Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Механизмы кальциевой сигнализации в электро-невозбудимых клетках

ВАК РФ 03.00.25, Гистология, цитология, клеточная биология

Содержание диссертации, доктора биологических наук, Казначеева, Елена Валентиновна

Список используемых сокращений,.

Общая хараю-еристика работы.

Материалы и методы исследования.

Результаты исследований и их обсуждение

Глава 1. Проводящие и селективные свойства

АТР-активируемых капьций-проводящих каналов в мембране макрофагов крысы; идентификация типа пуринорецептора.

Глава 2. Стимуляция рецепторов, сопряженных с PLC, активирует кальций-проводящие каналы в мембране клеток А431,.

Глава 3. IP3 активирует кальций-проницаемые каналы низкой проводимости.

Глава 4. Взаимодействие низкопроводящих кальциевых каналов плазматической мембраны и рецептора 1Рз эндоплазматического ретикулума.

Глава 5. Функциональное связывание фосфатидилинозитол

4,5-бисфосфата с рецептором IP3 эндоплазматического ретикулума.

Глава 6. Фосфатидилинозитол 4,5-бисфосфат модулирует активность низкопроводящих Са2+ каналов плазматической мембраны.

Глава 7. Стимуляция мембранных рецепторов, сопряженных с PLC, активирует комплекс PIP2/ IP3R/ Imin-.

Глава 8. Пассивное опустошение Са2+ депо активирует Un каналы.

Глава 9. Каналы, обеспечивающие депо- и рецептор-индуцируемый вход кальция в клетках А431.

Выводы.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Механизмы кальциевой сигнализации в электро-невозбудимых клетках"

Актуальность проблемы. Одним из общих для всех типов клеток ответов на внеклеточную стимуляцию мембранных рецепторов физиологически активными веществами (гормонами, нейромедиаторами, ростовыми фаеторами) является повышение концентрации ионов кальция в цитоплазме [Ca2+]¡. Реализация Са2+ как вторичного посредника, передающего сигнал к внутриклеточным системам, возможна благодаря тому, что в состоянии покоя [Ca2+]¡ находится на очень низком уровне - 50-200 нМ [1], поэтому даже небольшое повышение его концентрации может в значительной степени влиять на внутриклеточные процессы, контролируя множество клеточных функций от краткосрочных, таких как сокращение и секреция, до продолжительных, таких как пролиферация и дифференцировка [2, 3]. Поддержанием низкой [Са2+]-, занимается ряд систем, обеспечивающих его транспортировку из цитоплазмы или связывание. Повышение [Ca2+]¡ осуществляется в разных типах клеток либо вследствие активации потенциал-чувствительных кальциевых каналов разных типов [4-6], либо через рецептор-управляемые кальциевые каналы, которые, в свою очередь, делятся на три основные группы: 1) лиганд-оперируемые каналы, у которых участок связывания лиганда и ионный канал находятся в пределах одной молекулы полипептида. К этой группе каналов относят катионный канал никотинового ацетилхолинового рецептора [7], канал NMDA рецептора [8], канал Р2х пуринорецептора [9, 10], 2) Са2+-каналы, связанные с рецептором через G-белок [11] и 3) каналы, активируемые через мембранные рецепторы, сопряженные с фосфолипазой С (PLC) [12-14].

Один и тот же агонист, связываясь с различными рецепторами, может активировать рецептор-управляемые Са2+-каналы, относящиеся к разным группам. Так например, АТР, связываясь с Р2Х-пуринорецепторами в ПМ гладкомышечных клеток [9; 15] или клеток феохромоцитомы [16-19] активирует лиганд-оперируемые ионные каналы. Связь АТР с рецепторами ПМ макрофагов мыши вызывает как выброс Са2+ из внутриклеточных кальциевых депо, так и вход его из внеклеточной среды [20]. Авторы показали, что выброс Са2+ вызывается активацией Р2и-пуринорецептора, сопряженного с PLC, а последующий вход кальция определяется в основном связыванием АТР с р^-рецептором, возможно, через вовлечение G-белка [21].

Активация рецепторов, сопряженных с PLC, приводит к увеличению [Са2*]|, которое в литературе принято называть «кальциевым сигналом». Рецептор-индуцируемый кальциевый сигнал является комплексным процессом и включает в себя два взаимозависимых и тесно связанных компонента: быстрый и кратковременный выброс Са2+ из внутриклеточных депо, расположенных в эндоплазматическом ретикулуме (ЭР), и более медленный и продолжительный вход кальция через ПМ. Процесс выброса Са2+ из внутриклеточных депо хорошо изучен [22, 23]. Связывание агонистов, таких как брадикинин, гистамин, серотонин, тромбин, вазопрессин и многих других, со своими рецепторами на ПМ, приводит к активации PLC., гидролизу мембранного фосфолипида фосфатидилинозитол 4,5-бисфосфата (Р1Р2) и наработке вторичных мессенджеров - водорастворимого инозитол 1,4,5-трисфосфата (IP3) и мембраносвязанного диацилглицерина (DAG). 1Рз, диффундируя по цитоплазме, связывается с рецептором IP3 (IP3R) эндоплазматического ретикулума. Поскольку IP3R является катионным каналом, его активация вызывает выброс Са2+ из депо, что и определяет первую фазу кальциевого сигнала. Свойства IP3R подробно изучены как на электрофизиологическом, так и на молекулярном уровне. Кристаллографический анализ показал, что рецептор является тетрамером, образуя структуру размером около 25 нм в диаметре. Субъединица рецептора имеет молекулярную массу 260 кДа [24]. Каждая субъединица связывает одну молекулу IP3, причем ни само связывание, ни открывание канала не являются кооперативным процессом [25]. Субъединица рецептора имеет 8 трансмембранных доменов вблизи С-конца молекулы, трансмембранная петля между 7 и 8 доменами образует пору канала [26]. N-конец молекулы обращен в цитоплазму, на нем находится участок связывания IP3. IP3R является малоселективным катионным каналом с проводимостью 80 пСм для 50 мМ Са2+ [27]. Активность канала колоколообразно зависит от [Са2+]| и имеет максимум при 0,3 мкМ Са2+ [28]. Это свойство рецептора является одним из основных и определяет пространственно-временной ход первой фазы кальциевого сигнала.

Вслед за опустошением Са2+ -депо следует вторая фаза кальциевого сигнала - вход кальция из внеклеточной среды через, так называемые, депо-управляемые каналы (store-operated channels (SOC)) [29-31]. Функциональная значимость этой фазы велика, поскольку она более продолжительна по времени и именно благодаря ей [Са2+1 может поддерживаться на высоком уровне в течение нескольких десятков минут. Некоторые клетки, например Т и В лимфоциты, имеют весьма ограниченное количество Са2+ -депо, и, именно вход ионов кальция через SOC контролирует процесс созревания В лимфоцитов [32], экзоцитозный выброс литических гранул в цитотоксических Т-клетках и долгосрочную активацию генов цитокинов в хелперных каналами [40]. Гомологи trp были найдены во многих клетках млекопитающих [41-44] и разделены по степени их гомологии к TRP в Drosophila на три больших семейства: TRPC, TRPV, TRPM. Самое большое разнообразие было показано для белков TRPC. Существует, по крайней мере, 7 различных каналов, объединенных в это семейство. Для всех этих каналов было показано, что рецептор-зависимая стимуляция PLC приводит к активации каналов, однако данные о прямой связи с опустошением внутриклеточных Са2+ -депо весьма противоречивы. Имеется множество данных, что гетерологичеекая экспрессия этих белков приводит к появлению депо-зависимого входа Са2+, однако не меньшее количество работ противоречит этому. Вероятным объяснением этих различий может служить тот факт, что TRP каналы образуют мультимерные структуры, и в случае, когда в клетке экспрессируется несколько видов TRPC (эндогенных и экзогенных), может меняться механизм их активации. Подтверждением этому предположению может служить тот факт, что ко-экспрессия TRP и TRPL в клетках Sf9 вызывала значительно большее увеличение чувствительности к степени заполнения Саг+ -депо, чем экспрессия этих белков по отдельности. Различие механизмов активации, по-видимому, тесно связано и с типом клеток. Эндогенные TRPC2 каналы в клетках Якобсонова органа крысы не чувствительны к опустошению депо, тогда как те же каналы в сперматозоидах мышей активируются тапсигаргин-индуцируемым опустошением Са2+ -депо. Таким образом, TRP каналы также не могут служить универсальной моделью депо-зависимых каналов.

Открытым остается вопрос о механизме передачи сигнала от опустошенных кальциевых депо к Са2+ каналам ПМ. К основным гипотезам, выдвигаемым на настоящий момент, можно отнести: 1) гипотезу водорастворимого посредника [45, 46]; 2) гипотезу встраивания везикул, содержащих каналы, в ПМ [47, 48]; 3) гипотезу конформационного сопряжения (coupling model) [30,49].

Согласно первой гипотезе опустошенное депо начинает освобождать некий фактор, который диффундирует к мембране и активирует SOC. Было показано, что это низкомолекулярный фактор небелковой природы с наличием фосфатной группы. Вещество, изолированное из Т лимфоцитов линии Jurkat, было способно активировать Са2+ вход в различных линиях невозбудимых клеток [46]. Однако другие исследователи, используя предложенный метод выделения этого вещества, сделали вывод, что действие экстракта из клеток линии Jurkat объясняется скорее .содержанием множества факторов, которые запускают Са2+ ответ, по-видимому, через активацию поверхностных рецепторов [50]. На роль подобного фактора выдвигались также cGMP, метаболиты цитохрома Р-450, гетеротримерные G-белки, низкомолекулярные G-белки, тирозиновые киназы [31]. Твердо не установлено участие этих веществ в непосредственной передаче информации о состоянии Са2+ депо к ПМ. Однако большинство из них имеют несомненно важные регуляторные функции, влияя на свойства SOC, изменяя кинетику и величину Са2+ входа.

Согласно второй модели предполагается, что SOC находятся в везикулах, а при опустошении Са2+ хранилищ происходит их встраивание в плазматическую мембрану. В пользу этой модели говорят данные о действии примаквина (ингибитора везикулярного транспорта) на активацию lorao- Так, предобработка клеток примаквином значительно уменьшала способность иономицина активировать lcrac, однако примаквин не блокировал уже активированный lcrac [31]. Основной вопрос, возникающий при рассмотрении данной гипотезы, состоит в том, что экзоцитоз, как предполагается, является Са2+-зависимым процессом, в то время как активация SOC наблюдается и при очень низких уровнях [Ca2+]i [51].

Гипотеза информационного сопряжения предполагает непосредственное белок-белковое взаимодействие между SOC плазматической мембраны и IP3R эндоплазматического ретикулума по аналогии с прямым взаимодействием в клетках скелетных мышц потенциал-управляемых Са2+ каналов L-типа, расположенных в плазматической мембране, с рианодиновыми рецепторами саркоплазматического ретикулума [52]. Для такого взаимодействия необходимо, чтобы две мембраны близко прилегали друг к другу. Данные электронной микроскопии показали, что в ооцитах Xenopus существуют области, где щель между ПМ и мембраной эндоплазматического ретикулума всего 8-13 нм [53]. Если учесть, что диаметр IP3R около 25 нм, то с точки зрения пространственного расположения, взаимодействие двух белковых молекул, расположенных в разных мембранах, возможно. Существует много данных, подтверждающих гипотезу конформационного сопряжения. Флуориметрические исследования показали, что в эндотелиальных клетках 1Рз-индуцируемый выброс Са2+ и SOC локализованы в одной области [54] Аналогичные данные были получены на ооцитах Xenopus [55] и на клетках RBL [56]. В поддержку данной модели говорят данные о возможности ко-иммунопреципитировать комплекс IP3R с TRPC3 [57] и с TRPC4 [58], а также регуляция активности hTRP3 каналов путем прямого взаимодействия с IP3R [59].

Резюмируя, можно сказать, что различные варианты активации капьций-проводящих каналов могут сосуществовать как в разных клетках, так и в одном типе клеток. Понимание механизмов кальциевой сигнализации в электро-невозбудимых клетках требует детального исследования функциональных и биофизических свойств Са2+ каналов, способов запуска и регуляции их активности. Полное исследование возможно лишь при изучении свойств одиночных каналов.

Цель и задачи исследования. Цель настоящей работы заключалась в исследовании свойств лиганд-оперируемых АТР-зависимых Caz+ каналов в макрофагах, а также в изучении механизмов генерации и регуляции кальциевого сигнала в клетках А431 при стимуляции рецепторов, приводящих к активации фосфоинозитидного цикла. Для достижения данной цели были поставлены и решены следующие задачи:

1. Идентификация типа пуринорецептора, активирующего вход Са2+ в макрофагах в ответ на АТР, определение селективных и проводящих свойств кальций-проводящих каналов.

2. Исследование свойств кальциевых каналов при действии Са2+ мобилизующих агонистов и роли 1Рз, как внутриклеточного посредника, необходимого для активации этих каналов.

3. Исследование механизмов взаимодействия кальциевых каналов плазматической мембраны с рецептором IP3 эндоплазматического ретикулума.

4. Определение роли фосфатидилинозитол 4,5-бисфосфата, как модулятора активности каналов кальциевого входа.

5. Исследование связи опустошения внутриклеточных кальциевых депо с каналами входа кальция.

6. Идентификация типов Са2+ каналов, вносящих вклад в суммарный депо- и агонист-индуцируемый вход кальция в клетках А431.

Основные положения, выносимые на защиту,

1. В плазматической мембране макрофагов существует новый тип АТР-индуцируемых кальциевых каналов. Работа этих каналов связана с активацией Рутила луринорецепторов и не требует участия продуктов гидролиза фосфоинозитидов.

2. Связывание агонистов с рецепторами плазматической мембраны клеток А431, сопряженными с фосфолипазой С, вызывает активность Са2+-каналов низкой проводимости (Imin). В качестве внутриклеточного посредника, активирующего lmln каналы, выступает инозитол 1,4,5-трисфосфат (IP3).

3. Активация 1тт каналов происходит путем прямого белок-белкового взаимодействия молекулы канала в плазматической мембране и молекулы рецептора 1Рз в эндоплазматическом ретикулуме, образующих комплекс 1Р3(3/1тт.

4. Р1Р2 является непосредственной составляющей комплекса 1Р31Ч/1т1П и играет модулирующую роль в активации 1тщ каналов.

5. Пассивное опустошение внутриклеточных Са2+ депо вызывает активность |т1п каналов. В таких условиях все комплексы 1РзР*/1тт находятся в Р1Рг-связанном состоянии.

6. Интегральный ток через мембрану целой клетки, вызванный опустошением Са2+ депо, имеет сложную природу и включает в себя два компонента: 1сгас и Цп, причем 1т|П вносит основной вклад в развитие продолжительного входа кальция в цитоплазму клеток А431.

Научная новизна полученных результатов. Проведено комплексное исследование механизмов кальциевой сигнализации на примере двух типов электроневозбудимых клеток.

Обнаружен новый тип АТР-индуцируемых кальций-проводящих каналов в плазматической мембране макрофагов крысы. Показано, что работа этих каналов связана с активацией Р^-типа пуринорецепторов. Характерным свойством работы этих каналов является вовлечение в процесс запуска их активности 6-белка.

Впервые показано, что в клетках А431 связывание агонистов с рецепторами плазматической мембраны, сопряженными с фосфолипазой С, вызывает активность Са2+-каналов низкой проводимости (1т1п). В качестве внутриклеточного посредника, активирующего и,, каналы, выступает инозитол 1,4,5-трисфосфат (1Р3).

Впервые показано, что активация каналов входа Са2+ происходит путем прямого белок-белкового взаимодействия молекулы канала в плазматической мембране и молекулы рецептора 1Рз (1РзЯ) в эндоплазматическом ретикулуме, образующих комплекс 1Р3Р*/ил.

Предложена новая модель инициации кальциевой волны в клетке.

Впервые показано, что фосфатидилинозитол 4,5-бисфосфат Р1Р2 является непосредственной составляющей комплекса 1РзКЛтт и играет модулирующую роль в активации 1т|П каналов.

Впервые показано, что интегральный ток через мембрану клеток А431, вызванный опустошением Са2+ -депо, имеет сложную природу и включает в себя два компонента: 1сгас и 1тщ, причем 1тщ вносит основной вклад в развитие продолжительного входа кальция в цитоплазму.

Научно-практическая значимость. Данные проведенного комплексного исследования вносят существенный вклад в решение фундаментальной проблемы клеточной биологии - проблемы передачи сигнала с рецепторов плазматической мембраны к внутриклеточным структурам.

Исследованные механизмы кальциевой сигнализации могут быть использованы при изучении функциональных процессов, в которых в качестве основного вторичного посредника выступают ионы Са2+.

Полученные в работе новые данные о регуляции депо-зависимого входа кальция в клетку имеют не только теоретическое, но и большое практическое значение для медицины и фармакологии, поскольку в настоящее время ингибиторы входа Са2+ используются для лечения воспалительных процессов и, лечения онкологических заболеваний.

Полученные результаты могут быть также использованы в учебных процессах на биологических факультетах Санкт-Петербургского и Московского Государственных Университетов.

Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на Всесоюзном симпозиуме «Ионный транспорт и регуляция функций клетки» (Ленинград, 1990); Международных съездах Биофизического общества США (Бостон, 1993; Сан-Франциско, 1997; Канзас-Сити, 1998; Бостон, 2001); Международной конференции Физиологического общества Великобритании (НьюКасл, 1994; Лидс, 1996); Международном семинаре «Кальциевая сигнализация» (Ил-Чокко, Италия 2000); Всероссийском симпозиуме «Клеточная биология на пороге XXI века» (Санкт-Петербург, 2000); Всероссийской медико-биологической конференции «Человек и его здоровье» (Санкт-Петербург, 2000, 2001); Международной школе-семинаре «Мембраны и сигналы» (Киев, 2000); Конференции Чешского нейрофизиологического общества (Прага, 2001); Всероссийской конференции «Биология - наука XXI века» (Пущино, 2001); 18-м Съезде физиологического общества им. И.П.Павлова (Казань, 2001). Материалы работы также докладывались на .семинарах Института цитологии, на семинаре Санкт-Петербургского научного центра, на семинарах Юго-Западного Медицинского центра (Даллас, США).

Структура и о бьем работы. Диссертация изложена в виде научного доклада на 51 стр. машинописного текста и иллюстрирована 1 таблицей и 24-мя рисунками. Материалы отражены в 28 публикациях в отечественных и международных журналах. Личный вклад автора заключался в постановке цели и задачи исследования, участии в проведении экспериментов, обработке, обсуждении и обобщении результатов.

Материалы и методы исследования

Клетки. Резидентные перитонеапьные макрофаги, выделяли из взрослых крыс линии Вистар (150-200г) по методу, предложенному Конрадом [60]. Клетки высевали на покровные стекла размером 4x4 мм^. Клетки поддерживали в среде DMEM с добавлением 10% эмбриональной сыворотки крупного рогатого скота, 100 мкг/мл пенициллина и 100 ед/мл стрептомицина в инкубаторе с 5% СО2 при 37°С. Клетки использовали в опытах на 2-11-е сут. после выделения. Тест на эстеразную активность с использованием а-нафтил-ацетата [61] показал, что не менее 98% выделяемых клеток - макрофаги.

Клетки эпидермоидной карциномы человека А431, полученные из Российской коллекции клеточных культур (Институт цитологии РАН), культивировали на среде DMEM с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки и антибиотиков (100 мкг/мл пенициллина и 100 ед/мл стрептомицина). За 1-3 сут. до опыта клетки высевали на покровные стекла размером 4x4 мм.

Регистрация ионных токов. В работе использовали метод локальной фиксации потенциала (patch-clamp) в четырех конфигурациях: в условиях подведения регистрирующей пипетки к мембране интактной клетки (cell-attached), на изолированных фрагментах мембраны в варианте, когда в раствор экспериментальной камеры была обращена наружная (outside-out) или внутриклеточная поверхность фрагмента мембраны (inside-out), а также в условиях регистрации тока от целой клетки (whole-cell) [62].

Мембранный потенциал внеклеточного раствора принимали за нулевой. Сигнал с усилителя РС501А (Warner Instr.) с сопротивлением в цепи обратной связи 10 ГОм фильтровали при 500 Гц и записывали в компьютер с помощью аналого-цифрового преобразователя PCL-718 (Laboratory Technologies Corp.) с частотой 2.5 кГц. Анализ результатов проводили с помощью пакета прикладных программ со стандартным набором операций для обработки измерений токов через одиночные каналы. Для анализа и представления данных по измерениям одиночных каналов низкой проводимости проводили дополнительную фильтрацию (80-100 Гц). Амплитуды одиночных каналов определяли по записям токов и по амплитудным гистограммам. Для количественной оценки степени активности каналов использовали величину NPo, т.е. произведение количества проводящих каналов (N) в данном фрагменте записи на величину вероятности открытого состояния (Ро), которая определялась из следующего уравнения: Po=l/Ni, где I - среднее значение тока через мембранный фрагмент на данном временном интервале, i - амплитуда тока открытого канала. Поскольку активность каналов значительно менялась во времени, для сравнитёльного анализа использовали значение NPomax3o, т.е. величину NPo, измеренную в течение 30-ти секундного интервала, когда активность каналов была максимальна. Данные представлены как среднее ± среднеквадратичное отклонение. Для расчета отношения проницаемостей Рд/Рв использовали уравнение Гольдмана-Ходжкина-Каца [66]: Pa/Pb=[B]¡/4[A]0 exp (EravF/RT){exp(EretfF/RT)+1}

В whole-cell экспериментах на клетках А431 поддерживаемый потенциал на мембране равнялся 0 мВ. Для регистрации тока подавали пилообразные ступени напряжения (ramps) от -100 до +70 мВ длительностью 200 мсек с интервалом между ними в разных опытах от 4 до 10 сек. Ток, зарегистрированный перед активацией Icrac. Isoc токов, принимали за нулевой. Для представления и сравнения данных амплитуду тока относили к величине емкости клетки. Среднее значение емкости составляло 25 ± 2 пФ (п=36). Для расчета отношения проницаемостей Рва/Роз к значению потенциала реверсии была введена поправка на жидкостный контактный потенциал 5,9 мВ. Для проведения шумового анализа, каждые 5 сек подавали тестовые ступени напряжения (-50 мВ, -100 мВ) длительностью 700 мсек. Записи токов при каждом тестовом потенциале фильтровали с частотой среза 1 кГц и оцифровывали на частоте 5 кГц. Величину среднего тока и дисперсии оценивали из 200 мсек записей токов.

Растворы. В начале эксперимента стекла с клетками помещали в экспериментальную камеру, заполненную контрольным наружным раствором следующего состава (в мМ): 145 NaCI, 5 KCl, 10 HEPES/KOH, 2 CaCI2 (pH 7,4). После достижения плотного контакта между поверхностью регистрирующей пипетки и мембраной раствор в камере заменяли на аналогичный, в котором все ионы Na* были заменены на ионы К*, для компенсации потенциала покоя клетки.

В экспериментах на перитонеальнах макрофагах искусственный внутриклеточный раствор содержал (в мМ): 120 К Glutamate, 10 HEPES/KOH, 10

EGTA/KOH, 0,2 CaCI2, 1 MgCI2 (pH 7,4; pCa 8). В большинстве экспериментов на целой клетке и на изолированных фрагментах мембраны наружный раствор содержал (в мМ): 105 BaCI2, 10 Tris/HCI (pH 7,4). Для измерения селективности канала использовали наружные растворы, содержащие 105 мМ СаС12 (или ВаС12, SrCI2, MnCI2) или 145 мМ NaCI и 10 мМ Tris/HCI. Концентрации АТР4" и Са2+ рассчитывали на основании формул, приведенных в статье А.Фабиато и Ф.Фабиато [63].

В экспериментах на клетках А431 в большинстве опытов в конфигурациях whole-cell и outside-out внутриклеточный раствор содержал (в мМ): 145 NMDG Aspartate, 10 Cs-EGTA, 10 Cs-HEPES, 1.5 MgCi2,4.5 CaCI2 (pH 7.3, pCa 7.0) либо без CaCI2 (pH 7.3, pCa>9). Внеклеточный раствор содержал (в мМ): 140 NMDG Aspartate, 10 BaCI2,10 CsHEPES, (pH 7.3). DVF (divalent free) раствор содержал (в мМ): 135 Na Methanesulfonate, 5 NaCI, 10 HEDTA, 0.5 EGTA, 10 HEPES (pH 7.3). В экспериментах на фрагментах мембраны (cell-attached, inside-out), раствор регистрирующей пипетки содержал (в мМ): 105 BaCI2 или 140 NaCI и 10 Tris-HCI (pH 7.3). Искусственный внутриклеточный раствор содержал (в мМ): 140 К Glutamate, 5 NaCI, 1 MgCI2, 10 HEPES/KOH, 2 EGTA/KOH, 1,13 CaCI2 (pH 7.4, pCa 7.0). Все эксперименты по регистрации одиночных каналов (если это не оговорено специально) проводили в стандартных условиях при поддерживаемом потенциале на мембране -70 мВ, оптимальном для работы lmin каналов [Kaznacheyeva et al.,1996].

Инозитол 1,4,5-трифосфат (IP3),U73122 фирмы "Calbiochem" (США), уридин трифосфат (иТР).аденозин трифосфат (АТР), 4-4-бромфенацилбромид (4ВРВ) "Sigma" (США) хранили в замороженном виде; растворы приготавливали непосредственно перед экспериментом. Анти-Р1Р2 антитела ("PerSeptive Biosystems" США) (титр 1:1500) разводили во внутриклеточном растворе 1:100. Везикулы стеорил-арахидонил PIP2 фирмы "Roche Molecular Biochemicals" (США) были приготовлены по методике, описанной в статье Lupu et, al., 1998.

Подачу свежеприготовленных растворов производили путем перфузии камеры 3-5 кратным объемом, что обеспечивало полную смену раствора менее чем за 1 сек Опыты проводили при температуре 22-24°С.

Экспрессия и очистка рекомбинантных белков. Амино-концевой лиганд-связывающий домен 1Р3-рецептора (IP3RN) (аминокислоты 2-604) был амплифицирован с конструкции cDNA IP3R (тип I) и встроен в вектор рЕТЗбВ с добавлением 6-His-tag в качестве маркера. Образовавшаяся конструкция имела полную формулу pET36B-IP3RN-H¡s. IP3RN белок экспрессировали в обеднённом протеазами штамме Eco//' -BL-21DE3 в LB среде и индуцировали 1мМ IPTG. Основная трудность заключалась в том, что pET36B-!P3RN-His белок, экспрессируясь, быстро агрегирует в водной фазе образуя нерастворимые конгломераты ("inclusion body"), поэтому выделение и очистка белка заключалась в выделении и очистке "inclusion body" с последующим рефолдингом белка. Клеточный осадок лизировали, обрабатывали ультразвуком. На низких оборотах центрифугирования "inclusion body" отмывали от разрушенных ультразвуком более лёгких остатков бактериальной клетки, затем солюбилизировали в 8 M мочевине, быстро разбавляли в 50 объёмах фолдинг-буфера (50 мМ TrisCI, 2 мМ EDTA, 1.25 M NaCI, 0.5 M L-arginine (pH 8.0)). Далее полученный белок концентрировали на фильтре Amicon под давлением инертного газа. Все стадии выделения белка контролировали при помощи электрофореза с последующим окрашиванием Кумасси, а также Вестерн блотом с моноклональными антителами анти-His. Полученный белок сохранял нормальные для IP3R свойства связывания с IP3 и Р1Р2, которые контролировали с помощью радиоактивного метода с использованием [3Н]1Рз. Аналогичную процедуру использовали для наработки мутантного 1P3RN-K508R белка, не связывающего IP3.

Специфическое связывание с радиоактивным fH]lP3. 10-20 мкг выделенного белка IP3R, IP3RN либо IP3RN-K508R 10 минут инкубировали на льду в связывающем буфере (50 мМ Tris-HCI, ,1 мМ EDTA, 1 мМ DDT,100mM NaCI (рН8.3)), после чего добавляли 10 мкМ[3Н]1Р3, преципитировали с 12% PEG и 1.2 мг у -globulin при 14000g. Преципитат быстро промывали связывающим буфером, растворяли в Soluene. Содержание [3Н] определялось в жидком сцинциляторном счетчике Beckman LS6500. Неспецифическое связывание определялось в присутствии 25 мкМ 1Р3.Специфическое связывание определялось вычитанием неспецифического связывания из общего связывания. Для определения конкурентного связывания PIP2 и IP3 с IP3R, различные количества везикул PIP2 добавляли к связывающему буферу.

Эксперименты на бислойной липидной мембране. Церебеллярные микросомы выделялись по методике, описанной в статье Kaznacheyeva et.al., 1998 и хранились при -70 °С. Микросомы встраивали в плоский липидный бислой, состоящий из смеси синтетических фосфолипидов PE/PS (3/1), сформированный на отверстии (100-200 мкм) в тефлоновой пленке, разделявшей экспериментальную камеру на два отделения - cis и trans. Токи через одиночные каналы регистрировали при потенциале 0 мВ. В качестве носителя тока использовали 50 мМ Ва2+. Раствор в ç/s-камере, соответствующий раствору с цитоплазматической стороны мембраны, содержал (в мМ): 110 Tris/HEPES, 1 EGTA, 0.7 CaCI2, 1 Na2ATP. Эксперименты проводили при температуре 22-24 °С.

Результаты исследований и их обсуждение.

Гпава 1. Проводящие и селективные свойства АТР-активируемых кальций-проводящих каналов в мембране макрофагов крысы; идентификация типа пуринорецептора.

Литературные данные свидетельствуют о том, что ПМ макрофагов содержит, по крайней мере, два типа пуринорецепторов: Р2и-рецептор, связанный с метаболизмом фосфоинозитидов, и Ргг-рецептор, вызывающий вход Са2+ из внеклеточной среды в цитоплазму без участия PLC [64]. Исследования одиночных АТР-акгивирумых Са2+-проводящих каналов в ПМ макрофагов отсутствовали и их основные биофизические свойства оставались неизвестными. Исходя из этого, цель первой части работы заключалась в идентификации типа пуринорецептора, вызывающего вход Са2+ в перитонеальных макрофагах крысы, регистрации одиночных ионных АТР-индуцируемых Са2+ каналов и определении их проводящих и селективных свойств. Для определения типа АТР-рецептора эксперименты проводили в whole-cell конфигурации метода patch-clamp. Добавление 200 мкМ АТР к внеклеточному раствору, содержащему 105 мМ Ва2+, при потенциале на мембране -50 мВ вызывало входящий ток (рис. 1). Значение пиковой величины тока в этих условиях составляло в среднем 45,5 ± 36,2 пА (п=16). При длительном приложении АТР ток уменьшался вероятнее всего из-за десенситизации рецептора АТР [9, 65].

Рис. 1. Интегральный входящий ток, вызванный добавлением 200 мкМ АТР к наружному раствору, содержащему 105 мМ Ва2+.

Поддерживаемый потенциал на мембране -50 мВ.

На одной клетке при кратковременном приложении и последующем отмывании АТР можно было получить 3-4 ответа. Удаление АТР из внеклеточной среды приводило к быстрому уменьшению тока. Тот факт, что увеличение концентрации Мд2+ во внеклеточном растворе приводит к ингибированию АТР-индуцированного тока, позволил придти к заключению, что активной является именно анионная форма АТР

АТР

25 пА|

-5 с

ATP4"). Действующие концентрации ATP4" находились в области от 0,07 до 22 мкМ, что согласуется с областью эффективных концентраций для Ргг-рецептора, оцененной путем измерения внутриклеточной концентрации Са2+ в макрофагах мыши, инкубированных с тапсигаргином [20]. Одним из способов определения типа рецептора является изучение его фармакологического профиля, т.е. сравнение степени эффективности различных лигандов. Эксперименты с эквимолярными концентрациями различных нукпеотидов позволили получить следующую последовательность эффективности: ATP > ATPyS > ADP. UTP был абсолютно неэффективен. Таким образом, совокупность полученных данных позволяет предполагать, что входящий катионный ток обусловлен активацией Ргг-рецепторов. Уникальным свойством Ргг-Рецептора является способность образовывать большие неселективные поры в ПМ при высокой концентрации агониста. Подобный эффект также наблюдался в наших экспериментах при высоких (более 500 мкМ) концентрациях АТР4", что служит дополнительным доказательством правильности определения типа пуринорецептора [Naumov et al., 1992; Naumov et al„ 1995a; Казначеева и др. 1996].

Для определения проводимости АТР-активируемых катионных каналов эксперименты проводили в cell-attached конфигурации и на изолированных фрагментах мембраны (inside-out и outside-out). На рис. 2А приведены примеры

Рис 2. Идентичность АТР-активирумых и GTP-индуцируемых кальциевых каналов.

A. Пример записи АТР-активируемого тока в cell-attached конфигурации. Последующая изоляция мембранного фрагмента (inside-out) приводила к полному исчезновению активности каналов, которая возобновлялась приложением к внутриклеточной поверхности GTP либо GTPyS.

Б. Изменение вероятности открытого состояния канала (NPo) во времени.

B. Вольт-амперная характеристика АТР-активирумых (кружки) и GTP-индуцируемых (треугольники) каналов. Амплитуда тока соответствует 3-му наиболее вероятному подуровню. записей токов через одиночные каналы в cell-attached эксперименте, когда раствор в пипетке содержал 105 мМ Ва2+ и 200 мкМ АТР. Мембранный потенциал а 105мМВа,.30мВ cell-attached aL inside-out контроль

GTPyS

TLTT' в да. м лл м

V(MB) ew там. -*>-»-я> » ю « 1

1Л 1(пА> поддерживали на уровнях от - 40 до 0 мВ, в этих условиях ток имел входящее направление. Активность канала в присутствии АТР зарегистрирована в 41 эксперименте, что составляет 68% всех попыток. В отсутствие АТР активность каналов не наблюдалась (п=19).

Характерным свойством зарегистрированных АТР-активируемых каналов является наличие четырех проводящих подуровней. Средние значения проводимостей для каиздого из четырех подсостояний равны соответственно 3,5; 7; 10 и 15 пСм. В большей части экспериментов наиболее вероятным был 3-й подуровень, наименьшую вероятность имело 4-е подсостояние. [Naumov et al., 1995а; Казначеева и др. 1996]. Аналогично результатам экспериментов в whole-cell конфигурации, в опытах на нативной клетке (cell-attached) также наблюдался эффект десенситизации рецептора АТР. После внеклеточного приложения АТР активность Са2+-проницаемых каналов длилась в течение 30 - 40 сек и затем полностью исчезала, (рис. 2 А,Б). При изоляции мембранного фрагмента и переходе в конфигурацию inside-out, несмотря на присутствие АТР в регистрирующей пипетке, активность каналов также полностью отсутствовала. Однако оказалось возможным возобновление активности каналов с теми же характеристиками, что и при внеклеточном приложении АТР, путем добавления GTP или GTPyS к внутриклеточной поверхности мембраны (рис 2А,Б) [Naumov et al., 1992; Naumov et al., 1995b] (рис.2). Быстрая инактивация рецептора в присутствии АТР, не позволяла проводить длительные эксперименты для исследования селективных и проводящих свойств АТР-активируемых каналов. Поэтому факт GTP-зависимости был нами использован в опытах в конфигурации outside-out. GTPyS был добавлен к раствору в регистрирующей пипетке. В 70% экспериментов (п=45) наблюдалась активность каналов без приложения АТР к омывающему раствору. Отсутствие АТР во внеклеточном растворе исключало процессы десенситизации рецептора, что позволяло проводить эксперимент долго (до 15 мин) и регистрировать токи через канал в различных по ионному составу внеклеточных растворах в пределах одного эксперимента (рис ЗА). На рис. ЗБ показаны зависимости амплитуды токов через канал от напряжения на мембране для различных двухвалентных катионов. Исходя из экстраполированных значений потенциалов реверсии (рис. ЗБ), получен ряд селективности канала для двухвалентных ионов: Са2+ > Ва2+ > Mn2+ > Sr2*, Соответствующие потенциалы реверсии были равны +53, +43, +41 и +29 мВ. С использованием уравнения Гольдмана-Ходжкина-Каца, получено следующее отношение проницаемостей: Рса : Рва : Рмп: Psr: Рк=68 : 30 : 26 : 10 : 1. При этом выявились значительные отличия ряда проводимостей двухвалентных катионов от д -20 MB

105 mM Ca2+

FTT

105 mM srz+ rTW 'IT "

145 вЫ Na*

• и^дЦг^иЛ

105 mM Mn

-i-;-IT

Б vfo

-eo -*0

Рис. 3. Селективность каналов для различных двух- и одновалентных катионов.

А. Примеры записей токов в оШвйе-оЫ: эксперименте в различных по ионному составу внеклеточных растворах. Б. Зависимость амплитуды тока от потенциала на мембране. Концентрации катионов даны в мМ. ряда селективности. Ряд проводимостей, полученный из наклона вольт-амперных характеристик (рис. ЗБ), имел следующий вид: Са2+ (19 пСм) > Sr2* (18 пСм) > Мп2+ (12 пСм) >Ва2+ (10 пСм). Отличие ряда проницаемостей от ряда проводимостей свидетельствует о различной степени связывания катионов с отрицательно заряженными группами в поре канала [66; Naumov et al., 1995].

Чтобы быть уверенным, что АТР-активируемые каналы, активность которых наблюдается в экспериментах на фрагменте мембраны, вносят основной вклад в интегральный АТР-индуцируемый входящий ток, мы попытались зарегистрировать одиночные каналы в экспериментах на целой клетке. Для этого выбирали клетки малого размера, чтобы уменьшить число каналов и улучшить соотношение сигнал-шум. Показано, что одиночные каналы, зарегистрированные на целой клетке, идентичны 3-му подуровню АТР-акгивируемых каналов, полученных в cell-attached и outside-out экспериментах. На основании этих данных можно сделать вывод, что в АТР-индуцируемый интегральный ток основной вклад вносит активность тех же каналов, которые были зарегистрированы при внеклеточном приложении АТР в экспериментах как на нативной клетке, так и на изолированном фрагменте мембраны [Naumov et al., 1996].

Резюмируя результаты приведенных экспериментов, можно сказать, что в ЛМ макрофагов обнаружен новый тип АТР-индуцируемых кальциевых каналов, следствием активации которых является повышение [Ca2+]i. Работа этих каналов связана с активацией Ргг-типа пуринорецепторов и не требует участия продуктов гидролиза фосфоинозитидов. Характерным свойством работы этих каналов является вовлечение в процесс запуска их активности G-белка.

Глава 2. Стимуляция рецепторов, сопряженных с PLC, активирует кальций-проводящие каналы в мембране клеток А431.

Широко документирован тот факт, что для различных типов клеток гормональная стимуляция приводит к увеличению концентрации Са2+ в цитоплазме. Клетки линии А431 оказались не исключением. Эксперименты, проведенные в методике флуоресцентного измерения [Са2+]|, показали, что приложение кальций-мобилизующих агонистов к внешней стороне ПМ вызывает двухфазное увеличение концентрации кальция в цитоплазме [66, Алексеенко и др. 2003]. Первая, быстрая фаза, соответствует выбросу Са2+ из внутриклеточных кальциевых депо, вторая, более медленная и долго длящаяся фаза, соответствует входу кальция через плазматическую мембрану. Исходя из этих данных, задачей следующей части работы было определение свойств Са2+ каналов ПМ, активирующихся внеклеточным приложением Са2+-мобилизующих агонистов, таких как UTP и брадикинин (ВК). Для этого использовали cell-attached конфигурацию метода patch-clamp. Добавление 100 мкМ UTP либо 10 мкМ ВК к раствору, омывающему клетку, приводило к появлению активности каналов, длящейся в течение нескольких минут (рис.4). Активация каналов наблюдалась не мгновенно, а с задержкой в 24 ± 8 сек. Активность каналов, выраженная в вероятности открытого состояния (NPo), составляла 0,99 ± 0,08 (п=17, для UTP) и 0,71 ± 0,11 (п=8, для ВК). Проводимость канала была равна 1 пСм (для 105 мМ Ва2+ либо 100 мМ Са2+), а экстраполированный потенциал реверсии был близок к +60 мВ, что говорит о высокой селективности канала для двухвалентных катионов относительно калия (рис. 5). Вероятность открытого состояния канала зависела от потенциала и увеличивалась при гиперполяризации мембраны. Таким образом, было показано, что в клетках А431, связывание агонистов с рецепторами ПМ, сопряженными с PLC, вызывает активность высокоселекгивных Са2+-каналов низкой проводимости, названными нами lmln [Kaznacheyeva et al., 1996]. Тот факт, что эффект наблюдался при добавлении агонистов в раствор, омывающий клетку, и следовательно фрагмент мембраны, заключенный под регистрирующей пипеткой, был для него недоступен, говорит о том, что активность каналов вызывается неким растворимым внутриклеточным посредником. Логично предположить, что в качестве такого посредника может выступать IP3, концентрация которого в клетке увеличивается в результате метаболизма фосфоинозитидов, вызванного активацией PLC.

Глава 3. 1Р3 активирует кальций-проницаемые каналы низкой проводимости.

В экспериментах, когда активность каналов вызывалась приложением Са2+-мобилизующих агонистов, изоляция фрагмента в искусственный внутриклеточный раствор (inside-out конфигурация) приводила к полному исчезновению активности 1тщ каналов (рис.4). Этот факт является подтверждением предположения об определяющей роли внутриклеточного посредника. Добавление 1Рз в раствор, омывающий цитоплазматическую сторону мембранного фрагмента, приводило к появлению токов с характеристиками, полностью совпадающими с вызванными UTP cell-attached ttk

2.5 мкМ IP,

Ail

-70 MB

•0 30 . 60 . 90 120. 150 160 сек 0.5 Cexlo.SnA

Рис.4. Кальций-мобилизующие агонисты активируют кальций проницаемые каналы клеток А431.

Изменение вероятности открытого состояния каналов (NPo) и примеры записей токов, регистрируемых при действии UTP (cell-attached) и IP3 (inside-out). Фильтр 100 Гц. либо ВК (рис. 5). Активность 1Р3-индуцируемых каналов блокировалась гепарином. Проводимость обнаруженных нами lmin каналов была значительно ниже, чем проводимость 1Рз-чувствительных каналов описанных в невозбудимых клетках [12, 13, 68], обонятельных нейронах [14] и в эндоплазматическом ретикулуме нейронов мозжечка [27]. Для того, чтобы понять возможный механизм активации каналов, необходимо было исследовать влияние различных концентраций 1Рз на степень активации каналов.

Зависимость вероятности открытого состояния lmin каналов от концентрации 1Рз показана на рисунке 13. Эта серия экспериментов проводилась при добавлении 1Рз во внутриклеточный раствор при фиксированном потенциале на мембране -70 мВ. Значения NPo рассчитывались по отрезкам записей токов длительностью 30 сек в период стабильной активности каналов, не обнаруживающей признаков затухания. Можно заметить, что активность каналов достигала практически максимального значения уже при 2 мкМ IP3 и значимо не менялась при дальнейшем увеличении концентрации IP3. Кажущаяся константа связывания составляла 0,2 мкМ. Диапазон действующих концентраций IP3 очень близок к тому, который был показан для IP3R эндоплазматического ретикулума [27].

Рис. 5. Свойства UTP- и 1Р3-индуцируемых кальциевых каналов.

A. Записи токов через одиночные UTP-активируемые каналы при различных потенциалах на мембране. Б. Вольт-амперная характеристика lm;n канала, зарегистрированная в cell-attached конфигурации, после приложения UTP (кружки) и в inside-out конфигурации при действии 1Р3 (треугольники).

B. Зависимость открытого состояния каналов (NPo) от потенциала на мембране. Значения NPo при -70 мВ в каждом опыте приняты за 1. Г. Распределение времен открытого состояния 1Р3-активирумого lmin канала при потенциале на мембране -70 мВ.

При измерении зависимости активности lm)n каналов от концентрации 1Рз был замечен тот факт, что большие концентрации 1Рз (>5 мкМ) хотя и вызывали большую активность каналов, но она длилась недолго и практически полностью спадала в течение 1 минуты, тогда как умеренные концентрации IP3 (<2,5 мкМ) позволяли регистрировать каналы в течение нескольких минут. Эффект потери чувствительности рецептора IP3 при высоких концентрациях лиганда был описан в работе на гепатоцитах [69] и был приписан 1Рз-зависимой десенситизации рецептора.

Для многих кальциевых каналов замечена регуляция их активности внутриклеточной концентрацией Са2+. Так, для loao каналов в Т лимфоцитах показана инактивация каналов при повышении [Ca2+]i [34]. В работе Киселева с соавторами [70] было показано, что зависимость вероятности открытого состояния Urn каналов от концентрации кальция во внутриклеточном растворе описывается кривой с максимумом в области рСа7. Кривая имеет вид асимметричного колокола. NPo круто спадает при рСа<7, и более полого спадает при рСа 8-9. Форма этой зависимости схожа с зависимостью активности IP3R от [Ca2*]i [28] с тем отличием, что активность IP3R при низких концентрациях [Ca2+]i затухает практически полностью.

Уникальные характеристики 1тщ каналов позволяют отнести их к новому особому классу рецептор-управляемых Са2+-проницаемых каналов. Необходимость в детальном исследовании механизмов их регуляции возрастает, если учесть тот факт, что каналы, близкие по функциональным параметрам к lmi„, были обнаружены и на других типах электро-невозбудимых клеток, таких как клетки линии НЕК293 [Nikolayev et al. 2001] и макрофаги мыши [70].

-¡7U «О

О мВ

8.1 па t. I. 11 ■ ■

-150 -100 -50 О МВ

I.I.I., л -'-0,1

1 пСм .»•

--0,2

1^=7.7 мс

10 20 30 40 50 сек

Описанные свойства 1тт и известные по литературным данным свойства !Р3Я представлены в таблице.

IP3R lmin

Активация 1Рз Да Да

Чувствительность Да Да к гепарину

1Р3-зависимая Да Да инактивация с«Л. Колокол Асимметричный зависимость колокол

Проводимость 20-80 пСм 1 пСм

Селективность Низкая Высокая

Са2+/К+

Сравнивая основные свойства IP3R и 1тщ канала можно увидеть, что рецепторные свойства этих двух каналов весьма схожи, тогда как проводящие свойства, являющиеся основными идентификационными свойствами каналов, сильно различаются. Поэтому предположение о том, что lmin канал является самим рецептором 1Рз или его аналогом, расположенным в плазматической мембране, является несостоятельным. Однако, сходство рецепторных свойств (Са-зависимость, 1Рз-зависимость, ингибирующее действие гепарина) позволяет нам предположить, что рецептор 1Р3 каким-то образом связан с регуляцией активности lmin. Это предположение согласуется с гипотезой конформационного сопряжения, выдвинутой Ирвином [49], согласно которой существует непосредственная связь между каналами Са2+ входа в ПМ и молекулой рецептора 1Рз, расположенной в мембране эндоплазматического ретикулума. В поддержку этого предположения говорят данные о регуляции активности hTRP3 каналов путем взаимодействия с IP3R [59], а также возможность ко-иммунопреципитировать комплекс IP3R cTRPC3 [57] и с TRPC4 [58].

Гпава 4. Взаимодействие низкопроводящих кальциевых каналов плазматической мембраны и рецептора 1Рз эндоплазматического ретикулума.

В изолированных фрагментах мембраны активация 1тщ каналов путем добавления 1Р3 наблюдалась лишь в 50% экспериментов (пИООО), тогда как активация каналов в условиях целой клетки в ответ на приложение Са2+-мобилизующих агонистов, наблюдалась значительно чаще. Было замечено, что способность 1РЭ вызывать активность 1т(п каналов уменьшалась после нескольких смен внутриклеточного раствора. Можно было предположить, что при изоляции фрагмента мембраны и неоднократной смене раствора теряется важный компонент, необходимый для активации 1тщ каналов. Таким компонентом мог быть 1РзЯ1.

Для проверки гипотезы конформационного сопряжения были проведены прямые эксперименты по влиянию экзогенного 1Р3Я и рекомбинантного лиганд-связывающего домена 1Р3Я на активность 1т|Л каналов.

Активация 1тщ каналов экзогенным ¡РзЯ.

Для проведения экспериментов были выделены микросомы двух типов: содержащие большое количество 1РзЯ (из мозжечка крыс) и малое количество 1Р3Я (из переднего мозга крыс) [КагпасЬеуеуа а1., 1998].

Если после изоляции мембранного фрагмента добавление 1Р3 в искусственный внутриклеточный раствор вызывало активность 1тт каналов, то сменой раствора добивались ее прекращения, если же активности каналов не наблюдали, то продолжали эксперимент без дополнительных смен. В 63%

-50 мВ 2.5 мкМ 1Р, церебеллярные микросомы Контроль i*4*i Рис. 6. Добавление микросом, |05пА содержащих IP3R, к

К°"1^'1Ь л.лм,„.1.л.„, 1 "*н внутриклеточной поверхности

2.г„«м ,р мембраны активирует lmin каналы.

-0 Записи токов в сжатом (вверху) и в .4.F ■ -о.м па развернутом масштабе времени.

500 мс экспериментов добавление церебеллярных микросом во внутриклеточный раствор, содержащий IP3, вызывало появление активности lmin каналов.

Удаление из раствора IP3 приводило к затуханию активности каналов, несмотря на присутствие IP3R. (рис. 6). Активации lmin каналов не было зарегистрировано ни после подачи к внутриклеточной поверхности контрольных микросом из переднего мозга (п=27), ни после приложения церебеллярных микросом без IP3 (п=6).

Исследование основных свойств каналов (проводимость, селективность, зависимость активности от мембранного потенциала), активность которых вызывалась приложением церебеллярных микросом к цитоплазматической стороне мембранного фрагмента, показало их полную идентичность каналам, активируемым в ответ на добавление Са2+-мобилизующих агонистов к наружной поверхности мембраны.

Таким образом, можно утверждать, что активность imin каналов в плазматической мембране регулируется прямым взаимодействием с рецептором 1Рз, расположенным в мембране эндоплазматического ретикулума, и это происходит лишь в том случае, когда рецептор 1Рз связан с 1Рз [Zubov et al., 1999].

Лиганд-связывающий домен IP3R регулирует активность lmin каналов.

Исходя из полученных данных о необходимости связывания IP3R с !Р3 для активации Imm каналов, мы предположили, что именно лиганд-связывающий домен IP3R играет определяющую роль в активации lmi„ каналов.

Для проверки этого предположения был экслрессирован фрагмент рецептора 1Рз со 2 по 604 аминокислоту (IP3RN), являющийся участком, ответственным за

IP,RN

I 2,SukMIP, mim: .ц,||| | .»« ^[^Ш'ущр^

1 »mj 1 пА

Б 2,5 шМ 1Р3 ^ 1500 А

-70 ИВ о 1 в «0,4 -0,2 0.0 0,2 пА

2,5MKMlP+IPfiN J20001 k -90 иВ 81000 J Ä

-0,4 -0.2 0,0 0,2пА

IA

-0.20 nA g

-70 »B г'«® j 1000 7пА о soo

2 Сек [0,5 nA - 0

IV

-0,4 -0.2 0,0 ОДлА

-100 -S0 0 50 MB

Рис. 7. Лиганд-связывающий домен IP3R активирует lmin каналы.

A. Пример записи 1Р3-индуцирумых токов в inside-out конфигурации до и после подачи IP3RN в сжатом масштабе времени (Е=-70 мВ).

Б. Записи токов в расширенном масштабе времени и амплитудные гистограммы до и после добавления IP3RN при различных значениях мембранного потенциала.

B. Вольт-амперная характеристика lm>„ каналов, активированных 1Р3и IP3RN. связывание рецептора со своим лигандом. Для контрольных экспериментов был также сконструирован и экспрессирован белок 1Р^М-К5(Ш, который не должен был связывать 1Р3, поскольку лизин в позиции 508 играет критическую роль для связывания 1Р3 [71, 72]. Оба эти рекомбинантных белка были проверены на связывание с [3Н]!Р3. Только IP3RN связывал 1Рз с теми же параметрами, что и нативный IP3R.

Для исследования функциональной роли этих белков использовали такие же протоколы экспериментов, как и в опытах с добавлением микросом. В экспериментах, когда после добавления 1Рз к изолированному фрагменту мембраны наблюдалась слабая активность каналов, добавление IP3RN вызывало усиление активности lmi„ (рис. 7). Свойства каналов, вызванных аппликацией 1P3RN, полностью совпадали со свойствами lmin, исследованными при активации в ответ на приложение Са2+-мобилизующих агонистов. Как и в случае с церебеллярными микросомами активность каналов наблюдалась только в присутствии 1Р3(рис. 8А). То есть присутствие IP3 необходимо для 1Р3ЯМ-зависимой активации lmin. Однако, действительно ли связывание 1Р3 с IP3RN важно для наблюдаемого эффекта? Для решения этого вопроса был использован белок IP3RN-K508R. Ни в одном эксперименте (n=8) IP3RN-K508R не вызывал активности каналов, в то время как последующее добавление IP3RN активировало Un каналы (рис. 8Б).

Рис.8. Связывание 1Р3 с 1Р31ЗД необходимо для активации 1т|П каналов.

А. Записи токов в сжатом и расширенном масштабе времени в ¡г^е-оиг конфигурации до и после приложения 1Р3.1Р3ЯЫ присутствует в растворе в течение всего эксперимента.

Б. 1Р3ЯМ-К5СШ не вызывает активности 1т;п ."' ' канэл0®'

250 мс

Таким образом, можно утверждать, что активация каналов Са2+ входа происходит путем прямого белок-белкового взаимодействия молекулы канала в ПМ и молекулы 1РзЯ эндоплазматического ретикулума через 1Р3-связывающий домен [РзЯ и это происходит лишь в том случае, когда рецептор связан с 1Р3.

Глава 5. Функциональное связывание фосфатидилиноз итол 4,5-бисфосфата с рецептором /Р3 эндоплазматического ретикулума.

Для того, чтобы образование комплекса IPзR/lmln было возможно, необходимо предположить, что 1Р3К эндоплазматического ретикулума локализован в непосредственной близости к плазматической мембране. Недавние исследования

70 MB IP.RN то вв ;

2.5икМ IP,;.

1 сок IP RN мм—un—I ни ■ ш показали существенную роль кавеол в поддержании комплекса hTRP1- IP3R [73]. Также было показано, что 50% мембранного фосфолипида PIP2 находится в кавеолах и именно эта фракция PIP2 является субстратом для PLC [74]. Поскольку в области кавеол ЭР расположен близко к ПМ, мы проверили возможность существования прямого взаимодействия IP3R с Р1Р2.

Моноклональныв анти- Р1Р2 антитела активируют IP3R.

Поскольку IP3R является ионным каналом, расположенным в мембране ЭР, исследование его свойств возможно лишь на модельной системе путем встраивания микросом, содержащих IP3R, в бислойную липидную мембрану и регистрации токов через канальную пору IP3R. В нормальных условиях значение вероятности открытого состояния IP3R, встроенного в бислойную мембрану, низко (Ро< 5%) (рис. 9А). мшфопь

2BKMIP3 рдаайь

Рис. 9. Р1Р2АЬ усиливают активность рецептора 1Рз, встроенного в липидную бислойную мембрану.

А. Записи токов, в сжатом и расширенном масштабе времени, через одиночный канал рецептора IP3 (IP3R) встроенного в липидную бислойную мембрану при действии 1Р3 и после добавления Р1Р2АЬ с «цитоплазматической» стороны бислоя. Б. Активность каналов, выраженная в вероятности открытого состояния (Ро) до и после добавления Р1Р2АЬ.

Мы обнаружили, что добавление к цитоплазматической стороне мембраны моноклональных анти-Р1Р2 антител (Р1Р2АЬ) увеличивало активность каналов в 3-4 раза (рис. 9Б). Значение вероятности открытого состояния увеличивалась с 3,5 ± 0,5% (п=18, в контроле) до 13,6 ± 1,7% (п=14, после добавления PIP2Ab). В некоторых экспериментах Ро достигала значения 40%. В качестве контроля использовали либо PIP2Ab, денатурированные нагреванием, либо PIPAb. Ни в одном из экспериментов эти антитела не вызывали увеличения активности ÍP3R.

Эти эксперименты позволили нам предположить, что IP3R может образовывать комплекс с Р1Р2 in vivo. В процессе выделения фракции микросом и встраивания в бйслойную липидную мембрану существующий комплекс IP3R/PIP2 сохраняется, оставаясь при этом неактивным. После добавления Р1Р2АЬ этот комплекс разрушается, позволяя молекуле 1Р3 активировать рецептор.

Анти- Р1Рг антитела увеличивают чувствительность рецептора 1Р3 к1Р3.

Для того, чтобы определить механизм действия Р1Р2АЬ мы регистрировали активность IP3R в ответ на приложение различных концентраций IP3 до и после добавления Р1Р2АЬ к бислою (рис. 10А). Анализ дозозависимости с помощью уравнения Хилла показал, что для церебеллярного IP3R кажущаяся константа

Рис. 10. Р1Р2АЬ увеличивают чувствительность 1Р3(% к 1Р3.

А. Зависимость вероятности открытого состояния 1Р3Я от концентраций1Р3 в контрольных условиях (черные кружки) и в присутствии Р1Р2АЬ (полые кружки) Данные описаны с помощью уравнения Хилла: РО=Ртах[1Рз]ПН/([1Р3]ПН+КаррГ,Н). Б. Увеличение чувствительности !Р3К к 1Р3 после действия Р1Р2АЬ, показанное в рамках одного эксперимента. связывания !Р3 (КаРР) составляет 1,5 мкМ, максимальная Po (Pmax) достигает 6,6% и коэффициент Хилла (пн) равен 1,4. После обработки с помощью PIP2Ab Карр=0.13, Ртах=13,4% и пн=2,0. Таким образом, PIP2Ab индуцируют 10-кратное увеличение чувствительности IP3R к 1Рз и двукратное увеличение вероятности открытого состояния каналов.

Аналогичный эффект действия PIP2Ab можно было наблюдать в течение одного эксперимента (рис. 10Б). Добавление 2 мкМ 1Рз с цитозольной стороны вызывало умеренную активность IP3R (Po« 3-5%), приложение PIP2Ab увеличивало Ро до 15%. Удаление активирующих веществ приводило к полному затуханию активности IP3R. Последующее добавление малых концентраций IP3 (100 нМ) вызывало практически мгновенную активацию IP3R до максимального уровня (15%), и ни дальнейшее увеличение концентрации лиганда, ни добавление антител не приводило к заметному изменению активности 1Р3В.

Такое Р1Р2АЬ-зависимое смещение дозозависимости 1Р3Я позволило нам предположить, что эндогенный Р1Р2 взаимодействует напрямую с местом связывания 1Р3 на 1Р3Я.

Р1Рг ингибирует связывание 1Рз с рецептором 1Рз-Взаимодействие Р1Р2 с сайтом связывания 1Р3 на 1Р3Я проверяли путем измерения связывания [3Н]1Р3 с 1Р3Я при добавлении различных концентраций экзогенного Р1Р2 (рис.11 А). Было обнаружено, что стеарил-арахидонил-Р1Р2 (5А-Р1Р2, Ю5о=3,2 мкМ) и дипальмитоил-Р1Р2 (0Р-Р1Р2, 1С5о=1,3 мкМ) ингибируют связывание [3Н]1Р3 в микромолярной области концентраций. В качестве контроля использовали

0,01 0.1 1 10 100 Р1Ря [нкМ]

Рис. 11. Экзогенный Р1Р2 ингибирует рецептор 1Р3.

A. Р1Рг блокирует специфическое связывание [3Н]1Р3 с 1РзЯ Данные для каждой концентрации Р1Р2 были нормированы относительно значения, полученного для 0,01 мкМ Р1Рг- Контрольные эксперименты проводились с 20 и 100 мкМ РС (полые ромбы), Рв (черные ромбы).

Б. Р1Р2 блокирует 1Р3-вызванную активность 1Р3Р?, встроенного в липидную бислойную мембрану. Увеличение концентрации 1Р3 частично устраняет эффект, вызванный Р1Р2.

B. Водорастворимый аналог Р1Р2 (ЗИР1Р2) ингибирует активность 1Р3Р*. такие основные фосфолипиды, входящие в состав ПМ клеток, как фосфатидилсерин (РЭ) и фосфатидилхолин (РС).

Добавление этих фосфолипидов даже в высоких концентрациях (100 мкМ) не вызывало значительных изменений в эффективности связывания [3Н]1Р3. Добавление смеси Р1Р2/Р8 вызывало ингибирование связывания, пропорциональное молярному содержанию Р1Р2. Таким образом можно сделать вывод, что ингибирующий эффект связывания 1Рз был специфичен для Р1Р2.

Для дальнейшего подтверждения существования комплекса IP3R/PIP2, сопрягающего две близко прилегающие мембраны, плазматическую и эндосомальную, in vivo, проверили предположение, необходимо ли для ингибирующего действия Р1Р2 его встраивание в мембрану эндоплазматического ретикулума, или молекула Р1Р2 может располагаться в плазматической мембране. Для этого использовали синтетический водорастворимый аналог PIP2 (ShPIP2). ShPIP2 ингибировал связывание [3Н]1Рз с IP3R (1С50=1,9 мкМ) в манере, сходной с липофильными аналогами (SA-PIP2 и DP-PIP2) (рис. 11А). Из этого можно сделать вывод, что для блокирования связывания 1Рз с IP3R PIP2 не должен быть встроен в эндосомальную мембрану.

Р1Р2 ингибирует функциональную активность IP3R.

PIP2 в микромолярных концентрациях ингибировал активность IP3R, вызванную добавлением 2 мкМ IP3 (рис. 11Б). Увеличение концентрации 1Р3 до 20 мкМ частично восстанавливало активность IP3R. Добавление PIP2Ab также снимало блокирующий эффект PIP2. Аналогично PIP2 водорастворимый ShPIP2 вызывал ингибирование активности каналов (рис. 11В). Этот результат служит дополнительным подтверждением того факта, что PIP2 не должен быть встроен в мембрану ЭР для проявления своего блокирующего действия.

Полученные данные позволяют нам утверждать, что IP3 конкурирует с Р1Р2за место связывания на рецепторе IP3. Количественно сходное конкурирование между PIP2 и 1Р3 было показано для РН-домена PLCS [75].

Таким образом, мы предполагаем, что в нестимулированных клетках часть IP3R, расположенных в эндосомапьной мембране, взаимодействует через лиганд-связывающий домен с PIP2, расположенным в близко прилегающей плазматической мембране клетки. Этот комплекс PIP2/IP3R является неактивным. Гормональная стимуляция приводит к активации PLC и расщеплению PIP2 до DAG и IP3. При этом молекула IP3 мгновенно связывается с IP3R, что приводит к быстрому выбросу Са2+ из внутриклеточного депо. Мы предполагаем, что этот новый компартментализованный сигнальный механизм ответственен за инициацию кальциевой волны в специальных триггерных зонах, тогда как распространение Са2+-волны по клетке продолжается за счет регуляции активности IP3R, зависящей от [Са21 [Lupu et al., 1998].

Глава 6. Фосфатидилинозитол 4,5,-бисфосфат модулирует активность низкопроводящих Са2* каналов плазматической мембраны.

Поскольку мы показали, что активность 1РзИ напрямую зависит от связи его с Р1Р2, логично предположить, что Р1Р2 является непосредственной составляющей комплекса 1^/1 РзЯ и может играть модулирующую роль в активации 1тщ каналов.

Анти- Р1Рг антитела увеличивают активность 1Рз-чувствительных I„i„ каналов.

В экспериментах на изолированных фрагментах мембраны (inside-out конфигурация) добавление 5 мкМ 1Р3 к цитозольной стороне ПМ вызывало умеренную активность 1тщ каналов, которая длилась несколько минут и затихала, возможно, из-за 1Рз-зависимой десенситизации. Добавление Р1Р2АЬ к раствору, содержащему 1Рз, восстанавливало и увеличивало активность каналов (рис. 12А,Б).

В среднем, в присутствии 2.5 мкМ 1Рз вероятность открытого состояния канала NPo составляла 0,8 ± 0,2 (п=13) в контроле и после добавления PIP2Ab

Рис. 12. Р1Р2АЬ усиливают активность lmin каналов.

A. Примеры записей токов через одиночные каналы в инвертированном фрагменте мембраны в контроле, после добавления !Р3 и после приложения смеси 1Р3 и PIP2Ab. Б. Развитие активности каналов, выраженное в NPo.

B. Вольт-амперные характеристики IP3 -активированных lmi„ каналов до (кружки) и после приложения PIP2Ab (треугольники).

Г. График зависимости вероятности открытого состояния (NPOma*3o) от потенциала на мембране для IP3 -активированных lm¡n каналов до (кружки) и после приложения Р1Р2АЬ (треугольники). Значения NPo"1®^ при -70 мВ в каждом опыте приняты за 1. увеличивалась до 3,0 ± 0,2 (п=7). В отсутствие 1Рз в цитозольном растворе добавление PIP2Ab не имело никакого эффекта. В качестве контроля была проведена серия экспериментов с анта-PIP антителами. Добавление анти-PIP антител в присутствии IP3 к цитозольной стороне изолированного фрагмента мембраны не изменяло активность lmi„ каналов. контроль

5мкМ IP, 5 |мМ Ip^í-PIPjAb

-to UB

500 мсвк] 0.5 ПА

PIP,Ab

S 3 z 2 1 oJ

-150 -100 -50 0 50 MB -0.1 - -0,2 -0.3 nA

0,5 0

-150 -100 -50 0 MB

Обработка мембраны антителами не изменяла основных свойств 1Рз-индуцированных каналов. Вольт-амперные характеристики (рис. 12В) и зависимости вероятности открытого состояния (NPo™*®)) от потенциала (рис. 12Г) в присутствии либо IP3, либо при добавлении смеси IP3 и Р1РгАЬ полностью совпадали. Таким образом, результаты блокирования Р1Р2анти-Р1Ргантителами показали, что сами по себе антитела не способны вызвать активацию 1шП, но существенно увеличивают их активность, вызванную аппликацией IP3.

Анти-Р1Р2 антитела увеличивают чувствительность канала к /РЗ.

Для того, чтобы выяснить механизм влияния Р1РгАЬ на lmtn каналы, мы регистрировали активность каналов в ответ на приложение различных концентраций 1Р3 к внутренней стороне ПМ после обработки изолированного фрагмента анти-Р1Р2 антителами. На рисунке 13 представлена зависимость активности каналов (NPomax3o)

Рис. 13. PIPîAb и UTP увеличивают чувствительность каналов к IP3

График зависимости вероятности открытого состояния (NPomax3o) от концентрации IP3 в контроле (светлые кружки), в присутствии PIPaAb (кружки) и при добавлении 100 мкМ UTP в раствор регистрирующей пипетки (треугольники). Кривые, описывающие экспериментальные данные, получены с использованием уравнения Хилла: NPQmax3o=(NPQrn8x3o)ma,'f!P3lnH/([IP3fH+KappnH) от концентрации IP3 как в контрольных экспериментах, так и после обработки Р1РгАЬ. Анализ полученных данных с помощью уравнения Хилла показал, что анти-Р1Рг антитела увеличивают активность lmin более чем в 3 раза: максимальная NPo увеличивается с 0.87 (контроль) до 3.21 (+Р1Р2АЬ). Помимо увеличения вероятности открытого состояния lmin антитела изменяют чувствительность 1тщ каналов к IP3. Кажущаяся константа связывания IP3 составляет 0.51 мкМ (контроль), 0.08 мкМ (+Р1РгАЬ) и коэффициент Хилла (пн) близок к 1. Таким образом, можно сделать вывод, что PIP2Ab в значительной степени увеличивают способность IP3 вызывать активность Un каналов.

IP3, мкМ

Р1Рг ингибирувт активность 1т,п каналов.

Поскольку анти-Р1Р2 антитела специфически связывают Р1Рг, логично предположить, что Р1Р2 должен вызывать эффект, противоположный действию PIPaAb. Для проверки этого предположения была проведена серия экспериментов в inside-out конфигурации с добавлением везикул PIP2 к цитозольной стороне плазматической мембраны. В 15 из 18 экспериментов наблюдали практически полное подавление активности, вызванной аппликацией 2.5 мкМ IP3. Ингибирующее влияние PIP2 могло быть частично устранено последующим добавлением высокой (20 мкМ) концентрации IP3. Для исключения предположения о возможном влиянии на активность lmi„ каналов не самого PIP2, а продуктов его метаболизма, были проведены эксперименты с добавлением во внутриклеточный раствор ингибиторов фосфолипазы А2 (4ВРВ) и фосфолипазы С (U73122). Ингибирующее влияние PIP2 на активность каналов не зависело ни от присутствия в растворе 4ВРВ (9 экспериментов из 13), ни от U73122 (4 эксперимента из 4). Таким образом можно утверждать, что экзогенный PIP2, а не арахидоновая кислота и не DAG, является ингибитором активности lmin каналов. Более того, в специальной серии экспериментов было показано, что диацилглицерин, добавленный во внутриклеточный раствор, не влиял на активность 1тщ каналов.

Таким образом, на основании представленных данных можно заключить, что активность комплекса LJIP3R модулируется PIP2 [Kaznacheyeva et al., 2001; Казначеева и др., 2002].

Глава 7. Стимуляция мембранных рецепторов, сопряженных с PLC, активирует комплекс Р1Р2/ IP3R/ 1тш

Активация PLC увеличивает чувствительность l„,t„ канала к IP3.

Поскольку было показано, что добавление Р1Р2АЬ к внутренней стороне плазматической мембраны вызывает многократное усиление активности lmir> каналов, переводя неактивные Р1Р2-связанные комплексы 1т'Шканал/1РзР в активное Р1Р2-свободное состояние, можно предположить, что в нативных условиях Са2+-мобилизующие агонисты, связанные с активацией PLC, должны вызывать эффект, аналогичный действию Р1Р2АЬ, гидролизуя Р1Р2 и, тем самым устраняя его ингибирующее влияние на комплекс 1т1л канал/1Р3Я.

Мы сравнили активность 1тщ каналов в изолированных фрагментах мембраны в ответ на внутриклеточное приложение !Р3 в двух типах экспериментов: в контрольных - без стимуляции рецепторов Са2+-мобилизующим агонистом - и в опытах, когда UTP был добавлен в раствор регистрирующей пипетки. В условиях регистрации токое на нативной клетке (cell-attached конфигурация) активность каналов, выраженная в NPo, в контрольных экспериментах составляла 0,08 ± 0,06 cell-attached

NPo

5i 4 3 2 1 0 контроль

NPO™» =0.08

NPo

5 4 3 2

100мкМ UTP NPo"" =1.5 сек о inside-out

NPo 5-1 43 2 1

О'

2,5 мкМ IP,

NPo™ =0.81

NPo

2,5 мкМ IP3 NPo™ =3.41

UlAtt.

CZDcell-attached ■■nstde-out

Рис.14. UTP вызывает увеличение чувствительности lmirl каналов к IP3.

Активность lm)n каналов, выраженная в NPo, в условиях регистрации токов в нативной клетке (cell-attached конфигурация) и в изолированных фрагментах мембраны (inside-out конфигурация) в контроле (А) и при введении UTP в регистрирующую пипетку (Б). В. Средние значения NPo1™^ в опытах на нативных клетках (cell-attached) и на изолированных фрагментах мембраны (inside-out) в ответ на аппликацию 2.5 мкМ 1Р3 в контроле (левые столбики) и в присутствии 100 мкМ UTP в регистрирующей пипетке (правые столбики). п=12)) (рис. 14А.В), а в опытах с 100 мкМ UTP - 1,31 ± 0,17 (п=33) (рис. 14Б,В). После изоляции фрагмента мембраны (inside-out конфигурация) добавление 2,5 мкМ 1Р3 к цитозольной стороне ПМ в контроле вызывало умеренную активность Lin каналов (NPoma*30=0,86 ± 0,20 (п=И2)) (рис. 14А,В). Приложение той же концентрации IP3 к цитозольной стороне мембраны стимулированной клетки, вызывало активность каналов, во много раз превышающую контрольную: 2,91 ± 0,23 (п=9) (рис. 12Б.В). В таких условиях активация lmin каналов оказывалась возможной и при чрезвычайно низких концентрациях 1Рз, которые в контрольных условиях были неэффективны.

На рисунке 13 представлена зависимость активности каналов (NPomax3o) от концентрации IPs как в контрольных опытах, так и в опытах на стимулированных клетках. Анализ полученных данных с помощью уравнения Хилла показал, что после действия UTP кажущаяся константа связывания !Р3 составляла 0.15 мкМ, а максимальная вероятность открытого состояния канала (NPomax3o) равна 3.33.

Особое внимание необходимо обратить на тот факт, что влияние UTP на дозо-зависимость активности 1Рз-индуцируемых lmin каналов, как и ожидалось, количественно совпадает с эффектом, вызванным обработкой фрагмента мембраны Р1Р2АЬ. Это связано, по-видимому, с тем, что активация PLC, вызванная связыванием UTP со специфическим рецептором ПМ, приводит к уменьшению концентрации Р1Р2, тем самым, снижая его ингибирующее влияние на комплекс 1P3R/Imin и увеличивая способность 1Р3 вызывать активность каналов.

Возвращаясь к вопросу о передаче сигнала с рецепторов плазматической мембраны к каналам, определяющим вход ионов Са2+ в клетках А431, можно полагать, что этот процесс выглядит следующим образом (рис. 15). Связывание агониста с рецептором плазматической мембраны (рис.15,А) приводит к активации PLC через G-белок. Активированная PLC, с одной стороны, уменьшает концентрацию PIP2 вследствие гидролиза, чем снимает его ингибирующее действие на IP3R, с другой стороны - увеличивает концентрацию IP3. Оба процесса действуют синергично. Связывание 1Р3 изменяет конформацию IP3R и через лиганд-связывающий домен IP3R передает сигнал к активации каналов входа кальция через плазматическую мембрану.

A Cell- attached Inside-out

Рис.15. Схема, объясняющая механизм генерации кальциевого сигнала, вызванного активацией мембранных рецепторов, сопряженных с фосфолипазой С (А), и пассивным опустошением кальциевых депо (Б). Пояснения в тексте.

Вся совокупность данных свидетельствует о том, что вход кальция в клетках А431, вызванный активацией рецепторов, сопряженных с PLC, может быть убедительно объяснен моделью конформационного сопряжения [49].

Глава 8. Пассивное опустошение Са2+ депо активирует 1тт каналы.

Предложенная нами модель [Kaznacheyeva et al., 2001, Казначеева и др., 2002] адекватно объясняет активацию Un каналов через PLC-зависимый механизм. Однако в литературе широко документирован тот факт, что каналы кальциевого входа могут быть активированы в ходе пассивного опустошения Саг+-депо под действием ингибитора Са2+-АТРазы - тапсигаргина (Тд), либо при хелатировании внутриклеточной [Са2+]| с помощью ВАРТА или EGTA [76, 77] без вовлечения гидролиза PIP2 [78].

Существование SOC каналов в клетках . А431 подтверждается флуоресцентными измерениями внутриклеточной концентрации Са2+ в ответ на Тд, которое происходит не только за счет высвобождениг кальция из внутриклеточных депо, но и за счет входа его через ПМ. Какие же каналы ответственны за вход Са2+ в таких условиях? Каковы их свойства и имеют ли они отношение к наблюдаемым нами ¡mm каналам?

Для ответа на этот вопрос мы исследовали Са2+ каналы, активирующиеся при действии Тд. Добавление 1 мкМ Тд в раствор, омывающий клетку в cell-attached экспериментах, вызывало очень слабую активность Са2+ каналов (NPomax30=0,11 + 0,03 (п=9)) (рис. 16,А). Однако, в тех экспериментах, когда Тд был добавлен в раствор регистрирующей пипетки, спустя 10-20 сек после формирования плотного контакта наблюдалась заметная активация каналов (ЫРо^зо^Л ± 0,24 (п=18)) (рис. 16,Б). Задержка активации каналов может быть объяснена временем, необходимым для опустошения примембраных Са2+ депо под действием Тд, проникающего в клетку из регистрирующей пипетки.

Возможной причиной отсутствия видимого эффекта после обработки всей клетки Тд может служить массированный выброс Са2+ из внутриклеточных депо и, соответственно, Са2+-зависимая инактивация Imin. В случае, когда Тд добавлен в пипетку, увеличение [Са2+]| происходит локально и он быстро диффундирует по цитоплазме. Для проверки этого предположения мы фиксировали внутриклеточную концентрацию Са2* на низком уровне, используя мембранопроницаемый Са2+-буфер ВАРТА-АМ. В 9 из 15 экспериментов добавление 100 мкМ ВАРТА-АМ вызывало активность каналов (рис. 16,В), в остальных 6 экспериментах последующее приложение Тд активировало каналы.

Основные свойства Тд-индуцируемых каналов, такие как вольт-амперная характеристика, высокая селективность для двухвалентных катионов, зависимость вероятности открытого состояния от потенциала, полностью совпадали со свойствами U каналов, активируемых UTP. Таким образом, можно заключить, что и PLC-зависимый и депо-зависимый вход кальция в клетках А431 поддерживается одними и теми же каналами - Un, для которых нами показано белок-белковое взаимодействие с IP3R и модулирующее действие PIP2.

Можно предположить, что в нативных условиях механизм активации низкопроводящих Са2+ каналов происходит следующим образом (рис. 15,Б). Главным звеном этого процесса является изменение конформации молекулы IP3R, которое путем белок-белкового взаимодействия передает сигнал к открыванию кальциевого канала. Этот конформационный переход, по-видимому, может достигаться как вследствие связывания рецептора с IP3 за счет прямого расщепления молекулы PIP2, входящей в комплекс PIP2/IP3R/Lin> так и вследствие процесса уменьшения люминальной концентрации Са2+, которое неким неизвестным способом приводит к изменению конформации рецептора IP3 [30].

В агонист-стимулированную активацию lroin каналов вовлечены все элементы комплекса PLC/PIPa/IPaR/lmin- Принимает ли участие этот комплекс или отдельные его компоненты в активации каналов в процессе пассивного опустошения депо?

Cell-altacfted -70 мВ 1 мкМ Тд в камере

Рис 16. Активация lmin каналов при пассивном опустошении Са2+ депо.

Записи тока в сжатом и расширенном масштабе времени, вызванного: А добавлением 1 мкМ Тд в раствор, омывающий клетку; Б присутствием 1 мкМ Тд в растворе регистрирующей пипетки; В добавлением 100 мкМ ВАРТА-АМ и 1 мкМ Тд в раствор, омывающий клетку.

Пассивное опустошение Са2* депо вызывает переход комплекса 1Рзй/1тш в Р1Рг связанное состояние.

В отличие от того, что мы наблюдали ранее, когда активация PLC вызывала увеличение способности 1Рз активировать 1тщ, пассивное опустошение депо под действием Тд приводит к противоположному эффекту. Как видно на рис. 17А, Тд, добавленный в раствор регистрирующей пипетки, активирует lmin каналы, однако после изоляции фрагмента мембраны ни в одном из 20 опытов добавление !Р3 во внутриклеточный раствор практически не вызывало активности каналов. Поскольку было показано, что уменьшение концентрации PIP2 приводит к увеличению чувствительности каналов к IP3 (рис. 13) мы предположили, что обратный эффект, наблюдаемый при действии Тд, вызывается увеличением количества Р!Рг-связанных 1т!п/1РзН комплексов. Для проверки этого предположения мы исследовали с/а

Тд в пипетке О

2,Sm«M IP.

2.5 мкМ IP3+PIPjAb

3-, ♦у -г

Я

I 2- "Г ■

1 - ■

Z «I

0- -1

CUCel-altactMd Hi inside-out

Рис.17. Депо-активированные каналы теряют чувствительность к 1Р3.

А. Р1Р2АЬ восстанавливают способность 1Р3 активировать !т|„ после опустошения Са депо тапсигаргином. Б. Средние значения (Мро"""^ влияние PIP2Ab на 1Рз-зависимую активацию lm,n каналов в изолированных фрагментах мембраны после действия Тд или ВАРТА-АМ. Добавление к клетке PIP2Ab восстанавливало способность IP3 к активации каналов (NPomax3o=2,73 ± 0,30 (п=7)) (рис. 17). Действие Р1РгАЬ носило специфичный характер, поскольку PIPAb не вызывали никакого эффекта. Эксперименты с PIP2Ab подтвердили наше предположение о том, что пассивное опустошение внутриклеточных Са2+-депо переводит все комплексы 1РзЯ/1щ1п в Р1Р2-связанное состояние. При этом, в отличие от состояния покоя, в условиях опустошения депо Un каналы в комплексе PIP2/IP3R/lmin являются активными, но при этом полностью теряют чувствительность К IPs.

Совокупность наших данных подтверждает, что PIP2 ифает роль модулятора lmin каналов, регулируя динамическое равновесие, между IP3R/Imin и PIP2/iP3R/lmin комплексами, как при агонист- ,так и при депо-индуцируемой активации каналов (рис. 15). Внеклеточное приложение UTP приводит к активации PLC и расщеплению

Р1Р2 в мембране, значительная часть 1тщ каналов находится в составе Р1Р2 -свободных IPâR/lmin комплексов и наблюдается значительное увеличение чувствительности к 1Р3 (рис. 15А). Опустошение внутриклеточных Са2+ депо с помощью Тд или ВАРТА-АМ сдвигает это равновесие в противоположную сторону: все Ц„ каналы входят в состав 1т|„/1РзР/Р1Р2 комплексов. Imîn каналы в таких условиях не чувствительны к IP3 (рис. 15Б). Однако, несмотря на потерю чувствительности к IP3 , в условиях целой клетки каналы остаются активны до тех пор, пока депо опустошено и предотвращена их Са2+-зависимая инактивация. Возможно, это соответствует переходу в особое конформационное состояние молекулы IP3R. Для окончательного понимания природы этих конформационных изменений необходимы дополнительные исследования.

Глава 9. Каналы, обеспечивающие депо- и рецептор-индуцируемый вход кальция в клетках А431.

Поскольку все описанные выше эксперименты по изучению свойств и регуляции Uin каналов были проведены в методике измерения одиночных каналов, это не позволяло нам определить каков же вклад данного типа каналов в общий агонист- или депо-индуцируемый вход кальция в клетках А431. Невозможным было сравнение свойств lmin каналов с наиболее изученным типом SOC каналов - tcrac. поскольку все известные данные о природе и свойствах l^c были получены путем измерения интегральных токов через ПМ всей клетки. Поэтому в заключительной части работы для решения этих вопросов мы использовали whole-cell конфигурацию метода patch-clamp.

Депо-зависимый вход Саг* в клетках А431 обеспечивается двумя типами кальциевых каналов.

Для исследования депо-акгивируемого входа двухвалентных катионов в качестве переносчика тока использовали 10 мМ Ва2+, а опустошение внутриклеточных кальциевых депо инициировалось перфузией клетки бескальциевым раствором с высоким содержанием Са2+-буфера (10 мМ EGTA, 1,5 мМ Мд2+, рСа>9). Эксперименты проводили при поддерживаемом потенциале на мембране 0 мВ, для регистрации токов давали пилообразные ступени напряжения (ramps) от -100 до +70 мВ длительностью 200 мсек с интервалом между ними в разных опытах от 4 до 10 сек и регистрировали входящие и выходящие токи, при -80, +30 и +50 мВ (рис. 18А). На рис. 18 Б видно, что вольт-амперные характеристики

ВАХ), измеренные в разные периоды времени после начала эксперимента - на раннем этапе (159 сек) (а) и на более позднем этапе (275 сек) (Ь) имеют заметные пА/пФ 2 1 О

-1

-2

•3

-4

30 MB X

1 i ■ i ' i ' i ' i 120 240 360 480 600 сек

В -100 -S0

Рис.18. Опустошение внутриклеточных Са2+ депо активирует Icrac и lsoe токи.

Опустошение депо достигалось введением в пипетку бескальциевого раствора с высокой концентрацией EGTA (10 мМ).

А. Изменения во времени токов, зарегистрированных при различных потенциалах. 0 соответствует моменту образования whole-ceil. Б. Вольт-амперная характеристика, зарегистрированная на 159 сек (а) и на 275 сек (Ь) после образования whole-cell. В качестве носителя тока использовали 10 мМ Ва2*. различия не только в величине, но и в форме кривой. ВАХ (а) имеет хорошо выраженное входящее выпрямление, причем не наблюдается выходящих токов вплоть до +60 мВ. ВАХ (Ь) практически линейна и при потенциалах больше +30 мВ появляются выходящие токи. ВАХ типа (а) были характерны для токов, зарегистрированных в первые 200 сек после начала эксперимента, тогда как тип (Ь) был характерен для более «поздних» токов (от 300 сек до конца эксперимента). Вид ВАХ (а) с резко выраженным входящим выпрямлением весьма близок к тому, который был описан на лимфоцитах и тучных клетках для высокоселективных "классических" !сгас [34, 76, 77]. Вид ВАХ (Ь) соответствует менее Са2+-селективному А лА/лФ,

UTP I +50мВ \ -80мВ а A-w в пА/пФн 0,0

-1.5 -3,1

UTP

50мВ

Рис 19. Агонист-индуцирумые ■crac и Uoc токи, переносимые ионами Ва2+ (10 мМ)

А. Приложение UTP вызывает активность только lorac каналов. Б. Вольт-амперные

О 100 200 300 400 500 600с<ж

200 400 600 boo 1ооо 1200<ан характеристики, -100 -50

Г -100 -50

50 мВ зарегистрированные в том же опыте на 24 сек (а) и на 92 сек (Ь) после добавления итР В. Приложение 11ТР вызывает активность только 1.»с каналов. Г. Вольт- амперые характеристики, зарегистрированные на 20 сек (а),на 220 сек (Ь) и на 510 сек (с) после добавления 1)ТР. Тот же опыт, что и на рис. В. току. Можно предложить два объяснения изменения ВАХ во времени: либо мы имеем дело с двумя типами каналов: и 15ос с разной селективностью для двухвалентых катионов относительно Сэ+ и при этом в более поздние времена менее селективный 16оо вносит существенный вклад в суммарный ток; либо селективность 1сгас изменяется по ходу эксперимента. Полученные данные указывают скорее на первую возможность, поскольку ВАХ обоих типов в разных опытах могли наблюдаться раздельно. Так, в одних клетках (в 5 из 33 экспериментов) в течение всего времени форма ВАХ не изменялась и соответствовала 1сгас с высокой селективностью, с выраженным входящим выпрямлением и отсутствием выходящих токов вплоть до +60 мВ (рис.19.А,Б), а в других (в 7 из 33 экспериментов) - наблюдались только 1нс с умеренной селективностью (Егеу=+50 мВ) (рис. 19,В,Г). В большинстве экспериментов все же наблюдали оба сорта каналов (п=19).

Рис. 20.Токи в ответ на пассивное опустошение Са2+ депо в опытах, где наблюдались только lene (а, п=4) и только lSOc токи (Ь, п=6).

А Развитие во времени lcrac (а) и 1юс (Ь) токов при -80 мВ. В каждом эксперименте амплитуда тока была нормирована относительно величины тока на 200 сек для (а) и 400 сек для U (Ь).

Б Средняя ВАХ для экспериментов, в которых активировались только 1сгас (а) и только (b) на стационарном уровне их активности. Данные соответствуют тем же экспериментам, что и на рис.А. В качестве носителя тока использовали 10 мМ Ва2+.

Оба типа токов активировались опустошением Са2+ депо, но активация Icoc до максимального уровня проходила быстрее (100-150 сек), чем активация iSOc (более 300 сек) (рис. 20,А). Отнесенная к площади клетки амплитуда токов при -80 мВ, измеренная в момент достижения постоянного уровня (в среднем через 200сек), была равна -0,96 ± 0,02 пА/пФ (п=4) а для Isoc каналов, измеренная не менее чем через 340 сек, -2,1 ± 0,2 пА/пФ (п=6). Потенциал реверсии был более +60 мВ и около +30 мВ, соответственно (рис. 20Б). Отношение проницаемостей Рва/Pcs для lsoo может быть вычислено, исходя из измеренного потенциала реверсии (с поправкой на жидкостный контактный потенциал) в условиях, когда 10 мМ Ва2+ были во внешнем растворе и 35 мМ Cs+ во «внутриклеточном» растворе, с использованием уравнения Гольдмана-Ходжкина- Каца. Полученное значение PBa/Pcs оказалось равным 15, что сходно со значениями, полученными для в других типах невозбудимых клеток [30, 31,79, 80].

Таким образом, пассивное опустошение депо в клетках А431 приводит к активации двух типов Са2+-проницаемых каналов с разными селективными свойствами и разными видами вольт-амперной характеристики.

Агонист-индуцируемая активация lsoc и /„ас токов.

В нормальных физиологических условиях вход Са2+ вызывается активацией рецепторов, связанных с PLC. Поэтому мы измерили токи, вызванные внеклеточным приложением UTP. Внутриклеточная концентрация Са2+ в таких экспериментах поддерживалась на уровне 100 нМ (рСа7), что не приводило к пассивному опустошению депо (Рис. 19). Добавление 100 мкМ UTP также вызывало активацию двух типов каналов с характеристиками, идентичными lcrac (рис. 19Б), и lsoc (рис. 19Г).

Таким образом мы показали, что lSOc и lcrac токи в клетках А431 могут быть вызваны как опустошением Са2+-депо, так и в ответ на активацию рецепторов ПМ, сопряженных с PLC. Возникает вопрос, к какому из этих двух типов каналов относятся исследуемые нами lm¡n каналы, которые по нашим данным входят в комплекс PLC/PIP2/IP3R/lmin. Исходя из линейного вида ВАХ lm¡n, можно предположить, что они не относятся к типу классических lcrac> для которых характерна вольт-амперная кривая с выраженным входящим выпрямлением. Однако для того, чтобы отнести Urn к одному из этих двух типов каналов, необходимо было попытаться охарактеризовать проводящие свойства одиночных каналов, вносящие вклад в интегральный ток.

Моновалентные lsoc и lene токи в клетках А431.

Самым очевидным и точным способом для сопоставления одиночных каналов с интегральными токами, является применение специфичных блокаторов. Однако ни для lcrac, ни для всех описанных в литературе lSOc, такой агент не найден. Поэтому единственным способом сопоставления остается сравнение проводящих и селективных свойств каналов. Для многих типов кальциевых каналов, например для потенциал-зависимых Са2+ каналов, было показано, что в условиях полного отсутствия двухвалентных катионов во внешней среде (DVF условия (divalent free)) через эти каналы протекает большой ток, переносимый ионами Na+ [81, 82]. Недавно и для 1Шс было показано, что в DVF условиях через каналы протекает натриевый ток в 10 раз больший, чем ток двухвалентных катионов [83-85]. Оценки проводимости Icrac для моновалентных катионов по измерениям шумов в whole-cell экспериментах показали значение, близкое к 0.2 пСм [85].

Измерения токов через одиночные каналы в наших экспериментах в условиях, когда 105 мМ Ва2+ или Са2+ были единственными носителями входящих токов, как уже упоминалось выше, показали значения проводимости около 1 пСм как для IPs-чувствительных, так и для депо-зависимых каналов. Мы предприняли попытку исследовать натриевые токи, переносимые через ]т,п в изолированных фрагментах мембраны в условиях DVF. На рис. 21 показаны записи натриевых токов, вызванные аппликацией 2.5 мкМ !Р3 к цитозольной поверхности мембраны (inside-out конфигурация) (рис. 21 Б) и опустошением Са2+-депо после приложения Tg + ВАРТА AM (cell-attached конфигурация) (рис. 21В). Соответствующие средние ВАХ, представленные на рис. 22, дают проводимость одиночных каналов lmin около 8,5-10 пСм. При измерении токов через одиночные каналы целой клетки (whole-cell) опустошение внутриклеточных Са2+ депо в DVF условиях (140 мМ Na+, 0.5 мМ EGTA) вызывало развитие входящего тока, переносимого ионами Na+. Амплитуда тока, соответствующего открыванию одного канала, составляла 0.6 пА при -50 мВ (рис.

Рис. 21. Одиночные lm)n каналы, зарегистрированные в DVF условиях, когда в качестве носителей тока использовались ионы Na+ (145 мМ).

A. Записи токов через одиночные депо-акгивируемые каналы в whole-cell конфигурации.

Б. Записи токов через одиночные 1Рз-акгивируемые каналы при различных потенциалах на мембране в inside-out конфигурации.

B. Записи токов через одиночные депо-акгивируемые каналы в cell-attached конфигурации.

Справа - соответствующие амплитудные гистограммы. Фильтр 100 Гц.

-2 -1 О ПА

21 А). Амплитуда и ВАХ каналов, зарегистрированные в whole-cell экспериментах, полностью совпадали с измеренными на изолированных фрагментах мембраны

-100

-50 I I.

-0,3

- -1,0 пА

Рис. 22. Вольт-амперные характеристики одиночных lmln каналов, зарегистрированные в DVF условиях (145 мМ Na+ как носитель тока).

Вольт-амперные характеристики Un, построенные по средним данным 1) в inside-out в ответ на внутриклеточное приложение IP3 - кружки (п= 8)

2) в outside-out в ответ на внеклеточное приложение UTP - полые квадраты (л=4).

3) в cell-attached в ответ на Тд+ВАРТА - полые треугольники. (п=5).

4) в whole-cell в ответ на пассивное опустошение депо - треугольники (п=4). рис. 22) и, следовательно, могут быть отнесены к Urn. Их появление в whole-cell экспериментах наблюдалось с некоторой задержкой относительно начала опыта, и они могли наблюдаться достаточно длительное время (до 10 мин). Именно на данном этапе эксперимента ВАХ в ответ на пилообразное изменение напряжения (ramp) от-100 до +70 мВ была линейной, с потенциалом реверсии около 0 мВ и большими выходящими токами при положительных потенциалах (рис. 23Б, кривая Ь), что, по-видимому, соответствовало активации менее селективных isoc. иц.

IJOuB

Рис. 23. Депо-активируемые токи, переносимые ионами Ыа+ в 0\/Р условиях.

А. Временное развитие тока, зарегистрированное при различных потенциалах. Б. Вольт-амперные характеристики, зарегистрированные на 120 сек (а) и на 130 сек (Ь) после начала эксперимента. Момент подачи 0\/Р раствора обозначен стрелкой.

Таким образом можно сделать вывод что именно 1тщ каналы соответствуют lsoc-составляющей общего депо- и агонист-активируемого входа ионов Са2+ в клетках А431. В отличие от линейной, в первые 10 сек ВАХ имела хорошо выраженное входящее выпрямление и выходящих токов не наблюдалось (рис. 23Б, кривая а). Такая форма ВАХ характерна для тока моновалентных катионов через lorac [85] и именно на данном этапе опыта, в первые 50-100 сек после образования wholecell, не наблюдалось явных открываний каналов. Мы предположили, что отсутствие разрешимых одиночных каналов в начале опыта связано с чрезвычайно низкой проводимостью Icrac (0.2 пСм) [85], что лежит за пределами возможностей регистрирующей аппаратуры.

Поскольку оценка проводимости 1сгак каналов в Т лимфоцитах проводилась путем измерения шумов [85], мы применили аналогичный метод для определения проводимости Icrac в DVF условиях в клетках А431. Для этого выбирались эксперименты, в которых в ответ на внеклеточное приложение UTP в течение всего времени форма ВАХ не изменялась и соответствовала активации lcrac с высокой селективностью, с выраженным входящим выпрямлением и отсутствием выходящих токов вплоть до +50 мВ (рис. 24А,Б). Фаза нарастания тока сопровождалась увеличением шума. Дисперсия флуктуации тока линейно зависела от величины

Рис. 24 Флуктуационный анализ моновалентного 1сгас тока.

A. Временное развитие тока, зарегистрированное при различных потенциалах.

Б. Вольт-амперые характеристики, зарегистрированные на 53 сек (а) и на 273 сек (Ь) после добавления иТР.

B. Примеры 200 мсек фрагментов записей токов при -100 мВ до (1) и после (2,3) подачи иТР. Г. Зависимость дисперсии от величины среднего тока.

Д. Вольт-амперная характеристика \то канала среднего тока, чего следовало ожидать в случае, если ток переносится через каналы с низкой вероятностью открытого состояния. Амплитуда тока через одиночный канал, оцененная из наклона графика зависимости дисперсии от среднего тока, составила -0,09 пА при 0 мВ, -0,14 пА при -50 мВ и -0,18 пА при -100 мВ (рис. 24Г). Эти измерения показали, что проводимость одиночного 1сгас канала в ОУР условиях в клетках А431 составляет 0,9 пСм (Рис 24Д), что в 5 раз больше хордовой проводимости 1сгас оцененной в аналогичных условиях в клетках линии иигка) [85] и в 10 раз меньше, чем проводимость моновалентных 180с каналов в клетках А431 (рис. 22). Разница в значениях проводимости 1огаС канала, полученных на клетках А431 и на Т лимфоцитах [85], может отражать различия как в свойствах 1сгас в разных типах клеток, так и в определенных допущениях, присущих методу стационарного шумового анализа.

Таким образом, можно сделать вывод, что интегральный ток через мембрану целой клетки, вызванный опустошением Са2+ депо, имеет сложную природу и включает в себя как 1ааС, так и менее Са2+ селективные 180С, причем последние вносят главный вклад в суммарный вход кальция. Анализ свойств 1сгас и 1500 в условиях переноса моновалентных катионов в отсутствие двухвалентных катионов позволяет заключить, что именно 1щю каналы, входящие в комплекс Р1С/Р1Рг/1РзР?/1г™п, соответствуют ии-составляющей общего депо- и агонист-активируемого входа ионов Са2+ в клетках А431. Если принять во внимание тот факт, что наличие каналов с функциональными свойствами, близкими к 1т|п, характерно и для других электроневозбудимых клеток, даже таких филогенетически далеких друг от друга, как клетки НЕК293 [№ко1ауеу а1., 2001] и макрофаги мыши [70], есть основания полагать, что этот тип каналов может обеспечивать рецептор-индуцированный вход Са2+ в клетках различного происхождения и, соответственно, механизмы регуляции их активности могут быть достаточно универсальны.

В заключение, выражаю искреннюю благодарность моему Учителю, Галине Николаевне Можаевой, за огромную заботу и поддержку, неоценимую помощь на всех этапах работы.

Выводы

1. В плазматической мембране макрофагов обнаружен новый тип АТР-индуцируемых кальциевых каналов, следствием активации которых является повышение [Са2+],. Работа этих каналов связана с активацией Рутила пуринорецепторов и не требует участия продуктов гидролиза фосфоинозитидов. Характерным свойством работы этих каналов является вовлечение в процесс запуска их активности в-белка.

2. В клетках А431 связывание агонистов с рецепторами плазматической мембраны, сопряженными с фосфолипазой С, вызывает активность Са2+каналов низкой проводимости (lmin). В качестве внутриклеточного посредника, активирующего Urn каналы, выступает инозитол 1,4,5-трисфосфат (IP3).

3. Активация каналов входа Са2+ происходит путем прямого белок-белкового взаимодействия молекулы канала в плазматической мембране и молекулы рецептора IP3 (IP3R) в эндоплазматическом ретикулуме, образующих комплекс IPaR/lmin- Взаимодействие происходит через 1Рз-связывающий домен рецептора 1Рз и это происходит лишь в том случае, когда рецептор связан с IP3.

4. В нестимулированных клетках часть рецепторов 1Рз, расположенная в эндосомальной мембране, взаимодействует через лиганд-связывающий домен с фосфатидилинозитол 4,5-бисфосфатом (Р1Рг), находящимся в близко прилегающей плазматической мембране клетки, что блокирует активность IP3R.

5. PIP2 является непосредственной составляющей комплекса 1тш/1РзК и играет модулирующую роль в активации 1тщ каналов. В нестимулированных клетках существует комплекс Р1Р2/1РзР?/1тш. Связывание агониста с рецептором плазматической мембраны приводит к активации PLC, что, с одной стороны, уменьшает концентрацию Р1Рг вследствие гидролиза, чем снимает его ингибирующее действие на IP3R, с другой стороны -увеличивает концентрацию IP3. Связывание IP3 изменяет конформацию рецептора IP3 и через лиганд-связывающий домен IP3R передает сигнал к активации каналов входа кальция через плазматическую мембрану.

6. Пассивное опустошение внутриклеточных Са2+ депо вызывает активность lmln каналов, по-видимому, за счет изменения конформации IP3R из-за понижения концентрации Са2+ в люмене. В таких условиях все комплексы WIP3R находятся в Р1Р2-связанном состоянии.

7. Интегральный ток через мембрану целой клетки, вызванный опустошением Са2+ депо, имеет сложную природу и включает в себя два компонента: lorao и lmin, причем lmin вносит основной вклад в развитие продолжительного входа кальция в цитоплазму клеток А431.

Список цитируемой литературы.

1. Meldolesi J. et al. 1987. Exp. Cell Res. 171: 271-83; 2. Berridge M.J. et a/. 1998. Nature. 395: 645-8; 3. Berridge M.J. etal. 2000. Nature Rev. Mol. Cell Biol. 1:11-20; 4.

Reuter H. 1986. Nature. 301: 569-74; 5. Костюк П.Г. 1986. Кальций и клеточная возбудимость. Москва, Наука; 6. Fedulova S. et al. 1985. J. Physiol. 359: 431-46; 7. Popot J.L., Changeaux J.P. 1988. Physiol. Rev. 64: 1162-88; 8. Cotman C.W., Iversen L.L. 1987. Trends Neurosci. 10:263-5; 9. Benham C.D., Tsien R.W. 1987. Nature. 328: 275-8; 10. Mahaut-Smith M.P. et al. 1990. J. Biol. Sci. 265: 10479-83; 11. Авдонин П.В., Ткачук B.A. 1994. Рецепторы и внутриклеточный кальций. Наука; 12. Кипо М., Gardner Р. 1987. Nature. 326: 301-4; 13. Mozhayeva G.N. et al. 1990. FEBS Lett. 277: 233-4; 14. Fadool D.A., Ache B.W. 1992. Neuron. 9: 907-18; 15. Nakazawa K., Matsuki N. 1987. Pflug. Arch. 409: 644-6; 16. Inoue K. et al. 1989. Neurosci. Let. 106: 294-9; 17. Nakazawa K. et al. 1990. J. Physiol. 428: 257-72; 18. Nakazawa K. et al.

1991. J. Physiol. 434: 647-60; 19. Neuhaus R. et al. 1991. J. Neurosci. 11: 3984-90; 20. Alonso-Torre S.R., Trautmann A. 1993. J. Biol. Chem. 268: 18640-7; 21. Tatham P., Lindau M. 1992. J. Gen. Physiol. 95: 459-76; 22. Berridge M.J. 1986. Nature. 323: 294-5; 23. Putney J.W.Jr. 1987. Am. J. Physiol. 252: 149-57; 24. Ferns C., Snyder S.

1992. Annu. Rev. Physiol. 54: 469-88; 25. Worieyet P.F. et al. 1987. J. Biol. Chem. 262: 12132-6; 26. Mlgnery G.A., Sudhof T. 1990. EMBO J. 9: 3893-8; 27. Parys J.B., Bezprozvanny I. 1995. Cell Calcium. 19: 353-63; 28. Bezprozvanny I. et al. 1991. Nature. 351: 751-4; 29. Putney J.W., McKey R.Rr. 1999. Bioessays. 21: 38-46; 30. Berridge M.J. 1995. Biochem. J. 312: 1-11; 31. Parekh A.B., PennerR. 1997. Physiol. Rev. 77: 901-30; 32. Kurosaki T. etal. 2000. Immunol. Rev. 176:19-29; 33. Lewis R.S. 2001. Annu. Rev. Immunol. 19: 497-521; 34. Hoth M., PennerR. 1992. Nature. 355: 353-6; 35. Zweifach A., Lewis R.S. 1993. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 90: 6295-9; 36. Montell C„ Rubin G.M. 1989. Neuron. 12: 1313-23; 37. Montell C. 1999. Annu. Rev. Cell Biol. 15: 231-68; 38. Vaka L. et al. 1994. Am. J. Physiol. 267: 1501-5; 39. Niemeyer B.A. 1996. Cell. 85: 651-9; 40. Montell C. 2001. Sci. STKE. 90: RE1; 41. Hofmann T. et al. 2000. J. Mol. Med. 78: 14-25; 42. Harteneck C. et al. 2000. Trends Neurosci. 23: 159-66; 43. Zhu X. et al. 1995. FEBS Lett. 373: 193-8; 44. Zhu X. et al. 1996 Cell. 85: 661-71; 45. Putney J.W.Jr. 1990. Cell Calcium. 11: 611-24; 46. Randriamanpita C., Tsien R.Y. 1993. Nature. 364: 809-14; 47. FasolatoC. etal. 1993. J. Biol. Chem. 268: 20737-40; 48. Somasundaram B. et al. 1995. Biochem. J. 309: 725-9; 49. Irvine R.F. 1990. FEBS Lett. 263: 5-9; 50. Gilon P. et al. 1995. J. Biol. Chem. 270: 6429-32; 51. Putney J.W.Jr. et al. 2002. J. Cell. Sci. 114: 2223-9; 52. Franzini-Armstrong C., Jorgensen A.O. 1994. Annu. Rev. Physiol. 56: 509-34; 53. Chadwick C.C. etal. 1992. J. Biol. Chem. 267: 3473-81; 54. ParadisoA.M. etal. 1995. Nature. 377: 643-6; 55. Petersen C.C., Berridge M.J. 1996. Pflug. Arch. 432: 286-92;

56. Parekh А.В., Penner R. 1995. J. Physiol. 489; 377-82; 57. Vannier B. et al. 1999. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 96: 2060-4; 58. Tang J. et al. 2001. J. Biol. Chem. 276: 21303-10; 59. Kiselyov K. et al. 1998. Nature. 396: 478-82; 60. Conrad R.E. 1981. Manual of macrophage methodology; 61. Monahan R.A. etal. 1981. Blood. 56: 108999; 62. Hamill O.P. et al. 1981. Pflug. Arch. 391: 85-100; 63. Fabiato A., Fabiato F. 1979. J. Physiol. (Paris). 75: 463-505; 64. Steinberg Т.Н. et al. 1987. J. Biol. Chem. 262: 3118-22; 65. Vincent P. 1992. J. Physiol. 449: 313-31; 66. Hille B. 2001. Ionic channels of excitable membrane Sinauer Associates, Sunderland MA, USA. 814p; 67. Mozhayeva M„ Kiselyov K. 1999. Pflug. Arch. 435: 859-64; 68. Vaka L, Kunze D.L

1995. Am. J. Physiol. 269: 733-8; 69. Hajnoczky G., Thomas A. 1994. Nature. 370: 474-7; 70. Kiselyov K. et al. 1999. Pflug. Arch. 437: 305-14; 71. Yoshikawa F. et al.

1996. J. Biol. Chem. 271:18277-84; 72. Bosanac I. etal. 2002. Nature. 420: 696-700; 73. Lockwich T.P. et al. 2000. J. Biol. Chem. 275: 11934-42; 74. Pike L.J., Casey L. 1996. J. Biol. Chem. 271: 26453-6; 75. Cifuenteset M.E. et al. 1994. J. Bioi. Chem. 269:1945-8; 76. PremackB.A. etal. 1994. J. Immunology. 152: 5226-40; 77. Zweifach A., Lewis R.S. 1993. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 90: 6295-9; 78. Putney J.W.Jr. 1999. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 96: 14669-71; 79. Nillius В., Droogmans G. 2001. Physiol. Rev. 81: 1415-59; 80. Putney J.W.Jr. et al. 2001. J. Cell Sci. 114: 2223-9; 81. Aimers W. et. al. 1984. J. Physiol. 353: 565-83; 82. Hess P., Tsien R.W. 1984. Nature. 309: 453-6; 83. Hermosura M.C. et al. 2002. J. Physiol. 539:445-58; 84. Hoth M., Penner R. 1993. J. Physiol. 465: 359-86; 85. Prakriya M., Lewis R.S. 2002. J. Gen. Physiol. 119: 487-507.

Список публикаций Казначеева E.B., Курышев Ю.А. (1990) Два типа хлорных каналов клеток А431. Цитология. 32(9): 933-934.

Курышев Ю.А., Казначеева Е.В. (1990) Катионные неселективные каналы клеток А431. Цитология. 32(9): 937.

Naumov А.Р., Kuryshev Yu.A„ Kaznacheyeva E.V., Mozhayeva G.N. (1992) ATP-activated Ca2+ -permeable channels in peritoneal macrophages. FEBS Lett. 313:285-287.

Naumov A.P., Kuryshev Yu.A., Kaznacheyeva E.V., Mozhayeva G.N. (1993) Ca2+-permeable channels in plasma membrane of rat macrophages. Biophys. J. 64(2): A-7.

Mozhayeva G.N., Naumov A.P., Mamín A.G., Kiselyov K.I., Kaznacheyeva E.V. (1994) The mechanism of regulation of ATP-activated Ca-permeable channels in rat macrophages. Effect of GTP and intracellular calcium. J. Physiol. (London) 481:29.

Naumov A.P., Kaznacheyeva E.V., Kiselyov K.I., Kuryshev Yu.A., Mamin A.G., Mozhayeva G.N. (1995) ATP-activated inward current and calcium-permeable channels in rat macrophages plasma membrane. J. Physiol. (London) 486: 323-337.

Naumov A.P., Kaznacheyeva E.V., Kuryshev Yu.A., Mozhayeva G.N. (1995) Selectivity of ATP-activated GTP-dependent Ca2+ -permeable channels in rat macrophage plasma membrane. J. Membr. Biol. 148: 91-95.

Naumov A.P., Kiselyov K.I., Mamin A.G., Kaznacheyeva E.V., Kuryshev YuA, Mozhayeva G.N. (1995) ATP-operated calcium-permeable channels activated via a guanine nucleotide-dependent mechanism in rat macrophages. J. Physiol. (London) 486: 339-347.

Казначеева E.B. (1996) Новый тип АТФ-активируемых Са2+-переносящих каналов в плазматической мембране перитонеальных макрофагов крысы. Автореферат диссертации на соискание ученой степени к.б.н.

Казначеева Е.В., Мамин А.Г., Киселев К.И., Можаева Г.Н., Наумов А.П, (1996) Новый тип АТР-активируемых кальциевых каналов в плазматической мембране макрофагов крысы. Биол. мембраны. 13: 162-177.

Kaznacheyeva E.V., Kiselyov K.I., Mamin A.G., Mozhayeva G.N. (1996) Ca2+-mobilizing agonists activate Caz+-selective channels in plasma membrane of A431 epidermal carcinoma cells. J. Physiol. (London) 497:120.

Kaznacheyeva E.V., Mamin A.G., Kiselyov K.I., Mozhayeva G.N., Naumov A.P. (1996) A new type of ATP-activated calcium channels in rat macrophages plasma membranes. Membr. Cell Biol. 10(2): 173-189.

Kaznacheyeva E.V., Lupu V.D., Bezprozvanny I. (1998) Functional expression of inositol (1,4,5)- trisphosphate receptor type I (INSP3R-I) in HEK293 cells. Biophys. J. 74: A337.

Kaznacheyeva E.V., Lupu V.D., Bezprozvanny I. (1998) Single-channel properties of inositol (1,4,5) - trisphsphate receptor heterologously expressed in HEK-293 cells. J. Gen. Physiol. 111:847-856.

Lupu V.D., Kaznacheyeva E.V., Bezprozvanny I. (1998) Functional interaction of PIPz with IP3R. Biophys. J. 7: A37.

Lupu V.D., Kaznacheyeva E.V., Krishna U.M., Falck J.R., Bezprozvanny I. (1998) Functional coupling of phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate to inositol 1,4,5-trisphosphate receptor. J. Biol. Chem. 273:14067-14070.

Zubov A., Kaznacheyeva E., Nikolaev A., Alexeenko V., Kiselyov K„ Muallem S., Mozhayeva G. (1999) Regulation of the miniature plasma membrane Ca2+channel fmin by inositol 1,4,5-trisphosphate receptors. J. Biol. Chem. 274: 25983-25985.

Алексеенко B.A., Зубов A.H., Казначеева E.B., Можаева Г.Н. (2000) Взаимодействие кальциевых каналов низкой проводимости с эндоплазматическим рецептором 1Р3. Конференция "Горизонты физико-химической биологии", Пущино, с. 6

Казначеева Е.В., Можаева Г.Н. (2000) Молекулярные механизмы регуляции кальциевого сигнала в невозбудимых клетках. Конференция «Клеточная биология на пороге XXI века», Цитология, с. 28.

Gusev К.О., Kaznacheyeva E.V., Zubov A.N., Mozhayeva G.N. (2000) Regulation of calcium channels WIcracl activity of human epidermal carcinoma A431 cells. Neurophysiology. 32:193-194.

Kaznacheyeva E., Zubov A., Nikolaev A., Alexeenko V., Bezprozvanny I., Mozhayeva G. (2000) Plasma membrane calcium channels in human carcinoma A431 cells are functionally coupled to lnsP3R-PIP2 complexes. J. Biol. Chem. 275: 4561-4564.

Казначеева E.B., Зубов A.H., Гусев K.O., Можаева Г.Н. (2001) Рецептор-управляемые кальциевые каналы в клетках карциномы: механизмы их активации как путем опустошения Са2+ депо, так и взаимодействием с рецептором инозитолтрифосфата; модуляция их активности фосфатидилинозитол-бифосфатом. XVIII Съезд физиологического общества им. И.П. Павлова, Казань, с. 106-107.

Kaznacheyeva Е., Zubov A., Gusev К., Bezprozvanny I., Mozhayeva G. (2001) Activation of Ca2+ entry in human carcinoma A431 cells by Ca2+ store depletion and phospholipase С - dependent mechanisms converges on Icrac -like channels. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 98:148-153.

Kaznacheyeva E., Zubov A., Gusev K., Bezprozvanny I., Mozhayeva G. (2001) Activation of Imin/lcRAc-like channels in human carcinoma A431 cells by store operated and phospholipase С - dependent mechanisms. Biophys. J. 80: A618.

Nikolaev A.V., Kaznacheyeva E.V., Mozhayeva G.N. (2001) Store-operated calcium channels In plasma membrane of HEK293 cells. Fourth Conference of the Czech Neuroscience Society, Prague, p. 26-27.

Гусев K.O., Алексеенко B.A., Казначеева E.B., Можаева Г.Н. (2002) Влияние перестроек актинового цитоскелета на активность депо-управляемых кальциевых каналов. Конференция «Биология - наука XXI века», Пущино т. 1, с. 10-11.

51

Казначеева Е.В., Зубов А.Н., Гусев К.О. .Можаева Г.Н. (2002) Фосфатидил-инозитол 4,5-бифосфат модулирует активность каналов рецептор-индуцированного кальциевого входа в клетках А431. Биол. мембраны. 19: 5-13.

Алексеенко В.А., Гусев К.О., Казначеева Е.В. (2003) Влияние перестроек актинового цитоскелета на активацию каналов кальциевого входа у клеток А431. Цитология. 45(2): 143-148.

Gusev К.О., Glouchankova L., Zubov A„ Kaznacheyeva E., Mozhayeva G.N. (2003) Store-operated calcium channels in A431 cells. "Receptors and cell signaling in oxidative stress", Budapest, p. 33.

Gusev K., Glouchankova L„ Zubov A., Kaznacheyeva E., Wang Z., Bezprozvanny I., Mozhayeva G. N. (2003) Store-operated calcium entry pathways in human carcinoma A431 cells: functional properties and activation mechanisms J. Gen. Physiol, (принято к печати).