. Грибы (Fungi).

1.3.3. Насекомые (Insecto).

1.3.4. Нетрадиционные источники.

1.4. Способы переработки хитинсодержащего панциря ракообразных.

1.4.1. Получение хитина с помощью химических и биотехнологических способов обработки.

1.4.2. Получение хитозана с использованием химических и ферментативных методов.

1.4.3. Способы гидролиза хитозана.

1.5. Получение хитина и хитозана из насекомых.

2. Экспериментальная часть.'.

2.1. Объекты исследований, исходные материалы и химические реагенты.

2.2. Методы исследования.

2.2.1. Технологические стадии.

2.2.2. Методы анализа.

2.2.3. Изучение некоторых свойств полученных веществ.

3. Результаты и их обсуждение.

3.1. Разработка технологии получения биологически активных веществ из подмора пчел.

3.1.1. Водная экстракция.

3.1.2. Депротеинирование.

3.1.3. Обесцвечивание.

3.1.4. Деацетилирование.

3.1.5. Ферментативный гидролиз.

3.2. Технология переработки подмора пчел.

3.3. Физико-химические свойства полученных продуктов.

3.4. Биологические свойства полученных продуктов.

3.4.1. Антиоксидантные свойства.

3.4.2. Генопротекторные свойства.

3.4.3. Фотопротекторные свойства.

4. Выводы.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Разработка биотехнологических процессов получения биологически активных соединений из медоносных пчел и исследование их свойств"

Полисахариды хитин и хитозан, а также их производные, считаются, перспективными биоматериалами будущего. По некоторым оценкам, предполагаемый объем производства изделий из этих биополимеров в 2005г. составит около 2 млрд. долларов, из которых — 75% будет использовано в пищевой, косметической и фармацевтической промышленностях, биотехнологии, сельском хозяйстве. Уникальная структура макромолекулы хитозана и наличие положительного заряда обусловливают проявление ряда полезных свойств (антиоксидантные, радиопротекторные, волокно- и пленкообразующие, иммуномодулирующие, противоопухолевые и др.), а также его низкую токсичность и способность к биодеградации.

Пигмент меланин представляет собой высокомолекулярный биополимер нерегулярной структуры, относящийся к классу конденсированных фенольных соединений, обусловливающих темную окраску покрова насекомых, волос человека, клеточной стенки грибов, растений и микроорганизмов. Наличие разнообразных функциональных групп, высокостабильных парамагнитных центров, сопряженной системы двойных связей в молекуле меланина обеспечивают разнообразное применение в качестве фото-, радиопротекторов и антиоксидантов в различных областях промышленности.

На сегодняшний день основным источником для получения хитина и хитозана являются панцири ракообразных (крабы, креветки, криль). Технология обработки включает постадийное удаление сопутствующих веществ с использованием химических и ферментативных способов обработки. Основными субстратами для выделения меланинов являются чернильная сумка каракатицы Sepia officinalis, микро- и макромицеты, грибы и дрожжи, темные сорта винограда, проявляющие сходные биозащитные свойства с меланинами животного происхождения.

Расширение областей применения; данных биополимеров обусловливает поиск новых перспективных источников хитина и меланина. Как известно, в покровах насекомых до 50% занимает полимер хитин, наряду с белками придающий прочность экзоскелету. Вместе с хитином и белком в кутикуле присутствуют эумеланины, ковалентно связанные с остальными компонентами, обусловливающие окраску насекомого и некоторые защитные свойства. Таким образом, кутикулу насекомых можно рассматривать как источник различных биологически активных веществ с возможностью выделения в отдельном виде или в виде комплексов. Благодаря традиционно развитому пчеловодству в нашей стране в качестве источника биологически активных веществ можно предложить подмор пчел - медоносные пчелы Ар1Б теШ/ега Ь., погибшие во время зимовки в улье. Согласно расчетам, сырьевая база подмора пчел может составить от 6 до 10 тыс. тонн в год.

Цель настоящей работы - разработка биотехнологических процессов получения хитина, хитозана, меланина и их комплексов из подмора пчел, изучение некоторых физико-химических и биологических свойств данных полимеров.

Для достижения поставленной цели были определены основные задачи исследования: разработать технологию переработки подмора пчел с учетом особенностей сырья и определить оптимальные параметры на каждой стадии обработки; согласно выбранным оптимальным параметрам осуществить комплексную переработку подмора пчел с получением интересующих биологически активных веществ; изучить основные физико-химические свойства промежуточных и основных продуктов, полученных на каждой стадии переработки; исследовать некоторые биологические свойства водорастворимого меланина и низкомолекулярного хитозан-меланинового комплекса.

Научная новизна работы

Обосновано использование кутикулы пчелиных для получения различных соединений. Разработана комплексная технологическая схема переработки пчелиного подмора с получением таких биологически активных веществ, как водорастворимый меланин и низкомолекулярный хитозан-меланиновый комплекс. Определены основные оптимальные параметры переработки пчелиного подмора на каждой стадии обработки. Учитывая особенность сырья, обоснована необходимость включения стадии обесцвечивания в технологию переработки с целью более полного удаления пигмента. При исследовании ферментативного гидролиза показано, что хитозан-меланиновый комплекс может гидролизоваться с использованием специфических и неспецифических ферментов. Показано, что, варьируя условиями ферментативного гидролиза, существует возможность получения; хитозан-меланинового комплекса с различной молекулярной массой и степенью деацетилирования в зависимости от целей использования. Исследованы антиоксидантные, генопротекторные и фотопротекторные свойства хитозан-меланинового комплекса и меланинсодержащих продуктов из подмора пчел.

Практическая значимость работы

Разработана комплексная схема переработки подмора пчел с получением таких биологически активных веществ, как водорастворимый меланин и хитозан-меланиновый комплекс. Предложены оптимальные параметры для осуществления каждой стадии. Разработана рецептура косметического крема на основе водорастворимого меланина и низкомолекулярного хитозана для обеспечения фотозащитных свойств.

Структура и объем диссертации

Диссертация состоит из введения, литературного обзора, методической части, раздела с обсуждением экспериментальных результатов, выводов, списка литературы и приложения. Работа изложена на 152 страницах машинописного текста, содержит 27 таблиц и 25 рисунков, библиографию из 158 наименований.

Заключение Диссертация по теме "Биотехнология", Зуева, Ольга Юрьевна

4. ВЫВОДЫ

1. Разработана технологическая схема комплексной переработки подмора из медоносных пчел {Apis mellifera) с получением водорастворимого меланина (до 35%) и хитозан-меланинового комплекса (до 4-6%) различной молекулярной массы. Оптимизирован технологический процесс и определены оптимальные условия для каждой стадии.

4. Установлено, что меланины и низкомолекулярный ХзМК обладают антиоксидантной активностью, проявляющейся в способности предотвращать перекисное окисление липидов и пероксидазное окисление аминобифенилов. Ингибирующая активность меланинов снижалась в ряду субстратов: БД- о-ДА - ТМБД.

5. Показана способность меланинов, полученных на стадии водной экстракции при температурах 20-80°С, предотвращать повреждение ДНК фага А, продуктами окисления бензидина. Защитное действие обусловлено способностью меланинов дезактивировать свободные радикалы и активные формы кислорода, образующиеся при окислении, за счет присутствия неспаренных электронов в молекуле.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата технических наук, Зуева, Ольга Юрьевна, Щелково

1. Muzzarelli R.A.A. Chitin. 1977. Oxford: Pergamon Press. P. 309.

2. Cauchie H-M. Chitin production by arthropods in the hydrosphere // Hydrobiologia. 2002. -V. 470. - N. 1/3.- P. 63-95.

3. Majeti N.V., Kumar R. A review of chitin and chitosan applications // Reactive & Functional Polymers.-2000.- V.46.- N.I.- P.l-27.

4. Tolaimate A., Desbrie'res J., Rhazi M., Alagui A., Vincendon M., Vottero P. On the influence of deacetylation process on the physicochemical characteristics of chitosan from squid chitin // Polymer.- 2001.-V.41.- N.7.- P. 2463-2469.

5. Zhang M., Haga A., Sekiguchi H., Hirano S. Structure of insect chitin isolated from beetle larva cuticle and silkworm (Bombyx mori ) pupa exuvia // Int. J. Biological Macromolecules.- 2000.-V.27.- N.l.-P. 99-105.

6. Феофилова Е.П. Клеточная стенка грибов.- М.: Наука, 1983.- 248с.

7. Muzzarelli R.A.A. The discovery of chitin a > 570 Megayear old polymer // In: Chitosan in pharmacy and chemistry / Ed. R.A.A Muzzarelli, C. Muzzarelli. Atec, Italy, 2002.-P. 1-8.

8. Chatelet C., Damour O., Domard A. Influence of the degree of acetylation on some biological properties of chitosan films // Biomaterials.- 2001.-V.22.- N.3. P. 261-268.

9. Domard A. Some physicochemical and structural basis for applicability of chitin and chitosan. // Proc. 2nd. Asia Pacific Symposium "Chitin and chitosan" / Ed. F. Stevens, M.S. Rao, S. Chandrkrchang. Bangkok, Thailand, 1996.- P. 1-12.

10. Kumara G., Bristowa J.F., Smith P.J., Payne G.F. Enzymatic gelation of the natural polymer chitosan // Polymer.- 2000.- V.41.-N.6.-P.2157-2168.

11. Juang R-S., Shao H-J. A simplified equilibrium model for sorption of heavy metal ions from aqueous solutions on chitosan // Water Research.- 2002.-V.36.-N.12.- P.2999-3008.

12. Сафронова Т.М. Применение хитозана в производстве пищевых продуктов приведено в "Хитин и хитозан. Получение, свойства и применение" / Под. ред. К.Г. Скрябина, Г.А. Вихоревой, В.П. Варламова М: Наука, 2002.-С. 346-359.

13. Rhoades J., Roller S. Antimicrobial actions of degraded and native chitosan against spoilage organisms in laboratory media and foods // Applied and environmental microbiology.-2000.- V.66.- N.l.-P. 80-86.

14. Албулов А.И., Самуйленко А.Я., Фролова M.А. Хитозан в косметике приведено в "Хитин и хитозан. Получение, свойства и применение"/ Под.ред. К.Г. Скрябина, Г.А. Вихоревой, В.П. Варламова.- М: Наука, 2002.-С. 360-363.

15. Gain В. Natural products gain flavor// Chemical week.-1996. .-V.158.- N.48.-P.35-36.

16. Cho Y-W., Cho Y-N., Chung S-H., Yoo G., Ко S-W. Water-soluble chitin as a wound healing accelerator // Biomaterials.- 1999.- V.20.-N.22.-P. 2139-2145.

17. Jagur-Grodzinski J. Biomedical application of functional polymers // Reactive & Functional Polymers.- 1999.-V.39.-N.2.- P.99-138.

18. Khora E., Lim L. Implantable applications of chitin and chitosan // Biomaterials. 2003.- V.24.-N.13.- P.2339-2349.

19. Варламов В.П., Ильина A.B., Банникова Г.Е., Немцев С.В., Ильин JI.A., Чертков К.С., Андиранова И.Е., Платонов Ю.В., Скрябин К.Г. Способ получения низкомолекулярного хитозана для противолучевых препаратов. Патент РФ № 2188829. Россия. 10.09. 2002.

20. Vongchan P., Sajomsang W., Subyen D., Kongtawelerta P. Anticoagulant activity of a sulfated chitosan // Carbohydrate Research.- 2002.- V.337.- N.13.-P.1233-1236.

21. Ilium L. Chitosan and its use as a pharmaceutical excipient // Pharmaceutical Pesearch.-1998.-V. 15 .-N.9.-P. 1326-1331.

22. Zechendorf B. Sustainable development: how can biotechnology contribute? // Trends in Biotechnology.- 1999.- V.17.- N.6.-P.219-225

23. Красавцев B.E. Технико-экономические перспективы производства хитина и хитозана из антарктического криля // Мат. VII Международной конф. "Современные перспективы в исследовании хитина и хитозана".-М.: ВНИРО, 2003.-С. 7-9.

24. Vincent J.V. Arthropod cuticle: a natural composite shell system // Composites: Part A.- 2002.-V.33.- N.10.- P.1311-1315.

25. Stankiewicz В., Mastalerz M., Hof C. J., Bierstedt A., Flannery M.B., Derek E. G., Evershed B. Biodégradation of the chitin-protein complex in crustacean cuticle//Org. Geochem.-1998.-V.28.-N.l/2.-P. 67-76.

26. Быкова B.M., Немцев C.B. Сырьевые источники и способы получения хитина и хитозана приведено в "Хитин и хитозан. Получение, свойства и применение" / Под. ред. К.Г. Скрябина, Г.А. Вихоревой, В.П. Варламова.- М: Наука, 2002.-С.7-23.

27. Мезенова О.Я., Лысова А.С., Григорьева Е.В. Гаммарус балтийский -потенциальный источник получения хитина и хитозана // Мат. VII Международной конф. "Современные перспективы в исследовании хитина и хитозана".-М.: ВНИРО, 2003 .-С. 32-33.

28. Антарктический криль: Справочник. / Под. ред. В.М. Быковой. М: ВНИРО, 2001.-207с.

29. Lipke P. N., Ovalle R. Cell Wall Architecture in Yeast: New Structure and New Challenges //Journal of Bacteriology.- 1998.- V.180.- N.15.-P.3735-3740.

30. Унрод В.И., Солодовник Т.В. Хитин- и хитозансодержащие комплексы из мицелиальных грибов: получение, свойства, применение // Биополимеры и клетка.-2001.-Т. 17.- № 6.-С.526 533.

31. Тесленко А.Я., Воеводина И.Н., Галкин А.В., Львова Е.Б., Никифорова Т.А., Николаев С.В., Михайлов Б.В., Козлов В.П. Способ получения глюкан-хитозанового комплекса Патент № 2043995. Россия. 1995.

32. Pochanavanich P., Suntornsuk W. Fungal chitosan production and its characterization // Letters in Applied Microbiology.-2002.-V.35.- N.1.-P.17-21.

33. Тыщенко В.П. Физиология насекомых. Уч. Пособие.-М: Высш.шк, 1986.-303с.

34. Chapman R.F. The insects. Structure and function. London: The English universities press. 1969.-P. 600.

35. Giraud-Guille M-M. Chitin-protein supramolecular order in arthropod cuticles: analogies with liquid crystals // In: Chitin in life science / Ed. Giraud-Guille M-M. France, 1996.- P. 1-10.

36. Hamodrakas S.J., Willis J.H., Iconomidou V.A. A structural model of the chitin-binding domain of cuticle proteins // Insect biochemistry and molecular biology.-2002.-V.32.- N.l 1.-P.1577-1583.

37. Tellam R.L., Eisemann G. Chitin is only a minor component of the peritrophic matrix from larvae of Lucilia cuprina // Insect biochemistry and molecular biology.-2000.-V.30.- N. 12.-P. 1189-1201.

38. Шовен P. Физиология насекомых. Перевод с фран. В.В. Хвостовой / Под. ред. Е.Н. Павловского.-М: Ин. Лит-ры, 1953.-494с.

39. Харсун А.И. Биохимия насекомых. Кишинев: Карта, 1976.-С.170-181.

40. Курченко В.П., Кукулянская Т.А.,Новиков Д.А. Физико-химические и биологические свойства меланиновых пигментов // Мат. VII Международной конф. "Современные перспективы в исследовании хитина и хитозана".-М.: ВНИРО, 2003 .-С. 23- 31.

41. Барабой В.А. Меланин: структура, биосинтез биологические функции // Украинский биохимический журнал.-1999.-Т.71.-№4.-С. 5-13.

42. Бриттон Г. Биохимия природных пигментов. М: Мир, 1986.-436с.

43. Riley Р.А. Melanin // Int. Biochem.Cell Biol.-1997.-V.29.-N.1 l'.-P. 12351239.

44. Бышнева Л.Н., Сенчук В.В. Влияние меланинов на перекисное окисление липидов // Прикладная биохимия и микpoбиoлoгия.-2001.-T.37.-N^l.-C.105-109.

45. Борщевская М.И., Васильева С.М. Развитие представлений о биохимии и фармакологии меланиновых пигментов // Вопросы медицинской химии.-1999.- Т.45 .-№ 1 .-С.7-15

46. Барабой В.А. Структура, биосинтез меланинов, их биологическая роль и перспективы применения//Успехи современной биологии.-2001.-Т.121.-№1.-С.36-46.

47. Феофилова Е.П. Ключевая роль хитина в образовании клеточной стенки грибов приведено в "Хитин и хитозан. Получение, свойства и применение" /

48. Под. ред. К.Г. Скрябина, Г.А. Вихоревой, В.П. Варламова,- М: Наука, 2002.-С.91-99.

49. Горбунова Н.П. Альгология: Уч. пособие для вузов по спец. «Ботаника» -М.: Высш.шк., 1991. 256с.

50. Николаев В.А., Харвуд Д.М. Морфология, таксономия и система классификации центрических диатомовых водорослей. — СПб.: Наука, 2002. -118с.

51. Ерофеев Н.С. Основы биологии дробянок, водорослей, грибов и лишайников: Уч. пособие. — Саранск: Из-во Мордов. ун-та, 2001.-172с.

52. Place A.R. The biochemical basis and ecological significance of chitin digestion // In: Chitin Enzymology / Ed. R.A.A. Muzzarelli. Atec, Italy, 1996.-V.2.- P. 39-54.

53. No H.K., Meyers S.P. Preparation of chitin and chitosan. // In: Chitin handbook / Ed. R.A.A. Muzzarell, M.G Peter. Atec, Italy, 1997.-P.475-489.

54. Tolaimate A., Desbrieres J, Rhazi M., Alagui A. Contribution to the preparation of chitins and chitosans with controlled physico-chemical properties // Polymer.- 2003.- V.44.- N.26.-P.7939-7952.

55. Вахтер P., Тесманн X., Свеннинг P., Ользен P., Стенберг Э. Катионные полимеры биологического происхождения. Патент № 2159253. Россия. 1995.

56. Percot A., Viton С., Domard A. Optimiztion of chitin extraction from shrimp shells // Biomacromolecules. 2003.-V.4.- N.1.-P.12-18.

57. Куприна Е.Э., Водолажская C.B. Способы получения и активации хитина и хитозана приведено в "Хитин и хитозан. Получение, свойства и применение" / Под. ред. К.Г. Скрябина, Г.А. Вихоревой, В.П. Варламова.- М: Наука, 2002.-С.44-63.

58. Банников В.В., Львович Ф.И., Фрайман Д.Б. Способ получения хитозана. Патент №2073017. Россия. 1997.

59. Teng W-L., Khor E., Tan Т., Lim L-Y., Tan S-C. Concurrent production of chitin from shrimp shells and fungi // Carbohydrate Research.-2002.-V.332.- N.3.-P.305-316.

60. Tsai G-J., Su W-H., Chen H-C., Pan C-L. Antimicrobial activity of shrimp chitin and chitosan from different treatments and applications of fish preservation // Fisheries science.-2002.- V.68.- N.1.-P.170-177.

61. Wang S-L., Chio S-H. Deproteinization of shrimp and crab shell with the protease of Pseudomonas aeruginosa K-187 V/ Enzyme and microbial technology. -1998.-V.22.- N.7.-P.629-633.

62. Yang J-K., Shih I-L., Tzeng Y-M., Wang S-L. Production and purification of protease from a Bacillus subtilis that can deproteinize crustacean wastes // Enzyme and microbial technology.-2000.-V.26.- N.5/6.-P. 406-413.

63. Ежова E.A. Модификация "холодного способа" деацетилирования хитина // Мат. VII конф. "Современные перспективы в исследовании хитина и хитозана".-М.: ВНИРО, 2003. С. 17-19.

64. Chang К. L. В., Tsai G., Lee J., Fu W.-R. Heterogeneous N-deacetylation of chitin in alkaline solution // Carbohydrate Research.- 1997.-V.303.-№ 3.-P.327-332.

65. Rege P.R., Block L.H. Chitosan processing: influence of process parameters during acidic and alkaline hydrolysis and effect of the processing sequence on the resultant chitosan's properties // Carbohydrate Research.-1999.-V.321.- N.3-4.-P.235-245.

66. Tsigos I., Martinou A., Varum K.l M., Boutiotis V. Enzymatic deacetylation of chitinous substrates employing chitin deacetylases // In: Advan.Chitin Sci. / Ed. A. Domard, C. Jeuniaux, R. Muzzarelli. G. Roberts. France, 1995.-V.1.-P. 59 69.

67. Tsigos I., Martinou A., Kafetzopoulos D., Bouriotis V. Chitin deacetylases: new, versatile tools in biotechnology // Trends in biotechnology.-2000.-V.18.- N.7. P.305-312.

68. Martinou A., Tsigos I., Koutsioulis D., Bouriotis V. Chitin deacetylases: from basic research to biotechnological applications // In: Chitin Enzymology / Ed. R.A.A. Muzzarelli. Atec, Italy, 2001.- P. 503-510

69. Martinou A., Kafetzopoulos D., Bouriotis V. Chitin deacetylation by enzymatic means: monitoring of deacetylation processes / Carbohydrate Research.-1995.-V.273.- N.2.-P.235-242.

70. Win N-N., Stevens W.F. Enzymatic deacetylation of chitin // In: Chitin Enzymology / Ed. R.A.A. Muzzarelli. Atec, Italy, 2001.- P.553-563.

71. Pettersen H., Sannes A., Holme H.K., Kristensen A.H., Dornish M., Smidsrod.O. Thermal depolymerization of chitosan salts // In: Advan.Chitin Sci. / Ed M. G.Peter, A.Domard, R.A.A.Muzzarelli. Potsdam. Germany,-1999.- V4.-P.422-428.

72. Немцев C.B., Ильина C.M., Шинкарев C.M., Албулов А.И., Варламов В.П. Получение низкомолекулярного водорастворимого хитозана // Биотехнология.-2001 .-№ 6.-С. 37-42.

73. Tommeraas К., Va°rum К. М., Christensen В.Е, Smidsrod О. Preparation and characterisation of oligosaccharides produced by nitrous acid depolymerisation of chitosans // Carbohydrate Research. -2001. -V. 333.- N.2.-P. 137-144.

74. Allan G.G., Peyron M. Molecular weight manipulation of chitosan II: prediction and control of extent of depolymerization by nitrous acid // Carbohydrate research. -1995.-V.277.-N.2.- P.273-282.

75. Kubota N., Tatsumoto N., Sano Т., Toya K. A simple preparation of half N-acetylated chitosan highly soluble in water and aqueous organic solvents // Carbohydrate Research.-2000.-V.324.- N.4.-P.268-274.

76. Sato K., Kishimoto Т., Morimoto M., Saimoto H., Shigemasa Y. Hydrolysis of acetals in water under hydrothermal conditions // Tetrahedron Letters.-2003.-V.44.- N.47.-P.8623-8625.

77. Hai L., Diep Т., Nagasawa N., Yoshii F., Kume T. Radiation depolymerization of chitosan to prepare oligomers // Nuclear instruments and methods in physics research B.-2003.-V.208.-P.466-470.

78. Yoksan R., Biramontri S., Chirachanchai S. Structural characterization of y-ray irradiated chitosan // In: Advan. Chitin Sci. / Ed. K.Suchiva, S. Chandrkrachang, P. Methacanon, M.G. Peter. MTEC. Thailand, 2002.-V.5, P. 180-184.

79. Kardos N., Luche J-L. Sonochemistry of carbohydrate compounds // Carbohydrate Research.- 2001.-V.332.-N.2.- P. 115-131.

80. Chen R.H., Chang J.R., Shyur J.S. Effect of ultrasonic conditions and storage in acidic solutions on changes in molecular weight and polydispersity of treated' chitosan // Carbohydrate Research.- 1997.-V.299.- N.4.-P.287-294.

81. Kasaai M.R., Chin S.L., Arul J. Kinetic aspects of chitosan fragmentation by femtosecond laser // Journal of photochemistry and photobiology A: Chemistry.-2003.-V.159.- N.3.-P.207—211.

82. Kasaai M.R., Arul J., Chin S.L., Charle G. The use of intense femtosecond laser pulses for the fragmentation of chitosan // Journal of photochemistry and photobiology A: Chemistry.-1999.-V. 120.- N.3.-P. 201-205.

83. Вольфсон C.A., Никольский В.Г. Твердофазное деформационное разрушение и измельчение полимерных материалов. Порошковые технологии // Высокомол. соед. Серия Б.-1994.-Т.36.-№6.- С.1040-1056.

84. Роговина С.З., Акопова Т.А. Модификация полисахаридов в условиях сдвиговых деформаций // Высокомол. соед.-1994.-Т.36.-№ 4. С. 593-600.

85. Вихорева Г.А., Роговина С.З., Акопова Т.А., Зеленецкий С.Н., Гальбрайх JI.C. Изучение фракционного состава хитозана, полученного твердофазным и суспензионным методами // Высокомол. соед.-1996.-Т.38.-№ 10.-С.1781-1785.

86. Meens J., Schreiber С., Hain М. Screening of marine fungi for new chitin deacetylase enzymes // In: Chitin Enzymology / Ed. R.A.A. Muzzarelli. Atec, Italy, 2001.- P. 533-539.

87. Howard M.B., Ekborg N.A., Weiner R.M., Hutcheson S.W. Detection and characterization of chitinases and other chitin-modifying enzymes // J. Ind. Microbiol. Biotechnol.-2003.-V.30.- N.l 1.-P.627-635.

88. Koga D. Biological functions and properties of chitinase isozymes from yam // In: Advan.Chitin Sci. / Ed. A.Domard, C.Jeuniaux, R.Muzzarelli. G.Roberts. France, 1995.-V.1.-P. 70 77.

89. Reetarani S. P., Ghormade V., Deshpande M. V. Chitinolytic enzymes: an exploration // Enzyme and Microbial Technology.-2000.-V.26.-№ 7.- P.473^83.

90. Schrempf H. The chitinolytic system of Streptomysetes // In: Advan.Chitin Sci. / Ed. A. Domard, C. Jeuniaux, R. Muzzarelli. G.Roberts. France, 1995.-V.1.-P. 123 128.

91. Ilyina A.V., Tatarinova N.Yu., Varlamov V.P. The preparation of low-molecular-weight chitosan using chitinolytic complex from Streptomyces kurssanovii И Process Biochemistry.-1999.- V.34.- N.9.-P.875-878.

92. Ильина A.B., Варламов В.П., Мелентьев А.И., Актуганов Г.Е. Деполимеризация хитозана хитинолитическим комплексом бактерии рода Bacillus sp. 739 // Прикладная биохимия и микробиология.-2001.-Т. 37.-№2.-С. 160-163.

93. Новиков В.Ю., Мухин В.А. Деполимеризация хитозана под действием ферментов гепатопакреаса камчатского краба Paralithodes camtschaticus // Прикладная биохимия и микробиология.-2003.-Т.39.- №5.-С.530-535.

94. Ильина А.В., Ткачева Ю.В., Варламов В.П. Деполимеризация высокомолекулярного хитозана ферментным препаратом Целловиридин Г20х // Прикладная биохимия и микробиология.-2002.-Т.38.-№ 2.-С.132-135.

95. Kittur F.S., Kumar A.B.V., Tharanathan R.N. Low molecular weight chitosans preparation by depolymerization with Aspergillus niger pectinase, and characterization // Carbohydrate Research.-2003.-V.338.-№ 12.-P.1283 -1290.

96. Kumar A.B.V., Gowda L.R., Tharanathan R.N. Non-specific depolymerization of chitosan by pronase and characterization of the resultant products // Eur. J. Biochem.-2004.-V.271.-N.4.-P.713-723.

97. Kumar A.B.V., Varadaraj M.C., Lalitha R.G., Tharanathan R.N. Low molecular weight chitosans: preparation with the aid of papain and characterization // Biochimica et Biophysica Acta.-2004.-V.1670.-N.2.- P. 137- 146.

98. Muzzarelli R.A.A., Xia W., Tomasetti M., Ilari P. Depolymerization of chitosan and substituted chitosan with the aid of a wheat germ lipase preparation // Enzyme and microbial technology.- 1995.-V.17. N.6. P. 541-545.

99. Zhang H., Du Y., Yu X., Mitsutomi M., Aiba S. Preparation of chitooligosaccharides from chitosan by a complex enzyme // Carbohydrate Research.-1999.-V.320.-N.3/4. -P. 257-260.

100. Лопатин C.A., Папков B.A., Варламов В.П. Гидролиз хитозана иммобилизированными ферментными препаратами // Мат. VII конф. "Современные перспективы в исследовании хитина и хитозана". М.: ВНИРО, 2003.-С 398-402.

101. Быков В.П., Быкова В.М., Головкова Г. Н. Хитин и хитозан из биомассы личинок мух. // Тез. 4-ой Всерос. конф. "Производство и применение хитина и хитозана". М: ВНИРО, 1995.- С. 10-12

102. Шыш С.И., Винокурова Г.В. Способ получения хитина и способ получения хитозана. Патент № 2139887. Россия. 1996.

103. Немцев С.В., Зуева О.Ю., Исмаилов В .Я., Варламов В.П. Кутикула жуков станет новым источником хитина и хитозана // Мат. VII конф. "Современные перспективы в исследовании хитина и хитозана".-М.: ВНИРО, 2003.-С. 36-42.

104. Кузин Б.А., Бабиевский К.К., Прохоренко Г.К., Кузин А.Б. Способ получения хитозана. Патент № 2067588. Россия. 1996.

105. Struszczyk М.Н., Hahlweg R., Peter M.G. Comparative analysis of chitosans from Insects and Crustacean // In: Advan.Chitin Sci. / Ed. M.G. Peter, A. Domard, R.A.A. Muzzarelli. Potsdam. Germany, 2000.-V 4.-P 40-49.

106. Немцев C.B., Зуева О.Ю., Хисматуллин Р.Г., Хисматуллин M.P., Лариков В.В., Варламов В.П. Хитозан из подмора пчел новый продукт пчел // Пчеловодство.-2001.-№5.-С. 50-51.

107. ГОСТ 7636-85 Рыба, морские млекопитающие, морские беспозвоночные и продукты их переработки. 116 с.

108. Lim S., Hattori К., Hudson S.M. Preparation of a fiber-reactive chitosan derivative with enhanced antimicrobial activity / In: Advan.Chitin Sci. / Ed. M.G. Peter, A. Domard, R.A.A. Muzzarelli. Potsdam, Germany, 2000.-V 4.-P 454-459.

109. Твердохлебова И.И. Конформация макромолекул (визкозиметрический метод оценки). -М.: Химия, 1981.- 281с.

110. Wang W., Во S., Li S., Qin W. Determination of the Mark-Houwink equation for chitosans with different degree of deacetylation // Int. J. Biol. Macromol.-1991 .-V. 13 .-N.5 .-P.281-285.

111. Spektor T. //Anal. Biohem.-1978.-V.86.-P. 141 -146.

112. Westall F., Hesser H. Fifteen-minute acid hydrolysis of peptides //Anal Biochem.- 1974.- V.61.-N.2.- P.610-613.

113. Miller G.L. //Anal.Biochem.-1957.-V.31.-N.3.-P.426-428.

114. Климова В. А. Основные микрометоды анализа органических соединений.-М.: Химия, 1967.-207с.

115. Лях С.П., Рубан E.JL Микробные меланины.-М.: Наука, 1972.-185с.

116. Уэндландт У. Термические методы анализа / пер. с англ. Под ред. Степанова В.А., Берштейна В.А. .-М.: Мир, 1978. 526с.

117. ГОСТ. Р 50457-92. Жиры и масла животные и растительные. Определение кислотного числа и кислотности.

118. ГОСТ 17362-71 Изделия косметические. Метод определения числа омыления.

119. ГОСТ Р 51487-99. Изделия косметические. Метод определения перекисного числа.

120. Ионная имплантация полимеров / Под. ред. В.Б. Оджаева, И.П. Козлова, В.Н. Попок, Д.В. Свиридова. Минск: Изд-во БГУ, 1998. - 197 с.

121. Курченко В.П., Гавриленко Н.В., Исмаил И., Пикулев А.Т. Кинетика окисления бензидина и его производных с участием различных гемопротеинов // Вестник БГУ. 1991. - № 2. - С. 28-31.

122. O'Brien P. Multiple mechanisms of metabolic activation of arilamone cancerogens // Free Radicals in Biology / Ed. W. Pry or. 1984. -Vol. 6.-314 p.

123. Остерман JI.A. Методы исследования белков и нуклеиновых кислот: электрофорез и ультрацентрифугирование. М.: Наука, 1981.-260 с.

124. Кукулянская Т.А., Курченко Н.В., Курченко В.П., Бабицкая В.Г. Физико-химические свойства меланинов, образуемых чагой в природных условиях и при культивировании // Прикладная биохимия и микробиолоия. -2002.- Т.38.- №1.-С. 68-72.

125. Неклюдов А.Д., Иванкин А.Н., Бердутина А.В. Свойства и применение белковых гидролизатов // Прикладная биохимия и микробиология.-2000.-Т.36.-№5-С. 525-534.

126. Лях С.П. Микробный меланиногенез и его функции. М.: Наука. 1981. 274с.

127. Slokar Y.M., Majcen Le Marechal A. Methods of decoloration of textile wastewaters // Dyes and Pigments.-1998.- V.37.-N.4.- P. 335-356.

128. Brooks R.E., Moore S.B. Alkaline hydrogen peroxide bleaching of cellulose // Cellulose.-2000.-V.7. N.3. -P. 263-286.

129. Bartkowiak A. Binary polyelectrolyte microcapsules based on natural polysaccharides. Dissertation. Szczecin. 2001. P. 102.

130. Vachoud L., Zydowicz N., Domard A. Physicochemical behaviour of chitin gels // Carbohydrate Research.-2000.-V.326. N.4.- P.295-304.

131. Yang B.Y., Montgomery R. Degree of acetylation of heteropolysaccharides // Carbohydrate Research.-2000.-V.323.- N.l-4. -P. 156-162.

132. Стояченко И.А., Варламов В.П. Очистка и некоторые свойства хитиназ из Streptomyces kurssanovii II Биотехнология.-1993.- №2.- С. 29-36.

133. Azarkan М., Moussaoui A., Wuytswinkel D., Dehon G., Looze Y. Fractionation and purification of the enzymes stored in the latex of Carica papaya И Journal of Chromatography B. 2003 . V.790.-N.1/2.-P. 229-238:

134. Rubin B.R., Talent J.M., Kongtawelert P., Pertusi R.M., Forman M.D., Gracy R.W. Oral polymeric N-acetyl-D-glucosamine and osteoarthritis // J. Am. Osteopath. Assoc. -2001. V. 101. N.6. - P; 339-344.

135. Новиков Д.А., Курченко В.П., Азарко И.И. Фотопротекторные свойства меланинов из винограда (Vitis vinifera) и черного чая (Thea sinensis) // Радиационная биология. Радиоэкология.-2001.-Т.41.-№6. С. 664-670.

136. Бабицкая В.Г., Щерба В.В. Природа меланиновых пигментов некоторых микро- и макромицетов // Прикладная биохимия и микробиология. -2002.-Т.38.-№.3. С. 286-291.

137. Жеребин ЮЛ., Сава В.М., Богатский A.B. Исследование природы парамагнетизма эномеланинов. 1. Индуцированный анаон-радикал семихинона// Журн. общ. химии. 1983. - Т.53. - № 1. - С. 164-172.

138. Жеребин lO.JL, Сава BJVL, Богатский A.B. Исследование природы парамагнетизма эномеланинов. II. Феноксильный радикал // Журн. общ. химии. 1983. - Т. 53; - №2. - С. 272-276.

139. Жеребин ЮЛ., Сава В.М., Богатский A.B. Исследование природы парамагнетизма эномеланинов. III. Донорно-акцепторные взаимодействия // Журн. общ. химии. 1984. - Т. 54. - № 6. - С. 1340-1348.

140. Грасси Н., Скотт Дж. Деструкция и стабилизация полимеров.-М.: Мир, 1988.- 246 с.

141. Новиков Д.А. Биохимические свойства меланинов из винограда (Vitis vinifera) и черного чая (Thea sinensis).: Автореф. .дис.кан.биол.наук.-Минск, 2002.-21с.

142. Урьяш В.Ф. Термодинамика хитина и хитозана приведено в "Хитин и хитозан. Получение, свойства и применение" / Под.ред. К.Г. Скрябина, Г.А. Вихоревой, В.П. Варламова. М: Наука, 2002.-С. 119-129.

143. Щерба В.В., Бабицкая В.Г., Курченко В.П:, Иконникова Н.В., Кукулянская Т.А. Антиокислительные свойства меланиновых пигментов грибного происхождения // Прикладная биохимия и микробиология.-2000.-Т.36.-Ж5.- С. 569-574.

144. Александрова В.А., Обухова Г.В., Домнина Н.С., Кондакова Н.В., Топчиев Д. А. Конъюгаты хитозана с некоторыми природнымиантиоксидантами // Мат. 7-ой конф. "Современные перспективы в исследовании хитина и хитозана".М.: ВНИРО,- С. 218-220.

145. Курченко В.П., Сенчук В.В. Современные подходы для экспресс-анализа генотоксичности ксенобиотиков // Мат. Международной научной конф. "Ксенобиотики и живые системы". Минск, 2000 - С. 273-276.

146. Курченко В.П., Новиков Д.А., Желдакова Р.А. Антимутагенные свойства эномеланина // Мат. V Международного съезда "Актуальные проблемы создания новых лекарственных препаратов природного происхождения" СПб., 2001г. - С.74-78.

147. Naml K-S., Choi Y-R., Shonl Y-H. Evaluation of the antimutagenic potential of chitosan oligosaccharide: Rec, Ames and Umu tests // Biotechnology Letters.-2001.-V.23.-N.12.- P. 971-975.

148. Yevdokimov Yu. M., Salyanov V.I. Liquid crystalline dispersions of complexes formed by chitosan with double-stranded nucleic acids // Liquid crystals.-2003.- V.30.-N.9.-P. 1057-1074.

149. Je J-Y., Park P-J., Kim S-K. Radical scavenging activity of hetero-chitooligosaccharides // Eur. Food Res. Technol.-2004.-V.219.- N.I.- P.60-65.

150. Xie W., Xu P., Liu Q. Antioxidant activity of water-soluble chitosan derivatives // Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters. -2001.-V.11.-N.13.-P. 1699-1701.

151. Schulz P.C., Rodriguez M.S., Del Blanco L.F., Pistonesi M., Agullo' E. Emulsification properties of chitosan // Colloid and Polymer Science.- 1998,-V.276. N.12.- P. 1159-1165.

Информация о работе

Зуева, Ольга Юрьевна
кандидата технических наук
Щелково, 2004
ВАК 03.00.23

Диссертация

Разработка биотехнологических процессов получения биологически активных соединений из медоносных пчел и исследование их свойств - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Разработка биотехнологических процессов получения биологически активных соединений из медоносных пчел и исследование их свойств - тема автореферата по биологии, скачайте бесплатно автореферат диссертации

Похожие работы