Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Механизмы активации и регуляции инозитол (1,4,5) - трисфосфат - активируемых кальциевых каналов плазматической мембраны клеток А431

ВАК РФ 03.00.25, Гистология, цитология, клеточная биология

Автореферат диссертации по теме "Механизмы активации и регуляции инозитол (1,4,5) - трисфосфат - активируемых кальциевых каналов плазматической мембраны клеток А431"

I • т

РГЙ С-4

„ „ .4 Г; .'Л

(. { " На правах рукописи

КИСЕЛЕВ у-

Кирилл Игоревич V

МЕХАНИЗМЫ АКТИВАЦИИ И РЕГУЛЯЦИИ ИНОЗИТОЛ (1,4, 5)-ТРИСФОСФАТ-АКТИВИРУЕМЫХ КАЛЬЦИЕВЫХ КАНАЛОВ ПЛАЗМАТИЧЕСКОЙ МЕМБРАНЫ КЛЕТОК А431

03.00.25 Клеточная биология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических, наук

САНКТ-ПЕТЕРБУРГ 1997

Работа выполнена в Институте цитологии РАН, Санкт-Петербург

Научный руководитель:

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук,член-корреспондент РАН Г.Н.Можаева Институт цитологии РАН, Санкт-Петербург

доктор биологических наук И.И.Марахова, Институт цитологии РАН, Санкт-Петербург

доктор биологических наук, профессор Л.Г.Магазаннк Институт эволюционной физиологии и биохимии »М.Сеченова РАН, Санкт-Петербург

Ведущее учреждение:

С

Биолого-почвенный факультет, Санкт-Петербургский Государственный Университет

Защита состоится " ^ " нюня 1997 года в 13 ч. на заседании Диссертационного совета Д.002.73.01 Института цитологии РАН по адресу:

194064, Санкт-Петербург, Тихорецкий пр., д.4.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института цитологии РАН.

Реферат разослан " ^ " мая 1997 года.

Ученый секретарь Диссертационного совета

д.б.н.

(_^хог-а^^Л.Н.Писарева

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность темы.

Увеличение концентрации свободного цитоплазматического Са2+ -кальциевый сигнал - является важнейшим элементом ответа клетки на внешний стимул, запускающим основные- клеточные реакции, такие как деление, сокращение, секреция [Penner, 1988; Augustine, Neher, 1992]. Источником кальциевого сигнала является как выброс Ca1* из внутриклеточных хранилищ, так и его вход через плазматическую мембрану (ПМ). Вход Са2+ из внеклеточной среды обусловлен существованием в ПМ Са2+-проницаемых ионных каналов (ИК), открываемых либо при изменении потенциала на мембране, либо при связывании внешнего химического стимула с мембранным рецептором. В последнем случае, информация о связывании может передаваться с рецептора на ИК напрямую, либо через цепь событий, приводящих к образованию вторичных посредников.

Во многих невозбудимых клетках активация рецепторов, связанных с метаболизмом фосфатидилинозитола и образованием инозитол (1,4,5)-трисфосфата (1Рз), вызывает двухфазное увеличение концентрации свободного цитоплазматического кальция [Berridge, 1984]. Тот факт, что 1Р3 приводит к выбросу Са2+ из дело, хорошо документирован [Putney, 1987а], в то время, как природа механизма, контролирующего 1Рз-индуцированный вход Са2+, не ясна. Доступные данные обсуждаются в рамках двух гипотез: 1) инозитол (1,4,5)-трисфосфат прямо активирует Са2+ каналы в плазматической мембране ("1Рз модель"), или 2) вход Са2+ запускается неизвестным сигналом, генерируемым в ответ на опустошение внутриклеточных Са2+ депо ("емкостная модель" - "гипотеза опустошения") [Putney, 1990]. "1Рз модель" получила прямое подтверждение как в электрофизиологических [Kuno, Gardner, 1987; Mozhayeva, Naumov, Kurysliev, 1990; Vaca, Kunze, 1995; Kiselyov, Mamin, Semyonova, Mozhayeva, 1997], так и в биохимических [Khan, Steiner, Snyder, 1992a; Khan, Steiner, Klein, Schneider, Snyder, 1992b] исследованиях. Было показано, что инозитол (1,4,5)-трисфосфат-активируемые каналы в плазматической мембране селективны к двухвалентным катионам, не чувствительны к мембранному потенциалу и имеют проводимость 4-30 пСм. С другой стороны, существует целый ряд данных, что опустошение внутриклеточных Са2+ депо ингибиторами микросомальной АТР-азы, инозитол (1,4,5)-трисфосфатом, или инъекцией в клетку высоких концентраций CaJ+ буферов приводит к появлению Са2+ проводимости плазматической мембраны многих типов клеток [Hoth, Penner, 1993; Zweifach & Lewis, 1993; Premack, McDonald, Gardner, 1994; Vaca, Kunze, 1994; Oike, Gericke, Droogmans, Nilius, 1994; LuckhofT& Clapham, 1994] Этот факт рассматривается как прямое подтверждение "гипотезы опустошения". Ранее было показано существование в плазматической мембране клеток А431 рецепторов для таких агонистов, как эпидермальный

фактор'роста, уридинтрифосфат, брадикинин [Gonzalez, Gross, Heppel, Webb, 1988; Hepler, Nakahata, Lovenberg, DiGuiseppi, Herman, Earp, Harden, 1987]; активация этих рецепторов приводит к образованию инозитол (1,4,5)-трисфосфата и последующему повышению концентрации свободного внутриклеточного кальция. Этот факт делает клетки A43I удобным объектом для выяснения конкретного механизма входа Са2+ в клетку, опосредованного 1Рз.

Цели и задачи исследования.

Цель настоящей работы состояла в выяснении механизмов, обеспечивающих вход ионов Са2+ через плазматическую мембрану клеток А431 в процессе их активации агонистами, связанными с образованием инозитол (1,4,5)-грисфосфата, и в изучении регуляции этого входа.

Были поставлены следующие задачи:

1. Выяснить возможность прямой активации инозитол (1,4,5)-трисфосфатом входа кальция через Са2*-селективные каналы в плазматической мембране клеток А431.

2. Изучить механизмы регуляции и свойства этих каналов.

3. Определить физиологическую значимость 1Рз-индуцируемого входа кальция.

Научная новизна.

В результате проведенных исследований впервые показано существование в плазматической мембране клеток А431 высоко селективных Сан ханалов, непосредственно активируемых инозитол (1,4,5)-трисфосфатом. Изучены свойства и выявлен сложный механизм регуляции активности этих каналов мембранным потенциалом, уровнем свободного цитоплазматического кальция; показано вовлечение G-белка в регуляцию активности каналов.

Теоретическое и практическое значение работы.

Полученные в настоящей работе данные представляются важными для выяснения конкретного механизма входа ионов кальция в клетку при ее стимуляции агонистами, связанными с образованием инозитол (1,4,5)-трисфосфата. Установлено, что именно прямое действие 1Рз на Саг+-селективные каналы в плазматической мембране обеспечивает этот вход. Выявленный сложный и физиологически значимый механизм регуляция активности данных каналов существенно обогащает картину кальциевого сигнала и предлагает относиться с большей осторожностью к условиям наблюдения, обнаруживая сложную зависимость результатов от конкретных экспериментальных условий.

Апробация работы

Основные положения работы доложены и обсуждены на: Конференции Физиологического Общества Великобритании (Лидс, 1996), 41 Съезде Биофизического Общества США (Новый Орлеан, 1997), отчетной сессии Института Цитологии РАН (Санкт-Петербург, 1996) и на научных семинарах Лаборатории Ионных Каналов Клеточных Мембран Института цитологии РАН.

По материалам диссертации опубликовано 5 печатных работ. Объем и структура диссертации.

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложения экспериментальных данных, обсуждения результатов, выводов и списка литературы, содержащего публикаций. Работа изложена на страницах машинописного текста и иллюстрирована рисунками.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Клетки.

Клетки эгшдермондной карциномы человека A43I (Коллекция клеточных культур Института Цитологии РАН) культивировали во флаконах в среде Игла с добавлением 10% сыворотки крови крупного рогатого скота, инкубированной 10 мин. при 50°С в присутствии гентамицина (ЗОмг/мл). Для опытов клетки пересевали на покровные стекла (4x4мм), помещенные в пластиковые чашки. Обычно клетки использовали через 1-2 дня после пересева, т.е. когда еще не завершалось образование сплошного монослоя клеток.

Регистрация ионных токов и обработка данных.

В работе использовался метод локальной фиксации потенциала ("patch-clamp") в двух конфигурациях: в условиях подведения регистрирующей пипетки к мембране интактной клетки с последующим установлением гигаомного контакта и регистрации токов, протекающих через электрически изолированный таким образом фрагмент мембраны целой клетки - "cell-attached" конфигурация; второй метод -"inside-out" состоял в том, что после установления гигаомного контакта фрагмент мембраны изолировался физически, давая возможность производить смену раствора, омывающего цитоплазматическую сторону мембранного фрагмента [Hamill, Marty, Neher, Sakmann, Sigworth, 198II- Потенциал внеклеточного раствора принимался за нулевой. Микропипетки изготавливались из молибденового стекла, покрывались силгардом 184 и оплавлялись непосредственно перед экспериментом. Использовались пипетки, имеющие сопротивление от 4 до 12 МОм. Токи регистрировались при помощи "patch-clamp''-усилителя с сопротивлением обратной связи 10 ГОм, фильтровались 6-полюсным фильтром Бесселя с частотой среза 0.3 кГц и вводились в ЭВМ через аналого-цифровой преобразователь (частота считывания 1-2 кГц).

Последующая обработка результатов производилась при помощи пакета программ, позволяющих производить цифровую фильтрацию записеи, графическое представление токов, фиксирование событии с использованием критерия 50% порога амплитуды, определение амплитуд токов вероятностей открывания и кинетических параметров каналов. Активность каналов оценивалась по вероятности открытого состояния канала (NP„), Для количественной оценки степени активности каналов использовалась величина NP„, т.е. произведение количества проводящих единиц (N) в данном фрагменте записи на величину вероятности пребывания проводящей единицы в открытом состоянии 1о' которая определялась из следующего уравнения: Р0 = <I> / i, где <1> и i среднее значение тока через мембранных фрагмент на данном временном интервале и амплитуда тока открытого состояния соответственно.

Растворы

В начале опыта стекла с прикрепленными на них клетками помещали в экспериментальную камеру, заполненную контрольным наружным раствором следующего состава, мМ: 145 NaCl, 5 KCl, 20 HEPES/KOH, 2 CaCh, 1 MgCb, (pH 7.4). После достижения плотного контакта между поверхностью регистрирующей пипетки и мембраной, раствор в камере заменяли на аналогичный, в котором все ионы Na+ были заменены на К* для компенсации потенциала покоя клетки. В Оольшинстве экспериментов наружный раствор содержал, мМ: 105 10 ТРИС/НС1, присутствие ионов Ва2+ способствовало предотвращению активации Са^-зависимых и блокированию потенциал-зависимых калиевых каналов [Mozhayeva, Naumov К-uryshev, I989J. Использование Ва2* как носителя заряда призвано также было исключить возможную Са2+-зависимую инактивацию входящего тока [Striggow, Ehrlich, 1996]. В некоторых экспериментах в качестве проникающего катиона использовался 10-100 шМ Са2+ ^«-'"bn, раствор содержал, мМ: 140 KCl или К-глутамат, 1 NaCI, 10 HEPES/KOH, 1.13 СаСЬ. 2 EGTA, 1 MgCh, (pH 7.4, РСа 7). замена ионов С1- на глутамат не приводила к заметному изменению амплитуд токов. При определении Са^-зависимости каналов использовался внутриклеточный раствор с 10 мМ EGTA. Концентрации Ca3* рассчитывались на основании формул приведенных в статье Фабиато [Fabiato, Fabiato, 1979]. Инозитол U ,4,5)-трисфосфат, гуанозин-З'-О-тиотрифосфат, аденозин трифосфат, уридин трифосфат, гепарин, брадикинин (Sigma) хранились в замороженном виде; растворы приготавливались непосредственно перед экспериментом. Подача свежеприготовленного раствора производилась путем перфузии камеры 3-5-кратным объемом, что обеспечивало полную смену раствора менее чем за 300 мс.

РЕЗУЛЬТАТЫ

1Рз активирует Ся2+ каналы в изолированном мембранном фрагменте. Для выяснения возможности прямой активации Са2*-проводящих ионных каналов 1Рз проводились эксперименты с использованием метода patch-clamp в конфигурации insiderout. В этой конфигурации внеклеточная сторона изолированного фрагмента плазматической мембраны омывается раствором фиксированного состава, в то время как внутриклеточная его сторона доступна для подачи растворов переменного состава.

После изолирования мембранного фрагмента в подавляющем большинстве случаев не наблюдалось заметной активности каналов. Как показано на рис. 1, добавление во внутриклеточный раствор 2-15 мкМ 1Р3 приводило к появлению входящих токов (51 из 146 попыток). Раствор в пипетке содержал 105 мМ Ва2+ или 100 мМ Са2+ в качестве носителя заряда. Направление токов указывает на то, что ток переносится этими двухвалентными катионами. Можно видеть на рис. 1 н 2, что вызванные токи не постоянной амплитуды, но имеют несколько кратных подуровней. Данный феномен - присутствие нескольких подуровней проводимости ИК, достаточно хорошо описан в литературе [Fox, 1987]; с другой стороны, доступные в литературе методы математического описания подуровней проводимости применимы только для больших выборок и дают достоверные результаты в случаях большого числа событий. К сожалению, кратковременность активации данных ИК 1Рз не позволяла собирать достаточно большого для достоверного результата числа открываний, поэтому, описывая активность исследуемых ИК, мы вынуждены были

Контроль, 105 мМ Ва в пипетке, -70 м8 ,

10 мкМ IP3 -70 мВ

пА О -0.28

-90 MB М

ч»»^4*! I.....i ..............~.............. 0

"... . - VW^^V^^wM* JO

Рис. I. Приложение IPj к изолированному фрагменту ПМ клеток А431 приводит к активации Ва2* токов. При разных потенциалах представлены типичные записи токов, полученные в конфигурации inside-out, когда раствор в пипетке содержал Ва2+. Цифры справа означают амплитуды токов.

__LsejL

75

-70м В

< с

500 ч

6 250

-90м В

Рис. 2. 1Р3-активирумые Ва" токи имеют кратные подуровни. Представлены амлитудные гистограммы, полученные из фрагментов записей, представленных на рис. I. 1 истограммы были описаны суммой трех гауссовских распределений (гладкие линии), средние значения кот°Рь,х обозначены

вертикальными линиями и цифрами над ними.

основываться на визуальных наблюдениях - частота прямых двойных переходов между подуровнями довольно высока, что маловероятно в случае независимо работающих

каналов, н это дает основания полагать, что исследуемые ИК имеют два подуровня проводимости.

Проводимость канаттй Изучение свойств проводимости данных каналов выявило, что данные ИК одинаково хорошо проводят ионы Ва3+ и Са2+. Проводимости первого и второго подуровней составили 1-1 и 2 пСм (рис. 3). Экстраполированные потенциалы реверсии для этих катионов лежат около 75 мВ, когда раствор с внутриклеточной стороны мембранного

фрагмента содержал 140 мМ К+. Такое высокое положительное значение потенциала реверсии указывает на высокую

для селективность исследуемых ИК

Г/^ЛГожТГт? КаТИОНОВ- °Т,ЮШеШ,С проницаемостей РВа/Рк или пои испо^ вычислено, исходя из значения потенциала реверсии при использовании уравнения Гольдмана-Ходжкина-Каца [Hille 1992

Е„ =

RT 2F

Ш

^ва

тиц где Ава и Ак ' активности Ва2+ и К*. Коэффициенты активности принимались равными 0.75 для 145 мМ К-, 0.25105 мМ Ва' Гт

испопЛГ °бь,чнь,е значения. Полученные таким образом с

о™ошенИяаНпеМ экстРаполиРоваиных значений потенциала реверсии!

°ГТ "Р°ШШаеМ0СТеЙ можно в пеРвом приближении оценить

10 мМ :1' Пр" использовании В качестве носителя заряда

мМ Са?„оиНа7Гп Т0К0В бЫЛИ НИЖС' Н° ВП0ЛНе Рушимы - д»!НЮ ъ ^ при -/о мВ токпервого подуровня составлял -0.15 пА, для 10

^ о™ ТО, ЧТО исследуемые ИК

мМ Са2+ - -0.11

Физиологическим. Таким образом, можно с уверенностью говорить.

о

мВ -120 -100 -80 -60 -40 -20 0 20 40 60

1.1 «

2.0 п См

о « о

» о

-0.2

-0.3

-0.4

-0.5 "А

Рис. 3. 1Рз-активирумые ионные каналы в ПМ клеток А431 высоко селективны для двухвалентных катионов.

Вольт-амперные характеристики каналов, полученные при использовании Са2* (♦) и Ваг+ (О) в качестве носителей заряда. Ось абсцисс - МП, ось ординат - ток. Каждая точка - данные 3-15 экспериментов. Среднеквадратичное отклонение меньше размера символа.

что функционирование данного типа ИК физиологически значимо в ходе кальциевого ответа клетки на связывание агониста с рецептором. Определение точных значений среднего времени жизни открытого состояния ИК в разных условиях было в данной работе осложнено не только низкой амплитудой токов и невыгодным отношением сигнал/шум, но и присутствием нескольких подуровней проводимости одного ИК, а в большом числе опытов и наличием нескольких каналов в одном мембранном фрагменте. В обоих случаях имеет место наложение событий; если была открыта одна проводящая единица, и на этом фоне открывается вторая, то следующее закрывание не может

100 мМ Ва + в пипетке 10 мкм If з в растворе

'£ юо

ю

о

о

о и н

et о и

50

100 мМ Са в пипетке 10 мкм lf3 в растворе

100

6.12

время открытого состояния, мсек

100

0 время открытого100

состояния, мсек

1Рз-

Рис. 4. Распределения времен открытых состояний акгнвирумых Са'4 каналов в ПМ клеток А43).. Представлены типичные распределения времен открытых состояний первого подуровня проводимости канала, полученные в конфигурации inside-out с Ba2t и Са2* в пипетке. Гистограммы были описаны экспоненциальными распределениями; средние времена (в мсек) обозначены на рисунках. МП равен -70 мВ.

0

быть приписано однозначно ни первой, ни второй. В этом случае определение точного времени жизни открытого состояния ИК существенно затруднено; с другой стороны, кажется вполне обоснованным использовать средние времена жизни, например^ первого подуровня проводимости для сравнения кинетических характеристик ИК в разных экспериментальных условиях. На рис. 4 приведены типичные распределения времен открытого состояния первого проводящего подуровня канала в присутствии 105 мм Ва2+ и 100 мМ Са-+ в качестве основного носителя заряда. Средние значения, вычисленные из 5 и 4 опытов соответственно, оказались близкими для этих двух катионов - 6.35±0.65 и 6.12±0.82 мсек.

Зависимость активности каналов от концентрации 1Рз. Мерой активности ИК принято считать вероятность его открытого состояния (NPo), т.е. отношение времени, проведенного каналом в открытом состоянии к времени регистрации. В представленном случае факт активации Са2+-переносящих ИК ПМ клеток А431 инозитол (1,4,5)-трисфосфатом выражался в увеличении NP0 от 0.06±0.02 в контроле (9 измерений) до, например, 0.61+0.19 после приложения 5 мкМ 1Р3 (15 измерений). Удаление 1Рз из раствора приводило к исчезновению активности ИК (5 опытов). Это указывает на то, что 1Рз специфически активирует Са2+ каналы ПМ клеток А431. Активность ИК наблюдалась также при приложении субмикромолярных концентраций IPs (0.2 мкМ, 5 опытов). В трех экспериментах, когда эта концентрация не имела эффекта, последующее применение более высоких концентраций 1Рз приводило к активации каналов.

Времена между приложением 1Рз и появлением активности ИК измерялись секундами, так, в среднем, открывания ИК могли быть наблюдаемы спустя 20.77±6.61 сек. (13 измерений) после приложения 5 мкм 1Р3, и спустя 21.6019.46 сек. (5 измерений) после приложения 0.2 мкм 1Рз. Таким образом, изменение концентрации IPj более, чем на порядок не вызывало заметного увеличения латентного периода развития активности. Это означает, что скорее диффузия 1Рз к мембранному фрагменту, чем связывание 1Рз с рецептором, или наработка какого-либо промежуточного активатора каналов, является лимитирущей стадией процесса активации каналов в данных условиях. Кроме того, данные времена близки ко временам диффузии веществ к изолированному мембранному фрагменту в конфигурации inside-out метода patch clamp. Сходные величины латентных периодов развития IРз-индуцированной активности Са2+ каналов ПМ описаны в литературе, касающейся исследования свойств 1Рз-активируемых Са2+ каналов ПМ в изолированных мембранных фрагментах.

NP„

5 мкМ 1P3

Специфической чертой

поведения данных ИК является кратковременность,

характер их на рис 5 можно при постоянном IPj в растворе,

сек

о

Рис. 5. Изменение во времени вероятности открытого состояния канала после приложения 5 мкМ 1Рд.

Представлено развитие активности, индуцированной приложением 5 мкМ 1Р3 в эксперименте со 100 мМ Саг+ в качестве носителя тока.

преходящии активации -видеть, что присутствии омывающем цито плазматическую поверхность изолированного мембранного фрагмента,

активность каналов исчезает в течение нескольких десятков (сотен) секунд после приложения 1Рз- Это заставляет предположить существование механизмов, обуслав-ливающих инактивацию данных ИК, показанную ранее как для рецептора 1Рз плазматических мембран, так и для и, возможно, участвующих в ответа клетки, по крайней

эндосомального рецептора 1Рз регулировании длительности кальциевого мере,той его компоненты,которая обеспечена входом ионов Са-+ через плазматическую мембрану. С другой стороны, инактивация ИК в изолированном мембранном фрагменте, потерявшем физиологическую целостность с цитоплазмой, может происходить из-за потери водорастворимых факторов, участвующих в поддержании активности каналов. Очевидно, что только детальное изучение механизмов регуляции 1Рз-активируемых Са2+ каналов ПМ может дать точное указание на конкретные причины кратковременности их работы в изолированном мембранном фрагменте. В большом количестве опытов инактивация каналов не была ярко выражена и после того, как активность каналов была вызвана приложением 1Рз и достигала относительно стационарного уровня, мы могли производить множественные смены растворов и изменения мембранного потенциала, чтобы глубже исследовать механизмы регуляции активности данных каналов. На рис. 6 можно видеть, что кривая изменения NP0 от концентрации 1Рз ([1Рз]) имеет тенденцию к насыщению при [1Рз] выше 2 мкМ. Данные были описаны уравнением

Хилла: N РГ

NP„ = —ILD!-

[I PJ" + k"

где k - кажущаяся константа связывания, n - коэффициент Хилла. Значение константы связывания было найдено равным 0.18 мкМ, а коэффициент Хилла - близким к 1. Последнее значение указывает на

отсутствие кооперативное™ при связывании 1Р3, т.е. только одна молекула 1Рз нужна, чтобы открыть канал.

Значения NP„ составляли 0.33±0.06 для 0.2 мкМ 1Р3 (7 измерений) и 0.59±0.25 (7 измерений) для 10 мкМ 1Рз, когда раствор в пипетке содержал 105 мМ Ва2+. Когда пипетка содержала 100 мМ Са2+, соответствующие значения были ниже, возможно благодаря отрицательной регуляции активности канала концентрацией внутриклеточного Са2+. Так, NP„ каналов, активируемых 5 мкМ 1Рз, составила 0.42±0.20 (4 измерения) с Са-+ в пипетке, и 0.57±0 19 (14 измерений) для Ва2+.

NPC

1.5-,

1.0

0.5 п

П-

--D

0.2 2 5 10

1Р3 (мкМ)

105 мМВа, -90 мВ

контрольный раствор

»■».»».Щипачи, lim» f<** —.......

пА

0.2 мкМ 1Р3

?0.34

2мкМ1Р,

5 мкМ IPj

IOmkMIP,

-0.34

1 сек

Рис. 6. Зависимость активности 1Рз-чувствительных Са2+ каналов от концентрации 1Р3.

Каждая точка соответствует данным 3-6 экспериментов полученных в конфигурации inside-out с Ва" в пипетке. МП = -90...-70 мВ. В каждом эксперименте сравнивались значения вероятности полученные при разных концентрациях IPj; максимальное значение принималось за 1. Гладкая линия соответствует уравнению Хилла.

1Рз-активируемме Ca2* каналы блокируются гепарином Важным способом идентификации 1Рз-чувствительных Са2+ ИК является определение их чувствительности к гепарину - селективному ингибитору 1Р3-активируемых каналов [Ross, Meldolesi, Milner, Satoh Supattapone, Snyder, 1989; Somlyo, Walker, Goldman, Trentham' Kobayashi, Kitazawa, Somlyo, 1988; Ehrlich, Watras, 1988]. На рис. 7 можно видеть, что добавление гепарина к раствору, содержащему 1Р3 приводит к исчезновению активности каналов. Записи токов,

иллюстрирующие эффект гепарина приведены на рис 7. Этот эффект развивался в течение нескольких секунд, и способность гепарина „ингибировать активность зависела от его дозы. Так добавление 100 мкг/мл высокомолекулярного гепарина к раствору, содержащему 5 мкМ 1Рз привело к полному блоку активности только в 3 опытах из 9; в то время, как увеличение концентрации гепарина до 500 мкг/мл имело следствием 100% эффект (5 опытов из 5). Специфическое ингиби-рование активности 1Рз-чувствительных Са2+ каналов в ПМ клеток А431 гепарином позволяет определенно иденти фицировать данные ИК как 1Рз-зависимые.

Вероятность открытого состояния 1Рз-активируемых Са2* каналов зависит от мембранного потенциала.

Интересной и функционально важной особенностью 1Рз-активируемых Са2+ каналов ПМ, представленных в данной работе, отличающей их от других каналов этого типа, является сильная зависимость их активности от потенциала на мембране. На рис. 8 можно видеть, что вероятность открытого состояния исследуемых ИК существенно падает при деполяризации мембраны. Активность была редко наблюдаема при МП близких к 0 мВ; полное восстановление активности в ответ на гиперполяризацию не наблюдалось, если пэтч был достаточно долгое время деполяризован до МП близких к 0 мВ. Кроме того, способность [Рз вызывать активность ИК существенно снижалась, если он был приложен при небольших отрицательных МП (-30... 0 мВ).

Очень важным кажется тот факт, что зона максимальной чувствительности активности ИК к МП покрывает потенциал покоя и диапазон изменений МП во время гиперполяризации, вызываемой агонистами при физиологических условиях [Рап&еПа, Ма|£Ц, ЬоУ13о!о, МеИо1е$1, 1989]. Это показывает, что выявленная потенциал-зависимость активности 1Рз-зависимых Са2+ каналов ПМ клеток А431 является физиологически значимым регулятором их активности, реализующимся при изменениях мембранного потенциала, сопутствующих, например, активации Са2+-зависимых К* каналов, обнаруженных в клетках А431.

Контроль, 100 мМ Са в пипетке, -90 мВ 5 мкМ (Р3

5 мкМ 1Р3 +100 мкг/мл гепарина

1 сек

Рис. 1. Гепарин ингибирует активность 1Рз-зависимых Са2+ каналов. Представлен типичный inside-out эксперимент, направленный на выяснение действия гепарина на 1Р3-чувствительные Саг* каналы. Раствор в пипетке содержал 100 мМ Саг*. МП= s-70 мВ.

NP

1.5-,

1.0-

0.5-

Э-.

о

§

N

I05 мМ Ва в пипетке, 5 мкМ 1Р3 -90 мВ пА

^mm^pv^i 34

-70 мВ

°0.28

-50 мВ

WWtff^ iL

О

-30 мВ

I сек

0.24

- « I I-1-1-1

-150-120 -90 -60 -30 0

мВ

Рис. 8. Активность 1Рз-чувствительных Саг+ мембранного потенциала. Зависимость вероятности открытого состояния канала от МП каждая точка соответствует данным 3-6 экспериментов, полученных в конфигурации ¡™с!е-ои1 с Ва* в пипетке. Каналы активировались ¿-о мкМ 1Р3. в каждом эксперименте значение полученное при МП = -90 мВ, принималось за

каналов зависит от

вероятности,

ЗШ1Симость. активности ГРз-чувствителышх Гп2* каналов от £аыЦ£ШЕащ,и свободного внутриклеточного кальция. Одним из наиболее интересных наблюдений настоящей работы кажется сложная природа зависимости активности 1Рз-активируемых „„ каналов ПМ клеток A43I от концентрации свободного внутриклеточного Ca** <[Са^],). Из рис. 9 можно сделать вывод, что J.-зависимость активности каналов имеет колоколообразную форму; ассиметричность отличает ее от холоколообразной [Са^Ь-зависимости, показанной дня IP3R из эндоплазматического регикулума [Bezprozvanny, Ehrlich, 1991]. Кроме того, данный тип [СаЦ-зависимости не может быть объяснен в рамках простого монотонного ингиоирования активности каналов внутриклеточным Са^ показанного дая АТР-активируемых Са^ каналов ПМ макрофагов крысы [Mamin, Kiselyoy, Mozhayeva, 1996]. Простейшая модель которая, по-видимому, может объяснить такую форму [Са^],-зависимости может вовлекать 2 процесса: один подразумевает модуляцию связывания 1Р3 внутриклеточным Са^, другой - прямое ;,„',™ие Са"+ на проводящую часть канала. Это предположение иллюстрировано на рис. 9 - кривая, близкая к данным, получена из комоинации двух: монотонного блока проводимости и монотонного же улучшения связывания IP, при увеличении концентрации свооодного цитоплазматического Са2\ Кривая соответствует

уравнению: nNP0 =

Р х [Ca2+]i х К*

где nNPo

{[Са2+]х + Кп) х ¡[Са2+}1 + I/)' нормализованная вероятность открытого состояния, Р - коэффициент нормализация, К и Ь - кажущиеся константы связывания для центров активации и инактивации, п и ш - коэффициенты Хидла. Кажущаяся константа связывания для центра (центров), управляющего [Са2+]г зависимостыо связывания 1Рз, равна 0.25 мкМ, для Са2+-блока проводимости - 0.01 мкМ. Коэффициент Хилла, близкий к трем (2.7) для [Са2+|,-зависимости связывания 1Рз, указывает на то, что для того, чтобы Са2+ мог проявить себя как коагонист 1Рз, три иона должны связаться с рецептором 1Рз или с другим белком, опосредующим действие внутриклеточного Са2+. Для Са2+ блока проводимости значение коэффициента Хилла было найдено меньшим 1 (0.43).

NPC 1.0-1

0.5-

0

О

105 мМ Ва в пипетке, -90 мВ, 5 мкМ 1Р3

рСа 9 ^

•W" о

Mb

рСа 8

-0.34

чо

'M^^^^V^VW1^ -034 рСаб

n^iwyv^r/iy??^^ .0.34

сек

9 8 7 6 рСа

Рис. 9. Зависимость вероятности открытого состояния 1Рз-активирумых С а2' каналов от концентрации свободного внутриклеточного Са2\

Каждая точка соответствует данным 3-6 экспериментов, полученных в конфигурации inside-out с Ва2* в пипетке. [Ca2*]i поддерживалась 10 мМ EGTA. МП=-90...-70 мВ. В каждом эксперименте сравнивались значения вероятности, полученные при разных [Са2+],; значение вероятности, полученное при рСа 7, принималось за 1.

Каналы того же типа активируются в клетке при действии агонистов. вызывающих образование 1Рз-

Для выяснения физиологической значимости эффекта активации Са2+-проводящих каналов ПМ инозитол (1,4,5)-трисфосфатом, обнаруженного в модельной системе, необходимо выяснить, те ли же ИК активируются в нативной клетке при действии агонистов, связанных с продукцией 1Рз. Для этого эксперименты с использованием уридинтрифосфата (UTP) и брадикинина (ВК) были проведены в конфигурации cell-attached. Эта конфигурация позволяет проводить регистрацию токов через электрически изолированный мембранный фрагмент, сохраняя.тем не менее, клетку нативной. Состав раствора, омывающего внеклеточную сторону изолированного фрагмента мембраны, фиксирован, в то время, как остальная поверхность клетки остается доступной для подачи агонистов. Таким образом возможно регистрировать изменения мембранной проводимости, сопровождающие объективно значимые, с точки' зрения физиологической целостности, ответы клетки на внешние стимулы. На рис. 10 можно видеть, что добавление 100 мкМ UTP в раствор,

А

Cell-Attached_j__Inside-Out__

Контроль [ IOOmkMUTP I Контроль | 10 мкМ IP] | Отмыв

о. . 2

Ш

i il

MB -120 -90 -60 -30 0 30

й *

1.1 »

.Л"'

-0.2 •03 -0.4

Рис. 10, Агонисты, связанные с образованием IPj активируют каналы того же типа.

А, Изменение во времени вероятности открытого состояния канала. Раствор в пипетке содержал 105 мМ Ваг+. МП =-50 мВ. Внизу - 2 сек. записи токов.

ПА L -0.5

Б. Вольт-амперные характеристики 1Рз-активирумых ионных каналов в ПМ клеток А431, полученные в конфигурациях cell-attached при приложении 100 мкМ UTP(A) и inside-out (15 мкМ 1Рз, □) с Ваи в пипетке. Ось абсцисс - МП, ось ординат - ток. Данные 3-15 экспериментов.

.5

2.0

омывающий клетку, приводит к появлению Ва2+ токов. Это означает, что такой способ стимуляции приводит к образованию водорастворимого посредника, который, диффундируя под мембранный фрагмент, связывается с рецептором, находящемся в нем, и активирует ИК. Значения NPo для каналов вызванных 100 мкМ UTP, и 12 мкМ ВК составили, соответственно, 0.99+0.08 (17 измерений) и 0.71±0.11 (8 измерений). Изоляция мембранного фрагмента -погружение его цитоплазматической стороны в раствор, не связанный с цитоплазмой, приводит к исчезновению активности ИК. Это является еще одним доказательством предположения о водорастворимом посреднике, отмывающемся при таких условиях. Добавление 1Рз в раствор, омывающий цитоплазматическую сторону мембранного фрагмента, приводит к появлению токов с характеристиками, идентичными вызванным UTP. Сопоставление вольт-амперных характеристик ИК, активируемых в нативной клетке и в изолированном мембранном фрагменте (рис. 10 Б) однозначно указывает на их идентичность. Таким образом, прямая активация Са2+-лроводящих каналов ПМ инозитол (1,4,5)-трисфосфатом является именно тем механизмом, который реализует в живой клетке агонист-индуцируемый вход кальция из внеклеточной среды.

В работу канала вовлечен G-белок; каналы не чувствительны к внутриклеточному АТР.

Приведенные выше значения вероятности открытого состояния каналов, активируемых приложением Саг+-мобилизующих агонистов к мембране нативной клетки, значительно выше, чем достигаемые при действии IPs на изолированный мембранный фрагмент. Такое наблюдение не может быть объяснено большим накоплением 1Рз в условиях целой клетки, так как приведенная выше зависимость NPo от [JPjJ достигает плато при 5 мкМ 1Рз. Выраженный пик [Ca-+j,-зависимости активности ИК при рСа 7, а именно при этом значении [Са2+], проводилась большая часть экспериментов на изолированных мембранных фрагментах, не позволяет приписать высокий уровень активности ИК в нативной клетке их [Са^-зависимости. Данные аргументы заставляют предположить вовлечение некоторых дополнительных механизмов в процесс поддержания и регуляции активности данных каналов; вероятно, эти механизмы не реализуются в изолированном мембранном фрагменте при приложении только 1Рз. Кроме падения вероятности открытого состояния, потеря этих дополнительных звеньев вероятно обусловливает и инактивацию каналов в изолированных мембранных фрагментах. Возможным кандидатом на роль искомого регуляторного звена является G-белок, который, как было показано недавно на 1Рз-рецепторе эндоплазматического ретикулума клеток поджелудочной железы, активирует 1Рз-зависимый выброс Са2+ из внутриклеточных депо [Хи, Zeng, Muallem, 1996]. Для выяснения возможности вовлечения в работу канала GTP-зависимого механизма использовался как GTP, так и его

А

Б

ЮОмкМСТРчЗ |_¡5мкМ1Р, ! 100ыкМ ОТР-у5

1Р3 + ОТРуБ |_Огаыв

Рис. 11. В активацию 1Рз-чувствительных Са2+ каналов вовлечен в-белок. I

Представлен типичный ¡г^ск-оиЛ эксперимент, направленный на выяснение вовлечения ОТР-зависимого звена в активацию 1Рз-чувствительных Са5* каналов. Раствор в пипетке содержал 100 мМ Са2\ Панели А, Б и В - последовательные части одной 320 сек. записи. Тонкие вертикальные линии связаны с изменениями потенциала; толстые - артефакты подачи растворов. Вставки: внизу слева - 2 сек. записи токов; внизу справа - амплитудные гистограммы, полученные из соответствующих фрагментов записей. Горизонтальные линии обозначают подуровни проводимости. Цифры справа - амплитуды токов.

негидролизуемыи аналог - GTPyS. На рис. 11 можно видеть, что сам по себе GTPyS не активирует данные И К, в то время как поданный в смеси с 1Р3 существенно увеличивает вероятность открытого состояния канала. Так, значения NP0 составили в среднем 0.57±0.19 (14 измерений) для 5 мкМ 1Рз и 0.82+0.13 (3 измерения), когда 100 мкМ GTPyS был подан в смеси с 5 мкМ 1Рз.

Кроме того, на рисунке можно видеть, что GTPyS подчеркивает способность канала открываться на двойные подуровни. Таким образом, можно предположить, что GTPyS имеет два способа действия: один подразумевает опосредованное

GTPyS увеличение сродства рецептора к 1Р3, другой - модификацию воротных свойств канала.

Приложение АТР в концентрациях 0.1-1 мМ не имело влияния на активность 1Рз-активируемых Са2+ каналов ПМ клеток А431 (7 опытов).

Данные представленные выше указывают, что прямое действие 1Рз на Са2+ каналы плазматической мембраны ответственно, хотя бы частично, за рецептор-управляемый вход CaJ+, связанный с наработкой 1Рз.

Активация 1Рз-чувствительных Ca2f каналов не является результатом опустошения примембранных органелл.

Сильное возражение против предложенной модели прямой активации Са2+-проводящих каналов ПМ инозитол (1,4,5)-трисфосфатом может происходить из результатов электронномикроскопических исследований структуры изолированного мембранного фрагмента. Показано [Ruchnudin, Song, Sachs, 1991], что пэтч не может быть представлен простым бислоем, но некоторое количество органнел, возможно содержащих запасенный Са2+, может быть связано с ним после удаления фрагмента. Таким образом, полученный эффект активации ИК может быть объяснен в рамках емкостной модели непрямым действием 1Рз - приложение 1Рз может приводить к опустошению примембранных органелл, что таким образом повторяет условия, применяемые на целой клетке при регистрации токов, активируемых опустошением Са2+ депо. Однако, кажется маловероятным, что органеллы, тесно прилежащие к мембране будут изолироваться вместе с пэтчем достаточно часто; кроме того, анализ экспериментальных условий, использованных в настоящей работе, однозначно отвергает это предположение:

1. Водорастворимый посредник [Randriamampita, Tsien, 1993] не должен работать из-за его разбавления - объем раствора, в который погружен мембранный фрагмент, на несколько порядков превосходит объем клетки.

2. Даже если предположить, что путь посредника от Са2+ депо к ИК строго изолирован от внешней среды, или, что механическая связь передает состояние Са2+ депо ионному каналу, можно ожидать, что простое выдерживание пэтча в растворе, свободном от АТР, в

котором [Ca2+]i поддерживается на низком уровне, должно имитировать эффект ингибиторов микросомальной АТР-азы и индуцировать опустошение депо - развитие активности ИК. В нашем случае не наблюдалось развитие активности даже при 10 мин. выдержке мембранного фрагмента в таких условиях. Кроме того, выдерживание пэтча в растворе, в котором [Ca2+]i поддерживается на низком уровне (рСа 8) 10 мМ EGTA, не предотвращало способность 1Рз вызывать активность Са2+ каналов (7 наблюдений).

3. Отмыв IPj или подача гепарина приводила к исчезновению активности. Это не могло бы случиться в случае сигнала, вызываемого опустошением Са2+ депо - даже если опустошение было начато при действии 1Рз, заполнение депо не может начаться после удаления 1Рз или подачи блокатора ИК, т.к. [Ca2+]i поддерживается на низком уровне и в растворе отсутствуют доноры энергии для микросомальной АТР-азы. При этих условиях вход Са2+, если он происходит из-за опустошения депо, должен продолжаться и после удаления 1Рз из раствора.

4. Показано, что NP0 1Рз-активируемых Са2+ каналов из эндоплазматического ретикулума существенно увеличивается при добавлении АТР во внутриклеточную среду. Это должно означать, что опустошение Са2+ депо, и, следовательно NP0 представленных Са2+ ИК ПМ должна увеличиваться, если данные ИК активируются опустошением депо. В нашем случае это не так - NP0 не изменялась при добавлении АТР.

5. Наконец, важно, что многократное повторное добавление 1Рз после его отмыва также приводило к активации Са2+ ИК ПМ. Маловероятно, что объем Са2+ депо, втянутых вместе с мембраной в пипетку так велик, что сверхмаксимальная концентрация 1Рз не опустошает их полностью.

Таким образом, 1Рз-иидуцируемый ток Саг+ через изолированный мембранный фрагмент трудно представить как результат опустошения Саг+ депо - он несомненно является следствием прямого действия 1Рэ на Са2+-проннцаемые ионные каналы, существующие в плазматической мембране клеток А431.

выводы

1. Плазматическая мембрана клеток Л431 содержит высокоселективные Са2+ каналы низкой проводимости, активируемые инозитол (1,4,5)-грисфосфатом.

2. Данные каналы работают и в нативной клетке, обеспечивая, по крайней мере частично, рецептор-управляёмый вход Са2+, связанный с наработкой 1Рз.

3. Активность каналов находится под контролем мембранного потенциала и концентрации1 свободного внутриклеточного Са2+; в работу каналов вовлечен GTP-зависимый механизм.

4. Явное отличие свойств данного 1Рз рецептора/канала, как по проводимости, так и по фармакологическим характеристикам, от эндоплазматического рецептора 1Рз, заставляет предположить существование нового типа Са2+ канала/рецептора 1Рз, экспрессируемого в плазматической мембране клеток A43I.

ПУБЛИКАЦИИ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. KI Kiselyov, AG Mamin, SB Semyonova & GN Mozhayeva (1997) Low conductance high selective inositol (1,4,5)-trisphosphate-activated Ca2+ channels in plasma membrane of A431 carcinoma cells. FEBS Letters, 407, 309-312

2. КИ Киселев, АГ Мамин, СБ Семенова и ГН Можаева (1997) Новый тип 1Рз-чувствительных высокоселективных кальциевых каналов низкой проводимости в плазматической мембране клеток карциномы А431. Цитология,

3. KI Kiselyov, AG Mamin, GN Mozhayeva (1996) IP3-activated CaJ+-selective channels in plasma membrane of A431 cells and mouse macrophages. Journal of Physiology (London) 497, 139P

4. EV Kaznacheyeva, KI Kiselyov, AG Mamin, GN Mozhayeva (1996) Ca2+-mobylising agonists activate Ca2+-selective channels in the plasma membrane of A431 cells. Journal of Physiology (London) 497, 142P.

5. KI Kiselyov, AG Mamin, SB Semyonova & GN Mozhayeva (1997) 1Рз-activated Ca2+-selective channels from plasma membrane of human carcinoma A431 cells. Biophysical Journal, 72, 279A