Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Дизайн, конструирование и изучение свойств поли-CTL-эпитопного Т-клеточного иммуногена - кандидата ДНК-вакцины против ВИЧ-1/СПИД

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Дизайн, конструирование и изучение свойств поли-CTL-эпитопного Т-клеточного иммуногена - кандидата ДНК-вакцины против ВИЧ-1/СПИД"

На правах рукописи

Белавин Павел Александрович

ДИЗАЙН, КОНСТРУИРОВАНИЕ И ИЗУЧЕНИЕ СВОЙСТВ ПОЛИ-СТЬЭПИТОПНОГО Т-КЛЕТОЧНОГО ИММУНОГЕНА -КАНДИДАТА ДНК-ВАКЦИНЫ ПРОТИВ ВИЧ-1/СПИД

03.00.03 —молекулярная биология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Кольцово - 2006

Работа выполнена в ФГУН Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека Минздравсоцразвития России.

Научный руководитель:

кандидат биологических наук, с.н.с. Бажан Сергей Иванович Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук Орловская Ирина Анатольевна кандидат биологических наук Кочнева Галина Вадимовна

Ведущая организация:

Институт цитологии и генетики СО РАН, г.Новосибирск

Защита состоится 28 декабря 2006 года. в П_ часов на заседании диссертационного совета Д.208.020.01 при Государственном научном центре вирусологии и биотехнологии «Вектор» по адресу: ГНЦ ВБ «Вектор», Кольцово, Новосибирской области, 630559, тел. (8-383) 336-74-28.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГНЦ ВБ «Вектор». Автореферат разослан 24 ноября 2006 года.

Ученый секретарь диссертационного совета

Э.Г. Малыгин

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Наиболее эффективным средством предотвращения и даже искоренения многих вирусных инфекций являются вакцины, как это было продемонстрировано с вирусами оспы, полиомиелита, желтой лихорадки и кори. Однако, в случае ВИЧ-1 инфекции эффективной профилактической или терапевтической вакцины пока создать не удалось, несмотря на значительные усилия и инвестиции всего мирового сообщества. Разработка безопасной и эффективной анти ВИЧ/СПИД вакцины затруднена из-за ряда факторов, среди которых высокая генетическая вариабельность ВИЧ-1, недостаток знаний иммунных механизмов защиты, отсутствие релевантных и предсказуемых моделей и сложность проведения эффективных испытаний, особенно в развивающихся странах.

Известные стратегии создания вакцины против ВИЧ-1 основаны на использовании различных форм вирусного антигена, включая инактивированный вирус, модифицированный вирус, аттенуированный живой вирус, нативные белки, генноинженерные пептиды, а также рекомбинантные бактерии, вирусы и плазмидные ДНК [Berzofsky et al,. 2001]. Каждая из этих стратегий была опробована, однако проблемы создания анти-ВИЧ-1-вакцины до сих пор не решены.

Хотя точно не известно, какой тип иммунного ответа коррелирует с защитой от ВИЧ-1 у человека, тем не менее, многочисленные прямые доказательства, полученные в исследованиях на животных, и косвенные данные, полученные на человеке, предполагают, что в контроле ВИЧ-1 инфекции у людей и SIV инфекции у macaques важную роль должны играть как клеточные, так и гуморальные механизмы защиты, включая CD4+ и CD8+ Т-клетки, освобождаемые ими цитокины и хемокины, а также антитела с широким спектром нейтрализующей активности [Berzofsky et al., 2004; Ogg et al., 1998; Price et al., 1998; Wagner et al, 1998; Yang et al, 1997].

Несмотря на то, что в последнее время разрабатываются новые обещающие подходы, нацеленные на индукцию нейтрализующих антител [Binley et al., 2000], акцент многих исследователей сместился в сторону индукции клеточно-

го иммунитета [Thomson et al., 1995, 1996; Hanke et al., 1998], так как появились убедительные доказательства, что ответы цитотоксических Т-лимфоцитов (CD8+ CTL), ассоциированные с ВИЧ-инфекцией, являются важными медиаторами противовирусного иммунитета и, следовательно, ВИЧ-специфические CTL могут быть важным компонентом эффективной вакцины против ВИЧ-1 [Rowland-Jones et al, 1995; Yang et al., 1997; Letvin N.L. 1998; Ogg et al., 1998; Price et al., 1998].

Учитывая стремительное распространение эпидемии СПИДа во всем мире, задача создания вакцины против ВИЧ-инфекции имеет чрезвычайно актуальное значение и требует создания новых подходов к разработке эффективных анти-ВИЧ вакцин и систем их доставки. Один из наиболее обещающих подходов связан с идентификацией Т- и B-клеточных эпитопов в белках вируса и созданием на их основе синтетических полиэпитопных вакцин [Hanke et al., 1998; Woodberry et al., 1999; Firat et al., 2001; Bazhan et al., 2004; Karpenko et al., 2004; Lorin et al., 2005]. Такие вакцины будут свободны от многих недостатков, свойственных вакцинам на основе живого аттенуированного или целого инактиви-рованного патогена, а так же на основе отдельных вирусных белков.

Цель работы. Целью данной работы явилось конструирование искусственного поли-СТЬ-эпитопного Т-клеточного иммуногена (TCI), кандидата для использования в качестве эффективной и безопасной ДНК-вакцины против ВИЧ-1.

Задачи исследования. В ходе выполнении данной работы решались следующие задачи:

1) Проектирование поли-СТЬ-эпитопного иммуногена;

2) Синтез гена, кодирующий целевой белок;

3) Получение рекомбинантных плазмид для экспрессии целевого гена как в прокариотической, так и в эукариотической системах;

4) Доказательство антигенной специфичности и иммуногенности продуктов экспрессии целевого гена в составе рекомбинантных плазмид.

Научная новизна исследования. В представленной работе сконструирована рекомбинантная плазмида — кандидат ДНК-вакцины против ВИЧ-1, экс-прессирующая искусственный полиэпитопный Т-клеточный иммуноген TCI. Среди известных аналогов данная вакцинная конструкция является наиболее представительной, так как содержит более 80-ти эпитопов (как CD48+ CTL, так и CD4+ Th) из белков ВИЧ-1 Env, Gag, Pol и Nef.

Дизайн TCI иммуногена проведен с учетом ряда критериев, нацеленных на повышение безопасности и эффективности предложенной кандидатной вакцины.

Синтез гена, кодирующего целевой иммуноген проведен с использованием оригинальной схемы сборки комбинированием матричного и безматричного синтеза методом ПЦР.

Исследование специфичности и иммуногенности полученной ДНК-вакцинной конструкции проведено с использованием современных иммунохи-мических и иммунологических методов.

Показано, что плазмида, кодирующая белок TCI способна индуцировать как специфические Т-клеточные ответы (CTL и бласттрансформацию), так и вызывать синтез специфических антител у иммунизированных животных.

Научно-практическая значимость работы. Сконструированная в данной работе рекомбинантная плазмида pcDNA-TCI является ДНК-вакцинным компонентом двух созданных во ФГУН ГНЦ ВБ «Вектор» кандидатных вакцин против ВИЧ/СПИД «Сал-ВИЧ Д» и «КомбиВИЧвак». В настоящее время проведены доклинические испытания этих кандидатных вакцин. Показано, что обе вакцины индуцируют формирование ВИЧ-специфического гуморального и клеточного ответов и не оказывают негативного воздействия на функцию основных физиологических систем организма. Полученные при иммунизации животных сыворотки обладали вируснейтрализующей активностью in vitro. В Министерстве здравоохранения и социального развития РФ и ФГУ НЦ ЭСМП проведена предрегистрационная экспертиза комплекта разработанных документов на вакцины «КомбиВИЧвак» и «САЛ-ВИЧ Д», экспертиза наименования МИБП и

их лекарственной формы выпуска. В настоящее время в ГИСК им. JI.A. Тарасе-вича проводится экспертиза представленных документов на две кандидатные вакцины, экспертиза результатов их доклинического исследования, экспертиза качества серий вакцин и оценка воспроизводимости методик.

Апробация работы. Результаты работы были представлены на следующих отечественных и международных конференциях: The international conference, devoted to the 80 anniversary from the date of a birth of the academician Knorre D.G. (Novosibirsk, Russia, 30 July - 4 August, 2006); First Eastern European and Central Asian AIDS Conference (Moscow, 15-17 May 2006); International conference "Biotechnology and medicine " (Moscow, 14-17 March 2006); HIV/AIDS Final Workshop (Moscow, Russia, November, 14-18, 2004); IV-th ISTC Scientific Advisory Committee Seminar on Basic Science in ISTC Activities (Novosibirsk, 23-27 April, 2001); 1-я и 8-я Международная Конференция "СПИД, РАК И РОДСТВЕННЫЕ ПРОБЛЕМЫ" (Санкт Петербург, 24-28 мая 1999 г. и 19-24 мая 2000 г.)

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 3 статьи в рецензируемых журналах и получено два патента.

Структура и объём диссертации. Работа изложена на 108 страницах машинописного текста. Состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов и обсуждения, заключения, выводов и списка литературы. Список литературы включает 185 источника. Диссертация иллюстрирована 19-ю рисунками и 5-мя таблицами.

Автор выражает искреннюю благодарность коллегам, в сотрудничестве с которыми была выполнена диссертационная работа: Бабкиной И.Н., Бабкину И.В., Бажану С.И., Гилёвой И.П., Данилюк Н.К., Игнатьеву Г.М., Ильичеву А.А., Карпенко Л.И., Некрасовой Н.А., Серегину С.В.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Клетки, плазмиды, ферменты, питательные среды, олигонуклеотиды. В

работе использовали бактериальные штаммы Escherichia coli JM109 (recAl, endAl, gyrA96, thi-1, hsdRll (rk" nO, supE44, re/Al, X', A(lac-proA, B), [F' träD96, proA, B, /acIqZAM15]), AD494(DE3) (Novagen, США), XLl-blue из коллекции ГНЦ ВБ "Вектор", векторные плазмиды pFH123 [Daniliuk N.K. et al., 1991]; pBK-RSV (Stratagen, США), pcDNA3.1/Myc-His(-)/lacZ (Invitrogen, США), pET32a (Novagen, США) и pGEX-4T-l (Pharmacia, Швеция), эндонук-леазы рестрикции, Т4-ДНК-лигазу, Taq-ДНК-полимеразу производства "Си-бЭнзим" (Новосибирск); акриламид, агарозу, щелочную фосфатазу, нитротет-разолевый синий, 5-бром-4-хлор-3-индолилфосфат и другие реактивы для молекулярной биологии производства "Sigma" (США), основные компоненты питательных бактериологических сред производства фирмы "Difco" (США); олигонуклеотиды производства ГНЦ ВБ "Вектор" (Кольцово, Новосибирской обл.), кДНК ВИЧ-1 штамм ШУ-1/EVK [Sidney J. et al., 1996], а также диагностическую тест-систему ВИЧ-экспресс, панель человеческих сывороток против ВИЧ-1 и МКА против детерминанты EPFRDYVDRFYKTL, локализованной в белке р24 ВИЧ-1 (ЗАО "Вектор-Бест", Кольцово, Новосибирской обл.). Экспрессия гена TCI в клетках E.coli. Для доказательства экспрессии гена TCI в клетках E.coli были сконструированы рекомбинантные плазмиды рЕТ-TCI и pGEX-TCI, которые получали клонированием гена TCI (в виде BamWl-баЛ-фрагмента плазмиды pFH-TCI) в векторных плазмидах рЕТЗ2а/BamHl-Sall и рGЕХ-4Т-1 /BamHl-Sall, соответственно. Полученными плазмидами и трансформировали компетентные клетки E.coli JM109/pET-TCI и E.coli XL1-blue/pGEX-TCI. Наличие целевых химерных белков TRX-TCI и GST-TCI в индуцированных с помощью ИПТГ клетках E.coli определяли методом электрофореза в денатурирующих условиях [Laemmli U.K. et al., 1970]. Выделение химерных белков TRX-TCI и GST-TCI из бактериальных клеток проводили с использованием аффинной хроматографии на Ni-NTA агарозе (QIAexpress Protein

Purification System, "QIAGEN") по методике, рекомендованной фирмой-изготовителем. Чистота белков составляла 90-95%.

Получение поликлональной сыворотки к белку TRX-TCI. Беспородные кролики были трехкратно иммунизированы очищенным белком TRX-TCI в дозе 100 мкг/животное внутримышечно с интервалом две недели. Титры антител контролировали через каждую неделю. Сыворотки с максимальными титрами собирали и использовали для иммуноблот-гибридизации рекомбинантных белков.

Определение ВИЧ-антигенности рекомбинантных белков GST-TCI и TRX-TCI методами ИФА и иммуноблот-гибридизации. Образцы клеток E.coli, экспрессирующих белки TRX-TCI и GST-TCI, для проведения иммуноблот-гибридизации готовили следующим образом: 1 мл индуцированной клеточной суспензии центрифугировали при 6000 об/мин в течение 1 минуты на центрифуге "Eppendorf 5415". Клетки суспендировали в лизирующем буфере, кипятили 3 мин. и подвергали электрофоретическому разделению в 13% SDS-полиакриламидном геле как описано [Laemmli U.K. et al., 1970]. Иммуноблот-гибридизацию проводили с МКА 29F2 и 30А6 к белку р24 ВИЧ-1, а также с по-ликлональными анти-TRX-TCI антителами кролика. Проявление иммунной реакции осуществляли с помощью.конъюгата антител кролика против IgG мыши со щелочной фосфатазой и конъюгата антител козь1 против IgG кролика со щелочной фосфатазой.

Получение плазмиды для клонирования гена TCI в эукариотической системе. Для клонирования гена TCI в эукариотической системе использовали вектор pcDNA3.1/Myc-His(-)/lacZ (Invitrogen, США). Для того чтобы экспрессия целевого гена TCI была наиболее оптимальной, во-первых, был удален плаз-мидный фрагмент, содержащий промотор и участок lacZ-гена E.coli и, во-вторых, перед стартовым ATG-кодоном введена консенсусная последовательность Kozak. Полученная рекомбинантная плазмида pcDNA-TCI использовалась для ДНК-иммунизации и оценки иммуногенности полученной вакцинной конструкции.

Иммунизация мышей. Для исследования иммуногенности полученных вакцинных конструкций использовались мыши BALB/c весом 10-12 г из питомника лабораторных животных ГНЦ ВБ «Вектор». Иммунизацию плазмидными конструкциями pcDNA-TCI проводили инъекцией препаратов внутримышечно в задние лапы в отсутствии адьюванта. Для иммунизации использовали две дозы (20мкг иЮО мкг) плазмидной ДНК. Иммунизацию проводили двукратно с интервалом в две недели. Забор крови и спленоцитов для определения титров антител (ИФА), пролиферативной активности лимфоцитов (бласттрансформа-ция) и уровня CTL (ELISPOT) осуществляли через 7, 10, 14, 21, 30, 48 и 55 дней после иммунизации.

Определение пролиферации Т-лимфоцитов. Антиген-специфическую Т-клеточную пролиферацию оценивали с помощью реакции бласттрансформации спленоцитов иммунизированных и контрольных животных по общепринятому методу [Dittmer U. et al, 1994]. В качестве специфических антигенов использовали: белок TCI в концентрации 2 мкг/мл; пептид N15 (DRVIEVVQGAYRAIR), пептид N16 (KQIESfMWQEVGKAMYA). В качестве неспецифического антигена (отрицательный контроль) использовали антиген ЕНЕС (неинфекционный штамм E.coli 0:Н157) в концентрации 2 мкг/мл. В качестве митогена использовали конканавалин A ("Sigma", США), 5 мкг/мл. Пролиферативную активность спленоцитов оценивали по индексу стимуляции, который рассчитывали как отношение средних значений абсолютных чисел DeltaOD стимулированных к среднему значению абсолютных чисел DeltaOD не стимулированных спленоцитов. Достоверным увеличением пролиферативной активности является 50% увеличение индекса стимуляции по отношению к аналогичному показателю в интактном контроле.

Определение титров антител с помощью ИФА. В качестве антигенов для проведения ИФА использовали белок TCI и смесь рекомбинантных белков Gag и Env вируса ВИЧ-1. В работе использован 96-луночный планшет CORNING. Антиген в концентрации 1 мкг/лунку и в объеме 50 мкл адсорбировали 15 часов при 4°С. Для титрования использовали разведение сывороток, начиная с 1:10 до

1:2560. В работе использован коньюгат антител кролика против IgG мыши с пероксидазой хрена («Sigma», США).

Определение количества CTL с помощью реакции ELISPOT. При постановке реакции ELISPOT на первом этапе проводили сорбцию анти-INF-y МАТ с концентрацией 5 мкг/мл на лунку 96-луночного планшета ImmunoSpot М200. После инкубации в течение 12 ч при 4°С каждую лунку дважды промывали раствором PBS и блокировали средой RPMI 1640, содержащей 10% фетальную бычью сыворотку в течение 2 ч. В качестве клеток-эффекторов использовали спленоциты иммунизированных животных в концентрации 10б/мл. Для стимуляции продукции INF-y суспензией клеток использовали белок TCI (1 мкг/мл) и два пептида: N15 (DRVIEVVQGAYRAIR), N16 (KQIINMWQEVGKAMYA), для оценки неспецифической продукции использовали пептид ЕНЕС (отрицательный контроль). Клетки культивировали в присутствии 5% С02 при 37°С в течение 24 ч. INF-у-секретирующие клетки визуализировали, используя 0,5 мкг/мл биотинилированнных анти- INF-y антитела и 0,25 мкг/мл конъюгата Avidin-HRP. Окрашивание производили добавлением субстратов для пероксидазы (4-хлор-1 -нафтол, диаминобензидин фосфат). Реакцию останавливали удалением реагентов, лунки промывали 3 раза дистиллированной водой. Подсчет количества INF-у-продуцирующих клеток осуществляли с помощью микроскопа.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Дизайн искусственного иммуногена, содержащего множественные CTL-

эпитопы основных антигенов ВИЧ-1

Известно, что ВИЧ-1 индуцирует CD8+ CTL ответы путем представления своих антигенов совместно с молекулами главного комплекса гистосовмести-мости (major histocompatibility complex, МНС) I класса на поверхности инфицированных клеток. При этом вирусные антигены распознаются специфическими Т лимфоцитами не как полноразмерные белки, а как короткие пептиды (8-12 а.о.), ассоциированные со специфическими молекулами МНС I класса [Goldberg A.L. et al., 1992, Oldstone М.В. et al. 1989]. Эти короткие антигенные

эпитопы появляются из вирусных цитоплазматических белков в результате протеасом-опосредуемого процессинга [Rammensee H.G. et al., 1993, York I.A. et al., 1996]. Взаимодействие пептидов с молекулами МНС имеет определенную специфичность, в результате чего только некоторые пептиды могут представляться определенным типом МНС молекул. Так как распределение HLA-аллелей варьирует для популяций различных географических регионов, то создание эффективных вакцин против ВИЧ-1 требует индукции CTL-иммунных ответов, специфичных для подтипов вирусов, циркулирующих в данном географическом регионе.

Аминокислотные последовательности CTL-эпитопов, вовлеченных в индукцию ВИЧ-1-специфичных CTL-ответов у инфицированных индивидуумов, суммированы в базе данных Los Alamos HIV Molecular Immunology Database. Для конструирования CTL-иммуногена, кандидата в ДНК-вакцину, были выбраны те из них, которые удовлетворяют следующим критериям:

1. Выбранные эпитопы индуцируют как CD8+ CTL, так CD4+ Th и являются представителями трех основных подтипов ВИЧ-1 - А, В и С, циркулирующих на территории России, США и Западной Европы.

2. Эпитопы выбирались из основных вирусных белков-антигенов Env, Gag, Pol и Nef.

3. Учитывались CD8+ CTL-эпитопы, которые в совокупности рестрикти-рованы десятью различными оптимально подобранными аллелями HLA I класса. Как известно этого достаточно, чтобы покрыть генетическое разнообразие антигенов МНС I класса в популяции практически любого географического района [Напке T. et al., 1998, Lalvani A. et al., 1994, Sidney J. et al., 1996]. Так как распределение HLA-аллелей варьирует для популяций различных географических регионов, то для предсказания CTL-эпитопов в рассмотрение принимались те пептиды, которые связываются с наиболее распространенными HLA аллелями, которые встречаются в мировой популяции в >20% случаев. К таким HLA-аллелям относятся следующие молекулы: HLA-A1, HLA-A2, HLA-A*0201,

HLA-A*0205, HLA-A2.1, HL A-A3, HLA-A*1101, HLA-B7, HLA-B*3501, HLA-Cw*0301, HLA-Cw*0401.

4. Выбранные эпитопы не должны индуцировать аутоиммунные антитела, для чего в последовательностях белков ВИЧ-1 были идентифицированы районы, которые имеют локальное сходство с белками человека и соответствующие эпитопы были исключены из числа кандидатов в состав полиэпитопной вакцины [Maksiutov A.Z. et al., 2002].

Общий дизайн TCI-иммуногена представлен на рис. 1. Оказалось, что большинство выбранных CTL-эпитопов картируются в последовательностях нативных вирусных белков как частично, а иногда и полностью перекрывающиеся пептиды, которые в белках Env, Gag, Pol и Nef локализованы в нескольких непрерывных областях (рис. 1). Причем некоторые районы, кроме CTL-эпитопов (CD8+ CTL), содержат также Т-хелперные эпитопы (CD4+). Именно эти антиген-активные районы выбраны в данной работе для проектирования целевого Т-клеточного иммуногена TCI. Кроме того, эти районы (все кроме протеинкиназы и обратной транскиптазы) содержат также ряд В-клеточных эпитопов, которые перекрываются с Т-клеточными эпитопами (данные не показаны). Это позволило предположить, что белок TCI будет являться активным в отношении ВИЧ-1-позитивных сывороток.

Фактически целевой белок представляет собой упорядоченную последовательность фрагментов белков р17, р24, gpl20, gp41, Pol и Nef, указанных на рис. 1. При этом порядок расположения фрагментов практически не имеет никакого значения, поскольку целевой иммуноген должен представляться иммунной системе в виде коротких пептидов, ассоциированных с молекулами МНС I класса (см. выше). Длина белка TCI составляет 392 а.о. Белок содержит более восьмидесяти эпитопов (как CD8+ CTL, так и CD4+ Th), рестриктированных аллелями HLA I и II классов. Чтобы была возможность исследовать CTL-ответы, индуцируемые ДНК-вакциной на экспериментальных животных, в состав целевого иммуногена включены дополнительные эпитопы, представляемые молекулами МНС I класса мышей и обезьян Macaque rhesus (рис. 1).

□ □

' A3.1 -Al-*25

■A3.1 •Д2 __£7

~™A24 —B8 —Cw3

A2

■ вз

— А3.1

— B27(Bw62) — В35

— Th A24 — (B8) — Th ■ (38)

(вз) —(352)

— (B27)

— (Bw62)

_A2 Cw4 A29

A32 A24 A2+Th

Mamu-A'Ol

P17

(12-47:7.1-86У

„ p24 , (140-159^55-309)

gp120 (37-€1;120-128; -375-384:410444)

gp41 (593-600; 813-856)

A2 —

■ B7 B35

■ A3.1

■B35 ■ (All)

■ B7

-B35

-B35,A3

— A2,A3,(A11,B27)

— B35

— A3.1

— (All)

— (All)

— (All) — (B8)

Фрагменты \ белков ВИЧ-1, содержащие выбранные эпитопы

А2 ■

335 ■ В*2705 • (318)-(В37) — (В57) — (В57)—

Позиции эпитопов

, • Pol (71-79; 205-219;266-277;310;314)

Nef(70-149)

у Происхождение выбранных эпитопов

Рис. 6. Общий дизайн TCI-иммуногена - кандидата в вакцину против ВИЧ-1

Прямоугольниками обозначены последовательности белков ВИЧ-1, содержащие выбранные эпитопы. Позиции индивидуальных эпитопов обозначены линиями. Ограничения эпитопов по антигенам главного комплекса гистосовмести-мости человека, мышей и обезьян отмечены соответствующими буквами (HLA-A, В, Cw - human, Н-2а, b, d, f, k, p, u, q - mouse, Mamu-A*01 - Macaca mulatto). Th - Т-хелперные эпитопы.

Конструирование искусственного гена

Первичная структура гена TCI и соответствующая ей аминокислотная последовательность представлена на рис. 2. Для синтеза искусственного гена длиной 1176 пар оснований был реализован блочный способ сборки из трех предварительно синтезированных блоков ДНК. При этом блоки I, II, III были спланированы таким образом, что первый кодирует эпитопы из Gag, второй - из Env, и третий - из Pol и Nef.

Синтез фрагментов I, II и III осуществляли комбинированием матричного и безматричного синтеза методом ПЦР. В качестве матрицы использовали либо протяжённый участок кДНК ВИЧ-1 (штамм HIV-l/EVK [Mamaeva O.A. et al., 1991]), на котором локализованы выбранные перекрывающиеся CTL-эпитопы конкретного белка, либо частично комплементарные олигонуклеотидные прай-меры. Полученные ПЦР-фрагменты ДНК I, II и III гена TCI клонировали в составе векторной плазмиды pFH123 [Daniliuk N.K. et al., 1991] по участкам рестрикции ВатШ и Sali в клетках E.coli XL 1-blue. Эта плазмида несёт специфический полилинкер, содержащий сайты для SII-эндонуклеаз рестрикции (в данном случае нами была использована Fokl рестриктаза), позволяющая получать после стадии промежуточного клонирования ДНК с уникальными заранее запланированными «липкими» 5'-концами. В результате были получены реком-бинантные плазмиды pFH-I, pFH-II и pFH-III, содержащие фрагменты гена TCI.

Для получения плазмиды pFH-TCI, содержащей целевой ген TCI, использовали описанный выше вектор pFHl23/BamiH-Sall, а также три фрагмента гена TCI, выделенные из плазмид pFH/I (BamHl-Fokl - фрагмент), pFH/II (Fokl-Fokl -фрагмент) и pFH/III (Fokl-Satl - фрагмент). В этом случае изменённая структура 5'-концов фрагментов I, II и III гена TCI позволила легко осуществить их однозначную сборку с получением полноразмерного гена TCI на последнем этапе клонирования. Последовательность синтезированного гена TCI была подтверждена секвенированием.

Igctagfcfegcca'ctjj

^-начало гена TCI (начало блока I)

^T^AAATTCGGTTAAGGCCAGGGGGAAAGAAAAAATATAAATTAAAACATATAGTATGG

fMKIRLRPGGKKKYKLKHIVW

GCAAGCAGGGAGCTAGAACGATTCGCAGTTAATGGATCAGAAGAACTTAGATCATTATAT

ASRELERFAVNGSEELRSLY

AATACAGTAGCAACCCTCCAGGCCATATCACCTAGAACTTTAAATGCATGGGTAAAAGTA

NTVATLQAI S PRT LNAWVKV

GTAAATCCACCTATCCCAGTAGGAGAAATTTATAAAAGATGGATAATCCTGGGATTAAAT

VNPPIPVGEIYKRWIILGLN

AAAATAGT AAGAAT GTAT AGCCC T ACCAGCAT T CT GGACATAAGACAAGGACCAAAAGAA

KIVRMYSPTSILDIRQGPKE

конец блока 1^|(-начало блока II CCCTTTAGAGACTATGTAGACCGGTTCTATAAAACTCTAAGAGCCGAGCAAGCTACAGTC PFRDYVDRFYKTLRAEQATV TATTATGGGGTACCTGTGTGGAAGGAAGCAACCACCACTCTATTTTGTGCATCAGATGCT YYGVPVWKEATTTLFCASDA AAAGCATATAAATTAACCCCACTCTGTGTTAGTTTAAGTTTTAATTGTGGAGGAGAATTT KAYKLTPLCVSLSFNCGGEF T T С TACAGAATAAAACAAAT T ATAAACAT G T G GCAG GAAGTAGGAAAAGCAAT G TAT GC С FYRIKQI INMWQEVGKAMYA CCTCCCATCAGTGGACAAATTAGATACCTAAAGGATCAACAGCTCCTGAGCTTGCTCAAT PPISGQIRYLKDQQLLSLLN GCCACAGACATAGCAGTAGCTGAGGGGACAGATAGGGTTATAGAAGTAGTACAAGGAGCT ATDIAVAEGTDRVIEVVQGA TATAGAGCTATTCGCCACATACCTAGAAGAATAAGACAGGGCTTGGAAAGGATTTTGCTA YRAIRHIPRRIRQGLERILL конец блока II"i ^-начало блока III

ATCACTCTCTGGCAACGACCCCTCGTCGAAATTTGTACAGAAATGGAAAAGGAAGGGAAA

ITLWQRPLVEICTEMEKEGK

ATTTCAAAAATTGGGCCTACAGTACTCGATGTGGGTGATGCATATTTTTCAGTTTGGAAA

ISKIGPTVLDVGDAYFSVWK

GGATCACCAGCAATATTCCAAAGTAGCATGACAAAAATCTTAGAGCCTTTTAGAAAACAA

GSPAIFQSSMTKILEPFRKQ

AATCCAGACATAGTTATCTATCAATACATGGACGATTTGTTTCCAGTCACACCTCAGGTA

NPDIVIYQYMDDLFPVTPQV

CCTTTAAGACCAATGACTTACAAGGCAGCTGTAGATCTTAGCCACTTTTTAAAAGAAAAG

PLRPMTYKAAVDLSHFLKEK

GGGGGACTGGAAGGGCTAATTCACTCCCAACGAAGACAAGATATCCTTGATCTGTGGATC

GGLEGLIHSQRRQDILDLWI

TACCACACACAAGGCTACTTCCCTGATTGGCAGAACTACACACCAGGACCAGGGATCAGA

YHTQGYFPDWQNYTPGPGIR

конец гена TCI (конец блока 11ц|-) TATССАСТGACCTTTGGCTGGTGCT ACAAGCT AGT ACCAGjGGTТ ACC|AfrGA| jgtcgacl YPLTFGWCYKLVP

|gctagc| - сайт рестрикции ЫИе\',

|gtcgac| - сайт рестрикции 5а Л;

клСТТАСС^ - сайт рестрикции ВьгЕП (РзрЕ!) ;

рсдссасд - последовательность Когак;

|АТ(5| - инициирующий кодон;

|ТСА| — стоп-кодон.

Рис. 2. Нуклеотидная и аминокислотная последовательность иммуногена TCI

SV40 Pr+ori

Рис. 3. Генетическая карта плазмиды pcDNA-TCI

TCI — ген, кодирующий белок TCI; CMVpr — эукариотический промотор цито-мегаловируса; BGHpolyA, SV40polyA — сигналы полиаденилирования; bla — ген устойчивости к ампицилину; Neo-R — ген устойчивости к неомицину; SV40ori — эукариотический старт репликации (функционален только в присутствии большого Т-антигена вируса SV40, используется для анализа экспрессии целевых генов в Cos клетках. В отсутствии Т-антигена вируса SV40 в клетках животных и человека неактивен). Указаны положение сайтов узнавания для эндо-нуклеаз рестрикции

Иммунохимическое исследование продукта гена TCI

Чтобы доказать, что целевой ген экспрессирует эпитопы ВИЧ-1, ген TCI был клонирован в клетках E.coli в составе экспрессирующих векторов pGEX-2T и рЕТ-32а. Антигенные свойства искусственного белка TCI, связанного как с GST, так и TRX белками, были исследованы в ИФА с использованием панели ВИЧ-1 позитивных сывороток больных (10 образцов) и панели ВИЧ-1 негативных человеческих сывороток (10 образцов донорской крови). Оба химерных белка 100% выявлялись на панели позитивных сывороток и не связывались ни с одной из негативных сывороток. Это подтверждает, что белок TCI обладает ВИЧ-1 антигенной активностью.

Антигенные свойства белка TCI были исследованы также и с помощью иммуноблот-гибридизации с МКА 29F2 и 30А6, которые связываются с эпито-

пом EPFRDYVDRFYKTL, локализованном как в белке р24 ВИЧ-1, так и белке TCI. Из представленных данных видно, что продукты экспрессии с плазмиды рЕТ-ТС1 (белок TRX-TCI) и плазмиды pGEX-TCI (белок GST-TCI) связываются с МКА к р24 ВИЧ-1, следовательно, эти белки имеют общий эпитоп с белком р24. Этот вывод подтверждается также результатами, полученными с использованием сыворотки кролика, иммунизированного белком TCI-TRX, которая реагирует не только с обоими рекомбинантными белками TRX-TCI и GST-TCI, но и узнает природный белок р24 ВИЧ-1.

Исследование иммуногенности плазмидной ДНК, кодирующей белок TCI

Для оценки иммуногенности плазмидной ДНК, кодирующей поли-CTL-эпитопный иммуноген TCI использовалась рекомбинантная плазмида pcDNA-TCI (рис. 3). При этом исследовали следующие параметры иммунного ответа: ответ CTL, пролиферативный ответ лимфоцитов и титры антител.

Ответ CTL оценивали в реакции ELISPOT по выявлению IFN-y-продуцирующих лимфоцитов мышей, иммунизированных плазмидой pcDNA-TCI. Полученные результаты представлены в рис. 4. Анализ иммуногенности ДНК-вакцинной конструкции позволяет сделать следующие выводы.

Во-первых, плазмидная ДНК, кодирующая белок TCI способна индуцировать специфические CTLs у иммунизированных животных в ответ на стимуляцию спленоцитов in vitro как полноразмерным белком TCI, так и отдельными эпитопами (пептидами N15 и N16).

Во-вторых, при иммунизации животных pcDNA-TCI наблюдается четко выраженный дозозависимый эффект. Доза плазмидной ДНК 100 мкг вызывает более ранний, более высокий и более пролонгированный ответ CTL по сравнению с дозой 20 мкг.

Двукратная иммунизация животных (бустированных плазмидой pcDNA-TCI, доза 50 мкг) приводит к выраженному увеличению CTL ответов. Особенно это оказалось заметным в группе животных, праймированных той же плазмидой при дозе 100 мкг.

Ш

3 о

21

30

Дни после иммунизации

□ Контроль (ЕНЕС) ■ ТО О N15+N16

7 14 21 30 Дни после иммунизации

□ Контроль (ЕНЕС) ■ ТО В N15+N16

? ° 10

1 «

2 х п

g о 3 1

S S ш 50

I I I 40 ill30 |И 20

S 10

lis 0

О 7 14 21 30 Дни после иммунизации

□ Контроль (ЕНЕС) ■ ТО О N15+N16

0 7 14 21 30 48 Дни после иммунизации

□ Контроль (ЕНЕС) ■ ТО Ш N15+N16

Рис. 4. Цитотоксическая активность спленоцитов животных, иммунизированных плазмидой pcDNA-TCI

А, Однократная иммунизация, доза 20 мкг; В, Двукратная иммунизация, доза 20 мкг + 50 мкг; С, Однократная иммунизация, доза 100 мкг; D, Двукратная иммунизация, доза 100 мкг + 50 мкг. Ответ CTL оценивали по выявлению IFN-y-продуцирующих спленоцитов иммунизированных мышей BALB/c в реакции ELISPOT. Результаты представлены как среднее число IFN-y—продуцирующих клеток на 105 спленоцитов ± стандартная ошибка среднего значения. Для специфической стимуляции продукции INF-y суспензией спленоцитов иммунизированных мышей (BALB/c) использовали белок TCI и два входящих в него пептида: N15 (DRVIEVVQGAYRAIR - эпитоп из белка gp41) и N16 (KQI-INMWQEVGKAMYA - эпитоп из белка gpl20). Для оценки неспецифической продукции использовали пептид ЕНЕС (отрицательный контроль).

Исследование пролиферативного ответа лимфоцитов показало, что спле-ноциты, выделенные от иммунизированных животных, обнаруживают прирост пролиферации как на белок TCI, так и на пептиды N15 и N16 по сравнению с пролиферацией контрольной группы животных, иммунизированных векторной плазмидой pcDNA3.1. Как и в случае CTL-ответов, увеличение дозы вакцинации или вторичная иммунизация животных вызывают увеличение пролифера-тивной активности спленоцитов.

Титры антител у животных, иммунизированных рекомбинантной плазми-дой pcDNA-TCI оценивали в реакции ИФА с использованием ряда антигенов, в том числе белка TCI, смеси рекомбинантных белков Gag и Env, а также лизата вируса ВИЧ-1 (рис. 5). Полученные результаты позволяют сделать следующие выводы:

1) При ДНК-иммунизации мышей происходит наработка специфических антител, которые связываются как с белком TCI, так и с нативными (рекомби-нантными) белками (Env, Gag) и лизатом ВИЧ-1.

2) Титры антител ко всем антигенам увеличивались, начиная с 7-10 дня после иммунизации, и достигали максимальных значений к концу периода наблюдений (48-55 сутки).

У двукратно иммунизированных животных титры антител были примерно в два раза выше, чем у однократно иммунизированных животных.

Очевидно, что эффективная вакцина кроме CD8+ CTL- и В-клеточных эпи-топов должна также содержать CD4+ Т-хелперные эпитопы, которые, как известно, усиливают ответ В-клеток и цитотоксических Т-лимфоцитов. Как уже отмечалось, TCI иммуноген спланирован таким образом, что он включает CD4+ Т-хелперные эпитопы. Однако для индукции Т-хелперных ответов необходимо, чтобы TCI иммуноген представлялся CD4+ Т-хелперным клеткам молекулами МНС II класса. Для этого белок TCI содержит на СООН-конце последовательность типа Tyr-X-X-hydrophobic residue, а именно Tyr-Lys-Leu-Val (рис. 2) , которая согласно [Guarrtieri et al., 1993] может отвечать за нацеливание белка TCI на лизосому, а, следовательно, будет увеличивать презетнацию образующихся Т-хелперных эпитопов молекулами МНС II класса, вызывая более сильные ответы как В-, так и CD8+ Т-лимфоцитов, опосредуемые CD4+ клетками.

Таким образом, белок TCI, экспрессируемый в клетках в составе плазмиды pcDNA-TCI выполняет двойную функцию: 1) индуцирует специфические ответы CD8+ CTL и В-лимфоцитов и 2) выступает как адьювант, вызывая CD4-опосредованное усиление иммунного ответа.

3000

2500

с

2000

b

X

1500

е-

н 1000

500

Jj

Дни после иммунизации

□ pcDNA-TCI (20)* HPCDNA-TCI (20)" BpcDNA-TCI (100)* ирсОЫА-ТС! (100)'

Дни после иммунизации □ pcDNA-TCI (20)* ■pcDNA-TCI (20)" «pcONA-TCI (100)* ИрсОЫА-ТС! (100)*

3 1500 -

е-

Дни после иммунизации □ pcDNA-TCI (20)* EJpcDNA-TCI (20)** MpcDNA-TCI (100)* ирсОМА-ТС! (100)**

Рис. 5. Титры специфических антител IgG в группах животных, иммунизированных плазмидой ДНК pcDNA-TCI

А, ИФА с белком TCI; В, ИФА со смесью рекомбинантных белков Gag и Env; С, ИФА с лизатом ВИЧ-1.

pcDNA-TCI (20)* - Однократная иммунизация, доза 20 мкг;

pcDNA-TCI (20)** - Двукратная (prime-boost) иммунизация, доза 20 мкг + 50

мкг;

pcDNA-TCI (100)* - Однократная иммунизация, доза 100 мкг;

pcDNA-TCI (100)**- Двукратная (prime-boost) иммунизация, доза 100 мкг+50

мкг.

выводы

1) Проведен дизайн полиэпитопного Т-клеточного иммуногена (TCI), представляющего собой последовательность фрагментов белков Gag, Env, Pol и Nef ВИЧ-1. Иммуноген включает в себя 392 а.о. и содержит более восьмидесяти перекрывающихся эпитопов CD8+ CTL и CD4+ Th, ограниченных аллелями HLAI и II классов.

2) Синтезирован искусственный ген TCI длиной 1176 пар оснований. Для получения целевого гена разработан блочный способ его сборки. Получение генетической конструкции осуществляли комбинированием матричного и безматричного синтеза ДНК методом ПЦР.

3) Доказано, что целевой ген обеспечивает синтез белка TCI как в про-, так и эукариотической системах. С помощью ИФА и иммуноблота подтверждены антигенные свойства белка TCI. Присутствие выбранных фрагментов и эпитопов белков ВИЧ-1 в структуре TCI продемонстрировано с использованием ВИЧ-1-положительных сывороток и моноклональных антител к белку р24.

4) Получена кандидатная ДНК-вакцинная конструкция, кодирующая полиэпи-топный иммуноген TCI в составе плазмиды pcDNA-TCI. Показано, что однократная иммунизация животных плазмидой pcDNA-TCI индуцирует дозо-зависимые специфические ответы как CTL, так и антител. Повторная иммунизация животных приводит к выраженному увеличению Т- и В-клеточных ответов. Показано, что специфические антитела связываются как с белком TCI, так и с белками ВИЧ-1, а спленоциты иммунизированных животных индуцируют CTL ответ при стимуляции как полноразмерным белком TCI, так и его отдельными эпитопами.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Ильичев A.A., Карпенко Л.И., Некрасова H.A., Лебедев Л.Р., Игнатьев Г.М., Агафонов А.П., Белавин П.А,, Серегин С.С., Данилюк Н.К., Бажан С.И. Использование различных систем доставки ВИЧ-1 ДНК-вакцины, кодирующей поли-ЦТЛ -эпитопный иммуноген //Вестник РАМН. - 2005. - №1. - С. 41-44.

2. Bazhan S.I., Belavin P.A., Seregin S.V., Danilyuk N.K., Babkina I.N., Karpenko L.I., Nekrasova N.A., Lebedev L.R., Ignatyev G.M., Agafonov A.P., Poryvaeva V.A., Aborneva I.V., Ilyichev A.A. Designing and engineering of DNA-vaccine construction encoding multiple CTL epitopes of major HIV-l antigens. Vaccine, 2004, V. 22, P. 1672-1682.

3. Бажан С.И., Белавин П.А., Серегин C.B., Данилюк Н.К., Бабкина И.Н., Карпенко Л.И., Некрасова H.A., Лебедев Л.Р., Агафонов А.П., Игнатьев Г.М., Ильичев A.A., академик РАН Сандахчиев Л.С. Конструирование искусственного иммуногена, кандидата ДНК-вакцины, кодирующей множественные CTL-эпитопы ВИЧ-1. Доклады Академии наук, 2004, Т. 395, №6, С. 108-110.

4. Бажан С.И., Белавин П.А., Серегин C.B., Бабкина И.Н., Данилюк Н.К., Сандахчиев Л.С. Искусственный белок-иммуноген TCI, содержащий множественные CTL-эпитопы основных антигенов ВИЧ-1, искусственный ген TCI, кодирующий полиэпитопный белок-иммуноген TCI. Приоритет от 22.04.02г. Заявка №2002110800. Патент РФ №2238946, выданный 27.10.04 г.

5. Карпенко Л.И., Бажан С.И., Некрасова H.A., Белавин П.А., Данилюк Н.К., Серегин C.B., Бабкина И.Н., Игнатьев Г.М., Агафонов А.П., Бойченко М.Н., Воробьев A.A., Ильичев A.A., Сандахчиев Л.С. Рекомбинантная плазмидная ДНК pcDNA-TCI, обеспечивающая экспрессию искусственного гена TCI в клетках эукариот, и рекомбинантный аттенуированный штамм бактерий Salmonella enteritidis E-23/pcDNA-TCI как кандидат для конструирования живой ДНК-вакцины против вируса иммунодефицита человека. // Приоритет от 17.04.03 г. №2003111095. Решение о выдаче патента от 28.09.04 г.

Подписано к печати 21 ноября 2006 г.

Тираж 100 экз. Заказ № 1926. Отпечатано "Документ-Сервис", 630090, Новосибирск, Институтская 4/1, тел. 335-66-00

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Белавин, Павел Александрович

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Молекулярная биология ВИЧ-1-----------------------------------------.

1.2. Проблемы создания вакцины против ВИЧ-1

1.2.1. Антигенная изменчивость ВИЧ-1 -.-.

1.2.2. Проблемы тестирования вакцин

1.2.3. Значение иммунных механизмов в защите от ВИЧ-инфекции

1.2.4. Механизмы иммуносупрессии и имуннопатологии при ВИЧ-инфекции —

1.3. Традиционные стратегии вакцинации.

1.3.1. Стратегии вакцинации, основанные на использовании аттенуированного вируса .-.—

1.3.2. Стратегии вакцинации, основанные на использовании инактивированного вируса

1.3.3. Стратегии вакцинации, основанные на использовании рекомбинантных вирусных белков -.

1.4. Новые нетрадиционные стратегии вакцинации, основанные на использовании синтетических полиэпитопных иммуногенов.

1.4.1. Системы доставки вакцинных конструкций на основе использования плазмидной ДНК.

1.4.2. Системы доставки вакцинных конструкций на основе использования живых рекомбинантных векторов

1.4.3. Дизайн полиэпитопных иммуногенов

1.4.4. Синтез генов, кодирующих полиэпитопные иммуногены

1.5. Вакцинный иммунитет и клиническое заболевание

1.6. Биологическое тестирование CTL-вакцин

1.6.1. Тестирование иммуногенности вакцин

Введение Диссертация по биологии, на тему "Дизайн, конструирование и изучение свойств поли-CTL-эпитопного Т-клеточного иммуногена - кандидата ДНК-вакцины против ВИЧ-1/СПИД"

Актуальность проблемы

Синдром приобретенного иммунодефицита (СПИД) и его возбудитель, вирус ВИЧ-1, были открыты более 20 лет назад, и сейчас это заболевание продолжает распространяться по всему миру, охватывая как развитые, так и в развивающиеся страны. По данным ВОЗ общее количество заболевших в мире достигло уже более чем 40 млн. человек. Из них только в 2005 году около 5 млн. человек стали вновь инфицированными (http://www.unaids.org). Более 25 млн. человек уже умерли от СПИДа.

Наиболее эффективным средством предотвращения и даже искоренения многих вирусных инфекций являются вакцины, как это было продемонстрировано с вирусами оспы, полиомиелита, желтой лихорадки и кори. Несмотря на значительные усилия и инвестиции всего мирового сообщества, в случае ВИЧ-1 инфекции эффективной профилактической или терапевтической вакцины пока создать не удалось. Разработка безопасной и эффективной анти-ВИЧ/СПИД вакцины затруднена из-за ряда факторов, среди которых высокая генетическая вариабильность ВИЧ-1, недостаток знаний иммунных механизмов защиты, отсутствие релевантных и предсказуемых моделей и сложность проведения эффективных испытаний, особенно в развивающихся странах.

Известные стратегии создания вакцины против ВИЧ-1 основаны на использовании различных форм вирусного антигена, включая инактивированный вирус, модифицированный вирус, аттенуированный живой вирус, нативные белки, генноинженерные пептиды, а также рекомбинантные бактерии, вирусы и плазмидные ДНК [1]. Каждая из этих стратегий была опробована, однако проблемы создания анти-ВИЧ-1-вакцины до сих пор не решены. Традиционные подходы создания вакцин, основанные на использовании аттенуированного или инактивированного вируса, в случае ВИЧ-1 вообще не рассматриваются, так как в настоящее время не ясно, как получить безопасный аттенуированный вирус, а в случае убитого патогена всегда остается вероятность контаминации препарата вирусной нуклеиновой кислотой. Кроме того, использование цельновирионной вакцины или вакцины на основе отдельных белков вируса нежелательно из-за того, что отдельные фрагменты ВИЧ-1 могут подавлять иммунную систему хозяина. Уже идентифицированы пептиды ВИЧ-1, которые стимулируют антител-зависимое усиление инфекции, вызывая развитие иммунопатологии, приводят к возрастанию количества супрессорных клеток и ингибируют протективный ответ, перекрестно реагируют с белками клеток хозяина и являются потенциальными онкогенами [2].

Хотя точно не известно, какой тип иммунного ответа коррелирует с защитой от ВИЧ-1 у человека, тем не менее, многочисленные прямые доказательства, полученные в исследованиях на животных, и косвенные данные, полученные у людей, предполагают, что в контроле ВИЧ-1 инфекции у людей и SIV инфекции у macaques важную роль должны играть как клеточные, так и гуморальные механизмы защиты, включая CD4+ и CD8+ Т клетки, освобождаемые ими цитокины и хемокины, а также антитела с широким спектром нейтрализующей активности [3-7].

Несмотря на то, что в последнее время разрабатываются новые обещающие подходы, нацеленные на индукцию нейтрализующих антител [8], акцент многих исследователей сместился в сторону индукции клеточного иммунитета [9-13], так как появились убедительные доказательства, что ответы цитотоксических Т-лимфоцитов (CD8+ CTL), ассоциированные с ВИЧ-инфекцией, являются важными медиаторами противовирусного иммунитета и, следовательно, ВИЧ-специфические CTL могут быть важным компонентом эффективной вакцины против ВИЧ-1 [14,15]. В пользу этого свидетельствуют данные о том, что в плазме ВИЧ инфицированных индивидуумов обнаружена достоверная обратная корреляция между частотой ВИЧ специфических CTL и количеством вирусной РНК [4]. Предполагается, что CTL могут защищать от ВИЧ-инфекции, так как CTL убивали ВИЧ-инфицированные клетки до того, как они нарабатывали новые вирионы [7], и, кроме того, CTL освобождали хемокины, которые ингибировали ВИЧ-инфекцию [5,6].

Учитывая стремительное распространение эпидемии СПИДа во всем мире, задача создания вакцины против ВИЧ-инфекции имеет чрезвычайно актуальное значение и требует создания новых подходов к разработке эффективных анти-ВИЧ вакцин и систем их доставки. Один из наиболее обещающих подходов связан с идентификацией Т- и В клеточных эпитопов в белках вируса и созданием на их основе синтетических полиэпитопных вакцин [10,16-20]. Такие вакцины будут свободны от многих недостатков, свойственных вакцинам на основе живого аттенуированного или целого инактивированного патогена, а так же на основе отдельных вирусных белков.

Цель исследования

Целью данной работы явилось конструирование искусственного поли-СТЬ-эпитопного Т-клеточного иммуногена (TCI), кандидата для использования в качестве эффективной и безопасной ДНК-вакцины против ВИЧ-1.

Задачи исследования

В ходе выполнения данной работы решались следующие задачи:

1) Проектирование поли-СТЬ-эпитопного иммуногена;

2) Синтез гена, кодирующего целевой белок;

3) Получение рекомбинантных плазмид для экспрессии целевого гена как в прокариотической, так и в эукариотической системах;

4) Доказательство антигенной специфичности и иммуногенности продуктов экспрессии целевого гена в составе рекомбинантных плазмид.

Практическая значимость работы

Сконструированная в данной работе рекомбинантная плазмида pcDNA-TCI является ДНК-вакцинным компонентом двух созданных во ФГУН ГНЦ ВБ «Вектор» кандидатных вакцин против ВИЧ/СПИД «Сал-ВИЧ Д» и «КомбиВИЧвак». В настоящее время проведены доклинические испытания кандидатных вакцин «КомбиВИЧвак» и «Сал-ВИЧ Д». Показано, что обе вакцины индуцируют формирование ВИЧ-специфического гуморального и клеточного ответов и не оказывают негативного воздействия на функцию основных физиологических систем организма. Полученные при иммунизации животных сыворотки обладали вируснейтрализующей активностью in vitro. В Министерстве здравоохранения и социального развития РФ и ФГУ НЦ ЭСМП проведена предрегистрационная экспертиза комплекта разработанных документов на вакцины «КомбиВИЧвак» и «САЛ-ВИЧ Д», экспертиза наименования МИБП и их лекарственной формы выпуска. В настоящее время в ГИСК им. Л.А. Тарасевича проводится экспертиза представленных документов на две кандидатные вакцины, экспертиза результатов их доклинического исследования, экспертиза качества серий вакцин и оценка воспроизводимости методик.

Публикации

1. Ильичев А.А., Карпенко Л.И., Некрасова Н.А., Лебедев Л.Р., Игнатьев Г.М., Агафонов А.П., Белавин П.А., Серегин С.С., Данилюк Н.К, Бажан С.И. Использование различных систем доставки ВИЧ-1 ДНК-вакцины, кодирующей поли-CTL -эпитопный иммуноген //Вестник РАМН. - 2005. - №1. - С. 41-44.

2. Bazhan S.I., Belavin Р.А., Seregin S.V., Danilyuk N.K., Babkina I.N., Karpenko L.I., Nekrasova N.A., Lebedev L.R., Ignatyev G.M., Agafonov A.P., Poryvaeva V.A., Aborneva I.V., Ilyichev A.A. Designing and engineering of DNA-vaccine construction encoding multiple CTL epitopes of major HIV-1 antigens. Vaccine, 2004, V. 22, P. 16721682.

3. Бажан С.И., Белавин П.А., Серегин C.B., Данилюк Н.К., Бабкина И.Н., Карпенко Л.И., Некрасова Н.А., Лебедев Л.Р., Агафонов А.П., Игнатьев Г.М., Ильичев А.А., академик РАН Сандахчиев Л. С. Конструирование искусственного иммуногена, кандидата ДНК-вакцины, кодирующей множественные CTL-эпитопы ВИЧ-1. Доклады Академии наук, 2004, Т. 395, №6, С. 108-110.

4. Бажан С.И., Белавин П.А., Серегин С.В., Бабкина И.Н., Данилюк Н.К., Сандахчиев Л.С. Искусственный белок-иммуноген TCI, содержащий множественные CTL-эпитопы основных антигенов ВИЧ-1, искусственный ген TCI, кодирующий полиэпитопный белок-иммуноген TCI. Приоритет от 22.04.02г. Заявка №2002110800. Патент РФ №2238946, выданный 27.10.04 г.

5. Карпенко Л.И., Бажан С.И., Некрасова Н.А., Белавин П.А., Данилюк Н.К., Серегин С.В., Бабкина И.Н., Игнатьев Г.М., Агафонов А.П., Бойченко М.Н., Воробьев А.А., Ильичев А.А., Сандахчиев Л.С. Рекомбинантная плазмидная ДНК pcDNA-TCI, обеспечивающая экспрессию искусственного гена TCI в клетках эукариот, и рекомбинантный аттенуированный штамм бактерий Salmonella enteritidis Е-23/pcDNA-TCI как кандидат для конструирования живой ДНК-вакцины против вируса иммунодефицита человека. // Приоритет от 17.04.03 г. №2003111095. Решение о выдаче патента от 28.09.04 г.

Апробация работы

Результаты работы были представлены на следующих научных конференциях: о Basic Science for Biotechnology and Medicine, Novosibirsk, Russia, September 3-7, 2006 о XVI International AIDS Conference, Toronto Canada, 13-18 August 2006 о International conference " Biotechnology and medicine ", Moscow, 14-17 March 2006 о First Russian-German Workshop on Infection and Immunity, Berlin, Germany, 7 September 2005 о UK/Russian Seminar on Biothechnology: Policy Issues, International Partnerships & Commertial Opportunitis". At the Crown Plaza Hotel, the Royal Mile, Edinburg, 1621 October 2001 о XIth Symposium on HIV Infection, Toulon, June 14-16, 2001 о The Increasing Threat of Infectious Diseases'01, Bergendal, Sollentuna, Sweden, June 11-13,2001 о 5th International Conference on Molecular Biology, Moscow, June 21-26, 2001 о IV-th ISTC Scientific Advisory Committee Seminar on Basic Science in ISTC

Activities, Novosibirsk, 23-27 April, 2001 о 7-я Международная Конференция "СПИД, РАК И РОДСТВЕННЫЕ

ПРОБЛЕМЫ", Санкт Петербург, 24-28 мая 1998 о 8-я Международная Конференция "СПИД, РАК И РОДСТВЕННЫЕ

ПРОБЛЕМЫ", Санкт Петербург, 19-24 мая 2000 о Международная конференция "Оценка спонсируемых биологических исследований в России в новом тысячилетии", Новосибирск, ГНЦ ВБ "Вектор", 2-4 сентября 1999.

Заключение Диссертация по теме "Молекулярная биология", Белавин, Павел Александрович

ВЫВОДЫ

1) Проведен дизайн полиэпитопного Т-клеточного иммуногена (TCI), представляющего собой последовательность фрагментов белков Gag, Env, Pol и Nef ВИЧ-1. Иммуноген включает в себя 392 а.о. и содержит более восьмидесяти перекрывающихся эпитопов CD 8+ CTL и CD4+ Th, ограниченных аллелями HLAI и II классов.

2) Синтезирован искусственный ген TCI длиной 1176 пар оснований. Для получения целевого гена разработан блочный способ его сборки. Получение генетической конструкции осуществляли комбинированием матричного и безматричного синтеза ДНК методом ПЦР.

3) Доказано, что целевой ген обеспечивает синтез белка TCI как в про-, так и эукариотической системах. С помощью ИФА и иммуноблота подтверждены антигенные свойства белка TCI. Присутствие выбранных фрагментов и эпитопов белков ВИЧ-1 в структуре TCI продемонстрировано с использованием ВИЧ-1-положительных сывороток и моноклональных антител к белку р24.

4) Получена кандидатная ДНК-вакцинная конструкция, кодирующая полиэпитопный иммуноген TCI в составе плазмиды pcDNA-TCI. Показано, что однократная иммунизация животных плазмидой pcDNA-TCI индуцирует дозозависимые специфические ответы как CTL, так и антител. Повторная иммунизация животных приводит к выраженному увеличению Т- и В-клеточных ответов. Показано, что специфические антитела связываются как с белком TCI, так и с белками ВИЧ-1, а спленоциты иммунизированных животных индуцируют CTL ответ при стимуляции как полноразмерным белком TCI, так и его отдельными эпитопами.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Белавин, Павел Александрович, Кольцово

1. Berzofsky J.A., Ahlers J.D., Belyakov I.M. Strategies for designing and optimizing newgeneration vaccines //Nat. Rev. Immunol. 2001. V. 1. No. 3. P. 209-219.

2. Letvin N.L. Progress in the development of an HIV-1 vaccine // Science. 1998. V. 280. No.5371. P.1875-1880.

3. Berzofsky J.A., Ahlers J.D., Janik J., Morris J., Oh S,, Terabe M., Belyakov I.M. Progress onnew vaccine strategies against chronic viral infections // J. Clin. Invest. 2004. V. 114. No. 4. P. 450-462.

4. Ogg G.S., Jin X., Bonhoeffer S, Dunbar P.R., Nowak M.A., Monard S., Segal J.P., Cao Y.,

5. Rowland-Jones S.L., Cerundolo V., Hurley A., Markowitz M., Ho D.D., Nixon D.F., McMichael A.J. Quantitation of HIV-1-specific cytotoxic T lymphocytes and plasma load of viral RNA // Science. 1998. V. 279. No. 5359. P. 2103-2106.

6. Price D.A., Sewell A.K., Dong Т., Tan R., Goulder P.J., Rowland-Jones S.L., Phillips R.E.

7. Antigen-specific release of beta-chemokines by anti-HIV-1 cytotoxic T lymphocytes // Curr. Biol. 1998. V. 8. No. 6. P. 355-358.

8. Wagner L., Yang O.O., Garcia-Zepeda E.A., Ge Y., Kalams S.A., Walker B.D., Pasternack

9. M.S., Luster A.D. Beta-chemokines are released from HIV-1-specific cytolytic T-cell granules complexed to proteoglycans //Nature. 1998. V. 391. No. 6670. P. 908-911.

10. Binley J.M., Sanders R.W., Clas В., Schuelke N., Master A., Guo Y., Kajumo F., Anselma D.J.,

11. Hanke Т., Blanchard T.J., Schneider J., Ogg G.S., Tan R., Becker M., Gilbert S.C., Hill A.V.,

12. Smith G.L., McMichael A. Immunogenicities of intravenous and intramuscular administrations of modified vaccinia virus Ankara-based multi-CTL epitope vaccine for human immunodeficiency virus type 1 in mice // J. Gen. Virol. 1998. V. 79 (Pt 1). P. 83-90.

13. Напке Т., Schneider J, Gilbert S.C., Hill A.V., McMichael A. DNA multi-CTL epitopevaccines for HIV and Plasmodium falciparum: immunogenicity in mice // Vaccine. 1998. V. 16. No. 4. P. 426-435.

14. Напке Т., Blanchard T.J., Schneider J., Hannan C.M., Becker M., Gilbert S.C., Hill A.V.,

15. Smith G.L., McMichael A. Enhancement of MHC class I-restricted peptide-specific T cell induction by a DNA prime/MVA boost vaccination regime // Vaccine. 1998. V. 16. No. 5. P. 439-445.

16. Thomson S.A., Khanna R., Gardner J., Burrows S.R., Coupar В., Moss D.J., Suhrbier A.

17. Minimal epitopes expressed in a recombinant polyepitope protein are processed and presented to CD8+ cytotoxic T cells: implications for vaccine design // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1995. V. 92. No. 13. P. 5845-5849.

18. Thomson S.A., Elliott S.L., Sherritt M.A., Sproat K.W., Coupar B.E., Scalzo A.A., Forbes

19. C.A., Ladhams A.M., Mo X.Y., Tripp R.A., Doherty P.C., Moss D.J., Suhrbier A. Recombinant polyepitope vaccines for the delivery of multiple CD8 cytotoxic T cell epitopes // J. Immunol. 1996. V. 157. No. 2. P. 822-826.

20. Letvin N.L. Progress in the development of an HIV-1 vaccine // Science. 1998. V. 280. No.5371. P.1875-1880.

21. Rowland-Jones S., Sutton J., Ariyoshi K., Dong Т., Gotch F., McAdam S., Whitby D., Sabally

22. S., Gallimore A., Corrah Т.,. HIV-specific cytotoxic T-cells in HIV-exposed but uninfected Gambian women//Nat. Med. 1995. V. 1. No. 1. P. 59-64.

23. Firat H., Tourdot S., Ureta-Vidal A., Scardino A., Suhrbier A., Buseyne F., Riviere Y., Danos

24. Karpenko L.I., Nekrasova N.A., Ilyichev A.A., Lebedev L.R., Ignatyev G.M., Agafonov A.P.,

25. Zaitsev B.N., Belavin P.A., Seregin S.V., Danilyuk N.K., Babkina I.N., Bazhan S.I.

26. Comparative analysis using a mouse model of the immunogenicity of artificial VLP and attenuated Salmonella strain carrying a DNA-vaccine encoding HTV-1 polyepitope CTL-immunogen//Vaccine. 2004. V. 22. No. 13-14. P. 1692-1699.

27. Woodberry Т., Gardner J., Mateo L., Eisen D., Medveczky J., Ramshaw I.A., Thomson S.A.,

28. Ffrench R.A., Elliott S.L., Firat H., Lemonnier F.A., Suhrbier A. Immunogenicity of a human immunodeficiency virus (HIV) polytope vaccine containing multiple HLA A2 HIV CD8(+) cytotoxic T-cell epitopes // J. Virol. 1999. V. 73. No. 7. P. 5320-5325.

29. Barre-Sinoussi F., Chermann J.C., Rey F., Nugeyre M.T., Chamaret S., Gruest J., Dauguet C.,

30. Axler-Blin C., Vezinet-Brun F., Rouzioux C., Rozenbaum W., Montagnier L. Isolation of a T-lymphotropic retrovirus from a patient at risk for acquired immune deficiency syndrome (AIDS) // Science. 1983. V. 220. No. 4599. P. 868-871.

31. Levy J.A., Shimabukuro J. Recovery of AIDS-associated retroviruses from patients with AIDSor AIDS-related conditions and from clinically healthy individuals // J. Infect. Dis. 1985. V. 152. No. 4. P. 734-738.

32. Oroszlan S., Luftig R.B. Retroviral proteinases // Curr. Top. Microbiol. Immunol. 1990. V.157. P.153-185.

33. Electronic Citation.Warner C.Greene, B.Matija Peterlin. AnonymousHIV InSite Knowledge Base Chapter. 2005. // center for HIV information. Anonymous

34. Хаитов P.M., Игнатьева Г.А. СПИД. М.:Медицина, 1992.

35. Bryant М., Ratner L. Myristoylation-dependent replication and assembly of humanimmunodeficiency virus 1 // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1990. V. 87. No. 2. P. 523-527.

36. Gottlinger H.G., Sodroski J.G., Haseltine W.A. Role of capsid precursor processing and myristoylation in morphogenesis and infectivity of human immunodeficiency virus type 1 // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1989. V. 86. No. 15. P. 5781-5785.

37. Jacks Т., Power M.D., Masiarz F.R., Luciw P.A., Barr P.J., Varmus H.E. Characterization of ribosomal frameshifting in HIV-1 gag-pol expression //Nature. 1988. V. 331. No. 6153. P. 280-283.

38. Parkin N.T., Chamorro M., Varmus H.E. Human immunodeficiency virus type 1 gag-polframeshifting is dependent on downstream mRNA secondary structure: demonstration by expression in vivo // J. Virol. 1992. V. 66. No. 8. P. 5147-5151.

39. Miller M., Jaskolski M., Rao J.K., Leis J., Wlodawer A. Crystal structure of a retroviralprotease proves relationship to aspartic protease family //Nature. 1989. V. 337. No. 6207. P. 576-579.

40. Bushman F.D., Fujiwara Т., Craigie R. Retroviral DNA integration directed by HIVintegration protein in vitro // Science. 1990. V. 249. No. 4976. P. 1555-1558.

41. Bernstein H.B., Tucker S.P., Kar S.R, McPherson S.A., McPherson D.T., Dubay J.W.,1.bowitz J., Compans R.W., Hunter E. Oligomerization of the hydrophobic heptad repeat of gp41 // J. Virol. 1995. V. 69. No. 5. P. 2745-2750.

42. Kim S.Y., Byrn R., Groopman J., Baltimore D. Temporal aspects of DNA and RNA synthesisduring human immunodeficiency virus infection: evidence for differential gene expression // J. Virol. 1989. V. 63. No. 9. P. 3708-3713.

43. Heinzinger N.K., Bukinsky M.I., Haggerty S.A., Ragland A.M., Kewalramani V., Lee M.A.,

44. Schubert U., Bour S., Ferrer-Montiel A.V., Montal M., Maldarell F., Strebel K. The two biological activities of human immunodeficiency virus type 1 Vpu protein involve two separable structural domains // J. Virol. 1996. V. 70. No. 2. P. 809-819.

45. Strebel K, Daugherty D, Clouse K, Cohen D., Folks Т., Martin M.A. The HIV 'A' (sor) gene product is essential for virus infectivity // Nature. 1987. V. 328. No. 6132. P. 728-730.

46. Malim M.H., Emerman M. HIV-1 sequence variation: drift, shift, and attenuation // Cell. 2001.

47. V. 104. No. 4. P. 469-472.

48. Louwagie J., McCutchan F.E., Peeters M., Brennan T.P., Sanders-Buell E., Eddy G.A., van der

49. G.G., Fransen K., Gershy-Damet G.M., Deleys R.,. Phylogenetic analysis of gag genes from 70 international HIV-1 isolates provides evidence for multiple genotypes // AIDS. 1993. V. 7. No. 6. P. 769-780.

50. Descamps D., Collin G., Letourneur F., Apetrei C., Damond F., Loussert-Ajaka I., Simon F.,

51. Saragosti S., Brun-VezinetF. Susceptibility of human immunodeficiency virus type 1 group О isolates to antiretroviral agents: in vitro phenotypic and genotypic analyses // J. Virol. 1997. V.71.No. 11. P. 8893-8898.

52. Osmanov S., Pattou C., Walker N., Schwardlander В., Esparza J. Estimated global distributionand regional spread of HIV-1 genetic subtypes in the year 2000 // J. Acquir. Immune. Defic. Syndr. 2002. V. 29. No. 2. P. 184-190.

53. Osmanov S., Pattou C., Walker N., Schwardlander В., Esparza J. Estimated global distributionand regional spread of HIV-1 genetic subtypes in the year 2000 // J. Acquir. Immune. Defic. Syndr. 2002. V. 29. No. 2. P. 184-190.

54. Osmanov S., Pattou C., Walker N., Schwardlander В., Esparza J. Estimated global distributionand regional spread of HIV-1 genetic subtypes in the year 2000 // J. Acquir. Immune. Defic. Syndr. 2002. V. 29. No. 2. P. 184-190.

55. Gao F., Robertson D.L., Morrison S.G., Hui H., Craig S., Decker J., Fultz P.N., Girard M.,

56. Shaw G.M., Hahn B.H., Sharp P.M. The heterosexual human immunodeficiency virus type 1epidemic in Thailand is caused by an intersubtype (A/E) recombinant of African origin // J. Virol. 1996. V. 70. No. 10. P. 7013-7029.

57. Carr J.K., Salminen M.O., Albert J., Sanders-Buell E., Gotte D., Birx D.L., McCutchan F.E. Full genome sequences of human immunodeficiency virus type 1 subtypes G and A/G intersubtype recombinants//Virology. 1998. V. 247. No. 1. P. 22-31.

58. Liitsola K., Tashkinova I., Laukkanen Т., Korovina G., Smolskaja Т., Momot O.,

59. Paraskevis D., Magiorkinis E., Magiorkinis G., Anastassopoulou C., Lazanas M., Chrysos G.,

60. Laukkanen Т., Carr J.K., Janssens W., Liitsola K., Gotte D., McCutchan F.E., Op d.C.,

61. Cornelissen M., Heyndrickx L., van der G.G., Salminen M.O. Virtually full-length subtype F and F/D recombinant HIV-1 from Africa and South America // Virology. 2000. V. 269. No. 1. P. 95-104.

62. Hirsch V.M., Johnson P.R. Pathogenic diversity of simian immunodeficiency viruses // Virus

63. Res. 1994. V. 32. No. 2. P. 183-203.

64. Bailes E., Gao F., Bibollet-Ruche F., Courgnaud V., Peeters M., Marx P.A., Hahn B.H., Sharp

65. P.M. Hybrid origin of SIV in chimpanzees // Science. 2003. V. 300. No. 5626. P. 1713

66. Letvin N.L., King N.W. Immunologic and pathologic manifestations of the infection of rhesusmonkeys with simian immunodeficiency virus of macaques // J. Acquir. Immune. Defic. Syndr. 1990. V. 3. No. 11. P. 1023-1040.

67. Mascola J.R. Defining the protective antibody response for HIV-1 // Curr. Mol. Med. 2003. V.3. No. 3. P. 209-216.

68. Mascola J.R., Lewis M.G., Stiegler G., Harris D., VanCott T.C., Hayes D., Louder M.K.,

69. Montefiori DC. HIV-1 specific neutralizing antibodies // In: Retroviral Immunology / Eds. G

70. Pantaleo, В Walker. Totowa, N1: Humana, 2001. P. 191-211.

71. Reitter I.N., Means R.E., Desrosiers R.C. A role for carbohydrates in immune evasion in AIDS

72. Nat. Med. 1998. V. 4. No. 6. P. 679-684.

73. Chan D.C., Fass D., Berger J.M., Kim P.S. Core structure of gp41 from the HIV envelopeglycoprotein// Cell. 1997. V. 89. No. 2. P. 263-273.

74. Parren P.W., Burton D.R. The antiviral activity of antibodies in vitro and in vivo // Adv.1.munol. 2001. V. 77. P. 195-262.

75. Cocchi F., DeVico A.L., Garzino-Demo A., Arya S.K., Gallo R.C., Lusso P. Identification of RANTES, MIP-1 alpha, and MIP-1 beta as the major HIV-suppressive factors produced by CD8+ T cells // Science. 1995. V. 270. No. 5243. P. 1811-1815.

76. Walker C.M., Moody D.J., Stites D.P., Levy J.A. CD8+ lymphocytes can control HIVinfection in vitro by suppressing virus replication // Science. 1986. V. 234. No. 4783. P. 15631566.

77. Koup R.A., Safrit J.T., Cao Y., Andrews C.A., McLeod G., Borkowsky W., Farthing С., Ho

78. D.D. Temporal association of cellular immune responses with the initial control of viremia in primary human immunodeficiency virus type 1 syndrome // J. Virol. 1994. V. 68. No. 7. P. 4650-4655.

79. Richman D.D., Wrin Т., Little S.J., Petropoulos C.J. Rapid evolution of the neutralizingantibody response to HIV type 1 infection // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2003. V. 100. No. 7. P. 4144-4149.

80. Wei X., Decker J.M., Wang S., Hui H., Kappes J.C., Wu X., Salazar-Gonzalez J.F., Salazar

81. M.G., Kilby J.M., Saag M.S., Komarova N.L., Nowak M.A., Hahn B.H., Kwong P.D., Shaw G.M. Antibody neutralization and escape by HIV-1 // Nature. 2003. V. 422. No. 6929. P. 307312.

82. Berkower I., Murphy D., Smith C.C., Smith G.E. A predominant group-specific neutralizingepitope of human immunodeficiency virus type 1 maps to residues 342 to 511 of the envelope glycoprotein gpl20// J. Virol. 1991. V. 65. No. 11. P. 5983-5990.

83. Dalgleish A.G., Chanh T.C., Kennedy R.C., Kanda P, Clapham P.R., Weiss R.A. Neutralization of diverse HIV-1 strains by monoclonal antibodies raised against a gp41 synthetic peptide // Virology. 1988. V. 165. No. 1. P. 209-215.

84. Ho D.D., Sarngadharan M.G., Hirsch M.S., Schooley R.T., Rota T.R., Kennedy R.C., Chanh

85. T.C., Sato V.L. Human immunodeficiency virus neutralizing antibodies recognize severalconserved domains on the envelope glycoproteins // J. Virol. 1987. V. 61. No. 6. P. 20242028.

86. Steimer K.S., Klasse P.J., McKeating J.A. HIV-1 neutralization directed to epitopes other than linear V3 determinants // AIDS. 1991. V. 5 Suppl 2. P. S135-S143

87. Levy J.A. Pathogenesis of human immunodeficiency virus infection // Microbiol. Rev. 1993.1. V. 57. No. l.P. 183-289.

88. Levy J.A. Pathogenesis of human immunodeficiency virus infection // Microbiol. Rev. 1993.1. V. 57. No. l.P. 183-289.

89. Mosmann T.R., Coffman R.L. Heterogeneity of cytokine secretion patterns and functions ofhelper T cells // Adv. Immunol. 1989. V. 46. P. 111-147.

90. Clerici M., Shearer G.M. A TH1~>TH2 switch is a critical step in the etiology of HIV infection //Immunol. Today. 1993. V. 14. No. 3. P. 107-111.

91. Ozaki S., York-Jolley J., Kawamura H., Berzofsky J.A. Cloned protein antigen-specific, Ia-restricted T cells with both helper and cytolytic activities: mechanisms of activation and killing // Cell Immunol. 1987. V. 105. No. 2. P. 301-316.

92. Hammond S.A., Bollinger R.C., Stanhope P.E., Quinn T.C., Schwartz D., Clements M.L.,

93. Germain R.N. Immunology. The ins and outs of antigen processing and presentation // Nature.1986. V. 322. No. 6081. P. 687-689.

94. Daniel M.D., Kirchhoff F., Czajak S.C., Sehgal P.K., Desrosiers R.C. Protective effects of alive attenuated SIV vaccine with a deletion in the nef gene // Science. 1992. V. 258. No. 5090. P. 1938-1941.

95. Baba T.W., Jeong Y.S., Pennick D., Bronson R., Greene M.F., Ruprecht R.M. Pathogenicity oflive, attenuated SIV after mucosal infection of neonatal macaques // Science. 1995. V. 267. No. 5205. P. 1820-1825.

96. Murphey-Corb M., Martin L.N., Davison-Fairburn В., Montelaro R.C., Miller M., West M.,

97. Ohkawa S., Baskin G.B., Zhang J.Y., Putney S.D.,. A formalin-inactivated whole SIV vaccine confers protection in macaques // Science. 1989. V. 246. No. 4935. P. 1293-1297.

98. Karpenko L.I., Bazhan S.I., Ignat'ev G.M., Lebedev L.R., Il'ichev A.A., Sandakhchiev L.S.

99. Artificial anti-HIV immunogens and methods of their delivery. // Vestn. Ross. Akad. Med. Nauk. 2003. No. l.P. 24-30.

100. Perkus M.E., Tartaglia J., Paoletti E. Poxvirus-based vaccine candidates for cancer, AIDS, andother infectious diseases //J. Leukoc. Biol. 1995. V. 58. No. 1. P. 1-13.

101. Waine G.J., McManus D.P. Nucleic acids: vaccines of the future // Parasitol. Today. 1995. V.11. No. 3. P. 113-116.

102. Moss D.J., Schmidt C., Elliott S., Suhrbier A., Burrows S., Khanna R. Strategies involved indeveloping an effective vaccine for EBV-associated diseases // Adv. Cancer Res. 1996. V. 69. P. 213-245.

103. Couillin I., Culmann-Penciolelli В., Gomard E., Choppin J., Levy J.P., Guillet J.G., Saragosti

104. S. Impaired cytotoxic T lymphocyte recognition due to genetic variations in the mainimmunogenic region of the human immunodeficiency virus 1 NEF protein // J. Exp. Med. 1994. V. 180. No. 3. P. 1129-1134.

105. Udhayakumar V., Shi Y.P., Kumar S., Jue D.L., Wohlhueter R.M., Lai A.A. Antigenicdiversity in the circumsporozoite protein of Plasmodium falciparum abrogates cytotoxic-T-cell recognition // Infect. Immun. 1994. V. 62. No. 4. P. 1410-1413.

106. Albini A., Ferrini S., Benelli R., Sforzini S., Giunciuglio D., Aluigi M.G., Proudfoot A.E.,

107. Alouani S, Wells T.N., Mariani G., Rabin R.L., Farber J.M., Noonan D.M. HIV-1 Tat protein mimicry of chemokines // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1998. V. 95. No. 22. P. 1315313158.

108. Cantalloube H.M., Nahum C.E., Zagury J.F. Screening of protein sequences databanks by Automat for search of host sequences integration and/or autoimmune disorders induction by retroviruses//Biomed. Pharmacother. 1994. V. 48. No. 1. P. 17-26.

109. Chen Y.H., DierichM.P. A common immunological epitope existing between HIV-1 gp41 and human interferon-alpha and -beta // Immunobiology. 1998. V. 198. No. 4. P. 333-342.

110. Nakamura M.C., Nakamura R.M. Contemporary concepts of autoimmunity and autoimmune diseases // J. Clin. Lab Anal. 1992. V. 6. No. 5. P. 275-289.

111. Eroshkin A.M., Karginova E.A., Gileva I.P., Lomakin A.S., Lebedev L.R., Kamyinina T.P., Pereboev A.V., Ignat'ev G.M. Design of four-helix bundle protein as a candidate for HIV vaccine // Protein Eng. 1995. V. 8. No. 2. P. 167-173.

112. Donnelly J.J., Ulmer J.B., Shiver J.W., Liu M.A. DNA vaccines // Annu. Rev. Immunol. 1997. V. 15. P. 617-648.

113. Ramakrishna L. Anand K.K., Mohankumar K.M., Ranga U. Codon optimization of the tat antigen of human immunodeficiency virus type 1 generates strong immune responses in mice following genetic immunization // J. Virol. 2004. V. 78. No. 17. P. 9174-9189.

114. Yadava A., Ockenhouse C.F. Effect of codon optimization on expression levels of a functionally folded malaria vaccine candidate in prokaryotic and eukaryotic expression systems // Infect. Immun. 2003. V. 71. No. 9. P. 4961-4969.

115. Zhang S., Magnusson G. Kilham polyomavirus: activation of gene expression and DNA replication in mouse fibroblast cells by an enhancer substitution // J. Virol. 2001. V. 75. No. 21. P. 10015-10023.

116. Nimal S., Heath A.W., Thomas M.S. Enhancement of immune responses to an HIV gpl20 DNA vaccine by fiision to TNF alpha cDNA // Vaccine. 2006. V. 24. No. 16. P. 3298-3308.

117. Henke A., Rohland N., Zell R., Wutzler P. Co-Expression of Interleukin-2 by a Bicistronic Plasmid Increases the Efficacy of DNA Immunization to Prevent Influenza Virus Infections // Intervirology. 2006. V. 49. No. 4. P. 249-252.

118. Kasturi S.P., Sachaphibulkij К., Roy К. Covalent conjugation of polyethyleneimine on biodegradable microparticles for delivery of plasmid DNA vaccines // Biomaterials. 2005. V. 26. No. 32. P. 6375-6385.

119. Little S.R., Lynn D.M., Puram S.V., Danger R. Formulation and characterization of poly (beta amino ester) microparticles for genetic vaccine delivery // J. Control Release. 2005. V. 107. No. 3. P. 449-462.

120. Pfeifer B.A., Burdick J.A., Little S.R., Langer R. Poly(ester-anhydride):poly(beta-amino ester) micro- and nanospheres: DNA encapsulation and cellular transfection // Int. J. Pharm. 2005. V. 304. No. 1-2. P. 210-219.

121. Boyer J.D., Chattergoon M., Muthumani K., Kudchodkar S., Kim J., Bagarazzi M., Pavlakis G., Sekaly R., Weiner D.B. Next generation DNA vaccines for HIV-1 // J. Liposome Res.2002. V. 12. No. 1-2. P. 137-142.

122. Shen L, Chen Z.W, Miller M.D, Stallard V., Mazzara G.P., Panicali D.L., Letvin N.L. Recombinant virus vaccine-induced SIV-specific CD8+ cytotoxic T lymphocytes // Science. 1991. V. 252. No. 5004. P. 440-443.

123. Redfield R.R., Wright D.C., James W.D., Jones T.S., Brown C., Burke D.S. Disseminated vaccinia in a military recruit with human immunodeficiency virus (HIV) disease // N. Engl. J. Med. 1987. V. 316. No. 11. P. 673-676.

124. Shiver J.W., Emini E.A. Recent advances in the development of HIV-1 vaccines using replication-incompetent adenovirus vectors// Annu. Rev. Med. 2004. V. 55. P. 355-372.

125. Shiver J.W, Fu T.M., Chen L., Casimiro D.R., Davies M.E., Evans R.K, Zhang Z.Q., Simon

126. A.J., Trigona W.L., Dubey S.A., Huang L., Harris V.A., Long R.S., Liang X., Handt L. Replication-incompetent adenoviral vaccine vector elicits effective anti-immunodeficiency-virus immunity //Nature. 2002. V. 415. No. 6869. P. 331-335.

127. Letvin N.L., Huang Y., Chakrabarti B.K., Xu L., Seaman M.S., Beaudry K., Korioth-Schmitz

128. B., Yu F, Rohne D., Martin K.L., Miura A, Kong W.P., Yang Z.Y., Gelman R.S., Golubeva O.G. Heterologous envelope immunogens contribute to AIDS vaccine protection in rhesus monkeys // J. Virol. 2004. V. 78. No. 14. P. 7490-7497.

129. Dudek Т., Knipe D.M. Replication-defective viruses as vaccines and vaccine vectors // Virology. 2006. V. 344. No. 1. P. 230-239.

130. Goldberg A.L., Rock K.L. Proteolysis, proteasomes and antigen presentation // Nature. 1992. V. 357. No. 6377. P. 375-379.

131. Oldstone M.B. Viral persistence // Cell. 1989. V. 56. No. 4. P. 517-520.

132. Rammensee H.G., Falk K., Rotzschke О. MHC molecules as peptide receptors // Curr. Opin. Immunol. 1993. V. 5. No. 1. P. 35-44.

133. York I.A., Rock K.L. Antigen processing and presentation by the class I major histocompatibility complex//Annu. Rev. Immunol. 1996. V. 14. P. 369-396.

134. Heemels M.T., Ploegh H.L. Substrate specificity of allelic variants of the TAP peptide transporter // Immunity. 1994. V. 1. No. 9. P. 775-784.

135. Rammensee H.G., Falk K., Rotzschke O. MHC molecules as peptide receptors // Curr. Opin. Immunol. 1993. V. 5. No. 1. P. 35-44.

136. Lalvani A., Aidoo M., Allsopp C.E, Plebanski M., Whittle H.C., Hill A.V. An HLA-based approach to the design of a CTL-inducing vaccine against Plasmodium falciparum // Res. Immunol. 1994. V. 145. No. 6. P. 461-468.

137. Sidney J., Grey H.M., Kubo R.T., Sette A. Practical, biochemical and evolutionary implications of the discovery of HLA class I supermotifs // Immunol. Today. 1996. V. 17. No. 6. P. 261-266.

138. Hanke Т., McMichael A. Pre-clinical development of a multi-CTL epitope-based DNA prime MVA boost vaccine for AIDS //Immunol. Lett. 1999. V. 66. No. 1-3. P. 177-181.

139. Maksiutov A.Z., Bachinskii A.G., Bazhan S.I. Searching for local similarities between HIV-1 and human proteins. Application to vaccines. // Mol. Biol. (Mosk). 2002. V. 36. No. 3. P. 447-459.

140. Maksyutov A.Z., Bachinskii A.G., Bazhan S.I., Ryzhikov E.A., Maksyutov Z.A. Exclusion of HIV epitopes shared with human proteins is prerequisite for designing safer AIDS vaccines // J. Clin. Virol. 2004. V. 31 Suppl 1. P. S26-S38

141. Itakura K., Hirose Т., Crea R., Riggs A.D., Heyneker H.L., Bolivar F., Boyer H.W. Expression in Escherichia coli of a chemically synthesized gene for the hormone somatostatin // Science. 1977. V. 198. No. 4321. P. 1056-1063.

142. Mullis K.B. The unusual origin of the polymerase chain reaction // Sci. Am. 1990. V. 262. No. 4. P. 56-5.

143. Dillon P.J., Rosen C.A. A rapid method for the construction of synthetic genes using the polymerase chain reaction // Biotechniques. 1990. V. 9. No. 3. P. 298, 300.

144. Smith H.O., Hutchison C.A., III, Pfannkoch C., Venter J.C. Generating a synthetic genome by whole genome assembly: phiX174 bacteriophage from synthetic oligonucleotides // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2003. V. 100. No. 26. P. 15440-15445.

145. Prodromou C., Pearl L.H. Recursive PCR: a novel technique for total gene synthesis // Protein Eng. 1992. V. 5. No. 8. P. 827-829.

146. Stemmer W.P., Crameri A., Ha K.D., Brennan T.M., Heyneker H.L. Single-step assembly of a gene and entire plasmid from large numbers of oligodeoxyribonucleotides // Gene. 1995. V. 164. No. l.P. 49-53.

147. Hoover D.M., Lubkowski J. DNA Works: an automated method for designing oligonucleotides for PCR-based gene synthesis // Nucleic Acids Res. 2002. V. 30. No. 10. P. e43

148. Mandecki W., Hayden M.A., Shallcross M.A., Stotland E. A totally synthetic plasmid for general cloning, gene expression and mutagenesis in Escherichia coli // Gene. 1990. V. 94. No. l.P. 103-107.

149. Cello J., Paul A.V., Wimmer E. Chemical synthesis ofpoliovirus cDNA: generation of infectious virus in the absence of natural template // Science. 2002. V. 297. No. 5583. P. 1016-1018.

150. Hutchison C.A, Peterson S.N, Gill S.R, Cline R.T, White O, Fraser C.M, Smith H.O, Venter J.C. Global transposon mutagenesis and a minimal Mycoplasma genome // Science. 1999. V. 286. No. 5447. P. 2165-2169.

151. Walsh С. Antibiotics: Actions, Origins, Resistance. Washington, DC: Am. Soc. Microbiol., 2003.

152. Kodumal S.J., Patel K.G., Reid R., Menzella H.G., Welch M., Santi D.V. Total synthesis of long DNA sequences: synthesis of a contiguous 32-kb polyketide synthase gene cluster // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2004. V. 101. No. 44. P. 15573-15578.

153. Daniliuk N.K., Serpinskii O.I., Siniakov A.N. Design of recombinant-stable plasmids of the pFH series. // Bioorg. Khim. 1991. V. 17. No. 1. P. 81-87.

154. Sambrook J., Maniatis Т., Fritsch E.F. Molecular cloning a laboratory manual. Cold Spring Harbor, N.Y: Cold Spring Harbor Laboratory, 1989.

155. Rychlik W., Rhoads R.E. A computer program for choosing optimal oligonucleotides for filter hybridization, sequencing and in vitro amplification of DNA // Nucleic Acids Res. 1989. V. 17. No. 21. P. 8543-8551.

156. Laemmli U.K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4 //Nature. 1970. V. 227. No. 5259. P. 680-685.

157. Goldberg A.L., Rock K.L. Proteolysis, proteasomes and antigen presentation // Nature. 1992. V. 357. No. 6377. P. 375-379.

158. Oldstone M.B. Viral persistence // Cell. 1989. V. 56. No. 4. P. 517-520.

159. Rammensee H.G., Falk K., Rotzschke O. MHC molecules as peptide receptors // Curr. Opin. Immunol. 1993. V. 5. No. 1. P. 35-44.

160. York I.A., Rock K.L. Antigen processing and presentation by the class I major histocompatibility complex // Annu. Rev. Immunol. 1996. V. 14. P. 369-396.

161. Lalvani A., Aidoo M., Allsopp C.E., Plebanski M, Whittle H.C., Hill A.V. An HLA-based approach to the design of a CTL-inducing vaccine against Plasmodium falciparum // Res. Immunol. 1994. V. 145. No. 6. P. 461-468.

162. Sidney J., Grey H.M., Kubo R.T., Sette A. Practical, biochemical and evolutionary implications of the discovery of HLA class I supermotifs // Immunol. Today. 1996. V. 17. No. 6. P. 261-266.

163. Maksiutov A.Z., Bachinskii A.G., Bazhan S.I. Searching for local similarities between HIV-1 and human proteins. Application to vaccines. // Mol. Biol. (Mosk). 2002. V. 36. No. 3. P. 447-459.

164. Livingston B.D., Newman M., Crimi C., McKinney D., Chesnut R., Sette A. Optimization of epitope processing enhances immunogenicity of multiepitope DNA vaccines // Vaccine. 2001. V. 19. No. 32. P. 4652-4660.

165. Perkus M.E., Tartaglia J., Paoletti E. Poxvirus-based vaccine candidates for cancer, AIDS, and other infectious diseases // J. Leukoc. Biol. 1995. V. 58. No. 1. P. 1-13.

166. Guarnieri F.G., Arterburn L.M., Penno M.B., Cha Y., August J.T. The motif Tyr-X-X-hydrophobic residue mediates lysosomal membrane targeting of lysosome-associated membrane protein 1 // J. Biol. Chem. 1993. V. 268. No. 3. P. 1941-1946.

167. Ratner L., Haseltine W., Patarca R., Livak K.J., Starcich В., Josephs S.F., Doran E.R., Rafalski J.A., Whitehorn E.A., Baumeister K.,. Complete nucleotide sequence of the AIDS virus, HTLV-III //Nature. 1985. V. 313. No. 6000. P. 277-284.