Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Свойства рецепторуправляемых кальциевых каналов тромбоцитов

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Свойства рецепторуправляемых кальциевых каналов тромбоцитов"

российская акадения недяшнских наук

кардиологическии научный центр

На правах рукописи

ЧЕГЛАКОВ Иван Борисович

свойства рецепторуправляеных кальциевых каналов

тромбоцитов

03.00.04 - БИОХИМИЯ

носква

1992

Диссертационная работа выполнена в лаборатории молекулярной эндокринологии института экспериментальной кардиологии кнц раин.

научный руководитель:

кандидат биологических наук п.в.Авдонин

официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор С.Н.Орлов доктор биологических наук с.с.колесников

Ведупее учреждение:, институт Цитологии, г. санкт-петербург

«¿го» в 4L

защита состоится / " ^ 19^ года в 1 t часов на заседании специализированного совета в Кардиологическом научном центре РАНЯ по адресу: 121552, носква, 3-я Черепковская ул.,. 15а

Автореферат разослан "_"__1991 года-

Актуадьность гены. Большинство гормонов действуют на клетки через так называемые вторичные посредники, одним из которых является кальция, поскольку он ответственен за изменение целого ряда биохимических процессов в клетке, в настоящее вреня уделяется большое внинание изучению гормональной регуляции цитоплазматической концентрации этого катиона ([саг+]цит). согласно современный представления!* рецептор-зависимое увеличение [саг+щит происходит в результате активации каналов ретикулума и плазматической мембраны.

Первые данные, говорящие о существовании рецепторзависиных кальциевых каналов, появились более го лет назад, при работе на гладкомыиечных клетках (Зош1уо,19б8). тем не менее, довольно длительное время не удавалось доказать присутствие этих структур в плазматической ненбране. к началу настоящей работы с помощью кадьцийселективных красителей исследователями ухе был зарегистрирован подьек внутриклеточной концентрации кальция з различных клетках в ответ на воздействие горнонов и нейроне-диаторов, причем этот подъем мог происходить как за счет входа Саг+ в клетку, так и за счет его мобилизации (Тз1еп,19вг), Вскоре появились убедительные доказательства, что высвобождение кальция из внутриклеточных депо осуществляется с помощью инозитоп-1,4,5-трисФосФата (Вегг1<ие,1985-). однако механизм входа саг+ не был изучен, и возможность участия рецептор-управляеных каналов в этом процессе дискутировалась (3111,1905). лишь в последнее вреня удалось зарегистрировать в некоторых клетках проводящие Саг+ каналы, активируеные :..• оказалось, что существует несколько типов рецептор-

/кг.авляеинх каналов, но их свойства все еще недостаточно

цель исследования, проварка гипотезы о существовании

рецепторуправляемых кальциевых каналов в тромбоцитах и изучение их свойств.

В работе были поставлены следующие задачи:

1. Разработать методы регистрации рецепторзависиного входа

Саг+ и других катионов в тронбоциты. г. Исследовать неханизиы поступления ионов сан+ в тромбоциты.

з. охарактеризовать свойства рецепторуправляеных кальциевых каналов в этих клетках. Ч-. Исследозать деяствиа кальциевых антагонистов на дакнцг

каналы, научная новизна работы:

1. Доказано, что поступление кальция из Енешкей среды при активация тромбоцитов осуществляется через рецедтор-активируеные каналы, г. охарактеризована прокицаеность каналов и их регулящ«;

вторичннни посредниками, з. Определен неханизн действия кальциевых антагонистов (верапаиила, дигидропиридинов) на рецепторуправляекке каналы.

практическое значение работы. Результаты данного исследования позволяют вести направленный поиск фармакологических препаратов, регулирующих ределторулраЕВЯемые каналы.

Апробация работы. Результаты, полученные в настоящей работе, онли дагохекы на кегдународных симпозиумах "всибудкмг;е ненбраны» (Киев, 1967,1991) и на Всесоюзном симпозиуме "Псиные каналы в биологических ненбрапаг" ¡караяаг, 199«.

Кстоды исследования, грокбоиип; тзндсдялк из кров;; доногоя по негомУ, описанному

Е работе (Авдонин и. Алтухова, 19в5). определение входа ч-5са, внутриклеточной концентрации кальция к менбракного потенциала проводили в среде, содержащей 150 ни Haci, г.7 нн kci, о.зт ни ыангР04, i мн Hgso4, 1 мн Саыг (од нн саздг в случае измерения входа 45Са), 5 НН D-глюкоза, Ю НИ HEPES-HaOH, (РН 7,4). для расчета величины [Саг+щит (Tsien,i982) использовали уравнение;

[Саг+] = Ed ((Р - Fmin) / (Fraax - F)), Потенциал плазматической кенбраны троибогопов измеряли с помощью Флуоресцентного зонда dis-c3-(5). в некоторых случаях ионы натрия в среде инкубации заменяли на 150 нн холинхлорид (холинсодерхащая среда), nci (яитиясодержащая среда) или csci (цезнисодержащая среда), титрование мембранного потенциала (Ем) проводили раствором sei в присутствии валинонисина и рассчитывали по уравнению гопьднана (Goldman, 1943): Ен = 61,5 1ё([е+]внешн./[к+]ппт.).

Результаты и обсуждение

демонстрация существования рецепторактивяруеного, входа кальция в тромбоциты. стандартный подходок к изучению роли внешнего кальция в процессе редепторзависяного повышения его внутриклеточной концентрации в клетках является либо удаление, либо связывание этого катиона с помощью згта. другим аргументом в пользу существования редепторуправляемых каяьщгевых каналоЕ могли бы послугить данные об активации агонистани поглощения клетками 45са (Daniel, 1934). оба ■ эти подхода не являются однозначными. Так, уменьшение прироста tcas+иит при связывании внешнего кальция иогет бнть объяснено не только блокированием его входа, но и тек, что внеклеточный саг* необходин для

активапии агонисгаии его более полного выброса из внутриклеточных источников. Опыты с. захватом 45Са также ногли быть интерпретированы двояко, поскольку на тромбоцитах, напринер, было показано, что при добавлении к нин тронбина в первые десятки секунд в наружной нембране падает, а эатен повышается содержание са-связывающего. ФосФолипида фосФатидилияозитол-4,5-ЛИФосФата (Airanov,i9ô3), и возрастает количество са-связы-ВвШКХ фНбриНОГвНОВЫХ рецепторов (Bennet,1981; Haviger,19SO).

для исследования механизмов входа Са2+ в качестве объекта были выбрани тронбодмтц человека, где уае было продемонстрировано рецепторзависииое повыиение. [Саг+)цит, и где отсутствуют потешдаадуправляеные каналы (Doyie,i9ssj. в работе бия применен подход, благодаря которону резко возрастает количество внутриклеточного кальщ:я, необходимого для обеспечения долгового уровня свободных иопов саг+, при активации клеток, он закачается в использовании Флуоресцентного сонда квик-г, пе только позволяющего измерять ССаг+здкт, но и создайдего полн.цеи.к'я буферную емкость для этих двухвалектпых катионов. Прикопи* данный подход, ноано тем санын зарегистрировать вход ^¿са, поставив при гтои надлежащий контроль по отношению к меморанкоя сорбции у на кагруаенных индикатором тромбоцитов.

На рис.1 показано связывание *sca с контрольными тромбоцитам! и с такинл ае тромбоцитанк, е цитоплазме которых находится квин-2 ь концентрации порядка 1-2 нк. Видка, что, как к ожидалось, вход 45са при действии фат в контроле слабо отличается от такового в неактивированных тромбоцитах, но резко возрастает у клеток, содераапих зонд, этону факту ногно дать следующее ооьяснеаие. Константа диссоциации комплекса кальция с квинон-2 равна us нй, что очень близко к зкачелиян [с*2+}еит

Q

0

К

9 мо £

1

ь

¡200,

о §

100

й 0. 3 3MI

й гоа!

Д iso | ио|

ФАТ

рис. 1. акгизйцкя фат (гони) поглощения 45са гропсоцитаки, насиненными квкнои-г (l). пог-лоиение 45Са трон-боцигани, яасыдекаыки квиаок-г, но без фат

(2), контрольными грон-аодигзкк в отсутствие

(3) з а присутствия (4) зат. внизу - изменение концентрации саг+ г дктоалазке этих se ::деток при действий ■sat, измеренной по

J г I 5 I 5 6 удд Флуоресценции квкна-г.

рис.г. злияняе <эат (гонш на мекбранныя потенциал тромбоцитов, находящихся з натриясодергацея среде с 1 нк Са<лг. не нагругеяных и нагруженных квикон-2, и на изменение внутриклеточной концентрации кальция в отсутствие или в присутствии экзогенного саг+.

2 «ин

-50-

2+ [Са ]лК

2 мин

ФАТ

ФАТ

-55-

-60 f

\

\

J

-133-1

КОМТРСЛЬ

йЕин—2

500 300200150100-

CaCI,

'V-4-* ЭГТА

клеток в состоянии покоя. Поэтому в неактивировйикых тромбоцитах Флуоресценция квииа-г составляет около 5ок от максимальной. так как лишь половина молекул хелатора связывает ионы кальция, при действии фат уровень свободного саг» в' цитоплазме позываете;; до 55о-тоо нн (рис.1), однако, при этой обиая концентрация кальция в цитоплазме увеличивается ванного больше, поскольку происходит насыщение еде дополнительно примерно зох молекул квииа-г. таким образом, если учитывать собственную буферную емкость в цитоплазме, создаваемую са-евкзываисими белками, для повыиения Саг+ до с-оо нн его долгно вокги в тромбоциты с квином-2 в ю~20 раз сольес, чем в контрольные кяетзаз. Аналогичные результаты были получены с тромбином, таким образом данный подход одио:-.иачно доказывает существование ргоептол-активнруемого входа кальция в тромбоциты человека.

деполяризация спазматической не»брапы тромбоцитов л от;- х на агонисты. Выяснение механизма рецепторзавясииого восгуплышь' кальция в клетки, для решения зтея задачи определялись 5;пду-дироваяные агонистани ионные токи через плазматическую мане-рану, которые регистрировали по изменению нембранного потенциала (ЕН). ©луерзецентныя зонд <из-сз-(5) позволяет измерять потенциал плазматической мембраны, и его Флуоресцгнция линспно зависит от деполяризации в пределах от -90 до нв. Б солее ранних экспериментах не было обнаружено влияния агонкстос па мембранный потенциал тромбоцитов (Авдонин л соазг., 1965). ото ногло сыть связано с тем, что саг+ входит не через каналы, аибо входяиий через рецепторуправляемке каналы ток очень кал и пг оказывает занегпого влияния на Ел. кроне того, в тромбоцитах, как это происходит в раде других клеток (втг,19йТ), индуцированное агонистани повышение [сагмпнт когет вызывать активаций калкевш: каналов и препятствовать развитии деполяризации.

для того, чтобы уменьшить выходящие токи, увеличить количество входящих катионов (рис.1) и замедлить предполагаемую инактивацию каналов самкни ионами кальция со стороны цитоплазмы, исследование влияния агонистов на иекбрашшя потенциал проводилось на тромбоцитах, нагруженных квинон-г.. действительно, оказалось, что в тромбоцитах, содерканих квия-2, активатор входа саг* фат вызывает резкую деполяризацию .кеибраяы, после чего потенциал снижается до исходного уровня (ркс.2). В контрольных клетках, выделенных1 при таких ге условиях, но не содержащих кальциевый хелатор, фат вызывал либо значительно более слабое и медленное изменение кенбраяксго потенциала (рис.2), либо не оказывал влияния. Помимо ФАТ деполяризацию плазматической мембраны тромбоцитов вызывали и другие индукторы згода саг+: ад®, тромбин, агонист рецепторов тромбоксана-лг и-'¡■6619, вазопрессин (рис.г). Активатор трокбодитов адреналин, не вызывающий вход саг+ в эти клетки, не влиял на мембранный потенциал, яагрузка клеток другими са-связывающими зонданк фура-г или индо-1 также приводит к появлению индуцированной фат деполяризации, хотя в этих случаях эффекты были меньше, поскольку данные зондк создают меньшую буферную емкость в цитоплазме, для дальнейших опытов по изучению влияния агонистов на мембранный потенциал были использованы тромбоциты, содер-гаиие квин-г.

Параллельно с яследованиен влияния ФАТ на кембранныя потенциал на том же препарате тромбоцитов проводилось измерение внутриклеточной концентрации кальция, как видно из данных яркоэдеЕшхх на ряс.г, в яагруаенных квинон-г тромбоцитах '•■•яяувкроэажшя фат польем ссаг+шит, происходящий за счет выб-росл саг» кз гнутренаих депо, осуяествлязтся очень быстро -

Рис.з. влияние ЛД« (юонН), тромбина (0,1ед/нл), u-4eei9 (юнК), вазопресоина (моем) на величину мембранного потенциала клеток, нахоЕяакгсл q ¡уадг, cosepssscn ионы натрия и кальция.

Pnc.t.

Ахяивани;.

действием ОАТ ¡гоню входа саг+ и ваг+ в хгггругенпке квином-г тронбоциты и регистрация происходящих при этом изменения ненбранного потенциала. Тронооциты 'суспендировали в среде, где ионы натрия сыпи заменены на коны холлна. конечная концентрация добавок : с&сгг - 1нк, вас!2 - 5ик. Во всс прозы добавляли ¿is-сз-(5) до конечной концентрация о,£ ;;кИ.

некее чен за з сек. з отличив от этого, увеличгакг [Саг+]аит га счет входа нояов кальция из внешней среды занимает существенно больше времени, причем было показано, что кинетика индуцированного агонкстом входа Саг+ очень близка к кккгткке деполяризации плазматической кенбраны тромбоцитов. Более кедленпая скорость входа Са2+ по сравнении со скоростью мобилизации отчетливо видна так-е, когда концентрация кальция в среда инкубации была скигеяа до од нк (pitc.í).

Активация агонистаии вгодяяего гока катионов через рецеяторуправляеные каналы, возникает вопрос, токок каких ионов зызвана деполяризация плазматической кенбраны троксопитов, и кнеет ли она отношение к индуцированному агонистаии входу кальция, если деполяризация возникает из-за активации входящего тока катионов через рецепторуправляэные каналн, то следует сякдать, что при покепекки тромбоцитов в кзотоническуя среду с яепроникаюапня через каналы катконаии этот эффект ксчззнет. Действительно, в среде без кальция, в которой Ha.ci был занеаен на хлорисгна холян, увеличение «яуоресцелцкн &ts-c3~(5) в ответ л а фат резко унепыгааось (риса). Зыло исследовано, какие изменения кенбраккого потенциала будут происходить прк протекании через иеибрану индуцированного фат тока ионов саг* (рис.4), оказалось, что при добавлении фат {либо тромбина) к тронбоцитан, суспендированный в холинсодерзасей среде с i нН caci2 вслед за кратковременной деполяризацией в ответ на фат развивается гиперполяризация мембраны, повыиенае концентрации саг* в среде до 5-ю нк не приводило к увеличении деполяризации нзкбранн. параллельно с влиянием оа'г на мембранная потенциал на той sa препарате тромбоцитов проводилось изнерснке [Саг+)пит по Флуоресценции квкна-г (р::с.4). поскольку, в среде с холинои в присутствии ззеанего кальция фат вызывал ярко внраггкныя вход

зтого иона, го ножно заключить, что отсутствие индуцированной фат деполяризации в этих условиях не вызвано инактивааиек редепторактивируеного поступления ионов саг+. следовательно подученные данные ногно объяснить либо ген, что поступление Саг+ осуществляется не через каналы и не сопровождается переносом заряда, либо тен, что входящий ток Саг+ меньше индуцированного при действии агонистов выходящего тока К+, поэтому конечный результатом является гнперподяризация мембраны.

Чтобы выяснить, осуществляется ля вход двухвалентны: катионов через каналы, в хояинсодерзашую среду без сааг были добавлены ионы ваг+, которые не долгны активировать калиевые каналы (Соппогдэтэ; Айашздэво). результаты опытов, в которых исследовалась связь нггду входом ваг+ и изменением некбранното потенциала, продемонстрированы на рис.4,5. в среда с ВаС1г фат вызывал деполяризацию плазматической кенбранп трэкбоцятоз. Е этих ае условиях наблюдался вход ваг+, регистрируемая по Флуоресценции квинз-г. при повышении концентрации наружного ва£+ от 1 до 5 иК (рис.5) увеличивалась деполяризация непбраны, соответствующая переносу этого катиона. Ваг+ поступает в клетки по той ге кинетике, что и Са£+, но на более поздней стадии клеточного ответа падение Флуоресценции квина-г в присутствии ваг+ не происходит, т.к. этот катион не выводится из цитоплазмы кальпиевыни насосани (К1яап,1990; ЗсЫШп«,1989,Ь). совокупность всех этих данных свидетельствует, что индуцированный агонистани вход в тромбоциты двухвалентных катионов происходит через рецепторуправляемыа каналы.

Как представлено на рис.4, в холинсодерзащей среде в присутствии ши сас12 фат вызывает гиперполяризащх» плазматической кеибраны тромбоцитов. В отличие от этого, если фат

к

ФАТ,

Я" К и РГ о и а,

о >»

I,

5 чИ Ваа2

ш

1 цЦ Ве.а.

-и

-47

-«а

2

яз

-48

ш -<8

-50

-51

-61.

-62

ь -93

ФАТ/4'

I/

Ч.Ч

5 кМ ВаС)2

^П 1 ^

1£М вза,

1 контроль

2мнн

135 КМ №С1 1 им СаС12

-55 -1 150 ЫМ СШ

150 имела

1 ММ СаС12

га я

ы.

135 им МаС1

135 им ОС1 135 ММ СзС1

2 гкм

РИС-5. зависимость изменения мембранного потенциала я Флуоресценции кзина-г з антивирусных фат (гони) тромбоцитах от концентрации ионов ваг».

рис.6, изменение менбран-ного потенциала активи-руеныг фат (го нШ (момент добавления отнечеа стрелкой) тромбоцитов, содержащихся в среде либо с ионамк холияа, либо с ионами натрия, в зависимости от ПРИСУТСТВИЯ ионов саг* (верхняя часть рисунка). В нижней части рисунка представлено изменение мгнбранного потенциала плазматической мембраны тренвепитов под действием фат , суспендированных в среде, содержаией либо Каи, либо ЫС1, ДК60 С5С1 (135НМ).

другие агониеты добавляли к тромбоцитам, суспендированным з среде с i ш сасгг и iso мк Kaci, развивалась деполяризация (рис.г). Это ноаяо было объяснить либо тем, что в присутствии ионов натрия кэко возрастает ток саг+ через каналы, либо аго-нисты активируют вход в тронсодиты на+, ток которого деполяризует мембрану. Лля того чтобы проверить эти предположения, было исследовало влияние фат на мембранный потенциал тромбоцитов в среде, содержащей Наел, но в отсутствие ионов Саг+. как показано на pzc.6, в этих условиях под действием фат развивалась еще более сильная деполяризация некбраны. ответ клеток не изменялся при добавлении тетродотоксина и оуабаина. помимо ©AT деполяризацию в этих условиях вызывали и другие кядукгоры входа саг+ в тромбоциты, причем в ответ на них деполяризация такке была значительно сильнее, чен в присутствии кальция.

Наиболее простым объяснением полученных результатов является то, что редгпторуправляеные каналы тромбоцитов не обладают строгой сзлектЕВНость» в отношении двухвалентных катионов к проницаемы тгкзэ для одновалентных катионов щелочных металлов. Однако нельзя ижлючить и более слсгную трактовку, поскольку в одних к тех se клетках могут существовать несколько типов каналов, одни кг которых проводят одновалентные, а другие -двухвалентные катиони при активации меток одньп и тек ге аго-нистон (Реппетдэвв). для того чтобы выяснить, осуществляется ли индуцированный агонистани вход одновалентных катионов в тромбоциты через те ге каналы, через которые зходйт саг+ и Ба£+, было наследовано влияние, оказываемое на на-зависинув деполяризации двухвалентными катионами, блокирующими кальциевое каналы, а такг» самих ионоа саг*, ионы никеля к кадмия блокируют кцдудпишаннык агонкстон вход кальция в трокйсцкгы чело-Еекз с полунакскиадьнан инпкшрованиен примерно при so нкн и hs

влияют на его мобилизацию из внутренних депо (рис.7) (НаИат,1985). оба эти катиона в такой re концентрации в два раза подавляют индуцированнуа оат деполяризацию, вызванную входом Hat. Блокирование входа саг* и на-зависиноя деполяризации ионами ш.г+ и саг+ при одних и тех зе концентрациях доказывает, что натрий входит в тромбоциты через те ге каналы, которые обеспечивают вход и ионов саг*, деполяризация подавлялась такзе ионами Нпг*. ранее было показано, что агонисты активируют вход Нпг+ в тромбоциты (Haiiam.ises), поэтому эффект нпн+ ногно объяснить его конкуренцией с ионами на+. таким образом, двух- и одновалентные катионы входят в тромбоциты через одни и те ~е каналы.

каксво сродство рецапгорулравляеных каналов по отношению к дзухвалентяни и одновалентным катионам? для ответа на этот вопрос было опрадеяеко влияние разных концентраций ионов кальция снаружи на вызванную входом На+ деполяризацию, а такзе вавксиность индуцированной ФАТ деполяризации от концентрация 2а+ и ваг*. кчк доказано на рис.е, ток иоков натрия через канзды в яся.чсль::^ раз угеньсаатся под действием ионов кальция, такого рода явление описано в случае лотеяцяалуправляемых кальциевых каналов, где селективность по отношению к Са2+ определяется тем, что, связываясь с определенным участком в структуре канала, он в микромолярных концентрациях препятствует току :ia+ н других одновалентных катионов (Pie trobon,1988). б случае редепторуправляеннх каналов полунаксимадьное япгибиро-вание иопани кальция патриизависимоя деполяризации наблюдалось при о,з мм. Из этих данных следует, что репепгорупразляеные каяалн тромбоцитов менее селективны по отношению к саг+ чем потенциалуправляемые кальциевые каналы.

9

и «

еоа-400 -200 -о -

й5г-33 -£5 -20 -151050*—

СбС12

ЗГТА

Ш М № СИ . 50 £00

- т са еоа

Наа

35 50 150 400 50 : 600 гаем| Ш СЛ Цп

Рис.7. Блокирование индуцированного фат (2онш входа саг* в тромбоциты и деполяризации двухвалентными катионами металлов. Тронбо-дкты суспендировали в натрийсодергащей среде без згта. в присутствии I нн сас12, либо без саг+ с о,1 мм згта. при измеаении потенциала тромбоциты

суспендировали в натриясодер*аиек среде без кальция и ЭГТА. контроль - светлые столбики.

[Са"' ]цдг ,еМ

330-2ЯЗ 1С0

100

•¿г

2 мин

ФАТ

ПГЕ1|

ФМА ОАТ

Рис.а. Блокирование простагландинои Е1 (Ю икш и 1-Форбол-1г-ииристат-13-ацетатон (однки) иадуцирован-::ого фат (гоню подъема внутриклеточной концентрации кальция и натрийзавиеинок де-лоляризздии плазматической менбранц тро.м-

СОЦИТОЕ.

тем не ненае, проведенное исследование позволяет утверздать, что сродстео рецепторуправляемых кальциевых каналов к двухвалентным катионан значительно выше, чен к одновалентным, зависиность индуцированной фат деполяризации, обусловленной входом Rat, была линейной вплоть до iso нм Haci. в отличие от этого, зависиность вызванной входон• Ваг+ деполяризации от концентрации этого пока, yse при s им васзг практически выходила на плато, дальнейшее возрастание концентрации Еасхг (вплоть до 60 мн) увеличивало индуцированную агонистами деполяризации не более, чем на г ох.. из этих данных следует, что сродство рецепторуправляемых каналов к двухвалентным катионан значительно выше, чем к одновалентный, хотя по величине натриевый ток а несколько раз превосходит ток ионоз бария.

Блокирование редепторуправляамых кальциевых каналов тромбоцитов активаторами аденилатциклазы и лротаинкинагы-с. Вызванное агопистани увеличение [Саг+)я;:т в тромбоцитах подавляется при действии активаторов аденилатциклазы и при активации скдогггнся лротеинкияазн-с Форооловнми эфирами (авдояин и Алтугсва, I9C5; АВДОНИН и соавт., 1987; Ha.cInture,19S5; 2avoico,i9S«). Высказывались гипотезы, что устранение подъема [Са2+]цит связано с увеличением захвата ионов кальция внутриклеточными пулами и скорости выведения Саг+ из клетки (Toctiida 1987,1938,1959). С другоя стороны, данные исследований о влиянии этих Факторов на иядуцкрсванныя агопистани вход '¡5Са и Нпг+ указывали, что ото обусловлено такге блокированием репептор-завксиного входа двухвалентных катионов (Ardonin at ai., 1986). На рис.а показано, что добавление непосредственно перед фат активатора аденилатциклазы тромбоцитов простагландита El либо активатора лротсинкянаэы-с »-Форбол-12-нир!!сгат-1з-адетата полностью подавляет на-зависинуы деполяризации мембраны, эти

Ыа.Са

рис.9. кзиеяение иексранного потенцкаяа тромбоцитов, нахЕ^ дявшхся в нагрипсодерсацеи среде с касьаяеи е сез. при действий ©АТ (гоню, ннкар-лкакна (Е) аккт и вграпакнда (В) (аккн).

Рис.ю. зависимость вэдичкны обусловленной бюдои конов натрия деполяризации плазматической кеибраны троноодитов, содержащихся в среде без кадь-Кия, от концентрации никар-дцпика ц верапапила.

Е , ПБ

Нпкардкшш,

-25

-35 -451

-55

-65 {

/ у'

2ННН

Е . НВ

-35

..•г&1 ^ ~45

-55

-65

ггапаиил_ыкИ

.. -~-> 50

1 25

л 10

! 5

2:п:я

2

данные подтверждает ранее высказанное предположение о тон, что ПГЕ1 я фна блокируют рецепторуправляекые каналы тромбоцитов (Avdonin et al., 19S6) к еще раз свидетельствуют, что на+ входит через те se каналы, которые обеспечивают вход саг*.

Влияние на рецеяторуправляеные каналы кальциевых антагонистов. Такие вешества, как верапанил, диятиазем, нйкар-дипин, нифеяипин, хорошо известны в качестве органических бло-катороз потендиалэависиннх кальциевых каналов "Ь"-тила (Reuter,19s3). эти =е вещества, в более высоких концентрациях, могут снизать индуцированное агонистон повышение внутриклеточной концентрации саг+ за счет ингибироваяия его входа из внешнем срзды (Avdonin et ai., 1S36). поскольку саг+" поступает через редепторуправляеные кальциевые каналы и эти каналы проводят Hat, следовало ожидать такдг блокирование кальциевыни актагонистапи рзцезторэавмснного входа ионов натрия, однако их зФФгкг оказался пря?ю противоположным, как представлено яа рис.9, пикардилтш к верапакнл не только не устраняли деполяризацию, ваозапкуз cat, ло дп~е сиш уменьшали абсолютное значение мембранного зотекдгз.та грснгоаитоп. кроме того, озя устраняли ингибировакпе копани кальция ттряягавксякоя деполяризации, вызванной фат <p:íc.9) -<í другими агсякстамк. деполяризующее действие блокаторов проявлялось при никромслярных концентрациях (рис.10). Переносчиком зарядов могут слузить ионк натрия и попы лития, но не ноны холкна (рис.И). изиеаеяиа менбраяого потенциала, как ;; в случае с индуцированной cat яа'трийзависяноя деполяризацией, сыяо пряно пропорционально концентрации Haci ео внешней среда вплоть до 15о мн. сгсутствиз насышения, а такаа сходство действия на потенциал зерапаиила и н.чкардипина, с одкоя стороны, л агснистоз, с другог:, позволяло пуедлопо~нть,

что индуцированная антагонистами деполяризация объясняется входом катионов через каналы.

Возникает вопрос, входит ли при этой На+ через те хе каналы, за счет работы которых ны видим рецепторзависимую деполяризацию мембраны, либо через иные, присутствующие в плазнатическоя мембране тромбоцитов. Для того, чтобы сделать выбор мегду. этими возможностями, было проведено сравнение влияния разных концентрации кхг+ на ватригзависиную деполяризацию, вызванную агонисгон (ФАТ) и антагонистом (никардипик). оказалось, что в обоих случаях никель подавляет деполяризацию, причем сродство к ui£+ и наклон концентрационных зависимостей совпадали. Кроме того, вызванный органическими блокатораии кальциевых каналов вход Hat-, как и в случае с активаторами тромбоцитов, подавлялся ионами кальция (рис.9), хотя и в меньшая степени, эмг данные свидетельствует в пользу того, что деполяризация, вызванная антагонистами кальция, обусловлена входом попов натрия через те ге каналы, что и в случае акти-Z2.tsr.cs. трскгоцитов природными индукторами.

таким образом, бдокаторы оказывают комплексное действие на редгпторуправляекые кальциевые каналы тромбоцитов: ингиби-рух>т в*од Са2+, но при этой является акткзатораниг входа ионов натрия и потзкцкируют их поступление, индуцированное агонис-тамк. подавление тока кальция через каналы ногло быть следствием деполяризации плазнатическоя мембраны ' (AiUn.igae; Herritt,19S7; Mobr,i9ST; SctUlli.ng,19S9,a; Sage,19^6). однако, по нашим данным, если унекьаение абсолютной величины мембранного потенциала и имеет значение в действии антагонистов на рецепторзависиныи вход Са2+ в троибоцкты, его роль не является первостепенной. Выло определено действие никардшшна на инду-дированое Фактором активации тромбоцитов увеличение [Са2*)дит в

Е , I ....... ЦБ 2ШШ

-30

-40 -30 '/ ( п/Р Н 1

-во / У 1

йКгМаега

-70 На и сь

К , т 2Ш

-40-

-50 В 3-3 в в 1

-ОС- I К"' v. "у 1

-70^

| и СП

4 с-!

т о

« я

соо,

400' 200:

100

-10 -30 -30 -70

' V* I !

фат С а

213X121

рис.11, влияние никар-дилина (Н) (4нкк) и верапанила (В) (внкН) на ненбраняыя потенциал трокбопитов, находящихся лисо в натрия-, либо в литий-, либо в холин-содерааиея среде.

рцалг.

Влияние оче-

редности добавления кальция «ню к никар-диллна (Н1 (4нки) да иагяоирозание подьена вяутриклегочиоя концентрации кальция и на залнчкну дгподяриэадял пдазиатяческоя игнбрапы иддуцирозаяных ФАТ (гон:!) тронеепптов.

[Са2+]лМ

600 500

зоо

203 100

Na

ФАТ

Нккаршпшн

холин

2l£KS

Шхгардшжа

Ркс.13. Влияние ионного состава среды на кпгнбироваапе никардкпикок (внкю индуцированного фат (гоню подьека внутриклеточной концентрации кальция, тронбоцктк находились либо в натрий-, либо з холинсодергаиек среде с кадышен (ШН).

г нин

рис-it. изменение нен-бранного. потенциала при действии фат (гонн) и никардипина (2нкн) в гронбоцитах, нагруженных малыми количествами зонда фура-г и находящихся в иатркйсодерхаией среде с кальциен (1нн) к в отсутствие этого кона, аккаль добавлялся в концентрации loo нкн.

усдовияг, когда величина мембранного потенциала перед добавлением агониста была различной (рис.12), это достигалось за счет изменения порядка добавления кальция и никардипяна перед активацией клеток с помощью фат. Как показано на рис.9, кальций, добавленный до антагонистов, уменьшает вызванную ими деполяризации, но не влияет на нее при добавлении в монент достижения плато (рис.12). как оказалось, в таких, условиях (т.е. при разных значениях деполяризации мембраны) ингибирование никар-дяпином увеличения [Саг+зциг в ответ на фат было одинаковый.

на оснозании приведенных выше данных можно заключить, что блокаторы кальциевых каналов снижают подъем [Саг+шит, вызванный агонистами, однако их ингибирующий эффект не обусловлен уменьшением абсолютного значения мембранного потенциала клеток, для -того чтоб*: объяснить механизм действия антагонистоз кальцин, было предлологеко, что в нормальных условиях каналы имеют высокое срэтство к спг+, и на* не могет конкурировать с ним за канал, действие г;г алтагоилстов заключается в снижении сродства к попал кальция, б результата того начинает проязлятся конкуренция со стерка г исетч ьегг.-е*. таксе предположение мозно проверить, заменив !>ояп ;-'зтрня на ноны холима, которые сяиикон велики, чтобы проникать »:ерез канал, и действительно, как видно из рис.13, з холинсодергащея среде, когда исключается конкуренция других катионов с Сл?+, никардипия кг ингибирует индуцированный фат лодьен [Са2+]дит. такая ге картина наблюдалась и при активации тромбоцитов трокбинон, адо и зазопрессинсн.

Все экспериментальные данные, представленные выше, были подучены на тромбоцитах, нагруаенкых каином-г. такой подход позволил проследить за работой кальциевых каналов по изненеяию менбранного потенциала. но з клетках зивого организма

отсутствует хелатирующик агент для кальция. Возникает вопрос, правомерны ли сделанные выводы в случае клеток, не содержащих квин-£. Поэтону был проведен эксперимент на клетках, нагруженных надыми концентрациями зонда Фура-г, когда почти не создается буферная енкость для кальция, к вход саг+ отражает лишь вторая, более продолжительная фаза Флуоресценции (Poilóck, 19бб). в таких условиях почти не наблюдается изменение мембранного потенциала клеток в ответ на гормон (как ив случае ненагруженных Фяуоресцентныни зондами тромбоцитов), поскольку, по-видимому, мобилизации кальция достаточно для активации кальцийзависимкх калиевых каналов (рис.14), но в случае с никардкпинон, который не вызывает внутриклеточного выброса кальция и его поступления извне, было видно натриизависимое изненение мембранного потенциала клетки, блокируемое двухвалентными катионами (саг-t- и Н1г+). при Физиологических концентрациях ионов Са.г+ и на+ деполяризация плазматической нембраны клеток, вызываемая антагонистами кальция незначительна, поэтому ножко думать, что ингибирующее действие этих веществ на вход саг»- в клетки, как и в случае с рецепторуправляамыми кальциевыми каналами хронаФФинных клеток надпочечников (Hocbizuki-Oda, i99í), едва ли может быть обусловлено изменением мембранного потенциала.

выводы

i. использование квина-г как геяатора ионов кальция в цитоплазме позволяет резко усилить индуцируемый тромбином к Фактором активации тромбоцитов входящие ток 45са и отделить его от неспецифического захвата 45Са тромбоцитами, кинетика входа 45Са совпадала с кинетикой увеличения концентрации цитоплазматического Са2+, что свидетельствует о существовании

рецепторзависимого входа са2+ в эти клетки.

г. для выяснения механизма рецепторзависимого входа Са2+ определено влияние агонистов на ненбравный потенциал, который измеряли с поноиыо Флуоресцентного зонда dis-c3-(5). вход саг+ сопровождался гиперполяризациея нембраны за счет активации калиевых каналов, поэтому для оценки непосредственно связанных со входом двухвалентных 'катионов изменения мембранного потенциала была проведена замена саг+ на Ва2+. показано, что Ва2+ такке поступает в клетки при действии на них тромбина и ФАТ, и этот вход сонровоядается деполяризацией плазматической нембраны, что свидетельствует о существовании в тромбоцитах реценторупразляеных каналов.

3. показано, что агонисты (тромбин, и-45619. Фактор активации тромбоцитов, вазопрессин и адф) могут вызывать деполяризацию плазматической ненбранк, обусловленную входом кг+, Lit или Cs+. установлено, что вход одновалентных катионов когет осуиествдятьсч через те re каналы, которые проводят саг+. сделан вывод, что при Физиологических концентрациях ионов рецелторупразяяе?;цу xz\zc;r. трсжолптзз яронияаемы как для Сан+, так и для hai.

4. Активация протеинкиназ а и с в тронбоцитах приводит к блокированию индуцированных агонистани повышения внутриклеточное концентрации кальция и деполяризации мембраны, что свидетельствует о регуляции рецепторуправляекых каналов гронбоцитсв вторичными посредниками.

5. описан механизм действия кальциевых антагонистоз на рецелторулравляснца каналы тромбоцитов человека. Установлено, что никардилий и верапанил оказывают двойной эффект на каналы -подавляют индуцированная агонистани вход 0а2+, но усиливают

вход Ка+. ингибкрование входа са£+ этими соединениями наблюдается только в натрийсо держа щей среде и исчезает при замещении ка+ на ионы холина. кроме того, антагонисты сани вызывают деполяризацию мембраны, обусловленную входом на+ или предполохено, что антагонисты уменьшают сродство рецепторуправляемых каналов к саг+, в результате чего облегчается вход ка+ и становится существенной его конкуренция с ионани кальция. Это приводит к подавлению репепторзависимого входа саг* и усилению тока ка+.

Список публикаций по теме диссертационной работы.

1. п.в.Авдонин, Е.Н.Бугрий, и.Б.Чеглаков, а.в.иазаев, в-а.ткачук. доказательство судествования рецепт0рзависииых кальциевых каналов в тромбоцитах. дан ссср Т.2&9, CTP-220-E24, 1966.

2. И.Б.ЧеГЛаКОБ, П.В.АВДОНИН. РЕГИСТРАЦИЯ С ПОМОЩЬЮ ФЛУОРЕСЦЕНТНЫХ ЗОНДОВ РЕЦЕПТОРУПРАВЛЯЕИЫХ КАНАЛОВ ТРОНБОЦИТОВ. всесоюзный симпозиум "Неханизмы действия медиаторов и гормонов на эФФекторные клетки", г.суздаяь, стр.гог, 19Э9.

3. в.А.ткачук, п.в.авдонин, и.В.Свитина-Улитина, и.Б.Чеглаков, и.ю.Меньшиков, е.н.Бугрий. неханизмы рецеп-ТОРЗАВИСИИОИ РЕГУЛЯЦИИ концентрации кальция в питоплазне ТРОМБОЦИТОВ, "внутриклеточная сигнализация" Москва, "Наука", CTP.1S1-1BB, 1966.

4. л.в.авдонин, и.Б.Чеглаков, в.а.ткачук. ионная проницаемость и регуляция рецепторуправляеиых каналов плазматической ненбраны тромбоцитов человека. Биологические мембраны т.7, стрлг-гг, 1990.

5. P.V.Avdonlli, I.B.CUeglaKov, E.H.Boogry, I.ViSvltlna-UUtina, A.V.Mazaev, V.A.TKachuK. EVXDEHCE FOR THE RECEPTOR-OPERATED CALCIUM CHAKKELS IK JIUHAH PLATELET PLASMA HE MB RASE. Thrombosis Research 46; ȣ9-37, 1967.

6. V.A.TKachuK, P.V.Avaonin, I.B.CheglaKov, V.K.BochKov. RECEPTOR-OPERATED CHAKKELS. IH HUHAH PLATELETS. J,Protein Chemistry v.fi, n.3, P.42T-42S, 19fl9.

7. P.V.Avdonin, I.B.CheglaKov, V.A.TKachuK. STIHULATXOK OF KOItSELECTIVE CATIOH CHAHHELS PROVIDING Ca2+ IHFLUX IKTO PLATELETS BY PAF AHD OTHER AGGREGATION IHDIJCERS. Eur.JJSlochem. v.196, p.267-273, 1991.

5. I.B.CheglaKov, P.V.Avdonin. AGOKIST-IHDUCED ACTIVATIOH OF Hat AHD Ca2+ COHDUCTIVE CURREHT3 lETO HUHAH PLATELETS. PLATELETS, v.l, p.27-28, 1990.