Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Новый тип АТР-активируемых Са2+ -переносящих каналов в плазматической мембране перитонеальных макрофагов крысы

ВАК РФ 03.00.25, Гистология, цитология, клеточная биология

Автореферат диссертации по теме "Новый тип АТР-активируемых Са2+ -переносящих каналов в плазматической мембране перитонеальных макрофагов крысы"

¡'Го ОД На правах рукописи

УДК 577.352.465

1 1 НОЯ 1В25

КАЗНАЧЕЕВА /¿гД, /

Елена Валентиновна

НОВЫЙ ТИП АТР-АКТИВИРУЕМЫХ Са2+-ПЕРЕНОСЯЩИХ КАНАЛОВ В ПЛАЗМАТИЧЕСКОЙ МЕМБРАНЕ ПЕРИТОНЕАЛЬНЫХ МАКРОФАГОВ КРЫСЫ

03.00.25

Клеточная биология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научный руководитель -доктор биологических наук член-корреспондент РАН Г.Н.Можаева

САНКТ-ПЕТЕРБУРГ 1996

Работа выполнена в Институте цитологии РАН, Санкт-Петербург

Научный руководитель: доктор биологических наук, член-корр РАН

Г.Н.Можаева Институт цитологии РАН, Санкт-Петербург

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук И.И.Марахова Институт цитологии РАН, Санкт-Петербург

доктор биологических наук, профессор Л.Г.Магазаннк

Институт эволюционной физиологии и биохимии им.Сеченова РАН, Санкт-Петербург

Ведущее учережденле:

Биолого-почвенный факультет Санкт-Петербургского государственного университета, Санкт-Петербург

Зашита состоится 1996 года в /5

ч.

на заседании Диссертационного совета Д.002.73.01 Института цитологии РАН по адресу: 194064, Санкт-Петербург, Тихорецкий пр., д.4.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института цитологам РАН.

Реферат разослан "&!" 1996 года.

Ученый секретарь Диссертационного совета д.б.н. Л.Н.Пнсарева

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Связывание гормонов, нейромедиаторов и других агонистов с соответствующими мембранными рецепторами приводит к запуску в клетке цепи биохимических реакций, имеющих своим следствием либо специфический для данного типа дифференцированных клеток ответ, либо увеличение синтеза ДНК и деление клеток. Важная роль в передаче сигнала с наружной мембраны к внутриклеточным структурам принадлежит ионным событиям (см. например, Moolenaar, de Laat, 1985). Среди этих событий особая роль принадлежит кальциевому сигналу, т.е. временному увеличению концентрации свободного цитоплазматического Са^+ ([Са2+]цит). Восприятие и преобразование кальциевого сигнала осуществляется ферментами, транспортными белками, внутриклеточными модуляторами, активность которых зависит от [Са2+]цит (Rasmussen, Barret, 1984; Berridge, 1985; Abdel-Latif, 1986).

Возрастание уровня [Са2+]цит обеспечивается как за счет выброса Са^+ из внутриклеточных источников, так и за счет входа Са2+ из внеклеточной среды через плазматическую мембрану (Putney, 1987; Berridge, Irvine, 1989). В нервных, мышечных и других электровозбудимых клетках вход ионов Са^+ происходит через потенциал-управляемые Са^+ каналы (см., например, Reuter, 1986). Менее ясно, какие механизмы обеспечивают рецептор-зависимый вход Са^+ в невозбудимых клетках. Изучение потоков Са^+ (Johns et al., 1987; Nishimoto et al., 1987) и измерение уровня [Са2+]цит с помощью Са2+-чувствительных зондов (Volpi, Berlin, 1988; Авдонин и др., 1990; Курышев и др., 1991) дают основания полагать, что в плазматической мембране различных типов клеток имеются Са^+.проницаемые каналы, отличные по своим свойствам от потенциал-управляемых каналов. Однако, сообщения о регистрации одиночных Са^+-проницаемых каналов в мембранах невозбудимых клеток носят фрагментарный характер (Kuno, Gardner, 1987; Renharn, Tsien, 1987; Penner et al., 1988; Mozhayeva et al., 1990a,6; Mozhayeva et al., 1993). Из сказанного следует, что дальнейшее детальное исследование рецептор-

управляемого входа ионов Са?+ через плазматическую мембрану невозбудимых клеток необходимо для получения целостного представления о механизмах внутриклеточной сигнализации.

Макрофаги являются удобным объектом для изучения рецептор-управляемого входа т.к. мембрана этих клеток имеет большое число различных рецепторов,

а кальциевый сигнал в них в значительной степени определяется входом из внеклеточной среды (Alonso-Torre, Trautmann, 1993).

Цели и задачи исследования. Цель настоящей работы состояла в изучении механизмов, обеспечивающих вход ионов Са^+ через плазматическую мембрану перитонеальных макрофагов крысы в ответ на экстраклеточное приложение АТР. Были поставлены следующие задачи:

1. Выяснить возможность активации входа на макрофагах крысы внеклеточным приложением АТР.

2. Идентифицировать и охарактеризовать проводящие и селективные свойства Са2+-проницаемых каналов плазматической мембраны.

3. Определить тип пуринорецептора, индуцирующий вход ионов через плазматическую мембрану макрофагов крысы.

Научная новизна. В результате проведенной работы впервые зарегистрирован и охарактеризован новый тип высоко-селективных кальциевых каналов плазматической мембраны макрофагов крысы, активирующихся внеклеточным приложением АТР. Установлено, что АТР действует на пуринорецептор P2Z"THria> который, в свою очередь, активирует данный тип каналов, по-видимому, через GTP-связывающий белок. Полученные данные позволяют сделать вывод, что GTP-зависимые Са2+-проницаемые каналы вносят существенный вклад в АТР-индуцируемое повышение внутриклеточной концентрации Са^+.

Теоретическое и практическое значение работы. Полученные в настоящей работе результаты важны для конкретизации представлений о.механизмах, генерирующих кальциевый сигнал в невозбудимых клетках. Обнаружение нового

типа Са2+-проницаемых каналов является существенным дополнением к имеющимся знаниям о функциональной роли ионных каналов клеточных мембран. Тот факт, что индуцируемая внеклеточным приложением АТР стимуляция активности Са2+-проницаемых каналов осуществляется, по-видимому, через GTP-связывающий белок, подтверждает складывающееся к настоящему времени мнение о том, что GTP-связывающие белки являются универсальными модуляторами активности различных ионных каналов. Полученные данные о свойствах и механизмах регуляции АТР-активируемых Са2+-проницаемых ионных каналов могут быть использованы при разработке и тестировании фармакологических агентов и лекарственных препаратов.

Апробация работы Основные положения работы доложены и обсуждены на: 37 биофизическом конгрессе США (Бостон, 1993 г.), заседании Физиологического Общества Великобритании (Абердин, 1994), 39 биофизическом конгрессе США (Сан-Франциско, 1995), заседании отделения физиологии РАН (Москва, 1995), отчетной сессии Института цитолоии РАН (Санкт-Петербург, 1995) и на научных семинарах лаборатории ионных каналов клеточных мембран Института цитологии РАН.

По материалам диссертации опубликовано 5 печатных работ.

Объем и структура диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложения экспериментальных данных, обсуждения результатов, выводов и списка литературы, содержащего/^публикаций. Работа изложена на^страницах машинописного текста и иллюстрирована /^рисунками.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Клетки. Работа выполнена на резидентных перитонеальных макрофагах, выделенных из взрослых крыс линии Вистар (150-200г), по методу, предложенному Конрадом (Conrad, 1981). Клетки высевались в бакпечатки на покровные стекла

б

размером 4x4 мм^. Культуру поддерживали в среде DMEM ("Sigma", США) с добавлением 10% эмбриональной сыворотки крупного рогатого скота ("Flow", Англия), 100 мкг/мл стрептомицина и 100 ед/мл пенициллина в инкубаторе с 5% СО2 при 37°С. Клетки использовали в опытах на 2-11-е сут. после выделения. Тест на эстеразную активность с использованием а-нафтил-ацетата (Monahan et al., 1981) показал, что не менее 98% выделяемых клеток - макрофаги.

Регистрация ионных токов. В работе использовали метод локальной фиксации потенциала ("patch-clamp" ) в четырех конфигурациях: в условиях подведения регистрирующей пипетки к мембране интактной клетки ("cell-attached"), на изолированных фрагментах мембраны ("outside-out", "inside-out") и в условиях регистрации тока от целой клетки ("whole-cell") (Hamill et al., 1981).

Мембранный потенциал внеклеточного раствора принимался за нулевой. Микропипетки готовили из молибденового стекла, покрывали силгардом 184 и оплавляли непосредственно перед экспериментом. Использовали пипетки, имеющие сопротивление от 4 до 12 МОм. Электрическое сопротивление контакта пипетка-мембрана составляло не менее 20 ГОм. Опыты проводились при температуре 22-24°С.

Токи регистрировали "ра1сЬ-с1атр"-усилителем с сопротивлением обратной связи в головке 20 Юм и записывали на магнитную ленту с полосой пропускания 1,2-2,5 кГц. Для последующей обработки фрагменты записи фильтровали 6-полюсным фильтром Бесселя с частотой среза 0,6 кГц и вводили в ЭВМ через аналогоцифровой преобразователь ( частота считывания 1 кГц ).

Растворы. В начале опыта стекла с клетками помещали в экспериментальную камеру, заполненную контрольным наружным раствором следующего состава, (мМ): 145 NaCl, 5 КС1, 20 HEPES/KOH, 2 CaCl2, 1 MgCl2, (рН 7,4). После достижения плотного контакта между поверхностью регистрирующей пипетки и мембраной раствор в камере заменяли на аналогичный, в котором все ионы Na+ были заменены на К+-

Для исследования эффекта внеклеточного АТР в whole-cell экспериментах, чтобы исключить активность Са2+-зависимых калиевых каналов, найденных в макрофагах (Gallin, McKinney, 1988; Gallin, 1989), в искусственный внутриклеточный раствор добавляли 10 мМ EGTA ( "Sigma", США), что позволяло поддерживать уровень [Ca2+]jn=10 нМ. Этот раствор имел следующий состав (мМ): 120 KCI, 10 HEPES-KOH, 10 EGTA-KOH, 0,2 СаС12, 1 MgCl2 (рН=7,4; рСа=8). Для исключения активности хлорных каналов некоторые эксперименты на целой клетке и на мембранном фрагменте проводили, используя внутриклеточный раствор на основе К-глутамата или К-аспартата. Разницы в АТР-индуцированном ответе клетки при использовании С1" или органических анионов не наблюдалось.

В outside-out экспериментах эффект внеклеточного АТР изучался в аналогичных ионных условиях. В большинстве экспериментов на целой клетке и на мембранном фрагменте наружный раствор содержал, (мМ): 105 ВаС12, 10 трис-HCl (рН=7,4), что также препятствовало активации Са2+-зависимых К+-каналов и блокировало калиевые каналы входящего выпрямления (Нага et al., 1990, McKinney, Gallin, 1988). Использование изомолярных концентраций исключало возможную Са2+-индуцированную инактивацию входящего тока. В некоторых экспериментах в качестве проникающего катиона использовали Са^+ (2-10 мМ) или Na+ (10-20 мМ). Изотоничность таких растворов поддерживали добавлением трис+.

Для измерения селективности канала использовали внеклеточные растворы, содержащие 105 мМ СаС1г (или BaCl2, S1CI2, MnCl2) или 145 мМ NaCl и 10 мМ трис-С1. Изотоничность растворов, содержащих менее 105 мМ поддерживали добавлением трис+.

Концентрации АТР^- и Са2+ рассчитывали на основании формул, приведенных в статье Фабиато и Фабиато (Fabiato, Fabiato, 1979). Свежеприготовленные растворы АТР ("Sigma", США) и растворы с различными концентрациями катионов подавали к мембране путем перфузии камеры 3-5-кратным объемом, что обеспечивало полную смену раствора менее чем за 300 мс.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Измерения макроскопических токов (whole-cell). Добавление 200 мкМ АТР к внеклеточному раствору, содержащему 105 мМ Ва2+, вызывало входящий ток, сопровождающийся значительным увеличением шума (рис.1,а). Значение пиковой величины тока при потенциале мембраны -30 мВ составляло в среднем 45,5 ± 36,2 пА (п=16). Величина тока не зависела от размера клеток и значительно варьировала в различных сериях экспериментов. При длительном приложении АТР ток уменьшался, возможно, вследствие десенситизации рецептора АТР. На одной клетке при кратковременном приложении и последующем отмывании АТР можно было получить 3-4 ответа, что согласуется с данными, полученными на других объектах. Однако в отличие от того, что имело место в опытах на клетках слезной железы (Vincent, 1992), в экспериментах на макрофагах удаление АТР из внеклеточной среды вызывало быстрое уменьшение тока (рис. 1,6).

Величина АТР-индуцироваиного входящего тока зависила от концентрации Mg2+ во внеклеточном растворе. Как показано на рис.2., уменьшение концентрации Mg2+ от 10 до 1 мМ во время ответа клетки на приложение АТР приводило к быстрому увеличению входящего тока (рис.2,а). Смена раствора, содержащего I мМ Mg2+, на раствор с 10 мМ Mg2+ вызывала уменьшение тока; возвращение к исходным условиям восстанавливало амплитуду ответа с поправкой на его изменения во времени, которые связаны с десенситизацией рецептора (рис.2,б). Сходные результаты были получены в 10 аналогичных экспериментах. Эти данные позволяют сделать вывод, что вход катионов из внеклеточной среды обусловлен действием анионной формы АТР (АТР4-).

Далее задача состояла в сравнении эффективности различных нуклеотидов. Сопоставлялись величины входящих токов, переносимых ионами Ва^+ (105 мМ) в ответ на внеклеточное приложение АТР, ATPyS, ADP и UTP в равных концентрациях (200 мкМ). Во всех опытах UTP был неэффективен (п=19). Эффективность ATPyS и

10 шМ ATP

1_

21)0 мьМ ЛТР

U

ю Me 11 и« | ю Xt

lU ыкМ ATP

L_

Рис. 1. Интегральный «холящий ток, вызнанный добавлением АТР к наружному раствору. Представлены записи юков при длительном (а) и кратковременном (б) приложении АТР. Мембранный потенциал Е=-50 мВ (а) и Е=-30мВ (б).

Рис. 2. Ингабирование Mg2+ АТР-шщуцируе-мого ин-гарального входящего тока. Внеклеточный раствор содержал 135 мМ Na+, концентрация АТР - 10 мкМ, Е=-40 мВ. Результаты получены на двух различных клетках.

5 С

3,5 мкМ Л П>

• + + +

20 Na I ONa | 20 Na 125 Тг1з+ ¡1« Tris*| 125 Tris*

е*--

5иЛ I -

I- 5 с

Рис. 3. Плазматическая мембрана макрофагов непроницаема для трис+, когца входящий ток вызвал внеклеточным приложением АТР. Концентрация АТР - 3,5 мкМ (2 мкМ АТР^"), Е=-40 мВ

ADP проверяли в двух сериях экспериментов. В каждом опыте амплитуду ответа, вызванного приложением ATPyS или ADP, сравнивали с амплитудой тока, индуцированного последующим приложением АТР. Добавление АТР, в момент, когда ответ на приложение ATPyS или ADP достиг максимального значения, дополнительно вызывало входящий ток большей амплитуды, несмотря на десенситизацию рецептора, обысловленную длительным приложением фосфонуклеотидов. В экспериментах, где АТР был неэффективен, ответов на приложение ATPyS или ADP не наблюдали. Эти данные позволили получить последовательность эффективности нуклеотидов: АТР : ATPyS : ADP = 1 : 0,45 ± 0,05 (п=4): 0,088 ± 0,061 (п=13).

Из-за десенситизацни рецептора и большого разброса в величине первого ответа найти зависимость амплитуды входящего тока от концентрации агониста оказалось невозможным. Можно оценить лишь диапазон эффективных концентраций. Концентрации АТР^", индуцирующие входящий ток, находились в интервале от 0,07 мкМ (10 мкМ АТР, 135 мМ Na+, 10 мМ Mg2+ ) до 22 мкМ АТИ" (50 мкМ АТР, 135 мМ Na+, 2 мМ Ва2+ ), что согласуется с областью эффективных концентраций АТр4- для P2Z рецептора, определенной путем измерения 1Са^+]-т в макрофагах мыши, инкубированных с тапсигаргином (Alonso-Toire, Trautxnan, 1993).

В отличие от микромолярных концентраций, высокие концентрации АТР4-(более 500 мкМ) вызывали быстрое увеличение входящего тока, который достигая постоянного уровня, оставался неизменным до тех пор, пока АТР не был удален из внеклеточного раствора. Эти данные объясняются способностью АТР формировать большие неселективные поры в плазматической мембране (Buisman et al., 1988). В наших опытах входящий ток, индуцируемый субмикромолярными или микромолярными концентрациями АТР^"> не сопровождался увеличением проводимости, вызванным пермеабилизацией мембраны. В пользу этого свидетельствует тот факт, что плазматическая мембрана макрофагов, во время АТР-индуцированного входящего тока, остается непроницаемой для ионов трис+. На рис.3 приведен пример ответа клетки на добавление 3.5 мкМ АТР (2 мкМ АТР4-) к

наружному раствору, содержащему 20 мМ Na+ и 125 мМ трис+. При быстрой замене ионов Na+ на трис+ ток полностью исчезал. Возврат к исходным условиям (20 мМ Na+) восстанавливал ответ с учетом десенситизации рецептора. Аналогичные результаты были зарегистрированы в 31 опыте. Данные, полученные при полной замене всех проникающих неорганических катионов ионами трис+, свидетельствуют об отсутствии АТР-индуцированнои пермеабилизации плазматической мембраны в области тех концентраций АТР, которые использовались в экспериментах.

Наши результаты согласуются с данными, полученными на других объектах (Soltoff et al., 1992; Alonso-Torre, Trautman, 1993), и позволяют утверждать, что АТР-индуцируемый входящий катионный ток в макрофагах обусловлен активацией P2z рецептора. В пользу этого вывода говорят следующие факты: 1) активной формой АТР, является анионная форма АТР (АТР^-); 2) UTP не вызывает входящего тока; 3) наблюдается большая эффективность для АТР, чем для ATPyS и ADP; 4) высокие концентрации АТР вызывают пермеабнлизацию мембраны.

Измерения одиночных каналов. Эксперименты на нативной клетке (cell-attached). На рис.4 приведены примеры записей токов через одиночные каналы в cell-attached эксперименте, когда раствор в пипетке содержал 105 мМ Ва2+ и 200 мкМ АТР. Мембранный потенциал поддерживали на уровнях от - 40 до 0 мВ, в этих условиях ток имел входящее направление. В некоторых экспериментах потенциал достигал значения +50 мВ, но выходящие токи не наблюдались. Активность канала в присутствии АТР в пипеточном растворе зарегистрирована в 41 эксперименте, что составляет 68% всех попыток. В отсутствие АТР активность каналов не наблюдалась (19 опытов).

Характерным свойством зарегистрированных АТР-активируемых каналов является наличие проводящих подуровней. Как видно из рис.4, токи имеют по крайней мере 4 проводящих подуровня. Следующие факты указывают на то, что мы имеем дело не с четырьмя каналами низкой проводимости: во-первых, видны полные открывания канала до максимального (4-го) уровня (0,88 пА), тогда как

-60 -40 -20 0 го 40

3.5 нСм J'' 1

7 иСм -0.5 •

ЮиСм -1.0

15 пСМ (4) * ■ -1-5 „А

ё »о •8

1 оА

L.

-о.вг (з)

hi

-1-0 —0.5 о

L

О.Эв -0.18 О пА

Рис. 4. Токи через одиночные АТР-индуцирусмые каналы, зарегистрированые в эксперименте на нативной клетке (cell-attached). Раствор в пипетке содержал 105 мМ Ва2+ и 200 мкМ ATP. а -примеры записей токов при двух различных потенциалах на мембране. 6 - амплитудная гистшрамма (внизу), построенная по записи тока в течение 3-е интервала (вверху) и аппроксимированная гауссовыми кривыми, в - амплитудная гистограмма (внизу), построенная по 500 мс фрагменту заниси тока, отмеченному чертой в верхней части рисунка. Цифры справа от записи тока указывают величину амплитуды подуровней (пА), цифры в скобках соответствуют различным подуровням тока. Вертикальные линии на амплитудной гистограмме соответствуют значениям амплитуды подуровней. Гистограмма получена при фильтрации 50 Гц, ширина бина -0,02 пА. г - вольт-амперные характеристики различных подуровней, полученные в 5 экспериментах. Вертикальпые линии - среднеквадратичные отклонения. Значения, получение в экспериментах на интактиой клетке ("cell-attached"), обозначены кружками, в экспериментах на изолированном фрагменте мембраны ("outside-out") - треугольниками. Цифры в скобках соответствуют различным подуровням тока.

одновременное открывание или закрывание четырех каналов маловероятно; во-вторых, не было зарегистрировано событий, превышающих максимальный уровень, это дает возможность утверждать, что в исследуемом фрагменте мембраны нет каналов с различной проводимостью.

Амплитудные гистограммы, полученые при высокой фильтрации (50-100 Гц), содержали один или несколько различимых пиков. Амплитудная гистограмма (рис. 4,6), полученная из участка записи длительностью Зс, хррошо описывается суммой пяти гауссовских распределений. Средние амплитуды подуровней тока составляли 0,2; 0,4; 0,6; 0,86 пА, что близко к значениям, оцененным визуально из записей токов, представленных на рис.4,в (показаны горизонтальными линиями). Пики, плохо разрешимые на гистограмме (рис.4,б), более четко представлены на амплитудной гистограмме (рис.4,в), полученной из анализа короткого (500 мс) участка записи тока (отмечен чертой на рис.4,в). Вероятность различных подсостояний бьиа неодинакова, и число пиков, соответственно, варьировало в различные периоды регистрации. Анализ длинного (3 с) участка записи (рис.4,б) показывает, что 3-й подуровень преобладает, тогда как остальные имеют меньшую вероятность. В большей части экспериментов наименьшую вероятность имеет 4-й подуровень.

На рис.4,г представлены вольт-амперные характеристики различных подсостояний, полученные из 5 экспериментов на нативной клетке. Некоторые проводящие подуровни наблюдались не во всех опытах и не при всех потенциалах. Средние значения проводимостей для каждого из четырех подсостояний равны соответственно 3,5; 7; 10 и 15 пСм.

Эксперименты на изолированном фрагменте мембраны (outside-out). Как и в экспериментах на целой клетке, в outside-out экспериментах добавление 200 мкМ АТР к омывающему раствору вызвало активность каналов, исчезающую при удалении АТР из раствора. Входящее направление тока и положительное значение потенциала реверсии (треугольники на рис.4,г) свидетельствуют о том, что ток переносится ионами Ва2+. Аналогичные результаты были получены в 14 из 20 экспериментов.

Средние значения амплитуд различных подуровней тока, полученные из экспериментов на изолированном фрагменте мембраны, обозначены на вольт-амперной характеристике треугольниками (рис.4,г). Значения подуровней, полученные в экспериментах на нативной клетке (cell-attached) и на изолированном участке мембраны (outside-out), совпадают.

Наличие проводящих подуровней не связано с типом проникающего катиона. Наблюдалась активация каналов в "outside-out" экспериментах, когда наружный раствор содержал 10 мМ Са^+ в качестве единственного проникающего катиона. Рис.5,а показывает развитие активности при добавлении во внеклеточный раствор 50 мкМ АТР. В этом фрагменте мембраны работал только один канал. На рис.5,б. представлены различные подуровни тока при различных потенциалах. На 2-м и 3-м уровнях проводимости видны длинные открывания каналов, тогда как на 4-ом уровне канал работал редко и коротко. Вольт-амперные характеристики представлены на рис.5,в, углы наклона кривых соответствуют проводнмостям подуровней соответственно 4; 9; 13 и 17 пСм.

Отношение проницаемостей Рва/^К каналов можно оценить, исходя из экстраполированного значения потенциала реверсии (Ej), по уравнению Гольдмана-Ходжкина-Каца (Hille, 1992):

Er=(RT/2F) ln(4PBaABa/PKAK), где Aßa и Ак - соответственно активности Ва^+ и К+. Коэффициенты активности принимались равными 0,75 для 145 мМ К+ и 0,25 для 105 мМ Ba^+. R, Т и F имели обычные значения. Значение Ег (42 мВ) получено экстраполяцией вольт-амперной характеристики 3-го преобладающего уровня проводимости (рис.4,г). Полученное таким образом значение Рва/^К оказалось равным 29. Для экспериментов, где 10 мМ Са^+ бьши основным носителем тока, коэффициент активности принимали равным 0,3; Ef=26 мВ и Рса/рК имеет значение равное 71. Таким образом получено следующее отношение проницемостей: Рса:Рва:Рк=71:29:1.

-60 -40 -20 0 20 40

.4 U Mil

Рис. 5. Токи через одиночные АТР-индуцирусмыс каналы, зарегистрированные в эксперименте на изолированном фрагменте мембраны ("outside-out") в условиях, кота единственным проникающим катионом являлся Са2+ (10мМ). а - развитие активности каналов при добавлении АТР в наружный раствор. 6 - заннси токов в увеличенном масштабе цри различных значениях мембранного потенциала. Горизонтальные линии указывают на подуровни тока, значения этих подуровней указаны справа, в -вольт-амперные характеристики различных подуровней тока. Цифры в скобках на рис. 5,б,в соответствуют различным подуровням тока

-20 мВ 105 мМ Са21"

iW'vWvvJ ^ ' I ^

105 мМ St2+

'ПГТ^ГТГ"'

145 мМ Na+ 105 иМ Мп2+

105 мМ Ва2+_

-60 -40 -20

106 Еа 106 На

мВ

1иА I- 200 мс

Рис. 6, Селективность канала для различных двух- и одновалентных катионов, а - Примеры токов через одиночные каналы в "оШ31(1с-оиГ эксперименте с различными катионами во внеклеточном растворе, б -вольт-флперные характеристики для различных катионов, концентрации даны в мМ. Вертикальные линии - среднеквадратичные отклонения.

Измерения одиночных каналов в экспериментах на целой клетке ("whole-cell"] Чтобы быть уверенным, что АТР-активируемые каналы, наблюдаемые в экспериментах на фрагменте мембраны, вносят основной вклад в интегральный АТР-индуцируемый входящий ток, мы попытались зарегистрировать одиночные каналы в экспериментах на целой клетке. Для этого выбирались клетки малого размера, чтобь: уменьшить число каналов и улучшить соотношение сигнал-шум. Показано, что одиночные каналы, зарегистрированные на целой клетке, идентичны 3-му подуровню АТР-активируемых каналов, полученных в "cell-attached" и "outside-out" экспериментах. На основании этих данных можно сделать вывод, что ЛТР-индуцируемый интегральный ток, обусловленный переносится через те же

каналы, которые были идентифицированы при внеклеточном приложении АТР в экспериментах как на нативной клетке, так и на изолированном участке мембраны.

Селективность канала для двух- и моновалентных катионов. В экспериментах на нативной клетке ("cell-attached") после внеклеточного приложения АТР активность Са2+-проницаемых каналов сохранялась в течение 30 -40 с и затем полностью исчезала, возможно из-за десенситизации рецептора. В работ Наумова с соавт. (Naumov et al., 1995) было показано, что в конфигурации "inside-out" возможно возобновление активности каналов с теми же характеристиками, что i при внеклеточном приложении АТР путем добавления GTP или GTPyS к внутренней поверхности мембраны. Можно было ожидать, что введение GTPyS в пипеточный раствор в экспериментах на изолированном фрагменте мембраны макрофагов будет активировать те же каналы без участия АТР. Были проведены эксперименты в "outside-out" конфигурации, когда GTPyS добавляли к раствору в пипетке в концентрации 100 мкМ. В 70% экспериментов (п=45) наблюдалась активность каналов без приложения АТР к омывающему раствору. Значения проводимости (у) и потенциала реверсии (Ег), полученные из этих опытов, совпадают со значениями для наиболее часто встречающегося 3-го подуровня тока АТР-активируемых каналов,

получеными в cell-attached и outside-out конфигурациях в идентичных ионных условиях. Таким образом, GTPyS-индуцированные каналы, зарегистрированные в outside-out экспериментах идентичны АТР-активированным каналам. Отсутствие АТР во внеклеточном растворе исключало процессы десенситизации рецептора, что позволяло проводить эксперимент долго (до 15 мин) и регистрировать токи через канал в различных по ионному составу экстраклеточных растворах.

Таким образом, были подобраны условия для того, чтобы охарактеризовать относительную проницаемость АТР-активируемых каналов для различных двух- и моновалентных катионов. Была проведена серия экспериментов в outside-out конфигурации в условиях, когда наружный раствор содержал двухвалентные катионы (105 мМ) или Na+ (145 мМ). В одном эксперименте удавалось протестировать 4-5 различных катионов. Пример такого опыта представлен на рис.6,а. На рис.6,б показаны зависимости токов через канал от напряжения на мембране для различных двухвалентных катионов. Средние амплитуды токов получены из 6 - 8 опытов. Исходя из экстраполированных потенциалов реверсии ряд селективности канала Для двухвалентных ионов получился следующим: Са2+ > Ba2+ > Mn2+ > Sr2+. Соответствующие потенциалы реверсии равны +53, +43, +41 и +29 мВ. Используя уравнение Гольдмана-Ходжкина-Каца получено следующее отношение проницемостен: Рса:Рва:Рмп:Р5г:Рк=68:30:2б:10:1.

Ряд проводимостей, полученных из наклона вольт-амперных характеристик для каждого катиона (рис.7б), имел следующий вид: Са?+ (19пСм) > Sr2+ (18пСм) > Мп2+ (12пСм) >Ва2+ (ЮпСм). Он в значительной степени отличается от ряда проницаемостей, что можно объяснить различным сродством этих катионов к месту связывания в канале.

Оценку РМа^К проводили в экспериментах на изолированном фрагменте мембраны, когда наружный раствор, в качестве единственного проникающего катиона, содержал 145 мМ Na+. В опытах где наружный раствор не содержал Са2+, мембраны были менее стабильны. Это обстоятельство, а также наличие Na+ каналов,

непроницаемых для Са^+ (Negulyaev, Vedernikova, 1994), делали сложньш измерение натриевого тока через АТР-активируемые каналы. В трех успешных опытах, один из которых представлен на рис.7,а, экстраполированный потенциал реверсии для 145 мМ Na+ равнялся +31 мВ, что указывает на то, что канал более селективен для Na+, чем для К+. Проводимость канала для 145 мМ Na+ - 14 пСм и амплитуда тока, переносимого Na+ через АТР-активируемый канал, была много меньше тока, переносимого Са^+. Исходя из потенциала реверсии, значение P[\ja/Pj^ = 3,5.

В исследованиях одиночных потенциал-зависимых Са^+ каналов (Kostyk, et al; 1983; Aimers, et al; 1984) был показан ингибирующий эффект внеклеточного Са^+ в микромолярных концентрациях на ток, переносимый Na+. На гладкомышечных клетках (Benham, Tsien; 1987) и клетках феохромацитомы (Nakazawa et al, 19906; Neuhaus et al; 1991) был обнаружен аналогичный эффект для АТР-активированных каналов с использованием миллимолярных концентрациях Са^+. В обоих случаях натриевый ток, в условиях, когда внешний раствор не содержит был много больше тока, переносимого такими же концентрациями кальция. Как можно видеть на рис.7,а, в outside-out экперименте добавление 2 мМ к внеклеточному раствору, содержащему 145 мМ Na+, не только не привели к уменьшению тока, переносимого натрием, но, как видно из вольт-амперной характеристики, показанной на рис.7,б, несколько увеличили амплитуду тока.

По данным многих исследователей (Benham, Tsien, 1987; Nakazawa, Matsuki,1987; Friel, Bean, 1988; Sasaki, Gallacher, 1990; Vincent, 1992) в экспериментах на целой клетке АТР-индуцированный макроскопический ток имел потенциал реверсии, близкий к 0 мВ, т.е. АТР-активированные каналы могли классифицироваться как низкоселективные каналы, проницаемые для одновалентных катионов и Са^+. В экспериментах в "whole-cell" конфигурации на клетках слюнной железы (McMillan et al., 1988) и на сердечных клетках (Friel, Bean, 1988) было показано, что добавление GTP или GTPyS к раствору в пипетке не вызывает изменений в АТР-индуцированном ответе клетки, что говорит о том,

145 мМ Na

145 мМ Na+, 2 мМ Са2+

-40 мВ

-60 -40 -20 0 20 40 60

i/чЦ* -20 мВ Ч "*■"■■ " 1Щ -20 мВ А Y- o.s

ViiUir ' 0 мВ VfJwbftj gw у 0 МВ у/ -1.0

■ -1.5 пА

мВ

I IIA

Рис. 7. Натриевый ток через Са2+-проницаемые каналы в "о^Ме-ои!" эксперименте, а - примеры записей токов при различных потенциалах, б - вольт-ампериые характеристики (пустые символы -бескальциевый раствор заполненные символы раствор содержащий 2 мМ Са2+).

что рецептор и канал представляют собой единую молекулу, т.е. авторы имели дело с лиганд-управляемыми каналами. В нашей работе показано, что АТР-активируемые каналы в плазматической мембране макрофагов крысы более селективны для двухвалентных катионов, чем дня одновалентных и имеют доминирующую проницаемость для Са^+. Активность обнаруженных Са2+-проницаемых каналов стимулировалась приложением ко внутренней стороне изолированного фрагмента мембраны GTP или негидролизуемого аналога GTP, что свидетельствует, по-видимому, о том, что активность каналов этого типа регулируется непосредственно СТР-связывающим белком.

АТР-активируемые каналы макрофагов крысы, однако, менее селективны по сравнению с потенциал-зависимыми Са^+ каналами, в особенности с каналами L-типа, где Pq/Pk>3000 "(Hess et al, 1986).

Таким образом, каналы в плазматической мембране макрофагов крысы, активирующиеся в результате связывания анионной формы АТР с Р22"Рецептором по

всем основным показателям отличаются, как от других рецептор-управляемых каналов, так и от потенциал-чувствительных Са2+-каналов возбудимых клеток.

ВЫВОДЫ

1) В экспериментах с использованием метода локальной фиксации потенциала в условиях регистрации тока от целой клетки ("whole-cell") установлено, что АТР, поданный во внеклеточный раствор в микромолярных концентрациях, вызывает входящий ток, который переносится как двухвалентными, так и одновалентными катионами.

2) Входящий катионньш ток обусловлен активацией Pjz. рецептора. В пользу этого утверждения говорят следующие факты: a) ATP**" - активная форма; б) отсутствует реакция на UTP; в) наблюдается большая эффективность для АТР, чем для ATPyS и ADP; г) высокие концентрации АТР вызывают пермеабилизацию мембраны.

3) В экспериментах на нативной клетке ("cell-attached"), при заполнении регистрирующей пипетки раствором, содержащим АТР, наблюдалась активность одиночных каналов, которая исчезала через 30-40с вследствие десенситизации рецептора. Положительный потенциал реверсии этих каналов указывает на тот факт, что ток переносится катионами из раствора в пипетке. Специфическим свойством каналов являлется наличие по крайней мере четырех проводящих подсостояний.

4) В экспериментах на изолированном фрагменте мембраны ("outside-out") приложение АТР к наружной стороне мембраны вызывало активность тех же одиночных, каналов, что и в экспериментах на нативной клетке.

5) Приложение эквимолярных концентраций различных двухвалентных катионов или 145 мМ Na+ в экспериментах на изолированном фрагменте мембраны ("outside-out") дало ряд проницаемости: Р(]а : Рза : Рмп : Pgr : Pfvja : = 68 : 30 : 26 :10 :3,5 : 1, которьш существенно отличался от ряда проводимостей Са2+ (19пСм) > Sr2+ (18г.См) > Мп2+ (12пСм) >Ва2+ (ЮпСм). Таким образом, АТР-активируемые

каналы в плазматической мембране макрофагов крысы более селективны для двухвалентных, катионов, чем для одновалентных, с доминирующей проницаемостью для Са2+.

6) Активация АТР рецептора плазматической мембраны макрофагов крысы вызывает активность особого вида каналов, свойства которых отличаются от известных рецептор-управляемых или потенциал-управляемых Са2+-проницаемых каналов других типов клеток.

СПИСОК РАБОТ ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Naumov, А. P., Kuryshev, Yu. A., Kaznacheyeva, Е. V. & Mozhayeva, G. N. 1992. ATP-activated Ca2+-permeable channels in rat peritoneal macrophages. FEBS Letters. 313: 285-287.

Naumov, A. P., Kaznacheyeva, E. V., Kiselyov, К. I., Kuryshev, Yu. A., Mamin, A. G., Mozhayeva, G. N. 1995. ATP-activated inward current and calcium-permeable channels in rat macrophages plasma membrane. J. Physiol. 486: 323-337.

Naumov, A. P., Kaznacheyeva, E. V., Kuryshev, Yu. A., Mozhayeva, G. N. 1995. Selectivity of ATP-activated GTP-dependent Ca2+-permeable channels in rat macrophage plasma membrane. J. Membr. Biol. 148: 91-95.

Naumov, A.P., Kuryshev, Yu.A., Kaznacheyeva, E.V., Mozhayeva, G.N. 1993 Ca2+-perrneable channels in the plasma membrane of rat macrophages. Abstr. 37-th Meeting of Biophys. Society. Biophys. J. , 64, 2(part2), p. A-7.

Казначеева E.B., Мамин А.Г., Киселев К.И., Можаева Г.Н., Наумов А.П. 1996 Новый тип АТР-активируемых кальциевых каналов в плазматической мембране макрофагов крысы. Биол. мембраны 13: 162-177.

Подписано к печати 20.09.96 Заказ 251 Тираж 100 Объем 1,25 п.л. ЦОП СПГУ, 199034, Санкт-Петербург, наб. Макарова,6.