Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Кальциевые каналы низкой проводимости в плазматической мембране макрофагов

ВАК РФ 03.00.25, Гистология, цитология, клеточная биология

Автореферат диссертации по теме "Кальциевые каналы низкой проводимости в плазматической мембране макрофагов"

СЕМЁНОВА

На правах рукописи

Светлана Борисовна

КАЛЬЦИЕВЫЕ КАНАЛЫ НИЗКОЙ ПРОВОДИМОСТИ В ПЛАЗМАТИЧЕСКОЙ МЕМБРАНЕ МАКРОФАГОВ: АКТИВАЦИЯ ИНОЗИТОЛ (1,4,5)-

ТРИФОСФАТОМ

03.00.25 Клеточная биология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

САНКТ-ПЕТЕРБУРГ

1998

Работа выполнена в Институте цитологии РАН, Санкт-Петербург

Научный руководитель: доктор биологических наук,

член-корр РАН Г.Н.Можаева Институт цитологии РАН, Санкт-Петербург Официальные оппоненты: доктор биологических наук

И.И.Марахова, Институт цитологии РАЗН Санкт-Петербург

доктор биологических наук, профессор Г.А.Наеледов Институт эволюционной физиологии и биохимии им. И.М.Сеченова РАН, Санкт-Петербург

Ведущее учреждение Биолого-почвенный факультет,

Санкт-Петербургский Государственный Университет

Защита состоится 1998 года в /Зч.

на заседании Диссертационного совета Д.002.73.01 Института цитологии РАН по адресу: 194064, Санкт-Петербург, Тихорецкий пр., д.4.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института цитологии РАН.

Реферат разослан « 1998 года.

Ученый секретарь Диссертационного совета

д.б.н. ^ихГХ^Д,- Л.Н.Писарева

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ.

Актуальность проблемы.

Одним из первичных и общих для всех типов клеток ответов на внеклеточную стимуляцию является повышение концентрации ионов Са2+ в цитозоле, реализующееся как высокоорганизованный в пространстве и времени кальциевый сигнал, наименее ясным звеном которого остается рецептор-индуцированный вход ионов Са2+, сопровождающий выброс кальция из внутриклеточных депо.

Известно, что выброс Са2+ из депо осуществляется после связывания (1,4,5)-трифосфата (1Рз) с рецептором (IP3R), расположенным в мембране эндоплазматического ретикулума. П?з мобилизует Са2+ из ретикулума, увеличивая концентрацию свободного внутриклеточного Са2+ в цитозоле ([Ca2+]¡) как за счет опустошения кальциевых депо, так и за счет последующей активации входа Са2+ из наружной среды в клетку. Существуют экспериментальные данные о том, что 1Рз-зависимый вход Са2+ опосредуется особым типом высокоселективных Са2+-каналов низкой проводимости, активация которых регулируется состоянием Са2+-депо, которые по мере их опустошения от кальция посылают сигнал к плазматической мембране клеток и запускают его вход внутрь клетки («емкостная модель» входа Са2+) [Putney 1990; Putney, Bird 1993]. В пользу этой модели свидетельствуют данные о регистрации кальциевых токов (/вас) в условиях принудительного опустошения внутриклеточных кальциевых хранилищ [Hoth., Penner 1993; LuckhofT, Clapham 1994]. Природа сигнала, поставляющего к мембране сведения о степени заполнения депо Са2+, неизвестна и остается предметом дискуссий. В качестве возможных причин рассматриваются как формирование некоего водорастворимого мессенджера (CIF) [Parekh, Terlau 1993], так и передача сигнала благодаря конформациошшм изменениям EP3R и прямому взаимодействию его с кальциевыми каналами, расположенными в плазматической мембране (coupling model) [Berridge, 1995]. Свойства мембранных каналов, активируемых выбросом кальция - «Са2+ release-activated current» - CRAC [Hoth and Penner, 1992] в значительной степени охарактеризованы: они высокоселективны для Са2+, активируются при гиперполяризации мембраны, инактиви-

руются внутриклеточным Са2+ и обладают уникально низкой проводимостью (от фСм до 1 пСм), вследствие чего их идентификация на уровне измерений токов через одиночные каналы признана невозможной. Основным аргументом "депо-зависимости" СИАС-каналов являются данные о том, что их активация возможна при опустошении депо путем ингибирования эндосомальных АТФаз, без повышения концентрации 1Рз- С другой стороны появляются новые данные о способности ГР3 непосредственно активировать Са2+-псреносящие каналы в плазматической мембране со свойствами подобными СЯАС-каналам [К1$е1уоу й а1., 1997]. Свойства СКАС-каналов, связь между процессами опустошения Са2+ депо и запуском Са2+ входа, участие в этом процессе активации рецептора 1Р3, взаимодействие 1Р3К и кальций-переносящих каналов - это основные, проблемы кальциевой сигнализации. Исследование функциональных характеристик Нечувствительных кальциевых каналов в плазматической мембране и механизмов их регуляции позволит решить вопрос о ключевых звеньях в формировании кальциевого ответа клетки на стимуляцию рецепторов кальций-мобилизующими агентами (гормонами, ростовыми факторами и пр.).

Цели и задачи исследования. Цель данной работы состояла в исследовании участия в кальциевом сигнале Са2' -переносящих ионных каналов, способных непосредственно активироваться инозигол (1,4,5)-трифосфатом (1Р3) и обеспечивать вход Са2+ во время ответа клетки на рецепторный стимул. Были поставлены следующие задачи:

1. Изучить возможность 1Р3 -зависимой активации кальций-переносящих каналов в клетках перитонеальных макрофагов мыши.

2. Определить основные биофизические характеристики Нечувствительных каналов: проводимость, селективность по отношению к двухвалентным и одновалентным катионам, зависимость от мембранного потенциала.

3. Исследовать зависимость активности каналов от концентрации П"3.

4. Исследовать влияние на активность 1Р3-чувствитеяьных кальциевых каналов блокаторов ^-рецепторов эндоплазматического ретикулума - гепарина и ара-хидоновой кислоты.

5. Определить механизмы активации и ретуляшш исследуемых каналов.

Научная новизна исследования. Впервые описаны кальциевые каналы в мембране перитонеальных макрофагов мыши, активирующиеся непосредственно инозитол (1,4,5)- трифосфатом (1Р3) с циггоплазматнческой поверхности мембранного фрагмента.

Установлено, что исследуемые каналы высоко селективны для Са2+, имеют уникально низкую проводимость; характеризуются повышением активности при гипергюлярюации мембраны. Эти свойства сближают идентифицированные в плазматической мембране макрофагов каналы с каналами, чувствительными к опустошению внутриклеточных Са2' депо (СИАС-каналами). Определены ре-цепторные характеристики этих каналов; дозо-завясимость эффекта 1Ря, ГР}-зазясимачг десенситизашга рецептора, ингибирование гепарином, ингибирукнцее влияние арахидоновой кислоты. Сходства рецепторных характеристик исследуемых каналов с известными свойствами рецептора ЕР? эндоплазматического ретикулума позволяют предполагать возможность регуляции обнаруженных каналов через активацию этого рецептора..

Теоретическое и практическое значение работы. Полученные результаты важны для понимания сложного механизма регуляции поступления а клетку и роли инозитоя (1,4,5) -трифосфата в этом процессе. Анализ полученных результатов свидетельствует в пользу справедливости конформационной модели передачи сигнала при запуске рецептор- управляемого входа ионов Са-"' в невозбудимых клетках. Выяснение биохимических и биофизических механизмов рецептор-зависимой передачи кальциевого сигнала, запускающего основные физиологические функции, приведет к решению таких проблем как нарушение дифференцировки, пролиферации, секреции и других жизненно важных фуш-ций живой клетки.

Апробация работы.

Основные положетга работы доложены и обсуждены на: симпозиуме «Мембранный транспорт и функции клетки» (Санкт-Петербург, 1994), 41 Съезде Биофизического общества США (Новый Орлеан, 1997), Втором съезде Биохимического общества РАН (Москва, 1997), 33 Интернациональном Конгрессе фи-

экологических наук (Санкт-Петербург, 1997), заседании общегородского семинара «Молекулярные подходы к изучению физиологических процессов» (Санкт-Петербург, 1998).

Объем и структура диссертации.

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложения экспериментальных данных, обсуждения результатов, выводов и списка литературы, содержащей/^»публикации. Работа изложена на^ страницах машинописного текста и иллюстрирована /^рисунками.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Клетки. Исследования проводили на резидентных перитонеальных макрофагах, выделенных из взрослых самцов мыши линии Бальба. Клетки культивировали в пластиковых чашках Петри на покровных стеклах размером 4x4 мм2. Культуру поддерживали в среде RPMI 1640 (Москва) с добавлением 10 % эмбриональной сыворотки ("Flow", Англия ), 100 мкг/мл стрептомицина и 100 ед/мл пенициллина в инкубаторе с 5 % СОг при 37 °С. Тест на эстеразную активность с использованием а-нафтил- ацетата показал, что не менее 98 % выделяемых клеток - макрофаги.

Флуоресцентные измерения цюпотазматического Сс?*. [Ca2+]¡ в одиночных резидентных перитонеальных макрофагах измеряли с помощью флуоресцентного зонда fura-2 AM (Molecular Probes, США). Клетки окрашивались 30-45 мин при 37°С в среде с 5 мкМ зонда. Бескальциевую среду получали добавлением к раствору, не содержащему СаС12, 0,1 мМ EGTA. Флуоресценцию fura-2 поочередно возбуждали светом с длинами волн 340 и 380 нм с помощью ксеноно-вой лампы ДКСШ-150, а регистрировали при 520 нм. Для определения [Са2+]; использовали отношение флуоресценции при длинах волн F340/F380 (Grynkiewiez et al., 1985).

Регистрация ионных токов и обработка данных. В работе использовали метод локальной фиксации потенциала (patch clamp) в двух конфигурациях: в условиях подведения регистрирующей пипетки к мембране интактной клетки (cell-attached) и на изолированном фрагменте мембраны (inside-out) в условиях,

когда наружная поверхность плазматической мембраны обращена в регистрирующую пипетку, а цитоплазматическая сторона мембраны доступна для смены растворов. Потенциал внеклеточного раствора принимали за нулевой. Использовали пипетки, имеющие сопротивление в растворе от 4 до 10 МОм. Сигнал с усилителя PC 501А (Warner Instr.) с сопротивлением в цепи обратной связи 10 ГОм, фильтровали при 200 Гц и записывали в компьютер с помощью аналого-цифрового преобразователя PCL-718 (Laboratory Technologies Сотр.) с частотой 1-2 кГц. Обработку данных и подготовку графиков проводили при помощи прикладной программы для обработки токовых записей активности одиночного ионного канала pClamp б (Axon Instruments) и графической программы Microcal Origin (5).

Вероятность пребывания каналов в открытом состоянии NP0. вычислялась по формуле: NPo = <I> / i, где N - число функционирующих каналов в даипом мембранном фрагменте; <1> - средний ток; i - амплитуда тока через одиночный канал. Первоначальная оценка амплитуд токов проводящих подсостояний производилась визуально по наиболее длинным событиям. В дальнейшем значения амплитуд токов подуровней проводимости получались построением амплитудных гистограмм, которые описывались гауссовским распределением.

Эксперименты проводились при комнатной температуре.

Растворы. В начале опыта стекла с прикрепленными на них клетками помещали в экспериментальную камеру, заполненную контрольным наружным раствором следующего состава (мМ): 145 NaCl, 5 КС1, 20 HEPES/KOH, 2 СаС12, 1 MgCk, (рН 7.4). После достнжешм плотного контакта между поверхностью регистрирующей пипетки и мембраной, раствор в камере заменяли на аналогичный, в котором все ионы Na+ были заменены на К+ для компенсации потенциала покоя клетки. Раствор в регистрирующей пипетке содержал (мМ): 105 ВаСЬ, 10 Трис / НС1. Присутствие ионов Ва способствовало предотвращению активации Саг+-зависимых калиевых каналов. В некоторых экспериментах в качестве проникающего катиона использовали 100 мМ Са2+. Внутриклеточный раствор содержал (мМ): 120 К-глутамат, 5 NaCl, 10 HEPES/KOH, 5.98 СаС12, 10 EGTA, 1 MgCI2, (рН 7.4, рСа 7). Концентрации Са2+ рассчитывали на основании формул, приведенных в статье Fabiato А. и Fabiato F.(1979). 1Рз, гепарин, GTPyS, 4-

бромфенацилбромид (4-БФБ), мсиакрин, тапснгаргин, арахидоновую кислоту (АА) (Sigma), хранили в замороженном виде; растворы приготавливали непосредственно перед экспериментом. Подачу свежеприготовленного раствора производили путем перфузии камеры 3-5-кратным объемом, что обеспечивало полную смену раствора менее чем за 300 мс.

Опыты проводили при температуре 22-24 °С.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Активация входа Са2+ в клетку при действии уридинтрифосфата ГСЛГР').

В данной серии экспериментов исследовался вход Са2+ снаружи внутрь клеток, возникающий после П^-зависимого опустошения внутриклеточных кальциевых депо. Для изучения природы этого входа мы использовали UTP-агонист группы пуринэргических рецепторов, не имеющий рецепторов Са2+-каналов в плазматической мембране макрофагов, но запускающий фосфоинози-тидный обмен в клетке, приводящий к опустошению внутриклеточных кальциевых пулов. Измерение уровня цитоплазматического Са2+ проводилось с использованием Са2+- чувствительного зонда Fura-2M на одиночных клетках культуры перигонеальных макрофагов мыши. Подачу агониста проводили в бескальциевой среде, для того, чтобы добиться максимального опустошения внутриклеточных Са2+-депо. Затем проводили повторную подачу UTP предварительно выдерживая клетки в бсскальциевом растворе без агониста или добавляя Са2+ в среду. Как видно на рис.1 при стимуляции макрофага 100 мкМ UTP в среде, не содержащей Са2+, наблюдался резкий подъем цитоплазматического Са2+ и быстрый его спад до исходного уровня, что может быть объяснено 1Р3-зависимым выбросом Са2+ из внутриклеточных депо. При дальнейшем выдерживании клеток в бескальциевой среде повторная подача агониста не вызывала повторный выброс Са2+ из внутриклеточных хранилищ. После же выдерживания клеток в кальций содержащей среде (2 мМ СаС12), наблюдался длительный стационарный ответ, и регистрировался повторный выброс Са2+.

Гис.1 Депо-зависимый CaJ+ вход в нативпой клетке макрофагов мыши.

вверху: Изменение концентрации [Ca,+]j измеренное с использованием флуоресцентного красителя Fura-2M. Аппликация UTP вызывает выброс Са2+ из депо; повторная аппликация UTP не приводит к выбросу; вход Са2+ снаружи приводит к заполнению депо и обеспечивает повторный выброс, внизу: Ионы Ni2* блокируют поступление Са2+ в клетку.

время (сек)

Таким образом, было продемонстрировано, что выброс Са2+ из внутриклеточных депо влечет за собой вход Саснаружи внутрь клетки, необходимый для пополнения кальциевых запасов, он известеп в литературе как «депо-зависимый» кальциевый вход. Тот факт, что введение блокаторов Са2+-каналов Ni2v и La2* устранило вход Са2+ в клетку позволил нам предположить, что он имеет канальную природу.

Активация ионных токов в ответ на приложение ПЧ

На следующем этапе наших исследований было решено проверить, не может ли продукт фосфоинозигидного обмена инозитол (1,4, 5) трифосфат (1Р3) сам активировать вход Са2+ в макрофаги мыши. Для этого с цитоплазматической поверхности изолированного фрагмента мембраны (конфигурация inside-out) ап-плицировали ГРз в микромолярных концентрациях и регистрировали токи при фиксированном мембранном потенциале. Как правило, 1Рз подавали на фрагмент мембраны, в котором не было зарегистрировано базальной активности или она не превышала 0.1 пА. Раствор в регистрирующей пипетке содержал или Ва2+ (105 мМ) или Са21" (100 мМ) в качестве единственных проникающих катионов.

[Са2*], мкМ

Приложение 1Р3 в концентрации от 0.2 до 10 мкМ к цитоплазматической поверхности изолированных мембранных фрагментов в 47 из 65 опытов (72%) вызывало появление низкоамплитудных токов входящего направления. На рис.2,А показана типичная запись токов, вызванных приложением 2.5 мкМ ЕРз при потенциале на мембране -90 мВ. Можно видеть, активность каналов постоянной амплитуды 0.2 пА, как разрешимую визуально, так и в результате построенной амплитудной гистограммы. Ниже показаны фрагменты этой записи тока в развернутом масштабе времени.

2.5 1Р,

500мс

-0.4 -0.2 0.0 ПА

Рис.2 ГРз активирует каналы в изолированном фрагменте плазматической мембраны макрофагов.

А - Непрерывная запись токов, зарегистрированных после добавления 2.5 мкМ 1Рз (указано стрелкой). Мембранный потенциал -90 мВ. Фильтр 50 Гц. Фрагменты той же записи токов в развернутом масштабе времени. Пунктирные линии показывают амплитуду токов через одиночные каналы. Филыр 80 Гц.

Б - Амплитудная гистограмма, построенная по фрагменту записи (18 сек) Ва2+-токов при -90 мВ.

Изучение проводящих свойств данных каналов выявило, что они одинаково хорошо переносят ионы Ва2+ и Са2+. Чтобы исключил, возможную Са2+-зависимую инактивацию входящего тока, в последующих экспериментах в качестве проникающего катиона использовали в основном Ва2+.

На рис.3 приведена вольт-амперная характеристика каналов по полученным и усредненным в 12 экспериментах данным. В качестве носителя ионов использовали 105 мМ Ва2+. Из этой вольт-амперной характеристики следует, что индивидуальная проводимость каналов очень мала и составляет 1пСм, экстрапо-

лировашый потенциал реверсии токов составляет не менее +75 мВ. Такое высокое значение потенциала реверсии указывает на очень высокую селективность исследуемых каналов для Ва2+ по отношению к ионам К* (концентрация которого в растворе с внутриклеточной стороны мембранного фрагмента составляла 120 мМ К*).

Рис.3 Вольт-амперная характеристика 1Рз-активи-руемых каналов Значения среднеквадратичных отклонений не превышают размеров символов. Ось абсцисс -мембранный потенциал, ось ординат -ток. Данные 4-9 экспериментов.

Оценка селективных свойств канала по модифицированному уравнению Гольдмана-Ходжкина-Катца [Hille, 1992] дает отношение проницаемостей Рва/Рк>1000. Такое соотношение сопоставимо с аналогичными значениями для кальциевых потенциал-чувствительных каналов L-типа.

Активность исследуемых каналов имела очень четко выражеш1ую зависимость от мембранного потенциала. Вероятность открытого состояния каналов (NPq) была очень мала, либо канальная активность вообще не регистрировалась при поддерживаемых потенциалах на мембране от 0 до -30 мВ и увеличивалась с ростом гиперполяризации мембраны от -30 до -100 мВ. Такая зависимость может иметь определенный функциональный смысл - она создает положительную обратную связь в процессе активации каналов: повышение [Са2+]; при действии Са2+-мобшшзующих агонистов вследствие как выброса Са2+ из депо, так и его входа, приводит к активации Са2+-зависимых калиевых каналов [Mozhayeva G.N. et aL, 1989] и к пшерполяризации мембраны, которая, в свою очередь, способствует усилению входа Са2+.

IP3, непосредст венно активирует ионные каналы.

Целью следующей серии экспериментов было показать, что IP3 активирует каналы непосредственно, а не через опустошение микросомальных кальциевых депо, которые согласно некоторым исследованиям, могут быть затянуты в регистрирующую пипетку вместе с фрагментом мембраны [Rucbnudin A., Song M.J., Sachs F. 1991].

О 100 200 300 400 сек

Рис.4 Тапсигаргин пе активирует каналы в изолированном фрагменте плазматической мембраны. Изменение вероятности открытого состояния канала. В присутствии Тв не зарегистрировала канальная активность, в то время как аппликация 2.5 мкМ Р3 активирует каналы.

Мы выдерживали изолированный фрагмент мембраны в растворе с 10 мМ ЕвТА в течение 2-10 мин, тем самым уменьшая концентрацию Са2+ в гипотетическом микродспо. Эти условия часто используют для индуцирования 1стас. Но это не привело к какому-либо повышению активности каналов. Так же не наблюдалось эффекта и при обработке пэтча в течение 3 минут классическим ингибитором кальциевых АТФаз и активатором 1стас тапсигаргином (п=5), и только последующее добавление 1Р3 вызывало развитие активности каналов. На основании этих контрольных экспериментов нами был сделан вывод, что предварительное опустошение Са2+ депо в изолированном фрагменте не только не активирует каналы, но и не предотвращает способности 1Рз вызывать их активность. Рисунок 4 иллюстрирует эти опыты.

ПУзависимая инактивация Са2+-каналов.

Как правило активность регистрируемых каналов уменьшалась и в итоге исчезала при продолжительной аппликации 1Р3, тем быстрее исчезала, чем большая концентрация лиганда использовалась. На рис.5 показано развитие активности каналов, вызванной приложением разных концентраций (2.5, 5, 10

мкМ) ЕРз- В качестве меры активности каналов была принята верояггность открытого состояния (ИР»), усредненная по трем опытам и нормированная по максимальному значению в каждом из них. Из этих кривых отчетливо видно, что активность каналов, вызванная 10 мкМ 1Р3, полностью закончилась примерно через 30 секунд, активность, вызванная 5 мкМ 1Р3 закончилась через 100 секунд, в то время, как в присутствии 2.5 мкМ 1Р3 активность продолжалась и через 110 секунд после аппликации 1Рз.

Рис.5 Инактивация 1Рз-чувствительных каналов.

Спад активности каналов, выраженной в единицах NP0, зависит от концентрации 1Рз. Каждая гистограмма представляет собой средние данные из трех опытов, нормированные относительно максимального значения NP0 в каждом эксперименте. 105 мМ Ва2+ в пипетке, мембранный потенциал -70 мВ.

Данные кривые не отражают реальных значений NPo, в данной иллюстрации, но показывают характер развития активности каналов во времени. Увеличение скорости спада активности с увеличением концентрации 1Р3 указывает на то, что 1Р3 способен ингибировать вызванную им активность. Это согласуется с данными по десенситизации BP3R эндоплазматического ретикулума инозигол трифосфатом. [Hajnoezky, Thomas, 1994], что позволяет нам предположить, что одной из причин инактивации исследуемых токов является десепситизация рецептора.

В пользу этого предположения также можно привести следующие наблюдения. Во-первых, было отмечено, что после того, как активность, вызванная приложением IP3 в низких концентрациях (0.5-2 мкМ), достигала максимума, повышение концентрации IP3 (5-10 мкМ) не приводило к усилению активности каналов и более того - уменьшало ее. Во-вторых, уменьшение активности было обратимым, временное удаление IP3 из раствора восстанавливало способность каналов вновь активироваться на приложение ЕР3.

В работе было также показано, что добавление гепарина (100 мкг/мл), специфического блокатора ПУсвязывающего места на IP3R эндоплазматическо-го ретикулума [Ross С.А., Meldolesi J., Milner T.A. et all., 1989], полностью подавляет активность каналов (n=5).

Зависимость NPg каналов от концентрации ПЧ

С учетом процесса десенситизации рецептора 1фивая концентрационной зависимости NP0 была рассчитана по фрагментам записей токов длительностью 20 с в период стабильной активности каналов в ответ на первое приложение IP3. Поскольку для построения кривых дозозависимости мы использовали значения вероятности, полученные в разных опытах, а не на одном фрагменте, это существенно увеличило разброс данных. Значения NP0, полученные при каждой концентрации №3 в разных экспериментах, были усреднены и дали значения для 0.5 мкМ 1Р3 0.36+0.15 (п=4), для 2.5 мкМ IP3 0.64±0.1 (п=9), дом 5мкМ 0.58+0.15 (п=5) и для 10 мкМ ГР3 0.37±0.03 (п=3). Как видно на рис.6, NP0 увеличивается с ростом концентрации до 2.5 мкМ, а затем падает с увеличением концентрации. Было определено, что полумаксимальная величина NP0 для обоих типов клеток соответствует концентрация ГР3 от 0.2-0.5 мкМ, что близко по значению константе связывания для IP3R эндоплазматического ретикулума [Paiys J.B., Bez-prozvarmy I. 1995]. Однако разброс между значениями NP0 в разных пэтчах, который выгекает из специфики используемой методики, затруднил определение реальной константы связывания лиганда с рецептором.

NP0 0.8

0.60.40.2 -0.0-

П 1 г 0.5 2.5 5

10

Рис.6 Зависимость вероятности открытого состояния ГРз-акгивируемых каналов (NP0) от концентрации IP3. В качестве носителя тока использовали 105 мМ Ва2+, токи регистрировались при потенциале на мембране -70 мВ. Каждая точка построена по данным 3-9 экспериментов.

Щ

мкМ

Механизмы модуляции ПУакгивируемых кальциевых каналов.

Поскольку инактивация каналов, наблюдавшаяся даже при использовании относительно низких концентраций №3, затрудняла исследование их свойств, нами были предприняты попытки найти способы модуляции их активности. В исследовании на клетках А431 негидролизуемый аналог вТР, СГРуЗ, значительно продлевал время работы каналов. В экспериментах на макрофагах этот эффект повторялся лишь в 30% опытов. В последнее время появились работы в которых было показано, что можно повысить чувствительность рецептора (1Р3Я) эндоплазматического ретикулума к 1Рз, если ингибировать высвобождение ара-хидоновой кислоты , широко изучаемого в последнее время модулятора ионных каналов. На клетках поджелудочной железы крысы [Магиуата У. 1993], и мыши [Ыо\у1ез в., ОаИасЬег 1996] было показано, что предварительная обработка клеток 4-бромфенацилбромидом (4-БФБ), относительно селективным ингибитором фосфолипазы Аз, повышала чувствительность эндосомального П*з11 к 1Рз-Это приводило к увеличению выброса Са2+ из внутриклеточных депо и к повышению [Са2+]ь уровень которого контролировался по активности Са2+-чувствительных хлорных каналов.

Мы выдерживали клетки в растворе, содержащем 5 мкМ мепакрина- бло-катора фосфолипазы А2, а также вводили его с цигоплазматической стороны мембраны в процессе эксперимента на изолированных мембранных фрагментах.

10 мкМ|Р,

Как видно на рис.7,А,Б, мепакрин в присутствии 1Р3 существенно увеличивал активность каналов и устранял их инактивацию. После 3-минутной предобработки клеток мепакрином активность, вызванная 10 мкМ 1Р3, не спадала в течение нескольких минут (п-5) (Рис.7,Б). Введение мепакрина в цитозольный раствор восстанавливало и продлевало активность каналов после их инактивации (Рис.7,А). В контрольных опытах вымачивание клеток в мепакрине (п=4), или подача его во внутриклеточный раствор без 1Рз не имели какого-либо эффекта.

Рис.7 Мепакрин устраняет инактивацию каналов А - В эксперименте на изолированном мембранном фрагменте активность каналов, вызванная приложением 10 мкМ 1РЭ, исчезла через несколько секунд и была возобновлена и усилена добавлением 5 мкМ мепакрина. Б - После обработки клетки раствором с 5 мкМ мепакрина в течение 3 мин фрагмент мембраны был изолирован и продолжал находиться в растворе, содержащем мепакрин. Подача 10 мкМ 1Рз вызвала активность каналов, которая не обнаруживала признаков инактивации в течение нескольких минут.

250 сек

5 мкМ мепакрина

600 сек

Кроме того мы использовали также 4-БФБ в качестве ингибитора фосфо-липазы А2. Добавление 4-БФБ также, существенно увеличивало активность, вызванную 1Р3. Введение арахидоновой кислоты (1мкМ) во внутриклеточный раствор, содержащий ГР3, блокировало активность каналов (п=3). Тот факт, что активность ГРз-чувстшпельных каналов находится под негативным контролем арахидоновой кислоты, представляется важным, поскольку оба продукта - и ГР3, и арахидоновая кислота являются звеньями одного и того же сигнального пути метаболизма фосфоинозитидов, который запускается активацией фосфолипазы С, сопряженной с рецепторами кальций-мобилизующих агонистов.

Са2*-каналы. активируемые в условиях нативной клетки при действии UTP.

Следующие серии опытов были проведены с целью выяснить свойства каналов, активирующихся в нативной клетке при действии аготшста, вызывающего продукцию IPj. Для этого были проведены эксперименты в конфигурации cell-attached с использованием уридинтрифосфата (UTP). Добавление 100 мкМ UTP в раствор, омывающий клетку, приводило к появлению входящих Ва2+ токов. Значения NPn для каналов, вызванных 100 мкМ UTP составили 0.65±0.08 (п=6). Изоляция мембранного фрагмента приводила к исчезновению активности каналов, а последующее добавление 1Рз в раствор, омывающий цитоплазматическую сторону мембранного фрагмента, возобновляло активность каналов с характеристиками, идентичными UTP-вызванным (рис.8).

cell-attached до псдачииТР

cell-attached IOOMKMUTP

0,00 -0,18 -0,36 -0,64

Inside-out 2.5 мкМ IP.

IT

0.00 -0,18 -0,36

Рис.8. UTP активирует каналы со свойствами идентичными ПУ чувствительным Са2+-каналам.

Записи токов зарегистрированные в одном эксперименте: на целой клетке, в конфигурации cell-attached - до и после подачи UTP (вверху). После отрыва фрагмента мембраны, и переходе в конфигурацию inside-out -до и после подачи 2.5 мкМ 1Рз (внизу). В пипетке 105 мМ Ва2". Потенциал на мембране -70 мВ.

500 мсек

Сопоставление вольт- амперных характеристик каналов, активируемых в нативной клетке в макрофагах, а также в изолированном мембранном фрагменте, однозначно указывает на их идентичность

Таким образом, в настоящей работе показано, что инозитол-трифосфат прямо активирует ионные каналы в плазматической мембране перитонеальных макрофагов мыши. Свойства данных каналов идентичны, тем которые зарегистрированы при действии Са2+-мобилизующего агониста - уридинтрифосфата.

Низкая проводимость (порядка 1пСм даже при высокой концентрации носителя тока), высокая селективность к двухвалентным ионам, способность этих каналов активироваться при высоких отрицательных потенциалах на мембране, резко отличают эти каналы от известных 1Р3- активируемых каналов в эндоплазматиче-ском ретикулуме, однако позволяют их сопоставить с каналами, чувствительными к опустошению внутриклеточных Са2+- депо (CRAC-каналами). Примечательно, что рецепторные характеристики изучаемых каналов: значения действующих концентраций IPj (0.2-10 мкМ), 1Р3-зависимая десенситизация рецептора, ингибирование гепарином и арахидоновой кислотой - близки свойствам рецептора ГР3 (IP3R) эндошгазматического ретикулума. Полученные нами дшшые на изолированных фрагментах мембраны, позволяют исключить влияние на активность каналов процессов, сопряженных с опустошением Са2+ депо и предположить, что фактором, запускающим активность исследуемых каналов является их прямое взаимодействие с активированным, в результате связывания с IP3, рецептором IP3R эндоплазматического ретикулума, расположенным в непосредственной близости к плазматической мембране. Такая точка зрения согласуется с известной в литературе «coupling model», подкрепленной многими данными морфологического и иммуноцитохимического характера.

ВЫВОДЫ

1. Методом локальной фиксации потенциала на изолированном фрагменте мембраны показано, что инозитол (1,4,5)-трифосфат прямо активирует ионные каналы в плазматической мембране перитонеальных макрофагов мыши.

2. Методом локальной фиксации потенциала на нативной клетке показано, что уридинтрифосфат (UTP) активирует Са2+-каналы, со свойствами идентичными каналам зарегистрированным при действии IP3 в изолированном фрагменте мембраны.

3. Зарегистрированные каналы характеризуются низкой проводимость (около 1 пСм для 100 мМ Са2+ и 105 мМ Ва2*), высокой селективностью для Са2+ относительно К+ (Рса/Рк^ЮОО); вероятность их открытого состояния резко возрастает при гиперполяризации мембраны. Указанные свойства резко отличают

эти каналы от ГР^-активируемых каналов эндоплазматнческого ретнкулума, но позволяют причислить их к семейству CRAC-каналов.

4. Для исследуемых каналов характерна 1Р3-завнсимая десенситизация рецептора, они блокируются гепарином и арахидоновой кислотой, их активность можно продлить используя блокаторы фосфолипазы Аг. Рецепторные свойства исследуемых каналов, близки свойствам рецептора 1Р3 эндогагазматическо-го ретнкулума.

5. Полученные факты позволяют предположить, что исследуемые нами 1Рз-чувствительные Са2+ каналы, возможно, регулируются через 1Р3-рецептор эндоплазматнческого ретикулума, который путем неких конформационных изменений при связывании с IP3, передаст сигнал с эндоплазматнческого ретикулума к высокоселективному Са2+ каналу плазматической мембраны.

СПИСОК РАБОТ ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ.

1. М.Г.Можаева, А.Г.Бикташев, С.Б.Семенова, Г.Н.Можаева. (1995) EGTA-индуцированный вход ионов кальция в клетки макрофагов мыши. Цитология, 37,4, 377-378.

2. К.И.Киселев, А.Г.Мамин, С.Б.Семенова, Г.Н.Можаева (1997). Новый тип IPj-чувствительных высокоселективных кальциевых каналов низкой проводимости в плазматической мембране клеток карциномы А431. Цитология, 39, 6, 395-407.

3. С.Б.Семенова, К.И.Киселев, Г.Н.Можаева (1997). Инозитол-(1,4,5)-трисфосфат активирует кальциевые каналы плазматической мембраны пери-тонеальных макрофагов мыши. Второй съезд Биохимического общества РАН. (Москва) VI.38.

4. K.I. Kiselyov, A.G. Mamin, S.B. Semyonova & G.N. Mozhayeva (1997). IP3-activated Ca2~-selective channels from plasma membrane of human carcinoma A431 cells. Biophysical Journal, 72, 279A.

5. K.I. Kiselyov, A.G. Mamin, S.B. Semyonova & G.N. Mozhayeva (1997) Low conductance high selective inositol (l,4,5)-trisphosphate-activated Ca2+ channels in plasma membrane of A431 carcinoma cells. FEBS Letters 407, 309-312

6. A.G.Mamin, S.B. Semyonova, K.I Kiselyov & G.N. Mozhayeva (1997) Arachidonic acid affects IP3- activated Ca2' channels iii plasma membrane of human carcinoma cells. XXXIII International Congress of Physiological Sciences (St.Petersburg) P002.41.

7. K.I.Kiselyov, S.B. Semyonova, A.G. Mamm & G.N. Mozhayeva (1997) IP3-activated Ca2+ channels in plasma membrane of mouse macrophages. XXXIII International Congress of Physiological Science (St.Petersburg) P002.42.

8. С.Б.Семенова, К.И.Киселев, Г.Н.Можаева (1998). Кальциевые каналы низкой проводимости в плазматической мембране макрофагов: активация инозитол (1,4,5)-трифосфатом. Российский Физиологический журнал им И.М.Сеченова 1998, т.84, № 5/6, с.417-425.

9. K.I.Kiselyov, S.B. Semyonova, A.G. Mamm & G.N. Mozhayeva (1998) Miniature Ca2+ channels in excised plasma-membrane patches: activation by IP3. Pflugers АгсЬ.(в печати).

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Семенова, Светлана Борисовна, Санкт-Петербург

О О /з

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК ИНСТИТУТ ЦИТОЛОГИИ

На правах рукописи УДК 577.352.43:612.017

СЕМЕНОВА Светлана Борисовна

КАЛЬЦИЕВЫЕ КАНАЛЫ НИЗКОИ ПРОВОДИМОСТИ В ПЛАЗМАТИЧЕСКОЙ МЕМБРАНЕ МАКРОФАГОВ: АКТИВАЦИЯ ИНОЗИТОЛ (1,4,5)-ТРИФОСФАТОМ

03.00.25 Клеточная биология

ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научный руководитель -член-корреспондент РАН Г.Н. Можаева

Санкт-Петербург 1998

Содержание

Введение (4)

1. Обзор литературы (8)

1.1. Роль инозитол (1,4,5)-трифосфата в передаче внутриклеточного сигнала (8)

1.2. Структура и функции рецептора 1Р3 (10)

1.2.1. Локализация и типы рецептора 1Рз (10)

1.2.2. Молекулярная структура 1Рз-рецептора (12)

1.2.3. Функциональные свойства Са2+-канала рецептора IP3 (14)

1.3. Са2+ вход в клетку, индуцированный инозитол (1,4,5)-трифосфатом (17)

О 4-

1.3.1.1Р3-активируемые Са -каналы в плазматической мембране клеток (18)

1.3.2. Вход Са2+ в клетку, активирующийся после опустошения Са2+ депо (19)

1.3.2.1 Потенциал-зависимость, селективность и

проводимость тока, активируемого опустошением Са2+-

депо (Icrac) (21)

1.3.3. Модели «депо-зависимого» кальциевого входа (25)

1.3.3.1. Модели с участием водорастворимых факторов (26)

1.3.3.2. Конформационная модель взаимодействия «coupling model» (28)

1.4. Арахидоновая кислота - модулятор внутриклеточных процессов (35)

1.4.1. Механизмы образования свободной арахидоновой кислоты

(36)

1.4.2. Роль арахидоновой кислоты в регуляции ионных каналов и внутриклеточного Са2+ (38)

2. Материалы и методы исследования (43)

2.1. Клетки (43)

2.2. Флуоресцентные измерения цитоплазматического Са (43)

2.3. Регистрация ионных токов и обработка данных (43)

2.4. Растворы (45)

3. Результаты исследования (46)

3.1. Активация входа Са2+ в клетку при действии уридинтрифосфата (11ТР) (46)

3.2. Активация ионных токов в ответ на приложение 1Рз (48)

3.3. Прямое воздействие 1Р3 на ионные каналы (53)

2+

3.4. 1Рз-зависимая инактивация Са -каналов (55)

3.5. Зависимость ЫР0 каналов от концентрации 1Р3 (58)

3.6. Механизмы модуляции 1Рз-активируемых Са2+ каналов (59)

3.7. Са2+ каналы, активируемые в условиях нативной клетки при действии иТР (62)

4. Обсуждение результатов (66)

4.1.Заключение (73) Выводы (75) Список литературы (77)

СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ СОКРАЩЕНИЙ

АТР - аденозин 5'-трифосфат

[Ca2+]j - концентрация свободного цитоплазматического кальция

DAC - каналы активируемые опустошением депо

GDP - гуанозин 5'-дифосфат

GTP - гуанозин 5'-трифосфат

GTPyS - гуанозин 5'-0-тиотрифосфат

Лжас - ток через каналы, активируемые выбросом кальция

1Р3 - инозитол (1,4,5)-трифосфат

IP3R - рецептор 1Р3

NP0 - вероятность открытого состояния канала

PLA2 - фосфолипаза А2

PLC - фосфолипаза С

TG - тапсигаргин

UTP - уридин 5'-трифосфат

АК - арахидоновая кислота

4-БФБ - 4-бромфенацилбромид

CP - саркоплазматический ретикулум

ЭР - эндоплазматический ретикулум

ЭФР - эпидермальный фактор роста

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы. Одним из первичных и общих для всех типов клеток ответов на внеклеточную стимуляцию является повышение концентрации ионов Са2+ в цитозоле, реализующееся как высокоорганизованный в пространстве и времени кальциевый сигнал, наименее ясным звеном которого остается рецептор-индуцированный

9 4-

вход ионов Са , сопровождающий выброс кальция из внутриклеточных депо.

Известно, что выброс С а из депо осуществляется после связывания инозитол (1,4,5)-трифосфата (1Рз) с рецептором (IP3R), расположенным в мембране эндоплазматического ретикулума. 1Р3

мобилизует Са2 из ретикулума, увеличивая концентрацию свободного

2+

внутриклеточного Са в цитозоле ([Са ]¡) как за счет опустошения

гл 2+

кальциевых депо, так и за счет последующей активации входа Са из наружной среды в клетку. Существуют экспериментальные данные о том, что 1Рз-зависимый вход Са2+ опосредуется особым типом высокоселективных Са2+-каналов низкой проводимости, активация которых регулируется состоянием Са2+-депо, которые по мере их опустошения от кальция посылают сигнал к плазматической мембране клеток и запускают его вход внутрь клетки -«емкостная модель» входа Са [Putney 1990; Putney, Bird 1993]. В пользу этой модели свидетельствуют данные о регистрации кальциевых токов (7сгас) в условиях принудительного опустошения внутриклеточных кальциевых хранилищ [Hotli., Penner 1993; Luckhoff , Clapham 1994]. Природа сигнала, поставляющего к мембране сведения о степени заполнения депо Са2+, неизвестна и остается предметом дискуссий. В качестве возможных причин рассматриваются как формирование некоего водорастворимого мессенджера [Parekh, Terlau 1993], так и передача сигнала благодаря конформационным изменениям IP3R и прямому взаимодействию его с кальциевыми каналами, расположенными в

плазматической мембране - «конформационная» модель (coupling model) [Berridge, 1995]. Свойства токов, активируемых выбросом кальция -«Са2+ release-activated current» - CRAC [Hoth, Penner, 1992] в значительной степени охарактеризованы: они высокоселективны для Са2+, усиливаются при гиперполяризации мембраны, имеют четко выраженную зависимость от внутриклеточного Са2+ и обладают уникально низкой проводимостью (от фСм до 1 пСм), вследствие чего их идентификация на уровне измерений токов через одиночные каналы признана невозможной. Основным аргументом "депо-зависимости" CRAC-каналов являются данные о том, что их активация возможна при опустошении кальциевых депо путем ингибирования эндосомальных АТФаз, без повышения концентрации 1Р3. С другой стороны появляются новые данные о способности 1Р3 непосредственно активировать Са2+-переносящие каналы в плазматической мембране со свойствами подобными CRAC-каналам [Kiselyov et al., 1997]. Свойства CRAC каналов, связь между процессами опустошения Са2+ депо и запуском Са2+ входа, участие в этом процессе активации рецептора 1Р3, взаимодействие IP3R и кальций-переносящих каналов - это основные проблемы кальциевой сигнализации. Исследование функциональных характеристик 1Р3-чувствительных кальциевых каналов в плазматической мембране и механизмов их регуляции позволит решить вопрос о ключевых звеньях в формировании кальциевого ответа клетки на стимуляцию рецепторов кальций-мобилизующими агентами (гормонами, ростовыми факторами и пр.).

Цели и задачи исследования. Цель данной работы состояла в исследовании участия в кальциевом сигнале Са2+-переносящих ионных каналов, способных непосредственно активироваться инозитол (1,4,5)-трифосфатом (IP,) и обеспечивать вход Са во время ответа клетки на рецепторный стимул.

Были поставлены следующие задачи:

1. Изучить возможность 1Р3-зависимой активации кальций-переносящих

каналов в клетках перитонеальных макрофагов мыши.

2. Определить основные биофизические характеристики 1Р3-чувствительных каналов: проводимость, селективность по отношению к двухвалентным и одновалентным катионам, зависимость от мембранного потенциала.

3. Исследовать зависимость активности каналов от концентрации 1Р3.

4. Исследовать влияние на активность 1Р3-чувствительных кальциевых каналов блокаторов 1Р3-рецепторов эндоплазматического ретикулума - гепарина и арахидоновой кислоты.

5. Определить механизмы активации и регуляции исследуемых каналов.

Научная новизна исследования. Впервые описаны кальциевые каналы в мембране перитонеальных макрофагов мыши, активирующиеся непосредственно инозитол (1,4,5)-трифосфатом (1Р3) с цитоплазматической поверхности мембранного фрагмента.

Установлено, что исследуемые каналы высоко селективны для Са2+, имеют уникально низкую проводимость; характеризуются повышением активности при гиперполяризации мембраны. Эти свойства сближают идентифицированные в плазматической мембране макрофагов каналы с каналами, чувствительными к опустошению внутриклеточных Са депо (CRAC каналами). Определены рецепторные характеристики этих каналов: дозо-зависимость эффекта 1Р3,1Р3-зависимая десенситизация рецептора, ингибирование гепарином, ингибирующее влияние арахидоновой кислоты. Сходства рецепторных характеристик исследуемых каналов с известными свойствами рецептора 1Р3 эндоплазматического ретикулума позволяют предполагать возможность регуляции обнаруженных каналов через активацию этого рецептора.

Теоретическое и практическое значение работы. Полученные результаты важны для понимания сложного механизма регуляции поступления Са2+ в клетку и роли инозитол (1,4,5)-трифосфата в этом процессе. Анализ полученных результатов свидетельствует в пользу справедливости конформационной модели передачи сигнала при запуске рецептор- управляемого входа ионов Са2+ в невозбудимых клетках. Выяснение биохимических и биофизических механизмов рецептор-зависимой передачи кальциевого сигнала, запускающего основные физиологические функции, приведет к решению таких проблем как нарушение дифференцировки, пролиферации, секреции и других жизненно важных функций живой клетки.

1. Обзор литературы.

1.1. Роль инозитол (1,4,5)-трифосфата в передаче внутриклеточного сигнала.

Среди первых работ, показавших участие мембранных фосфолипидов в образовании вторичных мессенджеров, следует отметить работу Мичела [Michell, 1982]. Он выдвинул предположение о том, что стимулированное нейротрансмиттерами увеличение внутриклеточного Са2+ сопровождается гидролизом инозитол-содержащего липида фосфотидилинозитол 4,5-дифосфата (PIP2). И, уже в 1983 году Стреб с соавторами показали, что инозитол (1,4,5)-трифосфат (1Р3), являющийся продуктом рецептор- активированного гидролиза PIP2, участвует как вторичный мессенджер в образовании Са2+ сигнала. В опытах на пермеабилизованных клетках поджелудочной железы аппликация 1Р3 вызывала быстрое высвобождение Са2+ из внутриклеточных хранилищ в цитоплазму [Streb, Irvin, 1983]. Взрыв последовавших вслед за этим научных исследований показал всю важность этого открытия. Было продемонстрировано, что 1Р3-зависимый

/-1 2+ U к*

Ca сигнал опосредует действие гормонов, неиротрансмиттеров, ростовых факторов и других биологически активных веществ, которые регулируют такие жизненно важные процессы клетки, как мышечное сокращение, клеточный метаболизм и секрецию, а также рост клеток, их дифференцировку и пр. На нервной ткани было показано, что активация рецепторов (для глутамата, ацетилхолина, серотонина, брадикинина) и других, связанных с G-белками, приводит к образованию IP3 [Fisher, Agranoff, 1987; Fisher, et al., 1990].

Сейчас известно, что образование 1Р3 является ключевым событием в цепи двух путей клеточной сигнализации, один из которых берет начало со стимуляции рецепторов, связанных с G-белками, активирующихся ацетилхолином, гистамином, брадикинином,

глутаматом, вазопрессином, ATP, и т.д., другой - с активации рецепторов с тирозинкиназной активностью, к которым относятся ростовые факторы, такие как фактор роста тромбоцитов (PDGF), эпидермальный фактор роста (EGF) и пр. Эти отдельные рецепторные механизмы, используя энергию GTP или АТР, объединяются в конечном итоге в единый, который активирует фосфолипазу С (PLC).

В результате активации рецептора, связанного с G-белком, GDP, связанный с сс-субъединицей, заменяется на GTP и гетеротримерный G-белок диссоциирует с образованием Ga и Gpy субъединиц одна и другая из которых может активировать различные изоформы фосфолипазы С (PLC).

Другой путь клеточной сигнализации, осуществляющий высвобождение 1Рз, начинается с активации тирозинкиназного рецептора, который передает информацию через прямую связь с у-формой PLC. Ростовые факторы соединяют два рецептора вместе, их киназные цитоплазматические домены при этом фосфорилируют друг друга по тирозиновому остатку, образуя место для связывания с PLC-yl. В не стимулированных клетках PLC- yl находится в цитозоле, но переходит в мембранносвязанную форму сразу же после того как ее SH2 домен связывается с активированным рецептором. Активированная PLC гидролизует мембраносвязанный фосфолипид - фосфотидилинозитол 4,5- дифосфат (PIP2), в результате чего образуется водорастворимый посредник инозитол (1,4,5)-трифосфат и диацилглицерол (DAG). И 1Р3 и DAG являются в клетке вторичными мессенджерами, 1Р3 увеличивает внутриклеточную концентрацию Са в клетке, DAG активирует протеинкиназу С.

1Р3-вызванная мобилизация Са , включает два основных процесса:

л ,

1) - это быстрое (сек) высвобождение Са из внутриклеточных кальций содержащих пулов в ответ на связывание 1Р3 с рецепторами, расположенными в мембранах эндоплазматического ретикулума или

2+

кальциосомах и 2) - более продолжительная фаза входа Ca снаружи внутрь клетки. В то время как механизм выброса Са2+ из внутриклеточных депо хорошо изучен; рецептор, связывающий 1Р3 и одновременно являющийся каналом, проводящим Са2+, клонирован, изучена его молекулярная структура и механизмы регуляции, вторая фаза Са2+ ответа - 1Рз-зависимый вход внеклеточного Са2+ остается малопонятным процессом и, несмотря на усилия многих научных лабораторий, работающих в этом направлении, вызывает на сегодняшний день наибольшее количество споров и противоречивых толкований

1.2. Структура и функции рецептора IP3. 1.2.1. Локализация и типы рецептора IP3.

При проведении экспериментов по связыванию радиоактивного 1Р3 наибольшая плотность рецепторов IP3 (IP3R) была обнаружена в различных отделах мозга, в особенности, в мозжечке [Worley et al., 1987а; Worley et al., 1987b]. Специфическое связывание радиоактивного 1Рз было также показано при работе с микросомами периферических тканей, однако плотность рецепторов оказалась в среднем в 100 раз меньше. IP3R найдены во фракциях гладких мышц [Chadwick et al., 1990], печени [Pietri et al., 1990], коре надпочечников [Guillemette et al., 1990] и ооцитах [Parys, et al., 1992]. Многочисленные наблюдения IP3-индуцированного выброса Ca2+ из внутриклеточных депо в различных типах клеток позволили расширить этот список еще дальше.

Использование методики связывания с радиоактивным IP3 в качестве специфического маркера позволило осуществить выделение IP3R в виде индивидуального белка. В настоящее время рецептор IP3 выделен и очищен из клеток мозжечка, гладкомышечных клеток, и тромбоцитов. Очищенный рецептор является гликозилированным протеином (гликопротеином). Методами молекулярного клонирования

было обнаружено существование трех изоформ 1РзЯ, кодируемых разными генами. Это изоформа 1 (ТигшсЫ & а1., 1989; М1§пегу е1 а1., 1990], изоформа 2 [БисШоГ & а1„ 1991; Уатато1о-Нто а1., 1994;], изоформа 3 1Р3Я [В1оп<1е1, Таке(1а, 1993; Yamamoto-Hino & а1., 1994].

Среди других типов рецепторов 1Рз, изоформа 1 является наиболее распространенной, она состоит из 2749 аминокислотных остатков и имеет молекулярную массу 313 к Да. Структурно и функционально она разделяется на три части: лиганд связывающий ТЧН2-концевой домен занимающий примерно 24 % молекулы; СООН-концевой участок, формирующий Са2+-канал; и домен расположенный между двумя концевыми участками (около 60 %), обеспечивающий сопрягающую и модулирующую функцию между ними [М^пегу, БисШоГ 1990].

Изоформа 2 рецептора ГРз состоит из 2701 аминокислотных остатка и имеет молекулярную массу 307 кДа, 68 % процентов ее последовательности тождественны изоформе 1 1РзЫ [БисИк^ et а1., 1991]. Изоформа 3 1Р3Я состоит из 2670 аминокислотных остатков и имеет молекулярную массу 304 кДа, 62 % и 64 % её аминокислотной последовательности тождественны изоформе 1 и изоформе 2 рецептора 1Р3, соответственно [ТататоШ-Нто & а1., 1994]. Лиганд-связывающий домен является наиболее консервативным участком молекулы рецептора, в то время как сопрягающий домен является менее консервативным, что предполагает различие в регуляции этих трех изоформ 1Р3 Я.

Наибольшая плотность изоформы 1 1Р3Я найдена в клетках Пуркинье и поэтому основные молекулярные свойства были изучены у рецептора из клеток мозжечка, кроме того изоформа 1 была обнаружена в обонятельных нейронах, в коре головного мозга, в некоторых клетках гиппокампа [ТшшсЫ, Бшоп-СЬагойев, 1993], а также в гладкомышечных клетках, тромбоцитах и многих других, но в небольших количествах [№\у!:оп е1 а1., 1994]. Изоформа 2 и изоформа 3 1Р3Я имеют гораздо меньшее распространение. Методом

иммуноблоттинга было показано, что изоформа 2 экспрессируется в клетках печени, поджелудочной железы, легкого, селезенки и в небольших количествах в клетках мозга, включая мозжечок. Изоформа 3 экспрессируется в клетках поджелудочной железы, легкого, почек, мозга.

В основном, все изоформы рецепторов 1Р3 экспрессируются в разной степени в клеточных линиях независимо от их происхождения. [Newton et al., 1994; Wojcikiewicz, 1995].

1.2.2. Молекулярная структура 1Р3-рецептора.

Данные электронной микроскопии [Chadwick et al., 1990], метода поперечных сшивок [Maeda et al., 1991], центрифугирования в градиенте плотности сахарозы [Mignery et al., 1989] показали, что комплекс рецептора/канала 1Р3, так же как и рианодиновый рецептор (RyR), образует тетрамеры из четырех нековалентно связанных субъединиц, которые объединяются, формируя IP3-активируемый Са2+ канал. Каждая субъединица связывает одну молекулу 1Р3, а тетрамерный рецепторный комплекс может связать четыре молекулы. Однако, ни само связывание, ни открывание канала не являются кооперативным процессом: как в измерениях связывания