Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Гормональная регуляция гомеостаза кальция и энергетического метаболизма тимоцитов крыс

ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Гормональная регуляция гомеостаза кальция и энергетического метаболизма тимоцитов крыс"

АКАДЕМИЯ НАУКРКСНУБЛШШ УЗБЕКИСТАН ИНСТИТУТ ФИЗИОЛОГИИ И БИОФИЗИКИ

рГБ ОД

1 на правах рукописи

0 г {-лП, УДК 576.32/.36 +57.053.2+ 577.115.3

СУКОЧЕВА ОЛЬГА ЛНЛТОЛЪНВНЛ

ГОРМОНАЛЬНАЯ РЕГУЛЯЦИЙ ГО.МЕОСТАЗА КАЛЬЦИЯ И ЭНЕРГЕТИЧЕСКОГО ЛГЕТАВОЛШМА П1МОЦИТОН Kl'I.IC

(03.00,02 - 0£гоф(П1Ш1)

Аиторефсрат

диссертации im соискание учеюП степени кандидата биологических наук

ТАШКЕНТ 1996

Работа выполнена на кафедре биофивикк биолого-почвенного факультета ТашГУ лм. М. Улугбека и в Институте физиологии и биофизики АН РУа.

Научный руководитель: кандидат биологических наук,

з. 3. Гизатуллина.

Научный консультант: доктор биологических наук, профессор

А. И, Гагельганс.

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор

Ш. С. Азимова, кандидат биологических наук, доцент

и. В. Замараева.

Ведущая организация: Институт биохимии АН РУа.

Защита диссертации состоится ^ИсЛ-^кЯ 1996 г. в _

часов на заседании специализированного совета Д 015.01.21 по защите диссертаций на соискание ученой степени доктора наук по специальности "биофизика" при Институте.физиологии и биофизики АН РУз.

С диссертацией ысмно ознакомиться в библиотеке Института Физиологии и биофизики АН РУэ по адресу: 700095, г. Ташкент, ул. Ниязова, 1.

Автореферат разослан $3" О^^^^г ^96 г.

Ученый секретарь Специализированного совета, д.б.н. ^Х^^СЛ- Каликулов.

. аутуяяьнпгть pnriffnoMH. Поддержание Са'^-гоыеостаза при . гормональной стимуляции - тонкий, носошо отрегулированный и сложный Процесс (Berrldee, 1934; Ait/лзп et al. 1990: Nordstrom. 1992).. В нем принимают участие многочисленные Са'^-транспортируюцие системы. расположенные з различных мембрана* клетки. Но многие вопросы. касашиеся механизмов генерации и регуляции Са'^-сигнала, его соль а гормонально« активации клеток остаются не выясненными.

При исследовании механизмов клеточного ответа на гормональную стимуляцию основное внимание исследователей направлено на выяснение биохимических и биофизических Механизмов рецептор-зависимой передачи сигнала, приводящей к активации Физиологических Функций оетки CBerridgè. 1985: Gukovskaya et al. 1989). Эта область' исследований имеет не только фундаментальное значение, • но вызывает и большой практический интерес, т.к. действие различных гормональных и Фармакологических препаратов связано с модификацией активности ряда ферментов системы внутриклеточной сигнализации, управляющих Функциональной активностью клеток CAltman et al, 1990: Malbon et al. 1988).

S живом организме лимфоциты подвергаются действию тиреоидныи и глшжортикоидкых гормонов CGrablree et.al, 1S80: Hadden, 1986: Корнева. 1338). Показано наличие рецепторов к тисеоидным и глюко-кортикоидным гормонам на плазмалемме лимфоцитов С Segal, 1986, 1939; Tienrungroj. 1937), а также в цитозоле с Голиков, 193S; Carlson et al. 1992: Peers et al, 1993), на ядерной (Hashlzume, et al, 1989: Segal, 1939) и митохондриалькой мембранах (Sterling К., 1991: Buttgereit et al, 1993). Механизм передачи сигнала от таких рецепторов во многом из ясен, хотя согласно многим данным основным посредником на участке, предшествующем нуоеарным гормональным эффектам, являются ионы Са^* (Llchtman et al. 1983: Grlnshteln et al. 1989).

• Изучение действия тироксина -и гидрокортизона на состояние кальциевого гомеостаза ' и энергетического обмена клетки может явиться предпосылкой создания целостной картины первичного действия гормонов через систему трансмембранной передачи сигнала, включашей или тормозящей активность 'клеток иммунной системы на

"донуклеарном уровне". Ло настоящего времени не предпринимались попытки детального исследования действия данных гормонов на уровень внутриклеточного кальция CECa^in) тшоиитов. а их з<Мекты рассматривались обособленно, без учета новых данных о регуляции входа са^ в клетки. .

нд.ць ндстпямрй пабпты заключалась в изучении внутриклеточных механизмов генерации Са^-сигнала при действии тироксина и гидрокортизона. Объектом исследования являлись зрелые и незрелые лим-'Фошты тимуса крыс. '

Основные запачи. .исследования..

1. Выяснить. как изменяется íQ&+hn. исследовать роль различных Са^-транспортарущик систем клетки в Формировании Са'^-сиг-нала при действии тироксина и гидрокортизона и участие митохондрий ((«) и зндоплазматического ретикулума СЭР) в процессе перераспределения мембраносвязакного Са~*\ :

2. Проанализировать взаимосвязь Са^-сигнала с другими процессами. протекавшими в тимоцитах при гормональном воздействии, в частности, зависимость Са^-сигнала от внутриклеточной концентрации циклических нуклеотидов. арахидоновой кислоты и ее продуктов, активности протеинкиназ, G-белшв и кальмодулина С КТО.

3. Изучить влияние тироксина и гидрокортизона на Са'^-сигнал, индуцированный митогеном и другими С Ca'¿--] iп-повышагадими агентами.

4. Исследовать влияние различных доз гидрокортизона на энергетический метаболизм штохондрий в тимоцитах in vi tro и in vivo.

Научная тыпна парты, с помощью Сай+-чувствительных флуоресцентных зондов Схлортетраинклнна и Fur-a-2) впервые проведено комплексное исследование действия тироксина СТ4) и "Гидрокортизона СГЮ на гомеостаз свободного и мамбраносвязанного Са2^, участие в этом процессе внутриклеточных ксмпартментов и ряда белков трансмамбранной сигнализации плазмаламмы тимоиитов, а также действие ГК на энергетический метаболизм митохондрий в условиях целостной клетки, что было сопоставлено.с колебаниями концентраций С Caolín.

Епервыэ проведено исследование са^-транспортируЕшх систем клетки, принимающих участие в генерации са"+-сигнада при актива-

muí рецепторов гормонов. Показано, что изменение [Са^Нп проявляет МЭИООЛё9 ВЫСОКУЮ ЧУВСТЕЯТеЛЬКОСТЬ К действию Т4 in Vitt'ü, эффекты обнаруживается при концентрации гормона 1-Ю нМ.

Полученные результаты позволяют считать, что перёичныя рецеп-тор-опосреяоБаннкн гормональный эфккт заключается в модификации кальциевого гомеостаза, сопровождала госл увеличением Са~+-пула плазмалешы тимоиитов и перераспределением Са2- между ЭР и !■'./. Подобное перераспределение Са~-, посредством которого гормоны осуществляет свое воздействие в концентрациях, близким к Физиологическим, возмодао. является первым этапом в цепи последующих эффектов этого гормона.

Согласно экспериментам с применением различных ингибиторов, Са~-*-зависимь!е протеинкиназы у кн принимают участие в повышении [Ca'^in в тимоцитах при действии Т4. Полученные результаты свидетельствуют в пользу участия арахидоковой кислоты или ее продуктов в Формировании Т4-зависимо го са*>-ответа тишцитов. Участия цАМФ-зависимой протеинкиназы при этом не обнаружено.

ГК вызывал снижение CCa~+iin посредством блокирования Са'^-ка-налов плазмалемыы. что сопровождается посмемуижм выходом Са'^ из ЭР и поглощением его в MX. Установлен дозозависимый характер влияния ГК на энергетику тимоиитов. Высокие концентрации и длительное действие ГК вызывают угнетение энергетического метаболизма MX тимоиитов, кратковременное действие ГК in vivo, так же как и низкие концентрации ГК in vitro, вызывают стимуляцию транспорта пирувата и его окисления и тормозят окисление глюкозы.

Няуино-практичйскпд значение nafinm • Проведенные исследования вносят определенный вклад в представления, о гормональном механизме генерации рецептор-зависимого Са^-сигнала ■ в тимоцитая. Результаты работы могут быть использованы в исследованиях механизма управления такими процессами как пролиферация и секреция, в которых роль основного вторичного мессеняжера выполняют ионы Са£% в Фармакологии в качестве схема гормонального .влияния на гомеостаз са:-+ в клеткам иммунной системы для направленного тестирования гормональных аналогов и при поиске природных иммуности-

мулятсров, т.к. показано, что агенты, вызывашие увеличение проницаемости ли!лЮидных клеток для Са^-*. играют ключевую роль в активации ответа этих клеток.

апрппапия гуг^тн и пупдмкяпмм материалы диссертации были доложены на научной конференции Института Физиологии и биофизики АН FV3 "Структура и Функции биологических мембран" (Ташкент, 1994), на конференциях молодых ученым биолого-почвенного Факультета и научных семинарах кафедры биофизики ТашГУ. По материалам диссертации опубликовано..." статьи и... тезиса.

структура л»ггрт-анм;<- Диссертация состоит из введения, обзора литературы С гл. I), описания материалов и методов исследования С гл.II). изложения полученный результатов и ик обсуждения С гл. Ш). заключения, выводов и списка цитируемой литературы С251 ссылок). Работа изложена на... страница* машинописного текста, включая 32 рис. и 2 таблицы.

МАТЕРИАЛЫ,И МЕТГШ Эксперименты проводили на тимоцитах беспородный белых крыс С150 г.). Тимоимты выделяли по методике, описанной Grinsteln et al. с 1934), в среде А. содержащей 4.6 мм КС1. 145 мм Nací. 8 мМ MOPS, 1 мм Kf-fePO-i. 10 мм пирувата Na, i мМ caci£ с или без него): рн 7,4. Бескальциевую среду получали добавлением 2мМ ЭГТА.

Измерения ССа^*]in и количества мембраносвязанного проводили спектроФлуориметрически с помощью Флуоресцентных зондов Fura 2/АМ и хлортетрашклина (Tslen et al.., 1S32, 1989; Rink et. al.. 1932; добрешз и др.. 1939). Дыхание тимоцитов регистрировали в среде выделения при ,37°С с помощь» кислородного электрода Кларка (Мохова и др.. 1937).

В экспериментах in vivo крысам внутримышечно вводили тироксин CT'i) в доза 200 мхг/кг массы животного ежедневно в течении 7 дней иди ГК в дозе 20 мкг/кг массы квотного ежедневно в течении 6 дней (длительное воздействие ГЮ, за 3 ч. С кратковременное воздействие ГК) или за 72 ч. (однократное введение) до. забоя. Контрольным крысам вводили растворитель. В экспериментах in vitro т.-.иоцита, когда указано, инкубировали в среде А с 1-100 нМ Т4 в

течение 30 мин: или с ГК в дозе 0,1 или i мкМ в течение 60-1 '¿о мин. Условия содержания и кормления животных соответствовали нормативным (Лоскутова. 1990).

результаты чкгпррммрнтпя и ну пкгуждгние 1 дттяр.нгиныд ияряк-геп йпиянмя гипткпптотпмд на

чнрпгртычргк-ий мртдЯпт-пм тнмпии-iyir кт>ыГ-Влияние ГК на энергетический метаболизм тимоцитов носило дозо-зависимый характер, т.е. определялось временем действия и количеством гормона. Однократное введение ГК in vivo за 72 ч. до забоя вызывало стимуляцию дыхания тимоцитов при разобщении окислительного (Юсфорилирования СОФ'). Кратковрешнное-действие ГК ' (однократное ведение ГК за 3 ч. до забоя) вызывало стимуляцию окисления пирувата без признаков разобщения ОФ. Результаты преинкуба-ции тимоцитов in vitro с ímkM ГК сравнимы с данными, полученными в условиях кратковременного введения ГК in vivo (табл.1).

Преинкубация с 10 мкМ ГК 1л vitro не стимулировала дыхания, и его скорость при окислении пирувата у контрольных и опытных проб была примерно одинаковой (табл.1). Присутствие олигомшша практически не изменяло исходной скорости окисления субстратов, а днф не вызывал стимуляции дыхания у ГК-обработанных клеток. Присутствие сукцината значительно стимулировало дыхание клеток, свидетельствуя о повреждении плазмалеммы и цитотоксическом задекте ГК.

Известно, что длительное действие ГК оказывает штотоксичес-кое действие, вызывая апоптоэ (Terri et al,1987). При длительном действии ГК скорость окисления пирувата (табл.1) была ниже, чем в контроле, олигомицин практически не ингибировал дыхание, а в присутствии ДНФ наблюдалась меньшая стимуляция, чем в контроле, что указывает на значительное разобщение OD и уменьшение активности дыхательной цепи.

Хорошо известна роль ГК в стимуляции глкжонеогенеза в клетках печени и повышении концентрации глюкозы в крови с Hassan et al..iS86: Корнева и др., 1933). Введение ГК за з часа до забоя и псеинкубация тимоцитов с 1 мкМ ГК вызывали ингибирование дыхания тимоштов при использовании глюкозы как субстрата окисления. Если

- б -

Таблица 1: Влияние ГК в условиях 1п уп-о и 1п vit.ro на энергетику тимоцитов крысы.

n вариант Усубстр. Уолиго. 40« - УДНЩ 80л 120*

1. контроль 16*0.07 4*0,03 25*0.06 35*0,03 21*0.20

о ГК 1 мкМ»* 25*0.22 5*0,27 36*0.30 19*0,70 5 ¿0.34

3. ГК 10 мкМ** 19*0,50 19*0.4 19*0. 44 19*0.12 19*0.38

4. ГК 20 мкг/кг м.

однокр. 3 ч.«*к 27±0.54 5±0.60 39*0,71 18*0.98 6 *0,73

5. ГК 20 мкг/кг м.

однокр. 72 ч. »-»к 27±0.20 19*0.1 27*0, 25 39*1.01 20*0,70

6. ГК 20 мкг/кг м.

ежедневно, 6 я. 5 ¿0.30 5*0,23 8 ±0,35 12*0.46 12*0,23

ПРШЕЧАНИЕ: в табл. пюдстаалени еоедние значения из 6-7 экспа-' скментое ± станлаогные отклонения. V - скошеть дыкання С в нг-атом О/мин н 100 млн клеток), субстоат окисления - 10 мМ пи-1 руват. рН 7. Л. Свела инкубашш: см. Методы. Добавляли олигоми~(' иина О. г мкг/мд. м - указаны конечные юэни-ии мкМ. |

** - пгаинкубаиия тимоцитов с ГК 20-40 мин. ' |

мм« - воемя между введением ГК и забоем животных.

Таблица 2: Влияние 1-кратного введения ГК животным С20 ыкг/кг | за 3 ч. до забоя) на энергетику тимоцитов в средак с различными субстратами сем. Примечания к табл.1). :

Группа животных субстр. ОКИСЛ. УСУбСТР. Уолиго.

40« 80» 120«

Норма Норма ГК ГК пируват глюкоза пируват глюкоза 16*0.12 17*0,34 25*0.03 12*0.63 4*0.44 6*0.03 5±0.02 5*0.97 25*0.06 23*0.32 36*0.69 20*0.74 35*0,15 29*0,32 26*0.92 25*0,37 21*0.11 23*0,28 18*0,23 21*1.20

ПРИМЕЧАНИЕ: субстоат окисления 10 мМ пиоувата На или глюкозы:

к ГК-стимулироаанным тимоиитами in vivo или in vitro еносили гш-руват. то дыхание тимоиитов усиливалось (табл.2). свидетельствуя о росте скорости потребления кислорода без признаков разоошенил ОФ. Полученные данные подтверждают предположение о том. что гк модулирует транспортные процессы на уровне плазматической и MX мембран, блокирует транспорт глюкозы в клетку, не препятствуя транспорту пирувата в тимоииты и его окислению в MX.

9. Дрйгтвчр ГК 1 n vlt.r-r» на р5гш:рлз.ярн1;р ырнппанпр-гаг-^ ч U7MPHPHHP f rsg^l iя тимпштац мг

Вызываемые глякокорггикоидами изменения в состоянии меыбранос-вязанного са;-> могут лежать в основе действия этих гормонов С орлов и др. .1985). Согласно нашим данным, ГК оказывает стимули-рушее действие на связывание са2^ плазмалеыыой тимоиитов. которое усиливалось в присутствии 1мМ саО.2, что обусловлено переходом внеклеточного Св мембраносвязанное состояние.

Увеличение количества мембраносвязанного Са-- в плазмалемда под влиянием ГК может бьггь результатом активации кальшй-связы-вагацих белков и С или) бюгочения в этот процесс системы белков трансмембранной передачи сигнала (например, G-бежов) СGukovskaya,199i: Isekl et al.,1393). Нами было показано, что КМ-зависимые процессы в присутствии ГК инактивированы до такой степени, что блокаторы КМ не оказывают видимого действия на Са^-пул плазмалеммы. Оценивая активность G-белков in vitro, показано, что ГК стимулировал ее уже до действия A1F4-. Это свидетельствует о возможности рецептор-опосредованного механизма действия ГК на определенную часть Са^-пула плазмалеммы.

При последовательном добавлении ингибиторов Са-АТФазы. ЭР и ингибиторов дыхания MX нами показано.' что Ca'¿\ выходящий из • рети-кулума при блокировании са-АТФазы, накапливается в MX, и. наоборот, Са^-, высвобождаемый из НХ. аккумулируется в ЭР С рис. la) . MX принимает участие в регуляции tCa^]in в качестве "краткосрочного" Са'^-депо, когда при повышении [Ca'<Hin внутрймитохон-дриальный уровень ССа«+} также увеличивается, "что сопровождается усилением дыхательной активности, вследствие модулирования актив-

шсти системы Н^/Са2-*-обмена (Klmberg et al. Д967.1968), 0,1-1 mícM ГК способствует накоплению Са2+ в МХ, при этом увеличение ССаг-Ч в МХ в наших экспериментах обусловлено мобилизаций Са2+ из внутренних компартаентов, о чем свидетельствует снижение содержания Саг- в ЭР или кальциосомая (рис. 1), сопровождаемое ростом С ca^Jm (Духанин, 1988). наблюдаемые эффекты ГК на состояние МХ пула Са^ в условиях ln vltro в целом совпадают с эффектом кратковременного действия ГК ln vivo на энергетику тимоцитов.

Влияние ГК на интенсивность «Ьпуооесиениии ХШ пои использовании ингибитооов Са2*_пулов МХ и ЭР: а — пеозоас-пседеление мембоаносвязанного* Са2* в лазнтооле: б - в по«-. сутствии 1мкМ янтимшина А (Или сотенон 0.33 мкг/мл * 1 икМ олигомицинаЭ: е - пои добавлении 0.5>М ванапата или ■ ' >.0 мкМ БН0.1 - Контиоль'. 2 - * 0.1 юсМ. ГК. 3 - * 1 икМ ГК. . ..

Ряд авторов предполагает, что ГК-зависимый . апоптоэ связан с ростом £ Са2+] хп эа счет его освобождения из ретикулума (Нази еЬ а!.,1991: 1иа1а е1 а1.,1994), другие - что этот процесс может происходить в. отсутствие '¡»ста £Са2+н„ и что в первые часы инкубации увеличение I Са^ хп после, добавления ГК не является • обязательна условием реализации 'его зфхектов СВии.еаге1Ъ е1 а!., 1933). Из рис. 2а показало ГК-зависимое уменьшение [Са'^Ьп тимоцитов от уровня покоя. В течение ю и более минут происходило восстановление прежнего уровня [Са^Нп тимоцитов и затем незначительна* рост £Са*>] Енесение в среду инкубации 2 мМ ЭГТА

¿НИН»

. . CL.

. 5.

é

Рис, i <а,б,в).

или 0.1 мм ионов приводило к исчезновению картины гк-зависи-мого снижения [Са^Пп. Однако в присутствии 6локатора са--~кана-лов или ЭГТА незначительные колебания [Cas;-)in становятся незаметны. они исчезают таске на Фоне роста [ Саг>]ш в присутствии i мкМ SH-реагента тимеросала - инактиватора рецепторов плазмалеммы СТрепакова и др., 1394)).

Снижение С Са~-]iп при действии ГК может быть опосредовано либо вьиодом из клетки, котя нет показаний в пользу ГК-актива-ции Са-АТОазы плазмалеммы (Tienrungroj et al.. 1937). либо входом цитозольного Са:;- в сётикулум С что невозможно в присутствии BKQ или ванадата) или в ИХ. которые обладают более низким сродством к и в этик условиях eco не аккумулируют CCarafolí, 1983). либо блокированием са^--каналов плазмалеммы. что влечет за собой снижение уровня [Ca£-]in. При этом последнее предположение подтверкдается результатами, полученными при блокировании Сай~-каналов ионами Ni'2" CRink. 1990). В присутствии [Са^-] ^-повиша»-мин агентов Сиономишна, Кон A. EHQ или ванадата) ГК снижал tCa^-Jin на 50% (рис. 2а), что также указывает на гк-зависимое блокирование входа внешнего Са^-.

Если ГК блокирует са^-шшы плазмалеммы тимоцитов со снижением 1СаР+] in, то вслед за блокированием поступления внешнего Са:> может идти освобождение са2- из внутриклеточных (не-МХ) пулов. необходимое для поддержания са?---гомеостаза клетки, и вслед за этим - незначительный рост íCa^-lin.

Внесение ингибитора ФлАз (10 мкМ бромФенацилбромида (БгРЬВг))' в среду инкубации перед ГК вызывает резкое снижение уровня CCa^-lin. т.е. блокирование ФлАг стимулирует действие ГК на' систему снижения ГСа"-]1п на'уровне плазмалеммы тимоцитов. Известно, что активация ФлА?. вызывает освобождение арахидоновой кислота (АА). которая стимулирует рост ГСа2-] in (Трепакова, 1994). По-видимому. ГК и продукты окисления АА оказывают диаметрально противоположное действие на систему транспорта Са:'~.

В пользу гк-зависимого блокирования Са;>-каналов свидетельствует и тот Факт, что после добавления ГК ни Кон А. ни АЛ яе вызывали обычного прироста [Са^Нп, а прирост ССа^'-] tn при до-

бавлении EHQ после ГК был ниже, чем в контроле с рис. 26). Этот процесс, возможно, опосредован изменением активностей протеинки-наз (Hoeck et al.,1993: Pallogiannl et al.,1993). Не исключается и путь действия ГК через модулирование функционального состояния (^--активируемой протеинкиназы С (ПКС) посредством блокирования работы ФЛА2 С Koste1low et al.. 1993). Блокаторы Са2--зависимых протеинкиназ в наших экспериментах не оказывали видимого влияния на Фоыирование ГК-индуцируемого са^-^-ответа, что не исключает

0.1 мМ еаналата) + i мкМ ГК; 2-10 нМ иономшшна t tono.) - 1 мкМ ГК: 3-20 мкг/мл Кон А - 1 мкМ ГК: 4-1 мкМ ГК: Б) под действием: 1-10 мкМ ВНи. 2-1 мкМ ГК ♦ 10 мкМ EHQ: 3-5 мкМ АА: 4 - 20 мкг/мл Кон А: 5 - 1 мкМ ГК * 5 мкМ АА: в - 1 мкМ ГК -<■ 20 мкг/мл Кон А.

участия в этом процессе других изоформ ПКС (Akimoto et al.. 1994).

Поскольку ГК стимулирует кальмодулин-зависимую аденилатцикла-зу CALI) и увеличивает содержание u/У-ю в тимоиитах крыс (Сергеев и др. ,193?), возможно, что процесс блокирования Са2--каналов обусловлен ростом [цдМФНп. Увеличение уровня СиАМФНп сопровождается ростом активности протеинкиназы СПКА). которая способна ФосФо-рилировать ФЯС-ваша и ингибировать образование 1Рз по принципу обратной связи, снижая ССа^Нп, что опосредовано G-белками (баппоп, 1990). Однако вопрос о возможном ГК-зависимом блокирова-

нии Са£~-каналйв тимоцитов посредством увеличения продукции иА№ подлежит дальнейшему исследованию, т.к. стимуляция ПКА в нашия экспериментах форсколиком и присутствие дибутирнл-иАЧ'й не йказы-вали видимого влияния на rK-зависимкй Са2+-сигнал.

зг лрйСтвир .тироксина in vit.ro на оаспсрпелрнир измвганпсаячаинп-rn rag- и ичмрнрнир íCaZ-lir, r тиноиитач крыс, Согласно нашим данным. Т4 оказывает стимулирунцее действие на связывание Са^- плазмалеммоп тимоцитов. которое усиливалось в присутствии 1мМ CaClg в связи с перекопом внеклеточного Са^- а мембраносвязанное состояние. Рост-количества са2-. связанного с плазмалеммой. под влиянием Т4 вызывает активашш Са2-~транспорти-рушик систем, в частности - Сз-АТФазы плазмалемм С Segal. 1939) или Са^-связыващин белков СКМ-опосредованнке эффекты Т4 С Wor n i с et al..1988)3. По-видимому, усиление ингибирунцего действия бло-каторов КМ - трифтазина или R24 С рис. За) связано с активирующим действием Т4 на КМ-зависимые процессы транспорта са^-. в среде без Са"<> реакция на ингибиторы КМ не обнаружена.

Т4 стимулирует активность G-белков. вовлеченных в процесс активации аденилатциклазы CAU) CMalbon eL al., 1988). Вместе с тем. Т4-зависимая стимуляция активности ПКС по Са^--зависимому механизму CMeler et al.,1991) не исключает участия в этом процессе G-белков. сопряженных с активацией фосфолипазы с и. следовательно, ПКС. Согласно нашим данным, после инкубации тимоцитов с 'Т4, A1F4- (активатор G-белков. стимулирующих ПКС CCoggeshell К. & Altman А., 1939)). проявлял свое влияние .в меньшей степени. По-видимому. Т4 стимулирует активность {^белков, вовлеченных в стимуляцию ПКС в тимоцитах, уже до действия A1F4-. что указывает на возможность рецептор-опосредованного механизма действия Т4 на определенную часть Сз^-лула плазмалемш. проявляющую чувствительность к тиреоидным гормонач в условиях in vitro С рис. 36).

Известно действие Т4 на состояние Са~--транспортирушин систем изолисованных MX и ЭР СТуракулов и др. ,1980: Crespo-Armas et al.. 1933) - кальциевых депо, накапливавших Са<> и препятствуших избыточному росту [Ca^-lin в тимоцитах CGukovskaya et al., 1936).

Нами било, показано, что в клетках, обработанных Тц. наблюдалось более, кнтенсиыгое по сравнению с контролем снижение ХЩ-Флуоизс-ивнши в присутствии ингибитора дыхания 1 нкМ антимицина А или смеси: 1 мкМ олигомиии.ч + 0,33 мкг/мл роте нон. Т.о.. при тиреоид-ноа стимуляции клеток МХ способны активно накапливать Са5^ на фоне стимуляции дыхания.' восстанавливая прежний уровень ССа^-Нп. Присутствие Са-- в среде инкубации способствует его накоплении в мембранах МХ. причем Т4 усиливает этот процесс, возможно, вследствие увеличения С Са2^^ Последнее может быть обусловлено как увеличением а.чода в клетку, так и мобилизацией са^ из внут-

Влияние T-Í на интенсивность хтц-Ои1Уос<зеиенции: а> пои добавлении 3 к км к.альмиаззолиума cRí:4j (или 0.1 мм тсиФтази-на>: б) пси добавлении A1F4- (.AiF4~ поименяли как смесь 5 иМ NaF - £5 мкМ А1С1з). 1 - Контроль. 2-1 нМ Т4. 3 - 10 нМ Т*4. Добавляли 10 мкМ ЬНО для описейления заполненности внутсикл*?точных немитохондсилльных Сэй--пулов.

ренних немитохондриальных компартментов.

Лзйствие Т4 на величину не-мх са^-пула. согласно нашим данным in vitro, было разнонаправленным и зависело от используемой дозы ~4. У^нулаине количества мембраносвязанного са^ в не-мх пулах тимооитов вьйзлялось в присутствии ингибиторов са-АТФазы ЭР с соответствуашм выходом саг> в интозоль. регистрируемом как сни.чазкие хти-сшусресценши (Лобреиов :i др. ,1930). Добавление ю

ни Т4 без инкубации стимулировало сокращение Саг--пула ЭР. Этот зФФект Т4-зависимого уменьшения Ой^-пула ЭР проявлялся .или только е перзые минуты, или после 30 мин. инкубации с i нм Т4. В условиях in vitro этот э&Тект являлся одним из наиболее чувствительных к действию гормона в диапазона физиологических концентраций. Действие Гц в дозах более Ю нМ в течение 30 мин инкубации, напротив, вызывало рост размеров исследуемого пула, наши результаты свидетельствуют в пользу снижения активности са-АТФззы ЭР при действии близких к Физиологическим доз Т4 в первые минуты инкубации с или в условиях преинкубаиии с 1 нМ Т4). что приводит к освобождению сай" из ЭР, возможно, по 1Рз-зависимому пути. При 30 мин. инкубации тимоиитов со 100 нМ Т4 наблюдался противоположный эФИект, сопровождаемый активацией са-АТоазы ЭР и ростом количества мембраносвязанного Са^. При увеличении [ Т4] (> 100 нМ) амплитуда изменений ХТЦ-Флуоресшнции не менялась.

Можно предположить, что Т4-реиептор генерирует некий долгожи-вуиий интермедиат ->1Рз. "1Р4 или др. CNlshl2uka.i934), который стимулирует вход Са^- в клетки. С другой стороны не исключено, что опустошение внутриклеточного депо индуцирует са^-зазисимьй вход Ca«- сGukovskava et al.,ISSO). спустя некоторое время, избыточный рост CCaii^Jin способствует реаккумуляции Ca-*- в ЭР и активации Са-Атоазы плазмалеммы. т.е. служит сигналом для включения ряда механизмов поддержания кальциевого гомеостаза (Segal. 1988: Зинченко и др..1991). Стимулирующее действие Т4 на дыхание MX может осуществляться через увеличение С Ca-'J in с последующей аккумуляцией сгР+ в мх.

На рис. 4а показано Г4-зависимое увеличение CCa^Jm ти'моци-тов, регистрируемое по Флуоресшнцш Fura-2AM. от уровня покоя í 115 ± 5 нМ) до уровня 350 ± 50 нм. На этом уровне [Ca^Jm держится несколько минут и затем возвращается к исходному уровню, по-видимому, за счет стимуляции Са-АТФаэы плазмалеммы и 'других механизмов (Segal.1939: Davis et al.. 1993). Возможно, что 74 вызывает двухфазный по кинетике Са^~-емгнал: первая Фаза транзитного всплеска не наблюдалась из-за аккумуляции сар--, Еыбоаскзземо-го из ретикулума. вш, а стационарный рост хорош заметен, он

исчезает в присутствии 0.1 мм (блокатора Са2--каналов). 0.1 мМ ЭГТА или в бескальциевой среде. Действие Т4 на рост [Са2+Ьп было дозозависимым, достигая максимума при 0,1 мкМ гормона.

По-видимому, Т4 открывает рецептор-зависимые или са2+-управ-ляемые са2--каналы ллазмалеммы, т.к. в наших экспериментах наблюдался дополнительный рост ГСа^] после опустошения внутриклеточных Са2--пулов С рис. 46), когда в результате блокирования са-АТФэзы ЭР рост ССа2-:Нп мог осуществляться только за счет поступления внешнего поскольку мх в условиях роста [Са2+]1П. после блокирования са-АТСазы ЭР, не только не освобождают но, напротив, способствуюгг снижению Г Са2+]1П сзинченко,1992).

Чтобы оценить вклад Са2^-зависимых протеинкиназ в активации са*>-сигнала при гормональной стимуляции, мы использовали их спе-шфические блокаторы (Н1с1ака е1 а1.,1931). т4-эависиыый прирост цитозольного Са2^ блокировался ингибиторами протеинкиназ: стау-роспорином (515р), Н?,СТрелакова. 1994) или неошцином (ингибитор Соахолипазы С СФЛС) (АИшап е1 а1.1990)), что указывает на пря-

тооль). 2-3 мкМ Я24 » 0.1 мкМ Т4. 3 - 250 нМ стауооспо-шна СЭСгр) (или 200 иГ1 Н?) + 0.1 мкМ Т4: 4 - Т4 в ¿ис-СаЯ* среде; б) при последовательном добавлении: 1) -10 мкМ ВИЗ и О. I мкМ Т4; 2) - 10 мкм ВНО * 250 нМ стаурос-поринэ С5г5р) Сили 200 нМ Н7." или 3 икМ 1324) »0.1 мкМ Т4.

-

мое вовлечение' ПКС, ситемы гидролиза инозитфосфэтов и друг !• Са^-заеисимых протеинкиназ в генерацию Са^'-сигнала от т4-рецем тора С рис. 43. Об этом же свидетельствует и тот факт, что Та почти полностью блокирует Са2--ответ клеток на Коп А. В свою оче редь. Коп А блокирует т4-сигнал только на 50%, что возможно, ее ли передача сигнала от т4-реаептора идет по. нескольким путя».-С рис. 5). Рост Г Са2"*] т под действием т4 был сравним с действием Коп А, который, как предполагается, вызывает рост ССаг+Пп через систему гидролиза инозитфосфатов САИтап е1 а1.,1990).

Возможно, что Т4 не является непосредственным регулятором работы са2ч-каналов. а осуществляет свое влияние через посредников, роль которых могут играть АА или продукты её окисления СНок1п еЬ а!..1985), инозитфосфаты СЕегг1с1ее.1987), са^-зависимые протеин-киназы или их продукты С N15111 гика. 1934), а возможно и комбинация мессенджеров. В наших Экспериментах дополнительного роста Са^* после действия блокагоров Са-АТФаз ЭР не наблюдалось, если перед т4 были добавлены ингибиторы метаболизма аа: нордигидрогуаретико-вая кислота (НИЗА) - ингибитор липоксигеназного пути окисления АА, ВгРЬВг - ингибитор ФлА2 или ингибиторы Са^-зависимьи протеинкиназ и ФосФолипаз с БЧор. н?, неомииин). ПИА и иАМФ в данном процессе, по-видимому, не участвуют, т.к. этот сигнал не блокировался добавлением цАНФ-повышиаик агентов СФорсколина или дибута-рил-цАМФ).

Поскольку в передачу са^-сигнала по системе инозитфосфатного гидролиза через Са^-УКМ-зависимую протеинкиназу вовлечен КМ С №11 е1 а!.. 1988: Кондратюк: и др..1988), нами было исследовано ' влияние блокатороа КМ трифтазина и кальмидазолиума Сй24571) на рассмотренные выше эФ1екты т4. На рис. 4 показано блокирование ингибиторами КМ Са^-сигнала при действии т4. что указывает на участие КМ в Формировании клеточного ответа.

Известно стимулирушее влияние тироксина .СУШауегйе е1 а1..1993) и АА СА1опго е! а1..1990) на развитие различных видов иммунных ответов лимфоцитов. В реиептор-зааисимых процессах, сопровождающихся ростом ['Саа*]1п часто наблюдают освобождение АА и

продуктов ее окисления, повышение активность ФлАг и липоксигена-зы. Ряд метаболитов липоксигеназного пути окисления АА. в свою

очередь, может активировать рецептор-зависимый вход Саг* в клетку. возможно, открывая са^-каналы CDettbam et al. .1993). Гипер-тиреоз в мембранах клеток крови приводит к увеличению содержания ненасыщенных сжк (Foss el al.,1990), в тон числе - и АА. Наш было показано, что рост ССа:>] ¡.п при действии Т4 почта полностью блокировался внесением ингибиторов метаболизма АА CBrPhBr .или NDGA). По-видимому! в развитии Т4-зависимого роста [Са^-*] in принимают участие продукта метаболизма АА, поскольку сама АА лишь на 50% ингибировала Т<-индуцируемый Са2--сигнал. что возможно в случае передача сигнала от Т4-рецепторов по нескольким путям.

К числу потенциальных регуляторов входа саотносится и uAMO-зависимая лротеинкиназа спка) (Seamon et al.,1931). Судя по полученные начи данным, в формировании роста [Сая-нп тимоиитов в ответ на добавление Т4 ни ПКА. ни АЦ не принимает непосредственного участия, т.к. действие цамф-повышших агентов, Фоссколина или проникающего аналога цАМФ (дибутарил-цАМФ), не влияли на величину Т4-зависимого клеточного ответа.

Поскольку ТГ стимулируют рост С цам'м in С Segal. 1937) и рост CCa^^lin. возможно, что Т4-реиептор сопряжен с двумя эФОекторны-ш молекулами - флс, обеспечиващеи рост [са2-*] in. и с АЦ. обес-лечивашей рост luAWMin- В этом случае Т4-рецептор сопряжен с двумя G-белками: Go, связываиаим Т4-реиептор с ©лс. и с Gs, связывающим рецептор с 'АН." Следовательно, .рост [намфЬп и рост

СС(хЗга,нК.

ЪООг

Рис.5 Изменение сСаЗ-Нп под действием: 1) - 5 мкМ АА: 2) 20 мкг/мл Кон А [Трепакова Е.С.1: и при последовательном добавлении: 3) - 5 мкМ АА + 0.1 мкМ Т4: 4) 20 мкг/мл Кон А - 0.1 мкМ Т4.

100

ССа^Нп в тимоцитах может идти одновременно и. возможно, независимо. вызывая активацию тамоиитов в различных направлениях.

Известны как взаимоисключающие механизмы действия СцАМФНп и ССа'^-Ьп САНгаап е1 а1.. 1990). так и их синергичный эффект С01ег е1 а1., 1984). Основываясь на результатах наших экспериментов, можно полагать, что при действии Т4 рост этих внутриклеточных посредников в цитозоле тамоиитов связан не взаимоисключающим образом. Пседставляется# вероятным. что повышение уровня СиАМФНп идет вслед за увеличением ССа2-Нп. и даже [цАШт по принципу обратной связи снижает [ Са^'31п. обеспечивая его гомеостаз.

пакшчкнмк

Полученные нами данные позволяют считать, что действие ГК и Т4 на ССа^Нп. а также на специфику распределения мембраносвязанно-го са%* является рецептор-опосредованным процессом и связано с влиянием на са^-каналы плазматической мембраны. Именно этот эффект гормонов лежит в основе их модулирующего действия на процессы активации тимоиитов различными агентами С горюны, митогены и др. >. Передача сигнала от рецепторов гормонов осуществляется по нескольким Ферментативным путям через ряд посредников на Фоне множественной картины механизмов их влияния.

В формировании са'^+-сигнала приминают участие, по крайней мере. шесть Са^-транспортируших систем, локализованных в плазма^ , тической мембране, мембранах ЭР и мх (Лев1щкия.1990).

Потенциальными посредниками действия Т4 и ГК могут быть системы трансмембранной сигнализации - б-белки, КМ и Сай+-зависимые протеинкиназы. Действие Г4. по-видимому. • опосредовано. с 'одной стороны, стимуляцией ФЛС, ПКС и гидролизом инозитФасФэтов, а с другой стороны, не исключено участие Т4 в активации ФлА2. Дэй-ствие ГК, в свои очередь, может осуществляться посредством модулирования Функционального состояния ПКС через блокирование активности ФлАй- Непосредственного участия ПКА и.изменений ГцАМФНп в рецептор-опосредованном действии исследованных гормонов не обнаружено, хотя показано их стимулирующее действие на рост С иАМФ]1п тимоцитов СМа1Ьоп е1 а!.,1933).

Ингибкторныя зФСект ГК на рецептор-зависимые Cat-*- каналы сопровождается первоначальным снижением tca2-)in, что вызывает освобождение Са2- из ЭР и последушуи аккумуляцию его в MX. показано стимулирущее действие ГК в низких концентрациях на рост меыбра-носвязанного Сай- в рлазмалемме тимоцитов. транспорт пирувата и его окисление в MX. Модулируэдее действие гидрокортизона на транспортные процессы на уровне плазматической и митохондоиальнын мембран тимоцитов сопровождалось торможением транспорта глюкозы. При длительном действии гидрокортизона in vivo и высоких его концентрациях in vitro наблюдалось угнетение энергетического метаболизма тимоцитов •

Стимулирукиее действие Т4 на рецептор-зависимые Са2+- каналы и рост С Сэ^тЗ in может происходить различными способами: 1) при непосредственной активации рецептор-зависимых Са^-каналов - возможно, что Са^-канал непосредственно сопряжен с рецептором через G-белки (Pfafflnger et al.,1935: Eerridga.1987): 2) при активации Са^-каналов ионами Саа-. освобождащимися из ЭР по 1Рз-за- . висимому механизму при участии G-белков. ФЛС и ПКС, что. вероятнее всего, согласно гипотезе Putney (1986). в рамках которой 1РЗ-чувствительный пул Са^ связан с экстраоеточным пространством: 3) посредством образования других, неизвестный мессендже-ров, действ у шин независимо или сапрягатт выше перечисленные пути. Первичное повышение ICsfi^l ш может активировать КМ. а следовательно и КМ-зависимые поотеинкиназу и протеинфосфатазу, баланс между активностями которых может поддерживать колебания активности Сай--каналов и уровня "tCa2*jin cHess et al., 1893), Са-'АТФазу плазмалеммы и вход СгР-* в MX, при этом меняется активность некоторых Серментов ОФ. наблюдается стимуляция разобщенного дыхания (Brand et al.. 1994) и реаккумулядоя Са** в ЭР. Действие Т4 сопровождаете^ ростом количества мембраносвязанного в плазмалемме тимоцитов и перераспределением между MX и ЭР в зависимости от дозы гормона.

Механизм передачи сигнала в тимоштаи зависит от концентрации стимула, что наиболее четко проявляется в способности стимула мобилизовать са'-> из внутриклеточных структур. Одно иэ возможных

объяснения такЬй зависимости состоит в предположении наличия механизмов уменьшения сродства рецептора к агонисту, другое - в наличии двух типов рецепторов в клетках для гормонов, сопряженных с несколькими путями сигнализации САИтап et а1.Д990).

Еыше упомянутые процессы предшествуют событиям, происходящим на нуклеарном уровне, сопровождающимися экспрессией генов при гормональной стимуляции и последушей трансляцией. По-видимому, модулирование активности систем ионного транспорта является первым этапом в цепи последующих гормон-зависимых процессов и является общим механизмом рецептор-опосредованной сигнализации.

со.1* ге> " " -

;Рис. в: Предполагаемая схема регуляши ткроксин-активи-руемаго входа. Са2«- в тимоииты ' Сокоашвнияг Т4 - тироксин: R - рецептор: G _ ГТФ-гидоолиэушиа селки Со - активноушие ФДС: в - активирующие ALI); ТПК - тиоо-чи. новая поэте кнкиназа; ФЛС - Фосеолипаза С; IP3 - инози-тол-1.4.!5-токсФосФзт: ЛАГ _ диаиилглмиесол: КМ _ кальмодулин; Clf

- Фактоо входа Са2-; AU - аленилатиик^аза: ПКА - цА1№-элвислмая позтеинкиназа: КМ/ПК - кальмодулин-зависимая Псотеинкшаза; КМ/пь

- кальиодулин-завкскмая лиотеинфоогатаза: АА - аоахи до новая лота; ПКС - поонэинкиназа С: Фла2 _ Фосоолипаза'д2

кис-

-гона основе полученных данных предложена гипотетическая схема гормональной регуляции рецептор-зависимого входа caz* в тимоциты и сопутствующих этому процессов ( Рис.6), многие участки предложенной схемы подлежат дальнейшему уточнении. Молекулярный механизм регуляции входа Сг2"* в нееозбудимые клетки - не вполне ясен, котя обнаружены рецептор-зависимые са^-каналы 'лимфоцитов, которые по своим характеристикам отличаются от каналов электровозбудимых клеток С Кто, 1936; Gardner et al., 1933).

ВЫЕОШ

1. Влияние ГК на энергетический метаболизм тимоцитов дозозави-симо. определяется длительность» воздействия и количеством гормона. Высокие концентрации и длительное действие ГК вызывают угнетение энергетического метаболизма, кратковременное действие ГК in vivo и низкие концентрации ГК in vitro стимулирует- транспорт пи-рувата и его окисление, тормозят окисление глюкозы. ГК модулирует транспортные процессы на уровне плазматической и митохон-дриальных мембран, блокирует транспорт глюкозы в клетку, не препятствуя транспорту пирувата и его окислении в МХ. Эффекты длительного действия ГК не зависели от природы субстрата окисления.

2. ГК оказывает рецептор-опосредованное действие на. увеличение Са^-пула плазмалеммы тимоцитов, которое сопровождается перераспределением ионов са2- между внутриклеточными компартментами. Вызванное ГК увеличение [Сак?3 в МХ обусловлено мобилизацией са2+ из внутренних не-митохондриальных компартментов. о чем свидетельствует снижение содержания C¿¿¿+ в ЭР. • ,

д. ГК вызывает рецептор-опосредованное снижение [Ca'^rlin в тимоцитах путем блокирования Са^-каналов плазмалеммы, о чем свидетельствует снижение саг~-сигнала от агентов, повышащих ССа^+]т за счет входа внешнего ей2*.

4. Т4 оказывает рецептор-опосредованное действие на увеличение са2--лула плазмалеммы тимоцитов, которое сопровождается перераспределением ионов Са» между внутриклеточными . компартментами, в частности, шжду ЭР и 'МХ. подобное перераспределение Са'г+, посредством которого Т4 осуществляет свое воздействие в концентрациях. близким к Физиологическим, еозшжно, является первым этаном в цепи последующих эффектов этого гормона.

5. Т4 стимулирует вход Caz+ в тимоциты при одновременном подавлении рецептор-зависимого и рецептор-неэависимого ответа Са2+-повышающих агентов, возможно, при посредничестве Са2+-зависимых протеинкинаэ (особенно ПКС), КМ и КМ-зависимых ферментов.

6. В T4-33BHCHMOM действии на повышение tCaz+Jin в тимоцитах, лротелнкинаэа А, по-видимому, не принимает непосредственного участия.

7. Вход Са2+ в тимоциты при действии низких (близких к физиологическим) доз Т4 осуществляется частично через те же проводящие пути, что и под действием митогена Коп А, но вместе с тем Т4 индуцирует неспецифическул проницаемость плазмалеммы, действуя прямо на регуляторные участки Са21"-каналов, возможно при посредстве продуктов окисления АА.

СПИСОК РАБОТ ПО Ш ДИССЕРТЛЦИИ.

1. Гизатуллина 3.3., Сукочева О.А., Гагельганс А.И. Дозозави-симый характер влияния гидрокортизона на энергетический метаболизм тимоцитов крыс. //Биохимия, 1995, Т. 61, вып. 3, 0.458-461.

2. Сукочева 0.А,, Гизатуллина 3.3., Гагельганс А.И. Действие гидрокортизона In vitro на распределение кальция в тимоцитах крыс.// Биол. мембраны, 1998. т. 13, N 6, С. 573-579

3. Сукочева О.А., Гизатуллина 3.3., Сайфуллина Г. Регуляция гидрокортизоном внутриклеточного дыхания тимоцитов крыс.// В сб. "Структура и функции биологических мембран". Тез. докл. Ташкент, 1994, С. 63.

4. Сукочева 0.А., Гизатуллина 3.3., Сайфуллина Г. Распределе-'ние мембраносвязанного кальция под действием гидрокортизона в тимоцитах крыс.// В сб. "Структура и функции биологических мембран". Тез. докл. Ташкент, 1994, С. 64.

5. Сукочева О.А., Гагельганс А.И., Гизатуллина 3.3., Ташмуха-медов Б.А. Рост уровня [Ca^Jin цитозоля тимоцитов при действии тироксина опосредован системой генерации инозитфосфатов. // Тез. 3 Конф. биохимиков Узбекистана. 1996, С. 6.

6.Гизатуллина 3.3., Сукочева О.А,Гагельганс А.И., Я.X.Туракулов Перераспределение мембраносвязанного кальция в тимоцитах крыс при действии тироксина.//Тез.3 Конф.биохимиков Узбекистана. 1996,С.10.

Автор выражает глубокую признательность д.б.я. В.П.Эинчеико за научную консультации, совместному Уебекско-Американскому гуманитарному Предприятию (ПСТИ) и его генеральному директору Д.А.Пи-тиршову, а также моей семье за неоценимую моральную и материальную помощь, оказанную при выполнении данной работы.

КАЛАМУШ ТШ.ЩИГЛАРИ Са-ГОМЕОСТАЗИ БА ЭНЕРГЕТИК МЕТ АБОЛЙЗМИНЙНГ ГОРМОНАЛ ЕОЩАРЙЛШ Сукочева Ольга Анатольевна

Каламуш тимошггларида хлортетрациклин ва Рига/2АМ е-рдачида, тироксин (Т4) еки гидрокортизон (ГК) томонидая . рагбатлантирил-ган цитсзольдаги эргаш ва мембранага бсгланган Са ионларининг п айта таксимланиши «гекшщшди.

Наыойиш этадики, 1-100 нМ Т4-ёки ОД-1мкМ ГК плазмалеммада мембранага боглаиган Са-нянг рецептор оркали воситаланган ошиши-ни келтириб чикарада. Бунда унинг ыитохондриал ва ретккулум Са пуллари аро к,айта такуоиланяш кайд этилди.

1 ыкМ ГК ССа] ш-тшг рецептор оркали воситаланган камайи-Ш11ни келтириб читаради, афтидаи у плзыалеша Са каналарини блоклайди. Таащи Са хисобига [Са] т-ни ошрувчи агентлар (ионо-М1гщш, ванадзт, Кок А, ВНО, АА ва богг^алар) таъсирвдак Са сиг-калишшг ГК-га боглик камаПяши бунга далил булади. Ткмоцитлар энергетик метаболизмига ГК таъсирининг доэага богликлкги кайд этилди: 1п vit.ro-да ГК-никг кщ>ри концентрацкяси ва 1г. ут-да унинг узок давом этувчя таъсири уш босиктиради 1п у^го-да ГК -кинг тубан концентрацией ва унинг ш ут-даги киска мудатли таъсирл митохондрияда, шруваг транспорта ва оксидланкшини рагСатлантирнб, глхкозанинг оксидланшини торюзлайди. Т4, Са-шгаг тшоцитларга кирашни рагСарлантириш Силан Окрга, Са ошрувчи агентларнинг рецэпторга боглик ва боглж булыаган жа-вобкни Оосш^гирадн. Эзргимол, Са-шшг Т4 физиологи« дозалари таъ-сиридан тимоцитларга кириши, инозитфосфатяи гидрслизлувчм система. Са-га боглик протеинкиназалар, каяьшдулин (КМ) ва КМга боглик ферментл&р воситасида, ПКАнинг Севосита шгрокисиз, ццсмап гатоген Кои А таъсиридан уша утказувчи йуллар оркали амалга ошади. Еу Силан 0;:рга, Т4 Са-какалининг ьошщруьчи соха-ларлга б<?Еос:;?а екл восстали таъсир этиб плазмалеммаиикг нсмахс ус утказувчанлигкни чавдради.

HORMOKAL RSGirUTIKjToF THE CALCVW HOMEOSTASIS WTO EKERGEriC iSTTAEQLISM IU RAT THYlKKiYTES

O.A. Sukoclova.

Chlortetracycllne (CTC) and Fura-2AM as rluoruscincd indicators v;as used for Investigation of the redistribution Intracellular menbrane-bound Cal+ and for investigat. Ion of CCa'^Jin-charife'es in cytosol of the hydrocortisone (HO- or thyroxin(T4)-treated rat thymocytes.

It was shown that the action of T4 (1-100 ni.i)o or l!C (0,1-1 mkM) on the thymocytes incubated in madia with Ca2"1" Increased the quantity of membrane-bound Ca2+ in plasma membrane. Togather with It was observed the Ca2*"-redistribution betvieen intracellular thymocytes compartments, in particular betw<?6n mitochondria and endoplasmic reticulum.

1 mkM HC Induced th.~ receptor-radiated f Ca*-+1 i n-decrcase In thymocytes, possibly, by blockade of Ca2+-chsnnels on the level of plasma msiiibran® that was shown by the HC-mediated decreasing' of the level of Ca^-slgnals from ajrer.ts (ionomicyne, Concariaval.in A, BHQ, arachidonio acid and others) induced the rise of CCa2"""] ln through out of entsrance of external Ca"+-lons.

The influence of the HC different doses on rat thymocytes energetic metabolism was invotjtigeted. It has been demonstrated that as the prolonged action of HC in vivo ("0 m>:£/k? of mass during 6 d. daily) as the preincubation of thymocytes with 10 mV.U HC in vitro are cvtothccslcal and induce the decrease of the level of energetic metabolism. Short-time action of HC at the same dose and so the thymocyte preincubation with 1 ir.kM IIC stimulated the transport processes on the level of substrate (pyruvate) oxidation' without the oxidative phcephorilatlon uncoupling and inhibited the glucose oxidation in mitochondrias.

0.) mi Ti stimulated the [Ca2+] m-increass through out of enterance of external Ca2+-ions and inhibited the receptor-dependent and -independent Ca^-signals from CCa2,"l ln-increasinR stents, possibly, with participating the IP3-nydrollse-system, but without participating the FKA.

T-j-medlated Ca2+-enterance could particularly realize through the Con A-stlmulated Ca2+-conducted ways, but, at the same time, T4 could induce the unspeolftcul penr^ablllty of plasma membrane acted directly on the regulatory parts of Ca2+-channels, that is possible in the case when tha signaltransmission from the receptor goes on the several ways.

c