Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Механизмы регуляции функциональной активности рецептора инозитол-1,4,5-трисфосфата эндоплазматического ретикулума

ВАК РФ 03.00.25, Гистология, цитология, клеточная биология

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Глушанкова, Любовь Николаевна

СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1 Роль инозитол (1,4,5)-трисфосфата(1пзРз) в передаче внутриклеточного сигнала.

1.2 Структура и функции рецептора InsP

1.2.1 Локализация и типы рецептора InsP

1.2.2 Молекулярная структура InsPjR

1.2.3 Функциональные свойства InsP3R

1.2.4 Факторы, влияющие на активацию InsP3R.

1.3 Рианодиновый рецептор

1.4 СаМ- кальций- зависимый белок

1.4.1 Структура и функции СаМ

1.4.2 Действие СаМ на вход Са2+через потенциал -зависимые Са2+- каналы

1.4.3 Действие СаМ на выход Са2+ через рианодиновые peцeптopы(RyRs)

1.4.4 Действие СаМ на InsP3 -индуцированный вход кальция

1.5 Депо-управляемый вход кальция в клетку.

1.6 Каналы, активируемые выбросом кальция: CRAC.

1.7 Каналы семейства TRP.

1.8 Гипотезы о механизме регуляции депо-зависимых кальциевых каналов.

1.9 Конформационное сопряжение.

1.10 Низкопроводящие кальциевые каналы Imin

1.11 Регистрация внутриклеточной концентрации кальция с помощью флуоресцентных зондов.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

2.1 Клетки

2.2 Материалы

2.3 Получение рекомбинантных бакуловирусов.

2.4 Регистрация ионных токов и обработка экспериментальных данные

2.5 Экспрессия и очистка рекомбинантного белка InsP3R-N-His

2.6 Анализ связывания с [3H]InsP

2.7 Анализ связывания с [125I] ShPIP

2.8 Эксперименты на бислойной липидной мембране

2.9 Регистрация внутриклеточной концентрации кальция 48 РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

3.1 Специфическое связывание InsP3R с InsP3/ аденофостином A (AdА), а также антагонистом

InsP3R - водорастворимым Р1Р2.

3.2 Роль лиганд-связывающего домена InsP3R в регуляции активности Imin каналов.

3.3 Роль высоко-аффинного кальций-зависимого сайта связывания с СаМ в регуляторном домене InsP3R.

3.3.1 Мутация W1577A в InsP3R крысы отменяет кальций-зависимое взаимодействие с СаМ.

3.3.2 Модулирование активности рекомбинантного

InsP3R цитозольным кальцием.

3.3.3 Роль кальмодулина в модулировании активности рекомбинантного InsP3R цитозольным кальцием.

3.3.4 Ингибирование InsP3R кальмодулином. 70 ВЫВОДЫ 72 Благодарности 73 СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ

ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Введение Диссертация по биологии, на тему "Механизмы регуляции функциональной активности рецептора инозитол-1,4,5-трисфосфата эндоплазматического ретикулума"

Общая характеристика работы.

Актуальность проблемы.

Кальций является одним из универсальных регуляторов многочисленных процессов, происходящих в клетке таких, как: секреция, сокращение, пролиферация и генная регуляция. Передача физиологически важных сигналов от рецепторов плазматической мембраны к внутриклеточным структурам осуществляется путём повышения концентрации свободных ионов кальция в цитоплазме ([Ca2+]i). В невозбудимых клетках рецептор-индуцированные изменения [Са2+], обычно включают две составляющие: быстрое, кратковременное высвобождение Са2+ из Са2+-депо (представленных эндоплазматическим ретикулумом (ЭР) или его субкомпартментами) и последующий медленный, но продолжительный вход Са2+ из внеклеточной среды. ^ Рецепторы, сопряженные с G-белками или тирозиновыми киназами, активируют фосфолипазу С (PLC). Активированная PLC гидролизует мембраносвязанный фосфолипид - фосфатидилинозитол-4,5-бисфосфат (Р1Р2), в результате чего образуется водорастворимый инозитол-1,4,5-трисфосфат (InsP3) и диацилглицерин (DAG). Связывание InsP3 с рецептором инозитол-1,4,5-трисфосфата (InsP3R), являющимся катионным каналом эндоплазматического ретикулума, приводит к высвобождению Са2+ из внутриклеточных депо. Хотя механизм выброса Са2+ из внутриклеточных депо достаточно хорошо изучен, механизмы, регулирующие связывание InsP3 с рецептором, а также молекулярная организация данного комплекса продолжают вызывать интерес.

Важнейшим свойством InsP3R является бифазная регуляция его активности цитозольным кальцием [Bezprozvanny et al., 1991]. Именно ^ это свойство рецептора определяет пространственно-временной ход кальциевой волны в клетке. Считается, что одним из способов данной регуляции является взаимодействие InsP3R с кальций-связывающим белком кальмодулином через высоко-аффинный кальций-зависимый сайт расположенный в регуляторном домене InsP3R [Michikawa et al., 1999].

В результате опустошения Са2+-депо (понижения концентрации свободных ионов Са2+ в депо) активируются депо-управляемые катионные (SOC) каналы, обеспечивающие вход Са2+ в клетку. Благодаря входу Са2+ его концентрация в цитоплазме поддерживается длительное время (вплоть до нескольких десятков минут) на высоком уровне, что приводит к запуску Са2+-зависимых сигнальных каскадов, а также к восстановлению запасов Са2+ в депо [Parekh, Реппег, 1997; Putney, Bird, 1993].

Одна из основных моделей активации SOC-каналов подразумевает белок-белковое взаимодействие между InsP3R эндоплазматического ретикулума и SOC-каналами плазматической мембраны [Parekh, Реппег, 1997; Berridge, 1995; Putney et at., 2002]. Однако до конца остается неясным, каким образом сигнал о понижении концентрации Са2+ в депо передается к каналам плазматической мембраны.

Изучение механизмов кальциевой сигнализации в невозбудимых клетках требует детального исследования функциональных и биофизических свойств, как самого InsPsR, так и каналов, регуляция активности которых связана с InsP3R.

Цели и задачи исследования.

Цель настоящей работы заключалась в исследовании особенностей отдельных этапов передачи кальциевого сигнала в клетке через рецептор инозитол-1,4,5-трисфосфата (Insp3R) мембраны эндоплазматического ретикулума. Для достижения данной цели были поставлены следующие задачи:

1. Провести сравнительный анализ специфичности связывания InsP3R с природным агонистом инозитол-1,4,5-трисфосфатом (InsP3), с синтетическим агонистом - аденофостином A (AdA), а также с антагонистом InsP3R - фосфотидилинозитол-4,5-бисфосфатом (Р1Р2).

2. Определить конкурентоспособность связывания InsP3R с агонистами InsP3 и AdA и с его антагонистом Р1Р2.

3. Определить возможность активации кальциевых каналов плазматической мембраны при их взаимодействии с лигандсвязывающим доменом InsP3R.

4. Определить роль высоко-аффинного кальций-зависимого сайта связывания с кальмодулином (СаМ) регуляторного домена InsP3R в модуляции активности InsP3R.

Основные положения, выносимые на защиту.

1. Сайты связывания InsP3R с AdA и с Р1Рг, также, как и с InsP3 находятся в лигандсвязывающем домене InsP3R.

2. Активация каналов Са2+ входа в клетках происходит путём прямого взаимодействия канала с лигандсвязывающим доменом InsP3R.

3. Высоко- аффинный Са2+-СаМ связывающий сайт в регуляторном домене InsP3R не играет существенной роли в регуляции активности InsP3R цитоплазматическим Са2+.

Научная новизна исследования.

В настоящей работе впервые показано, что сайты связывания InsP3R с AdA и с Р1Р2, так же, как и с InsP3 находятся в лигандсвязывающем домене InsP3R, что конкурентоспособность Р1Рг, при связывании с лигандсвязывающим доменом InsP3R такова, что PIP2 способен вытеснять InsP3 при связывании с лигандсвязывающим доменом InsP3R, но InsP3 или AdA не способны полностью вытеснить PIP2, связанный с InsP3R. Впервые показано, что высоко-аффинный Са2+-СаМ-связывающий сайт в регуляторном домене InsP3R не играет существенной роли в регуляции активности InsP3R цитоплазматическим Са2+ .

Теоретическое и практическое значение работы.

Полученные результаты важны для понимания механизма регуляции поступления Са2+ в клетку и роли InsP3R в этом процессе. Анализ полученных результатов свидетельствует в пользу конформационной модели передачи сигнала при запуске рецептор-управляемого входа ионов Са2+ в невозбудимых клетках. Выяснение биохимических и биофизических механизмов рецептор-зависимой передачи кальциевого сигнала, запускающего основные физиологические функции, поможет решению таких проблем как нарушение дифференцировки, пролиферации, секреции и других жизненно важных функций живой клетки. Полученные данные могут быть использованы при разработке и тестировании фармакологических препаратов.

1 Обзор литературы.

4 1.1 Роль инозитол-1,4,5-трисфосфата (lnsP3) в передаче внутриклеточного сигнала.

Среди первых работ, показавших участие мембранных фосфолипидов в образовании вторичных мессенджеров, следует отметить работу Мичела [Michell, 1982]. Он выдвинул предположение о том, что стимулированное нейротрансмиттерами увеличение внутриклеточной концентрации кальция [Са2+] сопровождается гидролизом инозитол-содержащего липида плазматической мембраны -фосфотидилинозитол-4,5-бисфосфата (Р1Р2). И, уже в 1983 году Сгреб с соавторами показали, что инозитол-1,4,5-трисфосфат (InsP3), являющийся продуктом рецептор-активированного гидролиза "Р1Рг, участвует как вторичный мессенджер в образовании кальциевого сигнала [Streb, Irvine, 1983].

В опытах на пермеабилизованных клетках поджелудочной железы £ авторы обнаружили, что аппликация InsP3 вызывала быстрое высвобождение Са2+ из внутриклеточных депо в цитоплазму. Результаты, полученные вслед за этими научными исследованиями, показали всю важность этого открытия. Было продемонстрировано, что InsP3-зависимый кальциевый сигнал опосредует действие гормонов, нейротрансмиттеров, ростовых факторов и других биологически-активных веществ, которые регулируют такие жизненно важные процессы, как мышечное сокращение, клеточный метаболизм и секрецию, а также рост клеток, их дифференцировку и пр. На нервной ткани также было показано, что активация ряда рецепторов (для глутамата, ацетилхолина, серотонина, брадикинина и других), связанных с G-белками, приводит к образованию InsP3 [Fisher, Agranoff, 1987; Fisher eta!., 1990].

В настоящее время известно, что образование InsP3 является ключевым событием в цепи двух важнейших путей клеточной сигнализации, один из которых берет начало со стимуляции рецепторов, связанных с G-белками, активирующихся ацетилхолином, гистамином, брадикинином, глутаматом, вазопрессином, АТР и т.д., а другой - с активации рецепторов, обладающих тирозинкиназной активностью, таких как рецепторы эпидермального фактора роста и фактора роста тромбоцитов [Fain, 1990]. Общим свойством рецепторов факторов роста является их способность к димеризации и аутофосфорилированию. Два разных рецепторных пути, используя энергию GTP или АТР, объединяются в конечном итоге в единый, который активирует фосфолипазу С (PLC).

В результате активации рецептора, связанного с G-белком, GDP, связанный с а-субъединицей белка, заменяется на GTP, и гетеротримерный G-белок диссоциирует с образованием оа и ору субъединиц, которые могут активировать различные изоформы фосфолипазы С (PLC), что приводит к гидролизу Р1Р2.

Рис. 1. Образование инозитол-1,4,5-трисфосфата (InsP3) и диацилглицерина (DAG) при гидролизе фосфотидилинозитол-4,5-бисфосфата (Р1Р2) фосфолипазой С, С16:0-пальмитиновая (насыщенная) жирная кислота, С20:4-арахидоновая (ненасыщенная) кислота

При активации рецептора, имеющего тирозинкиназную активность, информация передается благодаря прямой связи рецептора с у-формой PLC. Ростовые факторы, взаимодействуя с рецепторами, способствуют димеризации рецепторов, при этом, их киназные цитоплазматические домены фосфорилируют друг друга по тирозиновому остатку, образуя место для связывания с PLC-yl. В нестимулированных клетках PLC-yl находится в цитозоле, но переходит в мембранносвязанную форму сразу же после того, как ее SH2 домен связывается с рецептором.

Активированная PLC гидролизует мембраносвязанный фосфолипид -Р1Р2, в результате чего образуется водорастворимый посредник - 1пзРз и диацилглицерин - (DAG). И 1пзРз и DAG являются в клетке вторичными мессенджерами. InsP3, диффундируя в цитоплазме к эндоплазматическому ретикулуму, связывается с соответствующим рецептором-каналоформером, расположенным в ЭР, что приводит к выбросу Са2+ из ЭР в цитоплазму. DAG остается в плазматической мембране клетки. Связываясь с киназой С (протеинкиназой, фосфорилирующей белки цитоскелета, хроматина и клеточных мембран), DAG повышает сродство этой киназы к Са2+, что приводит к активации процессов фосфорилирования в клетке. матический ретикулум

Изменение ме i аболизма □ и морфоложи клегки, — пролиферация, секреция

Гормин роста

Рис. 2. Механизмы активации фосфолипаэы С (PLC) гормонами и факторами роста

1п5Р3-вызванная мобилизация Са2+, включает два основных процесса: 1) быстрое (в течении секунд) высвобождение Са2+ из внутриклеточных кальцийсодержащих депо в ответ на связывание InsP3 с рецепторами, расположенными в мембранах эндоплазматического ретикулума или кальциосомах, и 2) более продолжительная фаза входа Са2+ из внеклеточной среды в клетку. Механизм выброса Са2+ из внутриклеточных депо достаточно хорошо изучен; но механизмы, регулирующие связывание InsP3 с рецептором, а также молекулярная организация данного комплекса продолжают вызывать интерес. Было получено множество синтетических аналогов на основе инозитола, позволяющих проводить структурно-функциональный анализ InsP3R, однако, ни один из этих аналогов не обладал большей аффиностью к рецептору, чем эндогенный лиганд. В 1993 году Такахаши с соавторами выделили антибиотики аденофостин А и В, продуцентом которых является PenicH/ium brevicompactum. Было обнаружено, что аденофостин А и В являются специфическими агонистами для InsP3R с аффинностью превышающей аффинность к Ins(l,4,5)P3 в 10-100 раз, причем связывание рецептора с аденофостином А было выше, чем с аденофостином В [Takahashi et al, 1993]. Рэйчел с соавторами попытались обнаружить структурные особенности аденофостинов ответственные за их высоко-аффинное взаимодействие с InsP3R [Rachel et al, 2000]. Для решения этой задачи авторы синтезировали нескольких соединений на основе аденофостина, заменяя или исключая в нем структурные единицы. Проанализировав связывание полученных синтетических соединений с InsP3R, авторы пришли к выводу, что высокая аффинность аденофостинов определяется в основном наличием в их структуре аденина.

Вторая фаза Са2+ ответа - 1пБР3-зависимый вход внеклеточного Са2+ остается малопонятным процессом и, несмотря на усилия многих научных лабораторий, работающих в этом направлении, вызывает на сегодняшний день наибольшее количество споров и противоречивых толкований.

Заключение Диссертация по теме "Гистология, цитология, клеточная биология", Глушанкова, Любовь Николаевна

выводы

1. Совокупность полученных данных о специфичности связывания агонистов и антагонистов с лигандсвязывающим доменом 1пбРзЯ даёт основание полагать, что сайт связывания InsP3R с InsP3 является частью сайта связывания рецептора с PIP2, а конформационные состояния при связывании лигандсвязывающего домена InsPsR с 1пбРз и AdA схожи между собой и отличаются от конформационного состояния при связывании его с PIP2.

2. С помощью радиоизотопного метода показано, что конкурентоспособность 1пбРз, PIP2 и AdA такова, что PIP2 способен вытеснять 1пбРз при связывании с лигандсвязывающим доменом InsP3R, но InsP3 или AdA не способны полностью вытеснить Р1Р2, связанный с этим доменом.

3. Активация каналов Са2+ входа происходит путем прямого белок-белкового взаимодействия молекулы канала в плазматической мембране и молекулы InsP3R в эндоплазматическом ретикулуме. Взаимодействие происходит через лигандсвязывающий домен InsP3R и это происходит лишь в том случае, когда рецептор связан с InsP3.

4. Используя молекулярно-биологические и электро-физиологические подходы обнаружено, что высоко- аффинный Са2+-СаМ связывающий сайт в регуляторном домене InsP3R не играет существенной роли в регуляции активности InsP3R цитоплазматическим кальцием.

Выражаю благодарность моим научным руководителям Елене Валентиновне Казначеевой и Илье Борисовичу Безпрозванному за помощь и поддержку, оказанную мне на всех этапах работы.

Я благодарна колегам по лаборатории за их помощь и доброжелательность.

Выражаю искренную признательность заведущей нашей лабораторией - Галине Николаевне Можаевой, за ее помощь и моральную поддержку при подготовке диссертации.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Glouchankova L., Krishna U.M., Potter B.V., Falck J.R., Bezprozvanny I. (2000). Association of the inositol (l,4,5)-trisphosphate receptor ligand binding site with phosphatidylinositol (4,5)-bisphosphate and adenophostin A. Mol Cell Biol Res Commun. 3 (3): 153-158

2. Tu H., Miyakawa Т., Wang Z., Glouchankova L., lino M, Bezprozvanny I. (2002). Functional characterization of the type 1 inositol 1,4,5-trisphosphate receptor coupling domain SII(+/-) splice variants and the Opisthotonos mutant form. Biophys J. 82 (4): 1995-2004

3. Nosyreva E., Miyakawa Т., Wang Z., Glouchankova L., Mizushima A., lino M., Bezprozvanny I. (2002). The high-affinity calcium-calmodulin-binding site does not play a role in the modulation of type 1 inositol 1,4,5-trisphosphate receptor function by calcium and calmodulin. Biochem J. 365 (Pt 3): 659-667

4. Gusev K., Glouchankova L., Zubov A., Kaznacheyeva E., Wang Z., Bezprozvanny I., Mozhayeva G. N. (2003). Store-operated calcium entry pathways in human carcinoma A431 cells: functional properties and activation mechanisms J. Gen. Physiol. 122(1): 81-94.

5. Глушанкова Л.Н., Безпрозванный И.Б. (2000). Специфическое связывание инозитол (1,4,5)-трисфосфатного рецептора с фосфатидилинозитол-4,5,бисфосфатом и аденофостоном А. Всеросийский симпозиум "Клеточная биология на пороге XXI века", Санкт-Петербург, с. 34.

6. Nosyreva Е., Miyakawa Т., Wang Z., Glouchankova L., Mizushima A., Patrick De Smet., Humbert De Smedt., lino M., Bezprozvanny I. (2002). Structural determinants underlyng the inositil (1,4,5)-trisphosphate receptors (InsPsR) regulation by cytosolyc calcium.Biophys J. 82 (1): 59a, 292-Pos

7. Tu H., Miyakawa Т., Wang Z., Glouchankova L., lino M., Bezprozvanny I. (2002). Functional characterization of the type 1 inositol 1,4,5-trisphosphate receptor coupling domain SII(+/-) splice variants and the Opisthotonos mutant form. Biophys J Jan 82 (1): 60a, 294-Pos

8. Gusev K.O., Glouchankova L., Zubov A., Kaznacheyeva E., Mozhayeva G.N. (2003). Store-operated calcium channels in A431 cells. Конференция "Receptors and cell signaling in oxidative stress", Будапешт, Венгрия, с. 33.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Глушанкова, Любовь Николаевна, Санкт-Петербург

1. Adkins С.Е., Morris S.A., De Smedt Н., Sienaert I., Torok К. and Taylor C.W. (2000). Ca 2+ -calmodulin inhibits Ca 2+ release mediated by type-1, -2 and -3 inositol trisphosphate receptors. Biochem. J. 345, 357-363.

2. Babu Y.S., Bugg C.E., Cook W.J. (1988). Structure of calmodulin refined at 2.2 A resolution. J Mol Biol Nov 5 204, 191-204.

3. Barbato G., Ikura M., Kay L.E., Pastor R.W., Bax A. (1992). Backbone dynamics of calmodulin studied by 15N relaxation using inverse detected two-dimensional NMR spectroscopy: the central helix is flexible. Biochemistry Jun 16 31:23, 5269-5278.

4. Berridge M.J. (1995). Capacitative calcium entry. Biochem.J. 312: 1-11.

5. Bezprozvanny I., Watras J. and Ehrlich B.E. (1991). Bell-shaped calcium-response curves of lns(1,4,5)P3 and calcium-gated channels from endoplasmic reticulum of cerebellum. Nature (London) 351, 751-754.

6. Bezprozvanny I. В., Ehrlich В. E. (1994). Inositol 1, 4, 5.-trisphosphate [lnsP3]-gated Ca Channels from Cerebellum: Conduction Properties for Divalent Cations and Regulation by Intraluminal Calcium. J. Gen. Physiol. 104:821-856.

7. Boehning D. and Joseph S.K. (2000). Functional properties of recombinant type I and type III inositol 1,4,5-trisphosphate receptor isoforms expressed in COS-7 cells. J. Biol Chem. 275, 21492-21499.

8. Cardy T.J. and Taylor C.W. (1998). A novel role for calmodulin: Ca 2+ -independent inhibition of type-1 inositol trisphosphate receptors. Biochem. J. 334, 447-455.

9. Clapham D.E., Runnels L.W., Strubing C. (2001). The TRP ion channel family. Nature Reviews. 2, 387-396.

10. Clapham D.E. (2002). Sorting out MIC, TRP, and CRAC Ion Channels. J. Gen. Physiol. 120, 217-220.

11. Fabiato A. (1988). Computer programs for calculating total from specified free or free from specified total ionic concentrations in aqueous solutions containing multiple metals and ligands. Methods Enzymol. 157, 378-417

12. Fain J.N. (1990). Regulation of phosphoinositide-specific phospholipase C. Biochim Biophys Acta Jun 12 1053:1, 81-88.

13. Ferris C.D, Snyder S.H (1992). Inositol phosphate receptors and calcium disposition in the brain. J Neurosci May 12:5 1567-74.

14. Fisher S.K., Agranoff B.W. (1987). Receptor activation and inositol lipid hydrolysis in neural tissues. J. Neurochem Apr 48:4, 999-1017.

15. Fisher S.K., Heacock A.M., Seguin E.B., Agranoff B.W. (1990). Polyphosphoinositides are the major source of inositol phosphates in carbamoylcholine-stimulated SK-N-SH neuroblastoma cells. Mol Pharmacol Jul 38:1, 54-63.

16. Gnegy M.E. (1993) Calmodulin in neurotransmitter and hormone action. Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 33, 45-70.

17. Grynkiewicz G., Poenie M., Tsien R.Y. (1985). A new generation of Ca2+ indicators with greatly improved fluorescence properties. J. Biol. Chem. 260 (6), 3440-3450.

18. Hamada K., Miyata Т., Mayanagi K., Hirota J., Mikoshiba K. (2002). Two-state conformational changes in inositol 1, 4, 5-trisphosphate receptor regulated by calcium. J. Biol. Chem. 277 (24): 21115-21118.

19. Hardie R.C., Minke B. (1992.) The trp gene is essential for a light-activated Ca2+ channel in Drosophila photoreceptors. Neuron. 8, 643-651.

20. Hardie R.C. (2001) Phototransduction in Drosophila melanogaster. J. Exp. Biol. 204, 3403-3409.

21. Harteneck C., Plant T.D., Schultz G. (2000) From worm to man: three subfamilies of TRP channels. Trends Neuroscience. 23, 159-166.

22. Hidalgo C., Jorquera J., Tapia V. and Donoso P. (1993). Triads and transverse tubules isolated from skeletal muscle contain high levels of inositol 1,4,5-trisphosphate. J Biol. Chem. 268, 15111-15117.

23. Hidaka H., Sasaki, Y., Tanaka Т., Endo Т., Ohno S., Fujii Y. and Nagata T. (1981). N-(6-aminohexyl)-5-chloro-1-naphthalenesulfonamide, a calmodulin antagonist, inhibits cell proliferation. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 78, 43544357.

24. Hofer A.M., Fasolato C., Pozzan T. (1998). Capacitative Ca2+ entry is closely linked to the filling state of internal Ca2+ stores: a study using simultaneous measurements of Icrac and intraluminal Ca2+. J. of Cell Biology. 140(2), 325334.

25. Holtzclaw L.A., Pandhit S., Bare D.J., Mignery G.A., Russell J.T.2002). Astrocytes in adult rat brain express type 2 inositol 1, 4, 5-trisphosphate receptors. Glia. 39 (1): 69-84.

26. Hoth M., Penner R. (1992). Depletion of intracellular calcium stores activates a calcium current in mast cells. Nature. 355, 353-356.

27. Hoth M., Fanger C.M., Lewis R.S. (1997). Mitochondrial regulation of store-operated calcium signaling in T lymphocytes. J. Cell Biol. 137(3), 633-648.

28. Hotoda H., Murayama K., Miyamoto S., Iwata Y., Takahashi M., Kawase Y., Tanzawa К., Kaneko M. (1999). Molecular recognition of adenophostin, a very potent Ca2+ inducer, at the D-myo-inositol 1,4,5-trisphosphate receptor. Biochemistry 38, 9234-9241.

29. Hotoda H., Takahashi M., Tanzawa K., Takahashi S., Miyamoto S. and Kaneko M. (1995). IP3 receptor-ligand. 2: Synthesis and molecular mechanics calculation of adenophostin A. Nucleic Acids Symp Ser., 163-164.

30. Jan C.R., Tseng C.J. (2000). W-7 induces Ca(2+).(i) increases in Madin-Darby canine kidney (MDCK) cells. J. Pharmacol. Exp. Ther. 292, 358- 365.

31. Jiang Q.X., Thrower E.C., Chester D.W., Ehrlich B.E., Sigworth F.J. (2002). Three-dimensional structure of the type 1 inositol 1, 4, 5-trisphosphate receptor at 24 A resolution. EMBO J. 21 (14): 3575-3581.

32. Kaftan E.J., Ehrlich. B.E, Watras. J. (1997). Inisitol 1, 4, 5-Trisphosphate lnsP3. and Calcium Interact to Increase the Dynamic Range of lnsP3 Receptor-dependent Calcium Signalling. J. Gen. Physiol. 110: 529-539.

33. Kakiuchi S., Yasuda S., Yamazaki R., Teshima Y., Kanda K., Kakiuchi R., Sobue K. (1982). Quantitative determinations of calmodulin in the supernatant and particulate fractions of mammalian tissues. J. Biochem. (Tokyo) 92, 1041-1048.

34. Kaznacheyeva E., Lupu V.D. and Bezprozvanny I. (1998). Single-channel properties ofinositol (1,4,5)-trisphosphate receptor heterologously expressed in HEK-293 cells, J. Gen. Physiol. 111, 847-856.

35. Kiselyov K.I., Mamin A.G., Semyonova S.B., Mozhayeva G.N. (1997). Low-conductance high selective inositol (1,4,5)-trisphosphate activated Ca2+ channels in plasma membrane of A431 carcinoma cells. FEBS Lett. 407(3), 309-312.

36. Kiselyov K.I., Mamin A.G., Semyonova S.B., Mozhayeva G.N. (1999a). Miniature Ca2+ channels in excised plasma-membrane patches: activation by IP3. Pflugers Arch. 437(2), 305-314.

37. Kiselyov K.I., Mignery G.A., Zhu M.X., Muallem S. (1999b). The N-terminal domain of the IP3 receptor gates store-operated hTrp3 channels. Mol. Cell. 4, 423-429.

38. Lai F.A., Anderson K., Rousseau E., Liu Q.Y., Meissner G. (1988). Evidence for a Ca2+ channel within the ryanodine receptor complex from cardiac sarcoplasmic reticulum. Biochem Biophys Res Commun Feb 29 151:1 441-449.

39. Lee C.H., Poburko D., Kuo K.-H., Seow C.Y., van Breemen C. (2002). Ca2+ oscillations, gradients, and homeostasis in vascular smooth muscle. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 282, H1571-H1583.

40. Leppie-Wienhues A., Cahalan M.D. (1996). Conductance and permeation of monovalent cations through depletion-activated Ca2+ channels (Icrac) in Jurkat T cells. Biophys. J. 71, 787-794.

41. Luby-Phelps K., Hori M., Phelps J.M., Won D., (1995). Ca(2+)-regulated dynamic compartmentalization of calmodulin in living smooth muscle cells. J. Biol. Chem. 270, 21532-21538.

42. Luckhoff A., Clapham D.E. (1992). Inositol 1,3,4,5-tetrakisphosphate activates an endothelial Ca2+-permeable channel. Nature. 355, 356-358.

43. Lupu V.D., Kaznacheyeva E.V., Krishna U.M., Falck J.R., Bezprozvanny I. (1998). Functional coupling of phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate to inositol 1,4,5-trisphosphate receptor. J ВС. 273(23), 14067-14070.

44. Ma H.T., Patterson R.L., van Rossum D.B., Birnbaumer L., Mikoshiba K., Gill D.L. (2000). Requirement of the inositol trisphosphate receptor for activation of store-operated Ca2+ channels. Science. 287, 1647-1651.

45. Maes K., Missiaen L., Parys J.В., De Smet P., Sienaert I., Waelkens E.,

46. Callewaert G., De Smedt H. (2001). Mapping of the ATP-binding sites on inositol 1,4,5-trisphosphate receptor type 1 and type 3 homotetramers by controlled proteolysis and photoaffinity labeling. J. Biol. Chem. 276, 34923497.

47. Marchant J.S., Beecroft M.D., Riley A.M., Jenkins D.J., Marwood R.D., Taylor C.W. and Potter B.V. (1997). Disaccharide polyphosphates based upon adenophostin A activate hepatic D-myo-inositol 1,4,5-trisphosphate receptors. Biochemistry 36, 12780-90.

48. Meissner G., Henderson J.S., (1987). Rapid calcium release from cardiac sarcoplasmic reticulum vesicles is dependent on Ca2+ and is modulated by Mg2+, adenine nucleotide, and calmodulin. J. Biol. Chem. 262, 3065- 3073.

49. Meissner G., (1986). Ryanodine activation and inhibition of the Ca2+ release channel of sarcoplasmic reticulum. J. Biol. Chem. 261, 6300-6306.

50. Michell R.H. (1982). Stimulated inositol lipid metabolism: an introduction. Cell Calcium Oct 3:4-5, 285-294.

51. Michikawa Т., Hirota J., Kawano S., Hiraoka M., Yamada M., Furuichi T.4 and Mikoshiba K. (1999). Calmodulin mediates calcium-dependentinactivation of the cerebellar type 1 inositol 1,4,5-trisphosphate receptor. Neuron 23, 799-808.

52. Mignery G.A., and Sudhof T.C. (1990). The ligand binding site and transduction mechanism in the inositol-1,4,5-triphosphate receptor. EMBO J. 9(12), 3893-3898.

53. Missiaen L., DeSmedt H., Parys J., Sienaert I., Vanlingen S., Casteels R.1996). Threshold for inositol 1,4,5-trisphosphate action. JBC. 271(21), 12287-12293.

54. Miyawaki A., Furuichi Т., Ryou Y., Yoshikawa S., Nakagawa Т., Saitoh T. and Mikoshiba K. (1991). Structure-function relationships of the mouse inositol 1,4,5-trisphosphate receptor. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, 49114915.

55. Miyakawa Т., Mizushima A., Hirose K. Yamazawa Т., Bezprozvanny I., Kurosaki T. and lino M. (2001). Ca2+-sensor region of IP3 receptor controls intracellular Ca2+ signaling. EMBO J. 20, 1674-1680.

56. Mozhayeva G. N. Naumov A. P., Kuryshev Y. A. (1990). Inositol 1,4, 5-trisphosphate activates two types of calcium permeable channels in human carcinoma cells. FEBS Letters. 277:233-234.

57. Natsume Т., Hirota J., Yoshikawa, F., Furuichi T. and Mikoshiba K. (1999). Real time analysis of interaction between inositol 1,4,5-trisphosphate receptor type I and its ligand. Biochem. Biophys. Res.Commun. 260, 527-33.

58. Newton C.L., Mignery G.A. and Sudhof T.C. (1994). Co-expression in vertebrate tissues and cell lines of multiple inositol 1,4,5-trisphosphate (InsPa) receptors with distinct affinities for lnsP3. J. Biol. Chem. 269, 28613-28619.

59. Noble S., Shimoni Y., (1981). The calcium and frequency dependence of the slow inward current 'staircase' in frog atrium. J. Physiol. (Lond.) 310, 57- 75.

60. O'Neil K.T., De'Grado W.F. (1990). How calmodulin binds its targets: sequence independent recognition of amphiphilic alpha-helices. Trends Biochem Sci Feb 15:2, 59-64.

61. Parekh A.B., Penner R. (1997). Store depletion and calcium influx. Physiological Review. 77: 901-930.

62. Parekh A.B., Fleig A., Penner R. (1997). The store-operated calcium current Icrac: Nonlinear activation by 1пэРз and dissociation from calcium release. Cell. 89, 973-980.

63. Parys J.В., Sernett S.W., DeLisle S., Snyder P.M., Welsh M.J., Campbell K.P. (1992). Isolation, characterization, and localization of the inositol 1,4,5-trisphosphate receptor protein in Xenopus laevis oocytes. J Biol Chem Sep 15 267:26, 18776-18782.

64. Parys J.В., Missiaen L., Smedt H.D., Sienaert I., Casteels R. (1996). Mechanisms responsible for quantal Ca2+ release from inositol trisphosphate-sensitive calcium stores. Pflugers Arch Jul 432:3, 359-367.

65. Patterson R.L., van Rossum N.B., Gill D.L. (1999). Store-operated Ca2+ entry: evidence for a secretion-like coupling model. Cell. 98, 487-499.

66. Pietri F., Hilly M., Claret M., Mauger J.P. (1990). Characterisation of 2 reversible states of the inositol 1,4,5-trisphosphate receptor in rat hepatocytes. Gastroenterol Clin Biol 14:10, 710-714.

67. Pike L.J., Miller J.M. (1998). Cholesterol depletion delocalizes phosphatidylinositol bisphosphate and inhibits hormon-stimulated phosphatidylinsitol turnover. JBC. 273, 22298-22304.

68. Prakriya M., Lewis R.S. (2002) Separation and characterization of currents through store-operated CRAC channels and Mg2+-inhibited cation (MIC) channels. J. Gen. Physiol. 119, 487-507.

69. Putney J.W.Jr. (1990). Capacitative calcium entry revisited. Cell Calcium, v. 11, 611-624.

70. Putney J.W.Jr., Bird G.St.J. (1993). The signal for capacitative calcium entry. Cell Oct 22 75: 2, 199-201.

71. Putney J.W.Jr, Broad L.M., Braun F.J., Lievermont J.-P., Bird G.St.J.2002). Mechanisms of capacitative calcium entry. J. of Cell Science. 114(12): 2223-2229.

72. Ramos-Franco J., Fill M., Mignery G.A. (1998). Isoform-specific function of single inositol 1,4,5-trisphosphate receptor channels. Biophys. J. Aug 75: 2 834-839.

73. Ramos-Franco J., Galvan D., Mignery G. A., Fill M. (1999). Location of the permeation pathway in the recombinant type 1 inositol 1, 4, 5-trisphosphate receptor. J Gen. Physiol. 114 (2): 243-250.

74. Rebechi M.J., Pentyala S.N. (2000). Structure, function, and control of phoshpoinositide-specifec phospholipase C. Physiol. Reviews. 80(4): 12911335.

75. Rodney G.G., Moore C.P., Williams B.Y., Zhang J.Z., Krol J., Pedersen S.E., Hamilton S.L. (2001). Calcium binding to calmodulin leads to an N-terminal shift in its binding site on the ryanodine Receptor. J. Biol. Chem. 276, 2069-2074.

76. Schlatterer C., Schaloske R. (1996). Calmidazolium leads to an increase in the cytosolic Ca2+ concentration in Dictyostelium discoideum by induction of Ca2+ release from intracellular stores and influx of extracellular Ca2+. Biochem. J. 313, 661-667.

77. Sienaert I., Missiaen L., De Smedt H., Parys J.В., Sipma H., Casteels R. (1997) Molecular and functional evidence for multiple Ca2+-binding domains in the type 1 inositol 1,4,5-trisphosphate receptor. J. Biol. Chem. 272, 2589925906.

78. Stokes D.L., Wagenknecht Т. (2000) Calcium transport across the sarcoplasmic reticulum: structure and function of Ca2+-ATPase and the ryanodine receptor. Eur J Biochem Sep 267:17, 5274-5279.

79. Streb H., Irvine R.F., Berridge M.J., Schulz I. (1983). Release of Ca2+ from a nonmitochondrial intracellular store in pancreatic acinar cells by inositol-1,4,5-trisphosphate. Nature Nov 3-9 306:5938, 67-69.

80. Sudhof T.C., Newton C.L., Archer B.T., Ushkaryov Y.A., Mignery G.A. (1991). Structure of a novel lnsP3 receptor. EMBO J Nov 10:11 3199-206.

81. Sugawara H., Kurosaki M., Takata M., Kurosaki T. (1997). Genetic evidence for involvement of type 1, type 2 and type 3 inositol 1,4,5-trisphosphate receptors in signal transduction through the B-cell antigen receptor. EMBO J Jun 2 16:11, 3078-3088.

82. Takahashi S., Kinoshita T. and Takahashi M. (1994). Adenophostins A and B: potent agonists of inositol-1,4,5-trisphosphate receptor produced by Penicillium brevicompactum. Structure elucidation. J. Antibiot. (Tokyo) 47, 95100.

83. Takahashi M., Tanzawa K. and Takahashi S. (1994). Adenophostins, newly discovered metabolites of Penicillium brevicompactum, act as potent agonists of the inositol 1,4,5-trisphosphate receptor. J. Biol. Chem. 269, 369-372.

84. Vaca L.f Sampieri A. (2002) Calmodulin modulates the delay period between release of calcium from internal stores and activation of calcium inflox via endogenous TPC1 channels. JSC. 44, 42178-42187.

85. Voets Т., Prenen J., Fleig A., Vennekens R., Watanabe H., Hoenderop J.G.J., Bindels R.J.M., Droogmans G., Penner R., Niiius B. (2001) CaT1 and the calcium release-activated calcium channel manifest distinct pore properties. JBC. 276(51), 47767-47770.

86. Wilcox R. A., Primrose W. U., Nahorski S. R., Challiss R. A. (1998). New developments in the molecular pharmacology of the myo-inositol 1, 4, 5-trisphosphate receptor. Trends Pharmacol. Sci. 19 (11): 467-475.

87. Wojcikiewicz R. J. 1995. Type I, II, and III inositol 1, 4, 5-trisphosphate receptors are unequally susceptible to down-regulation and are expressedin markedly different proportions in different cell types. J. Biol. Chem. 270 (19): 11678-11683.

88. Wolf B.A., Colca J.R., McDaniel M.L. (1986). Calmodulin inhibits inositol trisphosphate-induced Ca2+ mobilization from the endoplasmic reticulum of islets. Biochem. Biophys. Res. Commun. 141, 418-425.

89. Worley P.F., Baraban J.M., Supattapone S., Wilson V.S., Snyder S.H. (1987). Characterization of inositol trisphosphate receptor binding in brain. Regulation by pH and calcium. J Biol Chem Sep 5 262:25, 12132-12136.

90. Yamada M., Miyawaki A., Saito K., Nakajima Т., Yamamoto-Hino M., Ryo Y., Furuichi T. and Mikoshiba K. (1995). The calmodulin-binding domain in the mouse type 1 inositol 1,4,5-trisphosphate receptor. Biochem. J. 308, 8388.

91. Yoshida Y., Imai S. (1997). Structure and function of inositol 1,4,5-trisphosphate receptor. Jpn J Pharmacol Jun 74:2, 125-137.

92. Yoshikawa F., Morita M., Monkawa Т., Michikawa Т., Furuichi Т., Mikoshiba K. (1996). Mutational analysis of the ligand binding site of the inositol 1,4,5-trisphosphate receptor. J. Biol. Chem. Jul 26 271:30, 1827718284.

93. Zhang M., Tanaka Т., Ikura M. (1995). Calcium-induced conformational transition revealed by the solution structure of apo calmodulin. Nat Struct Biol Sep 2:9, 758-767.

94. Zubov A.N., Kaznacheeva E.V., Nikolaev A.V., Alexeenko V.A., Kiselyov K., Muallem S., Mozhayeva G.N. (1999). Regulation of the miniature plasma membrane Ca2+ channel lmin by inositol 1,4,5-trisphosphate receptors. JBC 274(37): 25983-25985.

95. Zweifach A., Lewis R.S. (1993) Mitogen-regulated Ca2+ current of T lymphocytes is activated by depletion of intracellular Ca2+ stores. Proc. Natl. Acad. Sci. 90: 6295-6299.