Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Регуляторные эффекты некоторых пестицидов на уровне митохондрий и внутриклеточного кальция

ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Регуляторные эффекты некоторых пестицидов на уровне митохондрий и внутриклеточного кальция"

РГ6 од

АКАДЕМИЯ НАУК РЕСПУБЛИКИ УЗБЕКИСТАН ИНСТИТУТ ФИЗИОЛОГИИ И БИОФИЗИКИ

На правах рукописи УДК576.31¡.347; 576.32/.36; 577.115.3

МЛМАТОВЛ Зудайхо Амянджаиов/п

РЕГУЛЯТОРНЫЕ ЭФФЕКТЫ НЕКОТОРЫХ ПЕСТИЦИДОВ НА УГОВНЕ МИТОХОНДРИЙ И ВНУТРИКЛЕТОЧНОГО КАЛЬЦИЯ

<03.00.02 - биофизика)

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Ташкент -1997

Работа выполнена в лаборатории биоэнергетики Института физиологии и биофизики АН РУэ и на кафедра биофизики биолого-почвенного факультета ТашГУ им. М.Улугбека.

Научный руководитель: д.б.н., профессор А.И.Гагельганс

Официальные оппоненты: д.б.н. И.Г.Ахмеджанов

д.б.н. Р.Н.Ахмеров

Ведущая организация: Институт биохимии АН РУэ

Защита состоится » iggy г. в ^ часов на

заседании специализированного совета Д 015.01.01 по защите диссертаций на соискание ученой степени доктора наук при Институте физиологии и биофизики АН РУэ по адресу: 700095, Ташкент, уд. Ни-язова, 1.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института физиологии и биофизики АН РУэ.

Автореферат разослан ¿¿-Я-**-^/' ^ 1997 г.

Ученый секретарь

специализированного совета, д.б.н. Д.КАЛИКУЛОВ

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность теш. Митохондрии рассматриваются в качестве наиболее чувствительной внутриклеточной "мипени" многих Сиологичес-ки активных соединений, в том числе - пестицидов. В качестве основного проявления действия пестицидов традиционно принято рассматривать разобщение окислительного фосфорилировзния, тсрмохенле или активацию дыхания. Однако состояние взжнейпнх функций митохондрий (Мх)* может Сыть существенно изменено и в результате влияния пестицидов и других ксенобиотиков на проницаемость мнтохонд-рнальных и других типов мембран, систем транспорта ионов, и прежде всего - Н1" и Ca2"1" (Асраров, 1989; Холмухамедова, 1984; Abo-Khatwa, Hollingworth, 1974; Farber, 1990; Hertel et al., 1931; Pounds, 1990; Rassmussen et al., 1990).

Ионам Ca2+ принадлежит важная роль внутриклеточного посредника действия многих гормонов, эффективного регулятора большинства клеточных функций, поэтому влияние пестицидов и других ЕАВ на гсыеостаз Ca21" можег иметь больсое значение в развитии конечных биологических эффектов. Выход цитоэольного уровня Caz+ (CCaZl"]in) за пределы физиологического диапазона под влиянием пестицидов, некоторых биорегуляторов или токсинов рассматривается как основа развития их цнтотокспческого действия (Orrenlus et al., 1992).

Таким образом, в связи с дальнейшем развитием представлений о способах регуляции функций Мх требуется детальный анализ механизма действия пестицидов, учитывающий не только т.н. "разобщающие эффекты", но и влияние на системы регуляции проницаемости мембран Мх и клеточного гсмеостаза Саг+.

Цель и задачи работы. Целью данной работы явилось исследование механизма действия некоторых пестицидов на функциональное состояние изолированных to и особенности распределения мембранос-вязанкого Сз2+ в клетках.

В соответствии с этим были решены следующие задачи:

Сокращения: БАВ - биологически активные вещества; 2.4-ДН2> -

2.4-динитрофенол; LD50 - летальная доза вещества, вызывающая гибель 50Х подопытных животных (в мг на 1 кг живой массы); № - митохондрии; 03> - окислительное фосфорилироваяке; ПОЛ - перекисное окисление лгаидоэ; СИ - среда инкубации; ХТЦ - хлортетраниклин; ЦсА - циклоспорин А; ЗПР - эндоплазмат1Г-г°скип ретикулум; ПИ -плазматическая мембрана.

1) исследовать влияние ряда пестицидов (фозалон, маврик, омзйт) на процессы дыхания и 00 изолированных Мх печени крыс;

2) изучить влияние пестицидов на проницаемость внутренних мембран митохондрий для различных одно- и двухвалентных кагпЗнов, а также неэлектролитов;

3) с использованием Са^-чуЕствительных флуоресцентных зондов оценить состояние различных кальциевых депо при действии пестицидов в условиях целостной клетки.

4) исследовать особенности взаимодействия пестицида болстар, с Са2*"-зависимой циклоспорин А-чувствительной порой мембран Мх;

На защиту выносятся следующие основные положения:

- одним из наиболее постоянных и распространенных механизмов действия пестицидов на функции Мх является разобщение окислительного фосфорилироганна н повышение проницаемости их внутренних мембран;

- некоторые пестициды реализуют свое действие на функциональное состояние Мх путем модификации проницаемости их внутренних мембран для двухвалентных катионов или влияния на состояние ПсА-чувствительной поры;

- в основе механизма цитотоксического действия некоторых пестицидов на клетку может лежать существенное повышение уровня Са2+ в цитозоле и влияние на внутриклеточное распределение Са2+.

Научная ноеизнз. Впервые исследовано действие пестицидов фо-залон, маврик и омайт на параметры, характеризующие распределение мембраносвязанного Са2+ в тимоцитах крыс, а также на дыхание, 00, и проницаемость мембран и транспорт Са2"1" в Мх печени крыс. Омайт и маврик в относительно низких концентрациях (5-15 мкМ) увеличивали проницаемость мембран Мх для одно- и двухвалентных катионов, в то время как фозалон - преимущественно для Мг2+ и Са2+.

Показано, что значительное увеличение Н+-проницаемости, необходимое для разобщения ОФ и снижения Са2+-аккумулирующей емкости изолированных Мх, имеет место только при использовании средних и высоких концентраций (35-200 мкМ) маврика и омайта.

Впервые обнаружено, что инсектицид болстар ингибирует транс- | порт одновалентных катионов и неэлектролитов через внутреннюю , мембрану Мх, причем это ингибкрование осуществляется на уровне : ПсЛ-чувствнтельнсй поры.

Впервые продемонстрировано, что фозалон в концентрации 5-26 мйЛ вызывает многократное увеличение цитозольного Саг+ в тимэцн-тах, з результате индукции входа Са2+ в клетку через ПМ.

Научно-практическая значимость ■ Полученные в настоящей работа данные расширяют представления о механизмах биологического действия и побочных эффектов разлэтных групп пестицидов и химических препаратов в целом, отводя суцэственную роль не только разобпап-щим эффекта!.;, но и их влиянию на уровень мембранссвяганного и цитозольного Са2+, модуляции ЦсА-чувствитальной поры Мх. Установленные е .настоящей работе мембрачоактивные свойства некоторых пестицидов, .в частности бслстара и фозалона, определяют перспективу их использования в качестве инструментов исследования в экспериментальной мембранологии как модуляторов состояния ЦсА-чувствительной поры МХ и клеточного гомеостаза Са2+.

Апробация работы и публикации. Материалы диссертации были доложены на научной конференции "Структура и функции биологических мембран" (Ташкент, 1995), на 2 Конференции биохимиков Узбекистана (Ташкент, 1995), на Международной научной конференции "Влияние физико-химических факторов на метабоккеские процессы в организме" (Андижан, 1997), ка конференциях молодых ученых и научных семинарах. По материалам диссертации опубликовано 3 статьи и 2 тезиса.

Структура диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы (гл.1), описания материалов и методов исследования (гл.II), изложения полученных результатов и их обсуждения (гл.III), заключения, выводов и списка цитируемой литературы, включающего 231 ссылок. Работа изложена на 161 страницах машинописного текста, включая 22 рис. и 8 таблиц.

Работа выполнена при поддержки гранта N 95/95 ОПОИ АН РУз.

Автор выражает искреннюю признательность к.б.к. М.И.Асрарову за ценные консультации и помосз» при проведении экспериментов.

НАТЕРШИ И ИГГОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Эксперименты проводились на самцах беспородных белых крыс массой 100-150 г. В работе были использованы пестициды, характеристики которых приведены в таблице 1.

Больеинстео методов (вцделэние Мх, полярографическая регистрация дыхания и 00), применявшихся нами в биоэнергетических исс-

Та5л;из 1.

Строение и некоторые характеристик: песткссов

жекезазке аестщщз ! /.галтчеекзя структура ■Мол.мзссз! Крзткзя характер.

:. 5-лгсп:и-0-этпгл:1тио5осфат ;бслстар)

С2Н50. C3H7S ■

екз

¡глсектицти: LX'50 (oral) -107 мг/кг, 322,4 растгоргаг в зрга-

Hir-iecr-j-j-: растЕз-рнтелях

грег-бутшйенокси, цик-гкекл-2-пропинилсудьфит (смайт)

(СН3)э-

н H о I I II

/> —0-C-C-0-S-CH2-C-CH

н2с сн2 \ / н2с — сн2

кксектоак=р:щ!Я, L.D50 (oral) -2£00 мг/кг 326 рзстЕор::м в орга-HI ГчвСКЛХ РЗСТЕО-

рктеддх

; - 3-метил-2- (4- тркфтор-^"гдхлэрфеЕлламкзо) бутаяо-2г;> кислоты №,5)-3-Фенскси-з-дгано-бензилоЕкй эфир Смзгркк)

Cl

^ NH-ÇHOOQCH-^ >

F3C сн(сн3)2 oceHs

¡шс ектезкарицзд, LD50 forai) -250-25:0 КГ/КГ 503 растЕОр:м в орга-

рзстао-рителях

4. 5-í '6-хлоро-2-оксоЗ (2Н)-бензс-ксазолил)иеткл> 0,0-ди-зтш; дитлсфосфат) (фозалон)

С2Н5-0. .S . Р

С2Н5-0х ^S-CH2

о=с

J-CI

инсектицид, 368,6 акзркдод

LD50 (oral) -120-170 мг/кг растЕсрш б метаноле, этаноле и ео многих ароматкчес-гак растворителях

Примечание: Характеристик:! пестицидов приведены по Н.Н.Мальниксау (1GS7) и "Farm chanicals handbock" (1SB3),

0

ледованияхж), детально описаны в ряде руководств (виноградов и др., 1977; Сранк и др., 1S73).

Дыхание к параметры СО Мх печени измеряли полярографическн при температуре 2В°С. Скорость дыхания Мх в метаболическом состоянии 3 и 4, а также величины коэффициентов дыхательного контроля (ДК) и АЛО/0 определяли по Чансу.

Транспорт Са21" через мембрану Мх регистрировали рН-метричес-ким методом с использованием рН-метра Radelkis OP-101 (Венгрия) с подключенным к нему самописцем КСП-4 (0-10 мв). Систему калибровали раствором НС1 известной концентрации.

Проницаемость внутренних мембран Мх для различных катионов оценивали по кинетике набухания деэнергизованных Мх в изоосмоти-ческкх растворах нитратов исследуемых катионов, эабуференных 10 мМ трис-нитратом, рН 7,4 я содержащих ингибиторы дыхательной цепи 1 мкМ ротенон + 1 мкМ антимицин A (Brierley, 1974). Набухание Мх измеряли по изменению оптической плотности суспензии Мх при 520 нм на фотометре Л.О-69 в комплекте с регистратором.

Тимоциты выделяли из тимуса крыс мзссой 120-150 г. по ранее описанному методу (СукочеЕа, 1996) а среде А следующего составз: 145 мМ NaCl, 4,6 мМ КС1, 8 мМ MOPS, 1 мМ фосфат калия, 10 мМ глюкозы (или пирувата), рН 7,4,",). В течение эксперимента клетки хранили в ледяной бане. Дыхание тимоцитов регистрировали полярог-рзфически в среде А.

Для измерения количества мембраносвязанного Caz+ к клеткам, помещенным в среду А, добавлял;: 20 мкМ ХТЦ и инкубировали 60 мин. Олуоресценцяо ХТД регистрировали на спектрофлуоркметре СФР-1 (Россия), при 37°С и постоянном перемешивании, длина еолны возбуждения ХТЦ - 405 нм, регистрации - 530 нм (Добрецов, Владимиров, 1980; Gukovskaya et al., 1986).

Для измерения ССаг+]щ тиыоцитов использовали флуоресцентный зонд Fui*a-2/AM. [CaZi_] рассчитывали, как описано ранее (Сукоче-ва, 1936; Berridge, 1987).

В таблицах и рис. представлены средние значения из Б-6 пов-торностей.

эксперименты выполнены совместно с к.б.н. . М.И.Асраровым *** зкспершенты на тимоцитах выполнены совместно с А.Ю. Абрамовым

- 8 -

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

1. Влияние пестицидов на дыхание, окислительное фосфори-лирование и проницаемость мембран митохондрий печени крис

В специальной серии экспериментов нами было изучено действие фозалона на дыхание и ОФ Мх печени крыс (таблица, 2). Исследуемый инсектицид в концентрациях 50-100 мкМ ингибирует дыхание Мх в состоянии Уз, снижает показатели дыхательного контроля (ДК) и АДФ/0. Более высокие концентрации фозалона (150 мкМ) полностью разобщают СО до значений ДК-1,0.

В связи с отмеченным разобщением 00 нами было исследовано действие различных концентраций фозалона на пассивную проницаемость внутренних мембран деэнергизованных Мх. Эксперименты показали, что этот пестицид увеличивает проницаемость внутренних мембран Мх для ионов Mjz+ и Са2"1", но при этом практически не влияет на мембранную проницаемость для катионов К+, Н+, Мат (рис.1). Можно предположить в связи с этим, что разобщение 00 в присутствии фозалона происходит преимущественно вследствие увеличения пассивной проницаемости внутренних мембран Мх для Са2"1" и Mg2+.

Поскольку фозалон разобщал 00 и индуцировал пассивную проницаемость внутренних мембран Мх для двухвалентных катионов, нами было исследовано его влияние на транспорт Са2+ в экергизованных Мх. Изучение особенностей транспорта Са2+ в Мх показало, что в присутствии 200 мкМ фозалона примерно наполовину уменьшается их емкость по Са2+ (рис.2). Этот эффект фозалона достаточно хорошо коррелирует с разобщением ОФ в данной дозе.

Таким образом, исследованный нами инсектицид фозалон обладает мембраноактивными свойствами, эффективно влияя на такие параметры функционального состояния Мх как дыхание, 00, проницаемость их внутренних мембран, особенно выраженное в случае Са2+ и

В другой серии экспериментов нами было исследовайо действие на функциональное состояние Мх инсектоакарицидов омайта и маври- ■ ка, которые в растущем объеме используются в сельском хозяйстве Республики для борьбы с членистоногши вредителями плодовых культур и хлопчатника. Мембраноактивные свойства этих препаратов до настоящего времени не были описаны.

- g -

Таблица 2.

Действие различных концентраций пестицидов на дыхание н окислительное фосфорилирование митохондрий печени (Среда инкубации: 60 мМ КС1, сахароза 120 м.\!, 2,5 мМ КН2РО4, сукцинат - 5 мМ, 10 мМ трис-HCl, рН 7,4, белок митохондрий -3,5 мг/мл. Добавки АДО по 125 кмоль).

Вариант опыта

Контроль Оозалон

Контроль Омайт

Контроль Маврик

Концентрация, МКМ

50 100 150 200

50 100 150 200

50 100 150 200

Скорость потребления кислорода нг-атом 0 /мин на 1 мг белка

Уз

82,9 81,3 64,а 31,9 31,7

82,3

85.0 96,2 92,5

85.1

69.2 51,7

53.0

50.1 45,1

21,4 21,8

23.8

31.9 31,7

30,9 34,9

47.0

51.4

54.3

23.5

23.5

23.1

23.4

23.6

_дк_

3,85 3,68 2,72 1,0 1,0

2,67 2,47 2,03 1,60 1,75

2,94 2,63 2,30 2,14 1,53

АД-3/0

1,92 1,65 1,21

1,91 1,84 1,53 1,37 1,21

1,53 1,82 1,60 1,45 1,34

Р/РО

С а;

K^HtNa^

2+

МГ

/ / / / / / /

,2+

50

100

150

[СЗфоч,, МкМ

Рис.1. Действие различных концентраций фозагона на проницаемость

внутренних мембран Мх для ионов К+, Н+, Ка+, Саг+, Мгг+. По оси ординат: Р/Ро - отношение проницаемости внутренних мембран Мх для катионов в контроле (Ро) и в присутствии фозалона (Р).

Рис.2. Действие пестицидов на кальциевую емкость

митохондрий печени крыс а - контроль; б - 200 мкМ фозалона; в - 125 мкМ омайта; г - 50 мкМ маврика. (СИ: сахароза - 12С мМ, КС1 - 60 мМ, сукцинат - БмМ, трис-НС1 - 5 мМ, рН 7,4; митохондрии - 3,6 мг белка/мл. Стрелками указаны добавки Са2+ по 100 нмоль).

Как следует из данных, представленных в таблице 2, омайт в концентрациях 50-100 мкМ увеличивал скорость дыхания Мх в метаболических состояниях Уз и У4, при этом уменьшались значения ДК и АДФ/О, что указывает на разобщение 00. В присутствии более высоких доз омайта (150-200 мкМ) наблюдалось некоторое кнгибирование Уз и дальнейшая стимуляция дыхания в состоянии У4. Величины коэффициентов ДК и АДФ/0 уменьшались, однако полного разобщения 00 не отмечалось, в отличие от омайта, маврик во всех исследованных концентрациях более эффективно подавлял дыхание Мх в активном метаболическом состоянии Уз, не оказывая ни в одной из использованных концентраций стимулирующего эффекта и практически не влияя на скорость дыхания в состоянии

С целью выяснения механизма разобщающего действия нами, как и в случае фозалона, было изучено действие омайта и маврика на проницаемость мембран Мх. Эти пестициды в концентрациях Б-15 мкМ до-зозависимо увеличивали проницаемость внутренних мембран Мх для катионов Н+, К+, Иа+, Са2+, М£г+, а также сахарозы (табл. 3). Индуцированная проницаемость имеет следующую относительную селек-п'рность:

омайт - Мг:Ма:К:Н:Са:сзхароэа - 1,0:0,26:0,21:0,06:0,05-:0,03, маврик - Мз:На:К:Н:Са:сахароза - 1,0:0,58:0.65:0.35:0,08:0.05. Следовательно, состояние проницаемости мембран Мх является более чувствительным показателем на действие сравнительно низких концентраций этих пестицидов по сравнению с дыханием и ОС.

В связи с эффективным действием оманта и маврика на проницаемость мембран Мх для двухвалентны;', катионов нами было исследоЕано действие этих соединений на процесс энергозавис!:мого транспорта Са2+ в Мх. Проведенные эксперименты показали, что оба пестицида эффективно снижают величину максимально аккумулируемого в Мл Са2+. причем маврик действовал несколько сильнее (рис.2).

Таким образом, иясектоакарицзды омайт и маврик эффективно влияют на ряд параметров функционального состоянии Мл, разобщая 02 и нарушая проницземость их внутренних мембран для катионов и неэлектролитов. Значительное увеличение проницаемости мптохондри-альных мембран для ионов калия, натрия и магния, индуцированное микромолярными концентрациями омайта и мазрика, может оказывать не только разобщающее, но и более тонкое регулирующее действие на ионный гсмеостаз, з частности - на распределение Са2+ и состояние кальциевых депо в условиях клетки.

Таблица 3.

Действие омайта и мазрика на пассивную проницаемость мембран митохондрий печени крыс

Наименование Еещестза — - Концентрация, мк.7. " 1 Проницаемость, Р/Р0

К- Н1- Ма+ Са2+ М22+ сахароза

Контроль . Омайт 5 10 15 1.0 3,8 У,В 11,0 1,0 1,6 3,3 4,3 1,0 2,3 6,3 13,7 1,0 1,0 1,0 3,0 1,0 35,0 45,6 53,0 1,0 1,0 1,3 1,5

Контроль Маврик 5 10 15 1,0 9,3 5,0 0,4 1,0 2.4 5.5 12,8 1,0 9,3 16,3 21,0 1,0 1,0 1.7 2.8 1,0 2,7 20,3 36,5 1,0 1,4 1,7 1,9

Примечание: В таблице представлены концентрации в пересчете на действующее вещество в коммерческом препарате пестицида.

Р - проницаемость мембран в присутствии пестицидов. Ро - в контроле.

- 12 -

2. Действие пестмртдов на кальциевый гоиеостаз клетки

Са2т как универсальный вторичный мессенджер регулирует практически все внутриклеточные процессы. Вполне естественно, что фармакологические и токсические эффекты многих ксенобиотиков на уровне клетки или функций органов в большинстве случаев оказываются связанными с транспортом ионов Са2+ (Гагельганс, Асраров, 1995; Hertel et al., 1931; Rassmussen et al., 1990).'

В связи с вышеизложенным нами было исследовано влияние фоза-лона, омайта и мазрика на гомеостаэ Са2+ в изолированных тимоци-тах крысы с использованием флуоресцентных зондов.

Влияния пестицидов на распределение Са2+ в мембранах тимоци-тов изучали как в среде с Ca2*, так и без него. Для идентификации важнейших внутриклеточных пулов Ca2"1" нами были использованы ингибитор Са-АТВазы ретикулума - ортованадат и ингибиторы дыхательной цепи Мх или разобщители СО.

Инсектоакарнциды оаайт и маврик. Добавление препаратов маврик или омайт в концентрациях 5-100 мкМ вызывало снижение уровня интенсивности флуоресценции ХТЦ в суспензии тимоцитов, которое носило дозозависимый характер. Так, в случае 100 мкМ омайта это снижение составляло 15Х. Маврик также вызывал снижение уровня интенсивности флуоресценции ХТЦ от 10Х (100 мкМ) до 5Х (6 мкМ).

Добавление 2 мМ ЭГТА, который не проникает внутрь клетки, позволяет судить о количестве мембраносвязанного Ca2* (Caть) на плазматической мембране (ПМ). В наших экспериментах было установлено, что снижение интенсивности флуоресценции ХТЦ, вызванное добавлением ЗГТА, у омайт-обработанных клеток (100 мкМ) было выше, чем в контроле на 35Х. В концентрации 5 мкМ омайт практически не ока?ывал влияние на аккумуляцию Са2+ на ПМ. Снижение уровня флуоресценции, вызванное ЗГТА, в экспериментах с мавриком было на 257. ниже контрольны/, значений, причем этот эффект наблюдался в широком диапазоне концентраций.

В присутствии ортованадата (5х10~4 М) добавление омайта или маврика вызывало меньшее снижение интенсивности флуоресценции по сравнению с контролем. Для омайта эта разница составляла 40X (100 мкШ и 10% (30 мкМ). В экспериментах с мавриком аналогичный процент снижения интенсивности флуоресценции отмечался соответствен-

но для концентраций 1(30 и 5 мкМ инсектицида. Следовательно, оба изученных нами препарата способствовали высвобождению Са2+ из пула ЭПР, причем магрик оказывает эффект в существенно меньших концентрациях по сравнению с омайтом.

Использование ингибиторов дыхания показало, что омайт вызывает освобождение СЭщь из пула f/x и ЭПР, но способствует накопления Сзщь на ГОЛ. Маврик также вызывает освобождение Сз^ь из Енутрпкле-точных пулов, но, в отличии от омаита, не вызывает аюс/ьг/ляцию Caz+ на ИМ. Отмеченные эффекты пестицидов по истощенна пула Са2"* Мх хорошо согласуются с данными об уменьшении Caz+-емкости изолированных Мх при действии омаита и маврика, которое, однако, наблюдалось в присутствии значительно больших их концентраций.

• Полученные нами данные представляют определенный интерес для понимания токсических эффектов исследованных препаратов. Индуцированное ими уменьсение аккумуляции Са2+ в Мх и немитохсндрпаль-ных пулах нарушает Са2*-гомеостаз клетки и повышает ССа2"1-! m с последующей реализацией цитотоксичесгас: эффектов Caz+. При солос-тавлешш минимально действующих концентраций в отношении истощения внутриклеточных пулов Caz+ маврик оказывается в несколько раз более эффективным по сравнешэо с омайтом. Аналогичное соотношение активностей наблюдается и при сопоставлении величин их LD50 (таблица 1): 250-280 мг/кг для маврика и 2200 - для омаита.

Фозалон. В другой серии экспериментов'нами было исследовано влияние фозалона на состояние Са^ь и внутриклеточное распределение Са21" в тимоцитач. При добавлении к суспензии клеток 2 мМ ЭГТА интенсивность флуоресценции ХТЦ в случае фозалон-стимулированных тимоцитов снижалась в большей степени, чем в контроле (рис.3). Уменьшение флуоресценции в Са2""-содержащей среде с фо?алоном в дозе 5 мкМ составляло при добавлении ЗГТА 307., тогда как в контроле - только 207.. Снижение флуоресценции ХТЦ в этих условиях объясняется связыванием ЗГТА ионов Caz+ из комплекса ХТЦ-Са2+ ПМ.

Действие фозалона на величину Са2т-пула Мх, согласно нашим данным, было разнонаправленным и зависело от используемой дозы фозалона. При 5-75 Midi он способствовал накоплению Са2+ в митохондриях, о чем свидетельствует более интенсивное, по сравнен™ с контролем, снижение ХТЦ-флуоресценции обработанных фозалоном клеток в присутствии ингибиторов дыхания Мх. Однако в среде без до-

флуоресценции ХТЦ J

3 ГТА

Лнтимиуин А

1 мин

V

Тимоцапы

_ контроль (20%)

1 мкМ (30%)

SmxM (W.)

Тимоциты

\

л "Л

5 мкМ (35-4СРЛ)

Рис.3. Влияние различных концентраций фозалона на распределение , мембраносвяэанного Са1+ п изолированных тимоцитах

(1-5 мкМ - кОнцстграция фозалона; в % указало снижение шггспсшшостн флуоресцсид1Ш ХТЦ; добавки: ЭГТА 2 мМ, шшиащии А 1 мкМ).

бавления Caz+ подобная разница с контролем не обнаружена. Уменьшение количества Са^ь в Мх в присутствии высоких доз фозалона (200-260 мкМ) свидетельствует об истощении их Са^-пула, скорее всего, вследствие разобщающего действия высоких концентраций данного пестицида и снижения Дцн+-

При исследовании Са^ь в немитохондриальных пулах, использовали 0,5 мМ ортованадат - ингибитор Са-АТОазы ЭПР. При его добавлении к тимоцитам наблюдается выход Са2+ в цитоэоль, что и регистрируется как снижение флуоресценции ХТЦ. В контрольных экспериментах (без пестицида) снижение интенсивности флуоресценции составляло около 30%, а в фозалон-стимулированных клетках оно равнялось 15-202 (100 мкМ фозалона) и 10Z - при дозах 5-1Б мкМ.

Полученные нами результаты по Сащь согласуются с данными о регуляции фоэалоном дыхания тимоцитов крыс. Начальная скорость потребления кислорода в суспензии тимоцитов соответствует в основном промежуточному состоянию V3-V4. в присутствии олигомицина у хорошо сопряженных Мх в тимоцитах наблюдается максимальное ин-гибирование дыхания, которое соответствует именно той части дыха-

ния. что сопряжена с синтезом АТФ (табл. 4). При последующем добавлении 2,4-ДНФ дыхание тпмоцитов максимально активируется, при этом снимается ингибирующий эффект олигзмицина, и в эгих условиях оценивается состояние дыхательной цепи, наличие или отсутствие ингибирующих воздействий на ее уровне. Нами было показано, что фозалон (25-100 мкМ) вызывает стимуляцию дыхания и разобщение Ш в тимоцитах, а в концентрации свыше 100 мкМ - ннгибирует их дыхание. По-видимому, высокие концентрации фоэалона оказывают цито-токсическое действие на мембраны Мх, способствуя снижению количества СЗть-

Добавление фоэалона (5-100 мкМ) к тимоцитам, обработанным Fu-га-2АМ, вызывало увеличение интенсивности флуоресценции, что свидетельствует о дозозависимом росте уровня цитозольного Caz+. Данный прирост цитозольного Caz+ происходит в основном, по-видимому, за счет его поступления в клетку извне, т.к. именно эти концентрации фоэалона в экспергалентах с использованием ХТЦ вызывали увеличение мембраносвязанного Caz+.

Таблица 4.

Влияние различных концентраций пестицидов на дыхание тимоцитов (СИ: 4,6 MM КС1, 145 мМ NaCl, 8 мМ MOPS, 1 мМ КН2РО4, 10 мМ глюкоза, рН 7,4)

Вариант опыта Концентрация, 1ÍIÍ1 Скорости дыхания (нг-атом0/минх100 млн кп.) Отношения

V4c Уолиг. '/дна 44/олиг. ДНФ/олнг

Контроль Фозалон 25 БО 100 24,8 17,0 15,0 13,8 9,2 12,2 10,2 12,6 38,0 28,0 23,4 12,6 2,7 1.4 1.5 1,1 4.1 2.3 2,3 1.0

Контроль Омайт 25 50 100 25,0 21,0 19,0 10,0 13,0 14,0 13,5 6,0 30,0 30,0 21,0 14,0 1.9 1,5 1,4 1,7 2,3 2,1 1.6 2,3

Контроль Маврик 26 50 100 12,5 13,8 12,2 8,8 ?,6 8,0 7,0 6,0 22,5 23,0 15,0 12,5 1.7 1,7? 1.7 1.8 3.0 2,9 2.1 Р., Г'

Эхо предположение подтверждают эксперименты с использованием Олокаторов Сагт-каналов ПМ (рис.4). При использовании 10 мкМ Сс12+ рост ССаг'+] щ, индуцированный фозалоном, практически не отмечался. тем не менее и в этом случае фозалон оказывал заметное влияние на перераспределение Са2+ во внутриклеточных депо. Таким образом, увеличение т» индуцированное фозалоном, можно объяснить влиянием пестицида на Са2+-каналы ПМ.

При добавлении к суспензии клеток ингибиторов метаболизма Мх - антимицииа А (1 мкМ) и олигомицина (2 мкг/мл) наблюдается рост [Сзг+3т в ре:/льтате высвобождения Са2+ из этого пула. В наших экспериментах показано, что в присутствии 5-25 мкМ фозалона количество высвобождаемого из Мх Са2+ было значительнее, что указывает на увеличение размер этого пула при действии фозалона. В случае клеток, обработанных более высокими концентрациями этого пес-тииида (60 и 100 мкМ), величина Са2+-пула Мх уменьшается, однако и в этом случае уровень [Са2+]т был выше контроля в 1,4 раза.

Таю™ образом, фозалон оказывает модифицирующее влияние на увеличение Са2+-пула плазмалеммы тимоцитов, которое сопровождается перераспределением ионпв Са2+ между внутриклеточными компарт-ментами, в частности, между ЭПР и Мх, что сопровождается изменением дыхания суспензии тимоцитов крыс. Необходимо также отметить, что фозалон отличается от других исследованных нами пестицидов в

Д [Са2+]i нМ

Рис.4. Изменение ССа2 в тимоцитах, вызванное фозалоном и блокаторами Са-каналов плазматических мембран 1 - при добавлении 50 мкМ фозалона;

2-50 мкМ верапамила + 60 мкМ фозалона;

3-10 мкМ Cd* + 50 мкМ фаз. Стрелками указан момент добавления фозалона. (Условия инкубации:

4,6 мМ КС1, 145 мМ HaCl, 8 мМ MOPS, 1 мМ КН2РО4, 10 мМ На-пируват, рН 7,4).

t, мин.

отношении действия на внутриклеточный гоыеостаэ Са^+ как по эффективности действия в малых концентрациях, так и по зависимости его эффектов от наличия экзогенного Са2+ в среде инкурации.

Вызываемые фоэалоном изменения в состоянии Са^ь, возможно, имеют, как и в случае других пестицидов (Orrenius et al., 1932), непосредственное отношение к проявлению его побочных токсических эффектов. В целом, резюмируя материал, изложенный в данном разделе, следует отметить, что не вызывает сомнения факт, что как н в случае омаита и маврика, действие фозалона на характер распределения Са2+ в клетке, может существенно модулировать интенсивность и направленность протекания • физиолого-биохимических процессов, способствуя проявлению цитотоксических эффектов.

3. Действие пестицида болстар на транспорт ионов и

неэлектролитов через ЦсА-чулствитольнуи пору митохондрия

Многие физиологические регуляторы и БАВ, включая ксенобиотики, про- и антпоксиданты, тяжелые металлы, гормоны и другие факторы, регулируют функциональное состояние Мх на уровне Са^-зави-симой ЦсА-чувствительной поры их внутренних мембран (Гайнутдшгов и др., 1993,1994; Halestrap et al., 1986; Pfeifer, 1989).

При скрининге большого числа инсектицидов, гербицидов и фунгицидов ряд из них (бенифен, бутрзлин, болстар, стомп, санолен и др.) оказывал на уровне изолированных Мх сопрягающий эффект, который проявлялся как увеличение Са21"-аккумулирующей емкости и снижение скорости Еыхода Са2+ из Мх (Асраров, 1988), что косвенно свидетельствует о ЦсА-подобном действии.

Нами в целях рассмотрения "неразобианщих" эффектов пестицидов и изучения механизма функционирования ЦсА-чувствительной поры было детально исследовано действие болстара'на Са2+-р?гулируршй транспорт ионов и неэлектролитов через эту пору.

В специальной серии экспериментов было установлено, что болстар подавляет скорость дыхания № в состоянии Уз и частично - ь V4, но не оказывает существенного влияння из скорость р.ч?-""шинного дыхания. С целью анализа механизма действия этого пестшмя-ч ня дыхание и С®, как и в случае других пестицидов, были и":,л''>лпп.ччп влияние болстара на проницаемость мембран Мх.

В экспершентзх с Сз?ж-ЗГТА буфером упелпч?ни<з уровня иснизн-

[ч.апчксго в физиологическом диапазоне концентраций вызывает нтбуханге энэргизованных Мх в среде с KCl в присутствии субстратов окисления и фосфата. Набухание Мх в присутствии физиологических концентраций Сз2+ не наблюдается при замене KCl на сахарозу. Енесение в среду ЦсА - блокатора неспешйической поры вызывало ш.гибирсвание Са2+-зависимого набухания знергиэованных Мх. Болстар в концентрациях 20-Б0 мкМ также ингибирует набухание энерги-зпЕанных Мх в среде с KCl и субстратами дыхания, индуцированное нонами Сая+, действуя подобно ЦсА.

В эксперпм?нтах по регистрации набухания деэнергизованных Мх в изоосмотических растворах KSCN и NH4SCN, а также КШз и NH4NO3 болстар в концентрациях 20 и 60 мкМ ингибировал подобно ЦсА транспорт ионов К* и Н*1" через внутреннюю мембрану. Результаты этих экспериментов позволили нам предположить, что ингибирование болстаром транспорта ионов К+ и Н+ осуществляется на уровне ЦсА-чувствнтельной поры мембран Мх. Для проверки этого предположения нами было исследовано действие болстара на транспорт неэлектролитов через внутреннюю мембрану Мх.

Болстар в тех же концентрациях, при которых он ингибировал набухание энергизованных Мх и транспорт ионов К+ и Н+ через их внутреннюю мембрану, снижал скорость набухания деэнергизованных Мх в изоосмотических растворах глицерина, арабиноэы, глюкозы и сахарозы.

Таким образом, результаты наших экспериментов свидетельствуют о том, что болстар ингибирует транспорт одновалентных катионов и неэлектролитов через внутреннюю мембрану Мх печени крысы, регулируя состояние ПсА-чувствительной поры.

Возникает закономерный вопрос, каким образом реализуется это действие болстара. В связи с этим нами было обращено внимание на то, что, во-первых, болстар и другие пестициды, стабилизирующие мембраны Мх (санолен, стомп, зеллек л др.), согласно данным, полученным в лаборатории М.Х.Гайнутдинова, резко снижают в условиях in vitro интенсивность ПОЛ в биомембранах. Другие пестициды с разобщающими эффектами на Мх действовали, напротив, как индукторы ПОЛ. Во-вторых, имеются данные об участии процессов ПОЛ в регуляции состояния ЦсА-чувствительной поры (Новгородов и др., 1983; Скулачев, 1994,1996; Castilcho et al., 1995; Nepomuceno, Perelra-

с1азЦуа, 1993).

С целью выяснения возможного механизма действия болстаря на ЦсА-чуЕСТЕИтельнуга пору Мх нами изучалась активность этого пестицида в качестве протектора при индукшш перекпгного окисления п Мх с использованием системы Ге+аскорбат. В условиях регистрации набухания Мх добавление системы Ге/аскорбат инлуцирует увеличение проницаемости их внутренних мембран в результате стимуляции ПОЛ, которое может быть объяснено переходом ЦсА-чувствительной поры в открытую конфигурацию. При этой индуцируется еыход аккумулированного Са2+ из Мх, увеличивается проницаемость мембран Мх для Сэ,'л и других ионов. Характерно, что добавление антиоксндантов (0,5 иМ дитиогреитол, 10 мкМ ионол) или 50 мкМ болстара препятствовало развитию состояния неспецифической проницаемости мембран (рис.5).

Т.о., можно считать, что в основе мембрано-стабилизирующих эффектов болстара наряду с ЦсА-подобным действием лежит его аити-оксидантная активность. В хорошем соответствии с приведенными выше результатами находятся данные о защитном влиянии ряда других веществ (в том числе и циклоспорина А) при действии различных

1992; Иеротсепо, РегеггаЗаяНуа,

Рис. 5. Влияние болстара и знтп-оксидантоз на кинетику ПОЛ-индуцированного выхода Са2+ из Мх.

Добавки: Са2+ - 500 нмоль, Ре504 - 20 мкМ, аекорбат - 3 мМ. болстар - 50 мкМ, ионол - 10 мкМ, ДДТ - 0,5 мМ.

Белок митохондрий - 3,5 иг/мл. а - контроль без индукторов ПОЛ; б - + индукторы ПОЛ; в - индукторы ПОЛ + ДДТ; г - индукторы ПОЛ + ионол; д - индукторы ПОЛ + болстар. Цифрами у кривых указана скорость >та Са2+, в нмоль П+/мнн.м1 бел

прооксидантоз (1гЬегМ ей а1., 1993; Раэ^гшо et а1., 1993).

£00 нмоль Н+ 1

1 мин.

транспор

- £0 -ЗАКЛЮЧИШЬ"

В целом, совокупность представленных в настоящей работе экс-г;>?гпм~нталбнн;< дзшил вполне согласуется с общепринятой концепци-что Мх и локализованная в них система трансформации энергии представляют собой своеобразную внутриклеточную мишень, довольно ч'}Тко реагирующую на воздействие различных пестицидов. Эта кон-ц-тшпч базируется на значительном количестве убедительных примерен. когда тот или иной пестицид оказывал конкретный биологический эффект, основу которого составляла тленно модификация важней-ичх функции Мх, включат активность дыхательной цепи, состояние системы 01, характеристики проницаемости внутренней мембраны, механизмов ионного транспарта и т.д. (Асраров, 198В; ОрынбаеЕа, 1993; Холмухамедова, 1984; АЬо-КЬа1у/а, НоШпргог^, 1974).

Исследованные нами инсектициды фозалон, маврик и омайт, аналогично многим другим пестшшдам, дозозависимо разобщали ОФ кзо-лнгованннх Мх. влияли на дыхательную активность. Разобщение 03> и уменьшение Саг+- емкости Мх в присутствии омайта и маврика, в целом, можно объяснить снижением мембранного потенциала в результате продемонстрированного нами увеличения проницаемости внутренних мембран Мх для катионов.

Обращает на себя внимание факт, что эффекты исследованных пестицидов на энергозависимые процессы проявляются в диапазоне их средних и высоких концентраций (35-200 мкМ), тогда как влияние на проницаемость мембран деэнергизованных Мх и на гомеостаз Са2+ в изолированных клетках отмечается в области более низких концентрации (Б-10 мкМ) этих пестицидов. Этот факт также позволяет рассматривать в тесной взаимосвязи Са^-мобилизующие и цитотоксичес-кие Э'Мег.ты данных пестицидов, что отмечается и в случае других токсикантов (Оггегпия еЬ а1., 1992).

Достаточно интересным является исследованный в настоящей работ® механизм взаимодействия пестицида болстар с мембранами Мх, который ео многих отношениях аналогичен эффектам ЦсА. Оба эти агента, скорее всего, фиксируют пору в конформации с минимальным диаметром. Поскольку стабилизирующее влияние на мембраны Мх, ко-терле проявлялось в увеличении их Са2+-емкости, оказывают и некоторые лругке пестициды (Асраров, 1988), можно полагать, что жесткая фиксация ЦсА-чувствительной поры как в конфигурации с мини-

мальньм диаметром, так и в максимально открытом ссстолшш пи^-г свои негативные последствия для клеточного метаболизма.

вьш/ш

1. Показано, что инсектициды фозапон, мзвркк, омаит в смд-них и высоких концентрациях (50-200 мкМ) вызывают догозависимое разобщение окислительного фосфорилировання, уменьшают Саг+-ем-кость митохондрии печени. Разобщающее действие пестицидов обусловлено индукцией значительной проницаемости мембран митохондрии для одно- и двухвалентных катионов.

2. Проницаемость внутренних мембран является наиболее чувствительным функциональным параметром митохондрий к цейстЕш низких (5-10 мкМ) концектращ:й смайта и мзврика. Индуцированная проницаемость имеет следующую относительную селективность:

СмгЗп - !.(3:iJa:К:Н:Са:сахароза « 1,0:0,23:0,21:0,03:0,06:0,03, мазрик - M¡j:Na:К:Н:Са:сахароза = 1,0:0,53:0.55:0.35:0,03:0.05. Увеличение проницаемости мембран для ионов К+ и Н+, индуцированное 5 мкМ маврика, в несколько раз выше аналогичных показателей омайта, обладающего меньшей токсичностью.

3. Соэалон в разобщающих концентрациях (50-150 мкМ) практически не увеличивал проницаемость внутренних мембран митохондрий для ионов Н+, К+ и Na+, в то время как проницаемость для Саг-+ и

стимулировалась в 1,5-2 раза. Предполагается, что ?№>кт этого пестицида на окислительное фосфорилирование обусловлен увеличением проницаемости мембран для Caz+.

4. С помощью ХТЦ и Fura-2AM в качестве флуоресцентных зондов на Caz+ исследовано влияние фозаяона на особенности распределения Caz+ в мембранных структурах тимоцитов. Влияние фозэлона проявляется в перераспределении Caz+ из других пулов в митохондрии и отмечается при дозах 1-6 мкМ этого пестицида. Более высггате концентрации фозалона вызывают многократное увеличение уровня пито-зольного Caz+, что может обеспечивать разбитие цчтотсктчссгл'х эффектов.

5. Омаит и маврик (5-100 мкМ) дозозэвнсшо влияют нг- пмут-риклеючное перераспределение Са2'*', вызывая выход Саг+ ня СГС' внутриклеточных дело. При этом более токсичный на животин» ч^гнк оказывает заметный эффект в меньших концентрациях (п и>М) ni

сравнению с омайтом (50 мкМ).

6. Обнаружено, что исследованные пестициды ингибируют дыхание и механизм синтеза АТФ в тимоцитах в области относительно высоких концентраций (100 мкМ), тогда как их эффекты на гомеостаз

реализуются при существенно меньших дозах (1-10 ыкМ). Это позволяет считать, что цитотоксические эффекты фозалона, маврика и пмайта могут быть обусловлены в первую очередь влиянием на клеточный гомеостаз Са2+.

7. Инсектицид болстар (20-Б0 мкМ) препятствует дестабилизирующему действию Са2+ и индукторов ПОЛ на мембраны Мх, ингибирует транспорт одновалентных катионов и неэлектролитов через их внутреннюю мембрану, взаимодействуя с ЦсА-чувствительной порйй Мх.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Кенов В.в., Лшмухамедов Р.Н., Захарова Т.Н., Халилова М.А., Маматова З.А., Асраров М.И., Гайнутдинов М.Х., Мирмахмудова С. Регуляция тиреоиднымп гормонами взаимодействия митохондрий с низ-комоде кула рными цитоплазматическими медиаторами, индуцирующими фосфатзависимый транспорт ионов К+ и Н+ через внутреннюю мембрану митохондрий // Биохимия. - 1390. - т.05. - N 12. - с.2239-2246.

2. Асраров М.И., Гагельганс А.И., Маматова З.А., Мушшова С., Камильджанов А.Х. Исследование действия инсектицидов омайта и мзврика на энергетические процессы митохондрий печени // Уэб.би-ол.журнал. - 1997. - N 1. - с.23-25.

3. Маратова 3.А., Абрамов А.Ю., Сукочева О.А., Асраров М.И. Действие фозалона на состояние мембраносвязанного кальция в тимоцитах крыс // Материалы Мекд.науч. конф. "Влияние физико-химичес-гаж факторов на метаболические процессы в организме", 16-17 мая г. Андижан. 2 часть. - 1997. - с.32-33.

4. Асраров М.И., Маматова З.А., Камильджанов А.Х. Действие некоторых инсектоакарицидов на функциональные параметры митохондрий // В сб."Структура и функции биологических мембран". - Ташкент. - 1995. - с.82.

Б. Маматова З.А., Асраров М.И., Абрамов А.Ю., Гагельганс А.И. Действие инсектоакарицида фозалона на функциональное состояние митохондрий и изолированных тимоцитов // Тез.докл. 3 конфер. биохимиков Узбекистана. 11-13 ноября. - 1995. - с.42.

- 23 -Кискача мазмун

Митохондрия ва ¡ц-лайра ичидаги кальций крмтгида баьэи бир пеошцидларнинг бошкдрув эффектдари Бзъзи бир пестицидларнинг (фозалон, омайт, маврик) аиратил-ган митохондриялар функционал ^олатига таъсир килпш ыеханизмдарл ва ^ужайрада мембранага богланган Са2+нинг жойлашшш хуеусилтларл к?риб чикилди. УпОу инсектицидлар уртача ва икори концентрация-ларда (50-200 мкМ) оксидланиш-фосфорилланишш парчалалш, митохондриялар кальций сигимини камайтирипи ва бу жараэнлар митохондрия ички мембранасини бир ва икки валентли катионларнинг уткаэуа-чанлиги оиишн натижасида зканлиги к?рсатилдп.

Митохондрия ички мембранаси нон >*ткаэувчанлиги омайт ва мав-рик каби инсектицидларнинг кичик доэалари (5-10 мк).1) таъсирига жуда сезгир функционал параметр б^либ, унинг 5 мкМ маврик билан К+ ва Н+ ионлари учун ошши, капрон; за^арли бу'лган омаптга нисба-тан бир неча марта к^пдир. Фозалон эса Са2* ва Мг2+ ионлари учун у'тказувчанликни 1,5-2 марта к^паитиради. Оксидлангап-фосфорилла-нишни парчалаш хусусияти ушбу пестициднинг мембрананинг Са2+ учун утказувчанлигини ошириши билан богланган, деб тахмин килинади.

«Злуоресцент зонд булган хлортетрациклин ердамида пестицид-ларни тшоцитларда меыбранага богланган кальцшгнинг жойлаииши ху-сусиятлари тадккк; кшинди. Тимоцитларда фозалон таъсири боткд манбадардан митохондрияларда кальцийнинг калта так,симланиши 1-5 мкМ дозада, тимоцитлар нафас олиши ва оксидланиш-фосфсрилланиш эса 25-100 мкМ дозада кузатилди. Демак, )$ужайра даражасада фозалон эффектлари авваламбор кальций гомеостазига таъсирида намоен б'? лад и. Омайт ва маврик >^ам мембраналарга богланган Са2+ га таъсир к^шиб, х,ужайра ичидаги Са2+ деполаридал уни чкк^зади. Бу фактлар пестицидларнинг х;ужайра ичидаги мембраналарга богланган калъциига таьсири ва уларнинг цитотоксик эффектлари ораеидаги боглшушкни к^рсатади.

Болстар инсектициди (20-50 мкМ) мембрзьаларга Са2+ таъсири ва липидларнинг перекис оксидланишига т?скинлик килади, Сир валентли катионлар ва эарядсиз моддаларнинг митохондрия ичгл м^мб-ранасидан ^тшини камайтиради, Су жзраёнлар инсектицидни циклос-поринсезгир пора билан ?эаро таъсир кушгага окибятидя ^олчр голяди, деб тахмин килинади.

ANNOTAT1OH

Regulating1 effects of some pesticides on the level of mitochondria and intracellular calcium.

By Z.A.MAMATOVA

Mechanisms of effects of pesticides (phozalone, omite, mav-nk) on functional state of isolated mitochondria and peculiarity of membrane-bound Ca2+ redistribution in cell have been examined. These pesticides in middle and high concentrations (60-200 nM) induce dose dependent uncoupling of oxidative phosphorylation, decrease CaZT-capacity of liver mitochondria. Uncoupling effect of these pesticides depends on induction of high permeability of mitochondrial membranes to mono- and divalent cations.

State of inner membrane permeability is the most sensitive functional parameter of mitochondria to the effect of small doses of omite and mavrik. The increase of membrane permeability to K+ and H+ induced by 5 pM mavrik is several times higher than analogous induces of omite which has lower toxic effect.

Phozalone in uncoupling concentrations (50-150 iiW) increased inner membranes permeability mostly for Ca2* and Mg2+ (in 1,5-2 times). It's supposed that the effect of pesticides on oxidative phosphorylation depends on permeability of mitochondrial membranes for Ca2+. The effects of pesticides on redistribution Camb in rat thymocytes were examined by use of CTC as fluorescence probe.

Obtained data allows us to suppose, that effects of phozalone on the cell level are mediated by the influence of pesticide on Ca2+ homeostasis. Omite and mavrik (15-150 ^M) also effectively influence on Ca^b. Inducing CaZi" efflux from Its intracellular pools. That fact allows us to consider, as in case with phozalone, correlation between Ca-mobilised and cytotoxic effects of pesticides.

Insecticide bolstar (20-50 |iM) prevents influence of Oa2"1" and inductors LP on mitochondrial membranes, it inhibites transport monovalent cations through inner membrane, interacting with Ca-sensitive pore and fixed it in state.