Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Исследование функциональной чувствительности тромбоцитов (методологические, физиологические и клинические аспекты)

ВАК РФ 03.00.13, Физиология

Содержание диссертации, доктора биологических наук, Миндукшев, Игорь Викторович

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1Л. Структура и функции тромбоцитов

1.2. Механизмы сигнальной трансдукции тромбоцитов.

1.2.1. Мембранные рецепторы тромбоцитов.

1.2.2. ГТФ-связываюгцие белки и эффеюпорные системы.

1.2.3. Механизмы регуляции внутриклеточной концентрации кальция.

1.2.4. Внутриклеточные механизмы изменения функционального состояния тромбоцитов.

1.3. Нарушения функции тромбоцитов.

1.4. Методы оценки функциональной активности тромбоцитов.

1.5. Гранулометрический анализ, - анализаторы размеров частиц.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

Глава 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ МЕТОДОЛОГИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ

3.1. Основные принципы применения техники малоуглового светорассеяния для цитологических исследований.

3.2. Описание разработанного лазерного анализатора микрочастиц «ЛАСКА».

3.3. Разработка нового метода оценки функционального состояния тромбоцитов.

Глава 4. ФИЗИОЛОГИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ

4.1. Оценка влияния пуриновых нуклеотидов на кинетические параметры активации и агрегации тромбоцитов.

4.2. Изучение влияния блокаторов кальциевых каналов на кинетику активации и агрегации тромбоцитов.

4.3. Исследование влияния БАВ, изменяющих внутриклеточную концентрацию циклических нуклеотидов, на функциональную активность тромбоцитов.

4.4. Изучение влияния биологически активных веществ на функциональную активность тромбоцитов в условиях t| обращенного 3Na /Са -обмена.

4.5. Изучение влияния агониста тс-опиатных рецепторов U на кинетику активации и агрегации тромбоцитов.

Глава 5. КЛИНИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ

5.1. Исследование развития рефрактерности тромбоцитов.

5.2. Влияние ишемии/реперфузии мозга на тромбоциты крыс.

5.3. Исследование функциональной активности тромбоцитов у больных ишемической болезнью сердца.

5.4. Влияние липопротеидов (ЛИНИ) на функцию тромбоцитов.

5.5. Функциональная активность тромбоцитов крыс после лучевого воздействия.

5.6. Оценка агрегации тромбоцитов у пациентов с искусственным сердечным клапаном.

5.7. Оценка агрегации тромбоцитов у беременных пациенток.

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ.

ВЫВОДЫ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Исследование функциональной чувствительности тромбоцитов (методологические, физиологические и клинические аспекты)"

Актуальность проблемы.

Тромбоциты представляют собой возбудимую популяцию форменных элементов крови, ответственную за процессы коагуляции, репарации сосудистой стенки, депонирование и транспорт Б AB, осуществление иммунных реакций организма (Siess W. 1989). Полифункциональность этих клеток обусловлена множественностью различных типов рецепторов на мембране и разнообразию сценариев трансдукции внутриклеточного сигнала. Выявлено более 20 участков связывания БАВ различной химической природы (пуринов, катехоламинов, производных триптофана, простагландинов, пептидов и проч.) (Brass L.F. 1993, Da Prada М. 1988, Kerry R. 1985, Ralevic V. 1998, Siess W. 1989).

Функционирование тромбоцитов строится на сопряжении процессов в плазматической мембране, являющихся непосредственным ответом на раздражение, и внутриклеточных механизмов, обеспечивающих специфическую реакцию клеток. Эта связь осуществляется высокоразвитой системой внутриклеточной сигнализации, которая запускает или модулирует соответствующие реакции путем передачи сигнала от поверхностной мембраны к исполнительным механизмам (Албертс Б. 1994).

Достаточно большой спектр активных веществ, с соответствующим рецепторно-сопряженным внутрисигнальным трансдукционным механизмом, предполагает достаточно строгую и в то же время гибкую временную организацию процесса трансформации клетки, предназначенную обеспечить не только основную репарационную функцию тромбоцитов, но и возможность локализации процесса тромбообразования.

Тромбоциты являются уникальной клеткой, для которой показано наличие трех различных типов пуриновых Р2-рецепторов к одному агонисту — АДФ: Р2Х1-, Р2У1- и P2Y12 (др. названия Р2Т, P2Yac, P2YADp„ SP1999) -рецепторы (Woulfe D. 2001). Р2Х1-рецепторы являются неспецифическими катионными каналами, и активация этих рецепторов АДФ вызывает быстрый поток ионов кальция из среды. Лигандирование Р2 У1 -рецептор о в, сопряженных с выбелками, приводит к активации фосфолипазы С, с последующей мобилизацией ионов кальция из внутриклеточных депо. При активации Р2У12-рецепторов, через в^-белки, угнетается аденилатциклаза. Методически довольно сложно установить специфичность связывания трех пуриновых рецепторов к одному агонисту непосредственно на одном объекте. Для установления фармакологического профиля эти рецепторы были клонированы в другие клеточные линии (Таказа1а I. 2001, Кейш§ег 1. 2003). В этих работах установлено, что величина ЕС50 этих рецепторов ниже 100 нМ. Возможность активировать тромбоциты в этой концентрационной зоне находится в противоречии с общепринятыми концентрационными зонами (1-10 мкМ) тестирования этих клеток традиционным клиническим методом Борна. Это может быть связано с неадекватностью метода Борна, что предполагает разработку метода, в котором тестирование тромбоцитов проходит в более адекватных физиологических условиях. По крайне мере, по концентрации ионов кальция в тестируемой среде, т.к. низкая концентрация ионов кальция (около 30 шкМ) в методе Борна не соответствует физиологической в крови (2-3 мМ). Метод Борна, основанный на регистрации агрегации клеток по пропусканию света (Вот С.У.К.1963), до сих пор является основным клиническим методом тестирования тромбоцитов. Достоинствами метода являются простота и невысокие требования к аппаратурному обеспечению. Но при этом, метод является полуколичественным: трактовка получаемых результатов сводится к относительной оценке конечной амплитуды сигнала и, практически, не характеризует изменение чувствительности тромбоцитов к агонистам.

Кроме методической проблемы, теоретически более важной является проблема соотносительности начального лиганд-рецепторного звена взаимодействия и последующего сценария развития каскада внутриклеточных реакций, приводящих (в данном случае) к сборке интегриновых рецепторов

ОРП/вРШ (аПЬ/рЗ). Изменение функциональной чувствительности тромбоцитов к индукторам агрегации должно зависеть, как от начального статуса внутриклеточной сигнальной системы, так и от развития реакций «обратного действия» (цАМФ-, цГМФ(ЫО)-системы).

Значительный прогресс, достигнутый в понимании внутриклеточных механизмов за последние десятилетия, позволяет целенаправленно оценивать временную организацию внутриклеточных процессов и, что очень важно, использовать тромбоциты в качестве фармакологической модели, позволяющей выявлять механизмы действия биологически-активных веществ, на ранней стадии разработки лекарственных препаратов.

Закономерна постановка вопроса, об изменении функциональной чувствительности тромбоцитов при различных патологиях. Нарушения тромбоцитарно-сосудистого гемостаза возникают при многих заболеваниях, таких распространённых, как ишемическая болезнь сердца, ишемия мозга, и т. д. В ряде случаев, изменение функциональной активности тромбоцитов к гормональному микроокружению, является определяющим звеном этой патологии гемостаза. Тромбоциты, являясь высоколабильными структурами, могут активироваться даже при небольших воздействиях, при этом повышается их чувствительность к различным стимулам. Очевидно, что такое гиперчувствительное состояние не может быть долговременным. Сохранение гиперчувствительности тромбоцитов, их последующая дегрануляция с высвобождением БАВ и вторичная активация клеток м икр о о кружен ия создают угрозу возникновения не только локального, но и распространённого тромбоза. В этих клетках существуют механизмы, которые «выводят» их из гиперчувствительного статуса, с изменением порога чувствительности, отличным от нормального статуса этих клеток.

Большинство методик, характеризующих функциональную активность тромбоцитов, основаны на тестировании ответа тромбоцитов при воздействии рецептор-зависимых агонистов. В этом случае существенной характеристикой функциональной активности тромбоцитов является их чувствительность к действию агониста. В медицине и биологии используют различные термины, характеризующие данную способность: толерантность отражает привыкание (адаптацию) биологической системы к длительному раздражению, и используется в иммунологии, фармакологии, токсикологии; рефрактерность, характеризует стадию не реагирования возбудимых клеток после стимуляции, и используется в кардиологии, неврологии. По существу, и толерантность и рефрактерность характеризуют снижение или отсутствие ответа клеток. Но если толерантность предполагает устойчивое снижение чувствительности клеток, без их последующего полноценного восстановления, то рефрактерность, чаще всего, представляет собой полное временное отсутствие ответа на действие агониста. В то же время, механизмы такой толерантности тромбоцитов, а также особенности их проявления при патологии, изучены недостаточно. Возможности методов исследования дисфункции тромбоцитов, до настоящего момента, не позволяли своевременно установить возникновение данных изменений и применить их в лабораторной диагностике и клинической практике.

Цель исследования: Основной целью нашей работы являлось разработка нового метода оценки функциональной чувствительности тромбоцитов, выяснение закономерностей действия синаптотропных веществ на внутриклеточные сигнальные системы тромбоцитов новым методом и изучение вариабельности функциональной чувствительности тромбоцитов при различных патологических процессах.

Задачи исследования: 1. Разработка аппаратурного и методического обеспечения применения техники малоуглового светорассеяния для исследований тромбоцитов, -разработка лазерного анализатора частиц для цитологических исследований.

2. Выбор и обоснование количественных параметров, характеризующих агрегационные свойства тромбоцитов, разработка метода оценки функциональной активности тромбоцитов.

3. Оценка эффекгивности действия пуриновых нуклеотидов на Р2-рецегггоры тромбоцитов.

4. Исследование механизма подавления блокаторами кальциевых каналов агрегации тромбоцитов.

5. Изучение влияния БАВ, изменяющих концентрацию циклических нуклеотидов, на кинетические параметры активации и агрегации тромбоцитов.

6. Изучение влияния БАВ и условий среды на функциональную активность

Hi тромбоцитов в условиях обращенного 3Na /Са -обмена.

7. Исследование механизма действия агониста лг-опиатных рецепторов U50488 на тромбоциты.

8. Изучение условий перехода клеток в рефрактерное состояние.

9. Исследование влияния ишемии/реперфузии мозга на агрегационную активность тромбоцитов крыс.

Ю.Исследование агрегационной активности тромбоцитов у больных ишемической болезнью сердца, сопровождающейся гиперхолестеринемией.

11.Исследование влияния липопротеидов низкой плотности (ЛПНП) на тромбоциты крыс in vitro.

12. Исследование динамики изменений функциональной активности тромбоцитов после общего однократного гамма-облучения в дозе ЗГр.

13.Исследование агрегационной активности тромбоцитов у пациентов с искусственным сердечным клапаном (ИКС).

14. Исследование агрегационной активности тромбоцитов у беременных пациенток: исследование влияния окситоцина и простагландина F2a (энзапроста) на тромбоциты; исследование характера гиперчувствительности тромбоцитов у беременных с гестозом.

Научная новизна работы.

Разработаны аппаратурные и методические основы применения техники малоуглового светорассеяния для исследования тромбоцитов. Разработана новая концепция лазерного анализатора микрочастиц для цитологических исследований.

Впервые изучен диапазон полумаксимальных эффективных концентраций пуринов на стадиях активации и агрегации тромбоцитов. Определена чувствительность трех типов пуриновых Р2-рецепторов к АДФ. Установлено, что АТФ является парциальным агонистом P2Y]-рецепторов тромбоцитов.

Показано, что катехоламины неконкурентно, а селективные адреном иметики конкурентно модулируют активацию тромбоцитов, индуцированную АДФ.

Установлено, что факторы, повышающие внутриклеточную концентрацию ионов Na+ (преинкубация клеток с уабаином или моненсином) увеличивают скорость обращенного Ыа'/Са2+-обмена.

Установлено, что активированные тромбоциты в отсутствии дополнительного стимула переходят в рефрактерное состояние.

Разработан новый метод оценки агрегационной активности тромбоцитов, получены значения, количественно характеризующие чувствительность тромбоцитов к АДФ. Этим методом показано, что в норме активация тромбоцитов тестируется в области концентраций АДФ 5-50 нМ, а агрегация -при концентрации 60-180 нМ. Область этих концентраций АДФ является физиологической, что выгодно отличает выбранную методику от ранее используемых для оценки тромбоцитов, где диапазон действия АДФ - 5 и более микромоль. Стандартизация условий тестирования тромбоцитов позволила характеризовать исходное функциональное состояние тромбоцитов по чувствительности к действию агонистов, оцениваемой величиной ЕС50. Была проведена оценка максимально возможной скорости агрегации (Umax), косвенно характеризующей интегриновое звено агрегации.

Показана вариабельность агрегационной чувствительности тромбоцитов к АДФ при патологических процессах на модели ишемия/реперфузия мозга крыс и у больных с ишемической болезнью сердца, сопровождающейся гиперхолестеринемией, установлено, что тромбоциты характеризуются толерантным состоянием, а у пациентов с искусственным сердечным клапаном и беременных женщин с угрозой прерывания беременности наблюдается гиперчувствительность тромбоцитов.

Впервые продемонстрирован фазовый характер восстановления агрегационной активности тромбоцитов крыс после общего однократного гамма-облучения в дозе 3 Гр в течение б месяцев. Получены новые данные об активации тромбоцитов крыс липопротеидами низкой плотности (ЛПНП) in vitro, изучен характер такого воздействия ЛПНП на АДФ-индуцированную агрегацию тромбоцитов. Проведена сравнительная оценка влияния энзапроста (простагландина F2a) и окситоцина на агрегационную активность тромбоцитов in vitro.

Научно-практическая значимость.

Совместно с НПФ «ЛЮМЭКС» разработан и начат серийный выпуск лазерного анализатора микрочастиц серии «ЛАСКА» предназначенного для цитологических исследований, в частности, для определения функциональной активности тромбоцитов.

Полученные результаты расширяют представления о механизмах изменения внутриклеточного Са2+ в тромбоцитах при их рецептор-зависимой активации, а также в результате изменения ионного транспорта. Это позволяет выработать стратегию изучения действия БАВ на внутриклеточные сигнальные системы тромбоцитов.

Разработан метод исследования ЗЫа+/Са2+-обмена в тромбоцитах, позволяющий оценивать пригодность клеток для изучения рецепторных механизмов.

Представленная модель развития рефрактерного состояния тромбоцитов дает возможность объективно оценивать полученные результаты и может использоваться при изучении механизмов патологических состояний.

Полученные в результате исследования новые данные расширяют представление об изменении функциональной активности тромбоцитов при патологических процессах: ишемической болезни сердца, ишемии мозга, лучевой болезни.

Результаты проведенных исследований существенно дополняют знания о патогенетическом значении изменений функциональной активности тромбоцитов в механизмах толерантности тромбоцитов при изучаемых патологических процессах.

Обосновано новое направление в гемостазиологии, связанное с изучением механизмов изменения функциональной активности тромбоцитов толерантности. Результаты исследований механизмов толерантности могут быть использованы при разработке методов клинической оценки нарушений системы гемостаза, прогноза и профилактики, связанных с ними осложнений.

Результаты работы обосновывают целесообразность применения нового метода оценки агрегационной активности тромбоцитов в клинических и лабораторных исследованиях.

Полученные данные о толерантности тромбоцитов и механизмах ее возникновения и развития могут быть рекомендованы для внедрения в учебный процесс в курс патофизиологии при рассмотрении вопросов патологии сердечно-сосудистой системы, гемостаза, микроциркуляторных нарушений, нарушений клеточной рецепции, а также могут быть использованы в лекционных курсах в ВУЗах медико-биологического профиля.

Апробация работы.

Результаты диссертационной работы были представлены на 1(Х1) Международном совещании по эволюционной физиологии (С.-Петербург, 1996). International Workshop «Laser in Medicine 97», Российской научнопрактической конференции "Патологическая боль" (Новосибирск, 1999), VI Российском национальном конгрессе "Человек и лекарство" (Москва, 1999); Международной конференции "Фармация в XXI веке: инновации и традиции" (С-Петербург, 1999); II Международной конференции по микроциркуляции и гемореологии (Ярославль-Москва, 1999), Втором Российском конгрессе по патофизиологии (Москва, 2000), Научной конференции, посвященной 95-летию со дня рождения академика РАМН Ф.Г. Углова (Санкт Петербург, 1999), Второй международной научно-практической конференции «Здоровье и образование в XXI веке» (Москва, 2001), 8th Annual International Ain Shams Medical Students Congress. (Cairo, 2000), 5th Baltic Congress of Laboratoty Medicine (Vilnius, 2000), Международной конференции «Медико-биологические последствия чрезвычайных ситуаций» (Санкт-Петербург, 2001), Щ International Scientific Conference «Economy, Logistic, and Ecology in Armed Forces» (Brno. 2003), Международной Конференции «Рецепция и внутриклеточная сигнализация» (Пущино, 2003), Международной конференции «Гомеостаз и инфекционный процесс» (Сочи, 2003), 3 Российском конгрессе по патофизиологии «Дизрегуляционная патология органов и систем» (Москва 2004), Научно-практической конференции «Методы исследования регионального кровообращения и микроциркуляции в клинике» (С.Петербург, 2004), 8th International Symposium on Protection against Chemical and Biological Warfare Agents. Gothenburg, Sweden (2004), VII конференции «Аналитика Сибири и Дальнего Востока» (Новосибирск, 2004).

Заключение Диссертация по теме "Физиология", Миндукшев, Игорь Викторович

ВЫВОДЫ

1. Разработан и внедрен в серийное производство лазерный анализатор размеров микрочастиц, позволяющий осуществлять цитологические исследования различных процессов: изменения формы и объема клеток, агрегационных, дезагрегационных и коагуляционных процессов. Анализатор не имеет прямых мировых аналогов.

2. Разработан новый метод функциональной чувствительности тромбоцитов. Чувствительность тромбоцитов к действию АДФ (ЕС50) и максимальная нормированная скорость агрегации (Umax) количественно характеризуют функциональную агрегационную активность данных форменных элементов крови. В норме для тромбоцитов человека, кролика и крысы величина ЕС50 находится в диапазоне 110-1 бОнМ.

3. Концентрационная последовательность действия АДФ на пуриновые Р2-рецепторы тромбоцитов располагаются в следующем порядке: ЕС5о~20нМ(Р2Х1) < EC5O~90hM(P2Y1) < EC50~120hM(P2Y12), Физиологическое значение выявленной последовательности состоит в необходимости контролирования каскадного механизма пусковых реакций. Показано, что активированные тромбоциты при отсутствии дополнительного стимула переходят в рефрактерное состояние с пониженной агрегационной чувствительностью тромбоцитов к АДФ, скорость развития этой реакции зависит от степени активированости клеток.

4. Вещества, повышающие уровень цАМФ ингибируют активацию тромбоцитов по конкурентному механизму: аденозин (Ki~400HM), форсколин (Ki~90hM), но-шпа (Ki~20mkM), дибутирил-цАМФ (Кр-85мк). Сходным конкурентным типом модулируют активацию и агрегацию тромбоцитов под действием АДФ селективные а2- и р2-адреномиметшси. Катехоламины не конкурентно усиливают активацию тромбоцитов крысы под действием АДФ, что обусловлено наличием двух типов адренорецепторов.

5. Представлена тромбоцитарная модель скрининга новых лекарственных препаратов, позволяющая выявлять клеточный механизм их действия. Модель позволяет проводить исследования воздействия препаратов на уровне рецепторного аппарата, на уровне кальциевой сигнальной системы (в частности в условиях обращенного натрий-кальциевого обмена) и на уровне сигнальных систем циклических нуклеотидов. Возможности модели продемонстрированы при исследовании действия кальциевых блокаторов: нифедипина и дилтиазема; агониста к-опиатных рецепторов Ш0488; утеротонических средств: окситоцина и энзапроста (ПГ Бг«).

6. Снижение чувствительности тромбоцитов (высокие значения ЕС50) наблюдаются, как в условиях острых патологических состояниях (экспериментальная модель ишемии мозга и последующей реперфузии у крыс), так и в условиях хронической патологии (у больных ишемической болезнью сердца сопровождающейся гиперхолестеринемией). Общей причиной является предшествующее активированное состояние тромбоцитов.

7. У пациентов с искусственными клапанами сердца и у беременных женщин с гестозом, тромбоциты гиперчувствительны к АДФ. Именно эти патологии, с повышенным риском возникновения тромбозов, характеризуются быстрым обновлением пула тромбоцитов. Сходный статус клеток наблюдается через полгода после гамма-облучения крыс.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ: На фоне умеренного к пролонгированию конечного этапа свертывания на уровне реакции отщепления фибринопептидов А в реакции генерации фибрина, разнонаправленность агрегационного потенциала тромбоцитов — увеличение мембранной акпшашш субпороговые дозы АДФ, гипоагрегация на адреналин может косвенно указывать на возможный системный дисбаланс эндогенных катсходаминс®, депрессия фибриноген ■ агрегации н умеренный дефицит фактора Виллсбранда, связано с первичной парциальной тромбоцитарной дисфункцией на индукторы поверхностного контакта. Необходимо исключение синдрома гемагомезенхимальной днеплазшг, рекомендуется гемостазиологических контроль в динамике.

Дата «09» октября 2003 г. Врач-гсмостазиолог: к.м.н. Счуров В.Г

Рис.3.22. протокол исследования функционального активности тромбоцитов

Глава 4. ФИЗИОЛОГИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ

4.1. Оценка влияния пуриновых нуклеотндов на кинетические параметры активации и агрегации тромбоцитов.

Внесение АДФ в кювету, содержащую суспензию тромбоцитов, сопровождается очень быстрым повышением интенсивности светорассеяния а1(12) (рис.3.17). Этот скачок происходит в результате повышения уровня внутриклеточного кальция. Известно, что связывание АДФ с Р2Х1-рецепторами вызывает открытие кальциевых каналов на поверхности тромбоцитов, а взаимодействие с Р2У1-рецепторами сопровождается стимуляцией фосфоинозитидного обмена и высвобождением Са из внутриклеточных депо. В итоге, это приводит к увеличению концентрации [Са24], и сферизации тромбоцитов.

Для того чтобы оценить действие пуриновых нуклеотидов на каждый тип Р2-рецепторов и выяснить вклад этих участков связывания в развитие активации клеток, эксперименты проводили в среде с 1мМ СаС12 и в безкальциевой среде.

На рис.4.1а приведена запись эксперимента, в котором активацию тромбоцитов крысы индуцировали последовательным добавлением (титрованием) АДФ. В присутствии кальция, сферизация наблюдается при внесении 5 нМ АДФ. С дальнейшим увеличением концентрации АДФ интенсивность светорассеяния - д1(12) вначале нарастает (при этом отмечается уменьшение амплитуды шума), достигает максимума, а затем инвертируется. Прирост амплитуды сигнала составил 55,8 ± 4,7 %. Обращение сигнала в угле 12 градусов совпадает с нарастанием интенсивности светорассеяния в угле 2 градуса, что свидетельствует о развитии агрегации. На рис.4 Л б приведен график зависимости интенсивности светорассеяния тромбоцитов от полумаксимальной эффективной концентрации АДФ в обратных координатах.

1(12) (%) ю 20 20 адф

170 т 10

160 | 5 150 -140 -- * J»1

130 120 110 100 90 I | w т г И J I

АГ(12)

Ч-1-1-Ь а) о 2 4 6 8 10 t (мин)

1/1(12)

0,07 -•

0,05 -

0,03 -■

-1/ЕС

50

-"•ЧсЛ

ЕС «, =20 нМ

I ' ■ 1 '■ I

I 1,1 I б)

О 0,1 0,2 0,3

1/АДФ (1/нМ)

Рис.4.1 а) Активация тромбоцитов крысы под действием АДФ в среде 140 мМ NaCl, 10 мМ Трис-HCl буфера, 1 мМ СаСЬ, рН 7,8. Над стрелками указаны значения вносимых концентраций АДФ (нМ); б) график зависимости прироста интенсивности светорассеяния от концентрации АДФ в обратных координатах.

Были проведены эксперименты, в которых активацию тромбоцитов регистрировали в ответ на однократное внесение агониста в возрастающих концентрациях. Значение ECs0, определенное в этих опытах, не существенно отличалось от значения ЕС50 АДФ, полученного при титровании.

Известно, что АТФ, связываясь с Р2Х1-рецепторами, вызывает поток кальция внутрь тромбоцитов. Действительно, внесение этого пуринового нуклеотида в возрастающих концентрациях в кальцийсодержащую среду с клетками также приводило к увеличению интенсивности светорассеяния. В отличие от АДФ, кинетика активации тромбоцитов под действием АТФ имела сигмоидальный характер (рис.4.2), более выраженный на тромбоцитах крысы. АТФ, в суммарной концентрации, не превышающей 150 нМ, вызывал незначительную активацию тромбоцитов - д1(12) увеличилась на 7,8 ± 2,4 %. Дальнейшее повышение концентрации агониста сопровождалось относительно быстрым ростом интенсивности светорассеяния. Максимальный прирост амплитуды сигнала составил 25,4 ± 4,3%. Кроме того, в противоположность АДФ, после достижения предельного значения д!(12) последующего обращения сигнала (агрегации) не наблюдалось. (мин)

Рис.4.2. Активация тромбоцитов крысы под действием АТФ в среде 140 мМ N801, 10 мМ Трис-НС1 буфера, 1 мМ СаСЬ, рН 7,8. Над стрелками указаны значения вносимых концентраций АТФ (нМ).

Наблюдаемое различие в кинетике активации тромбоцитов в ответ на внесение АДФ и АТФ может быть обусловлено особенностями лиганд-рецепторного взаимодействия.

Для выяснения данного вопроса, с помощью преобразования Скэтчарда, был проведен анализ параметров рецепторного связывания АДФ и АТФ. На рис.4.3 представлены экспериментальные данные, описывающие связывание этих веществ на поверхности тромбоцитов. Видно, что кривые связывания пуриновых нуклеотидов неодинаковы. Изотерма насыщения АДФ имеет линейный характер (рис.4.3а), а кривая связывания АТФ характеризуется изломом (рис.4.36) и представляет собой вогнутую параболу. Такой вид изотермы насыщения предполагает, что действие АТФ опосредуется высоко- и низкоаффинным участками связывания.

Д1(12}% а) Д1 (12)/[АОР], 1/пМ

Ы(12) ,%

Д1(12)/[АБР], 1/пМ

Рис.4.3. Определение равновесных параметров связывания АДФ (а) и АТФ (б).

Значения ЕС50 АДФ и АТФ, полученные в опытах на тромбоцитах крысы и кролика, представлены в табл. 4.1.

В условиях малоуглового светорассеяния также исследовано действие селективного агониста Р2Хгрецепторов Ь-Ду-метилАТФ на функциональную активность тромбоцитов крысы. Полученные данные свидетельствуют о том, что это соединение, также как и АТФ, способно активировать тромбоциты, не вызывая агрегации. Максимальный прирост интенсивности светорассеяния составил 10,2 ± 3,6 %. Значение ЕС ¡о приведено в табл.2.

Следует заметить, что активация тромбоцитов, развивающаяся в среде с 1 мМ СаСЬ, является результатом поступления Са2+ в цитоплазму не только снаружи, но и из внутриклеточного депо. Процесс сферизации, в данных условиях, обусловлен связыванием пуриновых нуклеотидов как с Р2Х! - , так и с Р2У1 - рецепторами. Непосредственно оценить действие пуринов на Р2У] -рецепторы и фосфоинозитидный обмен можно в условиях, исключающих наружный кальциевый ток. Поэтому эксперименты проводили в среде, содержащей 5 мМ ЭДТА. Сравнение полученных значений ЕС50 позволяет оценить вклад каждого типа рецепторов в развитие активации клеток.

Также как и в среде, содержащей 1 мМ СаСЬ, в безкальциевой среде внесение 5 нМ АДФ приводило к нарастанию интенсивности светорассеяния. Последующее ступенчатое повышение концентрации АДФ сопровождалось дальнейшим увеличением этого показателя. Однако кальциевый ответ тромбоцитов изменился — амплитуда прироста сигнала в угле 12 градусов уменьшилась, и ее максимальное значение составило 34,3 ±6,1 %. Величина ЕС50, полученная в этих условиях, представлено в табл.2.

Установлено, что дозозависимая сферизация клеток в среде с 5 мМ ЭДТА также развивается и в ответ на внесение АТФ. Пороговая концентрация этого пуринового нуклеотида в бескальциевой среде возросла и составила 50 нМ. Кинетика активации тромбоцитов под действием АТФ в среде с 5 мМ ЭДТА заметно отличалась от таковой, наблюдаемой в среде с 1 мМ СаС12. Повышение концентрации агониста сопровождалось плавным подъемом интенсивности светорассеяния, и максимальный прирост амплитуды сигнала Д1(12) составил 12.0 ±3,1 %. Полумаксимальные эффективные концентрации АТФ, полученные в данных условиях, существенно превышали аналогичные показатели, необходимые для сферизации тромбоцитов крысы и кролика в среде с 1 мМ СаС12 (табл.2).

При проведении экспериментов в среде, содержащей 5 мМ ЭДТА, нам не удалось зарегистрировать прирост интенсивности светорассеяния тромбоцитов д1(12) в ответ на последовательное повышение концентрации (вплоть до 20 мкМ) метилированного производного АТФ -Ь-Ду-метилАТФ (рис.4.4). Тем самым, мы подтвердили данные, свидетельствующие о неэффективности этого вещества в отношении Р2УГ рецепторов (К.а1еую V., Вигпэюск X 1998).

1(12) (относ, ед.) 1

400 А 350 -300 250 200 -| 150 100 50 0 4

0.00

2 V

4.00

Ь-Р,7-метилАТФ 5 10 (мкМ)

8.00

12.00 (мин)

Рнс.4.4. Оценка эффективности действия Ь-Д }'-метил АТФ на тромбоциты в присутствии 5 мМ ЭДТА.

Ещё одним методологическим подходом, позволяющим оценить влияние пуринов на фосфоинозитидный обмен, является блокада рецепторуправляемых кальциевых каналов.

ЛЦ12) ,% log (С)

Рис. 4.5. Зависимость прироста интенсивности светорассеяния от концентрации пуринов, полученная в опытах на тромбоцитах крысы: 1- АДФ в среде с 1 мМ СаСЬ, 2- АДФ в присутствии 5 мМ ЭДТА, 3 - АТФ в среде с 1 мМ СаСЬ, 4- АТФ в присутствии 5 мМ ЭДТА, 5 - L-Д у-метилАТФ в среде 1 мМ СаС12л I ^ ,

Как правило, для этого используют ионы Nr" или Cd . Блокирующий

Л I эффект ионов никеля проявляется независимо от того, находятся Са -каналы в закрытом или открытом (активированном) состоянии. В работе установлено, что полумаксимальное угнетение входа Са2+ происходит при концентрации этих ионов около 50 мкМ. Для того чтобы полностью заблокировать кальциевые каналы, и тем самым исключить ток кальция, мы проводили эксперименты в присутствии 500 мкМ Ni . В качестве агониста использовали АТФ. В данных условиях, также как и в среде с 5 мМ ЭДТА, пороговая концентрация пурина составила 50 нМ. Дальнейшее увеличение концентрации АТФ приводило к плавному повышению интенсивности светорассеяния. Кинетика активации тромбоцитов не отличалась от таковой в среде с 5 мМ ЭДТА. Максимальный прирост амплитуды сигнала составил 17,3 5,2 %. Значение ЕС50 АТФ, полученное в среде с 500 мкМ №2+, составило 1317,9 ± 82,1 нМ и не отличалось от полумаксимальной эффективной концентрации пурина в безкальциевой среде.

Необходимо отметить, что прирост амплитуды д1(12), отражающий степень активации тромбоцитов и развивающийся в ответ на действие пуринов, не одинаков. В среде, содержащей 1 мМ СаС12, максимальный прирост интенсивности светорассеяния тромбоцитов крысы и кролика наблюдался в ответ на внесение АДФ, минимальный - в ответ на внесение Ь-Ду-метилАТФ. На рис.4.5 представлены кривые "концентрация-эффект", полученные в опытах на тромбоцитах крысы. В присутствии 5 мМ ЭДТА относительный прирост интенсивности светорассеяния тромбоцитов, в ответ на возрастающие концентрации АДФ и АТФ, был значительно ниже этого показателя в среде, содержащей кальций.

ЛЦ12) , % 70 п 1

60 2

50

40

30

20

10 о

-9

-8

-7

-6

1оё(АДФ)

Рис. 4.6. Зависимость прироста интенсивности светорассеяния от концентрации АДФ, полученная в опытах на тромбоцитах крысы: 1 - рН 7,0; 2- рН 7,8.

Известно, что развитие некоторых патологических состояний (например, гипоксии) сопровождается изменением рН плазмы крови. Нами изучено влияние ионов водорода на АДФ-индуцируемую активацию тромбоцитов. С этой целью были проведены эксперименты в среде, содержащей физиологическую концентрацию Са2+, при разных значениях рН. На рис.4.6 представлены результаты опытов, полученные на тромбоцитах крысы. Изменение рН среды в диапазоне 7,0 - 7,8 отразилось на степени выраженности активации тромбоцитов. Установлено, что в среде с рН 7,0 прирост интенсивности светорассеяния д1(12) достоверно был выше аналогичного показателя в среде с рН 7,8. Различие в максимальной амплитуде сигнала составило 21,4 ± 2,3 % (п = 6). Вместе с этим, закисление среды не меняет значение ЕС50 агониста.

Библиография Диссертация по биологии, доктора биологических наук, Миндукшев, Игорь Викторович, Санкт-Петербург

1. Авдонин П.В. и др. Потенциирование активатором протеинкиназы С форболовым эфиром действия простагландина Е2 на тромбоциты человека / Авдонин ИВ.Бугрий Е.М., Ткачук В.А., Мазаев A.B. // ДАН СССР. 1986. Т.286. С. 746-749.

2. Авдонин П.В., Ткачук В.А. Рецепторы и внутриклеточный кальций. // — М.: Наука, 1994.-С. 288.

3. Авцын А.П. Шахматов В.А. Ультраструктурные основы патологии клетки. // М. Медицина. - 1979. - С. 320.

4. Албертс Б., Брей Д., Льюис Дж., Рэфф М., Роберте К., Уотсон Дне. Молекулярная биология клетки. Том 2. // М. Мир. - 1994. - С. 540.

5. Алиев М. А., Лемешко В. А., Бекболотова А. К. Влияние транзиторной ишемии мозга на синтез простациклина при артериальной гипертонии у собак. // Бюлл. Эксп. Биол. Мед. 1983. №9. - С. 280 - 282.

6. Балуда В.П. , Балуда М.В. , Деянов И.И. , Теплушков И.К. Физиология системы гемостаза. // М. 1995. - С. 71 - 111.

7. Балуда В.П. Патогенез геморрагического синдрома лучевой болезни. // Радиация и гемостаз. / Под. Ред. В.П. Балуды — М.: Энергоатомиздат. -1986.-С. 142- 153.

8. Барабанова А. В., Баранов А. Е.,Гуськова А. К. и др. Острые эффекты облучения у человека. -М.: ЦДИИатоминформ, 1986. -С. 80.

9. Бочков В.Н., Сорокин Е.В., Вызова Е.В., Мазуров A.B., Бобик А., Ткачук

10. B.А. Учавствует ли гликопротеины Ilb/IIIa в активации тромбоцитов человека посредством липопротеидов низкой плотности? Биохимия. 1995; 60(8):1187-94.

11. Веренинов A.A., Марахова И.И. Транспорт ионов у клеток в культуре. Л.: Наука, 1986. -С. 292.

12. Вестрайт М., Вермилен Дж. Тромбозы. // Пер. с франц. М., Медицина, 1986.

13. Габриэлян Э. С., Туняк Ю. С., Акопов С. Э., Балаян Б. Г., Бакунц Г. О. О роли поражений магистральных артерий головы в нарушениях гемостаза и реологических свойств крови // Журнал Невропатологии и психиатрии им.

14. C. С. Корсакова. 1993. - №7. - С. 1010 - 1014.

15. Гаврилов O.K., Козинец Т.Н., Черняк Н.Б. Клетки костного мозга и периферической крови. — М.: Медицина. 1985. - С. 288.

16. Гавриш A.C., Сергиенко О.В., Иващенко Т.Н., Порадун E.H. Структурно-фуекциональное состояние тромбоцитов при хронической ишемической болезни сердца. Клин.Мед. - 1993, 71 (5), С. 38-41.

17. Теннис Р. Биомембраны: Молекулярная структура и функции. М.: Мир, 1997.-С. 624.

18. Деркачев Э.Ф., Миндукшев И.В., Кривченко А.И., Крашенинников A.A. "Способ исследования активации и агрегации тромбоцитов" Патент RU 2108579 С1 6 G01N 33/49. 1998. Б.И. № 10 (П). С. 298.

19. Духанин A.C., Губаева Ф.Р. Фармакологическая регуляция активности тромбоцитов // Экспер. и клин, фармакол. 1998. № 4. - С. 66 —71.

20. Жербин Е.А., Чухловин А.Б. Радиационная гематология. // М. «Медицина» 1989.

21. Захаров В.Н., Караулов A.B., Соколов В.В., Фраш В.Н. Изменения системы крови при воздействии радиации и бензола. // Новосибирск., «Наука» 1990.

22. Иванов Е. П. Руководство по гемостазиологии. // Минск, 1991.

23. Игнатов Ю.Д., Петрищев H.H., Митрейкин В.Ф. Влияние морфина и пентазоцина на функциональную активность тромбоцитов // Экспер. и клин, фармакол. 1997. № 4. С. 42 45.

24. Киношенко Е. И. Тромбоцитарный гемостаз при инфаркте миокарда // Клиническая медицина. 1997. - Т.75. - №10. - С. 21-27.

25. Киношенко Е. И., Шустваль Н. Ф. Биосинтез МДА: диагностические и терапевтические аспекты. Роль эйкозаноидов в патогенезе и терапии сердечно-сосудистых заболеваний. // Харьков. 1991. - С. 46-47.

26. Климов А. Н., Никульчева И. Г. Обмен липидов и липопротеидов и его нарушения. Руководство для врачей. // СПб.: Питер. — 1999.

27. Костюк П.Г. Кальций и клеточная возбудимость. М.: Наука. - 1986. -С. 255.

28. Крутецкая З.И. Лебедев O.E. Структурно-функциональная организация G-белков и связанных с ними рецепторов. //Цитология. 1992. - Т.34 №11/12.-С. 24-45.

29. Крутецкая З.И., Лебедев О.И. Метаболизм фосфоинозитидов и формирование кальциевого сигнала в клетках // Цитология. 1992. Т. 34. № 10. С. 26-44.

30. Кулаков В.И., Серов В.М., Абубакирова А.Н., Баранов И.И. Акушерские кровотечения. // М.: Триада-Х. 1998. - С. 96.

31. Левицкий Д.О. Кальций и биологические мембраны. М.: Высш. Шк, 1990.-С. 124.

32. Мазур Э. М. Патофизиология крови. Пер. с англ. // М. СПб.: БИНОМ -Невский Диалект. - 2000. - С. 154 - 156.

33. Марков X. М. Простагландины и сердце // Пат. Физиология и Эксперим. Терапия. 1987. - №7. - С. 6 - 13.

34. Марков X. М. Простаноиды в физиологии и патологии сердечнососудистой системы // Кардиология. -1982. №3. - С. 13 - 24.

35. Миндукшев И.В. Исследование кинетики активации и агрегации тромбоцитов методом малоуглового светорассеяния. Специальность 03.00.02 биофизика. Дис. на соиск. учен. степ. канд. биол. наук. // СПб.: СпбГУ. - 1996. — С. 103.

36. Михайлова И.А., Липовецкий Б.М., Константинов В.О., Васильева Л.Е., Гуревич B.C. Функциональная активность тромбоцитов у лиц с атерогенными гиперлипидемиями в процессе лечения ловастатином. // Кардиология 1993, 33 (10), С. 60-63.

37. Пермяков Е.А. Кальций-связывающие белки. // М.: Наука. 1993. — С. 192.

38. Петрищев Н. Н. Роль эндотелия в тромбогенности и тромборезистентности сосудов // Ученые записки СПбГМУ им. акад. И. П. Павлова. 1999. - Т. 6. - №1. - С. 66-71.

39. Петрищев Н. Н. Тромборезистентность сосудов. // АНТ-М. 1994- С. 130.

40. Петрович Ю. А., Гуткии Д. В. Свободнорадикальиое окисление и его роль в патогенезе воспаления, ишемии, стресса. // Патол. Физиология и Эксперим. Терапия. -1986. №5. - С. 85-92.

41. Позднякова Т.М., Белицер Н.В. Взаимодействие фибриногена с тромбоцитами. // Успехи современной биологии. 1990. - Т. 110(2). — С. 267-283.

42. Самаль А.Б., Черенкевич С.Н., Хмара Н.Ф. Агрегация тромбоцитов: методы изучения и механизмы. // Мн.: Университетское из-во. 1990. — С. 104.

43. Северин Е.С. Избирательная регуляция клеточного метаболизма. — М.: Наука, 1991.-С. 63.

44. Северина И.С. Растворимые формы гуанилатциклаз. Механизмы активации оксидом азота, роль в агрегации тромбоцитов // Вести. Акад. Мед. Наук. 1995. - №2. - С. 41-46.

45. Северина И.С. Растворимая форма гуанилатциклазы в молекулярном механизме физиологических эффектов окиси азота и в регуляции процесса агрегации тромбоцитов // Бюл. экспер. биол. 1995. №3. С.230 235.

46. Следзевская И. К., Вятченко Е. В., Бабов К. Д., Сергиенко О. В., Савицкий Ю. В. Тромбоцитарное звено гемостаза у больных перенесших инфаркт миокарда//Кардиология. 1993. -.№3. — С. 25-27.

47. Соколов Е. И. Синдром диссеминированной внутрисосудистой коагуляции иу больных ишемической болезнью сердца // Кардиология. — 2000. №6. — С. 9-13.

48. Суворова Л. А., Вялова Н. А., Барабанова А. В., Груздев Г. П. Пострадиационное восстановление костного мозга человека и морфодинамика пула недифференцированных клеток // Тер. арх. -1981-№9.-С. 127-131.

49. Ткачук В. А., Авдонин П. В., Свитина-Улитина И. В., Чеглаков И. Б., Меньшиков М. Ю., Бугрий Е. М. Механизмы рецепторзависимойрегуляции кальция в цитоплазме тромбоцитов // Внутриклеточная сигнализация. Сборник научных трудов. М.: Наука, 1988 - С181-188.

50. Ткачук В.А. Гормональная регуляция транспорта Са2+ в клетках крови и сосудов //Росс, физиол. журн. 1998. Т. 84. № 10. С.1006 -1018.

51. Ткачук В.А. Мембранные рецепторы и внутриклеточный кальций // Биол. мембраны. 1999. Т. 16. № 2. С. 212 229.

52. Фултон А. Цитоскелет. Архитектура и хореография клетки. М.: Мир, 1987.-С. 120.

53. ХухоФ. Нейрохимия: Основы и принципы. — М.: Мир, 1990. -С. 384.

54. Чирков Ю. Ю., Белушкина Н. Н., Тыщук И. А. и др. Роль гуанилатциклазы в регуляции агрегации тромбоцитов человека. // Вестн. АМН СССР. 1991. №10. С. 51 54.

55. Шишкова A.C. Тромбоцитарный гемостаз. // СПб. Издательство СПбГМУ, 2000.

56. Шифрин К.С. Излучение свойств вещества по однократному рассеянию // Теоретические и прикладные проблемы рассеяния света. Минск, 1971.

57. Шифрин К.С., Пунина В.А. Об индикатрисе рассеяния света в области малых углов //Из. АН СССР., 1968. Т.4, №7.

58. Шифрин К.С., Чаянова Э.А. Определение спектра частиц по индикатрисе рассеяния // Из. АН СССР., 1966. Т.2, №2.

59. Шиффман Ф.Д. Патофизиология крови. // М.-Спб.: «Издательство БИНОМ» «Невский Диалект». 2000. С. 149-283.

60. Шутов A.A., Чудинов A.A., Каракулова Ю.В. Состояние гемостаза у больных ишемическим инсультом. Журнал невропатологии и психиатрии имени С.С.Корсакова, 1991, Т.91, № 7, стр.57-60.

61. Armstrong R. A. Platelet prostanoid receptors. // Pharmacol. Ther. 1996. — V. 72(3).-P. 171-91.

62. Authi K.S. Ca2+ homeostasis and intracellular pools in human platelets // Adv. Exp. Med. Biol. 1993. V. 344. P. 83 104.

63. Authi K.S. Ca2+ homeostasis and intracellular pools in human platelets I I Adv. Exp. Med. Biol. -1993.- V. 344. -P. 83 104.

64. Ballem P. J., Belzberg A., Devine D. V. et al. Kinetic studies of the mechanizm of trombocytopenia in patients with human iMMunodeficiency virus infection. // New Engl. J. Med., -1992. -V. 327. P. 1779-1784.

65. Beavo J.A. Multiple isoensimes of cyclic nucleotide phosphodiesterase, // Adv. Second Messenger Phosphoprotein Res. 1988. V.22. P. 1-38

66. Beavo J.A., Reifsnyder D.H. Prymary sequence of cyclic nucleotide phosphodiesterase isoensimes and the design of selective ingibitors // Trends Pharmacol. Sci. 1990. V.ll. N 4. P. 150-155.

67. Ben-Ari Z, Panagou M, Patch D, Bates S, Osman E, Pasi J, Burroughs A: Hypercoagulability in-patients with primary biliary cirrhosis and primary sclerosing cholangitis evaluated by thromboelastography. // J. Hepatol. -1997. -V.26.- P.554—559.

68. Bentley J.K., Beavo J.A. Regulation and Function of cyclic nucleotides // Curr. Opin. Cell. Biol. 1992. V. 4. №2. P. 233-240.

69. Berkels R., Bertsch A., Zuther T., Dhein. S., Stockklauser K., Rosen P., Rosen R. Evidence for a NO synthase in porcine platelets which is stimulated during activation / aggregation // Eur. J. Haematol. -1997. Vol. 58. - P. 265-271.

70. Berridge M.J., Irvine R.F. Inositol phosphates and cell signalling // Nature. 1989. V.341. P.197-205.

71. Beukers M.W., Pirovano I.M., van Weert A., Kerkhof C J. Characterization of ecto-ATPase on human blood cells. A physiological role in platelet aggregation? //Biochem. Pharmacol. 1993. V. 46. №11. p. 1959- 1966.

72. Bian J.S., Wang H.X., Zhang W.M. Effects of kappa-opioid receptor stimulation in the heart and the involvement of protein kinase C // Br. J. Pharmacol. 1998. V. 124. №3. P. 600-606.

73. Bishop W.R., Bell R.M. Attenuation of 8sn-l,2-diacylglycerol second messengers by diacylglycerol kinase. Inhibition by diacylglycerol analogs in vitro and in human platelets // J. Biol. Chem. 1986. V. 261. P. 6993-7000.

74. Born G.V.R. Observations on the change in shape of blood platelets brought about by adenosine diphosphate // J. Physiol. (London). 1970. V.209. P. 487-511.

75. Born G.V.R., Cross M.J. The aggregation of blood platelets// J.Physiol. (London). 1963. V.168.P.178-195.

76. Born G.V.R: Qualitative investigations into the aggregation of blood platelets. // J. Physiol. (Lond)- 1962. V. 67. - P. 162.

77. Boyer J.L., Graber S.G., Waldo G.L., Harden T.K., Garrison J.C. Selective activation of phospholipase C by recombinant G-protein alpha- and beta gaMMa-subunits // J. Biol. Chem. 1994. V. 269. №4. P. 2814-2189.

78. Brass L.F., Hoxie J.A., Kiber-EMMons T., Manning D.R. Agonist receptors and G protein as modulators of platelet activation // Mechanisms of platelet activation and control. New York: Plenum Press, 1993. - P. 17 - 36.

79. Bylund D.B. Subtypes of ar and cc2-adrenergic receptors // FASEB J. 1992. V. 6. P. 832-839.

80. Bylund D.B., Eikenberg D.C., Hieble J.P., Langer S.Z., Lefkowitz R.J. IV. International union of pharmacology nomenclature of adrenoceptors // Pharmacol. Rev. 1994. V. 46. №2. P. 121 136.

81. Camps M., Hou C., Sidiropoulos D., Stock J.B., Jakobs K.H. Stimulation of phospholipase C by guanine-nucleotide-binding protein beta gaMMa subunits // Eur. J. Biochem. 1992. V. 206. №3. P. 821-831.

82. Carlson K.E., Brass L.F., Manning D.R. Thrombin and phorbol esters cause the selective phosphorylation of a G-protein other than G; in human platelets. //J. Biol. Chem.- 1989.- V.264.-P. 13289-13305.

83. Carpenter E., Gent J.P., Peers C. Opioid receptor independent inhibition of Ca2+ and K+ currents in NG108-15 cells by the kappa opioid receptor agonist U50488H // Neuroreport. 1996. V. 7. №11. P. 1809-1812.

84. Carr M.E. Measurement of platelet force: The Hemodyne hemostasis analyzer. // Clin. Lab. Manage Rev.- 1995. V.9. - P. 312-314,316-318, 320.

85. Carr M.E., Carr S.L., Hantgan R.R., Braaten J: Glycoprotein Ilb/IHa blockade inhibits platelet mediated force development and reduces gel elastic modulus. // Thromb. Haemost. 1995. - V. 73. - P. 499-505.

86. Carr ME, Zekert SL: Force monitoring of clot retraction during DDAVP therapy for the qualitative platelet disorder of uraemia: Report of a case. // Blood Coagul. Fibrinolysis. -1991. V. 2. - P. 303-308.

87. Castagna M., Taka Y., Kaibuchi K., Sano K., Kikkawa U., Nishizuka Y. Direct activation of calcium-activated, phospholipid-dependent protein kinase by tumor-promoting phorbol esters // J. Biol. Chem.- 1982.- V. 257.- P. 7847 -7851.

88. Chandler W.L, Schmer G. Evaluation of a new dynamic viscometer for measuring the viscosity of whole blood and plasma. // Clin. Chem.- 1986. V. 32.-P. 505-507.

89. Clapham D.E., Neer E.G. G protein /fy subunits // Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol. 1997. V. 37. P. 167-203.

90. Clapham D.E., Neer E.J. New roles for G-protein beta gaMMa-dimers in transmembrane signalling // Nature. 1993. V. 365. №6445. P 403 406.

91. Coade S.B., Pearson J.D. Metabolism of adenine nucleotides in human blood // Circ. Res. 1989. V. 65. №3. P. 531-537.

92. Da Prada M., Cesura A.M., Launay J.M., Richards J.G. Platelets as a model for neurones? // Experientia. 1988. V. 44. № 2. P. 115- 126.

93. Daniel J.L., Adelstein R.S. Isolation and properties of platelet myosin light chain kinase. // Biochemistry. -1976. -V. 15. P. 2370-2377.

94. Daniel J.L., Dangelmaier C., Jin J., Ashby B. Molecular basis for ADP-induced platelet activation: I. Evidence for three distinct ADP receptors on human platelets. // J. Biol. Chem. 1998. - V. 273. - P. 2024 - 2029.

95. Dhawan B.N., Cesselin F., Raghubir R., Reisne T., Bradley P.B., Porthogese P.S. Imternational union of pharmacology. XII. Classification of opioid receptors // Pharmacol. Rev. 1996. V. 48. № 4. P. 567 592.

96. Doughert J. H., Levy D. E., Weksler B. B. Platelet actyvation in acute cerebral ischaemia. Serial measurements of platelet function in cerebrovascular disease // Lancet. 1977. - Vol. 16. - №1 (8016). -P. 821-824.

97. Doyle V.M., Ruegg U.T. Lack of evidence for voltage dependent calcium channels on platelets //Biochem. Biophys. Res. CoMMun. 1985. V. 127. №1. P. 161-167.

98. Dubyak G.R., el-Moatassim C. Signal transduction via P2-purinergic receptors for extracellular ATP and other nucleotides // Am. J. Physiol. 1993. V. 265. P. 577-606.

99. Eggerman T.L., Andersen N.H., Robertson R.P. Separate receptors for prostacyclin and prostaglandin E2 on human gel-filtered platelets. // J. Pharmacol. Exp. Ther. 1986; 236(3):568-73

100. Elwood P.C., Renaud S., Sharp D.S., Beswick A.D., O'Brien J.R., Yarnell J.W. Ischemic heart disease and platelet aggregation. The Caerphilly Collaborative Heart Disease Study. Circulation 1991; V.83(l) P.38-44.

101. Elwood PC, Beswick AD, Sharp DS, Yarnell JW, Rogers S, Renaud S: Whole blood impedance platelet aggregometry and ischemic heart disease. The Caerphilly Collaborative Heart Disease Study. // Arteriosclerosis. — 1990. — V. 10.-P. 1032-1036.

102. Enouf J., Bobe R., Lacabaratz-Porret C., Bredoux R. The platelet Ca2+ transport ATPase system//Platelets. 1997. V.8. P. 5 -13.

103. Fay S.P., Posner R.G., Swann W.N., Sklar L.A. Real-time analysis of the assembly of ligand, receptor, and G protein by quantitative fluorescence flow cytometry. // Biochemistry. 1991. - V. 30. - P. 5066-5075.

104. Feinstein D. I. Acguired disoders of hemostasis. In: Colman R. W., Hirsh J., Marder V. J., Salzman E. W. (eds)/ Hemostasis and Thrombosis: Basic Principles and Clinical Practice, 3rd ed. Philadelphia: J. B. Lippincott. 1994. -P. 881-905.

105. Ferris C.D., Huganir R.L., Supattapone S., Snyder S. Purifide inositol 1,4,5-trisphosphate receptor mediates calcium flux in reconstituted lipid vesicles // Nature. 1989. Y. 342. P. 87 89.

106. Fong H.K.W., Yoshimwoto K.K., Eversol-Cire P., Simon M.G. Identification of a GTP-binding protein subunit that lacks an apparent ADP ribosylation site for pertussis toxin //Proc. Nat. Acad. Sci. 1988. V. 85. P. 5580-5583.

107. Francis JL, Francis DA, Gunathilagan GJ: Assessment of hypercoagulability in patients with cancer using the Sonoclot analyzer and thromboelastography. // Tliromb. Res. -1994. V. 74. - P. 335-346.

108. Frassetto S.S., Dias R.D., Sarkis J.J. Characterization of an ATP diphosphohydrolase activity (APYRASE, EC 3.6.1.5) in rat blood platelets // Mol. CellBiochem. 1993. V. 129. №1. P. 47-55.

109. Fredholm B.B., Abbracchio M.P., Burnstock G., Daly J.W. VI. Nomenclature and classification of purinoceptors. //Pharm.Rev. 1994. V. 46. № 2. P. 143 -156.

110. Fressinaud E, Yeyradier A, Truchaud F, Martin I, Boyer-Neumann C, Trossaert M, Meyer D: Screening for von Willebrand disease with a new analyzer using high shear stress: A study of 60 cases. // Blood. 1998. - V. 91. - P. 13251331.

111. Frojmovic M.M., Milton J.G. Human platelet size, shape, and related functions in health and disease //Physiolog. Rev. 1982. V. 62. №1. P. 185 -261.

112. Funahara Y. Refractory state of the platelets to ADP: In vitro experiment using rabbit platelets. // Rinsho Byori. 1979;Suppl 40:155-60.

113. Gachet C., Cazenave J. P., Ohlmann P. ADP receptor-induced activation of guanine-nucleotide-binding proteins in human platelet membranes // Eur. J. Biochem. 1992. V. 207. №1. P. 259 63.

114. Geiger J., Nolte C., Butt E., Sage S.O. Role of cGMP and cGMP-dependent protein kinase in nitrovasodilator inhibition of agonist-evoked calcium elevation in human platelets // Proc. Natl. Acad. Sci. 1992. V. 89. № 3. P. 1031 -1035.

115. Geiger J., Nolte C., Walter U. Regulation of calcium mobilisation and calcium entry in human platelet by cyclic nucleotide-elevating and endotelium deriving factors. // Am. J. Physiol. 1994. - V. 267. - P. 236 - 244.

116. Geiger J., Walter U. Properties and regulation of human platelet cation channels // EXS. 1993. V. 66. P. 281- 288.

117. George J. N. et al. Idiopathhic thrombocytopenia purpura: a practice guideline developed by explicit methods for the American Society of Hematology. // Blood. 1990. -V. 75. - P. 1383-1395.

118. George J. N., Caen J. P., Nurden A. T. Glanzmann's trombasthenia: the spectrumof clinical disease. //Blood. 1990. -V. 75. - P. 1383 - 1395.

119. Gewirtz A. M., Hoffman R. Transitory hepomegakaryocytic trombocytopenia: aetiological association with ethanol abuse and implications regarding regulation of human megakaryocytopoiesis. // Br. J. Haematol. 1986. — V. 62. - P. 333 -334.

120. Greilich PE, Carr ME, Carr SL, Chang AS: Reductions in platelet force development by cardiopulmonary bypass are associated with hemorrhage. // Anesth. Analg. 1995. - V. 80. - P. 459-465.

121. Hallam T.J., Rink T.J. Responses to adenosine diphosphate in human platelets loaded with the fluorescent calcium indicator quin2 // J. Physiol. (Lond). 1985. V. 368, P. 131-146.

122. Hallbriigge M., Walter U. The regulation of platelet function by protein kinases // Protein kinases In Blood Cell Function. USA.: CRC Press, 1993. - P. 32 -45.

123. Harrison P, Robinson MS, Mackie IJ, Joseph J, McDonald SJ, Liesner R, Savidge GF, Pasi J, Machin SJ: Performance of the platelet function analyser

124. PFA-100 in testing abnormalities of primary haemostasis. // Blood Coagul. Fibrinolysis. 1999. - V. 10. - P. 25-31.

125. Haslam RJ., Rosson G.M. Aggregation of human blood platelets by vasopressin. //Am.J.Physiol. 1972. -V. 223(4). - P. 958 - 967.

126. Hawiger J. Adhesive interactions of platelets and their blocade. II Ann. NY Acad. Sci. 1991. -V. 614. - P. 270-278.

127. Herbert J.M., Augereau J.M., Gleye J., Maffrand J.M. Chelerythryne is a potent and specific inhibitor of protein kinase C // Biochem. Biophys. Res. ComMmi. 1990. V. 172. № 3. P. 993 999.

128. Hilgemann D. W., Matsuoka S., Nagel G.A. Collins A. Steady-state and dynamic properties of cardiac sodium-calcium exchange. Sodium-dependent inactivation //J. Gen. Physiol. 1992. V.100. № 6. P. 905-932.

129. Holme S., Holmsen H., Sixma J.J. Proceedings: ADP-induced refractory state of platelets in vitro. // Tliromb Diath Iiaemorrh. 1975.30;34(1):316.

130. Holmes M.B., Sobel B.E., Howard D.B., Schneider D.J. Differences between activation thresholds for platelet P-selectin glycoprotein llb-IHa expression and their clinical implications. // Thromb. Res. 1999. -V. 95. P. 75-82.

131. Honore' H., Martin C., Mironneau C., Mironneau J. An ATP-sensitive conductance in cultured smooth muscle cells from pregnant rat myometrium // Am. J. Physiol. 1989. V. 257. P. 294 305.

132. Horlocker TT, Schroeder DR: Effect of age, gender, and platelet count on Sonoclot coagulation analysis in-patients undergoing orthopedic operations. // Mayo. Clin. Proc. 1997. -V. 72. -P. 214-219.

133. Hossmann V., Hossmann K. A., Tacagi S. Effect of intravascular platelet aggregations on blood recirculation folloving prolonged ischemia of the cat brain // J. Neurol. 1980. - Vol.222. - №3. - P. 159-170.

134. Hourani S. M., Hall D. A. Receptors for ADP on human blood platelets // Trends Pharmacol. Sci. 1994. V.15. P. 103 108.

135. Hourani S.M.O., Hall D.A. P2T purinoceptors: ADP receptors on platelets I IP2 Purinoceptors: Localization, Function and Transduction Mechanisms. // Chichester: John Wiley & Sons. 1996. - P. 53 - 70.

136. Hoxie J. A. Hematologic manifestation of AIDS In: Hoffman R., Benz E. J., Shattil S. J., Furie В., Cohen H. J., Silberstein L. E., eds. Hematology: Basic Principles and Practice. // New York: Churchill Livingstone. 1995. - P. 21712200.

137. Hussain J.F., Mahaut-Smith M.P. Reversible and irreversible intracellular Ca spiking in single isolated human platelets // J. Physiol. (London). 1998. V. 514. P. 713-718.

138. ISO 13320-1:1999 Particle size analysis Laser diffraction methods - Part 1: General principles

139. ISO 9276-1:1998 Representation of results of particle size analysis — Part 1: Graphical representation

140. Jafar J.J., Menoni R., Feinberg H., LeBreton G., Crowell R. M. Selective platelet deposition durung focal cerebral ischemia in cats // Stroce. 1989. — Vol.20.-№5.-P. 664-667.

141. Jin J., Daniel J.L., Kunapuli S.P. Molecular basis for ADP-induced platelet activation: II. The P2Yrreceptor mediates ADP-induced intracellular calcium mobilization and shape change in platelets. // J. Biol. Chem. 1998. - V. 273.-P. 2030-2034.

142. Johansson J.S., Haynes D.H. Cyclic GMP increasas the rate of the calcium extrusion pump in intact human platelets but has no direct effect on the dense tubular calcium accumulation system. // Biochim. Byophis. Acta. 1992. - V. 1105.-P. 40-50.

143. Johansson J.S., Neid L.E., Haynes D.H. Cyclic AMP stimulates Ca2+-ATPase mediated Ca2+ extrusion from human platelets // Biochim. Byophis. Acta. 1992. V. 1105. P. 19-28.

144. Johnson G.J., Leis L.A., Francis G.S. Disparate effects of the calcium-channel blockers, nifedipine and verapamil, on alpha 2-adrenergic receptors andthromboxane A2-induced aggregation of human platelets // Circulation. 1986. V. 73. №4. P. 847-854.

145. Kaneko S, Nakamura S, Adachi K3 Akaike A, Satoh M Mobilization of intracellular Ca2+ and stimulation of cyclic AMP production by kappa opioid receptors expressed in Xenopus oocytes // Brain Res Mol Brain Res. 1994. V. 27. №2. P. 258-264.

146. Kaneko S., Fukuda K.3 Yada N., Akaike A. Ca2+ channel inhibition by kappa opioid receptors expressed in Xenopus oocytes //Neuroreport. 1994. V. 5. №18. P. 2506-2508.

147. Kanemasa T., Asacura K., Ninomiya M. kappa-opioid agonist U50488 inhibits P-type Ca2+ channels by two mechanisms // Brain Res. 1995. V. 702. №1-2. P. 207-212.

148. Katayama Y., Terashi A, Shimizu J, Suzuki S, Kashiwagi F, Kamiya T, Ashida S. Role of platelets as a factor aggravating cerebral ischemia. // Jpn. Cire. J. -1990. V. 54 (12). -P. 1511-1516.

149. Katz A., Wu D., Simon M.I. Subunits beta gawMa of heterotrimeric G protein activate beta 2 isoform of phospholipase C // Nature. 1992. V. 360. № 6405. P. 686-689.

150. Katz A.M. Cardiac ion channels // N. Engl. J. Med. 1993. V. 328. №17. P. 1244 -1251.

151. Kenakin T. The classification of seven transmembrane receptors in recombinant expression systems //Pharmacol. Rev. 1996. V. 48. № 3. P.413 -463.

152. Kereiakes D.J., Mueller M., Howard W., Lacock P., Anderson L.C., Broderick T,M., Roth E.M., Abbottsmith C.W. Efficacy of abciximab induced platelet blockade using a rapid point of care assay. // J. Thromb. Thrombolysis. — 1999. -V. 7.-P. 265-276.

153. Kerry R., Scrutton M.C. Platelet adrenoceptors // The platelets: physiology and pharmacology. New-York: Academic Press, 1985. - P. 113 - 156.

154. Kerry R., Scrutton M.C. Platelet ^-adrenoceptors // Br. J. Pharmacol. 1983. V. 79. P. 681-691.

155. Kerry R., Scrutton M.C., Wallis R.B. MaMMalian platelet adrenoceptors // Br. J. Pharmacol. 1984. V.81. P. 91 102.

156. Knapp RJ., Malatynska E., Collins N., Fang L. Molecular biology and pharmacology of cloned opioid receptors // FASEB J. 1995. V. 9. №7. P. 516 -525.

157. Koesling D., Bohme E., Schultz G. Guanylyl cyclases, a growing family of signal-transducing enzymes // FASEB J. 1991.V. 5 № 13. P. 2785 2791.

158. Kohmura C., Hayashi Y., Ikeda H. Detection of activated platelets by flow cytometry. // Rinsho. Byori. 1999. - V. 47. - P. 447-452.

159. Koshimizu T., Koshimizu M., Stojilkovic S.S. Contributions of the C-terminal domain to the control of P2X receptor desensitization. // J.Biol.Chem. -1999 -N.274(53).-P.37651-7.

160. Kottke-Marchant K., Powers J., Brooks L. Inhibition of platelet function with ReoPro (abciximab) detected by the platelet function analyzer (PFA-100) in patients undergoing coronary angioplasty (PTCA). // Blood. — 1997. V. 90. -P. 70.

161. Krupinsky J. The adenylyl cyclase family // Mol. Cell. Biochem. 1991. V. 104. P. 73-78.

162. Kunapuli S.P. Multiple P2 receptor subtypes on platelets: A new interpritation of their function // Trends Pharmacol. Sci. 1998. V.19. P. 391 394.

163. Kundu SK, Heilmann EJ, Sio R, Garcia C, Davidson RM, Ostgaard RA: Description of an in vitro platelet function analyzer — PFA-100. // Semin. Thromb. Hemost. 1995. -V. 21. -P. 106-112.

164. LapetinaE.G.The signal transduction induced by thrombin in human platelets // FEBS Lett. 1990. V.268. P400 404.

165. Lawrence D.M., Joseph D.B., Bidlack J.M. Kappa opioid receptors expressed on three related thymoma cell lines. Differences in receptor-effector coupling // Biochem. Pharmacol. 1995. V. 49. №1. P. 81 89.

166. Lenox R.H., Ellis J., van Rippen D., Ehrlich Y.H. Alpha2-adrenergic receptor-mediated regulation of adenylate cyclase in the intact human platelet. Evidence for a receptor reserve //Mol. Pharmacol. 1985. V. 27. P. 1 9.

167. Leon C., Hechler В., Vial C., Gachet C. The P2Y1 receptor is an ADP receptor antagonized by ATP and expressed in platelets and megakaryoblastic cells // FEBS Lett. 1997. V. 403. P. 26 30.

168. Li C., Peoples R.W., Weight F.F. Mg2+ inhibition of ATP-activated current in rat nodose ganglion neurons: Evidence that Mg2+ decreases the agonist affinity of the receptor //J. Neurophysiol. 1997. V. 77. P. 3391-3395.

169. Lincoln T.M., Cornwell T.L. Intracellular cyclic GMP receptor protein // FASEB J. 1993. V.7. P. 328 338.

170. Lisovskaya IL, Agranenko VA. ADP-induced refractoriness of platelets preserved in different temperature conditions. // Folia Haematol Int Mag Klin Morphol Blutforsch. 1985;112(5):769-76.

171. Littleton-Kearney M. Т., Hum P. D., Kichler T. S., Traystman R. J. Incomplete global cerebral ischemia alters platelet biology in neonatal and adult sheep // Am. J. Physiol. 1998. - Vol. 275. - № 6. ~Pt. 2. - P. 2191-2198.

172. Livne A., Grinstein S., Rothstein A. Characterization of Na/H exchange in platelet. // Thromb. Haemost. 1987. - V. 58. №4. - P. 971 - 977.

173. Livne A., Grinstein S., Rothstein A. Volume-regulating of human platelets //J. Cellular Physiol. 1987. V. 131. P. 354-363.

174. MacIntyre D.E., McNicol A., DrtiMMond A.H. Tumour-promoting phorbol esters inhibit agonist-induced phosphatidate formation and Ca influx in human platelets. // FEBS Lett. 1985. - V.180. - P. 160 - 164.

175. MacKenzie A.B., Mahaut-Smith M.P. Chloride channels in excised membrane patches from human platelets: effect of intracellular calcium // Biochim. Biophys. Acta. 1996. V. 1278. № 1. P. 131 136.

176. Mahaut-Smith M.P. Chloride channels in human platelets: evidence for activation by internal calcium // J. Membr. Biol. 1990. V. 118. P. 69 75.

177. Mahaut-Smith M.P., Sage S.O., Rink T.J. Rapid ADP-evoked currents in human platelets recorded with the nystatin permeabilized patch technique. // J. Biol. Chem. 1992. V. 267. - P. 3060 - 3065.

178. Mahaut-Smith M.P., Sage S.O., Rink T.J. Receptor-activated single channels in intact human platelets // J. Biol. Chem. 1990. V. 265. P. 10479 10483.

179. MaMMen EF, Alshameeri RS, Comp PC: Preliminary data from a field trial of the PFA-100 system. // Semin. Thromb. Hemost. 1995. -V.21. - P. 113-121.

180. MajviMen EF, Comp PC, Gosselin R, Greenberg C, Hoots WK, Kessler CM, Larkin EC, Liles D, Nugent DJ: PFA-100 system: A new method for assessment of platelet dysfunction. // Semin. Thromb. Hemost. 1998. - V.24. - P. 195202.

181. Marcus A. J., Safîer L.B. Tromboregulation: multicellular modulation of platelet reactivity in hemostasis and thrombosis // FASEB J. 1993. V. 7. P. 516 522.

182. Massberg S., M.Sauabier, P.Klatt, M.Bauer, A.Pfeifer, W.Siess, R.Fâssler, P.Ruth, F.Krombach, F.Hofmann. Increased adhesion and aggregation of platelets lacking cyclic guanosine 3\5X -monophosphate kinase I. J.Exp. Med. Volume 189. №8, 1999 1255-1263

183. Meade TW, Cooper JA, Miller GJ Platelet counts and aggregation measures in the incidence of ischaemic heart disease (1HD). // Thromb. Haemost. 1997. -V.78(2). - P. 926-929.

184. Mechrishi J.N., Mills I.H. Opiate receptors on lymphocytes and platelets in man // Clin. iMMunol. iMMunopathol. 1983. V. 27. №2. P. 240 249.

185. Meng F., Xie G-X. Thompson R.C., Mansonr A. Cloning and pharmacological characterization of a rat kappa opioid rcceptor // Proc. Natl. Acad. Sci. 1993. V. 90 №21. P. 9954-9958.

186. Miyashita T, Kuro M: Evaluation of platelet function by Sonoclot analysis compared with other hemostatic variables in cardiac surgery. // Anesth. Analg. — 1998.-V. 87.-P. 1228-1233.

187. Mody M, Lazarus AH, Semple JW, Freedman J: Preanalytical requirements for flow cytometric evaluation of platelet activation: Choice of anticoagulant. // Transfus. Med. 1999. -V. 9. -P. 147-154.

188. Moncada S., Palmer R.M.J., Higgs E.A. Nitric oxide: physiology, pathophysiology and pharmacology //Pharmacol. Rev. 1991. V. 43 №2. P. 109 114.

189. Mooren F.C. Kinne R.K.IT. Cellular calcium in health and disease // Biochem. Biophys. Acta. 1998. -V. 1406. -P. 127-151.

190. Motulsky HJ., Shattil S.J., Insel P. A. Characterization of a2-adrenergic receptors on human platelets using H.yohimbine // Biochem. Biophys. Res. 1980. V. 97. P. 1562-1570.

191. Nachmias V.T. Cytoskeleton of human platelets at rest and after spreading // J.Cell Biol. 1980. V. 86. P. 795 802.

192. Nahorski S.R., Bamette D.B., Cheung Y.-D. Alpha-adrenergic receptor effector coupling: affinity states or heterogenity of the alpha-2 adrenergic receptor? // Clin. Sei. 1985. V. 68. P. 39-42.

193. Newbolt A, Stoop R, Virginio C, Surprenant A, North RA, Buell G, Rassendren F. Membrane topology of an ATP-gated ion channel (P2X receptor) // J.Biol.Chem. -1998 -N.273(24). -P.15177-82.

194. Neubig R.R. Membrane organization in G-protein mechanisms // FASEB J. 1994. V. 8. №12. P. 939-946.

195. Neubig R.R., Gantzos R.D., Thomsen W.J. Mechanism of agonist and antagonist binding to alpha-2-adrenergic receptors: evidence for a precoupled receptor-guanine nucleotide protein complex // Biochemistry. 1988. V. 27. №7. P. 2374-2384.

196. Nicholson C.D., Challiss R.A., Shahid M. Differential modulation of tissue function and therapeutic potential of selective inhibitors of cyclic nucleotide phosphodiesterase isoenzymes // Trends Pharmacol. Sei. 199L V. 12. №1. P. 19 -27.

197. Nicke A, Baumert HG, Rettinger J, Eichele A, Lambrecht G, Mutschier E, Schmalzing G. P2X1 and P2X3 receptors form stable trimers: a novel structural motif of ligand-gated ion channels //EMBO J. -1998. -N.17(11). -P.3016-28.

198. Nicke A, Rettinger J, Schmalzing G. Monomeric and dimeric byproducts are the principal functional elements of higher order P2X1 concatamers. // Mol Pharmacol. -2003. -N.63(1). -P.243-52.

199. Park D J., Min H.K., Rhee S.G. Inhibition of CD3-linked phospholipase C by phorbol ester and by cAMP is associated with decreased phosphotyrosine and increased phosphoserine contents of PLC-gaiviMa 1 // J. Biol. Chem. 1992. V.267 №3. P. 1496 -1501.

200. Pedersen O.S., Reitchelt K.L. The effect of argfinine vasopressin, lysine vasopressin or oxytocin on ADP or arginine vasopressin-induced Ca2+ increase in human platelets. // Clin. Physiol. 1999. - V. 19(4). - P. 305 - 310.

201. Pivalizza EG, Abramson DC, Harvey A: Perioperative hypercoagulability in uremic patients: A viscoelastic study. // J. Clin. Anesth. 1997. - V. 9. - P. 442 -445.

202. Posner R.G., Fay S.P., Domalewski M.D., Sklar L.A. Continuous spectrofluorometric analysis of formyl peptide receptor ternary complex interactions //Mol. Pharmacol. 1994. V. 45. №1. P. 65-73.

203. Pratico D., Lawson J.A., FitzGerald G.A. Cyclooxygenase-dependent formation of the isoprostane, 8-epi prostaglandin F2 alpha. // J. Biol. Chem. 1995. - V. 270(17).-P. 9800-9808.

204. Pratico D., Reilly M., Lawson J., Delanty N., FitzGerald G.A. Formation of 8-iso-prostaglandin F2 alpha by human platelets. II Agents. Actions. Suppl. -1995.-V. 45.-P. 27-31.

205. Radomski M.W., Palmer R.M., Moncada S. Characterization of the 1-arginine nitric oxide pathway in human platelets // Br. J. Pharmacol. 1990. V.101. P. 325 -328.

206. Ralevic V., Burnstock J. Receptors for purines and pyrimidines // Pharmacol.Rev. 1998. V.50 № 3. P. 415 492.

207. Rand ML, Carcao MD, Blanchette VS: Use of the PFA-100 in the assessment of primary, platelet-related hemostasis in a pediatric setting. // Semin. Thromb. Hemost. 1998. - V. 24. - P. 523 - 529.

208. Reimers H.-J. Adenine nucleotide in blood platelets // The platelets: physiology and pharmacology. New-York: Academic Press, 1985. - P. 85 -112.

209. Rens-Domiano S., HaMM H. Structural and functional relationships of heterotrimeric G-protein // FASEB J. -1995. -V. 9. -P.1059 1066.

210. Rettinger J. and Schmalzing G. Activation and Desensitization of the Recombinant P2X1 Receptor at Nanomolar ATP Concentrations. // J. Gen. Physiol. -2003 V.5. -P.451-461.

211. Rettinger J. and Schmalzing G. Desensitization Masks Nanomolar Potency of ATP for the P2Xj Receptor // J. Biol. Chem. -2004. -Vol. 279 (8). -P. 64266433.

212. Rinder HM: Platelet function testing by flow cytometry. // Clin. Lab. Sci. — 1998.-V. 11.-P. 365-372.

213. Rink T.J., Smith S.W., Tsien R.Y. Cytoplasmic free Ca2+ in human platelets:1. Sjl

214. Ca thresholds and Ca-independent activation for shape change and secretion // FEBS Lett. 1982. V. 148. P. 21 26.

215. Ruggeri Z. M., Ware J. The structure and function of v Wf. // Thromb. Haemost. 1992. - V. 67.-P. 594.

216. Sage S.O. Calcium entry mechanisms in human platelets // Exp. Physiol. 1997. V. 82. P. 807-823.

217. Sage S.O., MacKenzie A.B., Jenner S., Mahaut-Smith M.P. Purinoceptor-evoked calcium signalling in human platelets // Prostaglandins Leukot. Essent. Fatty Acids. 1997. V. 57. № 4-5. P. 435 438.

218. Sage S.O., Sargeant P., Heemskerk J.W.M., Mahaut-Smith M.P. Calcium influx mechanisms and signal organization in liuman platelets. // Mechanisms of platelet activation and control. — New York: Plenum Press, 1993. P. 69 — 82.

219. Samra SK, Harrison RL, Bee DE, Valero V: A study of aspirin induced changes in bleeding time, platelet aggregation, and Sonoclot coagulation analysis in human. // Ann. Clin. Lab. Sci. 1991. - V. 21. -P. 315 -327.

220. Satoh K, Ozaki Y, Kume S: Detection of platelet aggregates using light scattering. //Rinsho. Byori. 1995. - V. 43. - P. 426 - 431.

221. Schmidt H.H., Lohmann S.M., Walter U. The nitric oxide and cGMP signal transduction system: regulation and mechanism of action // Biochim Biophys Acta. 1993. V. 1178. №2 P. 153-175.

222. Scott J. P., Montgomery R. R. Therapy of von Willebrand disease. // Semin. Thromb. Hemost. 1993. -V. 19. P. 37-47.

223. Scott NJ, Harris JR, Bolton AE. Effect of storage on platelet release and aggregation responses. // Vox Sang. 1983;45(5):359-66.

224. Scrutton M.C. The platelet as Ca2+-driven cell: Mechanisms which may modulate Ca2+-driven responses // Mechanisms of platelet activation and control. New York: Plenum Press, 1993. - P. 1 - 15.

225. Shattil S.J., Kashiwagi H., Pampori M. Integrin signalling: The platelet paradigm // Blood. 1998. V.91. P. 2645 2657.

226. Sheng J.Z., Wong N.S., Wang H.X., Wong T.M. Pertussis toxin, but not tyrosine kinase inhibitors, abolishes effects of U-50488H on Ca24.; in myocytes // Am. J. Physiol. 1997. V. 272. №2. P. 560-564.

227. Sheu S.S., Sharma V.K., Uglesity A. Na+-Ca2+ exchange contributes to increase of cytosolic Ca2+ concentration during depolarization in heart muscle // Am. J. Physiol. 1986. №4. P. 651 656.

228. Siess W. Molecular mechanisms of platelet activation. // Physiol. Rev. 1989. V.69. № 1. P. 58-178.

229. Siess W., Griindberg B., Luber K. Functional relationship between cyclic AMP-dependent protein phosphorylation and platelet inhibition // Mechanisms of platelet activation and control. — New York: Plenum Press, 1993. P. 229-235.

230. Siffert W., Akkerman J.W.N. Activation of sodium-proton exchange is a prerequisite for Ca2+ mobilisation in human platelets // Nature. 1987. V. 325. P. 456-458.

231. Siffert W., Akkerman J.W.N. Intracellular pH and cytoplasmatic free Ca2+ // Nature. 1987. V. 327. P. 376.

232. Siffert W., Akkerman J.W.N. Na+/H+-exchange as a modulator of platelet activation // Trends Pharmacol. Sci. 1988. V. 13. P. 148 -151.

233. Simon M.I., Strathmann M.P., Gautam N. Diversity of G proteins in signal transduction // Science. 1991. V. 252. P. 802 808.

234. Smart D., Lambert D.G. The stimulatory effects of opioids and their possible role in the development of tolerance // Trends in Pharmacol. Sci. 1996. V. 17. № 7. P. 264-269.

235. Smith JW, Steinhubl SR, Lincoff AM, Coleman JC, Lee TT, Hillman RS, Coller BS: Rapid platelet-function assay: An automated and quantitative cartridge-based method. // Circulation. 1999. - V. 99. - P. 620-625.

236. Takahasi I., Nakanishi S., Kobayashi E., Nakano H. Hypericin and pseudohypericin specially inhibit protein kinase C: possible relation to their antiretroviral activity // Biochem. Biophys. Res. ComMwi. 1990. V. 165. № 3. P. 1207-1212.

237. Tamaoki T.s Nimoto H., Takahashi N. Staurosporine, a potent inhibitor ofiphospholipid / Ca -dependent protein kinase // Biochem. Biophys. Res. CoMMun. 1986. V.135. P. 397-402.

238. Tang W.J., Gilman A.G. Adenylyl cyclases // Cell. 1992. V. 70. №6. P. 869 -872.

239. Tao J., Johansson J.S., Haynes D.H. Stimulation of dense tubular Ca2-f uptake in human platelets by cAMP.// Biochim. Biophys. Acta. 1992. V.1105. №1. P. 29 -39.

240. Taylor C.W., Broad L.M. Pharmacological analysis of intracellular Ca2+ signalling: problems and pitfalls // Trends Pharmacol. Sci. 1998. V.19. P.

241. Taylor S.J., Che H.Z., Ree S.G. Activation of the beta isozyme of phospholipase C by alpha subunits of the Gq class of G proteins // Nature. 1991. V.350.P.516-518.

242. Torres G.E., Egan T.M., Voigt M.M. Identification of a domain involved in ATP-gated ionotropic receptor subunit assembly // J.Biol.Chem. -1999. -N.6; 274(32). -P.22359-65.

243. Tremblay J., Gerzer R., Hamet P. Cyclic GMP in cell function // Adv. Second Messenger Phosphoprotein Res. 1988. V. 22. P. 319 -383.

244. Valant P.A., Adjei P.N., Haynes D.H. Rapid Ca2+ extrusion via the Na+/Ca2+ exchange of the human platelet// J. Membr. Biol. 1992. V. 130. №1. P. 63 82.

245. Valant P.A., Haynes D.H. The Ca2+-extruding ATPase of the human platelet creates and responds to cytoplasmic pH changes, consistent with a 2Ca2+/nH+" exchange mechanism // J. Membr. Biol. 1993. V. 136. № 2. P. 215 230.

246. Ventura C., Spurgeon H., Lakata E.G., Guarneieri C. Kappa and delta opioid receptor stimulation affects cardiac myocyte function and Ca2+ release from an intracellular pool in myocytes and neurons. // Circ. Res. 1992. V. 70. № 1. P. 66-81.

247. Von Voigtlahder P.F., Lahti R.A., Ludens J.H. U50,488H, a selective and structurally novel non-mu (kappa) opioid agonist // J. Pharmacol. Exp. Ther. 1988. V. 245. P. 13-16.

248. Wang J.S., Lin C.C., Chen J.K., Wong M.K. Role of chronic exercise in decreasing oxidized LDL-potentiated platelet activation by enhancing platelet-derived no release and bioactivity in rats. // Life Sci. 2000 V.66(20) P. 1937-48.

249. Wang L, Ostberg O, Wihlborg AK, Brogren H, Jem S, Erlinge D. Quantification of ADP and ATP receptor expression in human platelets // J. Thromb. Haemost. -2003. -V.l(2). -P.330-336

250. Wang L., Gintzler A.R. Bimodal opioid regulation of cyclic AMP formation: implication for positive and negative coupling of opiate receptors to adenylyl cyclase//J. Neurochem. 1994. V. 63. P. 1726- 1730.

251. Ware J. A., Johnson P.C., Smith TvL, Salzman E.W. Inhibition of human platelet aggregation and cytoplasmic calcium response by calcium antagonists: studies with aequorin and quin2 // Circ. Res. V. 59. № 1. P. 39 42.

252. Wenker O, Wojciechowski Z, Sheinbaum R, Zisman E: Thromboelastography. II Internet J. Anesthesiol. 1997. - V. 1(3).

253. Williams A.G., Ponez M., Manning D.R. Guanine nucleotide binding proteins in platelets and HEL cells // Circulation. 1988. V.78 №2. P. 516- 521.

254. Woulfe D., Yang J., Brass L. ADP and platelets: the end of the beginning. // J Clin Invest. 2001 V. 107(12) P. 1503-1505.

255. Yamahishi J., Takai Y., Kaibushi K., Sano K. Synergistic function of phorbol ester and calcium in serotonin release from human platelets // Biochem. Biophys. Res. CoMMun. 1983. V. 112. P. 778 786.

256. Yu X.C., Li H.Y., Wang H.X., Wong T.M. U50,488H inhibits effects of norepinephrine in rat cardiomyocytes-cross-talk between kappa-opioid and beta-adrenergic receptors // J. Mol. Cell. Cardiol. 1998. V. 30. №2. P. 405 -413.

257. Zeller JA} Tschoepe D, Kessler C: Circulating platelets show increased activation in-patients with acute cerebral ischemia. // Thromb. Haemost. — 1999. -V. 81.-P. 373-377.

258. Zhang W.M., Wang H.X. Suppresion of cAMP by phosphoinositol/Ca2+ pathway in the cardiac kappa opioid receptor // Am. J. Physiol 1998. V. 274. № l.P. 82-87.