Участие белков семейства Homer в регуляции депо-управляемого входа кальция в клетки А-431

Шалыгин, Алексей Вадимович

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Участие белков семейства Homer в регуляции депо-управляемого входа кальция в клетки А-431
ВАК РФ 03.03.04, Клеточная биология, цитология, гистология

Автореферат диссертации по теме "Участие белков семейства Homer в регуляции депо-управляемого входа кальция в клетки А-431"

Шалыгин Алексей Вадимович

УЧАСТИЕ БЕЛКОВ СЕМЕЙСТВА HOMER В РЕГУЛЯЦИИ ДЕПО-УПРАВЛЯЕМОГО ВХОДА КАЛЬЦИЯ В КЛЕТКИ А431

03.03.04

Клеточная биология, цитология, гистология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

20 Б

^ по да

Санкт-Петербург 2010

004619208

Работа выполнена в Учреждении Российской академии наук Институт цитологии РАН, Санкт-Петербург

Научный руководитель: доктор биологических наук

Казначеева Елена Валентиновна

Официальные оппоненты: доктор биологических наук,

Морачевская Елена Алексеевна

доктор биологических наук, Тихонов Денис Борисович

Ведущая организация: Учреждение Российской академии наук

Институт физиологии им. И.П. Павлова РАН, Санкт-Петербург

Защита состоится « 28 » января 2011 года в 12 часов на заседании Диссертационного совета Д.002.230.01 при Институте цитологии РАН по адресу: 194064, Санкт-Петербург, Тихорецкий пр., д. 4. Сайт Института: http://www.cytspb.rssi.ru E-mail: cellbio@mail.cytspb.rssi.ru Факс: +7 (812)297-35-41

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института цитологии РАН. Автореферат разослан <<2~} » декабря 2010 года.

Ученый секретарь Диссертационного совета

кандидат биологических наук J. Каминская Е.В.

ЯЖ----*

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Все живые организмы используют кальций в качестве внутриклеточного посредника. В покое его концентрация в цитоплазме поддерживается на очень низком уровне - 10"7 М, и поэтому может быть быстро повышена (Parekh et al., 2005). Клетка может повысить концентрацию кальция в цитоплазме за счет выброса кальция из внутриклеточных депо или за счет входа кальция из внеклеточной среды через плазматическую мембрану (ПМ). Быстрый выброс кальция из внутриклеточных хранилищ происходит через рецепторы инозитол 1,4,5-трисфосфата (IP3R), которые являются кальциевыми каналами эндоплазматического ретикулума (ЭР) и открываются после связывания с инозитол 1,4,5-трисфосфатом (IP3). В электроневозбудимых клетках основной путь входа кальция из внеклеточной среды - это депо-управляемые каналы (store-operated channels - SOC), которые активируются в ответ на опустошение внутриклеточных кальциевых депо.

В разных тканях были описаны депо-управляемые каналы с различными биофизическими характеристиками, что предполагает различный молекулярный состав таких каналов (Parekh et al., 2005). На сегодняшний день известны два семейства трансмембранных белков, составляющих депо-управляемые каналы: TRPC и Orai. Однако точный молекулярный состав большинства депо-управляемых каналов пока не определен, поскольку TRPC и Orai могут образовывать гетеро- и гомоолигомеры, а белки семейства TRPC и Orai представлены несколькими изоформами, например, у млекопитающих экспрессируется семь изоформ белков TRPC и три изоформы белков Orai (Parekh et al., 2005; Feske et al., 2006).

Механизм передачи сигнала от опустошенного депо к каналам ПМ остается малоизученным. Недавно были обнаружены белки семейства Stim, которые служат кальциевыми сенсорами ЭР (Liou et al., 2005). При опустошении депо белки Stim гомоолигомеризуются и перемещаются в puncta, выпячиваясь к ПМ, что приводит к активации депо-управляемых каналов.

Основная гипотеза передачи сигнала от опустошенного депо к каналам плазматической мембраны - это гипотеза конформационного сопряжения,

подразумевающая прямое взаимодействие белков ПМ (TRPC и Orai) с белками ЭР (IP3R и Stim) (Parekh et al., 2005; Wang et al., 2009). В недавних работах была экспериментально продемонстрирована колокализация элементов депо-управляемого входа: кальциевой АТФазы - SERCA (закачивающей кальций в депо), IP3R (через который выбрасывается кальций из депо), Stim (являющегося кальциевым сенсором ЭР) и белков ПМ, формирующих пору SOC (Wang et al., 2009; Manjarrés et al., 2010). Однако, неясно, как осуществляется такое близкое расположение белков.

В нервных клетках были описаны адаптерные белки семейства Homer, которые колокализовапи метаботропный глутаматный рецептор (mGluR) ПМ и IP3R ЭР (Tu et al., 1998). Позже было показано, что Homer может также взаимодействовать с кальциевой АТФазой, рианодиновым рецептором (RyR), TRPC (Yuan et al., 2003; Kim et al., 2006) и другими белками. Более того, в нервных клетках адаптерные белки Homer и Shank образуют сетеподобную структуру, которая организует постсинаптические белки (Hayashi et al., 2009). На N-конце белков Homer расположен домен EVH1, позволяющий им узнавать свои мишени, а именно аминокислотную последовательность PPXXF - пролин, пролин, две любые аминокислоты, фенилаланин. Среди изоформ белков Homer есть две принципиально разные группы: длинные и короткие изоформы. На С-конце длинных изоформ находится домен coil-coiled, позволяющий образовывать им олигомеры. У короткой изоформы, образующейся при альтернативном сплайсинге, этот домен отсутствует (Worley et al., 2007). Длинные изоформы образуют тетрамеры с антипараллельной укладкой С-концов и четырьмя доменами EVH1, такая структура позволяет им колокализовать белки кальциевой сигнализации (Hayashi et al., 2009). Поскольку короткие изоформы не могут олигомеризоваться, они тем самым служат негативными регуляторами функции длинных Homer. Помимо колоколизации (или участия в организации) элементов кальциевого входа, было показано, что Homer может модулировать активность mGluR (Ango et al., 2001), a также ионных каналов RyR (Feng et al., 2002) и TRPC (Yuan et al., 2003; Kim et al., 2006).

Было выдвинуто предположение, что адаптерные белки Homer могут

участвовать в регуляции депо-управляемых каналов. В клетках часто присутствуют несколько типов депо-управляемых каналов, например в клетках А431 ранее были описаны четыре типа депо-управляемых каналов: 1ПШ1, Imax, ICRAC, INS (Kaznacheyeva et al., 2007). Предыдущие исследования, подтверждающие роль белков Homer в регуляции депо-управляемых каналов, проводились с использованием метода локальной фиксации потенциала в конфигурации whole-cell или флуоресцентных измерений внутриклеточной концентрации кальция (Yuan et al., 2003; Kirn et al., 2006). Поскольку в этих экспериментах регистрировался суммарный вход кальция через все типы кальциевых каналов клеток, оставалось неизвестным, какие конкретно типы депо-управляемых каналов регулируются белками семейства Homer.

Цели и задачи исследования. Цель настоящей работы заключалась в исследовании роли белков семейства Homer в регуляции депо-управляемых кальциевых каналов в клетках А431. Были поставлены следующие задачи:

1. Выяснить, может ли разобщение белков Homer с белками-мишенями активировать вход кальция.

2. Охарактеризовать электрофизиологические свойства одиночных каналов, активируемых диссоциацией комплекса, образованного белками Homer с белками-мишенями.

3. Исследовать влияние на вход кальция различных изоформ белков Homer.

4. Изучить взаимодействие белков Homer с IP3R первого типа.

5. Сравнить активацию каналов, вызванную 1Р3, пептидом PPKKFR и белками Homer.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Адаптерные белки семейства Homer участвуют в регуляции депо-управляемых каналов в клетках А431.

2. Разные типы депо-управляемых каналов имеют разную чувствительность к белкам Homer.

3. Разные изоформы белков семейства Homer оказывают неодинаковое влияние на депо-управляемые каналы.

4.1Р3 нарушает взаимодействие Homer и IP3R первого типа.

Научная новизна исследования. В настоящей работе впервые описаны Нотег-чувствительные каналы в клетках А431. Впервые показано, что Homer неодинаково действует на разные типы депо-управляемых каналов ПМ, что позволяет различить механизмы активации каналов Imin и 1„1М. Впервые показано, что 1Р3 разрушает взаимодействие IP3RI и Homer. Предложен новый механизм действия IP3 на депо-управляемые каналы.

Теоретическое и практическое значение работы. Множество клеточных процессов регулируются изменениями внутриклеточной концентрации кальция (Parekh et al., 2005). Несмотря на то, что основные белки, вовлеченные в этот процесс, уже известны, непонятным остается механизм колоколизации этих белков. Данное исследование вносит существенный вклад в понимание организации и функционирования депо-управляемых кальциевых каналов.

Список заболеваний, вызванных нарушениями в кальциевой сигнализации, неуклонно расширяется. На сегодняшний день установлена роль кальция в нейродегенеративных (Bezprozvanny, 2009), иммунных (McCarl et al., 2009; Oh-Hora et al., 2008) и других заболеваниях. Проведенные исследования позволяют лучше понять причины этих болезней и предложить новые пути их лечения.

Апробация работы. Основные положения работы доложены и обсуждены на всероссийской межвузовской научно-технической конференции студентов и аспирантов "XXXIV неделя науки СПбГПУ" (Петербург, 2006); международной конференции "Рецепция и внутриклеточная сигнализация" (Пущино, 2007); всероссийском форуме студентов, аспирантов и молодых ученых «Наука и инновации в технических университетах» (Петербург, 2007); IV съезде Российского общества биохимиков и молекулярных биологов (Новосибирск, 2008); II Конференции молодых ученых ИНЦ РАН (Петербург, 2010); семинарах кафедры биофизики СПбГПУ и лаборатории ионных каналов клеточных мембран Института цитологии РАН.

Объем и структура диссертации. Диссертация включает введение, обзор литературы, постановку задачи, описание материалов и методов исследования, изложение экспериментальных данных, обсуждение результатов, выводы, список публикаций по теме диссертации и список цитируемой литературы. Работа

изложена на 106 страницах текста, иллюстрирована 15 рисунками и содержит 1 таблицу. Список литературы включает 148 наименований.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Клетки. Клетки эпидермоидной карциномы человека А431 (из коллекции клеточных культур Института цитологии РАН) культивировали в среде DMEM с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки и антибиотиков (100 мкг/мл пенициллина, 100 ед/мл стрептомицина). За 2-4 сут. до начала эксперимента клетки высевали на фрагменты покровных стёкол (3 мм * 3 мм).

Материалы. Для культивирования клеток использовали среду DMEM, сыворотку крови эмбрионов крупного рогатого скота, генетицин G-418. В работе также применяли глутатион-сефарозу; 1,5-изопропилтио-Р-В-галактозид; (1,4,5)1Р3; уридинтрифосфат; HEPES, тритон Х-100, EGTA; антитела к GST (Sigma, США), вторые антитела (кроличьи и мышиные) (Sigma, США); антитела к Homer lbc (Santa Cruz, США). Поликлональные антитела (pAb) к IP3R первого типа Т443 были описаны ранее (Kaznacheyeva et al., 1998). Синтез пептидов PPKKFR и PPKKRR был заказан в фирме Диафарм (Россия).

Метод локальной фиксации потенциала (patch clamp). В работе использовали метод локальной фиксации потенциала (patch-clamp) в конфигурации inside-out и в конфигурации whole -cell. В первом случае фрагмент мембраны, ограниченный плотным контактом с микропипеткой, изолируется от клеточной поверхности, что открывает доступ к внутриклеточной поверхности плазматической мембраны. Во втором случае разрушается кусок мембраны, ограниченный пипеткой, что позволяет записывать суммарный ток через все каналы плазматической мембраны.

Подачу свежеприготовленных растворов производили путем перфузии камеры 3-5-кратным объемом, что обеспечивало полную смену раствора менее чем за 1 с.

Во всех экспериментах потенциал внеклеточного раствора принимали за нулевой.

В конфигурации inside-out внутриклеточный раствор (камера) содержал (в мМ): 140 К-глутамат, 5 NaCl, 1 MgCl2, 10 HEPES-K, рН 7.4, 2 EGTA-K и 1.13 СаС12 (рСа 7). Раствор пипетки содержал (в мМ): 105 ВаСЬ, 10 Tris-Ci (рН 7.3). Присутствие ионов Ва2+ способствовало предотвращению активации кальций-зависимых и блокированию потенциал-зависимых калиевых каналов. Электрическое сопротивление заполненных раствором пипеток составляло 8-20 МОм.

В конфигурации whole-cell внутрипипеточный раствор содержал (в мМ) 145 NMDG аспартата, 10 Cs-EGTA, 10 Cs-HEPES рН 7.3, 1.5 MgCl2 и 4.5 СаС12 (рСа 7.0). Внеклеточный раствор содержал (в мМ): 140 NMDG аспартата, 10 ВаС12, 10 Cs-HEPES, рН 7.3. Для конфигурации whole-cell вытягивались пипетки, сопротивление которых после оплавления составляло 3-5 МОм. Во всех опытах whole-cell на мембране поддерживался потенциал, равный 0 мВ. С периодом в 5 с командный (управляющий) потенциал менялся по следующему алгоритму. Сначала подавался потенциал -100 мВ в течение 60 мс, затем следовало пилообразное изменение потенциала (voltage ramp) от -100 до +100 мВ в течение 600 мс, после чего потенциал возвращался к 0 мВ. Токи whole-cell нормировались на емкость клетки, которая отражает размер клетки. Среднее значение клеточной емкости составляло 21 ± 4 пФ (общее число опытов п = 25).

Регистрацию токов проводили с помощью усилителя Axopatch 200В (Axon Instruments, США). Сигнал оцифровывали на частоте 5000 Гц. Для анализа и представления данных по измерениям токов одиночных каналов низкой проводимости осуществляли дополнительную фильтрацию (80-100 Гц). Амплитуды токов одиночных каналов определяли по записям токов и по амплитудным гистограммам. Для количественной оценки степени активности каналов использовали величину NP0, т.е. произведение количества проводящих каналов (N) в данном фрагменте записи на величину вероятности открытого состояния (Ра), которая определялась из соотношения Р0= I/(iN), где I - среднее значение тока через мембранный фрагмент на данном временном интервале, i -амплитуда тока открытого канала.

Для оцифровки и анализа записей было использовано программное

обеспечение, написанное В.А. Алексеенко, а также пакеты программ pClamp 6.0.4, Microcal Origin 6.0, Microsoft Excel.

Электрофорез и иммуноблоттинг (ИБ). Белковые пробы разделялись с помощью электрофореза в 6, 8, 10%-ом полиакриламидном геле в денатурирующих условиях. Гель либо окрашивали Кумасси, либо переносили белки из него на мембрану. Перенос белков на мембрану осуществляли полусухим методом. Далее места неспецифической сорбции на мембране забивали 5%-ым молоком и инкубировали с антителами против интересующих нас белков. Затем к мембране добавляли подходящие вторые антитела и проявляли ECL реагентами. Положение белков было определено с помощью фотопленки.

Экспрессия и очистка рскомбинаитных белков GST-Homer 1с и GST-Homer la. Клетки Escherichia coli BL-21 DE3 трансформировали плазмидами pGEX-2T-HomerlA и pGEX-2T-HomerlC. Экспрессию рекомбинантных белков индуцировали 1 мМ IPTG в течение 2-3 ч для Homer la при +37 "С и 0.1 мМ IPTG в течении 20 ч для Homer 1с при + 25 °С. Клеточную суспензию охлаждали на льду, центрифугировали 10 мин с ускорением 5000 g, осадок ресуспендировали в 5 мл PBS с добавлением лизоцима 1 мг/мл, 1% Triton Х-100 и ингибиторов протеаз. Бактерии, находящиеся в суспензии, разрушали ультразвуком: 2-3 раза по 15 с на льду с перерывами. Полученный лизат центрифугировали 12000 g 15 мин при +4 °С. Химерные белки GST-Homer очищали на глутатион-сефарозе следующим образом. Супернатант инкубировали с 500 мкл глутатион-сефарозы 2-3 ч при +4 °С. Агарозные гранулы осаждали в центрифуге 300g 5 мин и промывали в 10 мл PBS с 1% Triton Х-100, такую операцию повторяли три раза. Белок элюировали инкубацией с 500 мкл буфера для элюции (50 мМ Tris, 100 мкМ глутатиона, pH 8.0) в течение 10 мин, этот шаг повторяли три раза, полученные пробы затем объединяли. Полученные белки хранили при +4 °С. Степень очистки белка проверяли с помощью электрофореза и имунноблоттинга с использованием поликлональных антител к GST и Homer или просто окраской геля кумасси.

Клеточный лизат. Клетки А431 в чашке диаметром 10 см лизировали в течение 10 мин при 4°С в 1 мл раствора, содержащего 150 мМ NaCl, 20 мМ Tris-

НС1 (pH 7.6), 1 мМ EDTA, 1 мМ EGTA, 1% тритон Х-100, 0.5% NP40, 10% глицерин, 0.5 мМ PMSF, с добавлением коктейля ингибиторов протеаз. Лизат трижды пропускали через шприц, затем центрифугировали с ускорением 22000 g при 4 °С в течение 30 мин и отбирали супернатант, который впоследствии использовали в опытах.

Получение микросом, обогащенных IP3R первого типа (IP3R1). Выделение и очистку белка проводили по методике, описанной в (Kaznacheyeva et al., 1998). 12 крыс в возрасте 4-5 недель были декапитированы. Крысиный мозжечок был измельчен и гомогенизирован с помощью тефлон-стеклянного гомогенизатора в 15 мл гомогенизирующего буфера (5 мМ NaN3, 1 мМ EDTA, 20 мМ HEPES, рН 7.4) в присутствии коктейля ингибиторов протеаз и 0.1 мг/мл PMSF. Затем еще 15 мл гомогенизирующего буфера добавляли к гомогенату, и полученную суспензию центрифугировали 15 мин с ускорением 4000g. Надосадочную жидкость фильтровали, и фильтрат центрифугировали 30 мин с ускорением 90000g. Получившийся осадок ресуспендировали в 30 мл буфера высокой соли (0.6 М КС1, 5 мМ NaN3, 20 мМ Na4P207, 1 мМ EDTA, 10 мМ HEPES, рН 7.2) с помощью тефлон-стеклянного гомогенизатора и центрифугировали 15 мин при ускорении 4000g. Супернатант центрифугировали 30 мин с ускорением 90000g. Полученный осадок растворяли в 0.5 мл буфера для хранения (10% sucrose, 10 мМ MOPS, рН 7.0), аликвотировали и моментально замораживали в жидком азоте, хранили при температуре -80 °С. Общая концентрация белка (измеренная по Бредфорд) в микросомах, полученных из крысиного мозжечка, составляла около 5-8 мг/мл.

Эксперименты pull-down (PD). К 25 мкл глутатион-сефарозы со связанными на ней химерными белками GST-Homer добавляли лизаты клеток А431 или микросомы, обогащенные IP3R1, и инкубировали на переворотном шейкере при 4°С в течение 12-24 ч. Реакцию проводили в буфере PBS с 1% тритона Х-100. В ряде экспериментов инкубацию проводили в присутствии IP3. После этого сефарозу промывали три раза в 1 мл PBS с 1% тритона Х-100 (на сефарозе оставался белок GST-Homer и связавшиеся с ним белки). Наличие IP3R1 в пробах проверяли методом иммуноблотгинга с использованием поликлональных антител к IP3RI.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

(1) Разобщение белков Homer с белками-мишенями, вызванное пептидом PPKKFR, активирует вход кальция в клетках А431. С помощью метода иммуноблоттинга показано, что в клетках А431 экспрессируются длинные изоформы белков Homer (рис. 1Б). Домен EVH1 белков Homer узнает в белках-мишенях аминокислотную последовательность PPXXFR, где X - любая аминокислота (рис. 1А) (Tu et al., 1998). Чтобы определить роль адаптерных белков семейства Homer в регуляции кальциевых рецептор-/депо-управляемых каналов, мы использовали синтетический пептид PPKKFR. Ранее было показано, что аналогичный пептид вызывает диссоциацию комплекса, образованного белком Homer с метаботропным глутаматным рецептором или с рианодиновым рецептором (Tu et al., 1998). В контрольных экспериментах мы использовали пептид PPKKRR, поскольку замена фенилалашша на аргшшн делает пептид неузнаваемым для домена EVH1 белков Homer.

EVH1 Coil-coiled

............................Homer 1а

-KWWWVq Homeric

---ppxxF---

кД -60

Homer 1c -»<■*>

-37

-20

Рис. 1.

В клетках A431 экспрессируются длинные изоформы белков семейства Homer.

А. Схема структуры белков семейства Homer.

Б. Представлен иммуноблоттинг лизата клеток А431, проявленный моноклональными антителами на Homer 1с. Справа отмечены положения молекулярных маркеров.

В экспериментах whole-cell на клетках А431 в раствор регистрирующей пипетки добавлялся пептид PPKKFR или PPKKRR. После получения

конфигурации whole-cell пептид из пипетки диффундировал в цитозоль клетки. Интегральный вход Са2+, регистрируемый при таком внутриклеточном диализе PPKKFR- или PPKKRR-содержащими растворами, сравнивали с интегральным депо-управляемым входом кальция, активированным приложением уридинтрифосфата к наружной стороне мембраны (UTP).

Рис. 2.

Записи токов, индуцированных пептидами PPKKFR или PPKKRR в экспериментах whole-cell.

А. Развитие во времени токов при потенциале -80 мВ, когда в регистрирующей пипетке находился пептид PPKKFR (серые квадраты) или PPKKRR (черные квадраты). Момент добавления UTP во внеклеточный раствор отмечен стрелкой сверху. Стрелками а и b отмечены максимальные значения токов.

Б. Усредненные вольт-амперные характеристики для токов, индуцированных пептидом PPKKFR или UTP. Усреднение проводилось для максимального значения токов whole-cell, которые отмечены стрелками а и b на панели А.

Внутриклеточный диализ раствором, содержащим 1 мкМ PPKKFR, приводил к активации селективного кальциевого тока, максимальная амплитуда которого при потенциале -80 мВ в среднем составляла 1.3 ± 0.1 пА/пФ (рис. 2А). Если вместо PPKK.FR раствор в пипетке содержал контрольный пептид РРЮСЛ^, ток не развивался, но последующее добавление к наружной стороне плазматической мембраны таких клеток 100 мкМ иТР приводило к развитию тока (рис. 2А). Максимальные амплитуды токов, вызванных иТР, составляли в среднем 1.8 ± 0.3 пА/пФ при потенциале -80 мВ, то есть были больше, чем амплитуды токов, активированных пептидом PPKKFR (рис. 2Б). Потенциал реверсии токов,

А 100 мкМ UTP

пА/пФ |

- 1 мкМ PPKKFR ■ 1 мкМ PPKKRR

300

600

900 с

1 мкМ PPKKFR

1 мкМ PPKKRR, 100 мкМ UTP

50 мВ

активированных пептидом PPKKFR, был выше, чем у токов в ответ на UTP. Таким образом, ток, активированный пептидом PPKKFR, был селективнее для ионов Са2', чем ток, активированный UTP (рис. 2Б).

Полученные нами данные согласуются с опубликованными ранее работами других авторов, предположивших взаимосвязь между белками Horner и депо-управляемым входом Са2+ в электроневозбудимые клетки (Yuan et al., 2003; Kim et al., 2006).

Ранее в клетках A431 было описано несколько типов чувствительных к UTP кальциевых каналов, токи через которые имели разный потенциал реверсии (Kaznacheyeva et al., 2007). Мы предположили, что различия в амплитуде токов и селективности каналов в ответ на пептид PPKKFR и па UTP связаны с тем, что стимуляция клеток UTP активирует несколько типов кальциевых каналов, тогда как пептид PPKKFR активирует не все типы каналов.

(2) К разобщению белков Homer с их белками-мишенями, вызванному пептидом PPKKFR, чувствительны каналы Imin, но не каналы Imi,,. Чтобы исследовать, какие кальциевые каналы, экспрессируемые в клетках А431, ответственны за токи, активируемые диссоциацией комплекса, образованного Homer с белками-мишеиями, мы поставили эксперименты в конфигурации inside-out. В экспериментах inside-out на клетках А431 встречаются два типа депо-управляемых каналов: Imin и Imax. Электрофизиологические характеристики этих каналов различны, что позволяет легко идентифицировать их по экспериментальным записям токов. Каналы Imin обладают малой проводимостью (1.2 пСм) и высокой селективностью для двухвалентных катионов. Каналы Imax обладают большей, чем Imj„, проводимостью (18 пСм), но при этом их селективность меньше. Оба канала активируются как пассивным опустошением депо, так и внеклеточным UTP или внутриклеточным 1Р3.

В конфигурации inside-out добавление 100 нМ пептида PPKKFR с цитоплазматической стороны мембранного фрагмента приводило к активации входящего тока (рис. ЗА). Оказалось, что основные электрофизиологические свойства активируемых каналов (кинетические характеристики, проводимость и

потенциал реверсии) совпадают с параметрами каналов Imin> описанными ранее (Kiselyov et al., 1997, 1999; Zubov et al., 1999; Gusev et al., 2003; Kaznacheyeva et al., 2001, 2007). Этот факт позволяет сделать вывод о том, что диссоциация комплексов Ношег/белки-мишени, вызванная пептидом PPKKFR, приводит к активации каналов Imin в клетках А431, что согласуется с полученными ранее данными на клетках НЕК293 (Николаев и др., 2004). Каналы Imin активировались пептидом PPKKFR в 43% случаев (рис. ЗА). Контрольный пептид PPKKRR (не приводящий к разделению молекул Homer с их мишенями) не активировал каналы ни в одном из опытов, причем последующее добавление PPKKFR в том же эксперименте активировало каналы Imm в 42% опытов (рис. ЗБ). Пептид PPKKFR не вызывал активацию каналов Imax - другого типа депо-управляемых каналов в клетках А431.

500 мс

Рис. 3. Пептид PPKKFR активирует каналы lmirl, но не I,

A. Добавление 100 нМ PPKKFR с цитоплазматической стороны мембранного фрагмента (конфигурация inside-out, потенциал на мембране -70 мВ) приводило к активации каналов 1ПШ. Снизу показан фрагмент записи тока в развернутом временном масштабе.

Б. Добавление 100 нМ контрольного пептида PPKKRR не активирует токи, тогда как последующее добавление 100 нМ пептида PPKKFR активирует каналы lmj„.

B, Г. Добавление 2.5 мкМ 1Рз активирует каналы lmj„ (В) и каналы Imax (Г). Примеры записей токов через одиночные каналы на изолированном фрагменте мембраны при потенциале, равном -70 мВ.

В аналогичных экспериментах, добавление 2.5 мкМ инозитол-1,4,5-трисфосфата (1Р3) с цитоплазматической стороны мембраны в экспериментах inside-out активировало каналы Imm в 32% и каналы 1гаах в 8% опытов (рис. 3 В, Г), что согласуется с нашими предыдущими результатами (Kaznacheyeva et al., 2007). При потенциале -70 мВ амплитуды токов через каналы Imin составляли 0.18 пА, тогда как амплитуды токов через каналы Imax составляли 1.7 пА (рис. 3 А-Г).

Таким образом, нарушение связи белков Homer с белками-мишенями, вызванное пептидом PPKKFR, приводит к активации каналов Imin, тогда как каналы 1гаах в клетках А431 не чувствительны к этому пептиду. Мы не знаем, регулируются ли белками Homer два других типа депо-управляемых каналов клеток А431 - INS и Icrac, поскольку эти каналы не встречаются (или не разрешимы) в конфигурации inside-out.

Данные по регистрации активности одиночных каналов хорошо согласуются с результатами экспериментов whole-cell. UTP активирует все типы депо-управляемых каналов у клеток А431, а пептид PPKKFR не активирует, по крайней мере, каналы Imax, что объясняет разницу в величинах зарегистрированных интегральных токов (рис. 2А, Б). Поскольку каналы Imax менее селективны, чем каналы Imin, то UTP-вызванный интегральный ток проявляет меньшую селективность (рис. 2Б).

(3) Каналы ImilI активируются изоформои Homer la, но не Homer 1с.

Среди белков Homer есть две принципиально разные группы (рис. 1А) (Worley, 2007). У длинных изоформ белка (таких, как Homer 1с) на С-конце находится домен coil-coiled, который позволяет им образовывать гомоолигомеры. Отсутствие домена coil-coiled у коротких изоформ (таких, как Homer la) не позволяет им формировать олигомерные комплексы (рис. 1А). Чтобы исследовать действие коротких и длинных изоформ на активность депо-управляемых каналов в А431, мы использовали рекомбинантные белки Homer, очищенные из бактерий Е. coli, трансформированных плазмидой GST-Homer. Функциональную активность выделенных белков Homer la и Homer 1с мы проверяли по их способности связывать IP3R первого типа (IP3R1) в экспериментах pull-down.

Мономерная изоформа белков Homer 1а в концентрации 100 нМ активировала кальциевые каналы в 30% экспериментов inside-out (рис. 4А, В). Вольт-амперная характеристика каналов, активированных белком Homer 1а (рис. 4Б, В), совпадала с вольт-амперной характеристикой каналов Imin, активированных UTP, опустошением депо или 1Р3 в клетках А431 или НЕК 293 (Kiselyov et al., 1997, 1999; Zubov et ab, 1999; Gusev et al., 2003; Bugai et al., 2005; Kaznacheyeva et al., 2001, 2007). Проводимость каналов, активированных белком Homer 1а, составила 1.3 пСм. Экстраполированный потенциал реверсии этих каналов оказался больше 50 мВ, что соответствует РВа/к > 20 для условий этих экспериментов (рис. 4Б, В). Длинная изоформа Homer 1с в концентрации 100 нМ не активировала каналы, в то время как последующее добавление Homer 1а приводило к активации каналов Imin в 27% экспериментов (рис. 4Г). Ни Homer 1а, ни Homer 1с не активировали каналы Imax.

Рис 4. Белок Homer 1а активирует каналы !„,{„.

A. Добавление 100 нМ белка Homer 1 а с цитоплазматической стороны мембранного фрагмента (конфигурация inside-out, потенциал на мембране -70 мВ), приводит к активации каналов 1га,п.

Б. Вольтамперная

характеристика токов, активированных рекомбинантным белком Homer 1а в опытах inside-out.

B. Записи токов активированных Homer 1а

при разных потенциалах на мембране.

Г. 100 нМ Homer 1с не активирует каналы 1„,ш, тогда как последующее добавление 100 нМ I-Iomer 1а активирует эти каналы. Внизу представлена запись тока в расширенном масштабе времени.

100 нМ Homer 1а

-70 мВ -Г—

0.5 пА|

30 с

-wriffmmnwm

ß 200 мс

-70 мВ

-100 -50 0

I I i | I I | | i

,.. 5рмв ¡^ч^^ЩуА - °0ц ^

-50 мВ

-0.1 о-й ПА

-30 мВ

КО. 2 ПА Л^vv^'^YV^M-V - 0.12 пА

100 нМ Homer 1с

100 нМ Homer 1а

-70 мВ

- 0.18 пА

400 мс

Из полученных данных можно сделать вывод о том, что разные изоформы Homer неодинаково действуют на каналы Imin в А431: мономерные белки Homer la активируют, а длинные изоформы Homer 1с не активируют каналы. Аналогичное действие различные изоформы белков Homer оказывают на mGluR (Ango et al., 2001) и каналы TRPC (Yuan et al., 2003; Kim et al., 2006), но не на каналы RyR (Feng et al., 2008; Pouliquin et al., 2009), которые активируются как длинными, так и короткими изоформами Homer, причем длинные изоформы активируют RyR первого типа даже сильнее, чем короткие изоформы.

Было предложено следующее объяснение действия белков семейства Homer на каналы TRPC. Поскольку белки Homer 1с могут формировать олигомеры, а короткие изоформы Homer la, у которых нет coil-coiled домена, не могут, было выдвинуто предположение, что олигомерные комплексы блокируют активность каналов, в то время как разобщение с олигомерами Homer активирует каналы (Yuan et al., 2003; Kim et al., 2006). По-видимому, аналогичным образом белки Homer регулируют и каналы Г„,т. Из наших электрофизиологических экспериментов с пептидами и рекомбинантными белками следует, что для активации каналов Imin необходим не белок Homer la сам по себе, а вызываемое им нарушение взаимодействия олигомерных комплексов Homer с белками-мишенями.

Поскольку олигомеры белков Homer организуют белки кальциевой сигнализации, можно предположить, что отделение олигомерных комплексов Homer приводит к изменению характера взаимодействия между белками-мишенями, а именно между кальциевым каналом и другими белками, в том числе и IP3R, что и активирует кальциевые каналы In,in- Такое разобщение белков-мишеней с нативными олигомерами Homer может вызываться пептидом PPKKFR, короткой изоформой Homer 1 а или 1Р3 (см. ниже). Известно, что белки Homer 1 не влияют на метаболизм фосфоинозитидов, в частности не приводят к увеличению концентрации IP3 и не изменяют выброса из 1Рз-чувствительных кальциевых депо (Shin et al., 2003). Таким образом, можно предположить, что белки Homer регулируют депо-управляемые каналы не косвенно, за счет влияния на выброс из кальциевых депо, а напрямую, за счет непосредственного воздействия на организацию как сигнального комплекса, связанного с каналом, так и самого канала

плазматической мембраны. Следовательно, несмотря на то, что каналы Imin являются депо-управляемыми в клетках А431, они, по-видимому, могут функционировать и по депо-нечувствительному механизму - в случае, когда они активируются при диссоциации комплекса, образованного белками Homer с белками-мишенями.

(4) 1Р3 нарушает взаимодействие белков Homer с IP3R1. В клетках А431 в основном экспрессируется IP3R первого типа (Глушанкова JI.H., неопубликованные данные). Как сообщалось ранее, в этих клетках депо-управляемые каналы плазматической мембраны Imi„, по-видимому, регулируются конформационным сопряжением с IP3R1 - белком эндоплазматического ретикулума (Zubov et al., 1999; Gusev et al, 2003).

В диссертационной работе показано, что белки Homer участвуют в регуляции Imi„. Данные рентгеноструктурного анализа белка IP3R указывают на близкое пространственное расположение мотива, узнаваемого белками Homer, и домена, связывающего IP3 (Bosanac et al., 2005). Известно, что 1Р3 может вызывать диссоциацию комплекса Homer с IP3R третьего типа (Kim et al., 2006). В связи с этим представляется интересным выяснить, влияет ли 1Р3 на взаимодействие IP3R первого типа с белками Homer.

А Б Рис-5-

1Рз ослабляет взаимодействие

- + 10 мкМ IP3 - + 10 мкМ IP, белков Homer с IP3RI.

кД кД

250 — :4nr;<~lpsR1 250 — <" ''к | А, Б. Результаты pull-down

ИЬ: рАЫР R1 ИБ: pAb-IP.RI экспериментов. IP3R1

инкубировался с GST-Homer 1с

75 mi»fiip;!<-GST-Homer1 с <;П _ „ (А) или GST-Homer la (Б)

50 - < -fr-GST-Homer1 а в отсутствие илй в

ИБ: pAb-GST ИБ: pAb-GST присутствии 10 мкМ 1Р3.

PD: GST-Homer

В экспериментах pull-down инкубация как микросом, обогащенных белком IP3RI, так и лизата клеток А431 с белками GST-Homer 1 показала, что IP3R1 специфично взаимодействует с рекомбинантными белками GST-Homer la и GST-

Homer lc. Если же инкубация проводилась в присутствии 1Р3, то взаимодействие IP3RI с белками Homer la или Homer 1с нарушалось (рис. 5А, Б).

Стимуляция рецепторов, связанных с PLC, увеличивает концентрацию 1Р3, который связывается с IP3R1 и активирует его, в результате чего происходит выброс кальция из депо. Кроме того, 1Р3 может разобщать взаимодействие Homer 1с с IP3R1. Как опустошение депо, так и нарушение взаимодействия белков Homer с их мишенями индуцирует активность каналов Imj„. Следовательно, 1Р3 может приводить к активации каналов Imjn не только опустошая депо, но и непосредственно вызывая диссоциацию комплекса IP3R1 /Homer 1с, то есть, изменяя характер взаимодействия канала Imin с IP3R1.

(5) Воздействие 1Р3 и разобщение взаимодействия нативных белков Homer с белками-мишенями влияют на работу каналов Imill не аддитивно.

Поскольку каналы Imin регулируются как 1Р3, так и белками Homer, возникает вопрос, аддитивно ли их действие на эти каналы.

Рис. 6. Отщепление нативных белков Homer и действие 1Р3 не аддитивны при активации каналов

lntii|.

A. Активность каналов Imj„, вызванная 100 нМ PPKKFR, не увеличивается при последующем добавлении 2.5 мкМ 1Р3.

Б. 100 нМ PPKKFR с цитоплазматической стороны

мембраны активирует каналы I„,in. Последующее добавление 2.5 мкМ 1Р3 вызывает активность каналов Imax.

B. Активность каналов Imi„, вызванная 100 нМ Homer la, не меняется при добавлении 2.5 мкМ 1Р3.

100 нМ PPKKFR

100 нМ Homer 1а

Добавление 2.5 мкМ 1Р3 к мембранным фрагментам с PPKKFR-индуцированной активностью в подавляющем большинстве опытов не приводило к дальнейшему увеличению активности каналов (рис. 6А). В аналогичных экспериментах с рекомбинантным белком Homer la, аппликация 1Р3 также не изменяла активность каналов Imln (рис. 6В). В нескольких опытах приложение 1Р3 после пептида PPKKFR активировало каналы Imax (рис. 6Б). В экспериментах, где пептид PPKKFR или рекомбинантный белок Homer la не вызывали активность каналов Imi„, 1Р3 также не активировал каналы.

Таким образом, мы показали, что разобщение нативных белков Homer с их мишенями и действие 1Р3 не аддитивны. Эти результаты хорошо согласуются с данными экспериментов pull-down, показывающими, что 1Р3 нарушает взаимодействие белков Homer с IP3R1. В совокупности эти данные позволяют предположить, что каналы Imin регулируются 1Р3 и белками Homer по одному сигнальному пути.

(6) Скорость развития активности каналов Imin, вызванной белком Homer la или пептидом PPKKFR, в клетках А431. Следующей задачей являлось сравнение параметров активации каналов Im|n пептидом PPKKFR или Homer la с активацией 1Р3 в клетках А431. В конфигурации inside-out добавление к цитозольной стороне плазматической мембраны 100 нМ рекомбинантного белка Homer la активировало каналы Imin в среднем через 168 ±18 с (рис. 7А). При потенциале на мембране -70 мВ величина NP0, отражающая уровень активности каналов, в среднем составила 1.17 ± 0.16. В аналогичных экспериментах со 100 нМ пептида PPKKFR каналы открывались в среднем с задержкой в 133 ± 20 с (рис. 7Б), а средняя величина NP0 была равна 1.32 ±0.21.

Добавление 2.5 мкМ 1Р3 вызывало активность каналов через 20 ± 4 с (рис. 7В). В среднем NP0 составляло 0.89 ± 0.23, что согласуется с характеристиками каналов Imin, полученными ранее (Kiselyov et al., 1997, 1999; Zubov et al., 1999; Gusev et al., 2003; Kaznacheyeva et al., 2001, 2007). Таким образом, полученные данные свидетельствуют о том, что активация каналов Imin, вызванная белком Homer la или пептидом PPKKFR, развивается в среднем в 7.5 раз медленнее, чем

активация, индуцируемая 1Р3.

В экспериментах по измерению интегральных токов (whole-cell) на клетках А431 пептид PPKKFR в концентрации 1 мкМ добавляли в раствор регистрирующей пипетки. Ток достигал своего максимального значения в среднем через 570 ±81 с после прорыва мембраны. Если в пипетке вместо пептида PPKKFR находился контрольный пептид PPKKRR, то развитие тока не наблюдалось. Для сравнения интегральный ток, вызванный добавлением в пипеточный раствор 2.5 мкМ 1Р3, достигал своего максимального значения в среднем за 200 с, что было продемонстрировано ранее в экспериментах whole-cell на клетках А431 (Gusev et al., 2003).

Рис. 7. Активация каналов Imi„ в клетках А431.

Результаты опытов inside-out при потенциале на мембране -70 мВ. Одиночная амплитуда канала Imj„ составляла 0.18 пА. Масштаб указан в левом нижнем углу рисунка.

A. Рекомбинантный белок Homer la в концентрации 100 нМ активирует кальциевые каналы Imjn. Активность каналов в среднем развивается спустя 168 с после добавления белка. Справа внизу показан фрагмент записи тока в расширенном временном масштабе.

Б. Приложение к цитозольной стороне плазматической мембраны 100 нМ пептида PPKKFR вызывало активность каналов Imm в среднем с задержкой в 133 с.

B. Активность кальциевых каналов In,i„ развивалась в среднем через 20 с после добавления 2.5 мкМ IPj.

На N-конце белков семейства Homer находится домен EVH1, который узнает последовательность PPXXFR в белковых мишенях (Worley et al., 2007). Поскольку

в наших экспериментах параметры активации каналов Imi„ белком Homer la и пептидом PPKKFR имели близкие значения, можно заключить, что влияние белков Homer на каналы Imin опосредовано именно доменом EVH1.

Результаты экспериментов inside-out показывают, что степень активности каналов 1т,„, вызванных 1Р3 и отделением нативных белков Homer от белков-мишеней, статистически неразличима. Однако приложение 1Р3 активировало каналы Imin значительно быстрее, чем добавление пептида PPKKFR или белка Homer la. Известно, что скорость диффузии зависит от молекулярной массы вещества, поэтому временная задержка в активации каналов Imin может быть связана с различной молекулярной массой активирующих агентов. Но поскольку и рекомбинантный белок Homer la, и пептид PPKKFR активировали каналы через сравнимый промежуток времени, несмотря на явно разный размер, то в нашем случае предположение о разной скорости диффузии неверно.

Результаты регистрации одиночных каналов хорошо согласуются с данными экспериментов whole-cell. Интегральный ток, вызванный пептидом PPKKFR, достигал своего максимального значения с гораздо большей задержкой, чем ток, вызываемый 1Р3.

Наши данные коррелируют с результатами, полученными на панкреатических клетках, выделенных из мыши с нокаутом по белку Homer 1 (Kim et al., 2006). Отсутствие в таких клетках длинной изоформы Homer 1с приводило к замедленному развитию кальциевого тока в ответ на 1Р3 в экспериментах whole-cell (Kim et al., 2006).

Известно, что в клетках А431 каналы Irain регулируются конформационным сопряжением с IP3R1 (Zubov et al., 1999; Gusev et al., 2003), а также белками семейства Homer, что продемонстрировано в данной работе. Более того, 1Р3 нарушает взаимодействие IP3R и белков Homer (Kim et al., 2006). Однако, в отличие от 1Р3, рекомбинантный белок Homer la или пептид PPKKFR вызывают разобщение нативных белков Homer не только с IP3R, но и с другими белками-мишенями. Возможно, в этом и заключается причина различий во времени активации каналов.

выводы

1. Разобщение взаимодействия белков Homer с их белками-мишенями, вызванное пептидом PPKKFR, приводит к активации кальциевого входа в экспериментах whole-cell на клетках А431.

2. Из четырех типов депо-управляемых каналов клеток А431 в экспериментах inside-out только каналы Im¡„ активировались разъединением нативных белков Homer с их белками-мишенями.

3. Мономериая изоформа Homer la активирует каналы Im¡„, тогда как олигомеры Homer 1с не вызывают активации. Следовательно, различные изоформы белков Homer по-разному воздействуют на кальциевые каналы клеток А431.

4.1Р3 приводит к нарушению взаимодействия белков Homer с белками IP3R1. Следовательно, 1Р3 может активировать депо-управляемые каналы, не только опустошая депо, но и за счет разобщения взаимодействия олигомерных комплексов Homer с IP3R1.

5. Действие пептида PPKKFR или белка Homer la и действие 1Р3 на каналы Imin не аддитивны. Развитие активности каналов Imin, индуцированное пептидом PPKKFR или белком Homer la, происходит гораздо медленнее, чем активация каналов Ira¡n в ответ на 1Р3.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Шалыгин A.B., Рязанцева М.А., Глушанкова Л.Н., Безпрозванный И.Б., Можаева Г.Н., Казначеева Е.В. Регуляция депо-управляемых кальциевых каналов белками семейства Homer в клетках А431 //Acta naturae, 2010, Т. 2, № 3, С. 109-115.

2. Shalygin A., Ryazantseva М, Glushankova L., Mozhayeva GN., Bezprozvanny I, Kaznacheyeva E. Homer regulation of native plasma membrane calcium channels in A431 cells // Cell Calcium, 2010, V.48, № 4, P. 209-214.

3. Рязанцева M.A., Шалыгин A.B. Вход кальция в клетку в результате диссоциации комплексов адаптерных белков семейства Homer в клетках линии А431 и линии SK-N-SH // Материалы II конференции молодых ученых Института цитологии РАН, Санкт-Петербург, 15-16 февраля 2010, Цитология, 2010, Т. 52, № 6, с. 504-505.

4. Шалыгин A.B., Рязанцева М.А., Казначеева E.B. Регулирование депо-управляемых каналов клеток А431 адаптерными белками Homer // Материалы II конференции молодых ученых Института цитологии РАН, Санкт-Петербург, 15-16 февраля 2010, Цитология, 2010, Т. 52, № 6, с. 511-512.

5. Рязанцева М.А., Шалыгин A.B. Участие белков Homer la и Homer 1с в регуляции активности депо-управляемых кальциевых каналов в клетках А431 // Двенадцатая Всероссийская медико-биологическая конференция «Фундаментальная наука и клиническая медицина», Санкт-Петербург, 18 апреля 2009, СПб.: Изд-во СПбГУ, 2009, с. 322-323.

6. Рязанцева М.А., Шалыгин A.B., Казначеева Е.В. Роль адаптерных белков семейства Homer в регуляции депо-управляемого входа кальция в клетках А431 // Материалы научной конференции "Ионные каналы: структура и функции", Санкт-Петербург, 17-18 марта 2009, Биологические мембраны, 2009, Т. 26, №. 3, с. 328.

7. Шалыгин A.B., Казначеева Е.В. Роль белков Homer в регуляции депо-управляемых каналов клеток А431 // VI съезд Российского общества биохимиков и молекулярных биологов, Новосибирск, 11-15 мая 2008, Новосибирск: Изд-во «Арта», 2008, с. 174.

8. Шалыгин A.B., Казначеева Е.В. Белок Homer как регулятор депо-управляемого входа кальция в клетках А431 // Всероссийский форум студентов, аспирантов и молодых ученых "Наука и инновации в технических университетах", Санкт-Петербург, октябрь 2007, СПб.: Изд-во Политехи, ун-та, 2007, с. 169.

9. Шалыгин A.B., Казначеева Е.В. Участие белков Homer в регуляции депо-управляемого входа кальция в клетки А431 // Материалы международной конференции "Рецепция и внутриклеточная сигнализация", Пущино, 5-7 июня 2007, с. 75.

10. Шалыгин A.B., Казначеева Е.В. Депо-управляемые кальциевые каналы в плазматической мембране клеток линии эмбрионального эпителия почки человека // Материалы конференций политехнического симпозиума "Молодые ученые промышленности Северо-Западного региона", Санкт-Петербург, 8 декабря 2006, СПб.: Изд-во Политехи, ун-та, 2006, с. 205-206.

11. Шалыгин A.B., Казначеева Е.В. Роль адаптерных белков семейства Homer в регуляции кальциевых каналов в клетках эпидермоидной карциномы человека // Материалы всероссийской межвузовской научно-технической конференции студентов и аспирантов "XXXIV неделя науки СПбГПУ", Санкт-Петербург, 1-2 декабря 2005, СПб.: Изд-во Политехи, ун-та, 2006,4.IV, с. 17-18.

СПИСОК ЦИТИРОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ

Ango F., Prézeau L., MullerT., et al. //Nature. 2001. V. 411. № 6840. P. 962-965. Bezprozvanny I. //Trends Mol. Med. 2009. V. 15. № 3. P. 89-100. Bosanac I., Yamazaki H„ Matsu-Ura Т., et al. // Mol. Cell. 2005. V. 17. P. 193-203. Bugaj V., Alexeenko V., Zubov A., et al. // J. Biol. Chem. 2005. V. 280. P. 16790-16797. Feng W„ Tu J., Yang Т., et al. // J. Biol. Chem. 2002. V. 277. № 47. P. 44722-44730. Feng W., Tu J., Pouliquin P., et al. // Cell Calcium. 2008. V. 43. № 3. P. 307-314. Feske S., Gwack Y., Prakriya M., et al. // Nature. 2006. V. 441. № 7090. P. 179-185. Gusev K., Glouchankova L., Zubov A., et al. // J. Gen. Physiol. 2003. V. 122. P. 81-94. Hayashi M.K., Tang C., Verpelli C„ et al. // Cell. 2009. V. 137. № 1. P. 159-171. Kaznacheyeva E., Lupu V.D., Bezprozvanny I. // J. Gen. Physiol. 1998. V. 111. P. 847856.

Kaznacheyeva E., Zubov A., Gusev K., Bezprozvanny I., Mozhayeva G N. // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2001. V. 98. P. 148-153.

Kaznacheyeva E., Glushankova L., Bugaj V., et al. // J. Biol. Chem. 2007. V. 282. № 32. P. 23655-23662.

Kim J.Y., Zeng W„ Kiselyov K., et al. // J. Biol. Chem. 2006. V. 281. № 43. P. 3254032549.

Kiselyov К. I., Mamin A. G, Semyonova S. В., Mozhayeva G N. // FEBS Lett. 1997. V. 407. P. 309-312.

Kiselyov К. I., Semyonova S. В., Mamin A. G, Mozhayeva G N. // Pflügers Arch. 1999. V. 437. P. 305-314.

Liou J., Kim M.L., Heo W.D, et al. // Curr. Biol. 2005. V. 15. № 13. P. 1235-1241. Manjarrés I.M., Rodríguez-García A., Alonso M.T., García-Sancho J. // Cell Calcium. 2010 V. 47. №5. P. 412-418.

McCarl C.A., Picard C., Khalil S., et al. //J. Allergy Clin. Immunol. 2009. V. 124. № 6. P. 1311-1318.

Oh-Hora M„ Yamashita M., Hogan P.G., et al. // Nat. Immunol. 2008. V. 9. № 4. P. 432443.

Parekh A.B., Putney J.W. Jr. // Physiol. Rev. 2005. V. 85. № 2. P. 757-810.

Pouliquin P., Pace S.M., Dulhunty A.F.// Pflügers Arch. 2009. V. 458. P. 723-732.

Shin D.M., Dehoff M.D., Luo X., et al. // J. Cell Biol. 2003. V. 162. P. 293-303.

Tu J.C., Xiao В., Yuan J. P., et al. //Neuron. 1998. V. 21. P. 717-726.

Wang Y., Deng X., Zhou Y„ et al. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2009. V. 106. № 18. P.

7391-7396.

Worley P.F., Zeng W„ Huang G, et al. // Cell Calcium. 2007. V. 42. № 4-5. P. 363-371.

Yuan J.P, Kiselyov K„ Shin D. M., et al. // Cell. 2003. V. 114. P. 777-789.

Zubov A. I., Kaznacheeva E. V., Nikolaev A. V., et al. // J. Biol. Chem. 1999. V. 274. P.

25983-25985.

Николаев А.В., Скопин А.Ю., Казначеева E.B. // Биологические мембраны. 2004. Т. 21. №6. С. 451-457.

Лицензия ЛР № 020593 от 07.08.97

Подписано в печать 24.12.2010. Формат 60x84/16. Печать цифровая. Усл. печ. л. 1,0. Уч.-изд. л. 1,0. Тираж 100. Заказ 6960Ь.

Отпечатано с готового оригинал-макета, предоставленного автором, в Цифровом типографском центре Издательства Политехнического университета. 195251, Санкт-Петербург, Политехническая ул., 29. Тел.: (812) 550-40-14 Тел./факс: (812) 297-57-76

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Шалыгин, Алексей Вадимович

Список сокращений'. введение:.

1. обзор литературы.

1.1. Депо-управляемый вход кальция.

1.1.1. Молекулярный состав депо-управляемых каналов.

1.1.2. Депо-управляемые каналы в клетках А431.

1.2. Белки семейства Stim.

1.2.1. Структура и функции доменов белков Stim.

1.2.2. Роль белков Stim в кальциевой сигнализации клеток.19f

1.3. Адаптерные белки семейства Homer.

Г.3.1. Изоформы белков Homer и регуляция их концентрации.

1.3.2. Структура,белков Homer.

1.3.3. Белки Homer определяют морфологию дендритных шипиков.

1.3.4. Взаимодействие белков Homer с белками*кальциевой сигнализации.

1.3.5. Регуляция локализации mGluR белками Homer.

1.3.6. Участие белков Homer в сигнальных каскадах.

1.3.7. Homer участвует в регуляции направления конуса роста аксона.

1.3.8. Взаимодейстиве белков Homer с белками RyR.

1.3.9. Регуляция каналов TRPC белками Homer.

2. постановка задачи.

3. материалы и методы.

3.1. Материалы и клетки.

3.2. Метод локальной фиксации потенциала (patch clamp).

3.3. Электрофорез и иммуноблотгинг (ИБ).

3.4. Экспрессия и очистка рекомбинантных белков GST-Homer 1с и GST-Homer la.

3.5. Получение микросом, обогащенных IP3R первого типа (IP3R1).

3.6. Клеточный лизат и эксперименты pull-down (PD).

4. результаты.

4.1. В клетках А431 экспр е с сиру ются длинные изоформы белков семейства Homer.

4.2. Разобщение белков Homer с белками-мишенями, вызванное пептидом PPKKFR; активирует вход кальция в клетках А431.

4.3. К отделению белков Homer от белков-мишеней, вызванному пептидом PPKKFR, чувствительны каналы но не каналы Imax.

4.4. Каналы Imin активируются изоформой Homer 1а, но не Homer 1с.

4.5.1Р3 нарушает взаимодействие белков Homer с IP3R1.

4.6. Воздействие 1Рз и разобщение взаимодействия нативных белков Homer с белками-мишенями влияют на работу каналов неаддитивно.

4.7. Скорость развития активности каналов Imi„, вызванной белком Homer 1а или пептидом PPKKFR, в клетках А431.

5. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ.

6. выводы.

Благодарности.

Список публикаций по теме диссертации.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Участие белков семейства Homer в регуляции депо-управляемого входа кальция в клетки А-431"

Актуальность проблемы. Все живые организмы используют кальций в качестве внутриклеточного посредника. В покое его концентрация' в цитоплазме поддерживается? на очень низком уровне - 10"7 М, и поэтому может быть быстро повышена (Parekh and Putney, 2005). Клетка может повысить концентрацию кальция в цитоплазме за счет выброса кальция из внутриклеточных депо или за счет входа кальция из внеклеточной среды через плазматическую мембрану (ПМ). Быстрый выброс кальция из внутриклеточных хранилищ происходит через рецепторы инозитол 1,4,5-трисфосфата (IP3R), которые являются кальциевыми каналами эндоплазматического ретикулума (ЭР) и открываются после связывания с инозитол 1,4,5-трисфосфатом (IP3). В электроневозбудимых клетках основной путь входа кальция из внеклеточной среды - это депо-управляемые каналы (store-operated channels - SOC), которые активируются в ответ на опустошение внутриклеточных кальциевых депо.

В разных тканях были описаны депо-управляемые каналы» с различными биофизическими характеристиками, что предполагает различный молекулярный состав таких каналов (Parekh and Putney, 2005). На сегодняшний день известны два семейства трансмембранных белков, составляющих депо-управляемые каналы: TRPC и Orai. Однако точный молекулярный состав большинства депо-управляемых каналов пока не определен, поскольку TRPC и Orai могут образовывать гетеро- и гомоолигомеры, а белки семейства TRPC и Orai представлены несколькими изоформами, например, у млекопитающих экспрессируется семь изоформ белков TRPC и три изоформы белков Orai (Parekh and Putney, 2005; Feske et al., 2006).

Основная гипотеза передачи сигнала от опустошенного депо к каналам плазматической мембраны - это гипотеза конформационного сопряжения, подразумевающая прямое взаимодействие белков ПМ (TRPC и Orai) с белками ЭР (IP3R и Stim) (Parekh and Putney, 2005; Wang et al., 2009). В недавних работах была экспериментально продемонстрирована колокализация элементов депо-управляемого входа: кальциевой АТФазы - SERCA (закачивающей кальций в депо), IP3R (через который выбрасывается кальций из депо), Stim (являющегося кальциевым сенсором ЭР) и белков ПМ, формирующих пору SOC (Wang et al., 2009; Manjarrés et al., 2010). Однако, неясно, как осуществляется такое близкое расположение белков.

В нервных клетках были описаны адаптерные белки семейства Homer, которые колокализовали метаботропный глутаматный рецептор (mGluR) ПМ и IP3R ЭР (Tu et al., 1998). Позже было показано, что Homer может также взаимодействовать с кальциевой АТФазой, рианодиновым рецептором (RyR), TRPC (Yuan et al., 2003; Kim et al., 2006) и другими белками. Более того, в нервных клетках адаптерные белки Homer и Shank образуют сетеподобную структуру, которая организует постсинаптические белки (Hayashi et al., 2009). На N-конце белков Homer расположен домен EVH1, позволяющий им узнавать свои мишени, а именно аминокислотную последовательность PPXXF — пролин, пролин, две любые аминокислоты, фенилаланин. Среди изоформ белков Homer есть две принципиально разные группы: длинные и короткие изоформы. На С-конце длинных изоформ находится домен coil-coiled, позволяющий образовывать им олигомеры. У короткой изоформы, образующейся при альтернативном сплайсинге, этот домен отсутствует (Worley et al., 2007). Длинные изоформы образуют тетрамеры с антипараллельной укладкой С-концов и четырьмя доменами EVH1, такая структура позволяет им колокализовать белки кальциевой сигнализации (Hayashi et al., 2009). Поскольку короткие изоформы не могут олигомеризоваться, они тем самым служат негативными регуляторами функции длинных Homer. Помимо колоколизации (или участия в организации) элементов кальциевого входа, было показано, что Homer может модулировать активность mGluR (Ango et al., 2001), a также ионных каналов RyR (Feng et al., 2002) и TRPC (Yuan et al., 2003; Kim et al., 2006).

Было выдвинуто предположение, что адаптерные белки Homer могут участвовать в регуляции депо-управляемых каналов. В клетках часто присутствуют несколько типов депо-управляемых каналов, например в клетках А431 ранее были описаны четыре типа депо-управляемых каналов: Imin, Imax, ICRAC, INS (Kaznacheyeva et al., 2007). Предыдущие исследования, подтверждающие роль белков Homer в регуляции депо-управляемых каналов, проводились с использованием метода локальной фиксации потенциала в конфигурации whole-cell или флуоресцентных измерений внутриклеточной концентрации кальция (Yuan et al., 2003; Kim et al., 2006). Поскольку в этих экспериментах регистрировался суммарный вход кальция через все типы кальциевых каналов клеток, оставалось неизвестным, какие конкретно типы депо-управляемых каналов регулируются белками семейства Homer.

1. Выяснить, может ли разобщение белков Homer с белками-мишенями активировать вход кальция.

3. Исследовать влияние на вход кальция различных изоформ белков Homer.

4. Изучить взаимодействие белков Homer с IP3R первого типа.

5. Сравнить активацию каналов, вызванную 1Р3, пептидом PPKKFR и белками Homer.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Адаптерные белки семейства Homer участвуют в регуляции депо-управляемых каналов в клетках А431.

2. Разные типы депо-управляемых каналов имеют разную чувствительность к белкам Homer.

3. Разные изоформы белков семейства Homer оказывают неодинаковое влияние на депо-управляемые каналы.

4.1Р3 нарушает взаимодействие Homer и IP3R первого типа.

Научная новизна исследования. В настоящей работе впервые описаны Ношег-чувствительные каналы в клетках А431. Впервые показано, что Homer неодинаково действует на разные типы депо-управляемых каналов ПМ, что позволяет различить механизмы активации каналов Im;n и Imax. Впервые показано, что 1Р3 разрушает взаимодействие IP3RI и Homer. Предложен новый механизм действия IP3 на депо-управляемые каналы.

Теоретическое и практическое значение работы. Множество клеточных процессов регулируются изменениями внутриклеточной концентрации кальция

Parekh and Putney, 2005). Несмотря на то, что основные белки, вовлеченные в этот процесс, уже известны, непонятным остается механизм колокализации этих белков. Данное исследование вносит существенный вклад в понимание организации и функционирования депо-управляемых кальциевых каналов.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Заключение Диссертация по теме "Клеточная биология, цитология, гистология", Шалыгин, Алексей Вадимович

6. выводы

2. Из четырех типов депо-управляемых каналов клеток А431 в экспериментах inside-out только каналы Im;n активировались разъединением нативных белков Homer с их белками-мишенями.

3. Мономерная изоформа Homer la активирует каналы 1т;п, тогда как олигомеры Homer 1с не вызывают активации. Следовательно, различные изоформы белков Homer по-разному воздействуют на кальциевые каналы клеток А431.

4.1Р3 приводит к нарушению взаимодействия белков Homer с белками IP3R1. Следовательно, 1Р3 может активировать депо-управляемые каналь1, не только опустошая депо, но и за счет разобщения взаимодействия олигомерных комплексов Homer с IP3R1.

БЛАГОДАРНОСТИ

Выражаю глубокую признательность своему научному руководителю Елене Валентиновне Казначеевой за неоценимую помощь на всех этапах работы.

Искренне благодарю коллег по Лаборатории ионных каналов клеточных мембран за сотрудничество, поддержку и доброжелательность. iirn

1. Шалыгин A.B., Рязанцева М.А., Глушанкова JI.H., Безпрозванный И.Б., Можаева Г.Н., Казначеева Е.В. Регуляция депо-управляемых кальциевых каналов белками семейства Homer в клетках А431 //Acta naturae, 2010, Т. 2, № 3, С. 109-115.

2. Shalygin A., Ryazantseva М., Glushankova L., Mozhayeva G.N., Bezprozvanny I., Kaznacheyeva E. Homer regulation of native plasma membrane calcium channels in A431 cells // Cell Calcium, 2010, V.48, № 4, P. 209-214.

4. Шалыгин A.B., Рязанцева М.А., Казначеева Е.В. Регулирование депо-управляемых каналов клеток А431 адаптерными белками Homer // Материалы II конференции молодых ученых Института цитологии РАН, Санкт-Петербург, 15-16 февраля 2010, Цитология, 2010, Т. 52, № 6, с. 511-512.

9. Шалыгин A.B., Казначеева E.B. Участие белков Homer в регуляции депо-управляемого входа кальция в клетки А431 // Материалы международной конференции "Рецепция и внутриклеточная сигнализация", Пущино, 5-7 июня 2007, с. 75.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Шалыгин, Алексей Вадимович, Санкт-Петербург

1. Abe H., Misaka T., Tateyama M., Kubo Y. Effects of coexpression with Homer isoforms on the function of metabotropic glutamate receptor 1 alpha // Mol. Cell Neurosci., 2003, V. 23, No 2, P. 157-168.

2. Ageta H., Kato A, Fukazawa Y., Inokuchi K., Sugiyama H. Effects of proteasome inhibitors on the synaptic localization of Vesl-lS/Homer-la proteins. // Mol. Brain Res., 2001, V. 97., No 2, P. 186-189.

3. Al-Hallaq R. A., Conrads T. P., Veenstra T. D., Wenthold R.J. NMDA di-heteromeric receptor populations and associated proteins in rat hippocampus // J. Neurosci., 2007, V. 27, No 31, P. 8334-8343.

4. Ango F., Prézeau L., Muller T., Tu J. C., Xiao B., Worley P. F., Pin J. P., Bockaert J., Fagni L. Agonist-independent activation of metabotropic glutamate receptors by the intracellular protein Homer //Nature, 2001, V. 411, No 6840, P. 962-965.

5. Ango F., Robbe D., Tu J. C., Xiao B., Worley P. F., Pin J. P., Bockaert J., Fagni L. Homer-dependent cell surface expression of metabotropic glutamate receptor type 5 in neurons // Mol. Cell Neurosci., 2002, V. 20, No 2, P. 323-329.

6. Bauer M. C., O'Connell D., Cahill D. J., Linse S. Calmodulin binding to the polybasic C-termini of STIM proteins involved in store-operated calcium entry. // Biochemistry, 2008, V. 47, No 23, P. 6089-6091.

7. Beneken J., Tu J. C., Xiao B., Nuriya M., Yuan J. P., Worley P. F., Leahy D J. Structure of the Homer EVH1 domain-peptide complex reveals a new twist in polyproline recognition. //Neuron, 2000, V. 26,No 1, P. 143-154.

8. Bertaso F., Roussignol G., Worley P., Bockaert J., Fagni L., Ango F. Homerla-dependent crosstalk between NMDA and metabotropic glutamate receptors in mouse neurons. // PLoS One, 2010, V. 5, No 3, e9755.

9. Bezprozvanny I. Amyloid goes global. // Sci. Signal, 2009, V. 2, Iss. 63, pel6.

10. Bird G. S., Hwang S. Y., Smyth J. T., Fukushima M., Boyles R. R., Putney J. W. Jr. STIM1 is a calcium sensor specialized for digital signaling. // Curr. Biol., 2009, V. 19, No 20, P. 1724-1729.

11. Bortoloso E., Pilati N., Megighian A., Tibaldo E., Sandona D., Volpe P. Transition of Homer isoforms during skeletal muscle regeneration. // Am. J. Physiol. Cell Physiol., 2006, V. 290, No 3, P. 711-718.

12. Bosanac I., Michikawa T., Mikoshiba K., Ikura M. Structural insights into the regulatory mechanism of IP3 receptor // Biochim. Biophys. Acta., 2004, V. 1742, No. 13, P. 89-102.

13. Brakeman P. R., Lanahan A. A., O'Brien R., Roche K., Barnes C. A., Huganir R. L., Worley P. F. Homer: a protein that selectively binds metabotropic glutamate receptors //Nature, 1997, V.386, No.6622, P. 284-288.

14. Brandman O., Liou J., Park W. S., Meyer T. STIM2 is a feedback regulator that stabilizes basal cytosolic and endoplasmic reticulum Ca2+ levels // Cell, 2007, V. 131, No. 7, P. 1327-1339.

15. Ciruela F., Soloviev M. M., Chan W. Y., Mcllhinney R. A. Homer-1 c/Vesl- 1L modulates the cell surface targeting of metabotropic glutamate receptor type 1 alpha: evidence for an anchoring function // Mol. Cell Neurosci., 2000, V. 15, No. 1, P. 36-50.

16. Ciruela F., Soloviev M. M., Mcllhinney R. A. Co-expression of metabotropic glutamate receptor type 1 alpha with homer-la/Vesl-IS increases the cell surface expression of the receptor// Biochem. J., 1999, V.341, Pt. 3, P. 795-803.

17. Das S. S., Banker G. A. The role of protein interaction motifs in regulating the polarity and clustering of the metabotropic glutamate receptor mGluRla // J. Neurosci., 2006, V. 26, No. 31, P. 8115-8125.

18. Ercan E., Momburg F., Engel U., Temmerman K., Nickel W., Seedorf M. A conserved, lipid-mediated sorting mechanism of yeast Ist2 and mammalian STIM proteins to the peripheral ER// Traffic, 2009, V. 10, No. 12, P. 1802-1818.

19. Feng W., Tu J., Pouliquin P., Cabrales E., Shen X., Dulhunty A., Worley P. F., Allen P. D., Pessah I. N. Dynamic regulation of ryanodine receptor type 1 (RyRl) channel activity by Homer 1 // Cell Calcium, 2008, V. 43, No. 3, P. 307-314.

20. Feng W., Tu J., Yang T., Vernon P. S., Allen P. D., Worley P. F., Pessah I. N. Homer regulates gain of ryanodine receptor type 1 channel complex // J. Biol. Chem., 2002, V. 277, No. 47, P. 44722-44730.

21. Feske S., Gwack Y., Prakriya M., Srikanth S., Puppel S. H., Tanasa B., Hogan P.G., Lewis R.S., Daly M., Rao A. A mutation in Orail causes immune deficiency by abrogating CRAC channel function //Nature, 2006, V. 441, No. 7090, P. 179-1852.

22. Foa L., Gasperini R. Developmental roles for Homer: more than just a pretty scaffold // J. Neurochem., 2009, V. 108, No. 1, P. 1-10.

23. Gasperini R., Choi-Lundberg D., Thompson M. J., Mitchell C.B., Foa L. Homer regulates calcium signalling in growth cone turning //Neural. Dev., 2009, V. 4, P. 29.

24. Gasperini R., Foa L. Homer lb/c expression correlates with zebrafish olfactory system development // J. Neurocytol., 2004, V. 33, No. 6, P. 671-680.

25. Hayashi M. K., Ames H. M., Hayashi Y. Tetrameric hub structure of postsynaptic scaffolding protein homer // J. Neurosci., 2006, V. 26, No. 33, P. 8492-8501.

26. Hayashi M. K., Tang C., Verpelli C., Narayanan R., Stearns M. H., Xu R. M., Li H., Sala C., Hayashi Y. The postsynaptic density proteins Homer and Shank form a polymeric network structure // Cell, 2009, V. 137, No. 1, P. 159-171.

27. Hennou S., Kato A., Schneider E. M., Lundstrom K., Gahwiler B. H., Inokuchi K., Gerber U., Ehrengruber M. U. Homer-1 a/Vesl-1S enhances hippocampal synaptic transmission // Eur. J. Neurosci., 2003, V. 18, No. 4, P. 811-819.

28. Hewavitharana T., Deng X., Wang Y., Ritchie M. F., Girish G. V., Soboloff J., Gill D. L. Location and function of STIM1 in the activation of Ca2+ entry signals // J. Biol. Chem., 2008, V. 283, No. 38, P. 26252-26262.

29. Hoth M., Penner R. Depletion of intracellular calcium stores activates a calcium current in mast cells //Nature, 1992, V. 355, P. 353-356.

30. Huang W. D., Fei Z., Zhang X. Traumatic injury induced homer-la gene expression in cultured cortical neurons of rat // Neurosci. Lett., 2005, V. 389, No. 1, P. 46-50.

31. Ishibashi T., Ogawa S., Hashiguchi Y., Inoue Y., Udo H., Ohzono H., Kato A., Minakami R., Sugiyama H. A novel protein specifically interacting with Homer2 regulates ubiquitin-proteasome systems // J. Biochem., 2005, V. 137, No. 5, P. 617-23.

32. Smyth J. T., Dehaven W. I., Jones B. F., Mercer J. C., Trebak M., Vazquez G., Putney J. W. Jr. Emerging perspectives in store-operated Ca2+ entry: roles of orai, stim and trp // Biochimica Et Biophysica Acta, 2006, V. 1763, No. 11, P. 1147-1160.

33. Kammermeier P. J., Worley P. F. Homer la uncouples metabotropic glutamate receptor 5 from postsynaptic effectors // Proc. Natl. Acad. Sci. U S A., 2007, V. 104, No. 14, P. 6055-6060.

34. Kammermeier P. J., Xiao B., Tu J. C., Worley P. F., Ikeda S.R. Homer proteins regulate coupling of group I metabotropic glutamate receptors to N-type calcium and M-type potassium channels // J. Neurosci., 2000, V. 20, No. 19, P. 7238-7245.

35. Kammermeier P.J. Endogenous homer proteins regulate metabotropic glutamate receptor signaling in neurons // J. Neurosci., 2008, V. 28, No. 34, P. 8560-8567.

36. Kammermeier P.J. Surface clustering of metabotropic glutamate receptor 1 induced by long Homer proteins // BMC Neurosci., 2006, V. 7, P. 1.

37. Kane J.K., Hwang Y., Konu O., Loughlin S. E., Leslie F. M., Li M. D. Regulation of Homer and group I metabotropic glutamate receptors by nicotine // Eur. J. Neurosci., 2005, V. 21, No. 5, P. 1145-1154.

38. Kato A., Fukazawa Y., Ozawa F., Inokuchi K., Sugiyama H. Activation of ERK cascade promotes accumulation of Vesl-lS/Homer-la immunoreactivity at synapses // Brain Res Mol. Brain Res., 2003, V. 118. No. 1-2, P. 33-44.

39. Kato A., Ozawa F., Saitoh Y., Fukazawa Y., Sugiyama H., Inokuchi K. Novel members of the Vesl/Homer family of PDZ proteins that bind metabotropic glutamate receptors // J. Biol. Chem., 1998, V. 273, No. 37, P. 23969-23975.

40. Kato A., Ozawa F., Saitoh Y., Hirai K., Inokuchi K. Vesl, a gene encoding VASP/Ena family related protein, is upregulated during seizure, long-term potentiation and synaptogenesis //FEBS Lett., 1997, V. 412, No. 1, P. 183-189.

41. Kawaguchi S., Shoji S., Sunamori M., Furuichi T., Kawano S. The fundamental properties of Homer 1 in association with cardiac ryanodine receptor in mouse heart // J. Med. Dent. Sci., 2007, V. 54, No. 1, P. 103-108.

42. Kaznacheyeva E., Lupu V. D., Bezprozvanny I. Single-channel properties of inositol (l,4,5)-trisphosphate receptor heterologously expressed in HEK-293 cells // J. Gen. Physiol., 1998, V. 111, No. 6, P. 847-856.

43. Kiselyov K., Mignery G. A., Zhu M. X., Muallem S. The N-terminal domain of the IP3 receptor gates store-operated hTrp3 channels // Mol. Cell, 1999, V. 4, No. 3, P. 423-429.

44. Kiselyov K., Xu X., Mozhayeva G., Kuo T., Pessah I., Mignery G., Zhu X., Birnbaumer L., Muallem S. Functional interaction between InsP3 receptors and store-operated Htrp3 channels //Nature, 1998, V. 396,No. 6710,P. 478-482.

45. Kiselyov K. I., Mamin A. G., Semyonova S. B., Mozhayeva G. N. Low-conductance high selective inositol (l,4,5)-trisphosphate activated Ca2+ channels in plasma membrane of A431 carcinoma cells // FEBS Lett., 1997, V. 407, No. 3, P. 309312.

46. Kiselyov K.I., Semyonova S.B., Mamin A.G., Mozhayeva G.N. Miniature Ca2+ channels in excised plasma-membrane patches: activation by IP3 // Pflugers Arch., 1999, V. 437, No. 2, P. 305-314.

47. Li X., Yang D., Li L., Peng C., Chen S., Le W. Proteasome inhibitor lactacystin disturbs the intracellular calcium homeostasis of dopamine neurons in ventral mesencephalic cultures // Neurochem. Int., 2007, V. 50, No. 7-8, P. 959-965.

48. Liou J., Kim M. L., Heo W. D., Jones J. T., Myers J. W., Ferrell J. E. Jr., Meyer T. STIM is a Ca2+ sensor essential for Ca2+-store-depletion-triggered Ca2+ influx // Curr. Biol., 2005, V. 15, No. 13, P. 1235-1241.

49. Lu J., Helton T.D., Blanpied T.A., Rácz B., Newpher T.M., Weinberg R.J., Ehlers M.D. Postsynaptic positioning of endocytic zones and AMPA receptor cycling by physical coupling of dynamin-3 to Homer // Neuron, 2007, V. 55, No. 6, P. 874-89.

50. Manjarrés I.M., Rodríguez-García A., Alonso M.T., García-Sancho J. The sarco/endoplasmic reticulum Ca(2+) ATPase (SERCA) is the third element in capacitative calcium entry // Cell Calcium, 2010, V. 47, No. 5, P. 412-418.

51. Mao L., Yang L., Tang Q., Samdani S., Zhang G., Wang J. Q. The scaffold protein Homerlb/c links metabotropic glutamate receptor 5 to extracellular signal-regulated protein kinase cascades in neurons // J. Neurosci., 2005, V. 25, No. 10, P. 2741-2752.

52. Mignen O., Thompson J. L., Shuttleworth T. J. Orail subunit stoichiometry of the mammalian CRAC channel pore // J. Physiol., 2008, V. 586, No. 2, P. 419-425.

53. Mizutani A., Kuroda Y., Futatsugi A., Furuichi T., Mikoshiba K. Phosphorylation of Homer3 by calcium/calmodulin-dependent kinase II regulates a coupling state of its target molecules in Purkinje cells // J, Neurosci., 2008, V. 28, No. 20, P. 5369-5382.

54. Prakriyal M., Feske S., Gwack Y., Srikanth S., Rao A., Hogan P. G. Orail is an essential pore subunit of the crac channel //Nature, 2006, V. 44, No. 7108, P. 230-233

55. Okabe S., Urushido T., Konno D., Okado H., Sobue K. Rapid redistribution of the postsynaptic density protein PSD-Zip45 (Homer lc) and its differential regulation by NMDA receptors and calcium channels // J. Neurosci., 2001, V. 21, No. 24, P. 95619571.

56. Okada D., Ozawa F., Inokuchi K. Input-specific spine entry of soma-derived Vesl-1S protein conforms to synaptic tagging // Science, 2009, V. 324, No. 5929, P. 904-909.

57. Parekh A. B., Putney J.W. Jr. Store-operated calcium channels // Physiol. Rev., 2005, V. 85, No. 2, P. 757-810.

58. Parvez S., Beck A., Peinelt C., Soboloff J., Lis A., Monteilh-Zoller M., Gill D. L., Fleig A., Penner R. STIM2 protein mediates distinct store-dependent and store-independent modes of CRAC channel activation // FASEB J., 2008, V. 22, No. 3, P. 752761.

59. Paschen W., Mengesdorf T. Conditions associated with ER dysfunction activate homer la expression // J. Neurochem., 2003, V. 86, No. 5, P. 1108-1115.

60. Penna A., Demuro A., Yeromin A. V., Zhang S.L., Safrina O., Parker I., Cahalan M. D. The CRAC channel consists of atetramer formed by Stim-induced dimerization of Orai dimers / Nature, 2008, V. 456, No. 7218, P. 116-120.

61. Pouliquin P., Dulhunty A.F. Homer and the ryanodine receptor // Eur. Biophys. J., 2009a, V. 39, No. 1, P. 91-102.

62. Pouliquin P., Pace S. M., Dulhunty A.F. In vitro modulation of the cardiac ryanodine receptor activity by Homer 1. // Pflugers Arch., 2009b, V. 458, No. 4, P. 723732.

63. Putney J. W. Capacitative calcium entry: from conceptn to molecules // Immunol. Rev., 2009, V. 231, No. 1, P. 10-22.

64. Rezvani K., Mee M., Dawson S., Mcllhinney J., Fujita J., Mayer R.J. Proteasomal interactors control activities as diverse as the cell cycle and glutaminergic neurotransmission//Biochem. Soc. Trans., 2003, V. 31, No. 2, P. 470-473.

65. Rezvani K., Teng Y., Shim D., De Biasi M. Nicotine regulates multiple synaptic proteins by inhibiting proteasomal activity // J. Neurosci., 2007, V. 27, No. 39, P. 1050810519.

66. Roche K. W., Tu J. C., Petralia R. S., Xiao B., Wenthold R. J., Worley P. F. Homer lb regulates the trafficking of group I metabotropic glutamate receptors // J. Biol. Chem., 1999, V. 274, No. 36, P. 25953-25957.

67. Ronesi J. A., Huber K. M. Homer interactions are necessary for metabotropic glutamate receptor-induced long-term depression and translational activation // J. Neurosci., 2008, V. 28, No. 2, P. 543-547.

68. Rong R., Ahn J. Y., Huang H., Nagata E., Kalman D., Kapp J. A., Tu J., Worley P. F., Snyder S. H., Ye K. PI3 kinase enhancer-Homer complex couples mGluRI to PI3 kinase, preventing neuronal apoptosis // Nat. Neurosci., 2003, V. 6, No. 11, P. 11531161.

69. Roos J., DiGregorio P. J., Yeromin A. V., Ohlsen K., Lioudyno M., Zhang S., Safrina O., Kozak J. A., Wagner S. L., Cahalan M. D., Veli9elebi G., Stauderman K. A.

70. STIM1, an essential and conserved component of store-operated Ca2+ channel function // J. Cell Biol., 2005, V. 169, No.3, P. 435-445.

71. Rosenblum K., Futter M., Voss K., Erent M., Skehel P. A., French P., Obosi L., Jones M. W., Bliss T. V. The role of extracellular regulated kinases I/II in late-phase long-term potentiation // J. Neurosci., 2002, V. 22, No. 13, P. 5432-5441.

72. Sala C., Futai K., Yamamoto K., Worley P. F., Hayashi Y., Sheng M. Inhibition of dendritic spine morphogenesis and synaptic transmission by activity-inducible protein Homer la// J. Neurosci., 2003, V. 23, No. 15, P. 6327-6337.

73. Sala C., Piech V., Wilson N. R., Passafaro M., Liu G., Sheng M. Regulation of dendritic spine morphology and synaptic function by Shank and Homer //Neuron, 2001, V. 31, No. 1,P. 115-130.

74. Sandona D., Scolari A., Mikoshiba K., Volpe P. Subcellular distribution of Homer lb/c in relation to endoplasmic reticulum and plasma membrane proteins in Purkinje neurons //Neurochem. Res., 2003, V. 28, No. 8, P. 1151-1158.

75. Schreiner D., Mtiller K., Hofer H. W. The intracellular domain of the human protocadherin hFatl interacts with Homer signalling scaffolding proteins // FEBS Lett., 2006, V. 580, No. 22, P. 5295-5300.

76. Sergé A., Fourgeaud L., Hémar A., Choquet D. Receptor activation and homer differentially control the lateral mobility of metabotropic glutamate receptor 5 in the neuronal membrane // J. Neurosci., 2002, V. 22, No. 10, P. 3910-3920.

77. Sgambato-Faure V., Xiong Y., Berke J.D., Hyman S.E., Strehler E.E. The Homer-1 protein Ania-3 interacts with the plasma membrane calcium pump // Biochem. Biophys. Res. Commun., 2006, V. 343, No. 2, P. 630-637.

78. Shiraishi Y., Mizutani A., Yuasa S., Mikoshiba K., Furuichi T. Glutamate-induced declustering of post-synaptic adaptor protein Cupidin (Homer 2/vesl-2) in cultured cerebellar granule cells // J. Neurochem., 2003b, V. 87, No. 2, P. 364-376

79. Shiraishi Y., Mizutani A., Yuasa S., MikoshibaK., Furuichi T. Differential expression of Homer family proteins in the developing mouse brain // J. Comp. Neurol., 2004, V. 473, No. 4, P. 582-599.

80. Shiraishi-Yamaguchi Y., Furuichi T. The Homer family proteins // Genome Biol., 2007, V. 8, No. 2, P. 206.

81. Shuttleworth T.J. Arachidonic acid, ARC channels, and Orai proteins // Cell Calcium, 2009, V. 45, Iss. 6, P. 602-610.

82. Skibinska-Kijek A., Wisniewska M. B., Gruszczynska-Biegala J., Methner A., Kuznicki J. Immunolocalization of STIM1 in the mouse brain // Acta. Neurobiol. Exp. (Wars)., 2009, V. 69, No. 4, P. 413-428.

83. Soboloff J., Spassova M. A., Hewavitharana T., He L. P., Xu W., Johnstone L. S., Dziadek M. A., GillD. L. STIM2 is an inhibitor of STIM1-mediated store-operated Ca2+ Entry // Curr. Biol., 2006, V. 16, No. 14, P. 1465-1470.

84. Soloviev M. M., Ciruela F., Chan W. Y., Mcllhinney R. A. Mouse brain and muscle tissues constitutively express high levels of Homer proteins // Eur. J. Biochem., 2000, V. 267, No. 3, P. 634-639.

85. Stathopulos P. B., Ikura M. Structurally delineating stromal interaction molecules as the endoplasmic reticulum calcium sensors and regulators of calcium release-activated calcium entry // Immunol. Rev., 2009a, V. 231, No. 1, P. 113-131.

86. Stathopulos PB, Zheng L, Li GY, Plevin MJ, Ikura M. Structural and mechanistic insights into STIMl-mediated initiation of store-operated calcium entry // Cell, 2008, V. 135, No. l,P.l 10-22.

87. Stathopulos P.B., Zheng L., Ikura M. Stromal interaction molecule (STIM) 1 and STIM2 calcium sensing regions exhibit distinct unfolding and oligomerization kinetics // J. Biol. Chem., 2009b, V. 284, No. 2, P. 728-32.

88. Feske S., Gwack Y., Prakriya M., Srikanth. Puppel S.-H., Tanasa B., Hogan P. G., Lewis R. S., Daly M., Rao A. A mutation in orail causes immune deficiency by abrogating crac channel function //Nature, 2006, V. 441, No. 7090, P. 179-185.

89. Stiber J. A., Tabatabaei N., Hawkins A. F., Hawke T., Worley P. F., Williams R. S., Rosenberg P. Homer modulates NFAT-dependent signaling during muscle differentiation // Dev. Biol., 2005, V. 287, No. 2, P. 213-224.

90. Tanaka M., Duncan R. S., McClung N., Yannazzo J. A., Hwang S. Y., Marunouchi T., Inokuchi K., Koulen P. Homer proteins control neuronal differentiation through IP(3) receptor signaling // FEBS Lett., 2006, V. 580, No. 26, P. 6145-6150.

91. Tu J. C., Xiao B., Yuan J. P, Lanahan A. A., Leoffert K., Li M., Linden D. J., Worley P. F. Homer binds a novel proline-rich motif and links group 1 metabotropic glutamate receptors with IP3 receptors //Neuron, 1998, V. 21, No. 4, P. 717-726.

92. Usui S., Konno D., Hori K., Maruoka H., Okabe S., Fujikado T., Tano Y., Sobue K. Synaptic targeting of PSD-Zip45 (Homer lc) and its involvement in the synaptic accumulation of F-actin // J. Biol. Chem., 2003, V. 278, No. 12, P. 10619-10628.

93. Van Keuren-Jensen K. R., Cline H. T. Homer proteins shape Xenopus optic tectal cell dendritic arbor development in vivo // Dev. Neurobiol., 2008, V. 68, No. 11, P. 13151324.

94. Van Keuren-Jensen K., Cline HT. Visual experience regulates metabotropic glutamate receptor-mediated plasticity of AMPA receptor synaptic transmission by homer la induction // J. Neurosci., 2006, V. 26, No. 29. P. 7575-7580.

95. Volpe P., Sandri C., Bortoloso E., Valle G., Nori A. Topology of Homer lc and Homer la in C2C12 myotubes and transgenic skeletal muscle fibers // Biochem. Biophys. Res. Commun., 2004, V. 316, No. 3, P. 884-892.

96. Ward C.W., Feng W., Tu J., Pessah I. N., Worley P. K., Schneider M. F. Homer protein increases activation of Ca2+ sparks in permeabilized skeletal muscle // J. Biol. Chem., 2004, V. 279, No. 7, P. 5781-5787.

97. Westhoff J. H., Hwang S. Y., Duncan R. S., Ozawa F., Volpe P., Inokuchi K., Koulen P. Homer proteins regulate ryanodine receptor type 2 function and intracellular calcium signaling // Cell Calcium, 2003, V. 34, No. 3, P. 261-269.

98. Wollacott A. M., Desjarlais J. R. Virtual interaction profiles of proteins // J. Mol. Biol., 2001, V. 313, No. 2, P. 317-342.

99. Worley P. F., Zeng W., Huang G., Kim J. Y., Shin D. M., Kim M. S., Yuan J. P., Kiselyov K., Muallem S. Homer proteins in Ca2+ signaling by excitable and non-excitable cells // Cell Calcium, 2007, V. 42, No. 4-5, P. 363-371.

100. Yamamoto K., Sakagami Y., Sugiura S., Inokuchi K., Shimohama S., Kato N. Homer la enhances spike-induced calcium influx via L-type calcium channels in neocortex pyramidal cells // Eur, J, Neurosci., 2005, V. 22, No. 6, P. 1338-1348.

101. Zhang G. C., Mao L. M., Liu X. Y., Parelkar N. K., Arora A., Yang L., Hains M., Fibuch E.E., Wang J. Q. In vivo regulation of Homer la expression in the striatum by cocaine // Mol. Pharmacol., 2007, V. 71, No. 4, P. 1148-1158.

102. Zheng L., Stathopulos P.B., Li GY, Ikura M. Biophysical characterization of the EF-hand and SAM domain containing Ca2+ sensory region of STIM1 and STIM2 // Biochem. Biophys. Res. Commun., 2008, V. 369, No. 1, P.240-246.

103. Zhou Y., Mancarella S., Wang Y., Yue C., Ritchie M., Gill D. L., Soboloff J. The short N-terminal domains of STIM1 and STIM2 control the activation kinetics of Orail channels // J. Biol. Chem., 2009, V. 284, No. 29, P. 19164-19168.

104. Зимина O.A., Вигонт B.A., Поздняков И.А., Глушанкова JI.H., Львовская С.В., Скопин А.Ю., Можаева Г.Н., Казначеева Е.В. «Роль белка STIM1 в рецептор-и депо-управляемом входе Са2+ в клетки НЕК293». // Биологические мембраны, 2010, Т. 27, №2, С. 1-7.

105. Николаев А.В., Скопин А.Ю., Казначеева Е.В. // Биологические мембраны, 2004, Т. 21, №6, С. 451-457.

Информация о работе

Шалыгин, Алексей Вадимович
кандидата биологических наук
Санкт-Петербург, 2010
ВАК 03.03.04

Диссертация

Участие белков семейства Homer в регуляции депо-управляемого входа кальция в клетки А-431 - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы