Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Разработка набора реагентов для определения уровня антител к респираторно-синцитиальному вирусу крупного рогатого скота в иммуноферментном анализе

ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "Разработка набора реагентов для определения уровня антител к респираторно-синцитиальному вирусу крупного рогатого скота в иммуноферментном анализе"

Кочиш Татьяна Юрьевна

РАЗРАБОТКА НАБОРА РЕАГЕНТОВ ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ УРОВНЯ АНТИТЕЛ К РЕСПИРАТОРНО-СИНЦИТИАЛЬНОМУ ВИРУСУ КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА В ИММУНОФЕРМЕНТНОМ АНАЛИЗЕ

03.00.23 - биотехнология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук.

Шелково - 2004 г.

Кочиш Татьяна Юрьевна

РАЗРАБОТКА НАБОРА РЕАГЕНТОВ ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯУРОВНЯАНТИТЕЛ К РЕСПИРАТОРНО-СИНЦИТИАЛЬНОМУ ВИРУСУ КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА В ИММУНОФЕРМЕНТНОМ АНАЛИЗЕ

03.00.23 - биотехнология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук.

Шелково - 2604 г.

Работа выполнена во Всероссийском научно-исследовательском и технологическом институте биологической промышленности (ВНИТИБП) Российской академии сельскохозяйственных наук.

Научный руководитель:

доктор биологических наук Дмитрий Павлович Кузнецов

Официальные оппоненты:

доктор ветеринарных наук, профессор Василий Иванович Белоусов.

заслуженный деятель науки РФ, доктор ветеринарных наук,

профессор Валентин Ильич Уласов

Ведущее учреждение - Всероссийский научно-исследовательский институт

экспериментальной ветеринарии им. Я.Р.Коваленко.

Защита состоится 29 октября 2004 года в 10 часов на заседании диссертационного совета по защите диссертаций на соискание ученой степени доктора наук Д 006.069.01 во Всероссийском научно-исследовательском и технологическом институте биологической промышленности (141142, г. Щелково, Московская область, пос. Биокомбинат, ВНИТИБП).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке института.

Автореферат разослан 28 октября 2004г.

Ученый секретарь диссертационного совета кандидат биологических наук

Ю.Д.Фролов

1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

1.1. Актуальность темы. Одним из движущих факторов развития экономики нашей страны является научно-технический прогресс, способствующий ускорению развития народного хозяйства путем интенсификации науки и производства, внедрения новых технологий. Процесс интенсификации охватывает и биологию в самом широком смысле слова.

Перевод животноводства на промышленную основу наряду с большими техническими и экономическими преимуществами имеет ряд недостатков, таких как создание благоприятной ситуации для массового распространения инфекционных заболеваний. В их числе и так называемые «малые» респираторные вирусные инфекции крупного рогатого скота. Они вызываются как самостоятельно, так и в различных сочетаниях вирусами парагриппа-3 (ПГ-3), инфекционного ринот-рахеита (ИРТ), вирусной диареи (ВД), аденовирусами, респираторно-синцитиальным вирусом (РСВ), нанося огромный экономический ущерб животноводству. Эти заболевания представляют значительную проблему в ветеринарии еще и потому, что протекают со сходными клиническими симптомами. По этой причине особенно велика роль лабораторной диагностики вирусных болезней крупного рогатого скота.

Одним из этиологических агентов, вызывающих вспышки острых респираторных заболеваний у крупного рогатого скота, овец и коз различного возраста является респираторно-синцитиальный вирус (РСВ), представитель семейства па-рамиксовирусов, рода пневмовирусов.

Респираторно-синцитиальная инфекция крупного рогатого скота контагиозная болезнь, клинически проявляющаяся повышением температуры, снижением аппетита, затрудненным дыханием, одышкой, истечением из носа, сильным кашлем с последующим развитием бронхопневмоний и интерстициальных эмфизем.

PC - инфекция не вызывает большого отхода животных, но тяжелое и длительное течение с осложнениями приводит к потере продуктивности, вынужденному убою крупного рогатого скота, нанося тем самым значительный экономический ущерб животноводству.

Однако, в отличие от других вирусных респираторных инфекций, распространение и наносимый экономический ущерб этим заболеванием остаются изученными недостаточно, что связано со сложностью выделения и культивирования РС-вируса.

Это в свою очередь затрудняет получение в достаточном количестве и с необходимой инфекционной активностью вирусного сырья, для диагностических препаратов и средств специфической профилактики.

В настоящее время PC - инфекция крупного рогатого скота зарегистрирована во многих странах мира: Бельгии, Японии, Англии, США, Нидерландах, Венгрии, Чехии, Словакии, ,Болгарии, в том числе и с 1975года в России (Халенев Г.А., Гуненков В. В.)

С 1977г. биологической промышленностью выпускается набор сухих диаг-ностикумов для диагностики PC-инфекции крупного рогатого скота, разработчиками которого являются Гуненков В.В., Халенев Г.А. Набор применяют для обнаружения вирусного антигена в патматериале методом иммунофлуоресценции (ИФ), выделения вируса и его идентификация в реакциях ИФ, связывания комплемента (РСК) и диффузной преципитации (РДП), а также для выявления специфических антител в сыворотке крови больных и переболевших животных в РДП. Однако его применение было очень ограничено, из-за трудностей интерпретации полученных данных. Ранее этот диагностический набор сыграл большую роль в диагностике PC-инфекции крупного рогатого скота в нашей стране, его применение позволило установить наличие инфекции.

При диагностике вирусных и бактериальных инфекций в ветеринарии все более широкое применение находят такие современные и высокоточные методы как молекулярная гибридизация и полимеразная цепная реакция (ПЦР). Однако ввиду их высокой стоимости, сложности в постановке и необходимости дорогостоящего оборудования и реактивов, метод определения антигенов и антител с помощью иммуноферментного анализа (ИФА) при оптимальном соотношении себестоимость-чувствительность остается действенным инструментом в ветеринарной лабораторной практике. Высокая разрешающая способность этого метода

обусловлена, главным образом, природой лиганда, степенью очистки компонентов и чувствительностью приборов, регистрирующих наблюдаемый эффект. Таким образом, очистка и концентрирование вирусов является решающим условием при изготовлении диагностикумов и получении высокоактивных иммунных сывороток, используемых при создании компонентов, необходимых для проведения иммуноферментного анализа.

Быстрый и точный диагноз PC-инфекции крупного рогатого скота является решающим условием организации необходимых мер борьбы с этим заболеванием.

1.2. Цели и задачи исследования.

В связи с вышеизложенным, целью настоящей работы являлась разработка набора на основе аффинно-очищенных и концентрированных антигенов РС-вируса КРС, штамм «Randall», для использования их в качестве компонента набора для определения уровня антител в крови больных, переболевших и вакцинированных животных в иммуноферментном анализе.

Решались следующиезадачи:

1.2.1. Сравнить условия репродукции PC-вируса, штамм «Randall», в первично-трипсинизированной культуре клеток почки (ПЭК), легкого (ЛЭК), трахеи (ТЭК), сердца (СЭК) эмбриона коровы и перевиваемых линий ПТ-80 и Тауэр;

1.2.2. Разработать метод получения очищенного и концентрированного антигена

PC-вируса, штамм «Randall», репродуцированного в культуре клеток.

1.2.3. Выделить IgG КРС, получить анти-IgG КРС антисывротки на кроликах, выделить анти-IgG КРС антитела и синтезировать анти-IgG КРС иммунопе-роксидазный коньюгат.

1.2.4. Выделить белки PC-вируса, штамм «Randall», иммобилизовать их в качестве лиганда на BrCN сефарозу.

1.2.5. На полученном сорбенте выделить специфические к антигенам РС-вируса антитела и иммобилизовать их в качестве лиганда на BrCN сефарозу.

1.2.6. Разработать компоненты набора для определения уровня антител к РС-вирусу крупного рогатого скота в иммуноферментном анализе на основе аффинно-очищеных антигенов РС-вируса.

1.2.7. Исследовать воспроизводимость результатов по определению уровня антител к PC-вирусу КРС, полученных с использованием разработанного имму-ноферментного набора;

1.2.8. Провести сравнительную оценку чувствительности и специфичности РН, РНГА и разработанного иммуноферментного Набора при определении уровня анти-РСВ антител в крови больного, переболевшего и вакцинированного крупного рогатого скота.

1.3. Научная новизна.

- В результате проведенной работы, разработан одноэтапный метод получения очищенных и концентрированных антигенов PC-вируса, репродуцированного в культуре клеток, с помощью препаративной аффинной хроматографии на ан-ти-РСВ igG Сефарозе.

- При изучении в электрофорезе белков PC-вируса, штамм «Randall», которые отщепляются при обработке Тритоном Х-100, выявлено 9 структурных глико-протеинов с молекулярной массой от 28 до 180 кД.

- По результатам иммуноблотинга показано, что 6 белков PC-вируса, которые отщепляются при обработке Тритоном Х-100, индуцируют выработку анти-РСВ антител в организме восприичивых животных.

- разработана технология изготовления иммуноферментного набора для определения уровня антител к PC-вирусу крупного рогатого скота на основе аффинно очищеных антигенов РС-вируса, штамм «Randall».

1.4. Практическая значимость работы.

Результаты проведенных исследований позволили разработать временную инструкцию по изготовлению набора реагентов для определения уровня антител к респираторно-синцитиальному вирусу крупного рогатого скота в иммунофер-ментном анализе и проект нормативной документации. Набор предназначается для индикации и количественного определения анти-РСВ антител в сыворотках крови КРС.

Внедрение в практику ветеринарии иммуноферментного набора для определения уровня антител к респираторно-синцитиальному вирусу позволит решить проблему массового эпизоотологического обследования поголовья КРС, составляющего основу мероприятий по ликвидации и предупреждению распространения данного заболевания.

1.5. Апробация работы.

Материалы исследований доложены и обсуждены на заседаниях Ученого совета ВНИТИБП (2002 - 2004г.г.), на международной научно-практической конференции молодых ученых «Научные основы производства ветеринарных биологических биопрепаратов», Щелково (2004 г).

По материалам диссертации опубликовано 3 работы.

1.6. Структура и объем диссертации. Материалы диссертации изложены на 143 страницах машинописного текста и состоят из следующих разделов: введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты собственных исследований, обсуждение результатов, выводы и практические предложения, список литературы, содержащий 69 отечественных и 167 зарубежных источников и приложение. В приложении представлены документы, подтверждающие результаты отдельных этапов работы, их научную и практическую ценность. Диссертация иллюстрирована 15 таблицами, 22 рисунками и 1 схемой.

Автор выражает глубокую благодарность академику РАСХН, профессору А.Я. Самуйленко за научно-методическую помощь в организации и проведении исследований.

2. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.1. Материалы и методы

Работа выполнена во ВНИТИБП в 2002 -2004 гг. в рамках Программы фундаментальных и приоритетных прикладных исследований по научному обеспечению развития агропромышленного комплекса Российской федерации на 2000 -2004г.

В работе использовали:

PC-вирус, штамм «Randall», репродуцированный в перевиваемой культуре клеток почки теленка - ПТ-80 и Тауэр, в первично-трипсинизированных культурах клеток почки (ПЭК), легкого (ЛЭК), трахеи (ТЭК) и сердца (СЭК) эмбриона коровы (на уровне 5 - 30-го субпассажа).

Питательные среды: среда Игла, 199, ГЛАХ (институт полиомиелита, г.Москва); сыворотка КРС для культуральных работ (ООО Фуро), фетальная сыворотка коров (ООО Фуро).

Животные: кролики массой 2,5 - 3,0 кг. Содержание и кормление кроликов проводили согласно принятым нормам.

Дезинтеграцию клеточных суспензий осуществляли на ультразвуковом дезинтеграторе УЗДН-2Т при 22 кГц в течение 10 секунд импульсивно 6 раз.

Концентрирование PC-вируса проводили осаждением ПЭГ с различной молекулярной массой и в различных концентрациях, высаливанием сульфатом аммония, ультрафильтрацией на полупроницаемых мембранах и осаждением ультрацентрифугированием при различных скоростях и продолжительности.

В работе по очистке PC-вируса от баластных белков использовали ультрацентрифугирование в градиентах сахарозы и Фикола-400. Плотность каждой фракции определяли на рефрактометре RL по составленным калибровочным кривым. В качестве контроля использовали дезинтегрированные ультразвуком неза-раженные PC-вирусом клетки ПТ-80.

Титр инфекционности вируса определяли по ТЦД5о/мл на культуре клеток ПТ-80 в 24-луночных микропланшетах для культуральных работ. Результаты оценивали по цитопатическому действию через 3-5 суток после заражения клеток и рассчитывали титр вируса по методу Ашмарина И.П. 8

Комплементсвязывающую активность PC-вируса определяли по методу Rossi G. с оценкой результатов реакции по общепринятой крестовой системе. В реакции использовали стандартные препараты гемолизина (Курская биофабрика) и комплемента (Щелковский биокомбинат), эритроциты барана, сыворотки КРС от животных с подтвержденным диагнозом и предварительно протестированные в РИГА.

Белки PC-вируса, штамм «Randall» отщепляли путем обработки вирус -содержащей суспензии Тритоном Х-100.

Общий белок определяли по методу Лоури и на спектрофотометре СФ-26. Процент очистки вируса рассчитывали на инфекционную дозу.

Вируснейтрализующую активность сывороток определяли в реакции вирус-нейтрализации на 96-ти луночных микропланшетах по методу Florent G.

Электрофорез в ДСН - ПААГ проводили по методу Лаэмли.

Электроперенос белков после окончания электрофореза в ДСН — ПААГ осуществляли по методике Тоубина.

Иммуноиндикацию белков на нитроцеллюлозных мембранах проводили в непрямом методе ИФА

Гипериммунные антисыворотки к IgG КРС получали по методу разработанному в лаборатории иммунологии и утвержденному на методическом совете ВНИТИБП.

Иммуноглобулины класса G (IgG) выделяли из цельной сыворотки КРС высаливанием сернокислым аммонием с последующим обессоливанием препарата гельфильтрацией на сефадексе G-25 и очисткой ионообменной хроматографией на ДЕАЕ-Трисакрил-М.

Очистку анти-IgG проводили с помощью аффинной хроматографии на колонке с иммобилизованными на BrCN-Сефарозу 4В очищенными иммуноглобулинами.

Контроль чистоты препаратов IgG осуществляли с помощью диск-электрофореза в 7,5 % полиакриламидном геле (ПААГ).

Однородность и специфичность препаратов IgG проверяли с помощью им-муноэлектрофореза.

Для получения коньюгатов анти-IgG КРС с пероксидазой из хрена использовали перийодатный метод Nakane P. При проверке активности коньюгатов использовали метод прямого твердофазного ИФА. Рабочее разведение коньюгата определяли согласно временной инструкции по изготовлению и контролю антивидовых иммуноглобулинов, меченных пероксидазой, утвержденной Главбио-промом Агропрома СССР в 1986г. Реакцию учитывали на автоматическом спектрофотометре.

В работе использовали стандартные методы прямого и непрямого твердофазного ИФА на 96 луночных микропланшетах по Engvall и др., а также метод конкурентного ИФА по Van Weemen и др. Результаты анализа учитывали визуально и фотометрически через 10-15 минут после внесения субстратного раствора.

Результаты исследований обрабатывали статистически в программе Microsoft Excel.

2.2. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Выбор культуры клеток для репродукции PC-вируса, штамм «Randall».

Респираторно-синцитиальный вирус, штамм «Randall» репродуцировали в перевиваемой культуре клеток почки теленка - ПТ-80 и Тауэр, в первично-трипсинизированных культурах клеток почки (ПЭК), легкого (ЛЭК), трахеи (ТЭК), сердца (СЭК) эмбриона коровы (на уровне 5 - 30-го субпассажа).

Клетки выращивали на культуральной среде,содержащей половину среды Игла, половину среды 199, 10% сыворотки КРС для культуральных работ, предварительно протестированной на наличие антител к PC-вирусу, либо 5% феталь-ной сыворотки КРС, 2 мМ глютамина, 1 мМ пирувата натрия и 40 единиц гента-мицина на литр среды.

После образования монослоя клеток его трижды отмывали раствором Хен-кса и инокулировали PC-вирус, штамм «Randall» в течение часа при 20 °С из расчета 1 -2 ТЦД5о на клетку. Затем добавляли бессывороточную среду ГЛАХ (гидро-

лизат лактальбумина на расворе Хенкса), содержащую 40 единиц гентамицина на литр среды.

После проявления 80% ЦПД клетки разрушали однократным замораживанием-оттаиванием, культуральные матрасы встряхивали и осаждали клеточный детрит центрифугированием при 5000 об/мин в течение часа.

Надосадочную вирус-содеожащую среду исследовали на инфекционную и комплементсвязывающую активность.

PC-вирус, выращенный в перевиваемой культуре ПТ-80, проявляется в реакции РСК в титрах 1:32 — 1:64, обладает инфекционностью на уровне 5,25 - 5,5 Ig ТЦД50/МЛ, 80% цитопатический эффект проявляется на 5 сутки культивирования. Ни в одном эксперименте не удалось репродуцировать PC-вирус, штамм «Randall» в перевиваемой культуре клеток - Тауэр. При репродукции PC-вируса в первичнотрипсинизированных культурах клеток эмбриона коровы, несмотря на более позднее проявление цитопатического эффекта (7-8 суток) вирус накапливался в титрах от 4,75 lg ТЦД5о/мл (СЭК) до 6,0 Ig ТЦД5о/мл (ЛЭК) и проявлялся в РСК в титрах от 1:16 до 1:128. Таким образом, при репродукции PC-вируса в культурах клеток наибольшее накопление вируса было достигнуто при использовании первичнотрипсинизированной культуры клеток легкого эмбриона коровы. Причем наиболее стабильные результаты были получены на ранних субпоссажах ЛЭК (5 — 10) и при использовании в ростовых средах фетальной сыворотки КРС.

Очистка и концентрирование РС-вируса.

Для получения очищенных и концентрированных препаратов РС-вируса было использовано несколько принципов выделения вируса из вируссодержащих суспензий.

При концентрировании PC-вируса, штамм «Randall», были изучены различные условия осаждения его полиэтиленгликолем (ПЭГ) с различным молекулярными массами: 3000,6000 и 20 000 дальтон в концентрации 5.0, 7,0 и 10,0%.

При концентрировании PC-вируса, штамм «Randall», репродуцированного в культуре клеток ЛЭК, полиэтиленгликолем очистка вируса варьирует от 11,5 до

90,5%. Потеря вируса равна 6,5 — 19,4%. Лучшие результаты получены в случае применения ПЭГ с молекулярной массой 6000 дальтон в концентрации 7%. Очистка вируса равна 90,5%, а потеря 6,5%.

Для концентрирования РС-вируса также был использован принцип осаждения вируса высаливанием. Для этой цели использовали 40% сульфат аммония — (N114)2804. До 90,4% вируса осаждается 40% сульфатом аммония при концентрировании в 100 раз. Очистка от балластных белков составляет в этом случае 66,4%.

Метод ультрафильтрации позволяет концентрировать препараты РС-вируса в 10 — 100 раз. Особенностью концентрирования вирусной суспензии на полупроницаемых мембранах является небольшая потеря инфекционной активности вируса от 5,7% при концентрировании в 10 раз до 14,5% - в 100 раз. Однако общее количество белка в концентрате при этом многократно увеличивается, что не позволяет добиться очистки вируса. Так при концентрировании вирусной суспензии по объему в 10 раз количество белка в расчете на инфекционную дозу вируса увеличивается на 13,8%, а при концентрировании в 100 раз на 42,3%.

Наряду с концентрированием вышеописанными методами испытывался также метод осаждения вируса высокоскоростным ультрацентрифугированием. Вирус из предварительно осветленной низкоскоростным центрифугированием культуральной жидкости осаждали при 90000g в течение 1, 2, 3, 4 и 5 часов. Высокоскоростное центрифугирование при 90000g в течение 5 часов позволяет практически полностью без потерь осадить РС-вирус из вируссодержащей суспензии. Очистка при этом достигает 91,0%

Концентрированную и частично очищенную вируссодержащую суспензию центрифугировали при 90000g в ступенчатом градиенте сахарозы от 15 до 55% с диапазоном изменения концентрации в 10%. По окончании ультрацентрифугирования собирали фракции по 1 мл. В каждой фракции измеряли рефрактометрический индекс, титр инфекционности, титр комплементсвязывающей активности и титр в ИФА Пик инфекционной активности приходится на фракции с плотностью 1,20г/см3, соответствующий уровню 45% сахарозы, с выходом вируса до 91,7%. Одновременно происходит очистка на 97,3%. Максимумы активности в ИФА и

РСК совпадают с пиком инфекционной активности. Однако ,в нижней фракции на дне центрифужной пробирки наблюдалась небольшая активность, как в РСК (1:4), так и в ИФА при полном отсутствии инфекционности данной фракции. Это наблюдение соответствует предложенной в 1962 году Grannof модели гетерозигот парамиксовирусов.

Определение плавучей плотности PC-вируса, штамм «Randall», репродуцированного в культуре клеток ЛЭК, позволило при очистке вируса использовать центрифугирование на «подушке» сахарозы или иначе на градиентную интерфазу. На дно центрифужной пробирки помещали «подушку» из 55% сахарозы с плотностью 1,25г/см3, затем наслаивали 45% сахарозу с плотностью 1,20г/см3, а сверху -25% сахарозу с плотностью 1,10г/см3. На такой преформированный ступенчатый градиент наслаивали вирусный препарат. Центрифугирование проводили при 90000g в течение 5 часов. Вирус локализовался в интерфазе между 25% и 55% сахарозы. Посторонние компоненты, с меньшей плавучей плотностью (белки и нуклеиновые кислоты), через зону 45% сахарозы не проходят и остаются в верхней части центрифужной пробирки. При этом достигается не только очистка на 99,6% (0,5мг/мл белка в исходном препарате и 0,01мг/мл - в конечном), но и концентрирование его в 10 раз. Выход вируса составил 99,2%.

Была также определена плавучая плотность вируса в градиенте Фиколла -400. Для этого очищенный и концентрированный вирус на этапе осаждения ПЭГ М-6000 ресуспендировали в 0,06М трис-HCl буфере, содержащем 0,1М NaCl и 1мМ ЭДТА (THE буфер), рН 7,3 и осветляли низкоскоростным центрифугированием при 5000об/мин в течении 10 минут. Вирус из надосадка осаждали ультрацентрифугированием при 90000g в течение 5 часов. Осадок ресуспендировали в THE буфере и наносили на линейный 10% - 40% градиент Фиколла-400. Центрифугирование проводили при 90000g в течение 5 часов.

По окончании центрифугирования собирали фракции по 1мл. В каждой фракции измеряли рефрактометрический индекс, титр инфекционности, титр комплементсвязывающей активности и активность в непрямом твердофазном ИФА. PC-вирус концентрировался в зоне, соответствующей 37% Фиколла-400 с

плотностью 1,19 г/см3, так как здесь был наивысший титр инфекционности вируса, его комплиментсвязывающая активность и активность в ИФА.

Фракции, содержащие PC-вирус, объединяли. Степень очистки определяли по отношению титра инфекционности вируса к количеству общего белка. В результате проведенной работы вирус был очищен на 99,5%, потери составили 7%.

Суммируя результаты экпериментов по концентрированию и очистке РС-вируса, штамм «Randall», репродуцированного в культуре клеток ЛЭК, можно заключить, что осаждение вируса ПЭГ с молекулярной массой 6000 Д в концентрации 7% наиболее оптимальный способ для первоначального'концентрирования и очистки, так как при концентрировании в 100 раз позволяет, во-первых, удалить до 90% баласного белка при потере не более 7% инфекционных частиц вируса, во-вторых, работать единовременно с большим объемом вируссодержащей суспензии. Сульфат аммония осаждает вместе с вирусным материалом большое количество баластного белка — очистка не превышает 67%. Ультрафильтрация, не-сморя на возможность работы с большими объемами вируссодержащего материала и сохранение до 85% инфекционных вирусных частиц, не позволяет добиться одновременной очитки, так как количество баластного белка, в расчете на инфекционную дозу, увеличивается при концентрировании в 100 раз на 42%. Осаждение вируса ультрацентрифугированием при 90000g в течение 5 часов позволяет практически без потерь осадить вирус на дно центрифужной пробирки при очистке до 91%, но очень трудоемка и позволяет единовременно очищать не более 40 мл вируссодержащей культуральной среды. Тоже самое относится и к ультрацентрифугированию в градиентах сахарозы и Фиколла 400.

Определив условия концентрирования PC-вируса, штамм «Randall», репродуцированного в культуре клеток ЛЭК, вышеописанными методами, была составлена схема получения концентрированного и очищенного вируса, включающая осаждение вируса из культуральной среды ПЭГ с молекулярной массой 6000 Д в концентрации 7%, переосаждение осадка ультрацентрифугированием при 90000g в течение 5 часов и осаждением полученного материала на градиентную интерфазу сахарозы.

Таким образом, получены препараты PC-вируса, штамм «Randall», репродуцированного в культуре клеток ЛЭК, которые использовались для изучения белкового состава вируса, выделения гликопротеинов, обладающих антигенной активностью, с целью синтеза иммуносорбента для выделения анти-РСВ антител из сывороток естественно переболевших животных.

При определении условий хранения PC-вируса, штамм «Randall», репродуцированного в культуре клеток ЛЭК, его помещали в условия, при которых, температура соответствовала -50°, -20°, -7°, +4°, +20° и +37°С.

PC-вирус хранится в условиях температуры от +4° до -50°С практически без снижения титра инфекционности в течение 1 месяца. При дальнейшем хранении вируса происходит снижение титра инфекционности на 1 lg ТЦД5о/мл практически ежемесячно.

В течение первых суток титр инфекционности PC-вируса, штамм «Randall», репродуцированного в культуре клеток ЛЭК, снижается с 5,75 до 5,5 lg в условиях температуры +20° и до 4,5 lg - при +37°С. Далее при температуре +37°С титр инфекционности снижается до 0 через 4 суток и до 2,25 lg при +20°С.

Антиген PC-вируса для определения уровня антител в иммунофермент-ном анализе

Для изучения белков, входящих в состав PC-вируса очищенную и концентрированную вируссодержащую суспензию обрабатывали 2% тритоном Х-100 и инкубировали при +20°С в течение 60 минут на шейкере. Затем нуклеокапсид и неразрушенные вирусные частицы осаждали центрифугированием при 100 тыс. g в течение четырех часов, а белки из надосадка концентрировали ультрафильтрацией на мембране с пределом исключения 3 кД до концентрации 500 мкг/мл. Далее белки разделяли электрофорезом в ДСН-ПААГ. Тритоном Х-Ю0 отщепляется 9 белков с ММ от 28 до 180 кД.

Вирусные белки, индуцирующие выработку анти-РСВ антител у восприимчивых к PC-инфекции КРС животных, определялись посредством иммуноблотин-га с индикацией белков в непрямом методе ИФА. В качестве анти-РСВ антисыво-

ротки использовали сыворотку от переболевших животных в разведении 1:50 (титр в непрямом ИФА 1:12800). Иммуноглобулины КРС выявляли антивидовым иммунопероксидазным коньюгатом. У переболевших животных вырабатываются антитела к 6 вирусным белкам с ММ от 42 до 180 кД.

Таким образом, в составе PC-вируса, штамм «Randall», репродуцированного в культуре клеток ЛЭК, выявлено 9 белков, отщепляющихся при обработке тритоном Х-ЮО с ММ от 28 до 180 кД. Шесть из них с ММ от 42 до 180 кД индуцируют выработку анти-РСВ антител у восприимчивых к PC-инфекции животных.

Концентрированные ультрафильтрацией белки PC-вируса, отщепленные Тритоном Х-100 были иммобилизованы на BrCN Сефарозу 4В по стандартной методике.

Полученный таким образом иммуносорбент был использован для аффинного выделения анти-РСВ антител из сыворотки естественно переболевших животных. Элюированные с колонки анти-РСВ IgG сразу переводили с помощью гель-хроматографии на Сефадексе G-25 в буфер для иммобилизации на носителе, концентрировали ультрафильтрацией и осветляли центрифугированием при 5000об\мин в течение 30 минут. Очищенные и концентрированные анти-РСВ IgG пришивали к активированной BrCN-Сефарозе 4В в количестве 8мг белка на 1мл геля, согласно инструкции производителя.

После заполнения колонки анти-РСВ IgG иммуносорбентом его трижды промывали 0,1 М глицин-HCI и ЗФР, затем уравновешивали ЗФР, содержащим 0,1% Тритон Х-100. Через подготовленную таким образом колонку пропускали вируссодержащую суспензию в режиме замкнутого реактора в течение ночи при +4°С. После отмывки колонки десятью объемами ЗФР, содержащим 0,1% Тритона Х-100, и пятью объемами ЗФР элюировали вирусные белки 0,1М глицин НС1, рН 2,5. Элюат немедленно нейтрализовали 1М NaOH.

Элюируемые фракции контролировали путем отбора 5 — 50мкл из собираемой фракции для неколичественного анализа по Бредфорду. Фракции, содержащие белок, объединяли и немедленно концентрировали для дальнейшего исследования ультрафильтрацией в ячейке ФМ001 на мембране с пределом исключения

ЗкД при давлении 0,ЗмПа до концентрации белка 0,1мг/мл. Затем колонку уравновешивали адсорбирующим буфером или хранили в адсорбирующем буфере, содержащем 0,02% азида натрия.

Степень очистки белка определяли с помощью электрофореза в 7,5% ДСН-ПААГ полученного препарата. С помощью аффинной хроматографии удается выделить гликопротеины РС-вируса практически без примесей.

Специфичность аффинно очищенных гликопротеинов определяли в имму-ноблотинге с анти-РСВ сывороткой КРС после электрофореза в 7,5% ДСН-ПААГ. Все гликопротеины сохранили свою антигенную активность после аффинной очистки на иммуносорбентах с анти-РСВ ¡яО.

Таким образом, была получена матрица для одностадийной очистки антигенов РС-вируса из вирус-содержащих суспензий, использование которой позволяет практически без потерь выделять антигены РС-вируса.

Тест-система для определения уровня антител к PC-вирусу КРС в им-муноферментном анализе

Для выявления специфических антител к РС-вирусу в сыворотках восприимчивых животных нами получены специфическая (из неблагополучных по РС-инфекции КРС хозяйств) анти-РСВ сыворотка, отрицательная (контрольная) сыворотка и коньюгат анти-1яО КРС с пероксидазой из хрена.

С целью оптимизации процесса постановки реакции, для увеличения точности, чувствительности и уменьшения расхода реактивов, необходимо подобрать концентрации используемых реагентов. Для определения оптимальной концентрации антигена при постановке ИФА его титровали с положительной и отрицательной сыворотками в разведении 1:200.

Оптимальное разведение антигена составило 1мкг/мл, что обеспечивало высокий уровень оптической плотности (0П490 равен 1,8 - 1,6) и достоверное различие результатов со специфической и контрольной сыворотками.

Для установления пороговой чувствительности ИФА определяли зависимость величины ОП49о продукта реакции от разведения сыворотки. Опыт прово-

дили при оптимальной концентрации сорбированного антигена вируса. Двукратные разведения положительной сыворотки начинали с разведения 1:50. Достоверно регистрируемое различие в показаниях ОП490 (более чем в 2 раза) наблюдалось при разведении специфической и контрольной сывороток с 1:200. При разведении ниже 1:100 наблюдается неспецифическое взаимодействие, что сказывается на результатах реакции.

Таким образом, была определена концентрация антигена PC-вируса и положительной сыворотки, которые могут быть использованы для определения уровня антител к PC-вирусу иммуноферментным методом.

Определение воспроизводимости, чувствительности и специфичности тест-системы для детекции уровня антител к PC-вирусу КРС в иммунофер-ментном анализе.

При разработке иммунологического контроля для подтверждения эффективности тест-системы использовалось несколько важных критериев, таких как воспроизводимость, чувствительность и специфичность.

В тесте на воспроизводимость использовались 5 планшетов для ИФА, сенсибилизированных антигеном PC-вируса. Высокоактивная, средне — и низкоактивная позитивная контрольная сыворотка проверялась на 30 из 96-ти лунок каждого из 5-ти планшетов. Данные были собраны по 15-ти планшетам и проанализированы. Коэффициент вариации и показатель степени адсорбции образца к среднему значению степени абсорбции положительной и нормальной контрольных сывороток были определены для оценки внутри- и межпланшетной воспроизводимости.

Коэффициент вариации среди лунок составлял от 3 до 6%. Коэффициент вариации между отдельными планшетами был менее 4% для любой сыворотки и незначительно отличался между отдельными лунками.

При определении чувствительности тест-системы планшеты были сенсибилизированы антигеном PC-вируса в рабочей концентрации. Высокоактивная анти-РСВ сыворотка была разбавлена нормальной контрольной сывороткой в соотно-

шении 1:2, 1:4, 1:8, 1:16, 1:32, 1:64 и 1:128. Эта калибровочная сыворотка была протестирована вРНГА и ИФА на 5 микропланшетах.

С помощью разработанной тест-системы по выявлению антител к РС-вирусу была продемонстрирована явная корреляция между 1оя2 титра в РНГА и титра в ИФА (коэффициент корреляции г2=87). ИФА был способен обнаружить специфические антитела к РС-вирусу в 5-7 разведениях высокоактивной ан-ти-РСВ сыворотки. РНГА может обнаружить специфические антитела только в первых трех разведениях. Все остальные разведения были негативны в РНГА.

При исследовании специфичности тест-системы для определения уровня анти-РСВ антител были протестированы коммерчески доступные анти-сыворотки КРС из наборов для выявленя антител к ИРТ, ПГ-3, аденовирусу 1 типа и РСВ в РНГА. Все сыворотки предварительно были протестированны в РНГА на предмет перекресных геакций с гетерологичными вирусами. Эти данные показывают, что ИФА обладает столь же высоким уровнем специфичности у известных позитивных анти-РСВ сывороток, как и РНГА и не работает с сыворотками к гетероло-гичным вирусам.

При определении чувствительности разработанной тест-системы методом ИФА было исследовано 839 сывороток КРС, полученных из различных хозяйств и определены благополучные и неблагополучные хозяйства.

Из всех исследованных сывороток произвольно взяли 236 с установленным титром в ИФА и исследовали в реакции вируснейтрализации и непрямой гемагг-лютинации.

Сравнительные исследования 236 сывороток КРС в ИФА, РН и РНГА показали, что 41 образец сывороток был отрицателен во всех трех реакциях, 6 образцов сывороток имели в ИФА титр 1:200 и были отрицательными в РН и РНГА, 189 исследуемых сывороток были позитивными во всех трех реакциях. Таким образом, если принять за стандарт значения полученные в РН и РНГА, применение которых для диагностики РС-инфекции утверждено Департаментом ветеринарии МСХ РФ, можно считать позитивными сыворотки титр которых в ИФА равен или превышает 1:400.

Таким образом, в результате проведенных исследований были получены компоненты для проведения ИФА при определении уровня антител к РС-вирусу КРС, определены условия постановки реакции, доказана воспроизводимость, чувствительность и специфичность разработанного теста.

Набор реагентов для определения уровня антител к респираторно-синцитиалъному вирусу КРСв иммуноферментном анализе.

Набор предназначен для выявления антител к вирусу респераторно-синцитиальной инфекции крупного рогатого скота путем постановки твердофазного иммуноферментного анализа (ИФА) с сыворотками крови больных, переболевших и вакцинированных животных при массовом серологическом обследовании поголовья КРС.

Набор представляет собой 2 комплекта биологических и химических компонентов, использующихся при постановке реакции, и иммунологического планшета, сенсибилизированного антигеном РС КРС. Биологические компоненты:

№ 1. Иммунологический планшет, сенсибилизированный антигеном РС-вируса — 2 шт.

№2. Коньюгат иммунопероксидазный анти-^О КРС 1 см3, - 2 фл. Химические компоненты:

№3. Буфер инкубационный 20 кратный концентрат, 20 см3,- 2 фл.

№4. Буфер субстратный, - 2 табл.

№5. Ортофенилендиамин (ОФД), 4 мг- 2 табл.

№6. Гидроперит (Н2О2), 2 табл.

№7. Стоп- реагент (1 М И2804), 10 см3, - 1фл.

№8. Позитивная контрольная сыворотка 0,05 см3 - 1фл.

№9. Нормальная контрольная сыворотка 0,05 см3 - 1фл.

Сущность иммуноферментной реакции заключается в специфическом взаимодействии антител из анализируемых сывороток и антигена РС с последующим выявлением иммунного комплекса с антивидовым иммунноперокси-

дазным коньюгатом, способным вызвать разложение субстрата с образованием окрашенного продукта ферментативной реакции.

На основании проведенной работы была разработана и утверждена «Временная Инструкция по изготовлению Набора реагентов для определения уровня антител к респираторно-синцитиальному вирусу КРС в иммуноферментном анализе.

Назначение разработки - создание технологии изготовления наборов.

Отзывы о Наборе положительные. Поступили просьбы о необходимости промышленного производства наборов и обеспечение ими потребностей ветеринарных служб.

"Набор реагентов для определения уровня антител к респираторно-синцитиальному вирусу КРС в иммуноферментном анализе" предназначен для серологической диагностики указанного заболевания и эпизоотологического обследования поголовья в племенных и пользовательных хозяйствах при организации оздоровительных в отношении РСВ КРС мероприятий в ветеринарных лабораториях республиканского и областного масштаба, на пунктах пограничного ветеринарного контроля для проведения проверки импортируемых животных. Внедрение в практику ветеринарии разработанного иммуноферментного Набора позволит решить проблему массового эпизоотологического обследования поголовья КРС, составляющего основу мероприятий по ликвидации и предупреждению распространения данного заболевания. Диагностикум может быть предложен для экспорта в страны со стационарным неблагополучием скота по РС-инфекции крупного рогатого скота.

Экономический эффект от применения наборов для диагностики респира-торно-синцитиального вируса крупного рогатого скота составит 120 тыс. рублей на тысячу исследований (в ценах 2004г).

Выводы.

1. При репродукции PC-вируса в культурах клеток наибольшее накопление вируса (до 6,0 Ig ТЦД5о/мл) было достигнуто при использовании первично-трипсинизированной культуры клеток легкого эмбриона коровы.

2. Разработана схема очистки и концентрирования PC-вируса, штамм «Randall», репродуцированного в культуре клеток ЛЭК, позволяющая получить препараты вируса очищенные на 99,6% в расчете на инфекционную дозу.

3. При изучении состава белков PC-вируса, штамм «Randall», репродуцированного в культуре клеток ЛЭК, полученных при обработке вирус-содержащей суспензии Тритоном Х-100, выявлено 9 структурных белков с ММ от 28 до 180 кД. По результатам иммуноблотинга 6 белков с ММ от 42 до 180 кД индуцируют выработку анти-РСВ антител в организме восприимчивых к PC-инфекции животных.

4. Показана возможность одноэтапной препаративной очистки антигенов РС-вируса из вирус-содержащих суспензий с помощью препаративной аффинной хроматографии на анти-РСВ IgG Сефарозе 4В.

5. При определении разброса результатов, полученных с использованием, разработанного Набора, установлено, что среди лунок коэффицент вариации не превышает 6%, между отдельными планшетами - менее 4%.

6. При сравнительной оценке специфичности и чувствительности разработанного Набора с РН и РИГА установлено, что 41 образец сывороток был отрицателен во всех трех реакциях, 6 образцов сывороток имели в ИФА титр 1:200 и были отрицательными в РН и РТГА, 189 исследуемых сывороток были позитивными во всех трех реакциях. Следовательно, можно считать позитивными сыворотки, титр которых в ИФА равен или превышает 1:400.

7. Разработана технология изготовления набора для определения уровня антител к PC-вирусу крупного рогатого скота в иммуноферментном анализе на основе аффинно-очищеных антигенов PC-вируса, штамм «Randall».

7. Практи ческие предложения.

На основе проведенной работы представлена нормативная документация:

«Временная Инструкция по изготовлению и контролю Набора реагентов для определения уровня антител к респираторно-синцитиальному вирусу крупного рогатого скота в иммуноферментном анализе» на основе аффинно очищеных антигенов респираторно-синцитиального вируса, штамм «Randall»» утверждена директором ВНИТИБП.

Проект технических условий на «Набор реагентов для определения уровня антител к респираторно-синцитиальному вирусу крупного рогатого скота в имму-ноферментном анализе»,

Проект «Временного наставления по применению «Набора реагентов для определения уровня антител к респираторно-синцитиальному вирусу крупного рогатого скота в иммуноферментном анализе».

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Кочиш Т.Ю., Кочиш И.И., Кузнецов Д.П. // Изучение репродукции респира-торно-синцитиального вируса крупного рогатого скота в первично-трипсинизированной культуре клеток почки, легкого, трахеи эмбриона коровы и перевиваемой культуры клеток ПТ-80.// Материалы международной научно-практической конференции молодых ученых «Научные основы производства ветеринарных биологических препаратов», 2004, с.с. 16-20.

2. Кочиш Т.Ю., Кочиш И.И., Кузнецов Д.П. // Очистка и концентрирование рес-пираторно-синцитиального вируса крупного рогатого скота. // Материалы международной научно-практической конференции молодых ученых «Научные основы производства ветеринарных биологических препаратов», 2004, с.с. 20 -24.

3. Кочиш Т.Ю., Кочиш И.И., Кузнецов Д.П. // Разработка тест-системы для детекции антител к респираторно-синцитиальному вирусу крупного рогатого скота в ИФА. // Материалы международной научно-практической конференции молодых ученых «Научные основы производства ветеринарных биологических препаратов», 2004, с.с. 24 - 28.

»17855

РНБ Русский фонд

2005-4 15022

Отпечатано в ООО "Мещера" зак. 068 тир. 100

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Кочиш, Татьяна Юрьевна

1. Введение

2. Обзор литературы.

2.1. Общая характеристика парамиксовирусов

2.2. Респираторно-синцитиальный вирус крупного рогатого скота

2.2. Историческая справка

2.2.2. Распространение болезни, клинические признаки и патологоанатомические изменения

2.2.3. Классификация, морфология и физико-химические свойства РС-вируса

2.2.4. Репликация РС-вируса

2.2.5. Антигенные свойства РС-вируса

2.2.6. Спектр патогенности возбудителя п экспериментальных условиях

2.3. Культуральные свойства PC - вируса

2.3.1. Культивирование PC - вируса в различных клеточных системах

2.3.2. Условия и методы культивирования. Питательные среды, сыворотки, добавки

2.3.3. Цитопатический эффект РС-вируса

2.3.4. Гемагглютинация и гемадсорбция РС-вируса

2.4. Лабораторная диагностика PC - инфекции крупного рогатого скота

2.4.1. Выделение PC - вируса и его идентификация

2.4.2. Серологическая диагностика PC — инфекции крупного рогатого скота

Введение Диссертация по биологии, на тему "Разработка набора реагентов для определения уровня антител к респираторно-синцитиальному вирусу крупного рогатого скота в иммуноферментном анализе"

1.1. Актуальность темы.

Одним из движущих факторов развития экономики н шей страны является научно-технический прогресс, способствующий ускорению развития народного хозяйства путем интенсификации науки и производства, внедрения новых технологий. Процесс интенсификации охватывает и биологию в самом широком смысле слова.

Перевод животноводства на промышленную основу наряду с большими техническими и экономическими преимуществами имеет ряд недостатков, ткаких как, создание благоприятной ситуации для массового распространения инфекционных заболеваний. В их числе и так называемые «малые» респираторные вирусные инфекции крупного рогатсл) скота [5]. Они вызываются как самостоятельно, так и в различных сочетаниях вирусами парагриппа-3 (ПГ-3), инфекционного ринотрахеита (ИРТ), вирусной диареи (В Д), аденовирусами, респираторно-синцитиальным вирусом (РСВ), нанося огромный экономический ущерб животноводству. Эти заболевания представляют значительную проблему в ветеринарии еще и потому, что протекают со сходными клиническими симптомами. По этой причине особенно велика роль лабораторной диагностики вирусных болезней крупного рогатого скота.

Одним из этиологических агентов, вызывающих вспынки острых респираторных заболеваний у крупного рогатого скота, овец и коз различного возраста является респиргторно-синцитиальный вирус (РСВ), представитель семейства парамиксовирусов, рода пневмовирусов.

Респираторно-синцитиальная инфекция крупного рогатого скота контагиозная болезнь клинически проявляющаяся повышением температуры, снижением аппетита, затрудненным дыханием, одышкой, истечением из носа, сильным кашлем с последующим развитием бронхопневмоний и интерстициальных эмфизем.

PC - инфекция не вызывает большого отхода животных, но тяжелое и длительное течение с осложнениями приводит к потере продуктивности, вынужденному убою крупного рогатого скота, нанося тем самым значительный экономический ущерб животноводству.

Однако, в отличие от других вирусных респираторнь: < инфекций, распространение и наносимый экономический ущерб этим заболеванием остаются изученными недостаточно, что связано со сложностью выделения и культивирования РС-вируса.

Это в свою очередь затрудняет получение в достаточном количестве и с необходимой инфекционной активностью вирусного сырья для диагностических препаратов и средств специфической профилактики.

Первоначально в 1957г. Ghanock R.M. et. al. [91] выделили PC-вирус человека и только в 1970г. Paccaud М.Р. et. al. [172] был выделен РС-вирус крупного рогатого скота антигенно-родственный р^спираторно-синцитиальному вирусу человека.

В настоящее время PC - инфекция крупного рогатого скота зарегистрирована во многих странах мира: Бельгии, Японии, Англии, США, Нидерландах, Венгрии, Чехии Словакии, Болгарии, в том числе и с 1975года в России (Халенев Г.А., Гуненков В. В.)

Необходимо отметить, что в России и за рубежом проводятся широкие исследования и получены положительные результаты по изучению и диагностике PC-инфекции человека.[35, 36, 45,48].

Но изучением PC-инфекции крупного рогатого скота и ее возбудителя занимаются мало, что подтверждается относительно немногочисленными данными зарубежной литературы.

В нашей стране имеется единственное опубликованное сообщение о выделении PC-вируса крупного рогатого скота Мартыновым Ю. В., Орловым

М.И. [37]. Но авторам не удалось культивировать вирус. ( ообщений о выявлении антител к PC-вирусу в сыворотках крови крупного рогатого скота на территории страны несколько больше. Об этом свидетельствуют данные Метревелли Г.Д. [40], Грязина В.Н. [19], Погуляевой А.В. и др. [25], Муравьева В.Н. и др. [17], Васильева А.В. и др. [52].

С 1977г. биологической промышленностью выпускается набор сухих диагностикумов для диагностики PC-инфекции крупного рогатого скота, разработчиками которого являются Гуненков В.В., Халенев Г.А. Набор применяют для обнаружения вирусного антигена в патматериале методом иммунофлуоресценции (ИФ), выявления вируса и его иден ификации в реакциях ИФ, связывания комплемента (РСК) и диффузной преципитации (РДП), а также для выявления специфических антител в сыворотке крови больных и переболевших животных в РДП. Однако его применение было очень ограничено, из-за трудностей интерпретации полученных данных. Ранее этот диагностический набор сыграл большую роль в диагностике РС-инфекции крупного рогатого скота в нашей стране, его применение позволило установить наличие инфекции.

Несмотря на то, что ветеринарная практика имеет в своем распоряжении большой набор диагностических сывороток и диалюстикумов, увеличение номенклатуры, улучшение качества и стандартизация диагностических препаратов для практических лабораторий по-прежнему остается важной задачей.

При диагностике вирусных и бактериальных инфекций в ветеринарии все более широкое применение находят такие современные и высокоточные методы, как молекулярная гибридизация и полимеразная цепная реакция (ПЦР). Однако ввиду их высокой стоимости, сложности в постановке и необходимости дорогостоящего оборудования и реактивов, метод определения антигенов и антител с помощью иммунофермент doro анализа (ИФА) при оптимальном соотношении себестоимость-чувствительность остается действенным инструментом в ветеринарной лабораторной практике. Высокая разрешающая способность этого метода обусловлена, главным образом, природой лиганда, степенью очистки компонентов и чувствительностью приборов, регистрирующих наблюдаемый эпфект. Таким образом, очистка и концентрирование вирусов является решающим условием при изготовлении диагностикумов и получении высокоактивных иммунных сывороток, используемых при создании компонентов, необходимых для проведения иммуноферментного анализа.

Быстрый и точный диагноз PC-инфекции крупного рогатого скота является решающим условием организации необходимых мер борьбы с этим заболеванием.

1.2. Цели и задачи исследования. ч»

В связи с вышеизложенным, целью настоящей работы являлась разработка набора на основе аффинно-очищенных и концентрированных, антигенов PC-вируса КРС, штамм «Ranaall», для использования их в качестве компонента набора при определении уровня антител в крови больных, переболевших и вакцинированных животных в иммуноферментном анализе.

Решались следующие задачи:

1.2.1. Сравнить условия репродукции PC-вируса, штамм «Randall», в первично-трипсинизированной культуре клеток почки (ПЭК), легкого (ЛЭК), трахеи (ТЭК), сердца (СЭК) эмбриона коровы и г гревиваемых линий ПТ-80 и Тауэр;

1.2.2. Разработать метод получения счищенного и концентрированного антигена PC-вируса, штамм «Randall», репродуцированного в культуре клеток.

1.2.3. Выделить IgG КРС, получить анти-IgG КРС антисыворотки на кроликах, выделить анти-IgG КРС антитела и синтезировать анти-IgG КРС иммунопероксидазный коньюгат.

1.2.4. Выделить поверхностные белки PC-вируса, штамм «Randall», иммобилизовать их в качестве лиганда на BrCN Сефарозу.

1.2.5. На полученном сорбенте выделить специфические к антигенам РС-вируса антитела и иммобилизовать их в качестве лиганда на BrCN Сефарозу.

1.2.6. Разработать компоненты набора для определения уровня антител к РС-вирусу крупного рогатого скота в иммуноферментноъ анализе на основе аффинно-очищеных антигенов РС-вируса.

1.2.7. Исследовать воспроизводимость результатов по определению уровня антител к PC-вирусу КРС, полученных с использованием разработанного иммуноферментного набора;

1.2.8. Провести сравнительную оценку чувствительности и специфичности РН, РИГА, РСК и разработанного иммуноферментного Набора при определении уровня анти-РСВ антител в крови больного, переболевшего и вакцинированного крупного рогатого скота.

1.3. Научная новизна.

- В результате проведенной работы разработан одноэтапный метод получения очищенных и концентрированных антигенов РС-вируса, репродуцированного в культуре клеток, с помощью препаративной аффинной хроматографии на анти-РСВ IgG Сефарозе.

- При изучении в электрофорезе белков PC-вируса, штамм «Randall», которые отщепляются при обработке Тритоном Х-100, выявлено 9 структурных гликопротеинов с молекулярной массой от 28 до 180 кД.

- По результатам иммуноблотинга показано, что 6 белко: РС-вируса, которые отщепляются при обработке Тритоном Х-100, индуцируют выработку анти-РСВ антител в организме восприимчивых животных.

- разработана технология изготовления иммуноферментного набора для определения уровня антител к PC-вирусу крупного рогатого скота на основе аффинно-очищеных антигенов PC-вируса, штамм «Randall».

1.4. Практическая значимость работы.

Результаты проведенных исследований позволили разработать временную инструкцию по изготовлению набора реагентов для определения уровня антител к респираторно-синцитиальному вирусу крупного рогатого скота в иммуноферментном анализе и проект нормативной документации. Набор предназначается для индикации и количественного определения анти-РСВ антител в сыворотках крови КРС.

Внедрение в практику ветеринарии иммуноферментного набора для определения уровня антител к респираторно-синцитиальь эму вирусу позволит решить проблему массового эпизоотологического обследования поголовья КРС, составляющего основу мероприятий по ликвидации и предупреждению распространения данного заболевания.

1.5. Апробация работы.

Материалы исследований доложены и обсуждены на заседаниях Ученого совета ВНИТИБП (2002 — 2004г.г.), на международной научно-практической конференции молодых ученых «Научные основы производства ветеринарных биологических биопрепаратов, Щелково (2004 г).

По материалам диссертации опубликовано 3 работы.

1.6. Структура и объем диссертации. Материалы диссертации изложены на 143 страницах машинописного текста и состоят из следующих разделов: введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты собственных исследований, обсуждение результатов, выводы и практические предложения, список литературы, содержащий 72 отечественных и 151 зарубежный источник, и приложение. В приложении представлены документы, подтверждающие результаты отдельных этапов работы, их научную и практическую ценность. Диссертация иллюст жрована 15 таблицами, 22 рисунками и 1 схемой.

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

Заключение Диссертация по теме "Биотехнология", Кочиш, Татьяна Юрьевна

6. Выводы.

6.1. При репродукции PC-вируса в культурах клеток наибольшее накопление вируса (до 6,0 lg ТЦД50/мл) было достигнуто при использовании первично-трипсинизированной культуры клеток легкого эмбриона коровы.

6.2. Разработана схема очистки и концентрирования PC-вируса, штамм «Randall», репродуцированного в культуре клеток ЛЭК, позволяющая получить препараты вируса очищенные на 99,6% в расчете на инфекционную дозу.

6.3. При изучении состава белков PC-вируса, штамп" «Randall», репродуцированного в культуре клеток ЛЭК, полученных при обработке вируссодержащей суспензии Тритоном Х-100 выявлено 9 структурных белков с ММ от 28 до 180 кД. По результатам иммуноблотинга 6 белков с ММ от 42 до 180 кД индуцируют выработку анти-РСВ антител в организме восприимчивых к PC-инфекции животных.

6.4. Показана возможность одноэтапной препаративной очистки антигенов PC-вируса из вируссодержащих суспензий с помощью препаративной аффинной хроматографии на анти-РСВ IgG Сефарозе 4В.

6.5. При определении разброса результатов полученных с исг эльзованием, разработанного Набора, установлено, что среди лунок кэффицент вариации не превышает 6%, между отдельными планшетами - менее 4%.

6.6. При сравнительной оценке специфичности и чувствительности, разработанного Набора, с РН и РНГА, установлено, что 41 образец сывороток был отрицателен во всех трех реакциях, 6 образцов сывороток имели в ИФА титр 1:200 и были отрицательными в РН и РТГА, 189 исследуемых сывороток были позитивными во всех трех реакциях. Следовательно, можно считать позитивными сыворотки, титр которых в ИФА равен или превышает 1:400.

6.7. Разработана технология изготовления набора для определения уровня антител к PC-вирусу крупного рогатого скота в иммуноферментном анализе на основе аффинно-очищеных антигеноч PC-вируса, штамм «Randall».

7. Практические предложения.

На основе проведенной работы представлена нормативная документация:

Временная инструкция по изготовлению и контролю Набора реагентов для определения уровня антител к респираторно-синцитиальному вирусу крупного рогатого скота в иммуноферментном анализе» на основе аффинно очищенных антигенов респираторно-синцитиального вируса, штамм «Randall»» утверждена директором ВНИТИБП.

Проект технических условий на «Набор реагентов для определения уровня антител к респираторно-синцитиальному вирусу крупного рогатого скота в иммуноферментном анализе»,

Проект «Временного наставления по применению «Набора реагентов для определения уровня антител к респираторно-синцитиальному вирусу крупного рогатого скота в иммуноферментном анализе».

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Кочиш, Татьяна Юрьевна, Шелково

1. А.с.№ 1116576 А 61 К 39/12. Способ получения сухого эритроцитарного диагностикума респираторно-синцитиальной инфекции крупного рогатого скота.// Г.Д. Метревели, 1Я. Чистова,

2. B.В. Гуненков, О.И. Шарабрин. СССР.- 3414875/30-15; Заяв. 29.04.80; Опубл. 31.03.82.

3. Астаханова Л.Н., Брайнингер М.Г. Методы получения стандартных диагностических сывороток к респираторно-синцитиальному вирусу // Лаб. дело.-1975.-№12. С.730-732.

4. Астаханова Л.Н., Брайнингер М.Г. О методах иммунизации пригодных для серийного приготовления диагностических сывороток к PC-вирусу. //Вопр. Этиологии, эпидемиологии, патогенеза и диагностики вирусных заболеваний: Сб./Свердловск, 1976. С.3-9.

5. Баженов К.С. Распространение вирусов парагриппа-3 и респираторно-синцитиальной инфекции среди телят на откорме в осенне-зимний период. //Бюлл. ВИЭВ. -1983.- Вып.50. С. 6-8.

6. Биология вирусов животных. Феннер Ф., Мак-Ослен Б.,Мисис С. Сэмбрук Дж., Уайт Д.; Под ред. В.И. Агола.: Мир. 1977. Т.1. СЛ 61336.

7. Борисович Ю.Ф., Кириллов Л.В. Инфекционные болезни животных: Справочник; Под ред. Д.Ф. Осидзе.-М.: Агропромиздат, 1987. С.77-78.

8. Боронкова Н.М. Сравнительное изучение методов идентификации риновирусов и диагностики вирусных инфекций: Автореф. Дис. Канд. Мед. Наук. -М.: 1972. С.23.

9. Бостанджиева Р., Текерлеков М., Хараламбиев Х.Е. Доказване на респираторно-синцитиальната вирусна инфекция по телятата через реакция за свырзване на комплемента. //Вет. Мед. Науки.- София. 1984. -XXI.- № 9. С.45-50.

10. Бостанджиева Р., Митов Б., Хараламбиев Х.Е. Иммунофлуоресцентное доказательство респираторно-синцитиальной вирусной инфекции у телят. //Вет. Мед. Науки. -София, 1985. -XXII. -№ 9. С.20-26.

11. Бостанджиева Р. Чувствительност на клетъчните культури към говяждия респираторно-синцитиален вирус. //Вет. Мед. Науки. — София,1986. -XXII. -№ 2. С.12-18

12. Бостанджиева Р. Культивирование и диагностика респираторно-синцитиального вируса крупного рогатого скота: Автореф. Дис. Канд. Биол. Наук. -София, 1987. С.27

13. Букринская А.Г. Вирусология. -М.: Медицина, 1986. С.271-274.

14. Вирусология: Под. Ред. Б. Филдса, Д. Найпа. -М.: Мир, 1989. -Т.2. С.41-42. .

15. Вирусология: Под. Ред. Б. Филдса, Д. Найпа. -М.: Мир, 1989. -Т.2. С.473-480.

16. Волкова О.В., Елецкий Ю.К. Основы гистологии с гистологической техникой. —М.: Медицина, 1971.201-205.

17. Генчев Г. Энзоотии респираторных заболеваний телят с признаками респираторно-синцитиального вируса //.XXI Всемирный вет. Конгресс.-М., 1979.-Т.З. С. 101.

18. Грязин В.Н. Этиология респираторных заболеваний телят и меры специфической профилактики в условиях спецхоза. //Научно-технический бюллетень Всесоюзной академии с-х. Наук им. В.И. Ленина Сибирское отделение. —1982. -№ 11. С. 19-22У

19. Гуненков В.В., Халенев Г.А., Сюрин В.Н. Респираторно-синцитиальная вирусная инфекция. //Животноводство и ветеринария. -М., 1975.Т.№ 8. С.70-76.

20. Звягин И.В., Хорьков И.А., Токарик Э.Ф. Методические рекомендации по разработке режимов замораживания- высушивания биологических препаратов. М., 1981. С.ЗЗ.

21. Изоляция респираторно-синцитиальния вирус от телят с респираторни заболевания/Харапамбиев Х.Е., Бостанджиева Р. , Георгиев Г.К., Митов Б. // Вет. мед. науки.-София,1984.-ХХ1. №2-С. 3-7.

22. Испытание сухого эритроцитарного диагностикума ^С-инфекции крупного рогатого скота/ Метревели Г.Д., Борисович Ю.Ф., Чистова З.Я.и др.//Сб. науч. тр. ВГНКИ ветпрепаратов.1983.-С.57-60.

23. Казанцев А.П. Матковский B.C. Справочник по инфекционным болезням.-3-е изд. перераб. и доп.-М.: Медицина, 1986-С. 85-87.

24. Комплексная диагностика вирусных респираторных заболеваний крупного рогатого скота /Погуляева JI.B., Иванов П.А., Пунская Н.И., Мунирова В.Ф. //Инфекционные болезни с-х животных. -1984. С. 102105.

25. Культура ткани в вирусологических исследованиях. /Анджапаридзе О.Г., Гаврилов В.И., Семенов В.Ф., Степанова Л.Г. //М.: Гос.изд.медлитер., 1962. С.57-146.

26. Культивирование клеток и тканей животных: Учебно-методическое пособие /Дьяконов Л.П., Глухов В.Ф., Поздняков А.А., Денисенко Г.Ф., Калмыкова Т.П. -Ставрополь, 1986. С.96.

27. Лабораторная диагностика респираторно-синцитиальной инфекции: Методические рекомендации /ЛещинскаяН.П., Покровская Е.П., Юрлова Т.И. и др.: Под ред. Я.С. Шварцмана; НИИ эпидемиологии, микробиологии и инфекц. болезней. -Алма-Ата, 1985. С.43.

28. Лакин Г.Ф. Биометрия. -М.: Высшая школа. 1980. С.294.

29. Лебедев Л.И., Авилов С.В. О некоторых биологических свойствах респираторно-синцитиального вируса. //Актуальные вопросы вет. вирусологии; Тез. докл. 5-й Всесоюзн. Науч. Конф.-Казань, 1980. С.83-84.

30. Лещинская Н.П., Юрлова Т.И. Эпидемиология гриппа и других ОРЗ: СБ.науч. тр. /ВНИИ МЗ СССР.-Л., 1983. С. 148-177.

31. Лещинская Н.П. Молекулярнаная биология и генетика вирусов гриппа: Сб.науч.тр. /ВНИИ МЗ СССР.-Л., 1983. С. 13-22.

32. Лещинская Н.П. Вакцинация против респираторно-синцитиальной инфекции //Вопр.вирусол. -1986. Т.31. № 5. С.517-527.

33. Лещинская Н.П., Камферин Л.Е. Респираторно-синцитиальная вирусная инфекция //Медицина и здравоохранение: Сер. Эпидемиология, вирусология и инфекционные заболевания. -М., 1986. С.77.

34. Лопатина О.А., Плетнева Е.А. Респираторно-синцитиальная вирусная инфекция //МРЖ, 1989., № 3. РЗ. С.50-54.

35. Лопатина О.А. Клинико-иммунологические показатели и лечение больных респираторно-синцитиальными вирусными заболеваниями: Автореф.дис.канд.мед.наук. -М., 1989. С.24.

36. Мартынов Ю.В., Орлов М.И. Выделение РСВ от телят с респираторным синдромом //Патогенез, лечение и грофилактика болезней жвачных животных в Западной Сибири. -Оме*:, 1985. С.22i 24.

37. Методические указания по применению перевиваемых клеточных культур для диагностики вирусных заболеваний сельскохозяйственных животных. -Госагропром СССР. М., 1988. С.12.

38. Методы лабораторной диагностики вирусных болезней животных: Справочник /Сюрин В.Н., Белоусова Р.В., Соловьев Б.В., Фомина Н.В. -М.: Агропромиздат, 1986. С.351.

39. Метревели Г.Д. Реакция непрямой гемагглютинации (РНГА) в диагностике респираторно-синцитиальной инфекции крупного рогатого скота. //Сб.науч.тр. ВГНКИ ветпрепаратов. -М, 1983. С.99-100.

40. Метревели Г.Д. Биологические свойства вируса и серологическая диагностика PC-инфекции крупного рогатого скота: Автореф.дис.канд.биол.наук. -М.,1989. С. 19.

41. Метревели Г.Д., ГуненковВ.В. Современная диагностика — залог успешной борьбы с PC-инфекцией крупного рогатого скота //Тез. докл. Всесоюзн. науч. конф. по проблемам эпизоотологии. -Казань, 1983. С.94.

42. Новак М. Культивирование в суспензии эксплантантов легких эмбриона крупного рогатого скота вируса парагриппа-3 и его некоторые биологические свойства: Дис.канд.биол.наук. -М., 1986. С.38-39.

43. Особенности клинического течения респираторно-синцитиального вирусного заболевания у взрослых /Лопаткина О.А., Крылов В.Ф.,

44. Иванова JI.А., Вихнович Э.М., Бакулина З.Е., Полякова Т.Г. //М., 1989. Деп. во ВНИИ МН МЗ СССР 28.02.89., № 17217. С.10.

45. Патологоанатомическая диагностика вирусных болезней животных: Справочное издание /Архипов Н.И., Чевелев С.Ф., Брагин Г.И.,Зеленцов В.А., Дымин Г.П., Ерохина Л.М.; Под ред. Н.И. Архипова. -М: Колос, 1984. С.76-78.

46. Показатели циркулирующего интерферона при различи »ix вирусных заболеваниях /Лаврухина Л.А., Ершов Ф.И., Крылов Ь.Ф., Князева Л.Д., Белостоцкая О.А., Лопатина О.А. //Вопр.вирусологии. 1989. -№ 2 .С.244-247.

47. Прингл К. Пневмовирусы //Вирусология. Методы: Пер. с англ.; Под ред. Б. Мейхи. М.: Мир. 1988. С. 131-159.

48. Пушкарев Н.В., Соболев А.Д. Основы вариационной статистики: методические указания для аспирантов зооветеринарных специальностей. —2-е издание.-М.: МСЗ СССР Моск. вет. академия., 1983. С.21.

49. Разработка метода получения высокоактивного респираторно-синцитиального вирусного диагногностикума для непрямой реакции гемагглютинации/Денер Л., Дрейзен Р.С., Янкевич О.П , Дикман У., Кемниц Ш/Вопр. Вирусологии-1976. №6 -с.73 9-745.

50. РНГА в серодиагностике респираторно-синцитиальной инфекции крупного рогатого скота/ВасильевА.В.,ОсидзеН.Г., СюринВ.Н.,АкбаеваЛ.М.,СтрогановаИ.Я.,БариноваЛ.И.//Ветеринария. -1988.-№10.-стр.32-34.

51. Сергеев В.А. Репродукция и выращивание вирусов животных.М.,Колос.1976.-стр.302.

52. Сергеев В.А.,Орлянкин Б.Г. Структура и биология вирусов животных. М. Колос, 1983 .-стр.252-267.

53. Слепенко Т.Б. Выделение из клеток и изучение свойства вируса герпеса индеек: Автореф.дисс. канд. Биол. Наук. М.,1987 -19с.

54. Соминина А.А., РумельН.В. Получение комплементсвязывающего антигена PC в суспензионных клеточных культурах //Сб.тр./ВНИИ гриппа.- 1976.-№17.стр.116-120.

55. Бектемиров Т.А. Донская Н.И.,КастрикинаЛ.Н., Агафонова J1.B., Бардина Е.Е./Состояние и перспективы специфической профилактики гриппа и других ОРЗ//Вопр. Вирусологии.-1987г.№-4. Стр.393.

56. Строганова И.Я.,Акбаева JI.M. Чувствительность первичных культур клеток к респираторно-синцитиальну вирусу крупного рогатого скота//Проблемы биологии и патологии с-х животн мх: Сб.науч. трудов./Моск. Вет. академия. 1987г.стр-96-98.

57. Сюрин В.Н. Фомина Н.В. Частная ветеринарная вирусология: Справочная книга.-М.:Колос,1979г.стр257-262.

58. Сюрин В.Н., Белоусова Р.В., Фомина Н.В. Ветеринарная вирусология.М.:Колос, 1984г- стр-61 -63.

59. Трофимова М.Г., Быков И.Н., Семенова Н.С. Повышение чувствительности реакции пассивной геммаглютинации с эритроцитарным диагностикумом респираторно-синцитиального вируса//Вопр. Вирусологии.- 1985г.-№-2.стр236-239.

60. Халенев Г.А.,Гуненков В.В. Комплексная диагностика респираторно-синцитиальной инфекции молодняка крупного рогатого скота в двух хозяйствах.//Проблемы молекулярной биологии и патологии: Сб. науч. тр./Моск. Вет. академия.-1975г.Т.80.стр193-199.

61. Халенев Г.А. Разработка методов производства диагностикумов и усовершенствование лабораторной диагностики вирусной диареи и респираторно-синцитиальной инфекции крупного рогатого скота: Дис. Канд. Вет.наук. -М.; 1976г. стр-270.

62. Халенев Г.А.,Гуненков В.В. Респираторно-синцитиальная, реовирусная и риновирусная инфекция крупного рогатого скота //Лекция15-я/ Моск.вет. академия.-1977г.-стрЗ-9.

63. Юрлова Т.И., ЗощенкоН.Я., КарповаЛ.С. Изучение естественной популяционной изменчивости респираторно-синцитиальных вирусов по их интерферирующим и репродуктивным свойствам.Ас1а virol 1985г. №29 стр.279-284.

64. Sttot E.J., Thomas L.H.,Taylor G., Collins A.P.Jebbett J., Crouch S. A comparion of three vaccines against respiratory syncytial virus in calves // J.Hyg-1984.V-93 .p251-261.

65. Andrews A.H., Grunsell G.S.C., Hill F.W.G. Respiratory disease in calves//The veterinarry annual Isseu.-1983.-v.23.-p.48-55.

66. Antibodies to respiratory syncytial virus polypeptides and their aignificfnct in human infection/Ward K.A.,Lambden P.R.,Ogilvie M.M., Watt P.J.//J. gen. Virol-1983. V.64.-pl867-1876.

67. Armstrong J.A.,Pereira H.G., Valentine R.C. Morfphelogy and development of respiratory syncytial virus in cell cultures//Nature.-1962.-vl96.-pl 179-1181.

68. A sero-epidemiological survey of infections with the bovine respiratory syncytial virus in firetsea aon gracieng calves /PloegerH.W.,Boon J.H.,Klaassen C.H.L.,Florent G.van//J.Vet.Med.-1986.-v.33,№4-p311-318.

69. Association of the chimpanzee corysa agent with acute respiratory disease in children /Baem M., Wright F.H., Hamre D., Egerer R., Cehme M. //New Eng. J. Med. -1960. -v. 263. P.523-530.

70. A survey of virus infections of the respirators tract of cattle and their assotiation with disease /Stott R.J., Thomas L.H., Collins A.P., Crouch S., Jebbett J., Smith G.S., Luther PX»., Casvell R. //J. Hyg. -1980.- v.83. P.257-270.

71. Bachi Т., Howe C. Moфhogenesis and ultrastructure of respiratory syncytial virus. //J. Virol. -1973. -v. 12. P. 1173-1180.

72. Baker J.C., Ames T.R., Markham R.J.F. Serologie studies of bovine respiratory syncytial virus in Minnesota cattle. //Am. J. veter. Res. -1985. — v.46, N 4. P891-892.

73. Baldridge P., Senterfit L.B. Peraistent infection of cells in culture by respiratory syncytial virus //Proc.Soc. Exp. Biol. Med. -1976. —v. 151. — P.684-688.

74. Bartha A., Benco M., Vetisi F. Bovin respiratory syncytial virusfertozottseg es kovetkezmenyei nagyuzemi szarvasmarhaallamanyckban //Magyar allatov. Lapja. -1986. -v.41. N 8. P.451-454.

75. Bennatt C.R., Hamre D. Growth and serological characteristics of respiratory syncytial virus //J. inf. Dis. -1962. -v.l 10. P.8-16.

76. Berthiaume L., Joncas J., Pavilanis V. Comparative structura, morphogenesis and biological characteristics of the respiratory syncytial (RS) virus and the pneumonia virus of mice //Arch. Ges. Virusforach. — 1974. -v.45. P.39-51.

77. Bloth В., Norrby E. Fractionation of respiratory syncytial virus components by centrifugation techniques //Arch. Ges. Virusforsch. -1966. -v.19. P.385-392.

78. Bovine Respiratory syncytial Virus: Host Range in Laboratory Animals and Cell Cultures /Matumoto M., Inaba Y., Kurogi H., Sate K., Omori Т., Goto Y., Hirose O. //Arch. Ges. Virusforsch. -1974. -v.44. P.260-290.

79. Bovine respiratory syncytial virus. Studies on an cutbreak in Japan 19681969 /Inaba V., Tanaka V., Sato K., Omori Т., MatumoO M. //Jap. J. Microbiol.-1972. V.16. P.373-383.

80. Brenner S., Horns R.W. A negative Staining Method for high Resolution Electron Microscopy of virusas //Biochim. Et Biophs. Acta. -1959. -v.34. P.103-110.

81. Cash P., Pringle C.R., Preston C.M. The polypeptidas of human respiratory syncytial virus: products of ctll-free protein synthesis and post-translational modifications //Virology. -1979. -v.92. P.375-384.

82. Chalal Y.D., Elashary Y. The pathogenesis of bovine reapiratory suncytial virus infection in lung organ cultures //Abstrs 79 th Annu.Mott. Amer. Soc. Microbiol. -Los Angeles calif., -1979.

83. Chanock R.M., Pinberg L. Reccvary from infans with respin.tory illness of a virus related to chimpanzee coiysa agent (CCA)/II. Epidemiologic asptcta of infection in infants and young Children //amer. J. Hyg. -1957. -v. 66. P.291-300.

84. Chanock R.M., Parrott R.H. Acute respiratory disease in infoncy and childhood: present understanding and prospects for prevention //Pediat.1965.-v.36. P.21-39.

85. Chanock R.M., Rolzman E., Myers R. Recovery from .n fants with respiratory illnasa of a virus related to chimpanzee coryza agent (CCA). J. Isolation properties and characterisation //Ammer. J. Hyg. -1957. -v.66. P.281-290.

86. Churchill A.E., Biggs P.M. Agent of Marek s disease in tissue culture //Nature (London). -1967. -v.215. P.528-530.

87. Churchill A.E., Chubb R.C., Baxendale W. The attenuation With loss of oncogenicity of the gerpestype virus of Marek s disease (strain HPRS-16) on passage in cell culture //J. Gen. Virol. -1969. -v.4. P.557-564.

88. CostesH.V.,Forsyth B.R., Chanock R.M. Biophysical studiesof respiratory syncytial virus.I.Bensity of respiratory syncytial virusand associated complement-fixing antigens in a caesium chloride density gradient//J.Bact.1966.-v.91.-PI 263-1269.

89. Collins P.L., Huang Y.T., Wertz C.W.Identification of a tenthin RNA of respiratory syncytial virus and assignmeht of polipeptidesto the 10 viral genes//J.Virol.-1984.v.49.-P.572-578.

90. Comparison of a newly developed ensymelinked immunosorbent assay of bovine respiratory syncytial virus infections/Watenbriak P.,Brinkhof J.M.A.,Straver P.J.,Quak J.,De Leeuw P.W.,//Res.Vet.Sci.-1985.-v,№3.-P334-340.

91. Cooney M.K.,Fox J.P., Xall C.E. The Seattle virus watch.VI. Observations of infections with and illness due to parainfluenza, mumps and respiratory syncytial viruses and Mycoplasmapneumaniace//Am.J.Epid.-1975.-v. 101.-P532-551.

92. Gutlip Paul A. Questions and ans were about serening testa//Disiena Jorn J.AIDS Patent Care.-1987.-v.l.№l-P25-27.

93. GutlipR.S., Lehmkuhl H.D.Leslong in lambe experimentakly infected with bovine respiratory syncytial virus//AM.J.Vet.Res.-1979.-v.40.-P.1479-1482.

94. De Jong J.C.,Harmaen M. Stimulated growth of respiratory syncytial virus the presence of actinomicin D.Antcnie van Leeuwenhoek//J.Microbiol.Serel.-1973.-v.39.P409-413.

95. Defection of. rinderpest antigen by latex agglutination test/Banaal R.P.,Joshi R.S.,Chandra U.,Sharma ВУ/Acta virol.-1988.-v.32,№3.-P275-277.

96. Diagnosis of bovine respiratory syncytial virusinfections b / complement fixation test/Takahashi ,Inaba Y.,Kurogi H., Sato K., Goto Y.,Omori T.//Nat.Lust. Anim.Health Quart.-l 975.-V. 15,№4.-P 179.185.

97. Diagnosis of bovine respiratory syncytial virus infections improved by virus detection i lung lavage samples/Kimman T.G.,Limmer G.M.,Straver P.J.,De Leeuw P.W.//Am.J.Veter.Res.-1986.-v.47.№l.-P.143-147.

98. Doggett J.E., Taylor-Robinson D., Gallop R.G.C. A study of an inhibitor in bovine serum active against respiratory syncytial virus //Arch. Ges. Virusforsch. -1968. -v.23. P. 126-137.

99. Dubovi E.J., Geratz J.D., Tidwell R.R. Inhibition of respiratory syncytial virus by BIS (5-amidino-2-bensimidazolyl) methane //Virology. -1980. — v. 103. P.502-504.

100. Dubovi E.J., Geratz J.D., Tidwell R.R. Enhancement jf respiratory syncytial virus induced cytopathology by trypsin, trombin and plasmin //Infect. Immun. -1983. -v.40. P.315-358.

101. Ilashaiy M.A.S.Y., Silim A., Mciin M. A natural cutbresk of bovine respiratory disease causend bu bovine respiratory syncytial virus //Cornell Vet. -1982. -v.72. N 3. P.325-333.

102. Electron microscopic evidence for bridges between bovine respiratory syncytial virus particles /Belanger F., Bethiaume L., Alain R., Lussier G., Trudel M. //J. Gen. Virol. -1988. -v.69. N 6.P.1421-1424.

103. Electron microscopic studies of respiratory syncytial virus temperature — senaitive mutants /Kalica A.R., Wright P.F., Hetrick F.M., Chanock R.M. //Arch. Ges. Virusforsch. -1973. -v.41. P.248-258.

104. Epidemiology of respiratory syncytial virus infection in Washington, D.C.I. Importance of the virus in different respiratory tract disease syndromes and temporal distribution of infection /Kim H.W., Arrobic J.O., Brandt C.D.,

105. Jeffries B.C., Pyles G., Reid J.L., Chanock R.M., Parrott R.H. //Amer. J. Epid. -1973. -v.98. P.216-225.

106. Evalution of a new latex agglutination method for detection of antibody to herpes simplex virus /De Girolami P.C., Dokos J., Eichelberger K., Bieno S. //J. Clin. Vicrobiol. -1988. -v.26. N 5. P. 1024-1025.

107. Experimental pneumonia in gnotobiotic calves produced by respiratory syncytial virus /Thomas L.H., Stott E.J., Collins A.P., Jebbett J. //Br. J. Exp. Path.-1984. -v.65. P. 19-28.

108. Experimental respiratory syncytial virus infection of abults /Mills J., Van Kirk J.E., Wright P.F., Chanock R.M. //J.Immunol. -1971. -v.107. P.123-130.

109. Experimental respiratory syncytial virus infection of fo ir species of primates /Belshe R.B., Richardson L.S., London W.T., Sly D.L., Lerfeld J.H., Camargo E., Prevar D.A., Chanok R.M. //J. Med. Virol. -1977. -v.l. P. 157-162.

110. Ffernil B.F., Gerin J.L. The stabilization and purification of respiratory syncytial virus using MgS04 //Virology. -1980. -v. 106. P. 141-144.

111. Ffernil B.F.,Ford E.C., Gerin J.L. The developmant of BALB/c cells persistent ly infected with respiratory syncytial virus: Presence of ribonucleoprotein on the call surfoco //Prog. Soc. Exp. Biol. Med. -1981. — v.l67. P.83-86.

112. Forsyth B.R. Identification of respiratory syncytial virus antigens by agar gel diffusion and immuncelectrophoresis //Prog. Sog. Exp. Biol. Med.-1970. -v.133. P.568-572.

113. Forsyth B.R., Coates R.V., Chanock R.M. Biophysical studies of respiratory syncytial virus. //Identification of two soluble complement — fuxing antigens of respiratory syncytial virus //J. Bact. -1966. -v.91. P. 1270-1276.

114. Cabathuler K. Respiratorisches syncytialvirus in der Riderpraxis //Schweiz. Areh. Tierheilk. -1983. -H 125. S.149-153.

115. Gillete K.G., Smith P.C. respiratory syncytial virus infection in transported calves //Am. J. Veter. Res. -1985. -v.46. N 12. P.2596.

116. Graham D., Estes M.K. Pretecfitic enhancament of rotavirus infectivity: biologie mechanisms //Virokogy. -1980. -v.lOl.N 2. P.432-439.

117. Grist N.R., Ross C.A.C., Stett E.J. Influensa respiratory syncytial virus and pneumonia in Glasgow 1962-1965 //Br. Med. J. -1967. -v.l. P.456-457.

118. Hall C.B., Douglas R.G. Modes of transmission of respiratory syncytial virus //J.Pediat. -1981. -v.99. P. 100-103.

119. Hall C.B., Douglas R.G., Geiman J.M. Respiratory syncytial virus infections in infants; quantitation and duration of shedding //J. Pediat. — 1976.-v.89. PI 1-15.

120. Hall С.В., Douglas R.G., Geiman J.M. Possible transmission by fomitos of respiratory syncytial virus //J. Inf. Dis. -1980. -v. 141. P.98-102.

121. Hambling M.H. Survial of respiratory syncytial virus during storage under various conlitions //Brit. J. exp. Pat'i. -1964. -v.45. P.647-655.

122. Haralambiev H.E., Bostandjieva R.M., Georgiev G.K. Cultivation of bovine respiratory syncytial virus jn cell line FLK and other cell cultures of sheep origin //Comptes rendus de 1 Academie bulgare des Sciences . -1982. -V.35.N11.P.1611-1613.

123. Holzhauer C., van Nieuwstadt A.P. De etiologischi rol van het bovine respiratory syncytial virus bij pinkangriop. Tijdschr //Diergenecskd. —1976. -v.l01. P. 1023-1031.

124. Huang Y.T., Wertz G.W. The genome of respiratory sync} tial virus is a negative stranded RNA that codes for at least seven mRNA species //J.Virol. -1982. -v.43. P.150-157.

125. Ivvunovirological studies on human respiratory syncytial virus structural protein /Trudel M., Nadon F., Sequin C., Ghoubril S., Paument P., Trepanier P. //Can. J. Microbiol. -1986. -v.32. N 1. P. 15-17.

126. Improvement of respiratory syncytial virus replication inactively growing Hep-2 cells /Pona Marcal W., Lambert A.L., Lambert D.M., Rochovansky O.M. //J. Virol. Meth, -1983. -v.7. N 4. P.217-221.

127. Infection of gnotobiotic calves with a bovine and human isolate of respiratory syncytial virus. Modification of the response by dexametasone /Thomas L.H., Stott E.J., Collins A.P.,Crouch S., Jebbett J. //Arch. Virol. -1984. -v.79. P.67-77.

128. Infectivity of respiratory syncytial virus by various routes of inoculation /Hall C.B., Douglas R.G., Schnabel K.C., Geiman J.M. //Infect. Immun. -1981. -v.33. P.779-783.

129. Ingh F.S.G.A.M., Verhoeff I., Niewatadt A.F.K.M.I. Clinical and pathological observat ons an spontanecus bovine respiratory syncytial virus infections in calves //Res. In veter. Sc. -1982. -v.33. N 2. P. 152-158.

130. Inhibition of respiratory syncytial, parainfluenza 3 and measles viruses bu 2 Deoxy-D-glucose. /Hobes D.S., Schnitzel T.J., Kalica A.R., Canargo E., Chanock R.M. //Virology. -1975. -v.63. P.201-208.

131. Inhibition of respiratory syncytial virus — host cell interactions by monoand diamedines /Dubovi E.J., Gerats J.D., Shaver S.R., Tidvell R.R: //Antimicrob. Ag. Chtmother. -1981. -v. 19. P.649-656.

132. Initiation and maintenance of persistent Inhibition by respiratory syncytial virus /Pringle C.R., Shirodorla P.V., Cash P., Choawell D.J., Malloy P. //J. Virol. -1978. -v.28. P. 199-211.

133. Isolation from turkeus of a cell-assotiated herpesvirus antigenically related to Marek's disease virus /Witter R.L., Nazerian K., Purchase H.G., Burgoyne G.H. //Am. J. Vet. Res. -1970. -v.31. P.525-538.

134. In vitro methods for assay of turcey herpesvirus /Calnek B.W., Carrido C., Okazaki W., Patrascu I.V. //Avian. Dis. 1972. -v. 16. P.25-56.

135. Joncas J., Berthiame L., Pavilanis V. The structure of respiratory syncytial virus //Virology -1969. -v.38. P.493-496.

136. Jordan W.S. Growth characteristics of respiratory syncytial , virus //J. Immunol. -1962. -v.88. P.581-590.

137. Kisch Q.L., Johnson K.M. A plaque assouy for respiratory syncytial virus //Prac. Soc. Exp.Biol. Med. -1963. -v.l 12. N 3. P.583-589.

138. Koves В., Bartha A. Isolation of respiratory syncytial (RS) virus from coffle diseased with respiratory symptoms //Acta Vet. Acad. Sci hund. — 1975 (1976). v.25. N 4. P.357-362.

139. Koves В., Bartha A. Respiratory syncytial (RS) virus isolatosa legzoszer vi tunetekkel meg betegibitt szarvasmarhakbol //Magy. Ellatorv. Lapja. — 1976. -v.31. N.2.P.99-102.

140. Lambert D.M., Pons M.W. Respiratory syncytial virus glicoproteins //Virology. -1983. -v.130. P.204-214.

141. Lehmkuhl H.D., Cough P.M., Reed D.E. Characterization and identification of a bovine respiratory syncytial virus isolated from Young Calves //Am. J. veter. Res. -1979. -v.40. N. 1 P. 124-126.

142. Lehmkuhl H.D.,Cutlip R.C. Ecsperimentally induced respiratory syncytial virus infection in lambe // Am. J. veter. Res. -1979. -v.40. P.512-514.

143. Lehmkuhl H.D., Smith M.N., Cutlip R.C. Morphogenesis ai.d structure of caprine respiratory syncytial virus //Arch. Virol. —1980. -v.65. P.269-276.

144. Levine S. Polypeptides of respiratory syncytial virus //J. virol. —1977. — v.21. P.427-431.

145. Levine S., Buthala D., Hamilton R. Late stage synchronisation of respiratory syncytial virus replication //Virology. -1971. -v.45. P.390-400.

146. Levine S., Hamilton R. Kinetica of respiratory syncytial virus growth cycle in HeLa cells //Arch. Ges. Virusforsch.-1969. -v.28. P.122-l.'-2.

147. Levine S.,Peebles M., Hamilton R. Effect of respiratory syncytial virus infection HeLa on cells macromolecular synthesis //J. Gen. Virol. -1977. — v.37. P 53-63.

148. Linggi Т., Wyler R. Das bovine respirstorische synzytiabvirus als Erreger van Respirationstrakterkrankungen des epidemiologiche Untersuchung in der Schweis //Schweiz. Arch. Teirheilk. -1985. -Bd.127. H.10. S.651-659.

149. Martin H.T. Indirect haemagglutination test for the detection and assay of antibody to bovine respiratory syncytial virus //Vet.Rec. -1983. -v.l 13. N. 3. P.290-293.

150. Matthews R.E.F. Classification and nomenclature of viruses //Intervirology. -1982. -v. 17. P.l 04-105.

151. Menulty M.S., Bruson D.G., Allan G.V. Ecsperimental respiratory syncytial virus pneumonia in young calves: Microbiologic and immunofluorescent findings //Am. J Vet. Res. -1983. -v.44. P.1656-1659.

152. Mohanty S.B., Ingling A.L., Lillie M.G. Experimentally indyced respiratory syncytial viral infection in calves. //Am. J. Vet. Res. -1975. — v.36. N. 4. P.417-419.

153. Monoclonal antibodies protect against respiratory syncytial virus infection in mice /Taulor G., Stott E.G., Bev M., Fernie B.F., Cote F.J., Collins A.P., Hughes M., Jebbett J. Immunol. -1984. -v.52. P.137-142.

154. Morris J.A., Blount R.E., Savage R.E. Recovery of cytopathic agent from chimpanzees with coryza //Prog. Soc. Exp. Biol. Med. 1956. -v.92. P.544-549.

155. Moyr A. Virus krankenheiten der Kelber //Reportasand Summaris. Repparts et resumes Referate und Zusammenfassungen. -1980. P.233-260.166,167.168.169170,171.172,173174175176177178179180

156. Van Nieuwstadt A.P., Verhoeff J. Serology for diagnosis and epizootological studies of bovine respiratory syncytial virus infections //Research in Veterinary Science.-1983. -v.35. P.153-159.

157. Norrby E., Enders-Ruchle G., Ter-Moulen V. Differences on the appearance of antibodies to structural components of measles virus after immunization with inactivated and live virus //Inf. Dis. -1975. —v.132. P.262-269.

158. Nosocomial respiratory syncytial virus infections /Hall C.B., Douglas R.G., Geiman J.M., Messner M.K. //New. Eng. J. Med. -1975. -v.239. P.1343-1346.

159. Nucleic acids of respiratory sync)tial virus /Lambert D.M., Pons M.W., Mbuy G.N., Dorach-Hasler K. //J. Virol. -1980. -v.36. P.837-846.

160. Nunez A., Caatell S. Defecctien de anticuerpos contra el virus syncytial respiratoric bovine por seroneitralizacion //Rev. Salnd anim. -1987. -v.9. N 3. P.266-267.

161. Odegard O.A.,Krogerud J. A field outbreak by bovine respiratory syncytial virus//Acta vet. Scand.- 1977,-v. 18.-P429-431.

162. Paccaud M.F.,Jacquier A. A respiratory syncytial virus of bovine oxigin//Arch.des. Virusforch.-1970.-V.-30.-P327-342.

163. Paramyxoviridae /Kingabury D.W.,Bratt M.A.,Choppin P.W. ,HansonR.P.,Hosaka Y.,ter Meulen V., NorrbiJ E.,Plowright W.,Rott R., Wunner W.H.//Intervirology.-197 8.-v. 10.-P 137-152.

164. Parry J.E.,Shirodaria P.V.,Pringle C.R. Pneumoviruses: the cell surfoce of lytically and persistently infected ceIle//J.Gen.Virol.-1979.-v.44.-P479-491.

165. Peacoch D.,Clarke S.K.R. Respiratory syncytial virus in Britain//Laneet.-1961.-V.2.-P466.

166. Peebles M.,Levine S. Metobolic reguirements for the maturation of respiratory syncytial virus//J.gen.Virol.l980.-v.50.-P81-88.1. Netu.

167. Pirie H.M., Petrie L., Pringle C.R. Acute fetal pneumonia in calves due to respiratory syncytial virus //Vet. Rec -1981. -v.108. P.411-416.

168. Physicochemical proporties of bovine respiratory syncytial virus /Inaba Y., Tanaka Y., Cmori Т., Matumoto M. //Jap. J. Microbiol. -1973. -v. 17. P.211-216.

169. Porter D.D., Mysk K.B., Prince G.A. The age dependence of respiratory syncytial virus growth in ferret lung can be shown in organ and monolayer cultures //Clin. Immund. Immunopath. -1980. -v.15. N 3. P.415-423.

170. Pospisil L., Mensik J., Valicek L. Isolation and identification of a Bovine Respiratory syncytial virus in Czechoslovakia //Acta. Vet. Brno. -1978. — v.47. P.79-86.

171. Potgieter L.N.D., Aldrida P.L. Use of the indirect fluorescent antebudy test in the detection of bovine respiratory syncytial virus antibodies in Bovine serum. //Amer. J. Vet. Res. -1977. -v.38. N 9. P.1341-1343.

172. Prince G.A., Porter D.D. The pathogenesis of respiratory syncytial virus infection in infant ferrete //Am. J. Pathol. -1976. -v.82. P.339-350.

173. Pringle C.R., Parry J.E. Location and quantitation of antigen of the surface of virus-infected cells by specific bacterial adherence and senbing electron microscopy //J. Viral. Meth. -1980. -v.l. P.61-75.

174. Propagation of bovine respiratory syncytial virus in calftesticle microcarrier culture /Charlier G., Wellwmans G., Lale A., Strobbe R. //Arch. Exp. Veterinarmed. -1984. -v.38. N 6. P.894-899.

175. Properties of a respiratory syncytial virus isolated from a sheep with rhinitis /Wermann J.F., Liggitt H.D., Parish S.M., Word A.C.S., Lea Master B.R. //J. Vet. Res. -1985. -v.46. N 4.

176. Reed L.J., Muench H.A. A simple method of astimating 50 percent endpoints //Am. J. Hyg. -1938. -v.27. P.493-497.

177. Reichstelner J. Thermal inactivation of respiratory syncytial virus in water and hypertonic solutions //J. gen. Virol. -1969. -v.5. P.397-403.

178. Respiratory syncytial virus antibodies in non-human primates and domestic animals /Richardson-Wyatt L.S., Belshe R.B., London W.T., Sly D.L., Camargo E., Chanok R.M. //Lab. Anim. Sci. -1981. -v,31. P.314-415.

179. Respiratory syncytial virus. IV. Corelation of virus shedding, serologic response and illness in adult volunteers /Johnsom K.M., Chanok R.M. Rifhind D., Kravetz H.M., Knight V. //J. Amer. Med. Ass. -1961. -v.176. P.663-667.

180. Respiratory syncytial virus. In: Evans A.S. (ed) /Chanock R.M., Kim H.W., Brandt C., Parrott R.H. //Viral infections of Humans. Epidemiology and Control: Plenum. -1976. P.365-382.

181. Respiratory syncytial virus infections and its serologic epidemiology /Suto Т., Yano N., Ikeda M., Takai S., Jhigeta S., Himema Y., Ishida N.//Am. J. Epidem. -1965. -v.82. P.211 -224.

182. Respiratory syncytial virus infections in indred mice /Prince G.A., Horswcod R.L., Beradt J., Suffin S.C., Chanock R.M. //Infect. Immun. -1979. -v.26. P.764-766.

183. Respiratory syncytial virus infections in mice /Taylor G., Stott E., Hughes N., Collins A.P. //Infect. Immun. -1984. -v.43. P.649-655.

184. Respiratory syncytial virus pneumonia in Friesian calves: physiological findings /Lekeuk P., Verhoeff J., Hajer R., Breukink H.J. /,Res. In veter. Sc.-1985.-v.39.N3.

185. Respiratory syncytial virus pneumonia in young calves: Clinical and pathologic findings /Bryson D.G., NcNulty M.S., Logan E.F., Cush P.F. //Am. J. Vet. Res. 1983. -v.44. N 9. P. 1648-1655.

186. Respiratory syncytial vims III. Production of illness and clinical jbservations in adult volunteers /Kravetz H.M., Knight V., Chanock R.M., Norris J.A., Johonson K.M., Rifkind D., Utz J.P. //Amer. Med. Ass. -1961. -v. 176. P.657-663.

187. Respiratory syncytial virus ts mutants and nuclear immunofluorescence //J. Virol. -1976. -V.20. N 2. P.487-500.

188. Respiratory syncytial virus vaccine, Merck and Ca. Inr. Пат.46727. Ирландил.заявк. 19.4.78. N768/78. Опублик. 7.9.83. №61к 39/12, С 127/08.

189. Richman A.V., Tauraso N.M. Growth of respiratory syncytial virus in suspension cell culture //Appl. Microbiol. -1971. -v.22. P. 1123-1125.

190. Rossi C.R., Kiasel G.K. Serological evidence for the associationof bovine respiratory syncytial virus with respiratory tract disease in Alabama cattle //Infect. Immun. -1974. -v. 10. P.293-298.

191. Rossi C.R., Kiesel G.K. Bovine respiratory syncytial virus infection of bovine embryonic lung cultures: a kinetic study by the fluorescent antidodi techique //Amer. J. Vet. Res. -1977. -v.38. N 11. P. 1901 -1904.

192. Rossi C.R., Kiesel G.K. Bovine respiratory syncytial viruj infection of bovine embryonic lung cultures: enhancement of infectiviey with diethylaminoethyl-dextran and virus-infected cells //Arch. Virol. -1978. — v.58. N 3. P.227-236.

193. Schirrmier M. Zur morphologischen und immunhistologischen Diagnostik wirusbedingter respiratorischer Erkrankungen der Kelber //Mh. Vet.-Med. -1980. H 35. S.35-39.

194. Senterfit L.B., Baldridge P.B. Separation and concentration of respiratory syncytial virus (RSV) antigens //J. Immunol. Meth. -1974. -v.4. P.349-357.

195. Serological evidence of respiratory syncytial virus infection in sheep /Berthiaume L., Joncas J., Boulay G., Pavilanis V. //Vet. Rec. -1973. -v.93. P.337-338.

196. Shahrabadi M.S.,Lee Patrick W.K.Calcium reguirement for syncitium formation in Hep-2gells by respiratory syncytial virus//J.Clin. Microbiol.-1988.-v.26.№ 1 .P139-141.

197. Smith M.H., Frey M.L.JDierks R.B.Isolation and characterisation of a bovine syncytial virus//Vet.Rec.-1974.-v.-94.-P599.

198. Storch G.A.,Reed C.A.,Dalu L.A. Evaluation ofa latex agglutination test for herpes simplexvirus//J.Clin.Microbiol.-1988.v.-26.№4.-P'87-788.

199. Structure of bovine respiratory syncytial virus/Ito Y.,Tanaka Y.,Inaba Y.,Omori T.//Arch.ges.Virusforsch.-l973.-v40.-P 198-204.

200. Stott E.J., Taylor G.Respiratory syncytial virus//Arch.Virol.-1985.-v.84.-Pl-52.

201. The characterisation and uses of monoclonal to respiratory syncytial virus/ Stott E.J.JBew M.H. Taylor G.,Jebbett J.,Collins A.P.//Develop.Biol.Standart.-1984.

202. The detection of respiratory syncytial virus in nasopharyngeal aspirates :assesament formulation,and eveluation of monoclonal antibodies as a diagnostic reagent/Freke A.,Stott E.J.,Roome A.P.,Caul E.O.//J.Med. Virol.-1986,-v. 18,№2 .-P181 -191.

203. The development of monoclonal antibodies to respiratory syncytial virus and their ugein liagnosis immunofluoreacence/Routledge E.G.,Mcquillin J.,Smason A.C.R.,Toms G.L.//J. Med. Virol.-1985.-vl5.№3.-P305-320.

204. The growth of respiratory syncytial virusin organ cultures of bovine foetal trachea/Thomas L.H., Stoff H.J.,Jebbett J.,Hemiltot S.//Arch.Virol.-1976.-v.-52.-P251-258.

205. The pathogenesis of respiratory syncytial virus infection in cotton rats/Prince G.A.,Jenson A.B.,Horawood R.L.,Camargo E.,Chanock R.M.//Am.J.Pathol.-1978.v.93.-P771-784.

206. TlorentG.,DeMarneffe C.,Boiler E.Bovines respiratorisches syncytial virus(BRSV) in der Sciwei:Eline serologische stutie//Schwauz.I.h.Tiasfeuk.-l 985 .-v. 10.-P 127.

207. Trepanier P.,Payment P.,Trudel M.Concentration of human respiratory syncytial virus sulphatepolysthylene glycol or hollow firbe ultrafiltration//J.Virol.Meth.-1981 .-V.3.-P201 -211.

208. Treuhaft M.W. A colorimetric assay for quanti fication of defective interfering particles of respiratory syncytial virus//J.gen. Virol.-1983.-V.64.P1301-1309.

209. Trauhaft M.W.,Beern M. O.,Defective interfering Particles of respiratory syncytial virus infect //Immun.-1982.-v.37.P 439-444.

210. Ueba O. Purification and polipeptides of respiratory syncytial virus//Microbiol.Immunol.-1980.-V.24-P.3 61 -364.

211. Bovine respiratory syncytial virus infectioon in young dairycattle:clinical and haematologicalfindinys/verhoeff J., Van der VanM., Nieuwstadt A.P.K.M.I.//V et.Rec.-1984. v. 114 ,N: 1 .P9-12.

212. Virus Gross-infection in paediatric wards/Gardner P.S.,GourtS.D.M.,Brocklebank J.T.,Downham M.A.R.S.,Weightman D.//Br. Med.J.-1973.v.2.-P571-575.

213. Vires isolations from throans of children admitted to hospital with respiratory and other diseses,menchester,1962-1964/Holzel A.,Parker L.,Patterson W.H.,Cartmel D.,White L.L.R.,Purdy R.,Thompson K.M.,Tobin J.O.H.//Br.Med. J. 1965. v. 1 .P614-619.

214. Welsh E.E.,Hruska J. Monoclonal antibodies to respiratory : yncytial virus proteins:Identification of the fusion protein// J.Virol.-1983.v.47.P171-177.

215. Waleh E.E.,Schlesinger J.J.,Brandriss M.W. Purification and characterisation of GP90,one of the en velope dlycjproteins of respiratory syncytial virus//J.gen.virol.-1984.v65 .P761 -767.

216. Wellemans G.,van Opdenboach E. Vaccination des bovins contre le respiratory syncytial virus (RSB) au moyen d'une souchs attenuee //Ann. Med. Vet.-1978.-v. 122. P.537-543.

217. Winner W.H., Faulkner C.P., Pringle C.R. Respiratory syncytial virus some biological and biochemical properties. -New York: Academie Press. — 1975. P. 193-201.

218. Winner W.H., Pringle C.R. Respiratory syncytial virus proteins //Virology. -1976.-v.73. P.228-243.

219. Yrlova T.J., Zoshchenkova N.Ya., Karpova L.S. Natural variability of respiratory syncytial viruses, their interverance and reproduction characteristics //Acta Virol. -1985. -v.29. N 4. P.279-284.

220. Zacstilskaya L.Ya., Almeida J.D., Bradstreet C.M.P. The morphological characterisation of respiratory syncytial virus by a simple electron microscope technique //Acta. Virol -1967. -v.l 1. P.420-423.

221. Zrein N., Obert G., Regonortal M.H. van. Use of agg-yalk antibody for detection of respiratory syncytial virus in nase secretions by ELISA //Arch. Viro. -1986. -v.90. N3. P. 197-206.

222. Zugraic N. Vaccination against RS virus: a five yaar experience with Rispoval //Proceedings of XII World Congresse on Diseases of Cattle. -1982. P.189-195.