Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Механизмы регуляции АТФ-активируемых Са2+ - переносящих каналов в плазматической мембране перитонеальных макрофагов крысы

ВАК РФ 03.00.25, Гистология, цитология, клеточная биология

Автореферат диссертации по теме "Механизмы регуляции АТФ-активируемых Са2+ - переносящих каналов в плазматической мембране перитонеальных макрофагов крысы"

-- г-

I о

л "

2 7

На правах рукописи

МАМИН Антон Григорьевич

МЕХАНИЗМЫ РЕГУЛЯЦИИ АТФ-АКТИВИРУЕМЫХ Са2+.

ПЕРЕНОСЯЩИХ КАНАЛОВ В ПЛАЗМАТИЧЕСКОЙ МЕМБРАНЕ ПЕРИТОИЕАЛЬНЫХ МАКРОФАГОВ КРЫСЫ

03.00.25

Клеточная биология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

САНКТ-ПЕТЕРБУРГ 1997

Работа выполнена в Институте цитологии РАН, Санкт-Петербург

Научный руководитель: доктор биологических наук,

член-корреспондент РАН Г. Н. Можаева Институт цитологии РАН, Санкт-Петербург

Официальные оппоненты: доктор биологических наук

Л. В. Щапша Институт цитологии РАН, Санкт-Петербург

доктор биологических наук, профессор Г. А. Наследов

Институт эволюционной физиолопш и биохимии им. Сеченова РАН, Санкт-Петербург

Ведущее учреждение: Кафедра биофизики,

Санкт-Петербургский Государственный Технический Университет

• Защита состоится " Су" июня 1997 года в 13 ч. на заседании Диссертационного совета Д.002.73.01 Института цитологии РАН по адресу: 194064, Санкт-Петербург, Тихорецкий пр., д.4.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института цитологии РАН.

Реферат разослав " мая 1997 года.

Ученый секретарь Диссертационного совета

д.б.н .Н.Писарева

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. В клетках высших эукариот ионы кальция являются универсальным вторичным посредником в сложной цепи передачи сигнала от рецептора на плазматической мембране к внутриклеточным эффекторным структурам. Изменение концентрации свободного цитопдазматического кальция ([Ca"+]i) является сигналом, регулирующим множество жизненно-важных для клетки процессов, таклх как возбуждение, сокращение, секреция, активация метаболизма и синтеза ДНК, деление.

Все клетки, в соответствии с функциональным назначением и тканевой специфичностью, имеют в своем распоряжении набор механизмов поступления Са~+ в цитоплазму; при этом строго регулируется количество и скорость поступления ионов, а также распределение Са2+ между внутриклеточными структурами. Уровень [Ca2+]i в невозбудимых клетках - результат тонкого динамического равновесия между поступлением Ca2f из внеклеточной среды через плазматическую мембрану и его транспортом из цитоплазмы. Стимуляция клеток агонистами вызывает смещение этого равновесия и в большинстве случаев приводит к увеличению [Са2+]ь Рост [Са2+]; может быть обеспечен как за счет выброса Са2+ из внутриклеточных источников, так и за счет входа Са2+ из внеклеточной среды через плазматическую мембрану (Putney, 1987; Berndge, Irvine, 1989).

Известно, что вход Са2* в электровозбудимых клетках происходит через хорошо изученные потенциал-управляемые Са2+ каналы L, Т, N, Р и R типов (Reuter, 1986). L и Т типы кальциевых каналов были обнаружены также в некоторых невозбудимых клетках (Hackshaw, Shi, 1994; Bossu et al., 1992; Nilius et al., 1985).

Однако, исследования последних лет свидетельствуют о том, что поступление Са2+ через плазматическую мембрану в невозбудимых клетках происходит, в основном, за счет рецептор-зависимого входа, осуществляемого семейством каналов, отличных по своим свойствам и механизмам регуляции от потенциал-управляемых ионных каналов. Литературные данные свидетельствуют о возможности участия ГТФ-связывающих белков (G-белков) в процессе рецептор-зависимой модуляции активности ионных каналов плазматической мембраны.

Использование метода локальной фиксации потенциала (patch-clamp) в электрофизиологических исследованиях позволило охарактеризовать большое количество Са2+-проницаемых каналов, участвующих в обеспечении рецептор-зависимого входа Са2+ через плазматическую мембрану невозбудимых клеток. В частности, при исследовании влияния фосфонуклеотидов на мембрану перитонеальных макрофагов была обнаружена Р и-рецептор-зависимая

активация катнонного тока при внеклеточном приложении микромолярных концентраций АТФ (ATP) (Naumov et al., 1992, 1995).

Однако, данные о путях рецептор-зависимого поступления кальция на уровне одиночных каналов косят фрагментарный характер. Дальнейшее детальное исследование рецептор-управляемого входа ионов Са2+ через плазматическую мембрану невозбудимых клеток необходимо для получения целостного представления о механизмах внутриклеточной сигнализации.

Объектом исследования в настоящей работе были выбраны макрофаги. Неоспоримым преимуществом макрофагов как объекта электрофизиологических исследований является то, что плазматическая мембрана этих клеток содержит большое число различных рецепторов, а кальциевый сигнал (временное увеличение концентрации свободного цитоплазматического Са2+) в них в значительной степени определяется входом Са"+ из внеклеточной средьг (Alonso-Torre, Trautmann, 1993).

Цель и задачи исследования. Цель данной работы состояла в изучении механизмов активации и регуляции АТФ-индуцируемых Са2+-переносящих ионных каналов плазматической мембраны перитонеальных макрофагов крысы.

1. Выяснить возможность участия G-белков в процессе активации рецептор-зависимого входа Са2+ в ответ на внеклеточное приложение АТФ.

2. Исследовать зависимость активности и проводящих свойств АТФ-чувствательных Са2+-переносягцих каналов плазматической мембраны макрофагов от наружной и внутриклеточной концентрации кальция.

3. Определить роль подсостояний проводимости в обеспечении рецептор-индуцнрованного входа ионов Са2+ через плазматическую мембрану перитонеальных макрофагов крысы.

Научная нови^з подученных результатов. В результате проведенной работы впервые показано участие G-белка в процессе активации Са2+-переносящих каналов при действии АТФ на пуринорецептор Ры типа.

Охарактеризованы подсостояния канала с различными уровнями проводимости. Впервые на уровне измерений тока через одиночные каналы обнаружено ингибирование каналов при повьгшении [Са f]i в физиологическом диапазоне (10"6 - Ю"8 М), что позволяет предположить существование отрицательной обратной связи в процессе рецептор-управляемого входа кальция в клетку. Показано, что уменьшение среднего тока при повышении [Ca2+]¡ происходит благодаря перераспределению подуровней проводимости: канал начинает функционировать с большей вероятностью на низко проводящих подуровнях.

О существовании подуровней проводимости для некоторых типов ионных каналов сообщалось ранее, однако выводов о физиологической роли этого

феномена сделано не было. Данные настоящей работы позволяют заключить, что подсостояння канала могут выступать в роли тонкого регулятора поступления Са2+ через плазматическую мембрану во время рецептор-нндуцированного входа Са2+ в клетку.

Практическая ценность работы. Полученные в настоящей работе результаты свидетельствуют о вовлечении С-белков в процесс активации АТФ-индуцированных Са2+ - селективных каналов, что подтверждает мнение о том, что О-белки являются универсальными модуляторами активности различных ионных каналов. Обнаружение отрицательной обратной связи в процессе рецептор-унравляемого входа кальция в клетку важно для понимания функциональной роли ионных каналов клеточных мембран.

Реализация нескольких проводящих подсостояний - достаточно общий принцип работы Са2+-переносящих каналов в плазматической мембране невозбудимых клеток. Результаты .настоящей работы могут быть использованы при изучении механизмов ионной проницаемости клеточных и модельных липидных мембран.

Полученные данные о функциональных свойствах АТФ-индуцированных ГТФ-зависимых Са2+-селективных каналов могут быть использованы при разработке и тестировании фармакологических веществ. Результаты могут быть полезны для понимания механизмов действия и эффектов применения в терапии Са"+-мобилизузощих лекарственных препаратов.

Апробация работы. Материалы диссертации докладывались на: конференции Физиологического Общества Великобритании (Абердин, 1994), симпозиуме "Мембранный транспорт и функции клетки" (Санкт-Петербург, 1994), 39 конференции Биофизического общества США (Сан-Франциско, 1995), конференции Европейского Научного Фонда "Молекулярная нейробиология", (Италия, 1995), конференции молодых физиологов и биохимиков России "Биохимические и биофизические механизмы физиологических функций", (С-Петербург, 1995), совместном семинаре лабораторий Физиологии и Молекулярной Биологии Университета г. Леувен (Бельгия, 1996), нескольких международных школах для молодых ученых и научных семинарах Лаборатории Ионных Каналов Клеточных Мембран Института цитологии РАН. По материалам диссертации опубликовано 6 печатных работ. Объем и структура диссертации. Диссертация состоит из Введения, Обзора литературы, Материалов и Методов исследования, Результатов, Обсуждения результатов, Выводов и Списка литературы, содержащего публикаций. Работа изложена на страницах машинописного текста и иллюстрирована рисунками.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

Получение перитон^альных макрофагов крысы. Резидентные перитонеальные макрофага крысы линии Вистар получали промыванием брюшной полости. Клетки культивировались в бакпечатках на покровных стеклах размером 4x4 мм в инкубаторе с 5% СОп при 37° С в течение 2-4-х суток после выделения. Тест на эстеразную активность с использованием а-нафтил-ацетата (Monahan et al., 1981) показал, что не менее 98% выделяемых клеток - макрофаги. Регистрация ионных токов. В работе использовали метод локальной фиксации потенциала (patch-clamp) в условиях подведения регистрирующей пипетки к мембране интактной клетки (cell-attached) и на изолированных фрагментах мембраны (inside-out, outside-out) (Hamill et al., 1981).

Микропипетки готовили из молибденового стекла, покрывали силгардом 184 и оплавляли непосредственно перед экспериментом. Использовали пипетки, имеющие сопротивление в растворе от 4 до 12 МОм. Электрическое сопротивление контакта пипетка-мембрака составляло не менее 20 ГОм. Опыты проводились при температуре 22-24° С.

Токи регистрировали "patch-clamp''-усилителем с сопротивлением обратной связи в головке 10 Юм и записывали на магнитную ленту с полосой пропускания 1,2-2,5 кГц. Для последующей обработки фрагменты записи фильтровали 6-полюсным фильтром Бесселя с частотой среза 0,3 кГц и вводили в ЭВМ через аналогоцифровой преобразователь (частота считывания 1 кГц ). Растворы, В начале опыта стекла с клетками помещали в экспериментальную камеру, заполненную наружным раствором следующего состава, (мМ): 145 NaCl, 5 КС1, 20 HEPES/KOH, 2 СаС12, 1 MgCl2, (рН 7,4). Для компенсации потенциала покоя клетки,, после достижения плотного контакта между регистрирующей пипеткой и мембраной, раствор в камере заменяли на аналогичный, в котором ионы Na+ были заменены на ионы К+.

Для исключения активности хлорных каналов, некоторые эксперименты проводили, используя внутриклеточный раствор на основе К-глутамата или К-аспартата. Разницы в АТР-индуцированном ответе клетки при использовании С1" или органических анионов не наблюдалось.

Искусственный внутриклеточный раствор имел следующий состав (мМ): 145 КС1 (калий-глутамат или калий-аспартат), 10 Hepes-KOH (рН 7.3), 10 EGTA-KOH и соответствующая концентрация СаСЬ- Содержание свободного Са2+ в растворе рассчитывали на основании формул, приведенных в статье Фабиато и Фабиато (Fabiato, Fabiato, 1979).

В ряде экспериментов в качестве носителя тока использовались ионы что предотвращало активацию Са2+ -зависимых К+-каналов, блокировало калиевые каналы входящего выпрямления (Нага et al., 1990; McKinney, Gallin,

1988), а также исключало возможную Са~+-индуцированную инактивацию входящего тока. В этом случае раствор в пипетке содержал, (мМ): 105 ВаС12, 10 трис-HCI (рН=7,4),

В ouíside-out экспериментах раствор в пипетке содержал 145 мМ KCl, 2 мМ EGTA и 100 мкМ GTPyS, а внеклеточиьш - 10 - 105 мМ Са2+. Изотоничность экстраклеточных растворов поддерживали добавлением Трис1". Обработка результатов. Для обработки данных электрофизиологических измерений использовали пакет прикладных программ, позволяющий фильтровать записи токов, конструировать и описывать амплитудные гистограммы.

Вероятность пребывания каналов в открытом состоянии NPD вычислялась по формуле: NP0=<I>/i, где N - число функционирующих каналов в данном мембранном фрагменте; <1> - средний ток; i - амплитуда тока через одиночный канал.

Средний ток расчитывался по амплитудным гистограммам, построенным из фрагментов записи токов, длительностью от 500 мс до 5 с. Первоначальная оценка- амплитуд токов проводящих подсостояний производилась визуально по наиболее длинным событиям. В дальнейшем значения амплитуд токов подуровней проводимости получались построением амплитудных гистограмм, которые описывались гауссовским распределением; далее устанавливались средние значения пиков и площади под каждой кривой.

Относительные веса подуровней рассчитывались как отношение площади под гауссовской кривой, описывающей один из подуровней тока к сумме площадей под всеми кривыми на данной гистограмме: w„ ~ s„ / (s¡+ ... + s„), где w„ - относительный вес подуровня, a s¡ , ... , s„ • площади под гауссовскими кривыми, описывающими 1-й.....n-й пики на амплитудной гистограмме.

РЕЗУЛЬТАТЫ

клетке. В большинстве экспериментов в конфигурации cell-attached (68% опытов, п=б1), при добавлении агониста (100 мкМ АТР) к раствору в пипетке, содержащему в качестве носителя тока 105 мМ Ва2+, наблюдалась активность каналов входящего направления, которая продолжалась около 1 мин. и затем исчезала, возможно, благодаря десенситизации рецептора. (Benham, Tsien, 1987; Sasaki, Gallacher, 1990; Vincent, 1992). В отсутствие агониста активности каналов не наблюдалось (п=19).

-60 -40 -20 0 20 40

3.5 пСм 7 пСм

10 пСм

—1-1---у-•

У } ^

(2) Лг sJ^S —0.5

■ -1.0

W ^ :~16 пА

мВ

Рис. 1. Зависимость амплитуды четырех подуровней тока АТФ-активируемых Са2+-переносящих каналов от потенциала на мембране, полученные в экспериментах на нативной клетке (cell-attached, п=5). Раствор в пипетке: 105 мМ Ва2+, 200 мкМ АТР. Вертикальные линии соответствуют среднеквадратичным отклонениям.

контроль

контроль

Ч' *■ ■ Ч .* f I . ^ , f I I

GTP

GTP-yS

НОТ"

титл

lift.»,

1 nA

L

400 мс

.HP„

1.0 o.e н 0.6 0.4 -0.2 -0.0 -

GTP

Jl

50 c

GTPyS

Рис. 2. Активация АТФ-завнсимых каналов в мембранном фрагменте гуаниловыми нуклеотидами.

а - Примеры записей токов через одиночные каналы (inside-out конфигурация), вызванных приложением 100 мкМ GTP (левая панель) и 100 мкМ GTPyS (правая панель). Раствор в пипетке: 105 мМ Ва2+, 200 мкМ АТР. Потенциал на мембране -ЗОмВ.

б - Изменение вероятности открытого состояния канала (NP0) во времени.

Характерным свойством зарегистрированных АТФ-активируемых каналов является наличие, по крайней мере, 4 проводящих подуровней. На рис.1 представлены вольт-амперные характеристики различных подсостояний, полученные в 5 экспериментах на натнвной клетке, когда в качестве носителя тока использовался Ва2* (105 мМ). Некоторые, проводящие подуровни наблюдались не во всех опытах и не при всех потенциалах. Средние значения проводимостей для каждого из четырех подсостояний равны соответственно 3,5; 7; 10 и 15 пСм. Когда в качестве единственного проникающего катиона использовался Са~+ (10 мМ), средние значения проводимостей подуровней составили 4, 9, 13 и 17 пСм.

переносящих каналов. Переход в конфигурацию inside-out во время активности приводил к ее быстрокгу исчезновению. После изоляции фрагмента мембраны продолжительность активности была незначительной вне зависимости от ее первоначальной величины; при этом наблюдались редкие кратковременные события входящего направления.

Добавление 100 мкМ ГТФ (GTP) к цнтоплазматической стороне фрагмента мембраны восстанавливало активность каналов (рис. 2 а). Удаление GTP из внутриклеточного раствора приводило к полному исчезновению активности. Последующее добавление 100 мкМ негвдролизуемого аналога GTP -GTPyS во внутриклеточный раствор вызывало возобновление активности с задержкой 25 с (рис. 2 а). Среднее время задержки развития активности составило 21±8 с (п=18). Время задержки увеличивалось до 4-х минут в аналогичных экспериментах, но без агониста в пипетке. Столь значительное различие во времени восстановления активности каналов согласуется с данными об увеличении времени связывания GTPyS с эффектором при отсутствии комплекса агонист-рецептор (Yatani et al., 1987).

Временной ход изменения вероятности открытого состояния канала NPo после добавления во внутриклеточный раствор 100 мкМ GTP или 100 мхМ GTPyS представлен на рис. 2 б. Среднее значение NPo при потенциале на мембране -30 мВ после подачи GTPyS составило 0.49Ю.27 (п=1б).

Примеры фрагментов записей токов при разных уровнях мембранного потенциала показаны на рисунке 3 а. Как видно, каналы не имеют постоянной амплитуды и можно определить несколько проводящих подсостояний. Амплитудная гистограмма (рис. 3 б), построенная из 500 мс участка записи и описанная 5 гауссовыми кривыми, подтверждает "визуальные наблюдения. Следующие факты указывают на то, что мы имеем дело с подсостояниями одного канала, а не с четырьмя независимо функционирующими каналами низкой проводимости: во-первых, видны полные открывания канала до максимального (4-го) уровни, тогда как одновременное открывание или

О мВ

-30 мВ

TP

-30 мВ

•р^г^гтут """У

/'ifLttget^

-50 мВ

1 liA

200 мс

1 I I 1 I

I

ш

-0.92 -ОМ -0.44 -0J20 О

пА

15 пСм

Рис. 3. Токи через одиночные каналы в изолированных мембранных фрагментах после добавления GTP-/S к цитошшматическон поверхности мембраны. Раствор в пипетке: 105 мМ Ва:+, 200 мкМ АТР.

а - Токи при разных потенциалах на мембране в развернутой временной шкале. Горизонтальные линии проведены через подуровни тока, б - Амплитудная гистограмма, построенная по фрагменту тока <500 мс) при фильтрации 50 Гц; ширина бина - 0.04 пА. Гистограмма описана суммой 5 гауссовых распределений со средними значениями амплитуд 0.2, 0.44, 0.64 и 0.92 пА.

в - Вольт-амперные характеристики четырех подсостояний канала. Каждая точка представляет данные 1 опыта, за исключением случаев, где приведены среднеквадратичные отклонения.

3 KOinpivm. GTPyS

-20 мВ

1-! t Wy^y-^ m OMB

=—м— 1 <Ki1

ll,AL_ 2Шмс

Рис. 4. Активность каналов в мембранном фрагменте после добавления GTPyS во внутриклеточный раствор; раствор в пипетке: 10 мМ Са2+, 50 мкМ АТР. а - Записи токов, представленные в сжатой временной шкале до (контроль) и после добавления 100 мкМ GTPyS; потенциал на мембране -20 мВ. б - Развитие активности каналов во времени;

в - Токи при разных потенциалах на мембране в развернутой временной шкале. Горизонтальные линии проведены через подуровни тока, г - Вольт-амперные характеристики четырех подсостояний канала. Цифры в скобках соответствуют различным подуровням проводимости.

закрывание четырех каналов маловероятно; во-вторых, заметны прямые переходы между подсостояниями канала; в-третьих,, не было зарегистрировано событий, превышающих максимальный уровень, что дает возможность утверждать, что в исследуемом фрагменте мембраны нет каналов с различной проводимостью.

На рис. 3 в представлена зависимость амплитуды подуровней проводимости от потенциала на мембране для каналов, активированных GTPyS. В этой серии экспериментов 105 мМ Ва2+ использовались в качестве единственного проникающего катиона. Средние значения проводимостей для каждого из четырех подсостояний равны соответственно 3.5, 7, 10 и 15 пСм.

В следующей серии экспериментов на инвертированном мембранном фрашенте в качестве носителя тока использовался Са2+ (10 мМ). Раствор в пипетке содержал 50 мкМ АТР. Добавление 100 мкМ GTPyS во внугриклеточньш раствор вызывало активность каналов (рис.4 а). Временной ход изменения вероятности открытого состояния канала NP0, фрагменты записей тока и вольт-амперная характеристика представлены на рис. 4 б, в, г. Средние значения проводимостей для каждого из четырех подсостояний равны соответственно 4, 9, 13 и 17 пСм.

Сравнение вольт-амперных характеристик каналов, зарегистрированных после приложения GTP илн GTPyS к цитоплазматической стороне фрагмента мембраны и АТР в экспериментах на нативной клетке при тех же ионных условиях, указывает на идентичность каналов.

подходов для выяснения роли G-белков в осуществлении регулируемых агонистами внутриклеточных процессов. Для всех типов гетеротримерных G-белков известна возможность активироваться под действием F (5-10 мМ) (Gilman, 1987; Bigay, Deterre, Pfister, Chabre, 1987). В качестве кофактора при активации G-белков фторидом в среду добавляют микромолярные концентрации А1С1з. Считается, что комплекс A1F4" имеет структуру, сходную с фосфатной группой, и может взаимодействовать с GDP, связанным с а-субъединицей G-белков, тем самым активируя ее. Неоспоримым преимуществом применением AIF4" по сравнению с другими активаторами G-белков - гуаниловыми нуклеотвдами, является его способность проникать через плазматическую мембрану клеток, что позволяет исследовать функциональную роль G-белков в интактных клетках.

На рис. 5 представлены результаты экспериментов в конфигурации cell-attached, когда Ва2+ (105 мМ) использовался в качестве носителя тока. В этой серии экспериментов агонист (АТР) в пипетку не добавлялся.

Инкубирование клеток в растворе с 50 мкМ AICI3 в течение 3 минут не приводило к появлению активности каналов. Через 1 минуту после добавления

-50 мВ

4 --Or-í-411 —i- s 1

1 1 да 1 f 1

1 иА

200 мс

-60-40-20 0 20

Рис. 5. Активация каналов в эксперименте на натнвной клетке (cell-attached) после добавления фторида (10 мМ) в наружный раствор. Раствор.в пипетке: 105 мМ Ва2+. а - Записи токов в развернутой временной шкале при потенциале на мембране -50 мВ. Горизонтальные линии проведены через подуровни тока

б - Вольт-амперные характеристики четырех подсостояний канала.

-20 мВ

Са2+ (мМ)

ш

105

20

мВ

-60 -40 -20 0 20 40 60

Са2* (мМ)

vwW' ^wA-t-wJlj^ 10

ЗЩГ-1---Г- 2

105

1 пА

200 мс

пА

2.0 1.5 1.0 0.5

-30 мВ

K¿= 10 мМ

О 20 40 60 80 100

Са2* (мМ)

ис. 6. Влияние внеклеточной концентрации Са2+ на АТФ-активируемые ГТФ-1висимые С;г+ -переносящие каналы.

- Записи токов через одиночные каналы в outside-out эксперимент. Раствор в листке: 145 мМ К+, 2 мМ EGTA, 100 мкМ GTPyS. Экстракл сточный раствор ¡держал 2, 10. 20, или 105 мМ Са2+. Потенциал на мембране -20 мВ.

- Соответствующая вольт-амперная характеристика, построенная по значениям «титул тока для 3-го подуровня. Для 2, 10 и 105 мМ Са2+ приведены средние тения полученные п 4-7 экспериментах, для 20 и 40 мМ - в одном опыте.

- Зависимость средних значений амплитуды тока через канал от концентрации шышя и экезраклеточном растворе; видимая константа диссоциации - 10 мМ.

б

10 мМ KF были зарегистрированы входящие события. Примеры записей тока и соответствующая вольт-амперная характеристика представлены на рис.5 а, б. Проводящие свойства каналов оказались идентичными таковым для каналов, зарегистрированных после приложения АТР к нативной клетке и GTPyS в опытах на инвертированных мембранных фрагментах. Приведенные данные позволяют сделать вывод о том, что в процесс активации АТФ-иццуцированных Са2+ -переносящих каналов плазматической мембраны перитонеальных макрофагов крысы вовлечен гетеротримерный G-белок.

Как показано выше, при переходе к конфигурации "inside-out" возможно возобновление активности каналов с теми же характеристиками, что и при внеклеточном приложении АТР путем добавления GTP или GTPyS к цитоплазматической поверхности мембраны. Таким образом, введение GTPyS в раствор в пипетке в экспериментах на изолированном фрагменте мембраны (outside-out) позволяло активировать те же каналы без участия АТР, тем самым предотвращая влияние десенситизации рецептора и позволяя регистрировать токи через канал в различных по ионному составу экстраклеточных растворах. Действительно, в экспериментах в "outside-out" конфигурации, когда GTPyS был добавлен к раствору в пипетке в концентрации 100 мкМ, в 70% случаев (п=45) наблюдалась активность каналов без приложения АТР к омывающему раствору. Добавление АТР к внеклеточному раствору не вызывало изменений в активности GTPyS-индуцированных каналов в outside-out экспериментах.

На рис.6 приведены примеры записей токов через одиночные каналы в outside-out эксперименте, когда раствор в пипетке содержал 145 мМ К\ 2 мМ EGTA и 100 мкМ GTPyS, а внеклеточный раствор содержал 2, 10, 20, или 105 мМ Са2+. Соответствующая вольт-амперная характеристика, построенная по значениям амплитуд тока для 3-го подуровня, представлена на рис.6 б. Для 2, 10 и 105 мМ Са2+ приведены средние значения, полученные в 4-7 экспериментах, для 20 и 40 мМ - в одном опыте. Кривая зависимости средних значений амплитуды тока через канал от концентрации кальция в наружном растворе ([Са2+]0) изображена на рис.6 в. Как видно амплитуда одиночных Са2+ токов имеет тенденцию к насыщению с ростом [Са2+]0 с видимой константой диссоциации 10 мМ.

Регуляция АТФ-зктивируемых ГТФ-зависимых. Са2*-переносяших каналов внутриклеточным кальцием. Следующей задачей настоящей работы было изучение влияния концентрации внутриклеточного кальция на активность АТФ-активируемых ГТФ-зависимых Са2+-переносящих ионных каналов плазматической мембраны перитонеальных макрофагов крысы.

Как было показано выше в экспериментах на инвертированных мембранных фрагментах, восстановленная приложением СГРуЭ активность каналов, продолжалась до 10 минут и не исчезала при убирании его из раствора, позволяя проводить многократные смены растворов с различной [Са2+]; в одном эксперименте.

На рис. 7 представлены примеры записей тока и временной ход развития активности при разных [Са2+]1. Во всех экспериментах данной серии в качестве

а б

Cell-Attachcd

Insidc-Oul

GTPyS, рСа 8

рСаб

pCaS

■ 200 мс

0.4-1

< с

«0.2-

е

о.

0.0

рСа 8

GTPyS

"рСа б рСа 8

СА

10

Ik

50 с

MJJLMf мв

15 пСм

L 1.5

о

Рис. 7. Активность А ГФ-индуцированных ГТФ-зависимых каналов, зарегистрированных в экспериментах на нативной клетке и после изоляции мембранного фрагмента.

а - Записи тока и б - временной ход развития активности при разных [Ca2+]j поддерживаемых на заданном уровне добавлением в раствор 10 мМ EGTA.

в - Вольт-амперная характеристика каналов, полученная в cell-attached (квадраты) и inside-out (круга) отведения.

носителя тока использовался Ва2+, а концентрация Са2+ в растворе, подаваемом к цитоплазматической стороне фрагмента мембраны, поддерживалась на

заданном уровне добавлением в раствор 10 мМ ЕОТА.

Увеличение [Са2+], приводило к быстрому уменьшению токов через исследуемые каналы. Возвращение к низким [Са2+]; немедленно восстанавливало активность вне зависимости от продолжительности выдерживания фрагмента мембраны в растворе с высоким [Са2+]ь Как видно из рис.7 б, средний ток через каналы уменьшился с 0.3 пА до 0.05 пА при замене растворов с низким содержанием Са2+ (рСа 8) в камере на таковой с высокой [Са2+]( (рСа 6). Возвращение к исходным ионным условиям восстанавливало средний ток до первоначальной величины.

На рис. 8 а представлены фрагменты записей тока при разных концентрациях Са2+ в растворе, подаваемом к цитоплазматической поверхности фрагмента мембраны.

рСа 8

рСа 7

рСа 6

рСа 5

1 пА

б

1.0-1 О

0.8-

«

£0.6->5

¡0.4-

0.2-

0.0

а'.О 7.5 7Я 6.5 6.0 5.5 5.0 рСа

200 мс

0

Рис. 8. Активность АТР-индуцированных GTP-зависимых каналов модулируется концентрацией внутриклеточного кальция, а - Записи токов через одиночные каналы в inside-out эксперименте после приложения GTPyS к цитоплазматической поверхности фрагмента мембраны при различных [Ca2+]j. Горизонтальные линии проведены через подуровни тока.

б - Зависимость величины суммарного тока через мембранный фрагмент от уровня [Са2+]ь

Для построения зависимости величины среднего тока от [Са2+]; в каждом эксперименте значения среднего тока, полученные при данной [Са2+]» усреднялись и были нормализованы относительно величины, полученной при

рСа 8. Необходимо отметить, что во всех случаях среднее значение тока через мембранный фрагмент было наибольшим при использовании раствора с [Ca2+]i, равной рСа 8. Результаты 16 экспериментов представлены на рис. 8 б. Можно видеть, что постепенное увеличение [Са2+], в диапазоне физиологических концентраций (10"8 - 10~б М) ингабировало активность каналов. При этом 50% уменьшение среднего тока достигалось при [Са2% - 0.08 мкМ.

рСа8

рСа 7

0.2

рСаб

число событий

1 iiA

-50 мс

Рис. 9. а - Фрагменты записей тока при сильной фильтрации (50 Гц) и растянутой временной шкале при различной [Са2+];, указанной в рСа над токами. Потенциал на мембране -30 мВ. Горизонтальные линии проведены через подуровни тока.

б - Амплитудные гистограммы соответствующих записей (500 мс). Гистограмма описана суммой гауссовых распределений со средними значениями амплитуд 0.2, 0.4, 0.7 и 1 пА.

Анализ примеров записей тока, приведенные на рисунках 7 и 8, показывает, что при увеличении [Са2+], происходит уменьшение числа событий, соответствующих открываниям канала до высокопроводащих подуровней (3-го и 4-го). При рСа 8 эти подуровни встречаются так же часто, как и низкопроводящие (1-й и 2-й), в то время как при повышении [Са2+]; во

внутриклеточном растворе до рСа 5 наблюдаются только события, амплитуды которых не превышают значения, соответствующие первому низкопроводящем> подуровню.

Визуальные наблюдения подтверждаются результатами статистического анализа экспериментальных данных, представленных на рис.9. На левой панели приведены фрагменты 500 мс записей тока при сильной фильтрации и при растянутой временной шкале. На правой - амплитудные гистограммы соответствующих 500 мс фрагментов. Постепенное увеличение [Ca2+]i с рСа 8 до рСа 6 приводит к исчезновению на гистограмме пиков с амплитудами 0.7 и 1 пА, соответствующих 3-му и 4-му подуровням проводимости. Примечательно, что амплитуды подуровней остаются неизменными при изменении [Са2+]-, в растворе, подаваемом к цитоплазматической стороне мембранного фрагмента. Более того, значения проводимостей подуровней и потенциала реверсии остаются неизменными при варьировании [Са2+]; , что позволяет исключить из рассмотрения возможность быстрого блока ("rapid flickery block"), из-за которого возможно уменьшение тока через канал.

Для того чтобы оценить, как перераспределяются подуровни проводимости в зависимости от [Са2+Ь, было проведено сравнение относительных весов всех подуровней при разных [Са"+];. При этом относительные веса подуровней (wn) рассчитывались как отношение площади под гауссовской кривой, описывающей один из подуровней тока, к сумме площадей под всеми кривыми на данной гистограмме. На рис. 10 представлена гистограмма распределения относительных весов четырех подуровней проводимости при разных [Са2+Ь, на которой представлены результаты обработки 10 экспериментов на изолированном фрагменте мембраны. Значения wn при разных рСа приведены в таблице 1. Таблица 1.

1 уровень 2 уровень 3 уровень 4 уровень

рСа 8.0 0.27+0.02 0.27±0.04 0.24+0.02 0.21 ±0.04

рСа 7.0 0.55±0.07 0.34±0.04 0.05+0.02 0.05Ю.02

рСа 6.0 0.84±0.07 0.13±0.06 0.03+0.02 0.00±0.01

Очевидно, что с увеличением [Са2+Ь вероятность функционирования канала на низкопроводящих подуровнях проводимости (1-ом и 2-ом) возрастает, в то время как относительные веса 3-го и 4-го уровней уменьшаются практически до нуля.

Изменение относительных весов подуровней проводимости при увеличении [Са2+]; может вносить вклад в уменьшение среднего значения тока, проходящего через мембранный фрагмент каждый раз, когда открывается канал. В этом случае, если средние значения тока через открытый канал к величина

8 7.5 7 6.5 6 рСа

Рис. 10. Распределение относительных весов четырех подуровней проводимости АТФ-активируемых ГТФ-зависимых Са2+-переносящих каналов при разных [Са2+];, представляющих данные 10 экспериментов на инвертированном фрагменте мембраны (inside-out конфигурация).

суммарного тока изменяются сходным образом, можно утверждать, что перераспределение подуровней проводимости вносит основной вклад в уменьшение тока через фрагмент мембраны при увеличении [Са2+];. Среднее значение тока через открытый канал рассчитывалось по формуле: iw= ijW] + ... + inwn, где I;... in - средние значения амплитуд тока отдельных подуровней и w;... w„ - относительные веса соответствующих подуровней.

На рис. 11 представлена зависимость средних значений тока через открытый канал от [Ca2+]j, выраженной в рСа. При потенциале на мембране -30 мВ средние значения тока через открытый канал составили 0.55 + 0.02 пА при рСа 8, 0.30 + 0.02 пА при рСа 7, 0.24 + 0.01 при рСа б. Для сравнения, на том же рисунке приведены значения суммарного тока через мембранный фрагмент при разных [Са2+],. Как видно, обе кривые спадают практически

параллельно с увеличением [Са2*],. В рамках принятых предположений это означает, что вероятность открытого состояния канала остается неизменной при концентрации внутриклеточного кальция в диапазоне 10~б - Ю'8 М. Следовательно, увеличение [Са2+]; не приводит к тому, что канал проводит больше времени в закрытом состоянии; канал начинает функционировать с большей вероятностью на низкопроводящих подуровнях проводимости.

рСа

Рис. 11. Зависимость средних значений тока через открытый кан; (квадраты) от [Са2+]1. При потенциале на мембране - 30 мВ эти значен! составили: 0.5510.02 пА при рСа 8, 0.30±0.02 пА при рСа 7, 0.24+0.01 щ рСа 6 (п=10). Для сравнения приведены значения суммарного тока (круг при разных [Са2+]ь

Таким образом, перераспределение подуровней проводимости является единственным механизмом, лежащим в основе модуляции общего тока через фрагмент мембраны внутриклеточной концентрацией кальция.

ВЫВОДЫ

1. С использованием метода локальной фиксации потенциала в экспериментах на нативной клетке (cell-attached) и на изолированных мембранных фрагментах (inside-out, outside-out) изучены функциональные свойства и пути регуляции АТФ-активируемых Са"+-переносящих каналов в плазматической мембране перитонеальных макрофагов крысы.

2. Установлено, что в процесс активации АТФ-индуцируемых Са2+-переносящих каналов, связанных с пуринорецептором P2z типа клеточной мембраны, вовлечен гетеротрпмерный G-белок.

3. Изучено влияние концентрации кальция во внеклеточном растворе на АТФ-активируемые ГТФ-зависимые Са2+-переносящие каналы. Показано, что амплитуда одиночных Са2+ токов имеет тенденцию к насыщению с ростом [Са2+]0 с видимой константой диссоциации 10 мМ.

4. На уровне измерений токов через одиночные каналы обнаружено ингибирование каналов при повышении концентрации внутриклеточного кальция в физиологическом диапазоне (Ю"6 - 10"8 М), что позволяет предположить существование отрицательной обратной связи в обеспечении рецептор-управляемого входа кальция в нативных клетках.

5. Установлено, что уменьшение суммарного тока, переносимого ионами кальция при повышении [Са2+]ь происходит за счет перераспределения подуровней проводимости: канал начинает функционировать с большей вероятностью на низко проводящих уровнях.

6. Данные настоящей работы позволяют предположить, что наличие подсостояний является функционально значимой особенностью кальциевых каналов и может обеспечивать тонкую регуляцию поступления Са2+ через плазматическую мембрану в процессе рецептор-индуцированного входа ионов в клетку.

ПУБЛИКАЦИИ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Mamin, A. G., Kiselyov, К. I. & Mozhayeva, G. N. ATP-activated GTP-dependent calcium-permeable channels in macrophages. Effect of intracellular calcium on current sublevels// Biophysical Journal. -1995 Vol. 68, P. A210.

2. Киселев К. И., Мамин А. Г., Можаева Г. Н. Механизмы регуляции Са-переносящих каналов перитонеальных макрофагов крысы. Эффект ГТФ и внутриклеточного кальция // Цитология. -1995 Т.37. N 4. С.376.

3. Naumov, А. P., Kaznacheyeva, Е. V., Kiselyov, К. I., Kuryshev, Yu. А., Mamin, A. G., & Mozhayeva, G. N. ATP-activated inward current and calcium-permeable channels in rat macrophages plasma membrane II Journal of Physiology (London) -1995. Vol. 486. P. 323-337.

4. Naumov, A. P., Kiselyov, К. I., Mamin, A. G., Kaznacheyeva, E. V., Kuryshev, Yu. A., & Mozhayeva, G. N. ATP-operated calcium- permeable channels activated -via guanine nucleotide-dependent mechanism in rat macrophages II Journal of Physiology (London). -1995. Vol. 486. P. 339-347.

5. Mamin A. G., Kiselyov К. I. & Mozhayeva G. N. Effect of intracellular calcium on ATP-activated GTP-dependent calcium channels in rat macrophages // Journal of Physiology (London). -1996. Vol. 491.3. P. 697-705.

6. Казначеева E. В., Мамин А. Г., Киселев К. И., Можаева Г. Н„ Наумов А.П. (1996). Новый тип АТР-активируемых кальциевых каналов в плазматической мембране макрофагов крысы // Биологические Мембраны. -1996. Т. 13. С. 162-177.

ООО "КомТехника" 24.04.97. 3.21. Т.100.