Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Механизмы действия арахидоновой кислоты на регуляцию входа Са2+ в тимоциты

ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Механизмы действия арахидоновой кислоты на регуляцию входа Са2+ в тимоциты"

Г 6 3

од

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ'НАУК ИНСТИТУТ БИОФИЗИКИ КЛЕТКИ

на правах рукописи УДК 576.32/.36 + 57.053.2 + 577.115.3

ГРЕПАКОВА ЕЛЕНА СЕРГЕЕВНА

МЕХАНИЗМЫ ДЕЙСТВИЯ АРАХИДОНОВОИ КИСЛОТЫ НА РЕГУЛЯЦИЮ ВХОДА Саг+ В ТИМОЦИТЫ

(03.00.02 - биофизика)

Автореферат диссертации на соискание ученой степени -кандидата биологических наук

1ЩИН0 1994

Работа выполнена в Институте биофизики клетки РАН

Научные руководители: кандидат биологических наук, В.В.Петруняка, доктор биологических наук, В.Л.Зинченко

Официальные оппоненты: доктор физико-математических наук, О.В.Коломыгкин, кандидат биологических наук, . Т.Г.Щипакина.

Ведущая организация; Научно-исследовательский институт физико-химической биологии им.А.Н.Белозерского. Защита диссертации состоится 1994 г. на

заседании специализированного совета Д 200.23.01 по защите диссертаций по специальности "биофизика" при Институте биофизики клетки РАН, г.Пущине.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института биофизики клетки РАН по адресу: 142292, г. Пущино Московской области.

Автореферат разослан " $ " 1994 г.

Ученый секретарь Специализированного совета, к.б.н.

Т.И.Смолихина

Актуальность проблемы. Арахидоновзя кислота (АА) яелявтся одним из полифункциональных медиаторов биохимических процессов во многих типах клеток. В покоящихся клетках АА находится в составе мембранных глицерофосфолипидов и практически отсутствует в свободной форме. Однако, при активации определенных рецепторов плазматической мембраны их соответствующими згонистами концентрация свободной АА в цитоплазма резко возрастает (Needleman et al.,1986; Hok-in, 1985 ). Значительная часть - высвобожденной АА затем в течение секунд окисляется специфичесними ферментами до эйкозаноидов (McGiff, 1987; Male et al.,1987), прием профиль метаболизма АА является характерным для каждого типа клеток (Needleman et al., 1986; McGlif, 1987).

Рецептор-стимулируемый выброс АА часто сопровождается повышением внутриклеточной концентрации Саг+ (£Саг+J±), как, например, в лимфоцитах, стимулированных митогенными лантанами (Ferber & Reach, 1973; Parker et al.,1979; Mlre-Slula et al., 1989). Этот факт позволил предположить, что АА или ее метаболиты являются медиаторами рецептор-зависимого повышения [Ca2+J1. Подтверждением этого предположения были данные, что антагонисты ферментативного окисления и высвобождения АА влияют на функции тимоцитов (Behrena et al.,1989) и, в частности, подавляют рецептор-зависимое повышение [Саг+31 (Gukovskaya et al.,1989). Кроме того было показано, что экзогенная АА способна повышать tCa2"1"^ за счет мобилизации внутриклеточных Саг+-пулов (Volpl et al.,1980; Wolf et al.,1986; Dettbarn & Pelade, 1993), a также активировать вход внешнего Саг+ (Alonzo et al., 1990)"и стимулировать множество Свг+-завдсимых процессов в клетках (Naccache et al.,1979; 19ВЗ; Badwey et al.,1987).

G другой стороны, было описано прямо противоположное действие АА и ряда других ненасыщенных тарных кислот. Показано, что эти вещества могут подавлять повышение базального уровня [Са2'|"]1 под действием различных агентов (Kolesnick & Gershengorn, 1985; Мас-

Сокращения: PLAa - фосфолипаза Ag; PLC - фофсолипаза С; Ю - липо-ксигеназа; СО - циклооксигеназа; BSA - йычий сывороточный альбумин; Con А - конкзнавалин A; IP3 - инозитол-1,4-,5-трисфэсфат; BHQ -2,5-flH-(t-CyT!u)~1 ,4-бензотадрохинон; PGEt и PGE2 - простагландины El и Ег; РИА - фитогемэгглютинин; NDGA - нордигидрогваяретовая кислота; 5-НЕТЕ - 5-гидрокси-5,8,11,14-айкозатетраеновая кислота; EIPA - втилизопротшламилорвд.

3

Ewan et al. ,1991), в том числе и в рецептор-активированных Т-лимфоцитах (Chow et al.,1990; Astashkln et al.,1993).

Т.о. жирные кислоты, и прежде всего АА, могут оказывать два противоположных эффекта на [Саг+31 в разных типах клеток. Однако, несмотря на многочисленность литературных данных о действии экзогенной ДА на ионный гомеостаз клеток, большинство работ носят описательный характер. Роль АА и продуктов ее окисления в трансмембранной передаче сигнала в клетках эукэриот и, в том числе, в лимфоцитах остается невыясненной. Практически не исследовалось участие АА в регуляции ионного гомеостаза. покоящихся лимфоцитов, а также ее роль в формировании ионных сигналов в рецептор-зависимых процессах. До настоящего времени не предпринимались попытки исследования причины двоякого действия АА на [Саг+11 в Т-лимфоцитах, а ее эффекты рассматривались обособленно, без учета новых данных о регуляции входа Са2'1" в клетки из внешней среды.

Цель настоящей работы заключалась в исследовании механизмов действия экзогенной АА на' Саг+-транспортирущие структуры и их регуляторы, и на изменения рН± в интактных тимоцитах крысы, а также влияние АА на рецептор-зависимую Свг+-сигнализацию в активированных клетках. Объект исследования - тимоциты крысы линии V/latar.

Основные задачи исследования:

1. Исследование эффектов экзогенной АА на тимоциты в покое и при активации Са2+-мобилизующими агонистами.

2. Изучение механизмов рецептор-зависимого входа Саг+ в тимоциты и сравнительный анализ эффектов АА и митогена Con А на повышение tCa21"^;

3. Идентификация возможных внутриклеточных мишеней ингибитор-ного и [Са2+^-повышающего действия акзогеной АА;

4. Выяснение причины снижения рН± под действием экзогенной АА, а также анализ вероятности участия АА в рецептор-стимулируэмом повышении 1Саг*~1± в тимоцитах крысы.

Научная новизна работа. С помощью внутриклеточных ион-чувствительных флуоресцентных зондов Quin 2 и БСЕС? нами было показано, что АА в зависимости от концентрации может оказывать два противоположных эффекта нв [Саг+одного и того же типа клеток, а именно, I) ингибировать повышение [Саг+] , индуцируемое

4

Саг+-мобилизущими агентами, не влияя при этом на [Саг+3± покоящихся клеток, - в концентрациях 0,1-1 ¡jM и 2) активировать вход Саг+ в клетки на фоне 100Ж-ного подавления рецептор-зависимого Саг+-сигнала - в концентрациях 1-100 jiN.

На тимоцитах ЕперЕне показано, что рецептор-эктквируедай вход Са2* в клетки определяется первоначальным повышением [Са24^ за счет мобилизации внутриклеточных пулов, что, е свою очередь, акти-Еирует КМ и КМ-зависимые протеинкиназу и протеинфосфатазу. КМ-фосфатаза, вероятно, опосредует инициацию Ехода Са2+, тогда как КМ-киназа необходима для инактивации Саг+-каналов при завершении Саг+-ответа.

Установлено, что тирозиновая и сАМР-зависимая протеинкиназы не принимают участия в регуляции активности Саг+-каналов плазматической мембраны и функционируют на этапах, предшествующих мобилизации Саг+ из внутренних пулов.

AÁ-индуцируемое закисление цитоплазмы определяется усилением продукции протонов внутри клетки.

АА в концентрациях 15-100 цМ индуцирует неспецифическую проницаемость плазматической мембраны, тогда как в концентрациях 0, Ills цМ АА активирует те же Сэг+-проЕодящие каналы, что и митоген Con А. Саг+-поБЫшающее (в отличие от Con А) и интибиторное действие АА нэ связано с ее влиянием на рецепторы, TFK, PLC или КМ, а также с продуктами ее окисления, а определяется прямым влиянием на Са2+-каналы плазматической мембраны. Противоположность эффектов разных концентраций АА на [Сан+]1 тимоцитов, вероятнее всего, не связана с ее действием на различные типы каналов, а обусловлена разными эффектами низких и высоких концентраций АА на одни и те же мишени, как это описано для ряда ингибиторов.

Данные указывают на то, что в тимоцитах АА не является медиатором рецептор-зависимого повышения {Саг+]± я не требуется для Con А-индуцируэмой активации клеток.

Научно-практическое значение работы. Проведанные исследования вносят существенный вклад в представления о механизмах генерации рецептор-зависимых ионных сигналов в тимоцитах. Полученные данные открывает новые возможности использования АА как высокоспециничного ингибитора рецептор-огорируемых Са2+-каналов при исследовании

5

путей передачи рецепторного сигнала в электро-невозбудимых клетках.

Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на симпозиуме стран С!НГ "Пути передачи внеклеточного сигнала" (Звенигород, май 1993); симпозиуме стран СНГ "Клинические и экспериментальные аспекты клеточной сигнализации" (Москва, сентябрь 1993); итоговой конференции ИБК (Пущино, ноябрь 1993).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 5 статей (в том числе I - в иностранном журнале) и I тезисы.

Структура диссертации. Диссертация состоит из введения, литературного обзора (гл.1), описания материалов и методов исследования (гл.11), изложения полученных результатов и их обсуждения (гл.III), заключения, выводов и списка цитируемой литературы (250 ссылок). Работа изложена на 145 страницах машинописного текста, включая 34 рисунка и I таблицу.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Эксперименты проводили на тимоцитах крыс Wlstar (150 г). Ти-моциты выделяли по методике описанной Grlnstein et al.(1984) в стандартном солевом буфере (ССБ), содержащем (мМ) 138 NaCl, 5,4 KCl, 1,2 CaClg, 0,4 КН2Р0Д, 0,8 MgS04, 0,3 Ма^ДРО^, 5,6 D-глюкозы, 10 HEPES, pH 7,2. Бескальциевую среду получали добавлением в ССБ 3 мМ ЭГТА.

Измерения CCa2+3i и р^ проводили спектрофлуориметрически с помощью внутриклеточных ион-селективных флуоресцентных зондов Quin 2/АМ (Tsien et al.,1982) и БСЕСР/АМ (Rink et al.,1982).

РЕЗУЛЬТАТЫ ЭКСПЕРИМЕНТОВ

I. Механизмы регуляции рецептор-зависимого входа Саг+.

Саг+-ответы тимоцитов, индуцируемые митогенным лектином Con А в наших экспериментах снижались в присутствии BSA, связывающего жирные кислоты, на 65-70 %. Это могло бы указывать на то, что Con A-ответ в тимоцитах хотя бы частично опосредуется АА или ее метаболитами. Для изучения этого вопроса мы рассмотрели эффекты экзогенной АА на tCa2+]± интактных я Con А-активированных тимоцитов.

АА (0,01-100 |лМ) дозозависимо повышала [Са2+ ]± тимоцитов

6

(Рис.1). В присутствии BSA все эффекты АА исчезали, а добавление

Рис.1. Зависимость амплитуда АА- индуцируемого повышения внутриклеточной концентрации Са2+ в тимоцитах от концентрации АА. Каждая точка соответствует одному измерению. Показания фиксировались в точке максимального увеличения [Са2+]1 под действием АА.

ESA на максимуме Са^-отЕета на АА не вызывало изменения скорости возвращения [Саг+1г к уровню покоя. Это roBopiT о том, что присутствие АА во внешней среде не является необходимым условием для поддержания индуцируемого ею Саг+-отвата.

Данные, полученные с пожи^ьп трипвнового синего или по фрагментации ДНК, указывают на то, что эффекты АА в концентрации до 100 pJá не связаны с нарушением целостности мембран. Однако, измерение флуоресценции этидаума бромида показало, что в концентрациях 15-100 АА индуцирует негагоцифическую проницаемость мембран.

Наряду с повышением [Са2+)1( АА (0,1-1 цМ) дозозависимо подавляла Con A-ответ тимоцитов (ftic.2A). Добавление АА после Con А (Рис.2Е) приводило к резкому ускорению снижения [Саг+]±. Эти факты указывают на то, что в тимоцитах. АА, по всей видимости, не участвует в рецептор-зависимом повышении ССаг+11, поскольку медиа-гор Саа+-сигнала не может иягибировать Саа+-ответы, индуцируемые агонистом рецепора.

Для исследования механизмов зафиксированного нами двоякого эффекта АА на 1Саг+11 тимоцитов, мы рассмотрели механизмы регуля-дии еходз Саг+, которые могут быть потенциальными мишенями действия АА. С этой целью мы использовали вещества, способные имитиро-зать рецептор-зависимую активацию, минуя первоначальные стадии

7

Рис.2. Влияние АА на Ca"" -ответ тимоцитов крысы на Con А. А - Зависимость эффекта АА на Са-отЕет, индуцированный 3 Цг/мл Con А,от концентрации АА.За 100$ принята амплитуда Са-ответа без предварительной обработки АА. Б - Изменение [Са]1 в тимоцитах под действием 10 Цг/мл Con А в контроле (а), на фоне 500 нМ АА (б) и при последовательном добавлении Con А (10 цг/мл) и АА (1 рМ) (в).

этого процесса - активацию поверхностного рецептора и Еыброс 1Р3: BHQ и иономицин.

BHQ, ингибитор Саг+-АТРазы эндоплэзматического ретикулума (Moore et al.,1987), дозозависимо повышал 1Саг+11 интактных тимоцитов, причем эффекты BHQ и Con А были неаддитивны (Рис.3). ДвЛст-

Рис.З. Влияние EHQ на [Ca]i тимоцитов крысы. А - Повышение [Ca]i покоящихся тимоцитов под действием 10 ¡аМ (а) 1 |ДМ (б) или 100 нМ (в) BHQ. Б - Изменение [Cali тимоцитов при последовательном добавлении 10 ЦМ BHQ и 10 цг/ мл Con А (а) или Con А и BHQ (б).

вив иономицина было изучено ранее достаточно подробно (Ариас, 1990). Известно, что в концентрациях до Ю~0 М он действует как Саг+-мобилизуюций агент. В наших экспериментах Саг+-ответы на BHQ и иономицин значительно ослаблялись в присутствии ЭГТА или Ni2'1", блокатора Саг+-каналов, что говорит о внеклеточном источнике повышения [Ca2+]t под действием этих агентов.

Двойная роль калълодумлш. Известно, что ингибиторы кальмоду-лина (КМ) подавляют пролиферацию Т-лимфоцитов (Cheung et al., 1984;

NaKabayashi et al.,1992), а также мобилизацию Ca2+ из 1Р3-чувствительных пулов (Hill et al.,1988). Однако, неясно, участвует ли КМ непосредственно в регуляции Са2+-каналов в Т-лимфоцитах. Мы показали, что ингибитор KM R2457I дозозависимо подавляет Саг+-ответы тимоцитов на Са2+-мобилизущие агенты с разными механизмами действия (Рис.4). Следовательно, в тимоцитах КМ скорее всего, не участвует в 1Р3-индуцированной мобилизации ■Са^-пулов, т.к. действие иономицина или BHQ не опосредовано 1Р3

Рис.4. Зависимость эффекта - R24571 на Са-ответ тимоцитов крысы, индуцированный 10 [ir/MJt Con А

(A), 1 JIM BHQ (Б), 10 нМ иономицином

(B) от концентрации Н24571 .За 100* принята амплитуда Са-ответа на агенты без Е24571. R24571 добавлялся в суспензию клеток за 2 мин до агонистов. Г - Изменение [Ca]i интактных тимоцитов при последовательном добавлении 2 ЦМ В24571 и 1 JiM BHQ (а), 1 UM BHQ и 2 JÍM Е24571 (б) ИЛИ БВД без R24571 (контроль) (в).

Добавление ингибитора КМ после максимального развития Саг+-ответа не вызывало падения уровня [Саг+]± <Рис.4Г), но полностью подавляло его самопроизвольное снижение, в отличие от контроля, что, по-видимому, исключает неспецифичвское действие R2457I, а также прямое действие ингибитора на Са2+-каналы. Результаты указывают на то, что КМ может участвовать в запуске механизма активации Са2+-каналов плазматической мембраны, а также в их инактивации.

Участие сАМР-эависилой и тирозиковой пратеинкшюз. Повышение в тимоцитзх внутриклеточного уровня сАМР, известного модулятора Са2+-завиеимых процессов (Wang .et al.,1973; Alava et al.,1992), с помощью четырех различных агентов - форсколин 10 jjM, дибутирил-

% оставшегося ответе 1 * оставшегося ответа Б

г а а

80 80 □ □ В

40 0 ■ ООП А ■ ■ 40 0 виз а а

10"® 10"' to-® 10"® to"7 10"'

1ГС4СТ1). II 1К4ЭТП. II

* остмаего-ся ответа В [Саг+1.,нМ Г

80 ве в 6 е S0O 300 E245TI Л" Л-

40 е Ицв—ивм е в г J-S ЕГО a

0 too 1 т BHQ R2457I

(О-* 10"т [R2<5T!1. II to-6 НИ»

9

cAMP I мМ, PGE1 20 цМ, PGE2 20 |jM - подавляло Con A-ответ примерно на Ь0%, но практически не влияло на BHQ-активируемое повышение [Са2+11 Следовательно, сАМР-зависимая протеинкиназа (РКА), активация которой обуславливает все эффекты сАМР, не участвует непосредственно в регуляции входа Са2+ и может функционировать лишь на этапах, предшествующих выбросу внутреннего Саг+ в цитозоль.

Поскольку ингибитор протеинкиназ стауроспорин, как показано ранее, подавляет Са2+-ответы тимоцитов на Con А (Никифоров и др., 1992), а также Т-лимфобластомы - на Con А и FHA (lard, et al.,1988), мы исследовали возможность участия тирозиновой протеин-киназы (ТРК) в регуляции входа Са2+. Мы показали, что стауроспорин в концентрации 250 нМ, в которой он подавляет все известные проте-инкиназы, практически не влиял на Са2+-ответ на BHQ. Однако, добавление ингибитора после достижения максимального ответа на BHQ полностью подавляло последующее возвращение ГСаг+]± к уровни покоя, аналогично действию E2457I (Рис.4Г). Исходя из этих данных, можно утверждать, что ТРК не принимает непосредственного участия в индукции Са^-проницаемости плазматической мембраны, и ее роль в рецепторном ответе тимоцитов может ограничиваться только показанной ранее активацией PLC (June et al.,1990; Park et al., 1991). В то же время, аналогичные эффекты стауроспорина и H2457I на восстановление LCaa+]± после развития Са2+-ответа могут свидетельствовать об участии КМ-зависимой протеинкиназы в инактивации Саг+-каналов.

2. Механизмы АА-индуцируемого повышения [Са2+]± в покоящихся тимоцитах.

Саг+-отввты на 0,1-12 цЫ АА практически полностью исчезали в среде без Саг+ (Рис.5А,б). Это указывает на то, что Са2+-ответ на АА обусловлен, главным образом, усилением входа экстраклеточного Са2+, как это показано ранее длй Con А-активированных тимоцитов (Gukorskaya & Zlnchenko, 1990). В присутствии 4 мМ Н12+, блокатора Саг+-каналов, АА (0,1-12 рМ) вообще не вызывала увеличения [Са2"1"^. Это свидетельствует о том, что АА-активируемый вход Саг+ происходит через Са2+-каналы плазматической мембраны. Снижение мембранного потенциала клеток за счет замены На+ в среде на

10

Рис.5. А - изменения [Са]1 под действием 5 |1м АА в контроле (а), в бес-Са среде (б), при замене Ма в среде на К (в), на фоне 15 (Ш 5-НЕТЕ (г) iura 10 цМ индометацина или ЮЗА (д). Б - зависимость амплитуды Са-ответов на 10 Цг/мл Con А от концентрации 5-НЕТЕ, добавленного за 2 мин до Con А. Каждая точка соответствует 1му измерению.

К+ вызывало уменьшение АА-индувдфуемого входа Саг¥ в клетку (Рис. 5А,в), аналогично Con A-ответу. Кроме того, как и Con А, в указанных концентрациях АА не стимулировала вход Мпг+ в тимоциты. Эти данные позволяют предположить, что в тимоцитах экзогенная АА активирует те не Саг+-канэлы плазматической мембраны, что и митоген.

В более высоких концентрациях (15-100 цМ) АА индуцировала вход Мп2+ и Н1г+ в клетки, а амплитуда Саг+-ответов не снижалась при деполяризации плазматической мембраны, что подтверждает данные, полученные с помощью этидиума бромида, об индукции неспецифической проницаемости мембраны высокими концентрациями АА.

Саг+-ответы, стимулируемые АА в присутствий ингибиторов ее окисления (индометацина, NDGA или 5-НЕТЕ), не отличались от контрольных, а 5-НЕТЕ, продукт лишжстгеназного окисления АА, был на порядок менее эффективным [Саг+]^повышающим агентом (см.рис.ВБ и X). Кроме того, PGEi и PGEa, циклооксигеназные метаболиты АА, вообще не повышали ÍСаг+ Э¿ тимоцитов. Это говорит о том, что неоки-сленная АА является более сильным регулятором ионного транспорта тимоцитов, и ее [Ca2+J^-повышающий эффект не опосредуется метаболитами.

Саг+-ответы на 3 рМ АА не кнтибировались 250 нМ стауроспори-чом. Поскольку известно, что отауроспория в этой концентращш подавляет тирозиновую протеинкиназу, активация которой необходима да запуска распада фосфоинозитидов фосфолипазой 0 в Т-лимфоцитзх, :о мокно утверждать, что АА-активируемое повышение ССа2+]ч не ого-:редувтся PLQ.

11

Ингибиторы КМ также не снижали амплитуду Са2+-ответов на АА, что говорит о КМ-независимом механизме повышения tCas+] .

3. Изменения pH тимоцитов год действием АА.

Экзогенная АА (0,01-12 рА1) вызывала быстрое дозозависимое

снижение pHä тимоцитов, за которым следовало более медленное заще-

лачивание (Рис.бА; Б,б). Закисление не связано с ингибированием

Рис.б. Действие АА на pH интактных ти моцитов. А-Ззбиси-мость амплитуды pH ответа от концентрации АА.П- АА-ин-дуцируемое изменение pH интактных клеток; ■ -Изменение pH тимоцитое, предварительно обработанных 10 jiM EIPA'. Изменения pH фиксировались в точке максимального закисления. Каждая точка соответствует одному измерению. Б - Изменение pH тимоцитов под действием 10 JiM EIPA (а), 3 (JM АА Е контроле (б), АА на фоне EIPA (в), 30 ЦМ АА (г). EIPA добавлялся за 2 мин до АА.

На+/Н+-обмена, т.к. ингибитор Ка+/Н+-обмена EIPA вызывал лишь незначительное медленное смещение рН.^ в кислую сторону, в отличие от АА (Рис.6Б,э). Кроме того, в присутствии EIPA закислянций эффект АА значительно усиливался и при этом исчезала фаза защелачивания (Рис.бБ.в), что указывает на активацию Ка+/Н+-обмена под действием АА-индуцируемого закисления. Защелачивание под действием более высоких концентраций АА (15-100 рМ) не устранялись EIPA, что предполагает исчезновение протонных градиентов мезду цитозолем и средой в этих условиях.

При регистрации pHQ мы обнаружили, что под действием 3 цМ АА выброс протонов тимоцитами во внешнюю среду усиливался примерно в 2 раза. Причем, этот выброс ингибировался EIPA. Это позволяет ут-верадать, что причиной АА-индуцируемого снижения рН^ в тимоцитах является усиление внутриклеточной продукции протонов. Одним из наиболее значимых внутриклеточных источников Н+ может быть гидро-

12

лиз ATP. Действительно, в тимоцитах, предварительно обработанных митохондриальными ингибиторами олигомици№'■•« (1 р.г/мл) + ротеноном (I \М), амплитуда pH-ответа на 3 |аМ М снижалась примерно на 30™. Кроме того, в таких клетках после кратковременного эакисления следовало очень быстрое защелачивание цитоплазмы, не устраняемое EIPA.

АА-стимулируемое закисление значительно подавлялось е клетках, обработанных протонофором FCCP, подавляющего синтез АТР. Сам FCCP вызывал закисление цитоплазмы, что позволяет предположить одинаковый механизм генерации протона под действием АА и FCCP.

4. Влияние АА на рецептор-стимулируемое повышенна [Саг+11.

При исследовании ингибиторного действия АА мы сравнивали ее аффекты с эффектами сАМР-поЕышаюдих агентов, поскольку известно, что циклооксигеназные метаболиты АА прсстагландины могут актиЕиро-вать аденилатциклазу, повышая т.о. внутриклеточный уровень сАМР, ингибитора увеличения [Саа+]±. Форсколин, дабутирил-сАМР, PGE, и РСЕг в максимально эффективных концентрациях подавляли Саг+-отЕеты на Con А не более чем на 50% (Рис.7А,б; Б). Причем, FGE, или FGE,, добавленные вместе с фэрсколином, не усиливали ингибиторное действие друг друга, что может свидетельствовать об одной и той же мишени действия этих агентов - аденилатциклазе. Одновременное добавление АА (в полумэксималъно эффективной концентрации 320 нМ) и форсколина (10 рЛ) полностью годэеляло Саг+-отЕет на Con А (Рис.7,А,г), а ингибитор GO индометацкн, предотвращающий образование простагландинов из АА, не устранял ингибиторный эффект АА. Эти факты указывают на то, что в тимоцитах ингибиторный эффект АА не связан с ее окислением до простагландинов и повышением внутриклеточного уровня сАМР.

Для того чтобы выяснить, не связано jm ингибиторное действие АА с ее способностью заютслять цитоплазму, как предположил Асташ-кин с соавт. (AstashKln et al.,1993), мы имитировали закисляиций эффект АА ацетатом Na+. Однако, закисление цитоплазмы с помощью 5 мМ ацетата Na+ практически не влияло на Саг+-ответ тимоцитов на Con А. Кроме того, предварительная обработка тимоцитов ШДС1, за-щелачиващим цитоплазму и предотвращающим т.о. сильное снижение

13

Fue.Т. Эффекты форс-колина, РОЕ и PGE, на Са-ответ тимоцитов, индуцируемый 3 цг/мл Con А. А- Са-ответы на Con А в контроле (а) и на фоне 10 |-Ш форско-лина(б), 32U нМ АА (в) или форсколина + АА (г). Б-зависи-мооть эффектов PGE (■)или РОЕ, (□) на Са-ответ ^на Con А от концентрации PGE. За !00$ принята амплитуда Са-ответов на Con А клеток, не обработанных РОЕ. Агенты добавлялись за 2 мин до Con А.

pHt под действием АА, не устранялд ингиоиторного действия АА на Con A-ответ. Т.о. закиеление цитоплазмы под действием АА не является причиной подавления Con А-стимулируемого Са2+-ответа.

АА дозозэвисимо подавляла Саг+-ответы на BHQ (Рис.8А) и ионо-

Рио.8. Действие АА на Сэ-ответы тимоцитов,- индуцируемые 1 ЦМ BHQ. А - Зависимость амплитуда Са-ответов на BHQ от концентрации АА, добавленной за 2мин до ВВД.За 100Ж принята амплитуда Са-ответа на 1 pW BHQ в отсутствии АА. Б-Изыенение [Ca]i под действием BHQ в контроле (а) и при последовательном добавлении BHQ и АА (1 рМ)(С).

мицин. Причем, кривая зависимости интибиторного эффекта АА от ее концентрации на BHQ-ответ практически не отличалась от кривой до-зозависимого действия АА. на Con A-ответ. А добавление АА после BHQ в момент выхода уровня [Саг+]1 на плато, как и в случае с Con А, резко снижало уровень [Саг+]± (Рис.ЗБ). Эти данные указывают на то, что эффект АА не связан с ее влиянием на сопряжение комплекса "лиганд-рецептор" с PLC и подавлением реакций, предшествующих мобилизации Са2'1" из внутренних пулов, а обусловлен, скорее всего,

14

прямым влиянием на Са2+-кэналы плазматической мембраны и, возможно, эндоплазмзтического ретикулума.

ОБСУЖДЕНИЕ

Полученные данные показали, что АА в зависимости от концентрации может вызывать два разных эффекта на [Саг+]1 тимоцитов - инги-бировать рецептор-активируемое повышение [Саг+)1 (0,1-1 рМ) или повышать базалышй уровень 1Саг+11 интактных тимоцитов при одновременном подавлении Con A-oteotob (1-1СЮ ¡jlM). Поскольку отмывание АА с помощью BSA после максимального развития Саг+-отЕета на АА не ускоряло снижения [Са2+]1( можно предположить, что в тимоцитах повышение ICa2"1"!. под действием экзогенной АА может активировать цепь событий, обычно имеющих место при рецепторном Са -ответе.

Исследуя механизмы регуляции входа Саг+, мы пришли к выводу, что в тимоцитах активация рецептор-заЕисш.юго входа Саг+ определяется первоначальным повышением [Саг+11 за счет мобилизации Са2+-пулов и не сопряжена с рецептором напрямую. Речь, следовательно, может идти о Саг+-активируемых Саг+-каналах. Активация этих каналов осуществляется, скорее Есего, Са2+-зависимыми посредниками. Одним из них является КМ, который, в свою очередь, активирует КМ-зависимые протеинкиназу и протеинфосфатазу. Первая, вероятно, опосредует инактивацию Саг+-каналов, тогда как вторая необходима для запуска входа Са2+. Не исключено существование и других регуляторов каналов, как, например, "фактор входа Ca2+" (GIF), описанный в Т-лимфоцитэх (Randriamampita & Tsien, 1993). CIF накапливается при активации лимфоцитов и является, по-видимому, прямым активатором Саг+-каналов. Наличие фосфатной группы у молекулы CIF позволяет предполагать, что • он может быть мишенью КМ-зависимой протеинфосфзтазы.

Полученные нами данные позволяют утверждать, что действие АА на [Са^ ] тимоцитов не опосредовано ее метаболитами и связано с ее прямым действием на Са^+-канэлы плазматической мембраны или их липидное окружение. В своих экспериментах мы не обнаружили посредников рецепторного Сай+-сигнала, которые могли бы быть потенциальными. мишенями экзогенной АА.

[ Саг+1 ^-повышающий эффект АА в тимоцитах не связан с актива-

15

цией фосфорилирования, РЪС или КМ. А ее ингибиторное действие на рецептор-зависимое повышение Юаг+11 указывает на то, что в тимо-цитах АА и ее метаболиты, скорее всего, не принимают участия в реализации рецепторного Саг+-ответа. Нельзя не учитывать тот факт, что экзогенная АА' активирует те же каналы, что и.митоген. Однако, исходя из принципов Сазерленда, описывающих вторичные мессендаеры (Robinson, 1971), медиатор Саг+-сигнала не может ингибировать опосредуемый им Саг+-сигнал. Т.о. очевидно, АА не участвует в Сап A-активируемом повышении (Саг+11, а показанное нами снижение амплитуды Сап A-ответов в присутствии BSA может объясняться высокой аффинностью BSA не только к АА, но и другим кирным кислотам, а также лизофосфолипидам, которые, как известно, могут опосредовать рецептор-зависимое повышение [Ca2+J1 (Howe & Marshall, 1993). Противоположность эффектов низких и высоких концентраций АА может быть связана с различными механизмами действия разных концентраций вещества нв одни и те же мишени, как это показано, в частности, для ингибиторов протеинфэсфатазы okaüaic acid и calyculin А (ОЬага & Yabu, 1993).

вывода

1. Экзогенная АА, в зависимости от концентрации, может вызывать два разных эффекта на 1Саг+11 тимоцитов: I) ингибировать вход Са'-+, вызванный Саг+-мобилизуицими агентами с разными механизмами действия - в концентрациях 0,1-1 цМ; и 2) стимулировать вход Саг+ в покоящиеся тимоциты при одновременном подавлении Con А-стимулированного ответа - в концентрациях I-I0Q цМ.

2. Активация входа Сэг+ в тимоциты опосредуется первоначальным повышением 1Саг+11 за счет мобилизации внутриклеточных Саг+-пулов,_что, в свою очередь, активирует КМ и КМ-зависимые ферменты. КМ-зависимая протеинкиназа, вероятно, необходима для инактивации Саг+-проводящих путей, тогда как КМ-зависимая протеинфос-фатаза может участвовать в инициации входа Саг+.

3. ГРК и РКА не принимают непосредственного участия в регуляции Са2+-каналов плазматической мембраны тимоцитов и действуют на этапе передачи сигнала с поверхностного рецептора внутрь клетки и активации инозитольного цикла.

4. Вход Са2+ в тимоциты под действием низких доз АА (0,1-12

16

|iM) осуществляется через те же Са2+-проводящие пути, что и под действием митогена Con А, тогда как высокие концентрации АА (15100 jiM) индуцируют не специфическую проницаемость плазматической мембраны. В отличие от Con А, АА действует прямо на регуляторные участки каналов.

5. Закисляющий эффект экзогенной АА, (0,1-12 цМ) обусловлен увеличением внутриклеточной продукции протона, что приводит к' активации №+/Н+-обмена.

6. Ингибиторное действие АА на повышение [Саг+11 не связано со снижением рН1Р а подавление рецептор-независимого повышения [Са2+] также как и резкое снижение [Саг+]1 при добавлении АА после Са -повышающих агентов свидетельствует о возможном прямом действии АА на Са2+-каналы.

7. Как Са^-повышавдее, так и ингибиторного действие АА не связано с ее окислением до эйкозаноидов, а также действием на РЪС или КМ. Хотя, не исключено влияние АА на КМ-зависимую протеинфос-фатазу.

8. Активация входа Саг+ в тимоциты - с одной стороны, и инги-бирование входа Саг+ под действием Са2+-мобилизующих агентов - с другой стороны, вероятнее всего, не связаны с влиянием АА на разные типы Са2+-каналов, а обусловлены противоположными эффектами низких и высоких концентраций АА на одни и те же мишени, как это показано для ряда ингибиторов.

9. Данные указывают на то, что в тимоцитах АА не является медиатором рецептор-зависимого повышения [Са2+]± и не требуется для Con А-индуцируемой активации клеток.

СПИСОК РАБОТ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Гуковская А.С., Котелевская С.М„ Трепакова Е.С., Зинченко В.П. Эф$ект SH-реагента тимеросала на Са -гомеостаз в тимоцитах. // Биол.мембраны, 1992, т.9, сЛ58-162.

2. Gukovskaya A.S., Trepakova E.S., Zinchenko V.P., Korystov Yu.N., Bezuglov V.V. Effect of sulfhydryl reagent thimerosal on cytosolic Iree Ca and membrane potential of thymocytes.// Bioch-im.Biophys.Acta, 1992, 7.1111, p.65-74.

3. Никифоров Е.Л., Трепакова E.C., Зинченко В.П. Стауроспорин ингибирует рецептор-зависшую активацию Na/H -обмена.// Биол.мембраны, 1992, т.9, с.1039-1042.

4. Трепакова Е.С., Мусиенко B.C., Петруняка В.В. Арахидоновая кислота подавляет.рецептор-стимулируемое повышение внутриклеточной концентрации Са через рецептор- и сАМР-независимые механизмы.// Биол.мембраны, 1994, Т.II, N I, с.24-32.

5. Трепакова Е.С., Петруняка В.В. Механизмы регуляции рецептор-зависимого входа Са в тимоциты, активированные Кон А.// В сб.:"Клинические и экспериментальные аспекты клеточной сигнализации". Тез.докл. Москва, 1993, с.78-80.

6. Трепакова Е.С., Петруняка В.В.., Мусиенко B.C. Механизмы регуляции рецептор-зависимого входа Са в тимоциты. Роль кальмо-дулина и лротеинкиназ.// Биол.мембраны, 1994, т.II, N 4, с.

21.04.94 г. Зак.6075Р. Тир.100 энз. Уч.-изд.л. 1.0 Отпечатано на ротапринте в ОНИ ПЩ РЖ