Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Рецепторзависимый вход Са2+ - механизмы и регуляция

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Рецепторзависимый вход Са2+ - механизмы и регуляция"

- < 9 3і

.лий?

КАРДИОЛОГИЧЕСКИЙ НАУЧНЫЙ ЦЕНТР РОССИЙСКОЙ АКАДЕМИИ МЕДИЦИНСКИХ НАУК ИНСТИТУТ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЙ КАРДИОЛОГИИ

На прапах рукописи УДК 546.41-576.8.097.1

Авдонин Лапал Владимирович

РПЦЕПТОГ.ІЛВИСИМНЙ КХОД С;-,“+ - МЕХАШПМИ И РЕГУЛЯЦИЯ

03,00.04 - Биохимия

диссертация

на соискание ученой степени доктора биологических наук

о форме доклада

Москва - I ')УЯ

Работа выполнена в лаборатории молекулярной эндокринологии Института экспериментальной кардиологии Кардиологического научного центра Российской Академии медицинских наук

Научный консультант:

Доктор биологических паук, профессор В.А.Ткачук

Официальные оппоненты:

Доктор физико-математических наук, профессор Доктор биологических наук, профессор Доктор биологических наук, чл,-корр. РАН

3. А. Печатнике

А.С.Соболе»

Л.М.Чайлахяи

Ведущая организация - Институт цитологии РАН

,993 г ц_/^час.

Защита состоится ______; г/ 1993 г. и_?_.'_час. на заседании

Специализированного совета Д 200.23.01 .по специальности "биохимия" при Институте биофизики клетки РАН по адресу:

1 42 2 92, Московская обл. , г.Пущино, Институт биофизики клетки РАН.

Автореферат разослан "_____"_____________ 1993 г.

Ученый секретарь Специализированного сойота кандидат биологических наук

Т.Н.Смолихииа

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблеми.' Активация гормонами и другими аго-

‘цистами многих клеточных реакций, таких как сокращение, секреция,

энергетический обмой, пролиферация и т.д опосредована

увеличением цитоплазматической копией грации попои Са~

( I Са 2 + 1цИТ) • Известно несколько путей рсцситорзависимого

повышения (Са2+] . Са~+ может входить в клетки через хороню

изученные пикопшовые холииорецепторные капали jMiledi et al ,

1 s0 ] , через каналы, активируемые глютаминовой кислотой при ее

связывании с Ы-метил-О-аспартатными рецепторами J МпсЭегшо 11 <?Т

al., 1986]. Ряд гормонов (катехоламины и некоторое друїие.} і +

стимулируют вход Са~ через нотеяциалуправляемые каналы L-тппа |Rcuter, 1983). К середине 80-ых годов был открыт еще один путь рецепторопосредоианного увеличения (Са^+)цит, повсеместно распространенный в клетках животных. При этом механизме агонисты активируют фосфолипазу С, расщепляющую фосфатидилянозитол-4,5-бисфосфат. Образующийся в ходе данной реакции вторичный посредник инозитол- 1, 4,5-трисфосфат вызывает высвобождение в цитоплазму внутриклеточного Са^+, открывая кальциевые каналы ретикулума {Streb et al., 1 9 S 3 ; Berridge, 19X4]. Эффект!.! aroiüi. і он (за исключением факторов росса) на фосфоинози гидиыи обмен и вн\ триклоточный кальции опосредованы рецепторами, входящими в отдельное сvncрсемоиство, все представители которсио имеют однотипную счр\ктчру !т н. семидоменные или сечь раз прошивающие мембрану рецепторы) и все сопряжены с ГТФ-связываюншми белками

Косвенные данные указывали, ч'і о одновременно с мобилизацией _ і +

впутриклеточнот о Са“- агонисты с иомо.'цью рецепторов данпоіо типа активирует плиц наружного С'а~ , однако пи о способе его переноса через мембрану, ни о регуляции кальциевого транспорта практически ничего не было известно. Высказывались гипотезы, что Са“т входи і через каналы fHallam, Rink, 19K5J, но нельзя было исключить также транспорт С'а'+ с помощью переносчика, в качестве которого р а е с.\/а т р и в а л п продукты фосфоинозигидного метаболизма, о частности, фосфатидную кислоту [Putney et al., 1980; Salmon,

Honeyman, 1980J.

В последние голи в ряде лабораторий были предприняты попытки зарегистрировать кальциевые каналы, которые могут иметь отношение к рассматриваемому пути рецепторзависимого входа Са^ + , однако публикации по этому вопросу до сих пор немногочисленны. Суммируя имеющиеся данные, можно выделить каналы, активируемые инозитол-I,4(5-трисфосфатом [Kuno, Gardner, 1986; Mozhaeva et al,, 1990],

иегидролизуемыми аналогами гуаиозиитрифосфата, действующими, no-видимому, через G-белки [Penner et al. , 19SS; Mozhaeva et al. ,

19 9 0), внутриклеточным Ca ^ + {von Tscharner et а 1, , 1986],

АТФ/АДФ-актнвируемые капали {Benham, Tsien, 1987; Mahaut-Smith et al. , 1 990 ], а также каналы, сопряженные с внутриклеточными

кальциевыми депо (Roth, Penner, 1992]. Есть косвенные данные о том, что в яйцеклетках и некоторых других видах клеток кальциевые каналы плазмалеммы активирует инозитол- 1,3,4,5-тетракисфосфат [Irvine, Moor, 19 86; Irvine, 198 9]. Таким образом, о разных клетках найдены каналы с совершенно разными свойствами, и даже в одних и тех же клетках можно зарегистрировать два или более различающихся между собой проводящих Са^+ каналов (Penner et al., 1988; Mozhaeva et al. , 1990].

Подводя итог приведенным выше данным можно заключить, что механизмы активации агонистами входа Са^+ в клетки изучены недостаточно. К моменту начала наших исследований даже само существование рецепторзависимого входа Са^+ ставилось под сомнение (Gill, 1 985 ( и требовало экспериментального подтверждения. Практически ничего не было известно о регуляции этого пути увеличения [Са^+)цИТ внутриклеточными факторами. Не было изучено влияние па рецепторзависимый кальциевый вход фармакологических препаратов и не проводились исследования о связи между нарушениями рецепторзависимого обмена Са^ + и развитием заболеваний человека»

Цель »I задачи исследования.

Целью настоящей работы было изучение механизмов и регуляции рецепторзависимого входа Са^+ в клетки. Исследования проводились на тромбоцитах, на эндотелиальных и гпздкомышочных клетках кровеносных сосудов и на трансформированных клетках эпителия

Е:> аром;. тлюлт'ппм д г\ и 11 о: і рабо і;,і били ііостлпЖ'і:^ ~:лс'п> н-’і1. .ч .кСі'Г'римоіп альт,:? за.ча^ 1

] Г'азрпГ)о га ; ь на осиогс сгіситічімесн и ч флуорсспои гпь1 \ зо> , : . '.поды о;и іоиромілііюп регистрации а і описі пн ду цлрпиапнич и ч\. он с' !і:':мораі:і!огп і! і, і о ; и\ и а л і і. котц’п і ¡'ЛііііП с іі с> ” і; і і :: . .> о .

:ч-■ »п л.ч.'' і і > ІЬР» ч-' ’'Ги'.'Г’.і I'1' Г !•: ЦП І ОІІ'І.'ПИ.' КИ'.' > і

¿.Наити условия, при которых избирательно усилиьаеж-п осцепторзависимый вход наружного Са^+ и подавляется вклад

¡ли у І ргіК/іС 1 и^ииі ^ Килимп'ї.

З.Определить механизм рецепторзависимого переноса С а-- «к,* р плазматическую мембрану.

{.При решении предыдущей задачи было показано, что вызванной

г~ 1 “г

агонистами еїход Сз происходит через рецопторулрапляомыо капал;.; Следующей задачей было выяснение проводимости данных капало» по отношению к другим катионам.

5.Исследовать механизм сопряжения рецепторов с ионными канапами, обеспечивающими пх^ч С^і +

О р «и С* О і Д И р ід ь ~ — А - -

изучения ионного транспорта через плазматическую мембрану, позволяющие одновременно оценивать токи ионов через мембрану и их кпнпйнтпаиии в цитоплазме. Были найдены условия избирательного

усиления р с це п •; с» р ? а в и с и мо г о входа С:: ' " и п о у а в л оп и >, ^ ' -

активируемых токов через мембрану других ионов (К+ и С1”), что позволяет спектрофлуориметрическими методами регистрировать рецспторуправляемые Са^+-транспортирующие каналы.

Установлено, что агонисты, связывающиеся с "семидомелными" рецепторами и активирующие фосфоинозитидный обмен, вызывают вход Са^+ через катионные каналы, проницаемые также для Ва^ + , и

одновалентных катионов Ыа+, 1Л+ и Сб+.

Доказано участие ГТФ-связиоающих белков (О-белков) в передаче сигнала от рецепторов к кальциевыми каналами плазмалеммы. С-белки могут прямо активировать каналы, но возможна, по-видимому, также опосредованная передача сигнала путем активации фосфолипазы С, высвобождения Са^+ из внутриклеточных везикул с последующей стимуляцией каналов плазматической мембраны в результате их взаимодействия с опорожненными внутренними кальциевыми депо, в-белки, участвующие в кальциевом транспорте, не являются специфичными и в разных клетках могут различаться.

Открыт механизм десеиситизации клеток к агонистам, активирующим фосфоинозитидный обмен и вызывающим вход Са^+, который реализуется через протеинкиназу С. Протеинкиназа С, активирующаяся вслед за повышением [Сз^ + 1циТ» блокирует рецепторуправляемые каналы данного типа во всех исследованных клетках и осуществляет таким образом отрицательный обратный контроль за их работой. Блокирование протеинкиназой С каналов обусловлено инактивацией в-белка. Обнаружено, что одновременно с подавлением ответов на агонисты, увеличивающих (Са^+]^ит, протеинкиназа С может увеличивать чувствительность клеток к активаторам синтеза цАМФ.

Показано, что адснилатциклаэная система может участвовать в регуляции рецепторзависимого обмена Са^+, однако действие цАМФ является ткансспецифичным: в тромбоцитах этот вторичный

мессенджер блокирует каналы и не влияет па кальциевый обмен в эндотелиальных клетках, клетках НеЬа и А431.

Установлено, что кальциевые антагонисты (дигидрониридины, верапамил, дилтиазем) модулируют рецспторуправляемые каналы. В тромбоцитах они подавляют индуцированный агонистами вход Са^+, по усиливают входящий ток Ыа+. Предложена модель регуляции

кальциевыми антагонистами рецептору r>pan л чемых капало ) ч cor чаем о которой блокирование1 tíлтií üxojn Са'+ паоисхо/игг ч рсзульгато

• ■ - сродспп кпіілл.уі к Сл*"* и конкуренции- v :> > им .<м

_ , При-и^ут^мии "у'і< 'і'ііпєлі.іог-іи ч ¡го-, '»'-і! :и і ом чьш*х. первичном

і. <■,; чч;п.чч.} ;ч и ;(мі і -мпп • ’і к агонистам - яктпь.чоплм -ч’.'..' ’ С і" ,

1 ’ і ’ і ;) у -í ' •' ', -і Г о у 6п»!і,!іііч l, u - і с и с 11 - т и о и ) і.), і фо р • ■ ч 'j г;', j забппгл'.ни і .5 .•;<{■ ч'-С'-о і ,ччл рач i >ч.: -o р.чк.-пгиріапіїсимп^ -

■ <íf і L : • ^ ¡ .. П’>:‘ :-п.г ч iía4í герапеотмтг і :ч ^ лг.іс ; а.: -• ч

¡ чі 4<íís;ua препаг»ято-> гк.т.ночч, ч: ' 1 ¡чч’ ччі1; -їм ■ г -чі.:.««нні>ши

"’ті • -чичч і ,ЧЧ:,-Чі-:'.';)Ч чч:. чч'м ч нририсіа (Са/+1цИТ может бить ' • і.• і: 4!¡.v,o чрименрние лекарств, облап¡»•'v?;,..;.

действием на вход Са^ + .

Ялпо*>г7Т7„; рлоотг*

Результати работы были представлены на 5-он Всесоюзной конференции по биохимии мышц (Тбилиси, 1985), 5-ом Всесоюзном

биохимическом съезде (Киев, 1986), на Всесоюзном симпозиуме 4 Циклические нуклеотиды и система регуляции ферментатившге процессов" (Рязань, 1985), на Всесоюзной конференция <ю ионным каналам в Kapanare (Крым, 1990), гм ме*.дупарш(шгч :: пчпочиу м-і': ■,

клеточной биологии ; Сан -Лнч nm?o, СЫл, і 9^, ' Рот - >! тгчл и нот- ■'

u.-i >»ч. л " Í ’ 'і::: іч».ч! v , і 9 í! Л , К не м , і ’> ‘И ) , " Мом бр л і і ч : .«t ¡ я і міч ч. нчіл «:

н ''пміііцгк'члс. і і. ме мі >р;и: ' (1: рева і j , ! S ;> > . іЧин* гч. > - -ч мс р и и ч і г_ і . •. •

¡,;'Рлпоі!оп:чічч-чм с!{мпопчуі.і>: ( Ліпнил и, С Hi Ч , 1 9 S 7 ) , н.-і mo * д v пчро.ч! ч >ч

і HMii'j'.niv неї ччо'іочноГ; Гінолої ми ппччіх ÍBvnc Хок:., і.іііЛ, ¡-ИМ;,

ІП КОНфОрСИПЧЯ\ ГМфОПОЙСКОН ГрУІШП ІЮСЛЬЧІПІЧЧІОНС,' ГрОмГчм.’м : IV, {')p^>vjr,', Германия, Iv.s^i. > (hs 9, í V V 2 ) .

Пп материалам рабі» s ы опубликовано iü стпісії, ппдто і овлена к гс-чаїн монография " Роионторзлнисимал регуляция внутриклеточного калымы " .

.Методы исследования

Тромбоциты выделяли из венозной крови человека, которую

смешивали с кислым цитратным антикоагулянтом о отношении 6:1 [Аодонин, Алтухова, 1985]. Кровь центрифугировали 15 мин при 190g, отбирали верхний слой обогащенной тромбоцитами плазмы и осаждали тромбоциты в течение 10 мин при 1200g. Осадок суспендировали в растворе Тироде (pH 6,55) и использовали полученные тромбоциты для выделения мембран или нагрузки клеток кальциевым зондом квипом 2 или натрмеоым зондом SBFI. Для нагрузки тромбоцитов квином 2 их инкубировали при 37°С в течение 30 мин в присутствии 10 мкМ ацетооксиметильного эфира квина 2, центрифугировали 10 мин при 1200g и суспендировали в нейтральном растооре Тироде (pH 7,4). При нагрузке тромбоцитов натриевым флуоресцентным зондом SBFI в среду дополнительно добавляли эмульгатор Pluronic до концентрации 0,025%. Выделение мембранной фракции проводили методом лизиса в глицерине {Steer, Wood, 1979) или путем трехкратного замораживания и оттаивания в жидком азоте и промывания центрифугированием [Аодонин и соавт., 1989}.

Гладкомышечные клетки выделяли из аорты крысы [Little et al. , 1 989 } и культивировали о среде DMEM в присутствии 10%

сыпоротки теленка. Для экспериментов по определению (Са^+] ит и мембранного потенциала использовали клетки 5-20 пассажей, которые высевали па прямоугольные покровные стекла размером 6x11 мм, находящиеся о чашках Петри. При достижении клетками примерно 50%-ой плотности среду с сывороткой заменяли на среду с 4%-ым Моиомедом (заменителем сыворотки, не содержащим факторы роста). После этого клетки совершали не более одного деления, что было достаточным для достижения ими полной конфлюэнтности.

Эндотелиальные клетки выделяли из пупочной вены, аорты и легочной артерии человека и из легочной артерии быка [Ryan et al., 1 988J. Для определения 1Са^+]цит их высевали па внутреннюю поверхность пластиковой кюветы спектрофлуориметра. Мембранную фракцию выделяли из клеток бычьей легочной артерии. Для эторо эндотелиальные клетки соскребали с поверхности культурального флакона, промывали фосфатным буферным раствором без кальция, замораживали в жидком азоте и гомогенизировали потом гомогенизатором со стеклянным пестиком. Мембраны осаждали в течение 20

мил при lOOOOOg.

Определение концентрации иопоп Са^+ и цитоплазме. В тромбоцитах [Ca^+)ltUT определяли с помощью кмина 2 ¡'Чидоиип, Алтухова, 1 О S5 I . Флуоресценцию возбуждали при длине волны 140 им, а излучение измеряли при 500 им. В опдогслианьиых клетках [Са^+] опредоляии с помощью зонда Indo-І методом разложения спектра флуоресценции {Popov et al. , 1988 ]. Лля омрецоления

в гпаакомиі:іечііи\ клетках и\ пагрукалн зондом Fu; л-2 и и л зо у л\ д ая и флуоресцентно двумя длинами поля - 340 и 380 им.

[{ «лучение регио'і рпрооали при 500 нм. Покровное стекло с выпящен-ными на нем гладкомышечными клетками помещали гол; углом 40-4Я r'pT7vcoi. ирямпугптыю;: кміієтр лпуту-ісиоі о флуориметра фирмы "Spey" . Расчет І^а^^іцит 11Р°нодили согласно |Poervie et ai., 1985). В опытах, в которых проводилось одновременное измерение мембранного потенциала и [Са^+1цИТ в г падкомышечных клетках флуоресценцию Fura-2 регистрировали при 580 нм.

Определение количества поглощенного тромбоцитами

проводили в тех же условиях, при которых определяли |Са^+] ,

4 *Г ~> * ' '

Для этого к суспензии клеток добавляли 2-5 мкКн Са‘ па мл, а концентрацию ГаС і , снижали до 0, ! мМ для уїкмінчснии > до m> поп ¡1.4 ДНГ\'<;;Т'.П ИНН' Г и КЧЛЧЦПН , В ОПр(*ДСЛСПНЫС’ момсічи 11|)('МСПМ С У СИОН'J ИМ

¡ ро мб и цп то г. фп у, і. г р о г? а л и через с теме и офп л t> ч 7>u í - F / 1' Wh.il tu a г , промывали нося іпкратньїм рас пшром без кальция и он ре дол и >т ;ui счпн т и л ч я 11 и о п н о м счетчике к о ли чес'тип по' лощошюго 'і ромолчи та мп >'‘Са^г ! Дпдоиин и соант. , 1 ЧН 7 |

Потенциал плазматической мембраны тромбоціп on измеряли о помощью 3 . З ’ ~ дні іропші - 2 , 2 ’ - тиодикарбоцпаишшодида (diS-C-j-(5)), флуоресценцмы ко t oporo регистрировали на спектрофлуоримс гр<* Hitachi- 8 50 при длинах поли мо-зПуждопия и излучения соо'чютсгнотю 65<> и (¡/5 нМ и ширине »¡{¡лей 5 пМ Величину поіонцилла рае-тчт і-ічали по ураьнению Нернста, проводя калибровку с помощью валиномицииа и возрастающих концентраций КС1 (Авдонин и соавт. , 1991].

В гладкомышечных клетках мембранный потенциал измеряли с помощью флуоресцентного зонда бисоксонола. Его добавляли в кювету спектрофлуориметра до концентрации 40-100 нМ. Флуоресценцию возбуждали при длине волны 540 нм, а излучение регистрировали при 580 нм. Для обоих флуоресцентных зондов нами показана линейная зависимость их флуоресценции от величины мембранного потенциала в области от -80 до 0 мБ. При определении потенциала плазматической мембраны в гладкомышечных клетках в ряде опытов проводилась одновременная регистрация изменений (Са^+)цит. В этом случае клетки нагружали предварительно кальциевым зондом Fura-2 и использовали еще один источник возбуждения с длиной волны 340 нм. Для калибрования мембранного потенциала гладкомышечных клеток их помещали в безнатриевую среду, добавляли в кювету ионофор грамицидин D, вызывавший в этих условиях гиперполяризацию, и титровали потенциал, ступенчато повышая в среде концентрацию изотиоцианата натрия.

Активность адспилатциклазы в мембранах тромбоцитов определяли по ранее описанному методу [Авдонин и соавт., 1985],

используя в качестве субстрата [альфа-^Р]-АТФ. После остановки реакции образовавшийся [^Р]-цАМФ отделяли путем хроматографии на окиси алюминия [White, 1974},

Активность высокоаффинной ГТФазы мембран определяли по высвобождению ( 32Р] -НзР04 при гидролизе [ гамма-**2Р]-ГТФ [Cassel, Selinger, 1976].

Активность фосфолипазы С мембран эндотелиальных клеток определяли по гидролизу экзогенного []-фосфатидилинозитол-4, 5-бисфосфата (Rittenhouse~Simmons, 1979; Jada et al., 1989].

Образовавшийся []-ипозитол-1,4,5-трисфосфат экстрагировали кислой смесью хлороформа и метанола и хроматографировали на колонках с анионообменным сорбентом Dowex-1 (Berridge et al., 1983). После этого измеряли радиоактивность []-инозитол-1,4,5-трисфосфата.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

1. Оценка роли внешнего и внутриклеточного Са^+ в индуцированном агонистами подъеме [Са2+] т. Увеличение входящего тока Са2+ путем создания в цитоплазме буферной емкости для ионов кальция.

На рис.1 показано влияние агонистов на уровень Са^+ в цитоплазме тромбоцитов, эндотелиальных и г л а дк о мыше ч н их клеток. В этих экспериментах были использованы сильно флуоресцирующие кальциевые зонды второго поколения фура-2 и индо-1, почти не вносящие искажений по внутри*лсточтшй

2 +

кальциевый обмен. В присутствии Са во внешней среде в отягт на агонист наблюдался быстрый подъем 1Са‘2+]цИТ, после чего происходило его довольно медленное, в течение нескольких минут

ГМК

ЭКл

1-а

200 1 50

400

300

Са • ЗГТ А 100

с а

ЭГТА

Рис. 1 . Определение вклада ннешного и ии утриклеточпого Са индуцированиос аі-отістами увеличение |Са“+’)1игг в гладкомитсчиых (ГМК) и эндотелиальных (ЭКл) клетках и в тромбоцитах (Тц) без загрузки и с загрузкой кальциевым хелатором БАФТА. ГМК и ЭКл активировали тромбином (1 Ед/мл), а тромбоциты - фактором активации тромбоцитов (20 нМ). В ГМК высвобождение внутреннего Са^+ определяли в присутствии 1 мМ ЬаС1^, в ЭКл и Тц - в бескальциепой среде в присутствии ЭГТА.

5 200.

100

о

400

0 12 14 5 6 Ь4ИН

Рис.2.Увеличение рецепторзави-симого ихода ^Са + в тромбоциты при создании в цитоплазме буферной емкости для ионов кальция с помощью квина-2. А.Вход Са^ + в

контрольные (3,4) и нагруженные квином-2 (1,2) тромбоциты в отсутствие (2,4) и в присутствии (1,3) 0.1 мкМ ФАТ. Б.Изменения [Са ]цит в

загруженных квином-2 тромбоцитах в ответ на ФАТ. Концентрация Са в среде - 0,1 мМ.

Б

О 1 2 3 4 Ь 6 ЫИЯ

снижение до базального уровня. В бескальциевой среде или при подавлении входа Са^+ ионами лантана (гладкомышечные клетки) кинетика увеличения и максимальный прирост {^•а^+1цит практически не изменялись, однако снижение уровня Са^+ происходило гораздо быстрее и уже через 1-3 мин концентрация этого иона в цитоплазме возвращалась к исходному уровню. Таким образом, в начальный момент ответа клеток на агонисты вход ионов Са2+ из внешней среды практически отсутствовал и наблюдался главным образом во второй фазе. В общем увеличении [Са^+[11ИТ вклад внешнего Са^+ составлял около 50%.

В этих условиях исследование механизма рецепторзависимого входа Са^+ затруднено, поскольку он маскируется высвобождением Са^+ из внутриклеточных везикул. Поэтому представлялось необходимым каким-либо образом усилить рецепторзависимый вход наружного Са2+ и уменьшить вклад Са^+ из внутриклеточных депо. Оказалось, что этого можно достичь, если искусственно увеличить буферную емкость цитоплазмы по отношению к ионам

С" . Для это;'': цели бил использован кальциевый хслатор БАФТ\

[Тз і е ч, 1 9 8 0 ( , которнм тромооциты загружали ояноппрмр!!"'*".*'

— фл'У'О!“ - 14 *7 О іі;ч'МЛ ! ! "I г Р \ .1 К II .} И. ■?.'!' "Л он ‘І М О Т И Л Ы 1'Л ‘-Г 0\!Н''> . с ,• ;і т - 1 п

• •/! Г\ > не'-' ав ;:он •' >іу ■> иь •'•VI пом пчГчігі"! ^' > мк:.1; .,о

о : подели» к эфиру фуры-2 (2 мкМ) . Кроме того, з л 6 уфс-рпвз; ■ і: .■ С' ь пи г оь лаачс- способствует високо:.; сродство БЛФТа ^гоу. полу - в 2-3 раза нише, чем у фури-2 или индо-1. После создания таким образом буферной емкости для СаА еі'о запаси,, во гшу трик лоточни:-. депо стаиоиитсп уже недостаточно д л

11 о и и 'и с 11 и я [^п-^^1цит неоиходимого уровня и эта нехватка

компенсируется входом наружного Са2+ (рис 1). Е іакил > - лйиилл вход Ся**г о^с с п о чииаст &0-90% от обже^п у педичент.

(Г^+-•,ЦНТ*

Вместо хелатора БАФТА для создания внутриклеточной кальциевой буферной емкости можно использовать флуоресцентный зонд квин-2. Как и БАФТА, он имеет высокое сродство к Са2+, загружается о клетки до высоких концентраций (до 1-2 мМ) и очень удобен для регистрации 1Са2+]цит. Одновременно с измерением 1Са2+]цит по флуоресценции квина-2 было определено количество вошедшего в тромбоциты радиоактивного изотопа

4 с •> ^

С?*“ П опн'Г ил фактор активации ч ромбоціггсі! (рис. 2) <

; ачсС гио контроля брали тот «с препарат тромбони і он. по не

за|-ру «емших кальциевым хелатором Как видно из этих длміш\,

;;о і ланис н цитоплазме буферной емкости для Са“' рсч ко

^и счичи в аст индуцируемый агонистом вход ^'^Са“+ в клетки

4 с , ~> г

(_ л чоироизьолышй вход 'Са“ в тромбопитм по изменялся

2.Исследование мрхамизма рецепторзависпмого входа Са^т в тромбоцит« и гладкомшпечние клетки

Для изучения механизма рецопторзависимого входа Са/+ быт.

л ^

ПРИ мене ни методики О ДН о 13 реме ННО г О измерения {Са“' !цИ1 и потенциала плазматической мембраны с помощью двух' флуоресцентных зондов. В случае тромбоцитов были взяты квин-2 и потенциалчувствительный зонд сііЗ-С^- (5) , а для гладкомышечных клеток - фура-2 и бисоксонол. В зависимости от механизма рецепторуправлпемого входа Са*- , можно получить различные

Рис.3.Влияние ФАТ (20 нМ) на потенциал плазматической мембраны контрольных и загруженных квииом-2 тромбоцитов (А) и на 1^а )цит (Б). Измерения Е проводили в стандартной среде Тироде, содержащей 1 мМ СаСІ2 и 150 мМ ЫаС1. Высвобождение внутриклеточного Са определяли в бескальциевой среде в присутствии 0,1 мМ ЭГТА.

изменения мембранного потенциала. При активации каналов будет происходить деполяризация, при натрий-кальциевом обмене -гиперполяризация (поскольку на два заряда входящего Са^ + приходится три заряда трех ионов Ыа+), а при работе переносчика возможен электронейтральный механизм, й начале своей работы мы исходили из гипотезы, что вход Са^+ происходит через рецепторуправляемые каналы (Авдонин и соавт., 19 8 6]. Выяснение

влияния агонистов на мембранный потенциал позволяло нам подтвердить или опровергнуть эту гипотезу. Кроме того, если эта гипотеза оправдывалась, то при регистрации изменений мембранного потенциала можно было увидеть не только ток Са^+Г но и токи других ионов, которые могли проходить через каналы.

5 +

2.1.Вход Са в тромбоциты происходит через низкоселективные катионные каналы

Влияние фактора активации тромбоцитов (ФАТ) на потенциал плазматической мембраны тромбоцитов показано на рис.ЗА. В тромбоцитах, не нагруженных квином-2, не наблюдалось

существенного изменения Ем под действием ФАТ. Это могло бить объяснено тем, что в этих условиях входящие_._через каналы.токи. невелики и вызываемые ими изменения Ем компенсируются Са“ + -чувствительными К+-каналами. В нагруженных квнном-2 тромбоцитах активатор входа Са^ + ФАТ вызывает быструю и обратимую деполяризацию мембраны.

Параллельно с регистрацией изменений Ем под действием ФАТ мы измеряли ¡Са^+]1шт. Кинетика входа Са“+ практически совпадала с кинетикой деполяризации плазматической мембраны под действием ФАТ (рис,ЗБ). Деполяризация плазматической мембраны происходила также под действием других активаторов входа Са^+

- тромбина, АДФ, вазопрессина, аналога простагланлина Н U46619.

Наблюдаемому явлению можно было дать несколько объяснений. Во-первых, данные о деполяризации (рис.З) согласуются с гипотезой о том, что агонисты активируют рецепторуправляемые каналы, через которые входит кальций. Во-вторых, теоретически нельзя было исключить, что деполяризация обусловлена актиоацией ионами Са^+ хлорных каналов. И, наконец, в-третьих,

2 J,

одновременно с активацией входа С а агонисты могли

активировать еще и некие натриевые каналы, как :этп имеет место в случае тучных клеток [Penner et al. , 1088], и ток натрия через

эти каналы деполяризовал мембрану Чтобы разобраться в этих вопросах, мы исследовали влияние ионного состава внешней среды на деполяризацию. Для этого из среды был удален Са^т, a NaCl был замещен на хлористый холин, В таких условиях почти не было увеличения флуоресценции d i S- С ^- 5 в ответ на ФАТ ( р ис. 4) . Деполяризация мембраны, которая соответствует этим изменениям флуоресценции, по превышала 2 мв.

При добавлении в среду ионов Са^ + (рис.4) изменения флуоресценции diS-C^-(5) в ответ на ФАТ по величине не превышали прирост, наблюдаемый в контрольных условиях. Отличие от контроля заключалось ь том, что после очень кратковременной деполяризации мембраны в ответ на агонист развилась гиперполяризация ( Е = -5, 8 + 1, 5 мв, п = 4). Параллельно с определением влияния ФАТ на мембранный потенциал на том же препарате тромбоцитов проводилось измерение (Са2+jUHT. В

§

X

а

о

ш

о.

о

>1

<

&•

Е, мВ -35

-40

-45

-50'

-55'

-60'

1'*кч

Ч>АТ

Г

Рис.4.Активация под действием ФАТ входа в тромбоциты Са , Ва^+

(A) и происходящие при этом изменения мембранного потенциала (Б). Деполяризация плазматической мембраны тромбоцитов под действием ФАТ в бескальциевой среде в присутствии 135 мМ ЫаСЬ, ЫС1 или СзС1

(B).Увеличение концентраций Са и Ва

в цитоплазме регистрировали по флуоресценции квина-2.

лВ

135мм N<30 135мМ иС1 135мМСзС!

отсутствие ионов кальция в холинсодержащей среде этот агонист повышал [Са^+]цит на 34+9 лМ (п~2), а в присутствии в среде 1 мМ СаС12 - на 347+.1 8 нМ (п=2). Это говорит о том, что отсутствие индуцированной фактором активации тромбоцитов деполяризации в присутствии Са2+ в холинсодержащей среде нельзя объяснить инактивацией рецепторактивируемого входа Са^+. Следовательно, эти данные можно объяснить либо тем, что ионы Са^ + поступают в клетки не через каналы, либо переносимый ими электрический ток, даже при условии нагрузки клеток квином-2, все же значительно меньше, чем

гсж К через Си -активируемые калиевые капали.

Лгописти а 5сскз.льцнсоой сродс могут индуцировать иход ы

I р'_!л-('о1иг:'1.1 погон Вл“’, ;;о’! орме, такж!.' как и Са"4, евччыпар-' ел с

Ь И И 1 |ОМ - 2 и V ВО ДПЧИВ Л:/1Т О Г'О фл V ОРОСЦСН! [ИЮ К" роме юга, н з ве ;.Т: <о ,

что Ва"1 ингибирует Са^т-активируемые Кт-каналы [Соппог, 1979;

Л‘!лг^ аис! .'¡П2е, I 9О ] . На рпс.4 покязапз увеличение флуоп^.-цепппи

, -1 (.

м>. I !Т сл - 2, вызванное входом На" , п происходящие при з гом изменения Л т. 0 +

м'',,5згл’ноп гт^тенцнл ла. \пк пит но нз этих нчмпмх, п<од >■ сч■; • о!;о < ;и*о-: <" -I !.;•! 1 о чя ри ?а;и:еГ) мембраны ’Инл) иирпппиппл фа:; ! онг-,м ■; 1"ро:.»ооци 1 оь деиолнризацин зависела от концентрации

ентрациях наблюдалось уиеличение индуцироианного фактором

(вплоть до 60 мМ) приводил к увеличению вызванной агонистом деполяризации не более, чем на 30-35%, что говорит о насыщении. Представленные данные свидетельствуют, что индуцируемый агонистами вход двухвалентных катионов в тромбоциты происходит через каналы.

С по цу ющой чалачем'і работы было определение п оошшаемое ти исследуемых канаїю» для одновалентных катионов ü шляснснне иопроды тока, благодаря которому происходи г лсноляріпакни мембраны под влиянием агоиисгон в нормальных условия^, ¡.е. н присутствии и Cad-,, и Nad (рис. 3). Поскольку вход Са"т по низынаст заметной деполяризации, можно было предположить, чго заряды перепосл'1 ся с ионами Nah. Если это так, то в содержаще:'1 .Na ереде без Саь ісікає должна наблюдаться дополяртациг мемооатл а ответ на агонисты. Действительно, как показано на рис.4, в этих условиях ФАТ вызывал сильную деполяризацию мембраны ( Е=28,9+7,1 мВ, п=8), которая была гораздо больягсГі, чем п среде с 1 мМ СаС 1-, ( Е-9, 5^1,7 мВ п=6). При уменьшении коиценчрациг

NaCl н среде до 7 5 мМ и 15 мМ в результате замещения на хлористый холин деполяризация (_ЕМ) в бескалъциевой среде уменьшалась до 16±2,1 мВ (п=3) и 6,5+Д,4 мВ (п = 3) соответственно. Эти данные говорят о том, что ФАТ вызывает деполяризацию плазматической мембраны тромбоцитов путем активации входящего тока Na+. Помимо

Ыа*, ФАТ мог активировать вход в тромбоциты 1Л + и Сб+ (рис. 4). В бескальциевой 1^а+-содержащей среде другие агонисты также вызывали сильную деполяризацию мембраны: тромбин на 43,1 ±4,7, мВ (п=4), 1М6619 на 41,2±б, 1 мВ (п*4). Ыа+-зависимая деполяризация не подавлялась блокатором быстрых натриевых каналов тетродотоксином (1 мкМ) или ингибитором Ыа+/К+-АТФазы уабаином (10 мкМ) .

ФАТ

БА^ТА

Ем,м6

-30

-40

-50

-60

ФАТ

I

2мин

БАФТА

Рис. 5.Влияние ФАТ на концентрацию ионов N8 в цитоплазме и мембранный потенциал в контрольных и загруженных хелатором БАФТА (нижние кривые) тромбоцитах.

Для того, чтобы прямо зарегистрировать вход Ыа+ о тромбоциты

под действием агонистов, был применен Ыа+-чувствитепьный

флуоресцентный зонд бензофурапизофталат (8ВР1), которым нагружали

тромбоциты. В обычных условиях при отсутствии в тромбоцитах

1 +

дополнительной буферной емкости для Са фактор активации тромбоцитов не вызывал деполяризацию мембраны и не активировал вход (рис.5). После одновременной нагрузки клеток зондом БВРІ

и хелатором БАФТА наблюдалась деполяризация мембрани и активация

CS 200

U

<3

- A

- ■ 1 CaCI2 БЕЗ С a2*

- н і І »X'

\vv

N.2* 50 Cd3* ,uM Ni2- Cd2* 500 >uM Ni2* Cd2* 500 ЛіМ

CD

2 -го

2 -зо Ш

Mn ФАТ со ФАТ

р-* 1 Jл*

у**

Рис.6.Блокирование двухвалентными катионами рецепторзави--

симого входа Са (А) и N а+ (Б) »

тромбоциты. Изменения [Са2+1ЦИТ опреле-ляли в отсутствие и в присутствии 1мМ

CaCi-,

деполяризацию

регистрировали п бескальциевой среде в присутствии 150 мМ N301. Влияние ФАТ па Ем определяли в отсутствие блокато-роп и п присутствии 1 мМ МпС12, 5 0 мкМ Сс1С12, 35, 50 и 350

мкМ М£С 1 .

входа N'a+. Таким образом, эти данные прямо демонстрируют способность агонистов активировать входящий ток Na + через капали.

Осуществляется ли ток Na+ через те же каналы, которые обеспечивают индуцированный агонистами вход Са“+, либо эго параллельная активация двух разных видов каналов - натриевого и кальциевого? Напомним, что второй вариант описан для тучных клеток [Penner et al., 19 8 8 1. Чтобы сделать выбор между этими

двумя объяснениями, мы исследовали влияние на Na+-зависимую до поля рн з з паю бпокатороп входа Са‘-+. Ионы никеля н кадмия блокируют агонист-индуцировашши вход Са^+ п тромбоциты человека

и не влияют на мобилизацию внутриклеточного Са^+ (рис.6А) [Hallam

2 +

and Rink, 1985]. Полумаксимальное ингибирование входа Са происходит при концентрациях Ni^+ и Cd^+ около 50 мкМ. Как

показано на рис. 6Б. , оба эти катиона в концентрации 50 мкМ более чем в 2 раза подавляют индуцированную ФАТ деполяризацию,

А- Б

Е,мВ _ дЕ.

-35 150 мМ NaCl с М[™

А 1—

-45 ! \ 150 ыМ NaCl 60

\ 1мМ СаС12 60 V

-55 \ 40 1

-65 \ -v^j\ 20 V,

! 1 0

ФАТ ФАТ 7 6 5 4 3

-Lg([Ca2+], М)

Рис. 7.Подавление ионами Са2 + индуцированной ФАТ Na+-зависимой деполяризации плазматической мембраны тромбоцитов.

вызванную входом Na+. Деполяризация подавлялась также ионами Мп2 + (1 мМ). Ранее было показано, что агонисты активируют вход Мп2 + в тромбоциты [Hallam and Rink, 1985 1. Эффект Mn2+ объясняется , по-видимому, его конкуренцией с ионами Na+.

В присутствии ионов Са2 + и Na+ индуцированная под действием ФАТ деполяризация мембраны тромбоцитов ниже, чем в присутствии только ионов Na+ без Са2 + (рис.7А). Ингибирование не

2 + - 7

проявлялось при концентрации свободного Са в среде, от 10 до

10”^М. Ингибирующий эффект ионов кальция проявлялся при концентрации ионов Са2 + 0,1-1 мМ с Kq ^ около 0,25 мМ (рис.7Б).

Таким образом, приведенные данные (блокирование натриевого тока ионами Ni2 + , Cd2 + и Мп2+, ингибирование ионами Са2+) указывают, что вход Na+ происходит через те же каналы, которые ответственны за рецепторзависимый вход Са2+ в тромбоциты. Исходя

из этого можно сделать вывод, что рецепторуправляемые каналы в

/-2 +

тромбоцитах не являются строго селективными по отношению к Са , по и хорошо проницаемы для Na+, Li+ и Cs+.

2. 2. Влияние активатороа входа из ысибраннкЛ потенциал

гладкомишсчних клеток аортіл

3 г и іді; ом я in о ч її и ч клетках (ГМК) аорты криста _ ¡:- с і ¡.г ;v- і со,; ,* << я н но \( .і д з он ро с cm;a, аигиогензина 11, тоомбинл, 'іилпоттчп'ч и нссотзрі-гх лруї мч .’гоклстс.і { I і ; ;пл о і '¡І. ,

; Johnson ¿1 -ді. , I 9 I + ! X; ¡Jerk г t лі., і 9 ‘і і ] . --St ~ >4

что ;;ри добавлении к клеткам тромбина ппомсчо,п”т . '.Tj ; " ¡і п ^ р : > о j: т и з •?.. і,и>ч і ;іЧ”.ско,і ч^мЗ,-! :i"j "\z"' ^

і <) )

Гтп,-;т'5 ¡¡.и-1 м:1миоч)1ни:; к огокциал мсл'юппо иоз>:р?г 1- л к исходному значению. На нижней кривой (рис.8А) показаны изменения

флуоресценции ''трт1 ~ ^__<11 иНИСТОМ упалм'!«-"»

idf-us ж я прСіг'

и >*н,цотел:-!гі-

Мы предположили, что регистрации рсцепторуправляемых каналов ГМК препятствует высокая активность Са^+-чувствительных калиевых

UJ

Тр

ш

!ТР

I

•¿ГО 800 1500

'і*лму і ■ •

*’'■> iV* ' t *г;'у« I,**; U~!, 4 '

400 300 1200

ВРЕМЯ, сек

Рис.8.Деполяризация плазматической мембраны и изменения [Са^+|цит в гладкомышечных клетках под действием тромбина в контрольных условиях (а) и после загрузки их хелатором БАФТА (Б).

ВПр

Рис.9.Влияние вазопрессина (О, 1 мкМ) на мембранный потенциал гладкомышечных клеток в контроле и после забуферивания цитоплазмы кальциевым хелатором БАФТА. По оси ординат отмечена флуоресценция бисоксонола.

каналов. Для того, чтобы воспрепятствовать их активации, был использован уже примененный ранее подход с забуфериванием цитоплазмы кальциевым хелатором. Для этой цели был взят хелатор БАФТА. ГМК нагружали предварительно кальциевым зондом фурой-2, а затем одну партию клеток инкубировали в присутствии 20 мкМ ацетооксиметильного эфира хелатора БАФТА, а другую - в контрольных условиях. Вслед за этим определяли влияние тромбина на потенциал и на (Са2+]цит (рис.8Б). В ГМК, нагруженных хелатором БАФТА, увеличение [Са2+]цИТ в ответ на тромбин было значительно меньшим, а перед гиперполяризацией происходила кратковременная деполяризация мембраны. Кинетика деполяризации совпадала с кинетикой увеличения [Са2+]цит. Еще более выраженные эффекты на мембранный потенциал наблюдались, когда вместо тромбина был использован другой агонист - вазопрессин (рис. 9). В контрольных клетках вазопрессин гиперполяризовал мембрану, а после забуферив-ания цитоплазмы его действие становилось прямо' противоположным. С помощью зонда БВР1 показано, что оба агониста активируют вход Ыа+, причем действие вазопрессина было более сильным; агонистин-дуцированная деполяризация резко уменьшалась при замещении на

непроникающие катионы (данные не показаны). Приведенные результаты свидетельствуют, что в гладкомышечных клетках, как и в тромбоцитах, агонисты активируют Са^+-транспортирующие каналы, проницаемые также для

3.1; Участие------ГТФ-спязмвяющих" белков п активации

рецепторзаоисимого пхода Са7'

jicíiCTiiiiCM агонистов, сиязицающихся с " ссмпломоппыми " рецепторами. Рецепторы, входящие в это суперсемейство, акт[!»!!руют сітчана ГТФ - с ізя з un аюіцнс белки (G-бслкн) п тс, и спою очередь, оказывают воздействие на целый ряд мембранных систем - аденилатциклазу, фосфолипази С и А2, отдельные виды капнепих каналои и т.д. [Вirnbauroer, 1990}). В то же время есть

механизмы гормонального иоздсіїсіиия, при которых рецепторы сами выполняют роль эффекторпой системы как, например, никотиновые холипорецепторы, являющиеся Na+/Са^+-каналами [Katz, Miledi, 1969; Decker, Dani, 1 9 9 0 I , рецепторы предсердного натрийуретического фактора, работающие как гуанилатциклаза (Paul et al., 1987J, рецепторные тирозинкиназы факторов роста [Carpenter, Cohen, 1990]. Мы решили исследовать, участвуют ли G-белки в активации рецепторзависимого входа Са^+. Для этого, во-первых, определяли, сопряжены Ли рецепторы агонистов,

Рис. 10. Активация пол действием ФАТ (0,1 мкМ) гше ок оаффн иной ГТФазы 0-белка в плазматических мембранах тромбоцитов.

ГТФ. мкМ

активирующих вход Са^+, с ГТФ-связывающими белками, и, во-вторых, исследовали действие активатора О-белков фторида на рецепторуправляемые каналы. Эти исследования проводились на тромбоцитах и клетках А431.

3. 1. 1. Активация кальциевыми агонистами высокоаффинной ГТФазы.

Взаимодействие рецепторов с ГТФ-связывающим белком (или белками) плазматической мембраны оценивали по влиянию агонистов на активность высокоаффинной ГТФазы, каталитический центр которой находится на альфа-субъединице б-белка. На рис.10 показана зависимость активности ГТФазы от концентрации субстрата. Видно, что эта зависимость представляет из себя наложение двух линий: кривая линия при низких концентрациях субстрата отражает гидролиз ГТФ высокоаффинной ГТФазой, а прямая характеризует зависимость скорости гидролиза от концентрации ГТФ для неспецифических нуклеозидтрифосфатаз. Кажущаяся Км высокоаффинной ГТФазы составляет приблизительно 0,3-0,5 * 3 О”^М. Км неспецифической ГТФазы превышает 10 мкМ.

Как видно из этих данных (рис.10), даже в отсутствие агонистов высокоаффинная ГТФаза проявляет некоторую активность. Возможно, базальная активность ГТФазы отражает спонтанный обмен

Рис. 11. Зависимость активности высокоаффинной ГТФазы в-белка и аденилатциклазы плазматических мембран тромбоцитов от концентрации 1)46619.

гуамилогшч иуклоотилоп ид Ci-белках. В наших экспериментах ми оіфо;и.:лп!іи илнпнис па ГТ'І'азу плазматических мембран тромбоцитом

агонпстоз, иизииающих подъем (Са^4 1,1ИТ. о . этих..клеткахфактооа —------ —

'і ктииацми тромб о ніг гоп ( ФАТ ) и с та икл/»мо го a/i л лога и рос глглаг/,;-кионон -juroiicpcKuc’t Н-, U460 1 9 { 9 , 1 3 * метано-эпоксн - 1 5 - гщюок си -

проста- 5, 13 диеновой кислота). ФАТ активирует гидролиз ПТТ> писокояфФиино)! ГТФазой, по не »лпйвт на неслеяифичссиго иуклеозидтрифосфатази (рис. 10). Влияние ФАТ на иисокоаффинную ГТФазу лучше пилмо после пычитапия из общей активности пклада песпецпфичоского гидролиза ГТФ (вставка па рис. 10). Агонист рецепторов тромбоксана А2 U46619 также стимулирует гидролиз ГТФ высокоаффинной ГТФазой (рис. 11). Активяиия высокояффиноГ! ГТФлзп мембран тромЗоцитои продемонстрирована также лля .npyrnv пг-оиистон, повышающих 1^а^+1цИТ- ~ тромбина и вазоирессина (Grandt

et al., 1986; Houslay et al., 1986J.

Таким образом, приведенные данные указывают, что рецепторы агонистов, повышающих (Са 1цит п тромбоцитах, сопряжены с ГТФ-связивающим белком (или белками), который, по всей вероятности, нужен для передачи сигнала на системы, обеспечивающие подъем внутриклеточной концентрации Са^+.

Однако, нами было показано, что помимо активации входа Са^+ в тромбоцити тс же самые агонисты ингибируют а до н и л атци ¡< л а з у ipnc.M; [Avdonin et al. , 1 ^ К 5 а, b J ) Ингибирование

алепилатциклазы коррелирует' с актнпацией иысокоэффинной ПТФазы, поэтому можно было С>и предположить, что О-белок сопрягает рецепторы с адспилатциклазой и sic имеет отношения к кальциевым каналам. В связи с этим необходимо било оценить независимым методом взаимодействие (И-бедка (белкой) и канадон.

3.1. 2. Вход Са^+ при актинации G-бслкоп фторидом.

Для псех ТИПОВ гсторотримерных О-болков С II о it С "Г О С If II о активироваться иод действием фторида (5-10 мМ). В качестве кофактора при активации G-белков фторидом в среду добавляют микромолярные концентрации AlCl-j, поскольку активирующим действием обладает комплекс AIF^ (Sternweis, Gilman, 1982], который взаимодействует с ГТФ-спязьтатщим центром С-белков.

1 мин

дагитонин

Й дигитонин

♦

¿))р,Ш+Се.С12 Ы01+Вааг

Иттш ^шшшт-ыа3

♦ ♦ ♦

Ска2 № ВаС12

Рис. 12. Активация фторидом входа Са^ + и Ва^+ в тромбоциты. По оси ординат обозначена флуоресценция квина-2.

Большим достоинством А1Р^ по сравнению с другими активаторами в-белков - ГТФ и его негидролизуемыми аналогами, является его способность проникать через плазматическую мембрану внутрь клеток.

Для определения влияния А1Р4 на|1Са^+]цИТ за 5 мин до СаС1-2 в среду добавляли 9 мМ КаР и 20 мкМ А1С1^. Эти концентрации оптимальны для активации мембранных С-белков. Последующее добавление в среду ионов кальция приводило к резкому подъему [Са^+1цит Д° величины 434.+ 24 нМ (рис.12). Теоретически эффект фторалюмината можно было объяснить тем, что он ингибирует

•у х

выведение Са из клеток АТФазами, а не активирует его вход.

Чтобы исключить эту возможность вместо Са^ + был использован Ва^ + .

Выше были приведены данные о том, что рецпторуправляемые каналы

2 +

проницаемы для Ва и в то же время этот ион не откачивается из

цитоплазмы кальциевыми АТФазами. Как показано на рис. 12, фторид

• ") +

вызывает вход в цитоплазму ионов Ва , которые, взаимодействуя с квином-2, усиливают его флуоресценцию. В бескальциевой среде фторид не вызывает подъема 1^а^+1цИТ в нагруженных квином-2 тромбоцитах. По-видимому, это объясняется болЫлой буферной емкостью, создаваемой квином-2 в цитоплазме, что не позволяет

2

регистрировать высвобождение Са из внутренних депо.

Повышение [Са^' 1цРТ под лсиствисм фчоралюмнпата наблюдалось и на других типах клеток. Нэ пис. 13 показана вызванные-Фторидом' изменения [ С а‘’.Т. ] в к л стіс л ч эпи.цорм^лыюи карциноми л • З 1 ,

I Г'П ОрЫС НОГру .КО I ¡1»! ИНГОЙ-І. Кг-'К ВИДНО і і 3 ,ГП!\ напних, :з ¡. по г.-. л.х

\;3 1 \1Г'« мошдглет ! С'--" ‘ ] цкт как за счет его пнепобожчення ггз

внутриклеточных чем о, пи и н результате; входа наружного С а ~+ ’’Місі: грофнзно лог ичоскио не слало и алия метолом локальной фиксации потенциала показали, что вход Са^ + проио.холиг чего і канули Их проводимость еостанчнот 2,5 г;С, и конфигурации і п •? і ч‘ а - пи ‘ си а к і пн ¡і р у рте її г а к ,1 с- аналогом ГТ'15 - Сзрр(І^Н)р (данные не

нрнаодятся).

Резюмируя пп°"Г"г данные, мо”т;о ^аклычшь, что фтор.,,;

имитирует дйистри'* 'ітііі'.Оии, акі ивнрующих вход кальция із клетки. Действие фторида направлено на ГТФ-соязывающий белок (или белки). Сопоставление наших и имеющихся литературных данных показывает,

200

+

см

03

О

100«-

І

I

501

’чч^

авдадум

8 12 16 мин

Рис. 13 . Высвобождение внутриклегочного и вход наружного Са клетки А431 под действием фторниа.

что способность активировать кальциевые каналы не является специфическим свойством какого-либо одного типа Б-белка. В тромбоцитах сопряженный с каналами ГТФ-связывающий белок не-относится к или в^-типам, поскольку ни коклюшный, ни холерный токсин не устраняют активацию высокоафинной ГТФаэы под действием ФАТ или 1М6619. В отличие от этого индуцированный фторидом и агонистами вход Са^+ в клетки А431 устраняется холерным токсином (данные не приводятся), который специфичен в отношении 05 или близких к ним белков. Есть агонисты, активация которыми входа Са^+ блокируется коклюшным токсином.

3.2.Сопряжение рецепторуправляемых каналов с внутриклеточными кальциевыми депо.

В действии на клетки изучаемых нами агонистов, активирующих вход Са^+, есть одна общая закономерность, - все

Рис. 14.Влияние ди-терт-бутил-бензогидрохинона (25 мкМ) на концентрацию ионов Са , N3* в цитоплазме тромбоцитов и потенциал плазматической мембраны. {Са^+)цит определяли с помощью фуры-2, когда тромбоциты были суспендированы в среде с 1 мМ СаС1-2- При измерении [Ыа+1цит и Ем тромбоциты находились в среде без кальция. В конце измерения [Ыа+1ЦИТ в среду добавляли грамицидин 0 (10 мкМ).

ОНИ ТЭКЖО стимулируют гидролиз фОСфОИНОЗИТИДОВ и ВЫСВОбОЖДСНИС Са^ + из внутрикнеточных депо. Это указывает на существование глубокой связи между входом Са^*,- с одной стороны, и образованием ииозитол-1,4,5 -трисфосфата и мобилизацией внутриклеточного Са ~ , с другой стороны. Высказывалось по крайней мере две гипотезы, объясняющие данный феномен. По одной точке зрения, инозитол-1,4,5-трисфосфат открывает кальциепые каналы не только во внутриклеточных везикулах, но и в плазматической мембране. Такие каналы п плазмалемме действительно найдены [Kuno, Gardner, 1986; Mozhaeva et al., 1990], однако теперь уже ясно, что это не единственно возможный механизм активации входа Са^+. Вторая гипотеза предполагает, что каналы плазматической мембраны сопряжены с внутриклеточными кпльцнс'ьими депо и активируются при выбросе из них С а ^ + [Putney, 1986]. В последнем случае последовательность реакций, приводящих к активации каналов плазмалеммы, будет также включать в себя на первой стадии гидролиз фосфатидилинозитол-4, 5-бисфосфата, далее ИнФ^-зависимое высвобождение Са^+ из внутренних депо, а вслед за этим передачу воздействия от везикул к плазматической мембране.

Вторая гипотеза косвенно подтверждается данными о том, что ингибиторы Са^+-насосоо ретикулума тапсигарпш и ди-терт-бутилбензогидрохинон (БГХ), вызывающие выход Са^+ из внутриклеточных депо п цитоплазму, одновременно активируют вход Са^+ снаружи Мы исследовали, окажет ли влияние бутилбелзо-гидрохинои на вход Na+ через предполагаемые рецепторуправляемые каналы тромбоцитов. Как показано на рис. 14, 25 мкМ бутилбенз-

огидрохинон в натриевой среде без Са^+ активировал вход Na+ и вызывал деполяризацию мембраны. Эти эффекты блокировались ионами никеля. Быстрая деполяризация, коррелирующая с активацией входа Са“+, под действием данного соединения наблюдалась также в гладкомышечных клетках (данные не приводятся). Таким образом, можно прелполагать, что один из путей активации рецепторуправлясмых каналов осуществляется із результате их сопряжения с внутриклеточными кальциевыми депо.

4,Предполагаемый механизм инактивации рецепторуправляемых кальциевых каналов.

4.1.Блокирование рецепторзаписимого схода Са^+ протеинкиназой С.

После добавления к клеткам агонистов повышенный уровень [Са^+]цИТ и активность рецепторуправляемых кальциевых каналов сохраняются в течение ограниченного времени. При этом даже в момент наивысшсго подъема 1Са2+]цит остается высокий градиент в концентрациях ионов Са^+ снаружи и внутри клетки, и с термодинамической точки зрения их ток через мембрану не должен прекращаться. В связи с этим можно было преднолагать, что существует механизм инактивации рецепторуправляемых кальциевых каналов. Как показывают опиты с нагрузкой клеток хелаторами Са^ + , причиной закрывания каналов может быть увеличение

Г ^ 1 П Ч П П М II "Э птг'гтчш/ ИЛ'ГЛИГ^Г!' ■«ишт |А|и1 П ЧП I I Л I I П I' -I 1» 1^ ПМП

является Са^ - и диацилглицеринактивируемая фосфолипидзаписимая протеинкиназа (протеинкиназа С) (^БЬ^гика, 1 984). При действии

[рм4

м

Рис.15.Блокирование активатором лротеинкиназы С форболмирис-татацетатом (ФМА) увеличения IСа } под действием ФАТ. Концентрации ФМА: 2 - 0,05, 3 - 0,15, 4 - 0,3, 5 - 0,6 и 6 - 6 нМ.

1 - в отсутствие ФМА.

агонистоп она актиинрусгся как cavitM Ся" , ток и образующимся ьо ирсмя гидролиза фо с ф о пн о з и т и д о;; диацилглинерип’им. В ь: • •" предположено, что., даниьп*' ф<^ р чеич учасм . t т ь г t:; j ре»»«*птор зяиис ичого обмена С.а ~

' Г,к ! iifs.i;í!H1 i:rOTOI4IKHIiáji4 С был ИСПО^ЬЗСЬи'! см Р> чт> рпь,.; п:.,члсг лиацилглим^рк!/;! -í-óe гл-форбо.'1мир1!/:та гацста 1 ((.‘\ЧЛ - ,

Ctк"í !ппiр' юишíí э:иг ;|'срмсп i даже при порчалььсм уровне •

(100 ¡ЛЬ. Как оказалось, ФМА уже ггртт koi;kí ¡прйшт И-‘ ‘ ‘-К ‘‘ '■

подавляет и чоонл»'.? i-irntó :-> • i v rpn:> лет с. м ¡ о Cj" г- о '¡¡с.;- г««*

!<'! о р i :< г п ¡jó пп и '! р-.чГо'апо,, (рис. 15) и другие агонисты - АДФ, ipk-.iOiui <;2.зод*рессии и аналог простагландинот-"-“

U4 66 1 9. Полумаксимя"' **Г'_ ¿аи'ибмргпглк.ь кал*-'"” „,,х отпетиь ■"¡^..¡«ицито« гр .'..wauiiuti^ пр.. ..^ицсччтрации ФМА 0,5 нМ. В этих же v^.t i рациях форболмиристатацетат актиЕшрует протеипкипазу С

[Са^+]цит,нМ 5СЮ

300

200

150

фаТ№ц4

2 мин

ФАТ

ПГЕЧ

г. ¡ .*{ **;

rj¡ ■ - ' ' - Д,. Y ■ i )

“11

nns,|

Л),ФАТ

CDMA {

Рис. 16. Подавление форболмиристятацстатом (0, 1 мкМ) .и r^zr ,.j; —

дином Ej (10 мкМ) индуцированных ФАТ угс имя ! Г г, '' ] {Гt* - 5‘ “

зависимой деполяпм^г*:-:;;! s з -, ^ чмитнч' скоГ: 1 рг?мс:с:¡\ .

{Castagna et al. , 1982}. 4-альфа-форболдидеканоат, стереоизомер,

не обладающий способностью активировать протеинкиназу С, не вызывая подавления рецепторзавнсимого подъема [Са2+]цИТ в тромбоцитах. Таким образом, действие форболмиристатацетата специфично и опосредовано протеинкиназой. С. Одновременно с нами аналогичные данные были получены Макинтайром и соавт. [MacIntyre et al., 1985]» показавшими, что форболмиристатацетат в тромбоцитах ингибирует повышение [Са^*]цит и активацию фосфо-инозитидиого- обмена, вызванные вазопрессином. Впоследствии блокирование протеинкиназой С рецепторзавнсимого подъема [Са2+]цмт и фосфоинозитидного обмена было продемонстрировано на многих типах клеток (см. обзор (Houslay, 1991]). В частности, нами было показано, что форболовый эфир подавляет вызванное гистамином увеличение [Са^+]цИТ'в эндотелиальных клетках кровеносных сосудов и в трансформированных клетках эпителия линии HeLa (данные не приводятся).

Подавление протеинкиназой С рецепторзавнсимого увеличения

[Са2->'1цИТ может происходить в результате блокирования поступления

Са^+ в цитоплазму из внешней среды и ретикулума либо в результате

активации кальциевых насосов» удаляющих этот ион из цитоплазмы.

Для того, чтобы оценить влияние данного фермента на

рецепторзависимый вход ионов кальция было исследовано влияние

форболмиристатацетата на вызванный тромбином захват ^Са^ + , на

индуцированные агонистами вход Мп^+ и Ва^+ и на деполяризацию

мембраны, обусловленную током Na* через каналы. Измерение

количества поглощенного тромбоцитами радиоизотопа проводили

одновременно с определением 1Са2+]цнт в нагруженных кпииом-2

тромбоцитах, ФМА, добавленный за 1-2 мин до тромбина, резко

2 +

уменьшал вызванный этим агонистом подъем (Са Іцит и по/иіость,° подавлял захват 4^Са^+ (Авдонин, Алтухова, 1985], Активация протеинкиназы С устраняла также вход Ва^ + и Мп^+ (данные не приподятся) и ток Na^ + через рецспторуправлясмые каналы (рис.16). Таким образом, псе эти результаты однозначно показывают, что подавление рецепторзавнсимого увеличения 1Са^+]цИТ в нервую очередь обусловлено инактивацией механизма его входа.

Каким образом протоинкипаза С блокирует канали? Мы уже пи-

сали, что рецепторупрапляомыо капали и тромбоцитов, и других клеток устроены очень сложно. Их..открывание"происходит п несколько, стадий;"'включающих спязипаиис гормона с рецептором, активацию G-белка и затем передачу воздействия от G-белка на капал либо непосредственно, либо через фосфолипазу С и продукт фосфолипазпой реакции - инозитол-1, 4,5-трисфосфат. Теоретически блокирование может происходить на любом из этапов передачи гормонального сигнала, так как протеинкипаза С в принципе может фосфорилировать рецептор, G-белок, сам капал либо какой-нибудь другой компонент, участвующий в сопряжении этих белков.

-» +

4. 2. Блокирование протеинкиназой С увеличения (Саг*’ 1цИТ* вызванного фторидом.

Может ли подавление протеинкиназой С рецепторзавнсимого входа Са^+ быть обусловленным воздействием этого фермента на рецепторы агонистов? Прецеденты такого рода имеются: протеин-киназа С фосфорилирует альфаj-адренергические (Leeb-Lundberh et al., 19S5J, мускариновые холинергические fKwatra, Hosey, 19 861 и другие рецепторы, изменяя их сродство к лигандам я взаимодействие с О-белком. Если это гак. то активация протеинкиназы С фопболовым эфиром но должна подавлять вход Са~т. вызванный фторидом, который, как огмечалочь ранее, активирует G-белок напрямую, минуя рецепторы.

Однако оказалось, что ФМА подавляет отвег громбопитов па фторид точно так же. как и в случае нормального способа увеличения {Са~+]цИТ (г.е. при действии агонистов через их пепгчггоры) .

По.чума,.сималыюс ингибирование наблюдается при концентрации ФМа

- ’ Г/ - ч

около 1О -10 М. что примерно соответствует той дозе, которая оказывала 50'й-ный ингибирующий эффект на увеличение (Са^+][[ИТ, вызванное агонистами. Исходя из ^того можно заключить, что блокада протеинкиназой С рецопторзанисимого «хода Са~+ не внзнапа инактивацией рецепторов, -\ происходит на какой-то более поздней стадии передачи сигнала.

4.3.Влияние протеинкиназы С на чувствительную к GTPgamroaS фос-фолипазу С.

Вторым после рецепторов компонентом в системе передачи гормонального сигнала является в-белок, который в рассматриваемом нами случае должен быть сопряжен с фосфолппазой С, прямо с каль-

Рис.17.Потеря чувствительности мембранной фосфолипазы С к гуано-эинтиотрифосфату (СТРдаштаБ) после активации эндогенной протеин-киназы С. Мембраны выделяли из эндотелиальных клеток, преинку-бированных в отсутствие или в присутствии 0, 1 мкМ ФМА.

циевыми каналами либо и с тем, и с другим. Мы решили оценить влияние протеинкиназы С на регулируемую в-белком фосфолилазу С в клетках эндотелия, в которых, как ранее нами было показано, активация протеинкиназы С форболмиристатацетатом приводит к устранению их чувстоитсльиости к агонистам, увеличивающий

ІСа2+іцит-

Фосфолипаза С в мембранах эндотелиальных клеток активируется тромбином и GTPgammaS, при действии которых наблюдается синергизм (данные не приводятся). Для изучения влияния протеинкиназы С на этот фермент клетки, из которых проводилось выделение мембран, проинкубировали в течение 5 мин в присутствии 10 М форболмиристатацетата. В контроле клетки

преинкубнровали с неактивным эфиром форболдидеканоатом. Как показано на рис.17, а мембранах контрольних клеток GTPgarшnaS активировал фосфолипазу С более, чем и 2 раза.-После преипкубании с ФМА происходило-сниженис'базальной активности фосфолипазу С и фактически полностью подавлялась активация со гуаниловым нуклеотидом.

Полученные данные указывают, что прогенпкиназа С может подавлять передачу сигнала от агонистов, активирующих вход Са^+ на уровне О-белка и фосфолипаэм С. Однако из этих результатов остается поясним, какой из этих двух белкой инактивируется. Били основания предполагать, что мишеныо для протеинкиназы С является альфа-субъединица С-белка. В пользу этого спилетсльстионало то, что в условиях іп vitro іомогеннап О -альфа яплястсп субстратом протеинкиназы С {Каї^сїа еі а1. , 1985]. После фосфорилирования в--

альфа утрачивала способность ингибировать аденилатциклазу. Можно было допустить, что альфа-субъединица в-белка, передающая сигнал от рецепторов агопистоп, активирующих вход Са^+, также может инактивироваться под действием протеинкиназы С.

4.4. Избирательная инактивация протеннкиназой С ГТФазы С-белка, сопряженного с рецепторами фактора активации тромбоцитов.

Опыты по опродс лейию влияния протеинкиназы С па чувствительную к агонистам высокоаффиппук> ГТФазу проводились па тромбоцитах человека. Общая схема постамоики эк с перимен гоп была такой же, как и при изучении регуляции фосфодииазы С. Тромбоциты преинкубировали 2 мин и присутствии 1 0 ~ М форболмиристатацетата или неактивного эфира форболдидекапоо.та. После этого проводили выделение мембран и определяли в них активності» ГїФази. С тромбоцитах есть но крайней мерс три типа

О-бедков- 05, сопряженный с рецепторами простАгландина ,Е^, С|,

сопряженный с альфа2-адренорецепторамн, которые ингибируют аденилатниклаэу и пеидептифицпровапиый О-белок (или 0-белки), опосредующий действие агонистов, активирующих фосфолипазу С и повышающих 1Са~*|цИт. На роль последнего выдвигается недавно открытый белок (или Сх), который не АДФрибозилируется

коклюшным и холерным токсинами. ГТФазную актипності. каждого из

этих белков можно избирательно стимулировать, возбуждая соответствующий рецептор, и по ее приросту судить о функциональной активности интересующего нас О-белка.

На рис. 18А показано, как увеличивается скорость гидролиза

ГТФ под действием адреналина, фактора активации тромбоцитов и

простагландина Е^. .В контрольном препарате мембран тромбоцитов

каждый из этих агонистов увеличивает гидролиз ГТФ за счет-

активации высокоаффинной ГТФазы своего в-белка. После обработки

тромбоцитов активатором протеинкиназы С форболмиристатацетатом

совершенно не изменяется ГТФззная активность сопряженного с

рецепторами простагландина Е^ белка С&, на 26% снижается

активация адреналином ГТФазы белка 0^ и практически полностью

исчезает активность ГТФазы С-белка, сопряженного с рецепторами

фактора активации тромбоцитов. Во всех случаях реакция гидролиза

3 2

[гамма- Р)~ГТФ была линейной в течение 15-минутного инкубационного периода. Из этого следует, что устранение после активации протеинкиназы С действия фактора активации тромбоцитов на

Рис. 18.Избирательная инактивация эндогенной протеинкиназой С ГТФаэной активности С-белка, сопряженного с рецепторами фактора активации тромбоцитов (А), и влияние протеинкиназы С на аденилатциклазу тромбоцитов (Б). Перед выделением мембран тромбоциты преинкубировали 2 мин в отсутствии и в присутствии указанных на рисунке концентраций ФМА.

шлсокоаффмшіую ГТФазу не обусловлено снижением стабильности G-

белка, - - ' ’ _

....На- основан» и " л сіл н их о подавлении про тс и п к и л а з о й С нн-

дуииронапного (р'го р//дом у ¡¡елнчсння ( Са ~ } цИТ, ii-бслокзаьіісимои

фосфолииазы С и ГТФазной активности О-болка, сопряженного с рецепторами фактора актнпании тромбоцигон, можно заключить, м'іо действие протеипкинззи С направлено на G-белок, отличный

ОЧ Gx И Og. Такой ВЫВОД СЛ<?ДуОТ 1>3 ТОГО, ЧЧО 0--ГК'ЛСЬ ''МіГЯОГГ?: с.і'-.іс rf.tMiicj** еГ.цмч компонентом но ьссх троч ксс.'!елогіаіи;ііг<ся г кггомач "Jra глію-іеза, с:.ориые высказанная нами о 1 987 г. (Avdonin, Tkachuk, 1987} получила подтоержпенм<=» ^ rr,Zo':o Карлсона

И СПЯ«Т I ^ j,i ii»un Ct Я»І , * П $ 9 J , г% ^ і О П Ije Ci\pub<l ли

іромопи.итн n обработали их форболошлм эфиром (ФМА) и

после этого пропели иммунопреципитацию с помощью специфических антител против альфа-субъединицы G^-белка. Оказалось, что протеинкипаза С пнзиваст включение метки в 02-альфа и не фосфорилирует другие G-белки.

4.5.Частичное устранение протеиикиказой С G-белокзаізисимого ингибирования аденилатциклазы троыбоцитоп.

Фактор инацпи -і ромбоцитпц не тельце повьпиаеч | Са~ ' по и ингибнруот через G- бо м ок а де н и л атци к л а з v тромПоціп ои jAvdonin ct лі , і ' > ^ { . Оказалосг, , что про і сипкпплза С } сі рзиясг

а ■ і г но п ру ющин З'рфект данного пгонисга (рис. І8Б) В несколько '■'спьшей степени } менынается ипгтЗипоппнпо здоппла гциклазы а д ро на л и і і о м и > с л л ип а є і с я ос акгттция і'рог'і аі'.’ійіитном P. , Слияние і: ро ге инк и и а ‘ч i,i С ¡а а д і., м и л а тпи к л д з v имеет нозмо по . '¡чгз и о :;оп1чи'1'но1 • :?i ¡а '-ччпю . потом у что оно наблюлає і с я на нн гаитиых j ромбопп! ах ( Андсшш и сиаит. , 19866}. Может возникнуть вопрос,

не объясняется ли Са ^ + - блоки^ю>”Р*г* дпГіс і пне ,/до ; г миг иплзы С г. >• '! и о а п и о и д с п и л а і пик-тли : і п с v ■: < ■ ч ,<чц н м и с л а ь л о н и о м рс;'(л: го-и нл!сгм>.;ч' у: -- <-*,*■<;» нпя ,и ~ Іцит *‘од влиянием цАМФ. Однако э.о не так, Во-первих, после инкубации тромбоцитов с форболовым эфиром фосфорилируются сопсем не то белки, п которые включается фосфат при добавлении простагландина Е-. ( ¡и. ¡чмш'.<:(>г; с>< ,

Кг»ом» 7ЛГЛ, ■*’ і • Л 'і: > ¡< 1.' \ р >" ■! .с > і: 15• і'Г л ■,; і -і і цч- * * и р а-- ч < • к і І і

не изменяется. Из всего этого следует, что в тромбоцитах протеинкиназа С не только блокирует рецепторзависимое увеличение {Са^+]цит, но и переключает чувствительность этих клеток с агонистов, активирующих Са^ + - зависимые реакции (секрецию, агрегацию), на агонисты, действующие через цАМФ.

5.Влияние активаторов адснилатциклазы и цАМФ на внутриклеточный кальциевый обмен.

2 +

Аденилатциклаза и система обмена фосфоинозитидов и Са -это две основные сигнальные системы клеток животных. Их функционирование взаимосвязано. Хорошо известны данные о согласованном влиянии цАМФ и СаА на энергетический обмен, секрецию, сократимость клеток, ионные каналы плазматической мембраны и т.д. {Rasmussen et al. » 19901. Взаимодействие

кальциевой и циклазной систем проявляется также на уровне регуляции ими активности друг друга. Было известно, что в сердце [Reuter, 1 987 ) и в нейронах [Федулова и соавт. , 1981)

потенциалуправляемые кальциевые каналы активируются путем цАМФ-зависимого фосфорилирования. В обонятельных нейронах цАМФ непосредственно открывает Са^4-транспортирующие каналы [Колесников и соавт., 1990}. Влияние цАМФ на

рецепторуправляемые кальциевые каналы не было исследовано.

Мы исследовали влияние активаторов аденилатциклазы и цАМФ на рецепторзависимый вход Са^+ в тромбоциты. В отношении тромбоцитов было известно, что цАМФ подавляет Са^+-зависимые реакции этих клеток [Feinstein et al., 1981] и препятствует увеличению [Са2 +1иит [Rink, Smith, 19831. Механизм

7 +

ингибирования рецепторзависимого подъема [Са 1цИт не ®ыл изучен. Высказывалась гипотеза, что в тромбоцитах происходит цАМФ-зависимое фосфорилирование кальциевого насоса и его активация {Adunyah, Dean, 1987J.

На рис.16 показано, что добавление простагландина Ej за 1 мин до фактора активации тромбоцитов вызывает полное блокирование повышения 1Са2+]цИТ. Аналогичное действие оказывают- форсколин (10“^М) и ингибитор фосфодиэстераэы циклических нуклеотидов изобутилметилксантин. Базальный уровень 1Са^+1цИТ при добавлении

DCCX этих эффекторов не изменяется. Наиболее простое объяснение

приведенных данных заключается в том, что действие простагланд-„____________ —-

инов, форсколина,- ингибитора’ фосфодиэстеразы изобутилмстил-ксантина опосредованы цАМФ. В пользу такой точки зрения говорит также подавление индуцированного агонистами подъема 1Са^+1цНТ под действием проникающего через мембрану дибутирильного производного цАМФ (данные не приводятся). С другой стороны, мы никогда не наблюдали полного блокирооания вызванного агонистами прироста [Са2+11(ИТ под действием дибутирил-цАМФ. Это свидетельствует о том, что наряду с цАМФ-зависимым ингибированием кальциевого обмена может существовать еще один путь. Возможно, происходит прямое воздействие сопряженного с аленилатциклазой С^-белка на системы увеличения [Са2+їцИТ.

Как было показано выше, в нагруженных квином тромбоцитах

у .

вызванное агонистами увеличение (Са 1цит пР°исходит главным образом за счет активации его входа снаружи. Для того, чтобы определить, связано ли Са2+-блокирующее действие активаторов аденилатциклазы и дибутирил-цАМФ с воздействием на каналы, мы исследовали влияние простагландина Ej на индуцируемый фактором активации тромбоцитов ток ионов Na+ и на вход в тромбоциты ионов В а 2 + и М п 2 + . Последние, и отличие от С а 2 + , ме транспортируется кальциевыми насосами, поэтому повыше нис их концентрации в цитоплазме прямо отражает работу каналов. Как показано на рис. I <*, простагландин Е| полностью блокировал Na+-зависимую деполяризацию плазматической мембрани тромбоцитов Гецспторзависимый вход двухвалентных катионов Ва^+ п Мп^+ также полностью устранялся при действии активаторов аденилатциклазы.

Таким образом, приведенные данные показывают, чіо активаторы я!Н'!1и;)атлиьлл»и д с /У с т п и го л >,п о блокируют механизм

рсцспторзависимого входа Са^+ в тромбоциты.

Какие звенья и систсмс регуляции (Са^+| , п тромбоцитах подвергаются ь о :: де й г т и м при активации в э т и\ к л с т к а х ;./С11ил,ч гциклазы/ По /¡сен вероя тости блокирование происходи'! на с Годии передачи сигнала через плазматическую мембрану, поскольку кроме входа Са2+ ингибируется также гидролиз фосфатидилипозитол-4,5-бисфосфата и образование ипозитол-1,4,5-трисфоефатп [ Lар с 1 і n а , 1 У 9 0 [ Од н о п а п р а в л с п н ы с эффекты

активаторов аденилатциклазы на вход Са^+ и фосфоинозитидный обмен еще раз свидетельствуют о связи между этими процессами, отмеченной впервые Робертом Мичсллом {МісЬеІІ, І975І. Ингибирование осуществляется на уровне О-белка либо на более поздней стадии, поскольку простагландин Е} подавлял вход Са2+, индуцированный не только эгоистами, но и фторидом (данные не приводятся).

цАМФ-зависимое ингибирование внутриклеточного обмена Са2+ не является свойством всех клеток. Мы не обнаружили какого-либо действия активатора аденилатциклазы форсколина и

ингибитора фосфодиэстеразы цАМФ изобутилметилксаитина на

1 +

вызванное гистамином повышение |Са ]цит в эндотелиальных клетках или в клетках А431 (данные не приводятся).

б„Влияние фармакологических препаратов на рецепторзаоиси-мый кальциевый обмен

В табл.1 приведены данные о действии на индуцированное

агонистами повышение (Са^+]цит в тролгбоцитах, нагруженных

Таблица I. Действие фармакологических препаратов на индуцированное фактором активации тромбоцитов (1 нМ) увеличение Г + 1 ццт в тромбоцитах (ЮО'Х).

Препарат (Са2+1цит. *

10~^М хлорпромазин 72

Ю М хлорпромазин 24

10"^М лидокаии 48

Ю М этидокаин 50

Бензодиззепимм

2, 5’ Ко5-4864 3 3

10_’М Ко5-4РГ.4 5

10" М клоназепам 31

10“^М флунитрозенам 4 ;

10“> (-)-бутакламок 34

10“ М (-)-бутакламил ' ’ С

Ю М (+)-бутакламол

4 10 М хинидин 1 2

г_--------------

600- 1 *■>. ф

Рис. 1 Полэшгешю пс ра г (ам и лом (А) ;! микардипниом (И)

!: с г. и ч о ;1 и я ( Са ^ + ] т , пи-.'Л'НПрСШалНОГО ФА'Г. Копнен-тпачни *АТ составляли 10 нМ (крш^р 1; и 1 пМ (кривые 2 и 3). А1п атомисты /(.сбавляли за ' - 1, 5 ::мп до ФАТ.

о 107 Ю° *0 10

НИКАРДИПИН. М

квииом-2, фармакологических препаратов, относящиеся гг г-'мп'м группам: ;ч ?»“ >т-г о;< и«.- г;; м бь.. н-.' ■: м •* ’ ■ ч< -о; • пгг..'--; <г ’ ~ 1 I г . ’ о I 11< ■ и ^ I 1 > г • ь с. I '• ' ><.

". с , ьс; , дигидропиридииов и дилтиазема, которые,

как оказалось, подавляют репрптл.- . ,, .

»..ан иьнрооанис кальциевыми антагонистами входа Са

П о л у м а к с и м а л ы I о е и и г и 6 и р о о а н и е

НабЛЮПЯппг* ■. ■ , ■ • !

Ц|

концентрации ФАТ, что указывает на отсутствие конкуренции между верапамилом и агонистом (рис.19А). Верапамил не полностью

подавлял рецепторзависимое увеличение (Са г,-5

* цит*

При концен-

трациях выше 5' ЮМ кривые его дозовых зависимостей выходили на плато. Блокатор дигидропиридинового ряда никардипин также

подавлял рецепторзависимое увеличение

[Са2+1

цит

в тромбоцитах

(рис.19Б). Полумаксимальный эффект никардипин оказывал при концентрации 1 мкМ. В отличие от верапамила, данное соединение полностью блокировало ответ на ФАТ. Нифедипин также ингибировал подъем [Са2+]цИТ, но с несколько меньшим сродством, чем никардипин (данные не приводятся).

Неполное ингибирование верапамилом ответа на ФАТ могло означать, что он избирательно подавляет либо вход Са2+ снаружи, либо его высвобождение из внутриклеточных хранилищ. Чтобы сделать выбор между этими двумя возможностями, мы определили влияние этого блокатора на индуцированный ФАТ вход ^Са2+. Захват «Са2 +

тромбоцитами

измеряли одновременно с регистрацией

750

500

300

5 200

Е 100

§

ФАТ

45Са

V

ФАТ

Са В

І

соответственно 100 и 0, 1 мкМ. Жирными стрелками обозначены моменты отбора тромбоцитов для определения захвата 4^Сз .

А

ЭГТА

Рис. 2 1 ..Влияние " никардишша ( Н ) и о о р а 11 а м и л а ( В ) и а мембранный потенциал

тромбоцитов и устранение ими ингибирующего действия ПОНОВ кальция на N а+-зависимую деполяризацию, индуцированную ФАТ (20 нМ) . Эффекты антагонистов на Е определяли в тех же условиях, при которых они подавляли вход Са“ , на нагруженных кшшом-2 тромбоцитах. Концентрации аерапа-мила и никардипина составляли

4 0 мкМ каждый, концентрации ОГТА {слевя) и СаС^ (справа) составляли соотвественно 0, 1 и 1 мМ.

[Са^г|11ИТ в нагруженных квином~2 тромбоцитах. Как показано на рис. 20, увеличение (Са^]11ИТ в ответ на ФАТ сопровождалось значительным входом ^'>Са“+. Верапамил в несколько раз уменьшал прирост ¡Са2+]цит и полностью подавлял индуциропашшГі агонистом захват ’^Са*-4’. Независимое от ФАТ поглощение радиоизотопа Са“+ не изменялось в присутствии верапамила. Таким образом, снижение этим соединением прироста !^а^+1дит обусловлено блокированием механизма рецепторзависимого входа Са^+.

Действие кальциевых блокаторов не было специфично по отношению к фактору активации тромбоцитов. Верапамил и никардипнн подавляли также ответы тромбоцитов на АДФ, оазогтрессин, тромбин и аналог простагландиновой эндоперекиси ^ ІІ46619.

6.2.Механизм действия блокаторов на рецелторупраоляемые каналы тромбоцитов - активация входа №+ н конкуренция его с Са^.

Активируемый агонистами вход Са^4 в тромбоциты происходит через каналы, проницаемые также для Ыа+. Было исследовано действие блокаторов па ток Ыа+ через рецепторуправляемые каналы, который регистрировали по изменению мембранного потенциала. Результат оказался неожиданным (рис.21). Во-первых, кальциевые антагонисты сами по себе вызывали деполяризацию плазматической мембраны тромбоцитов. И, во-вторых, они не только не устраняли эффект агониста (ФАТ) на мембранный потенциал, но даже снимали ингибирование агонистиндуцированной деполяризации ионами Са^ +. Деполяризация мембраны верапамилом проявлялась при микромолярных концентрациях этого соединения. При 50 мкМ верапамил деполяризовал плазматическую мембрану тромбоцитов приблизительно па 30 мВ. Никардипин вызывал еще большую деполяризацию (вплоть до

0 мВ) и при меньших концентрациях, Дилтиазем, взятый в микромолярных концентрациях, также вызывал деполяризацию плазматической мембраны тромбоцитов.

Рис.22.Влияние ионного состава среды на вызываемую никарди-пином (Н) и верапамилом (В) деполяризацию плазматической мембраны. Тромбоциты находились в среде, содержащей 135 мМ ЫаС1, 135 мМ Ь1С1 или 150 мМ хлористый холин. Концентрации никардипина- и верапамила’ составляли 40 мкМ.

Для того чтобы выяснить, током каких номоп вызвана деполяризация плазматической мембраны тромбоцитов, _было

определено влияние на этот процесс иошюго. состава внешней среди. ]ри помещении тромбоцитов, в-среду, п которой хлористый натрий был замещен-на-чпористий холил, деполяризация мембраны в ответ па шкардшши и верапамил исчезала (рис. 22). В холшюиой среде этсутствовал также эффект днлтиазема. Деполяризация мембраны зависела от кошюгп ранни полос Кат наблюдалась также, если Ка + :з среде был замещен на Ь1т. С помощью фиуорс>сцснтного зонда SBгl было прямо показано. что иикарлипип и верапамил вызывают вход Ыа+ в тромбониты (рис. 23).

]!з приведенных данных следует, что пмтпзнная кяльцисаимм «итагопистами деполяризанигт обусловлена ихоляншч током одпова-

, < : г . 1..^ ¿и мкМ) и верапамилом (20 мкМ)

. .'-4и1Ы. {Ыа + )ц^т регистрировали по флуоресценции

Концентрации уабаина и грамицидина 0 ссставлялм соответственно 20 и 1С я.л<М.

Е, мВ

. 2мци

I 1 | * чГ

• - НикарЗипин о-ФАТ

-Ьд[№2+|, \

Рис . 24.Блокирование ионами N1^* деполяризации, вызванной иикардипином и фактором активации тромбоцитов. Регистрация Ем проводилась в среде без кальция. Концентрация N1 в опыте, показанном слева, составляла 100 мкМ, Концентрации никардипина и ФАТ составляли соответственно 40 мкМ и 20 нМ.

лентных катионов в клетку. Как уже отмечалось, такое же действие оказывают агонисты, которые открывают проницаемые для кальция неселективиые катионные каналы. Логично было предположить, что и Са-антагонисты, и Са-агонисты вызывают вход одновалентных катионов щелочных металлов через одни и те же каналы, но первые сами не активируют вход Са^+ и подавляют кальциевый ток, вызываемый агонистами.

Из предложенной гипотезы вытекает, что факторы, которые

подавляют индуцированный агонистами ток ионов натрия через

каналы, должны ингибировать деполяризацию, вызванную анта-

2 +

гонистамн. Как было показано выше, ионы N1 в одних и тех же концентрациях блокируют вход Са^+ и ток ионов натрия, вызванные фактором активации тромбоцитов. На рис. 24 показано, что такое же действие ионы N1^* оказывают па повышение мембранного потенциала под действием никардипина. При этом зависимости ингибирования деполяризации, вызванной антагонистом и агонистом (ФАТ), от концентрации совпадают. Индуцирооанная фактором активации

тромбоцитов и другими агонистами деполяризация плазматической мембраны тромбоцитов подавляется внеклеточным кальцием. Такой же,

“Л А,

этя и более слабый, эффект ионы Са оказывают на изменения

змбранного потенциала при дсйстоии антагонистов -(рис.’21). В гсучае подавления индуцированного агонистами тока ионн

альция могут действовать с внешней и внутренней (повышение

-а^+1цИТ) стоРоиы мембраны. Антагонисты не активируют вход Са2+ тромбоциты, поэтому ингибирование натриевого тока может быть извано только внешним воздействием кальция, Наиболее простое эъяснепие заключается в том, что Са^ + и Ыа+ конкурируют в самом авале.

Если Са^+ и Ыа+ конкурируют при прохождении через сцепторуправляемыс каналы тромбоцитов, можно было редполагать, что при каких-либо условиях ионы Мп+ должны ызывать ингибирование входа Действительно, оказалось,

то ингибирование индуцированного агонистами входа Са^+ в ромбоциты под действием никардипина наблюдалось только в рисутствии ионов Ыа+ и практически исчезало в изоточичной олиисодержащей среде (рис.25). Исходя из полученных данных мы редложили гипотетическую модель действия кальциевых антагонистов а рецепторуправляемые каналы (рис.26). Согласно этой модели аналы, открываемые агонистами, в обычных условиях проницаемы для а^+ и ^+, однако сродство их к Са^+ гораздо выше Благодаря тому ингибируется ток Ыа*. Такое ингибирование описано для отенциадупраплясмыч кальциевых каналов, ток N3* через которые

г- 2+ -

локируется уже при микромолярных концентрациях Са в наружной

реле ( К о с т ю к и с о а в т . , 1 9 Н 3 ; Л 1 ш е г б , М с С 1 е э к. е , 19 8 4]. В

ецепторуправляемых каналах также, по-видимому, есть участки

вязывания Са^+, хочя их кажущееся сродство к данному иону на

дин-два порядка ниже, чем у потенциалуправляемих каналов. При

ействии на рецепторунравляемые каналы кальциевых антагонистов

родство этих каналов к Са2+ уменьшается и благодаря этому

блегчается ток ионов N8*. По-видимому, взаимодействие Са*+ с

2 +

аналами достаточно прочное и Са не может самопроизвольно ысвобождаться, поскольку мы не наблюдали спонтанной Иа+-ависимой деполяризации при суспендировании тромбоцитов в ескальциевой среде.

Рис. 25.Устранение Са^ + -блокирующего действия никардипниа (40 мкМ) при помещении тромбоцитов в беэнатриевую среду (ЫаС1 замещали на холинхлорид).

Сз”4-

Без антагониста С антагонистом

Рис.26.Предполагаемый механизм модуляции рецепторуправляемых каналов кальциевыми антагонистами.

.Особенности рецепторзаписимого обмена кальция при ипертоинчсской болезни. - "~

О;’.но Л из _ о с но и т»м\ причин, ч ы в a кич и х іМоінітік' э с с с и -г ,: '> і і с її :i л ¡1 черничной і'п.і'.'ртоначсмкси болезни рг!"Яі''і ся .Сличение С ГНрО 1 .4i 'СИШІ периферических Cr’C), JiOb КСОІіИ, которое ¡СЛЄТ быть RWTn.illO ПОіН.іИК'НПим -¡опусом Г'ІЗЛКИХ мышц стенок ■осудов. В сиою очередь ключевым фактором, ~ с г у л и ру юі;іи ч юкрятпмость гладкомышечн»^ К ИСТОК, я Н Л Я Г.? Г С Я КОПИР!!"! р(1Ш1Я юнов кальция n ij\ цитоп.чазмс t \ С а *+ ] ,. т ’ . Взаимосвязь между лнтпом ).<пу т рми.и'томного хадьция и патогенезом эссенция г» т»; т с =1 .шертслии уже давно привлекает иос л г-дсьате п«~ у

’.Н. Орловым, Ю. В Псстіісііьім ы Ч ”. Покуяит’ч '.vh4j и сотрудниками ;аОорят^^ті [Zt пч ct al., 1984 } было показано, что в

гомОоцитах крыс линии SHR с паследстпсииой спонтанной гипер-'ОниеГг и в тромбоцитах больных эссснциалыюН гипертонией понышона назальная концентрация ионов кальция в цитоплазме.

Увеличение уровня 1Са^+)цИТ в покоящихся клетках, возможно, не единственное отклонение во внутриклеточном кальциевом обмене при гипертонии. Целью нашего исследованин 5ыло выяснение взаимосвязи между развитием ^т.м'с г,.^'>о,л > м»н :: зецепторз ап исимсіі рс г у •: п ;ьи’:: і ’' ' ' ~ * ч і '' ° :: s '' р

‘ре ггиолс ; а ! г ч ”■ ч л ". \ і ричиней і: о і ,!>!•!"•'. і ь ; <

- : с:річільиог г давления ,,с тел ^ не л ичс н н п я ч■- ни > ; ..і hov. і ь

!ягтс!> ч :зг:)ін'ст.'^і, і 'гмлі;і»..і!іім чолм'м і Са~ ’т j ( . при изучении

ісоР'Піііос'го:! ¡> < ■ ’ ’ с ч і о р з а и и о и м о й р е г \ ляции ! С a “ ] при

.'сеонциальнон гипертонии чи исходили из предположения о том. -мо

ГГО ЗОООЛСЧіОИИЄ ЯН.ШСі СЯ ClICI CMHUM. ¡ІОЗТСму НОЭМО^НиС і;

<альциеноч оомгне должны з а ч з»ииать чо только гладкомышечиис :'ис.2 7 Как видно из этих данных, базальная концентрация ионов в цитоплазме тромбоцитов достоверно отличалась пс і рем .юслсдуемым группам. У здоровых (16 чслсискі !Са~ І,пп сосіаилял 37 + 4 нМ, у больных лабильной гипертонией <40 пациентов) - ¿00+4,9 іМ, а у болышх стабильной формо»! этого заболевания (34 пациента)

- 12 2+./), 4 нМ. Эти результаты подтверждают ранее полученные данные Эрне и соавт. (Erne et al., 1984] и Орлова и соавт. [1984] о зависимости между развитием первичной гипертонии и концентрации

КД, мм Нд

- ЛГ СГ р 1—а—з <0.01

[са2*

цит '

НМ

[са2+]

цит'

НМ

Р1-2-3 <0.01

ФАТ Р)-а-з >006

АДФ

>0.05

ВПр

>0.05

Рис.27, Базальный уровень [Са2+) Т и прирост [Са ]цит в ответ на ФАТ, АДФ и вазопрессин в тромбоцитах здоровых людей и больных лабильной (ЛГ) и стабильной (СГ) формами гипертонии. Концентрации ФАТ, АДФ и вазопрессина составляли соответственно 10 нМ, 10 и 1 мкМ. Слева показано среднее артериальное давление у здоровых и больных гипертонией.

клетки сосудов, но и другие типы клеток. В качестве клеточной модели в настоящей работе, как и в исследованиях лабораторий Постнова и Бюлера, были использованы тромбоциты.

Базальный уровень Г<-'а^+1цит и его прирост, вызванный фактором активации тромбоцитов, АДФ и вазопрессином, в тромбоцитах больных гипертонией и у здоровых доноров показаны на

!_ ^.ул Г I 'х/л

ои ( У/Л

СИЗ - стГенч??, с'срчяа

. ¡213 - 1-;«спеост6енная--'

г^" Г - -- — " ’" ,-

Т *■

у 4., 1

\/л ^

1-':: ■ а$Л \'№

0и_и1_ «Ща

_1

✓ УМ

^л~т' ЕПр

5!1С\ 28. Еазалышй уровень (Са^' )ц?гг и рецепторзаписимое увеличение Са~']цит 1з тромбоцитах больных иаследстиенной и ненаследстпенной [>срмами гипертонии. Величины сродного артериального давления показаны слова.

*а рис. 27. Как видно из этих данных, базальная концентр ип«^,п

^а^+ в цитоплазме тромбогчитои и^^тг.Г1 ¡••чс с > м"мг.; • 1 г.. • << ч и'м- .4/- \ ) ¡1' м г 11. V (.-(¡'(Н I! К ■ ’!{ ■ ,”Л ... 1С

] . | , , ■' г . * 111 ш '■ '/ .1. С1 <;' (:п г ; ■ к с ‘-м< (; ,*• к ч с рал|1 ь ирс! и

:;'Т..ч К,'"- •• , 1'31 ‘; ,и-. и у больных гипертонической

с ■..•¿■¡•г. т^м не менее о группе больных ра^^гсг г счсроиу увеличенного подъема г ' - '.‘(Г ?'с Гс.ЧМ’.Ил

т м.' , . :■ ! с '"г- мт 1-1 •; г.--.'и;: о: С - * ^ о»«ет на ФАТ

!: ' , г'5 •:<' 5 : г - *:■ I о. ^ Сильных гипертонической болезнью, особенно

у обладающих стабильной формой гипертонии (рис.27). В отношении

вазопрессина какой-либо закономерности или тенденции при таком сопоставлении не обнаружено. Достоверных отличий между группами больных гипертонией и контрольной группой выявлено не было.

Мы предположили, что может существовать взаимосвязь между чустпитепьностью тромбоцитов к агонистам, повышающим 1Са^+1цит и каким-либо признаком, характеризующим развитие и течение гипертонической болезни. Была проведена систематизация больных на основе их семейной предрасположенности к данному заболеванию. На рис.28 показано, что по величине базального уровня (Са2+|цнт в тромбоцитах различия между лицами с семейным характером гипертонии (19 человек) и больными, не имевшими гипертоников среди близких родственников (20 человек), отсутствуют. Концентрация свободного Са^+ в цитоплазме тромбоцитов составляла в среднем 110+.7,5 нМ и 12 1,9+.9,8 нМ соответственно в первой и во второй группе. В то же время рецепторзависимое повышение [Са2+]цит п ответ на фактор активации тромбоцитов, АДФ и вазопрессин у больных с наследственной предрасположенностью к гипертонической болезни было в два раза большим. Ранее аналогичное наблюдение было сделано Орловым и соавт. [1984), показавшими, что у крыс со спонтанной гипертонией линии БНК в тромбоцитах повышен прирост 1Са^+1цит в ответ на тромбин по сравнению с линией иормотензивных крыс \VtCY. По абсолютной величине прирост {Са2+]цИТ в ответ на агонисты у больных без наследственной предрасположенности к артериальной гипертонии практически не отличался от такового у здоровых людей (рис.28). Это указывает, что повышенная чувствительность к гормонам, увеличивающим внутриклеточный Са^+, не является просто сопутствующим признаком гипертонической болезни, а присуща, возможно, какой-то разновидности этого заболевания, которая не выявляется при традиционных методах обследования.

Причина увеличенного рецепторзависимого прироста [Са^+]цит у больных с семейным характером гипертонии неизвестна. Вряд ли это можно объяснить увеличением числа рецепторов, т. к. в этом случае нужно было бы предполагать, что разные виды рецепторов синтезируются в клетке синхронизирование. Возможно, что при наследственной гипертонии дефект локализован на более позднем этапе при передаче сигнала

г рецепторов внутрь клетки. Гипотеза о механизме нарушения 'рсдачи гормонального сигнала через., плазматическую мембрану згласуется. с опубликованным сообщением об изменении реїулянпм юнилатнпклазм •: ромбоцнто!! у больных с семенным характером шер і’оііііп | Нпуег е 1 а 1 . , 1 9 8 7]. Оказалось, что

денилатциклаз а этих больиих п меньшой степени активируется тпстаї'лаїїдіїиом Е ^ и пмоеч попышеииум чу о сто ите л ь и о с т ь к фсналпну, ингибирующему через альфа -а дрепорсцонторы сшпез ■Л*’*’

Пет 1ч ;г пеьозмо.мю г уиереппосч ью говорить о связи между повьгш-шой чувствительностью к гормонам, увр личсі.но

'а^+)И1Т, и Р'ЧПНІНСМ ГИПРГТПІШ’іОСКОЙ бопеттпи. 1им не менее, 'лп .ірії какой-п’Го рллювидностк данного заболевания эта шотеэа оправдывается, имеет, по-видимому, смысл использовать і я его лечения лекарственные препараты, подавляющие щепторзависимое увеличение (Сз^+)иит- Соединения, которые были $ способны селективно блокировать этот.путь повышения 1Са^+1цИТ» жа отсутствуют. Однако, некоторые из применяемых в настоящее эемя антигипертелзипиых лекарств в числе прочих эффектов называют также блокирующее действие па в*-* чегттс п ч ;■ і. н и ч»;ч ¡хаиизм упоги'ісш'і»* ’ __ Рр< • лиг.;-м і - - т . чі .с „ (; н чл. .,’><»-¡и ,

3\КЛКїЧЕІПІР

П Наг '1 < ЧЧКЧЧ! раоо'1 О пліті ;;о и і V ЧГ'МПС: Мі'ХПІЧІЗМП 1\ ( 11 В а ! 111 (і

■ о^ ( а ,ч и ччсд.і і л ' 1 ч ллечки. Мы не рассматривали все

2 +

) ¿мо.!сііос.тіі ; > с ц (' і ! ! о р у и р с* в л я е м о г о транспорта С а через іаз матич е с к у ю мембрану. Речь илот о ¡и1 їй і іиіп лі і;пис іов.

) то рое ппс'.'рс1'.::';:"!1.'- р ;ч і ; і ; ■ ‘ р ч ч и . ¡і' оляїіінчп в о д е л ьн по

' іі С р <_ С Ме Ч С Т ч 1-е С і ! р і1; ' ‘ і' . 1 і: V1 ) і' /і» і которого имеют весьма ре^к-.ісчііио признаки. Полипептидная цепь каждого из них семь із прошивает плазматическую мембрану и в с с они аимодействуют с гетеротримерными ГТФ-ст>п-:ь:/>/г мшичи " елг ч\чі іследнее бы”о ті--:--.,и ■ а 'ічкич'іііч: р ч цщ.іопов трпмиїпіа,

вазопрсссина, гистамина и эндотелина-1 и показано нами для двух других использованных агонистов - фактора активации тромбоцитов и аналога тромбоксана 1М6619 (по их способности активировать

высокоаффииную ГТФазу), Второй характерны:“! признак - все эти вещества через данные рецепторы активируют фосфолипазу С. Сейчас установлено, что рецепторы данного типа опосредуют эффекты подавляющего большинства гормонов, простагландинов и других агонистоп. Как оказалось, действующие по такому принципу агонисты активируют вход Са^+ через рецепторулравляемыс катионные каналы, хорошо проницаемые также для одновалентных катионов. Через них в клетки могут поступать ионы N3*. Это продемонстрировано для тромбоцитов и гладкомышечных клеток аорты.

Наиболее детально свойства рецепторуправлясмых каналов

исследовались па препарате тромбоцитов. Ток Иа+ через каналы

этих клеток подавляется ионами Са^ + . Возможно, этот эффект

осуществляется через Са^+-связывающий регуляторный центр.

Такой механизм предложен для потенциалуправляемых кальциевых

каналов, однако для них характерно на два порядка более

высокое сродство к Са^+ [Костюк и соавт., 1983). Сходство

между изучаемыми в данной работе рецепторуправляемыми каналами

и потенциалуправляемыми Са^ + - капалами проявляется также в

действии на них кальциевых антагонистов. И те, и другие

ингибируются дигидропиридинами, верапамилом и дилтиаземом. Мы

обнаружили, что рецепторулравляемыс каналы тромбоцитов не

блокируются, а модулируются кальциевыми антагонистами.

Антагонисты подавляют вход Са^+, но активируют при этом

транспорт N3*. Выяснение механизма действия кальциевых

антагонистов на рецепторуправляемые каналы требует дальнейших

исследований, однако можно предположить, что данные соединения

уменьшают сродство каналов к Са^+, тем самым устр-аияя

ингибирование ионами кальция натриевого тока. При этом сами

ионы N3* приобретают способность конкурировать с Са^+ и за

счет этого подавлять рецепторзависимый сход Са^+, В пользу

последнего свидетельствуют данные об отсутствии ингибирования 7 +

никардипином входа Са в беэ.натриевой среде.

Сопряжение между рецепторами и каналами осуществляется при участии С-бслков, причем для разных рецепторов они могут быть

13ЛИЧНЫ. Как G-белки активируют каналы, пока не ясно. По-ддимому, есть прямое взаимодействие, но с другой стороны,-зльзя исключить участие в регуляции., каналов' ииозитол - 1,4,5-зисфосфата и сопряжение' каналов плазмалеммы и внутриклеточных зльцисвых депо. Не исключено существование нескольких пилой <тнпнруемых агонистами каналов, но можно также предполагать есколько путей регуляции одних и тех же каналов. В редставленной работе пет данных, указывающих на сущест»onai me азпых каналов. В действии на клетки различных агонисч он спользоваиними методами не било выявлено качественных азличпи.

В работе показано, что те же самис агонисты, которые ткрывают кана.тм, запускают процесс их инактивации. пгиОиропаиис каяяпоп происходит по механизму отрицательной Пратно» связи через протсимкиназу С. Этот фермент ктивируется ионами кальция и вторым продуктом, образующимся рн гидролизе фосфатидилииозитол-4, 5-бисфосфата, -иацилглицерином. Блокирование каналов происходит на стадии средачи сигнала от рецепторов и мишенью, судя по полученным анкым, яоляется ГТФ-связывающий белок. Данный механизм пляется универсальным и реализуется во всех исслсдонаиних и астоящей работе клетках. Имеющиеся литературные данные ¡одтверж дают эт от вывод.

Изучено влияние на pe i и' пто р з а и ис и м ы й кальциевый о б ме н ixeпилпт циклазион гиси'мы На iu. i' л с доплш млх к до скач показано, ч го

5 с г > лят орпое дейет вне иАМФ ян дне тс я специфичным. В тромбоцитах по г вторичный («»средни« подавляет вход Сз “ , по не влияет на кальциевый обмен в эндотелиальных клеткахи в трансформированных члетках зпителин лиши! HeLa и А411. В клетках печени цЛМФ, tanpoTim, погепинирчс i вход С'а^ (Kass et al. , 1‘>У0|.

Исследование механизма и регуляции рсцопторзалигjjmoj о $хода Са^+ имеет не только чисто научное значение, по, вероятно, иожет найти п пос ле до i вин п рак г ичес к ос применение. Поскольку обнаружено, ч(о при наследственной форме гипертонии резко увеличена чувствительность к агонистам, активирующим вход Са^+, направленное воздействие па этот механизм повышения 1Са^+|ц!п, возможно, будет способствовать лечению данного заболевания.

выводы

1 .Разработаны методы одновременной регистрации агоїшст-индуцированных изменений потенциала плазматической мембраны и концентраций свободных двухвалентных катионов и о цитоплазме

клеток. Методы основаны на флуоресценции специфических зондов.

2.Исследованы механизмы рецепгорзависимого входа Са“+ в тромбоцитах, гладкомышечных и эндотелиальных клетках кровеносных сосудов, о трансформированных клетках эпителия линий НеЬа и А431.

3.Показано, что активируемый агонистами поток Са^+ через плазматическую мембрану транспортируется катионными каналами. Активация этих каналов в исследованных клетках опосредована 0-белками различных типов. Полученные данные свидетельствуют о возможности прямого взаимодействия 0-белков с каналами.

4. Установлено, что при добавлении к клеткам ингибитора Са^ + -АТФазы внутриклеточных Са -депо ди-терт-6утилбензогидрохинопа активируются рецепторуправляемые каналы плазматической мембраны. Показано, что наблюдаемые эффекты не опосредованы повышением концентрации свободных ионов Са в цитоплазме. Полученные данные подтверждают гипотезу о сопряжении внутриклеточных кальциевых депо с Са -транспортирующими каналами плазматической мембраны как фактора регуляции входа Са^+.

5.Открыт механизм десенситизации клеток к агонистам, активирующим фосфоинозитидный обмен и вызывающим вход Са , который реализуется через иротеинкиназу С. Протеинкиназа С подавляет рецепторзависимый вход и мобилизацию пнутриклегочного Са*'+ во всех исследованных клетках и осуществляет таким образом отрицательный обратный контроль. Блокирование агонистиндуироваи-ного увеличения {Са 1цИТ обусловлено инактивацией б-белка.

6.Изучена роль системы метаболизма цАМФ в регуляции рецепторзависимого входа Са^+. Показано, что цАМФ подавляет вчод и мобилизацию внутриклеточного Са в тромбоцитах и не влияет на рецепторзависимый обмен Са^+ в эндотелиальных клетках, в клетках линий НеЬа и А431.

'У X

7.Исследовано влияние Са -антагонистов на рецепторзависимый вход

Са В случае тромбоцитов впервые показано, что Са -антагонисты подавляют вход Са V» активируют вход Ма+ через

рецепторуправляемые каналы. Предложена модель регуляции кальциевыми антагонистами данных каналов.

Основные работы, опубликование по теме диссертации.

1. V. A. Tkachuk, P. V. Avdonin. А.V.Mazurov, I.V.Svitina- lllitina, Regulation of platelet-platelet and platelet-surface interactions via membrane receptor-coupled enzyme system. J.Ce LI.Bio 1. 1983, 97, N5, part 2, 95A.

.^1.2, I . '' . S v i t : г л - ‘ 1 ; t л rmi V. I I'.'.'kIc'. S'-iijn-;■•*. ;■ r :: i ’ h - Г f i p. i t} h о г о .-•« f ^ i i v e i)7 / a s e__ о f hum a rv

; • I - 0-:ii¡.>'*-¿-o-acetyl-sn-f b'r?r,‘'T ■ " - ; ’M ' ’ ■ о ' -1 .; \ >idieiet activ^t’ - , ; < f r 1 , . ¡, r.

" ... ' ’ Uv-Liicu-Uiitina. V.T, : r .!

iicraction of 5+ г»*’1 с г . : ; • ' -¡■! : :i cr.<i ;• с. .ч : i \ ¡

•. г...- г t I';;-., ^ _ <; ТГ-i • ' ; с .. ivtiasc, Thro mb. Rp c

’ fi • ' • ^r,u i cconstitution of

. , ■ v 11111 í c„l«i>uc components of heart adenylate cy-

¿csse. J.Molec,Cell.Cardiol. 5 984, 1 6, 82 1 -STf

И П *__________ ojjoKunf'"---- „„..mrflOpOM П)ЛЧЧПШ'

с шпт'бпг’'«'— i '^муим рсцептсрз аг^иеимих кальциович каналон

к..',н)0|’итои . Биохимия 19К5, 50, 1 235 - 1 240.

. П . Ü1 . Дпдонии , М . Ю . Мо!п>шикоп, С . Н . Орлсо , Н . И . Покулип,

. Л.Тз^ачук. Механизм увеличения концентрации Са^+ fí цитоплазме рембоцитоп при действии факторов агрегации. Биохимия 1985, D. 1 2 4 1 - 1 2 4 Я .

.П. В.Аплонин, А. Г. Тоиегзицкий, Г.Ю.Григорян. Актилация входа a¿ "г тз клетки В-субъсдмшщоП рицина. Биол. мембраны 1985, 2,

00-805.

.В. А Т Y Ч Ч у *V ч Г, п ...., у ... о- ’ -

• ‘ ' i г; ' ’' -i . т i' ; ' г ’¡ ;. г С \ í"í г !

j.'.i -"u\ • ti тромбоцитах. ДАН СССР

1. М. Ю. Мень«"^1'-

рюлл; ВКНЦ АМН, СССР

2. P. V. Avdonin, I.B.Cheglakov, E.M.Boogry, I.V.Svitinc

litina, A.V.Mazaev and V. A. TI<achu>'. Evidence for + H-* »-t--

rr-opcraled channels in human «1• : hrotr.b. Re« 1 oo-t • -

13.P.V.Avdonin and V.A.Tkachuk. Properties of receptor-operated calcium channels in platelets. In: Receptors and Ion Channels (Eds. Y.A.Ovchinnikov and F.Hucho) 1987, Walter de Gruyter & Co., Berlin, N-Y, 193-201.

14.U.S.Ryan, G.Yu.Grigorian, P.V.Avdonin. Platelet-activating

factor (PAF) effects on endothelial cells. Symposium "Platelet-activating factor in the immune response", Paris, 1987, p. 45. •

15.U.S.Ryan, P.V.Avdonin, B.G.Posin, E.G.Popov, S.M.Danilov, V.A.Tkachuk. Influence of vasoactive agents on cytoplasmic free calcium in vascular endothelial cells. J.App1.Physiol. 1988, 65, 2221-2227.

16.P.V.Avdonin. B.Hayes, C.VanBreeman, U.S.Ryan. Two phase regulation of cytosolic free calcium in endothelial cell response to agonists. FASEB J. 1988, 2, A810.

17.И.П.Шхвацабая, A. H. Кравченко, П.В.Авлонин. М,Ю.Меньшиков, А.А. Некрасова, В.А.Ткачук. Рецепторзависимая регуляция ионов С а в цитоплазме больных гипертонической болезнью. Кардиология 1988, 28, 72-77.

18. А. Н.Кравченко, И. К.Шхвацабая, А. А.Некрасова, М. Ю.Меньшиков, П.В.Авлонин. В. В. Панфилов, Г.Н.Завадская. Влияние гипотензивной терапии на рецепторзависимую регуляцию ионов Са + в тромбоцитах больных гипертонической болезнью, Бюлл.ВКНЦ АМН СССР 1987, 10, 46-52.

19. P. V. Avdonin. М. Yu. Men’shiкоv, I . V.Svitiпа-U 1 itina and V.A.Tkachuk. Blocking of the receptor-stimulated calcium entry into human platelets by verapamil and nicardipine. Thromb.Res.

1988, 52, 587-597.

20. M. Yu. Menshikov, P.V.Avdonin. A. N. Kravchenko, A.A.Nekrasova, A.V.Mazaev, I. K. Shkhvatsabaya. Platelets as a model for studying the action of antihypertensive drugs. Health Psychol 1988, 7 Suppl., 75-88.

2 1 . P. V. Avdonin. B.A.Hayes, E.Ya.Posin, E.G.Popov, I.Yu.Gavrilov, .V.A.Tkachuk, U.S.Ryan. Dual-phase response of bovine pulmonary artery endothelial cells to agonists which increase free cytoplasmic calcium concentration. Tissue and Cell 1989,

21. 171-178.

22. V.A. Tkachuk, P. V.Avdonin. I . В . Cheg 1 aкоv, V.N. Bochkov, Receptor-operated channels in human platelets. J.Protein Chem.

1989, 8, 427-428.

23.В.Л.Лейтин, Ф.Миссельвитц, П. В.Авлонин, Е.В.Любимова,

С.П.Домогатский. Стимуляция распластывания и агрегации тромбоцитов на иммобилизованном коллагене V типа: механизмы,

зависящие от Са и протеинкиназы С. Биохимия 1989, 54, 1565-

1570.

П. В Апдоппм ■ И Б Чеглакон, П А.Ткачук. Кппиая прсмшиаомос; р о г \ л я 11 и я ропот о р у п р а п л я с м ы \ каналом пла а м ,j 1 и ч с.- с к с. 11 1ираны громСоцитоь чслинека. Биол. мембраны 1990, 7, 12-22.

.В. И И F Чг>т~ттнт?с:г,- Л Э Л ;т г v ’т , ** К' Г'чп“тт~т~г,

5 . А и j i о i 11 ¡ 11~ П uuuújc iinu >ptJL¡H;j пинии к a;; l. да;: и u:ia;¿¡.laj:.i-jiük itcLa, ludu - ¡ , под it ji и н ii mi; м i и с i а м ti н a

iji. Эксп. Биол. Мод. 1990, N1, 40-42. •

.Ю.А.Куришеи, Г. A. CanQXima, П . В , Ап по ими , А . 11. На у мои . :ледопа!1ИС роли ГТФ - с в я з и в а ющи х белков в генерации тьциевого отпета эпидермальным фактором роста в клетках П. Действие фторида и бактериальных токсинов. Биол.мембраны •1, 8, 1082- 1087. ‘

P. V.Avdonin, A.N.Kravchenko, M.Yu.Men’shikov, A.A.Nekraso-V.A.Tkachuk. The peculiarities of l^a^+!in regulation in

1 t I- 1 C‘ t •» U f ‘ p <-» I I t' / > I S «■ i f »1 ¡i1i *l V pf r • f c fl s ( o n P I -i ' J r t b

I . C, ChegUikuv, P V A v d on i ¡i I n v с t j v л t і i t у and regulation of platelet, receptor npotential-sensitive t 1 и о г e л с с гі t probt; s 10 9 0, 1 , 2 S - 2 (і.

о 1

1C і

P , V . Avdonin , I . В С heg! л kov, V А . Т к о с h u k St i m и 1 .) t ] о n о i i-selective cation channels providing С a “ ’ l n f 1 и .■ into itelets by PAF and other aggregation inducer's Гиг J Сю-

ü. S. Ryan, P . V. Avdonin, B. Hayes, K. 0. Broschat. Signal msduction in endothelial cells. In: Endothelial regulation

vascular tone (Eds. U.S.Ryan, G.M.Rubanyi), Marcel Dekker,

. , New York-liasel -Hong Kong . 1 99 2 P. 7 '■> - 0 ,

P . V . A v d о ri i n . В A. Hayes, U S Ryan R с с e p t о r - d pc ri d ^ n t i е;,ч ion of ICa“-1 ) and phospho1ipase С in vascular endothelial Is. In: Signal transduction in lung cells (Eds. J.S.Brody,

!. Center, V. A. Tkachuk) , Marcel Dekker, Inc. , New York-Basel-

g Kong. Ю93. P. 4 15-434.

Y. A. Kurvshev, A P. Naumov, P V Avdonin, N. Mo/haeva f » uion^'

involvement of a GTP-binding protein in activation o: ( '

lux by epidermal growth factor- in A 4 3 1 cells Г t f l t - oi oride arid bacterial toxins. (1993 г., в печати).

П . В . Аплонин, В. А. Ткачу к. Рсцопторзаниси мая pot \ ляшы триклоі очі югп кальция М., Наука, 1993 (н печ;пи).