Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Взаимодействие кальциевых каналов плазматической мембраны клеток А431 и рецептора инозитолтрисфосфата эндоплазматического ретикулума

ВАК РФ 03.00.25, Гистология, цитология, клеточная биология

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Алексеенко, Вадим Аркадьевич, Санкт-Петербург

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК ИНСТИТУТ ЦИТОЛОГИИ

На правах рукописи УДК 577.352.465

АЛЕКСЕЕНКО Вадим Аркадьевич

ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ КАЛЬЦИЕВЫХ КАНАЛОВ ПЛАЗМАТИЧЕСКОЙ МЕМБРАНЫ КЛЕТОК А431 И РЕЦЕПТОРА ИНОЗИТОЛТРИСФОСФАТА ЭНДОПЛАЗМАТИЧЕСКОГО РЕТИКУЛУМА

03.00.25

Гистология, цитология, клеточная биология

ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научный руководитель: доктор биологических наук, чл.-корр. РАН Г. Н. Можаева

Санкт-Петербург 2003

по электрофизиологическим свойствам являются наиболее близкими к депо-управляемым каналам CRAC.

Для объяснения механизмов активации депо-управляемых кальциевых каналов были выдвинуты две основных гипотезы. Согласно первой из них, сигналом для активации этих каналов является образование растворимого посредника - «фактора кальциевого входа» (Randriamampita, Tsien, 1993), вызванное опустошением Са2+ депо; по второй - ключевую роль играет непосредственное (конформационное) взаимодействие между IP3R внутриклеточного депо и кальциевым каналом плазматической мембраны (Irvine, 1990; Berridge, 1995). Было получено значительное количество косвенных свидетельств в пользу последней гипотезы, в том числе пространственное сближение места 1Р3-индуцированного выброса кальция из депо и места входа кальция через плазматическую мембрану (Gregory et al., 1999). Возможность активации кальциевых каналов плазматической мембраны белком IP3R (KiseJyov et al., 1998) прямо указывает на наличие белок-белковых взаимодействий при активации кальциевых каналов. В дальнейших исследованиях модели конформационного сопряжения было показано влияние перестроек цитоскелета на кальциевую сигнализацию (Ribeiro et al., 1997), и вовлечение в процесс регуляции кальциевых каналов плазматической мембраны белков, участвующих в экзоцитозе (Yao et al., 1999). Развитие этой гипотезы привело к появлению предположений о подвижности кальциевого депо в процессе активации кальциевого входа (Patterson et al., 1999), и возможной роли кавеол в нём (Isshiki, Anderson, 1999; Lockwich et al., 2001).

Основное положение, выносимое на защиту

Высокоселективные депо-зависимые кальциевые каналы 1т!п активируются путём конформационного взаимодействия с рецептором инози-толтрисфосфата, находящемся в мембране внутриклеточного кальциевого депо (эндоплазматический ретикулум).

Рис. 3. Метаболизм инозитол-фосфатов. Синие стрелки -дефосфорили-рование, красные- фосфори-лирование. Циклический (1:2,4,5)1Р3 образуется в незначительных количествах (пунктирная стрелка). По Putney, Bird, 1993, с изменениями.

|р,р, ip5p

и другие ииозитол-попифосфаты

Инознтол

Деактивация 1Р3 фосфорилированием 3-киназой и дефосфори-лированием 5-фосфатазой приводит к образованию различных фосфо-рилированных производных инозитола, физиологическая роль которых исследована всё ещё недостаточно. Для некоторых из этих метаболитов было показано кальций-мобилизующее действие, для других был показан обратный эффект (Mayrleitner et al., 1995; Bird, Putney, 1996; Lu et al., 1998; Hermosura et al., 2000). В конце концов, основная часть этих веществ дефосфорилируется до инозитола, который используется для ресинтеза Р1Р2.

Пути активации фосфолипазы С

Известны четыре основных типа PLC и два основных пути их активации: один - через рецепторы, связанные с G-белками (активируются изомеры PLCJ3), другой - через рецепторы с тирозинкиназной активностью (изомеры PLCy).

Через G-белки действуют различные рецепторы: адренэргические, мускариновые, бомбезина, брадикинина, пуринэргические, и некоторые другие (Yoshida, Imal, 1997). При связывании молекулы агониста эти рецепторы претерпевают конформационные изменения и приобретают способность активировать гетеротримерные G-белки. Активированные G-белки диссоциируют на субъединицы - Ga и G(3y, при этом GTP вытесняет GDP из сайта связывания на субъединице Ga. Далее эти два диссоцииро-

1,7, 3,5, 4,9 и 6,6 пА при потенциале на мембране -50 мВ. Наибольшее время открытого состояния наблюдалось на третьем уровне проводимости (2-7 мсек, для остальных менее 1,5 мсек). Авторы работы предложили модель, в которой наблюдаемые уровни проводимости соответствуют четырем подсостояниям одного канала, образованного четырьмя субъединицами. Ионный канал рецептора 1Рз слабо селективен для двухвалентных катионов относительно ионов калия Рвз/Рк = 6,3, а его ряд селективности для 55 мМ двухвалентных катионов против 110 мМ К+ выглядит следующим образом: Ва2+> Sr2+> Са2+> Мд2+. Проводимость канала для двухвалентных катионов при нулевом потенциале на мембране убывала в той же последовательности: Ва2+ -85 пСм, Sr2+ - 77 пСм, Са2+ - 53 пСм, Мд2+ - 42 пСм (Bezprozvanny , Ehrlich, 1994). Коэффициент Хилла для концентрационной зависимости IP3R от 1Р3 оказался равным 1. Полученные данные позволили авторам предположить, что для открывания Са2+-канала достаточно связывания одной молекулы 1Рз на любом из четырех рецепторов, составляющих тетрамерный белковый комплекс.

Кривая зависимости наблюдаемого уровня активации IP3R от концентрации цитозольного Са2+ имеет колоколообраз-ный вид, с максимумом при 0,25 мкМ при использовании в качестве агониста 5 мкМ IP3 (Bezprozvanny, Ehrlich, 1991). Зависимость активности IP3R от цитозольного Са2+ может отражать функционирование механизма обратной связи в ходе IP3-индуцированного выброса Са2+ из депо. На начальной стадии выброса кальция из депо рост его концентрации в цитозоле способствует увеличению вероятности открытого состояния канала, и ускорению этого входа. При превышении «критической» концентрации дальнейший рост концентрации кальция уже тормозится из-за понижения вероятности открытого состояния канала. В дальнейшем было показано, что положе-

Calcium (цМ)

Рис. 6 Зависимость вероятности открытого состояния канала IP3R от концентрации кальция. Приведены кривые для 0,02 (□), 0,2 (■), 2 (А), и 180 (•) мкМ 1Р3. Из (Kaftan et al., 1997).

ры IP3R - гепарин и арахидоновая кислота. Хотя каналы 1тщ могли быть активированы и пассивным опустошением внутриклеточных депо с помощью тапсигаргина, всё же с помощью 1Рз их активность вызывалась гораздо легче. Максимальная вероятность открытого состояния (около 0,6) достигалась в диапазоне концентраций 1Р3 в диапазоне 2,5 - 5 мкМ. При этом наблюдалась 1Р3- зависимая деактивация каналов (рис. 9). Все приведенные на этом рисунке кривые нормализованы по максимальному значению вероятности, поэтому при его анализе следует учитывать, что они отражают лишь изменение уровня активности каналов относительно этого максимума. В частности, 1Рз в концентрации выше 10 мкМ вызывал значительную по амплитуде, но быстро прекращающуюся активность Imm- А в концентрации ниже 2,5 мкМ вызванная им активность каналов была значительно ниже, но не спадала и после 100 секунд.

Участие G-белков в активации каналов исследовалось с помощью негидролизуемого аналога GTP - GTPyS. Добавление 100 мкМ GTPyS вместе с 1Р3 к цитозольной стороне мембраны приводило к увеличению времени активности каналов и повышению вероятности открытого состояния, в том числе за счёт появления «двойных открываний» (одновременные открывания двух каналов). GTPyS без 1Р3 каналы не активировал.

При обсуждении механизмов активации каналов Imjn было выдвинуто несколько предположений. Предположение о том, что эти каналы являются встроенными в плазматическую мембрану молекулами эндоплазматического рецептора 1Рз или хотя бы родственными им каналами было сразу же признано неосновательным. В самом деле, по сравнению с IP3R селективность Imm для кальция по отношению к калию более чем на 2 порядка выше, а их проводи-

Рис. 9. Быстрая инактивация каналов Imin при использовании высоких концентраций 1Р3.

Каждая гистограмма представляет собой усредненные данные из трех опытов, нормированные относительно максимального значения NP0 в каждом эксперименте. 105 мМ Ва2+ в пипетке, мембранный потенциал -70 мВ. Из (Kiselyov et al., 1997).

не имеет кальциевой АТР-азы эндоплазматического ретикулума, его кальциевое депо постоянно опустошено, и «фактор опустошения» должен постоянно образовываться в этих дрожжах. Авторы этой работы смогли использовать ВЭЖХ для очистки действующего начала экстракта дрожжей но, к сожалению, им удалось очистить его лишь частично.

Таким образом, на данный момент из свойств «фактора опустошения депо» известны лишь приблизительная молекулярная масса, близкая к 1 кДа (по некоторым оценкам (Csutora et al., 1999) - около 700 Да), и известно наличие в нем функционально значимых фосфатных групп (Thomas , Hanley, 1995). Несмотря на очевидную стабильность этого фактора, достаточную для применения различных методов разделения низкомолекулярных веществ, с 1999 года никакого дальнейшего прогресса в его очистке и исследовании, по-видимому, не произошло.

Встраивание везикул, содержащих канал

Выдвинутая еще в 1993 г. (Fasolato et al., 1993) идея о встраивании везикул, содержащих кальциевые каналы, в плазматическую мембрану, довольно долго не имела чётких экспериментальных подтверждений. Первое существенное её подтверждение было получено в лаборатории Роджера Чена при попытке подтвердить существование растворимого посредника (Yao et al., 1999). В опытах на ооцитах шпорцевой лягушки Xenopus laevis было показано, что формирование гигаомного контакта пипетки с клеточной мембраной перед опустошением депо с помощью 1Р3 предотвращает депо- зависимый вход кальция через плазматическую мембрану. В то же время на новом контакте, образованном после опустошения депо можно наблюдать кальциевый ток (рис. 10).

При этом изоляция мембранного фрагмента в бескальциевом растворе не приводила к исчезновению тока, обусловленного активацией депо-зависимых каналов, напротив, этот ток даже усиливался. Независимость этих токов от наличия цитозольных компонент и различное поведение каналов при изменении порядка событий трудно объяснимы исходя из гипотезы существования растворимого посредника и его обратимого связывания с каналом плазматической мембраны.

ные клетки DT40 не отвечают на стимуляцию кофеином (агонистом RyR). По-видимому, остается заключить, что в этих клетках, как и в клетках RBL (Bakowski et al., 2001), регуляция кальциевого входа осуществляется другим, не требующим наличия IP3R, способом.

Взаимодействие IP3R и Р1Р2

Если принять гипотезу о том, что IP3R непосредственно взаимодействует с каналами в плазматической мембране, то нужно отметить, что из неё следует, что его N-конец находится в непосредственной близости от этой мембраны. В результате появляется возможность его взаимодействию с различными молекулами, находящимися в примембранной области, и с компонентами мембраны. Для некоторых молекул характерных для плазматической мембраны, уже известны аминокислотные последовательности, которые необходимы для формирования сайтов их связывания в белках. Такая последовательность была обнаружена и для Р1Рг (Yu et al., 1992).

В работе Лупу с соавторами (Lupu et al., 1998) исследовали влияние моноклональных антител к PIP2 (Р1РгАЬ), собственно PIP2, а также его водорастворимого аналога на активацию встроенных в бислойную ли-пидную мембрану молекул IP3R. Добавление РГРгАЬ к «цитозольной» стороне бислоя в несколько раз увеличивало вероятность открытого состояния IP3R, в среднем - от 3,5 ± 0,5 % до 13,6 ± 1,7 %; при этом в некоторых опытах максимальная вероятность достигала 30-40 %. Добавление микромолярных концентраций Р1Р2 (в виде везикул или его водорастворимого аналога) к цитозольной стороне бислоя приводило к инги-бированию IP3R. Дальнейшие исследования позволили авторам этой работы предположить, что PIP2 связывается с IP3R на его N-конце, в сайте связывания 1Рз. В нормальных условиях значительная часть IP3R связана с PIP2 и ингибирована им, а активация фосфолипазы С приводит к одновременному устранению ингибитора IP3R - Р1Р2 и к образованию его активатора - 1Р3.

Цитоскелет и ионные каналы

Все четыре перечисленные гипотезы в той или иной степени требуют, чтобы кальциевое депо располагалось в непосредственной близости

Заключение

Из изложенных выше литературных данных можно заключить следующее:

В плазматической мембране клеток А431 существуют низкопрово-дящие высокоселективные депо-зависимые кальциевые каналы Imjn, весьма близкие по свойствам к активируемым при опустошении депо каналам CRAC. Выделение каналов Imin в высокоочищенном виде технически крайне затруднительно, поскольку отсутствуют необходимые для этого высокоспецифичные фармакологические инструменты. Поэтому невозможно прямое секвенирование белка и получение его молекулярных характеристик. Механизм активации каналов Imjn не известен, но есть указания на то, что значительную роль в нем может играть рецептор 1Р3 эндоплазматического ретикулума. Вполне вероятным является прямая активация каналов Imin взаимодействием с IP3R («конформацион-ное сопряжение»), однако не исключены и другие варианты.

Целью данной работы было выяснение механизма активации каналов Imjn. Для её достижения были поставлены перечисленные ниже задачи экспериментальной работы.

Задачи исследования:

1. Попытаться воспроизвести in vitro (в изолированных мембранных фрагментах) активацию депо-зависимых кальциевых каналов Imin с помощью экзогенного IP3R.

2. Исследовать влияние Р1Р2 (ингибитора IP3R) на активацию каналов Imm в изолированных мембранных фрагментах.

3. Изучить влияние перестроек примембранного актинового цито-скелета на процессы опустошения внутриклеточного кальциевых депо и входа кальция через депо-зависимые каналы плазматической мембраны в клетках А431.

4. Исследовать влияние перестроек примембранного актинового ци-тоскелета на активацию каналов Imin при регистрации токов от участка клеточной мембраны (cell-attached).

клеточный бескальциевый раствор содержал 140 мМ KCI, 10 мМ HEPES/KOH, 100 мкМ EGTA, кальциевый раствор содержал 140 мМ KCI, 10 мМ HEPES/KOH, 2 мМ СаС12. Изменение концентрации кальция в цито-золе определяли по изменению флуоресценции Fura-2 при возбуждении УФ излучением с длиной волны 340 и 380 нм. Отношение интенсивно-стей флуоресценции зонда при двух длинах волн возбуждения F340/F380 прямо пропорционально концентрации свободного кальция внутри клетки (Grynkiewicz et al., 1985).

УФ фильтр Модулятор УФ

(5ММУФС-6) (интерфсрспфюпш» фшмры. сиена 50 ре» а ссгумду]

3

1 CI П)

с S (0

а Тепловой

0 фильтр

1 (вода) 0)

■=£ X

о

Датчик

положения

модулятора

v

Люминесцентный объектив 40х, ВИ

IBM PC, программа оцифровки и отображения

данных / V*

АЦП

Счетчик импульсов ■- 380

Флюорасцмция

. л- н ■■

Дискриминатор

Интегратор? (ФНЧ)

Рис. 14. Блок- схема установки для регистрации концентрации свободного кальция в цитозоле с помощью флюоресцентного зонда Fura-2. Назначение различных блоков установки описано в приложении, стр. 75.

На врезках показан вид сигнала на разных этапах его обработки. Базой для установки служит переделанный металлографический микроскоп Метам РВ-23 (ЛОМО, Санкт-Петербург). Используется люминесцентный объектив 40Х с водной иммерсией (ЛОМО), фотоумножитель ФЭУ-130, АЦП L-305(L-Card, Москва). Интегратором служит четырех-полюсный бесселевский фильтр низких частот. Осветитель и подвижное зеркало, направляющее изображение в окуляр, используются только для фокусировки изображения перед началом эксперимента. Пунктиром/серым цветом показан не использовавшийся альтернативный способ регистрации импульсов с фотоумножителя.

Рабочие растворы IP3 (Calbiochem, США), UTP, цитохалазина Д и ка-ликулина A (Sigma, США) приготовлялись непосредственно перед экспериментом. Антитела анти-Р1Р2 (PerSeptive Biosystems, США, титр 1:1500)

разводили 1:100 перед экспериментом. Везикулы стеарил-арахидонил

налов (рис.17). При подаче церебеллярных микросом в растворе, не содержащем 1Рз, активность Imm не восстанавливалась (6 экспериментов). Таким образом, для активации Imiri необходим не IP3R сам по себе, а IP3R, активированный 1Р3.

контрольные

2.5 цМ 1Р3

-70 мВ

микросомы

;церебеллярные 'микросомы

тппрг

<7

"~~ГТ

1мин

1

1пА

-0,18 па

250 мс

0,5 пА

Рис. 18. Микросомы, не содержащие IP3R, не способны активировать каналы Imin. Контрольные микросомы выделены из переднего мозга крыс. При одинаковой концентрации белка микросомы, выделенные из мозжечка, содержат в 20 и более раз больше IP3R, чем контрольные.

Контрольные микросомы, содержащие значительно меньшие количества IP3R, никакого эффекта на активность молчащих Imjn не оказывали (27 экспериментов). В нескольких экспериментах нам удалось на одном и том же фрагменте мембраны показать и отсутствие активации Imin контрольными микросомами, и восстановление активности Imin микросомами, обогащенными IP3R (рис. 18). Это указывает, что в опытах с контрольными микросомами фактором, не позволяющим наблюдать активацию Imin, являлись именно отсутствие IP3R в микросомах, а не каналов в пэтче.

-150-100 -50 0 50 lllinlllllllinllllllll

б

мВ 0

S=1nC o(L-0,1

"0,2 L пА

о. z

* 1 П -I

со х

X СО

ш о

(О

§0,5Н

СП

S а о

X

0,0

\

ж

ж

-150 -100 -50 0 МВ измеРений

Рис. 19. Кинетические свойства Imtn при их активации с помощью IP3R.

а - вольт- амперная характеристика. Каждая точка-среднее из 6 измерений;б -зависимость NP0 от мембранного потенциала, нормализованная относительно NP0 при -70 мВ. Каждая точка- среднее и