Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Оценка показателей гемостаза у потомков, рожденных от самок крыс в норме и в экспериментальных моделях

ВАК РФ 03.03.01, Физиология

Автореферат диссертации по теме "Оценка показателей гемостаза у потомков, рожденных от самок крыс в норме и в экспериментальных моделях"

На правах рукописи

Шаталова Галина Юрьевна

ОЦЕНКА ПОКАЗАТЕЛЕЙ ГЕМОСТАЗА У ПОТОМКОВ, РОЖДЕННЫХ ОТ САМОК КРЫС В НОРМЕ И В ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫХ МОДЕЛЯХ

03.03.01 - физиология

005007437

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

12 янв гт

Саратов - 2012

005007437

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Ставропольский государственный университет» Министерства образования и науки России.

Научный руководитель:

доктор медицинских наук, профессор Бондарь Татьяна Петровна.

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор Понукалина Елена Вячеславовна; доктор биологических наук, профессор Сердюков Василий Гаврилович.

Ведущая организация: Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Ставропольская государственная медицинская академия» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации.

Защита состоится « » 2012 г. в часов на заседании

диссертационного совета Д 208.094.03 при ГБОУ ВПО «Саратовский ГМУ им. В.И. Разумовского» Минздравсоцразвития России по адресу: 410012, г. Саратов, ул. Большая Казачья, 112.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГБОУ ВПО «Саратовский ГМУ им. В.И. Разумовского» Минздравсоцразвития России.

Автореферат разослан 2011г.

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор медицинских наук, профессор

Кодочигова А.И

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

В настоящее время принято считать, что беременность с первых дней сопровождается комплексом динамических системных адаптационных реакций, направленных на поддержание гомеостаза и обеспечение нормального развития плода. От состояния материнского организма зависит структурно-функциональная организация всей системы мать-плацента-плод. При этом роды и ранний постнатальный период жизни представляют собой уникальное сочетание экстремальных воздействий, требующее непрерывной смены механизмов на функциональном, гормональном и биохимическом уровнях (Сидельникова В.М., Шмаков Р.Г., 2004; Протопопова Н.В., 2005). Динамические изменения в системе гемостаза, отражая характер процессов адаптации, должны создать условия для нормального функционирования фето-плацентарного комплекса и остановки кровотечения из сосудов плацентарной площадки после отделения последа и не должны выходить за границы, опасные развитием тромбозов или кровотечений (Мацакария А.Д., Бицадзе В.О., 2003).

Многочисленными исследованиями установлено, что беременность всегда протекает с явлениями гиперкоагуляции, а в Ш триместре она становится необходимым атрибутом долговременной адаптации системы гемостаза. При этом особая роль принадлежит тромбоцитам, в которых содержатся тромбопластические и антигепариновые факторы, фибриназа, фибринолитические агенты, сократительные белки, необходимые для распластывания, адгезии, агрегации и реакции высвобождения тромбоцитов (Аляутдинова О.С., 1999).

Нарушения в системе гемостаза во время беременности и родов изменяют гемодинамические реакции как матери, так и плода. При этом значительно увеличивается риск антенатальной гибели плода; по данным В.М. Синельниковой и П.А. Кирющенко (2004), показатель перинатальной смертности детей, рожденных от матерей с тромбогеморрагическими осложнениями беременности и родов, повышается в 15 раз, а доля тромбофилии в структуре причин синдрома потери плода составляет от 40 до 70% (Мацакария А.Д., 2003).

Проведенный анализ данных научной литературы показывает, что несмотря на то что тромбогеморрагические расстройства остаются частыми осложнениями беременности, родов, тяжелых форм неонатальной патологии и непосредственной причиной смерти новорожденных в этот период, однозначной интерпретации данных о влиянии состояния тромбоцитарного звена гемостаза матери на морфофункциональные характеристики тромбоцитов их детей практически нет. Вероятно, определенные трудности состоят в том, что многократное лабораторное обследование беременных

женщин и новорожденных детей, связанное с моделированием патологических процессов и неоднократным взятием крови, некорректно, а обследование плода - невозможно. В связи с вышеуказанным создание экспериментальной модели гипо- и гиперкоагуляции у беременных самок крыс с последующим исследованием показателей тромбоцитарного звена гемостаза в системе мать-плод и у новорожденных в различные сроки, делает настоящее исследование актуальным. Правомерность использования крыс в эксперименте обусловлена наиболее близкой гемохориальной плацентацией данных грызунов к плаценгации человека.

Цель исследования

Изучить динамику изменения показателей тромбоцитарного звена гемостаза у крыс и их потомков при физиологически протекающей беременности и на экспериментальных моделях гипо- и гиперкоагуляции в Ш триместре беременности, период родов и раннем неонаталыюм периоде.

Задачи исследования

1. Определить состояние тромбоцитарного гемостаза у крыс и их потомков при физиологически протекающей беременности в Ш триместре, в день родов и на 5-й день после родов.

2. Выявить изменение морфофункциональных характеристик тромбоцитов периферической крови у крыс и их потомков на экспериментальной модели гипокоагуляции в последнем триместре беременности, в день родов и на 5-й день после родов.

3. Установить динамику изменения показателей тромбоцитарного звена гемостаза у крыс и их потомков на экспериментальной модели гиперкоагуляции при беременности в Ш триместре, в день родов и на 5-й день после родов.

4. Оценить влияние состояния гемостаза матери во время беременности на морфофункциональное состояние тромбоцитов периферической крови потомков внутриутробно и раннем неонатальном периоде.

Научная новизна

Впервые разработана модель гипо- и гиперкоагуляции у экспериментальных животных для оценки состояния тромбоцитарного звена гемостаза во время беременное™ у самок крыс и их потомков в разные периоды развития (патент РФ на изобретение №211116383, заявка от 02.2011г. «Способ моделирования гипо- и гиперкоагуляции на экспериментальных животных»).

Установлена .зависимость морфофункционального состояния тромбоцитов периферической крови потомков крыс от состояния гемостаза самок крыс при физиологически протекающей беременности, при экспериментальной гипокоагуляции, как проявление аспириновой

тромбопатии, и при экспериментальной гиперкоагуляции (гипергомоцистеинемия).

Реактивность тромбоцитов определяется количеством тромбоцитов периферической крови, средним объемом, средней площадью клетки, выраженностью индуцированной агрегации, а также фактором формы клетки, отражающим степень образования псевдоподий, и интегральным оптическим показателем индекса омоложения тромбоцитов (ИОТр), характеризующим степень омоложения тромбоцитов в препарате по насыщенности гранулами цитоплазмы тромбоцитов.

Практическая значимость

Полученные результаты расширяют современные представления о морфофункциональном состоянии тромбоцитов у матерей и их детей при тромбогеморрагических осложнениях течения беременности по сравнению с данными физиологически протекающей беременности.

Так как правомерность использования крыс в эксперименте обусловлена наиболее близкой гемохориальной плацентацией данных грызунов к плацентации человека, экспериментально полученные новые да!шые об особенностях морфо-функциональных параметров тромбоцитов можно использовать как теоретическую предпосылку для оценки состояния плодов при беременности, сопровождающейся тромбогеморрагическими нарушениями.

Применение схемы исследования функциональных и морфометрических параметров тромбоцитов может дать возможность в дальнейшем проводить мониторирование нарушений тромбоцитарного звена гемостаза в Ш триместре беременности и родах с последующим назначением соответствующей медикаментозной коррекции с целью предотвращения этих осложнений, что позволит снизить частоту тромбогеморрагических осложнений у матерей и новорожденных в интранатальный период.

Основные положения, выносимые на защиту

1. Количество, размеры, агрегационная активность и степень омоложения тромбоцитов периферической крови взрослых самок крыс и их потомков динамически увеличиваются в дородовый период и в день родов, что определяется явлениями адаптационной гиперкоагуляции, и приближаются к норме на 5-е сутки после родов при адаптации к послеродовому периоду жизни. У взрослых самок крыс и их потомков регистрируется пик тромбоцитарной реактивности в день родов.

2. При экспериментальной гипокоагуляции, вызванной аспирином, развивается аспириновая тромбопатия, характеризующаяся уменьшением количества, размеров и функциональной активности тромбоцитов, увеличением доли «старых» тромбоцитов в периферической крови взрослых самок крыс и их потомков в последнем триместре беременности и в день

родов. На 5-е сутки после родов у самок крыс сохраняется состояние гипокоагуляции, у потомков регистрируется активация тромбоцитарного звена гемостаза из-за прекращения поступления аспирина и адаптацией к внеутробной жизни.

3. При экспериментальной гиперкоагуляции, вызванной получешем метионина самками крыс во время беременности, у взрослых животных и их потомков регистрируются гипергомоцистеинемия и активация тромбоцитарного звена гемостаза в дородовый период и в день родов. На 5-е сутки после родов у самок крыс сохраняется состояние гиперкоагуляции, у потомков регистрируются снижение агрегационной активности тромбоцитов и омоложение пула тромбоцитов периферической крови из-за прекращения поступления метионина, элиминации «старых» тромбоцитов крови и адаптации к внеутробной жизни.

4. Влияние состояния гемостаза матери во время беременности на морфофункциональное состояние тромбоцитов периферической крови потомков определяется особенностями фето-плацентарного кровообращения экспериментальных животных во время беременности, прекращением поступления крови матери в организм новорожденных после родов, продолжительностью жизни тромбоцитов в периферической крови и адаптацией к внеутробной жизни.

Внедрение

Основные результаты опубликованы в печатных работах, доложены на симпозиумах и научно-практических конференциях разных уровней.

Материалы исследования используются при чтении лекций и проведении занятий по лабораторно-диагностическому блоку на кафедрах физико-химических основ медицины и клинической лабораторной диагностики; физиологии, анатомии и гигиены человека в Ставропольском государственном университете для студентов по специальности «Медицинская биохимия» и других специальностей медико-биолого-химического факультета; для врачей-интернов по специальности «Клиническая лабораторная диагностика».

По результатам исследования издано учебно-методическое пособие «Коагулология и гемостазиология» (Ставрополь, 2011).

Алгоритм исследования тромбоцитарного звена гемостаза применяется в работе клинико-диагностических лабораторий лечебно-профилактических учреждений г. Ставрополя.

Апробация диссертации

Материалы диссертации докладывались и обсуждались на:

1. XI Международном конгрессе «Здоровье и образование в XXI веке» (Москва, 2010).

2. V междисциплинарной конференции по акушерству, перинатологии, неонатологии «Здоровая женщина - здоровый новорожденный» (Санкт-Петербург, 2010).

3. 55-й и 56-й Межрегиональных научно-практических конференциях «Университетская наука - региону» (Ставрополь, 2010,2011).

4. Заседаниях Краевого научно-практического общества специалистов клинической лабораторной диагностики (Ставрополь, 2010,2011).

5. VII ежегодной научной конференции студентов и аспирантов базовых кафедр Южного научного центра РАН (Ростов-на-Дону, 2011).

По материалам диссертации опубликовано 10 научных статей, в том числе 3 в журналах, включенных в перечень ВАК Минобрнауки РФ; 1 учебно-методическое пособие для врачей-йнтернов и студентов медицинских, медико-биологических факультетов и специалистов по клинической лабораторной диагностике.

Получен патент РФ на изобретение №211116383; заявка от 02.2011г. «Способ моделирования пшо- и гиперкоагуляции на экспериментальных животных».

Объем и структура работы

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, глав с изложением результатов исследования, обсуждения результатов, выводов, списка литературы и приложений. Диссертация изложена на 130 страницах, содержит 13 таблиц, иллюстрирована 28 рисунками. Список литературы включает 155 источников (81 отечественный и 74 иностранных).

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ Объекты исследования

Объектом исследования выбраны белые крысы линии Вистар, полученные из Рапполово (Санкт-Петербург). При выборе крыс в качестве экспериментального материала мы основывались на том, что при всей актуальности проблемы лабораторное обследование беременных женщин и новорожденных детей, связанное с моделированием патологических процессов и неоднократным взятием крови не корректно, а обследование плода -невозможно. Правомерность использования крыс в эксперименте обусловлена наиболее близкой гемохориальной плацентацией данных грызунов к плацентации человека.

При проведении лабораторного эксперимента мы полностью соблюдали международные принципы декларации о гуманном отношении к животным, используемым в научных целях, изложенные в современных рекомендациях европейских независимых комитетов по вопросам этики (Брюссель, 1995,1997) и Рекомендации Комитетам по этике, проводящим экспертизу биомедицинских исследований (Женева, 2000).

Всего использовано 69 взрослых самок крыс, 132 плода крыс (Ш триместр беременности) и 299 новорожденных (148 - в день родов и 151 - на 5-й день после родов). На 62 взрослых самках крыс поставлены основные эксперименты; 7 крыс служили контролем.

На 3-4-е сутки после спаривания и установления наличия беременности взрослых самок крыс распределяли в группы: 1-я - с физиологически протекающей беременностью; 2-я - для создания модели гипокоагуляции и 3-я - модели гиперкоагуляции. У всех крыс и их потомства исследования проводили на 19-20-й день беременности, в день родов и на 5-й день после родов. Кровь у взрослых животных брали из хвостовой вены, а у крысят после декалитации собирали в общую пробирку для получения необходимого количества крови.

Крысы с физиологически протекающей беременностью получали обычный рацион питания и находились на свободном питьевом режиме. Крысы с созданной экспериментально моделью гипокоагуляции в течение всей беременности получали обычный рацион питания и кардиомагнил, растворенный в суточном объеме воды (кардиомагнил назначали в суточной дозе, рассчитанной по аспирину, в зависимости от массы животного (0,38-0,39мг) с нормальным суточным потреблением воды (30-32мл). Крысы с созданной экспериментально моделью гиперкоагуляции в течение всей беременности получали сухой корм и метионин, растворенный в объеме воды, составляющем 2/3 от нормального суточного объема. Метионин назначали в суточной дозе, рассчитанной в зависимости от массы животного (0,6-0,7мг) после установления факта наличия беременности, на фоне ограничения питьевого режима (28-30мл в сутки).

Удобство такой модели состоит в том, что в лабораторных условиях на крысах могут контролироваться как эндогенные, так и экзогенные факторы, влияющие на течение беременности и условия содержания и кормления (Стуров В.Г., 2006).

Методы исследования

Для установления факта гипо- или гиперкоагуляции у экспериментальных животных проводили определение длительности кровотечения по Дьюку и активированного парциального тромбопластинового

времени на коагулометре «OLVEX DIAGNOSTICUM» с набором реагентов (АПТВ-Эл-тест).

Для подтверждения факта развития метаболических нарушений осуществляли определение концентрации гомоцистеина методом иммунохемилюминесцентного анализа на анализаторе IMMULYTE 2000 (SIMENS, США).

Для оценки количественных показателей тромбоцитов периферической крови кондуктометрическим методом на автоматическом гематологическом анализаторе фирмы «ABBOTT» (США) определяли: PLT - количество Тр, MPV - средний объем Тр, РСТ - тромбокрит.

Для изучения функциональной активности тромбоцитов проводили исследование агрегации тромбоцитов методом Вот G. V. R. с графической регистрацией на лазерном агрегометре (модель БИОЛА LA230, Россия) с различными индукторами (коллаген (0, 2%), АДФ (малой концентрации - 0,2 мМ/л), ристомицин (5 мкМ/мл).

Для оценки морфо-функционального состояния тромбоцитов методом компьютерной цитоморфометрии с использованием компьютерно-аппаратного комплекса МЕКОС-Ц (Россия) определяли геометрические размеры, выраженность псевдоподий, цветояркостные показатели - насыщение цитоплазмы гранулами и индекс омоложения тромбоцитов периферической крови. Для оценки степени «омоложения» Тр рассчитывали ИОТр, т.е. отношение доли синего цвета к доле красного в препарате.

Статистическую обработку данных выполняли с использованием методов параметрического и непараметрического анализов и пакета Microsoft Excel. Определяли следующие статистические параметры: среднее значение (X), ошибку среднего значения (м) и стандартное отклонение (5). Достоверность различия средних оценивали по критерию Стьюдента (t) для коэффициентов вариации; уровень значимости р выбран менее 0,05.

Результаты исследований и их обсуждение

Известно, что беременность всегда протекает с явлениями гиперкоагуляции, а в Ш триместре она становится необходимым атрибутом долговременной адаптации системы гемостаза. При этом особая роль принадлежит тромбоцитам, в которых содержатся тромбопластические и антигепариновые факторы, фибриназа, фибринолитические агенты, сократительные белки, необходимые для распластывания, адгезии, агрегации и реакции высвобождения тромбоцитов (Аляутдинова О.С., 1999).

1. Изучение состояния тромбоцитарного звена гемостаза у самок крыс и их потомков при физиологически протекающей беременности и родах.

В группе здоровых беременных самок крыс во все изучаемые периоды интранатального развития определялось укорочение активированного парциального тромбопластинового времени по сравнению с данными здоровых небеременных крыс, что характерно для нормально протекающей беременности и расценивается как физиологическая гиперкоагуляция.

При оценке морфометрических тромбоцигарных показателей видно, что все тромбоцитарные показатели небеременных крыс ниже, чем у здоровых животных. Данные обследования самок крыс и их потомков при физиологически протекающей беременности представлены в таблице 1.

Таблица 1

Показатели тромбоцитов в группах самок крыс и их потомков при

Показатели (М±т) РЬТ, 109/л Агрегация с ристомици-ном, % Площадь тромбоцитов, мкм Фактор формы, У.е. ИОТр, у.е.

Самки крыс

19-20-й день беременности 449,2±15 11,06±0,23 2,48±0,04 13,3±0,31 0,94±0,03

День родов 508,2±18 12,01±0,28 3,10±0,03 14,7±0,36 1,14±0,05

5-е сутки после родов 468,4±14 10,64±0,13 2,57±0,03 12,9±0,23 0,96±0,03

Р <0,05 <0,01 <0,001 <0,01 <0,001

Р, >0,1 >0,1 >0,1 >0,1 >0,1

Р, >0,1 <0,001 <0,001 <0,001 <0,005

Потомки

19-20-й день беременности 403,7±9,0 5,16±0,13 2,48±0,06 13,8±0,32 0,92±0,04

День родов 524,2±19 6,45±0,19 4,10±0Д0 15,7±0,42 0,73±0,04

5-е сутки после родов 431,1±11 5,29±0,17 3,07±0,08 13,9±0,33 0,89±0,03

Р <0,001 <0,001 <0,001 <0,001 <0,005

Р, >0,05 >0,1 <0,001 >0,1 >0,1

Р? <0,001 <0,001 <0,001 <0,001 <0,005

Рз <0,01 <0,001 >0,1 >0,1 >0,1

Р4 >0,1 <0,001 <0,001 >0,05 <0,001

Рч <0,05 <0,001 <0,001 <0,05 >0,1

Примечание: Р- ,, . . _

в день родов; Р[ - уровень достоверности внутригрупповых различий показателей до родов и на 5-й день после родов; Р2 - уровень достоверности внутригрупповых различий показателей в день родов и на 5-й день после родов; Р3 - уровень достоверности межгрупповых различий показателей у самок крыс и их потомков до родов; Р4 - уровень достоверности межгрупповых различий показателей у самок крыс и их потомков в день родов; Р5 - уровень достоверности межгрупповых различий показателей у самок крыс и их потомков на 5-й день после родов.

При этом обращает на себя внимание достоверно более выраженная степень активации тромбоцитов (Тр) в день родов, что соответствует описанному в литературе «пику первого дня». В день родов у здоровых самок крыс в крови отмечается увеличите размеров кровяных пластинок, также определяется повышение образования псевдоподий - фактор формы в этот период максимальный - 14,7±0,36 у.ед. Увеличивается и содержание в крови молодых Тр с повышенной реактивностью, о чем свидетельствует увеличение УОПеШ. до 0,411±0,018у.ед. и ИОТр до 1,143±0,045у.ед.

На 5-й день после родов все показатели здоровых животных приближаются к результатам здоровых небеременных крыс, сохраняется достоверное увеличение только количества тромбоцитов. Полученные данные являются подтвервдением адаптационных изменений системы гемостаза при физиологическом течении беременности. В послеродовом периоде рассматриваемые выше показатели имеют тенденцию к приближению к дородовым показателям, сохраняя тенденцию к гилеркоагуляции.

При изучении состояния тромбоцитарного звена гемостаза у потомков при физиологически протекающей беременности на 19-20-й день внутриутробного развития в крови плодов крыс определяется тенденция к уменьшению количества кровяных пластинок при увеличении их объема (Р>0,1).

Агрегационная активность Тр в крови потомства с индукторами АДФ и ристомицином - низкая, а с коллагеном не определяется во все периоды интранатального развития потомства крыс.

При оценке влияния состояния гемостаза матери на состояние потомства при физиологически протекающей беременности отмечается достоверное увеличение доли синего и красного цветов в препаратах взрослых крыс по сравнению с результатами в группах потомков, интегральный показатель ИОТр оказался выше у крысят, обследованных во внутриутробный период развития и на 5-й день жизни. Подобные изменения свидетельствуют об активизации реактивности Тр в указанные периоды развития у потомков, рожденных от здоровых самок крыс.

В результате анализа полученных данных также установлено, что количество тромбоцитов у потомков достоверно ниже, чем у самок крыс на 1920-й день внутриутробного развития и на 5-й день жизни. При этом наблюдается достоверное увеличение количества тромбоцитов у потомков в день родов по сравнению с данными самок крыс.

Сравнительный анализ динамики агрегационной активности Тр у здоровых крыс и их потомков позволил установить, что у взрослых самок крыс и их плодов в день родов отмечается наиболее высокая степень агрегации Тр со

всеми индукторами. При этом показатели агрегации с АДФ и ристомицином у потомков достоверно ниже, чем у их матерей.

Сравнение динамики изменения размеров Тр в микроскопических препаратах экспериментальных животных показало, что средняя площадь Тр и фактор формы кровяных пластинок у самок крыс и их потомков во все периоды интранатального развития выше, чем у небеременных взрослых самок. Однако эти тенденции наиболее выражены у потомков в день родов, что графически выражается как «пик первого дня».

Сравнение показателя ИОТр показало, что у самок крыс и их потомков отмечаются динамически изменяющиеся разнонаправленные изменения, свидетельствующие об увеличении доли молодых Тр в крови самок крыс и снижении в крови их потомков, причем наиболее выраженные изменения определяются в день родов как у потомков, так и у самок крыс.

2. Изучение состояния тромбоцитарного звена гемостаза у самок крыс и их потомков при создании экспериментальной модели гипоко агул яции.

Доказательством гипокоагуляции у крыс в данной группе явилось увеличение длительности кровотечения по Дьюку до 8 мин 28 сек, а также удлинение активированного парциального тромбопластинового времени до 35,5±0,7 сек по сравнению с данными животных с физиологически протекавшей беременностью-20,5±0,4 сек в день родов.

При этом наиболее выраженные изменения отмечались в обеих группах экспериментальных животных в день родов и в первый день после родов.

Длительность кровотечения увеличивается при применении кардиомагнила за счет угнетения функций тромбоцитов, что соответствует задаче исследования - создать экспериментальную модель кровоточивости. При введении метионина происходят противоположные изменения, характерные для состояния гиперагрегации тромбоцитов (Момот А.П., 2006).

Количество Тр в крови экспериментальных животных, получавших кардиомагнил, достоверно ниже во все периоды интранатального обследования, по сравнению с количеством тромбоцитов в крови здоровых самок крыс; при этом отмечается достоверное его повышение в день родов. Различий в среднем объеме Тр в крови беременных и небеременных животных не выявлено, что, вероятно, связано с низкой реактивностью кровяных пластинок у крыс, получавших кардиомагнил, и характеризует гипокоагуляцшо.

При оценке агрегатограмм животных, находящихся в условиях экспериментальной гипокоагуляции, у всех животных отмечается снижение индуцированной агрегации Тр крови. Монотонно низкие показатели агрегации Тр со всеми индукторами наблюдались у взрослых крыс как до родов, так и в

послеродовый период. У потомков крыс, получавших кардиомагнил, выявлено повышение активности агрегации Тр на 5-й день жизни, что, вероятно, связано с уменьшением действия антиагреганта после рождения.

При индукции АДФ вторая волна агрегации четко не регистрируется; отмечается наступление ранней дезагрегации, что связано с нарушением реакции высвобождения.

Таблица 2

Показатели тромбоцитов в группах самок крыс и их потомков при экспериментальной гипокоагуляцин (Х±м)

Показатели (М±ш)

РЬТ, 109/л

Агрегация с ристомици ном, %

Площадь тромбоци тов, мкм

Фактор формы, У-е-

19-20-й день беременности

День родов

5-е сутки после родов

333,8±17

352,4±22

325,2±18

>0,1

>0,1

>0,1

Самки крыс

7,86±0,22

8,03±0,19

7,99±0,16

>0,1

>0,1

>0,1

2,18±0,03

2,21±0,02

2,07±0,02

>0,1

<0,01

<0,001

10,6±0,21

11,3±0,26

10,9±0,19

<0,05

>0,1

>0,1

Потомки

19-20-й день беременности

День родов

5-е сутки после родов

Р1

Р?

Р5

327,8±16

346,2±15

401,7±13

>0,1

<0,001

<0,01

>0,1

>0,1

<0,001

4,31±0,11

4,65±0,17

5,02±0,19

>0,1

<0,005

>0,1

>0,1

>0,1

>0,1

2,02±0,05

2,17±0,04

2,34±0,06

<0,05

<0,001

<0,05

<0,01

>0,1

<0,001

9,9±0,18

10,3±0,16

10,5±0,22

>0,1

<0,05

>0,1

>0,1

<0,005

>0,1

Примечание: Р - уровень достоверности внугригрупповых различии показателей до родов и в день родов; Р1 - уровень достоверности внугригрупповых различий показателей до родов и на 5-й день после родов; Р2 - уровень достоверности внугригрупповых различий показателей в день родов и на 5-й день после родов; Р3 - уровень достоверности межгрупповых различий показателей у самок крыс и их потомков до родов; Р4 - уровень достоверности межгрупповых различий показателей у самок крыс и их потомков в день родов; Р> - уровень достоверности межгрупповых различий показателей у самок крыс и их потомков на 5-й день после родов.

Тенденции к повышению агрегации Тр, индуцированных ристомицином и коллагеном в день родов у крыс с гипокоагуляцией, вероятно, связаны с адаптационной активацией гемостаза в родах, что у здоровых животных проявляется физиологической гиперкоагуляцией. Данные обследования животных иллюстрирует таблица 2.

Тр животных, находящихся в условиях экспериментальной гипокоагуяяции в интранатальный период, характеризуются снижением оптических показателей. Так, отмечается достоверное снижение доли как синего (цитоплазма), так и красного цвета (гранулы), в препарате животных, получавших кардиомагнил, по сравнению с аналогичными показателями здоровых небеременных самок крыс. Оценку реактивности Тр проводили по интегральному показателю - ИОТр: выявлено снижение доли молодых активных кровяных пластинок у животных с экспериментальной гипокоагуляцией во все временные периоды по сравнению с данными здоровых небеременных крыс.

Количество Тр у потомков крыс, получавших кардиомагнил, достоверно ниже, чем у крысят, родившихся от здоровых самок крыс; при этом наиболее низкое количество кровяных пластинок отмечается на 19-20-й день внутриутробного развития.

На 5-й день после рождения количество тромбоцитов в крови крысят достоверно выше (р<0,001), чем у самок крыс, которые продолжали принимать кардиомагнил. Более высокое содержание тромбоцитов в крови новорожденных крысят, рожденных от матерей, получавших кардиомагнил, объясняется тем фактом, что при лактации аспирин попадает в грудное молоко в незначительных количествах и не вызывает клинических нарушений (Машковский М.Д., 2008); следовательно, увеличение количества тромбоцитов на 5-е сутки внеутробного развития можно расценить как адаптациошгую реакцию.

Агрегационную активность Тр с АДФ у потомства крыс, получавших кардиомагнил, измерить на лазерном агрегометре БИОЛА ЬА230, унифицированным методом не удалось.

Антиагрегационное действие аспирина проявляется в снижении агрегации со всеми индукторами у взрослых крыс, с ристомицином у крысят в отсутствие регистрируемой агрегации с индукторами АДФ и коллагеном у потомства крыс с гипокоагуляцией. Снижение морфофункциональной активности тромбоцитов у всех взрослых животных, получавших кардиомагнил, и их потомства проявляется в уменьшении геометрических размеров тромбоцитов, изрезанности края клетки и степени их омоложения.

Изменение тромбоцитарных показателей у взрослых крыс не различается в последнем триместре беременности, в день родов и на 5-й день после родов,

что, вероятно, объясняется развитием у экспериментальных животных аспириновой тромбопатии. У потомства крыс, получавших кардиомагнил, снижение реактивности тромбоцитов отмечается в период внутриутробного развития и в день родов, что связано с влиянием изменений тромбоцитарного гемостаза матери на тромбоциты плода. На 5-й день жизни у крысят выявлено повышение реактивности тромбоцитов, что объясняется снижением поступления кардиомагнила в организм потомства через грудное молоко и адаптацией новорожденных к условиям внеутробной жизни.

Средняя площадь Тр у потомства крыс, получавших кардиомагнил, достоверно ниже, чем у здоровых крысят на 5-й день жизни. Наиболее выраженные изменения наблюдаются у недоношенных крысят, т.е. на 19-20-й день внутриутробного развития. Также определяется аналогичное снижение фактора формы Тр, что свидетельствует о снижении образования псевдоподий кровяными пластинками в условиях аспириновой тромбоцитопатии и снижении реактивности Тр.

При сравнении количества Тр в группах самок крыс, получавших кардиомагнил, и их потомства на 19-20-й день беременности и в день родов результаты не различаются, при этом значительно ниже, чем содержание кровяных пластинок в крови здоровых небеременных и их потомства (контрольные группы). На 5-й день после рождения количество Тр в крови крысят достоверно выше (р<0,001), чем у их матерей, которые продолжали принимать кардиомагнил. Более высокое содержание Тр в крови новорожденных крысят, рожденных от матерей, получавших кардиомагнил, объясняется тем фактом, что при лактации аспирин попадает в грудное молоко в незначительных количествах и не вызывает клинических нарушений; следовательно, увеличение количества Тр на 5-е сутки внеутробного развития можно расценить как адаптационную реакцию.

При оценке динамики изменения оптических показателей тромбоцитов в группах самок крыс и их потомков с гипокоагуляцией видно, что доля синего цвета в препарате снижена, а доля красного цвета в препарате повышена, по сравнению с контролем во все периоды обследования, за исключением показателей у потомков из группы с гипокоагуляцией на 5-й день жизни. При этом снижение степени омоложения Тр регистрируется у всех животных при экспериментальной гипокоагуляции.

Аналогичные изменения регистрируются при сравнении геометрических показателей тромбоцитов (в % от контроля), полученных с помощью компьютерной морфометрии клеток. Средняя площадь тромбоцитов и фактор формы клеток взрослых крыс, получавших кардиомагнил, ниже, чем у здоровых животных, и больше, чем у их потомков во все периоды шггранатального развития. Наименьшие показатели отмечались на 19-20-й

день беременности, но не выявлен «пик первого дня», характерный для здоровых животных и их потомков. При этом у крысят, рожденных от крыс, получавших кардиомагнил, на 5-й день жизни регистрируется тенденция к увеличению геометрических размеров и образованию псевдоподий (фактор формы), т.е. активация тромбоцитов. При этом регистрируется снижение количества тромбоцитов и среднего объема клеток периферической крови, степени омоложения тромбоцитов у всех животных при экспериментальной гипокоагуляции.

Известно, что во время беременности в норме уровень гомоцистеина имеет тенденцию к снижению. Это снижение происходит обычно на границе первого и второго триместров беременности, и затем остается относительно стабильным. Нормальные уровни гомоцистеина восстанавливаются через 2-4 дня после родов. Считается, что снижение уровня гомоцистеина при беременности благоприятстствует плацентарному кровообращению. Уровень гомоцистеина в крови обратно пропорционален массе плода и новорожденного. (Шевченко О.П. и соавт., 2002; Кшщ Б.Б. е1 а1, 1992; Рокот А.Я. ег а1., 1999). Исследование уровня гомоцистеина в нашей работе мы проводили с помощью метода ИФА. Нами было установлено, что при создании экспериментальной модели гиперкоагуляции средняя концентрация гомоцистеина в крови беременных самок крыс составила 23,81±2,28 мкмоль/л, что достоверно превышает концентрацию гомоцистеина в крови контрольной группы здоровых небеременных крыс (5,06±0,42 мкмоль/л, р<0,001). На модели экспериментальной гиперкоагуляции показано, что при назначении метионина во время беременности у самок крыс развивается состояние, характерное для тромбофилии, вызванной гипергомоцистеинемией, характеризующейся гиперреакгивностью тромбоцитов.

Изучение динамики тромбоцитарных показателей в дородовый период, период родов и на 5-й день после родов позволило установить, что количество тромбоцитов, размеры тромбоцитов, агрегационная активность и цветояркостные характеристики у взрослых особей, получавших метионин, достоверно повышаются по сравнению с контрольной группой, что характерно для активации тромбоцитов в условиях гипергомоцистеинемии.

3. Изучение состояния тромбоцитарного звена гемостаза у самок крыс и их потомков при создании экспериментальной модели гипокоагуляции.

Доказательствами гиперкоагуляции у крыс в данной группе явились уменьшение длительности кровотечения по Дыоку - 5 мин 55 сек, а также укорочение активированного парциального тромбопластинового времени

(АПТВ) до 15,7±0,3 сек, по сравнению с данными животных с физиологически протекавшей беременностью - 20,5±0,4 сек в день родов.

Было выявлено достоверное повышение количества тромбоцитов в периферической крови крыс, получавших метионин во все исследуемые периоды, с тенденцией к повышению количества тромбоцитов в день родов. Средний объем тромбоцитов в крови беременных крыс с гиперкоагуляцией достоверно увеличивался при исследовании на 19-20-й день беременности и в день родов. У взрослых беременных крыс при гиперкоагуляции по сравнению с данными здоровых небеременных самок крыс было выявлено состояние гиперактивности тромбоцитов, так как регистрировалось достоверное повышение максимальной агрегации тромбоцитов крови с индукторами АДФ, ристомицином и коллагеном во все исследуемые периоды интранатального развития.

Оценка агрегатограмм с индукцией АДФ показала повышение как обратимой (первичной), так и необратимой (вторичной) агрегации у крыс с гиперкоагуляцией, по сравнению с данными здоровых небеременных крыс.

Сравнительный анализ данных, полученных при морфомегрии тромбоцитов экспериментальных животных с гиперкоагуляцией и здоровых самок крыс, показал достоверное увеличение среднего диаметра и средней площади тромбоцитов, фактора формы у беременных крыс, получавших метионин во все периоды интранатального развития, что свидетельствует об активации тромбоцитов в интранатальный период в условиях экспериментальной гиперкоагуляции (таблица 3).

При исследовании оптических показателей тромбоцитов, отражающих возраст тромбоцитов (удельная оптическая плотность по синему и красному цветам) в препаратах крови крыс, получавших метионин, выявлено достоверное увеличение доли синего цвета, что указывает на появление большого количества молодых форм тромбоцитов (Луговская С.А., 2002; 2009).

Достоверное увеличение интегрального показателя ИОТр у крыс в эксперименте по сравнению с данными небеременных самок крыс подтверждает активацию тромбоцитов при гиперкоагуляции во все периоды интранатального периода.

Статистический анализ результатов обследования крысят, рожденных от матерей, получавших метионин, на 19-20-й день гестации, в день родов и на 5-й день внеутробной жизни позволил установить достоверное увеличение количества тромбоцитов во все периоды интранатального периода по сравнению с данными в группе потомства здоровых крыс на 5-е сутки жизни, что отражает изменение активности тромбоцитарного звена гемостаза новорожденных крысят и самок крыс. При этом наибольшее увеличение

количества кровяных пластинок наблюдается в группе крысят в день родов (552,9±21*109/л), а на 5-е сутки жизни количество тромбоцитов снижается, что, вероятно, связано с прекращением действия метионина и адаптацией новорожденных к внеугробной жизни.

Таблица 3

Показатели тромбоцитов в 1руппах самок крыс и их потомков при

Показатели (М±ш) РЬТ, 109/л Агрегация с ристомици ном, % Площадь тромбоци тов, мкм Фактор формы, у.е. ИОТр, у.е.

Самки крыс

19-20-й день беременности 519,3±21 12,61±0,20 4,04±0,05 14,1±0,31 0,95±0,03

День родов 588,1±17 13,27±0,29 4,41±0,05 14,7±0,36 0,96±0,03

5-е сутки после родов 546,9±12 12,14±0,26 3,93±0,03 13,8±0,29 0,95±0,03

Р <0,05 >0,05 <0,001 >0,1 >0,1

Р1 >0,1 >0,1 >0,05 >0,1 >0,1

Р, <0,05 <0,01 <0,001 >0,05 >0,1

Потомки

19-20-й день беременности 493,7±12 7,26±0,15 3,79±0,09 14,8±0,26 1,05±0,04

День родов 552,9±21 8,52±0Д8 4,25±0,11 15,7±0,39 1,02±0,03

5-е сутки после родов 483,8±18 6,03±0,1б 3,14±0,08 14,1±0,35 0,90±0,03

Р <0,05 <0,001 <0,001 >0,05 >0,1

Р1 >0,1 <0,001 <0,001 >0,1 <0,01

Р2 >0,1 <0,001 <0,001 >0,1 <0,01

Рз >0,1 <0,001 <0,01 >0,1 <0,05

Р4 >0,1 <0,001 >0,1 >0,05 >0,1

Ъ <0,01 <0,001 <0,001 >0,1 >0,1

Примечание: Р - уровень достоверности внутригрушювых различий показателей до родов и в день родов; Р1 - уровень достоверности виутригрупповых различий показателей до родов и на 5-й день после родов; Р2 - уровень достоверности внутригрупповых различий показателей в день родов и па 5-й день после родов; Р3 - уровень достоверности межгрупповых различий показателей у самок крыс и их потомков до родов; Р4 - уровень достоверности межгрупповых различий показателей у самок крыс и их потомков в день родов; Р5 - уровень достоверности межгрупповых различий показателей у самок крыс и их потомков на 5-й день после родов.

Аналогичная динамика изменения показателей регистрируется при исследовании агрегации, оптических показателей тромбоцитов на 19-20-й день внутриутробного развития плодов и в день родов, а на 5-е сутки жизни показатели тромбоцитов крысят, рожденных от матерей с гиперкоагуляцией, практически не различаются с показателями тромбоцитов крысят, рожденных

от здоровых крыс. Подобные изменения, вероятно, свидетельствуют о прекращении действия метионина на организм новорожденных крысят после рождения и развитии адаптационных реакций системы гемостаза в условиях внеутробной жизни.

Таким образом, установлено, что влияние системы кроветворения матери на систему кроветворения плода проявляется в условиях экспериментальной гилеркоагуляции во внеутробный период и сохраняется в периоде родов. Это проявляется гиперреакгивностью тромбоцитов (с увеличением морфометрических размеров и цветояркостных характеристик) у потомков на 19-20-й дни гестации и в день родов. На 5-е сутки внеутробного развития новорожденных крысят отмечается снижение гиперреактивности тромбоцитов (средняя продолжительность жизни тромбоцита - 4-6 дней), что обусловлено адаптационными механизмами системы гемостаза к внеутробной жизни после прекращения поступления метионина.

ВЫВОДЫ

1. Состояние тромбоцитарного гемостаза у самок крыс и их потомков при физиологически протекающей беременности в Ш триместре, в день родов и на 5-й день после родов, характеризуется проявлениями адаптационной гиперкоагуляции с увеличением количества, размеров, индуцированной агрегации и степени омоложения тромбоцитов периферической крови.

2. В условиях экспериментальной гипокоагуляции, вызванной аспирином, уменьшаются количество, размеры и величина агрегации тромбоцитов с индукторами - коллаген (0,2%), АДФ (малой концентрации - 0,2 мМ/л), ристомицин (5 мкМ/мл); увеличивается доля «старых» тромбоцитов в периферической крови взрослых самок крыс и их потомков в последнем триместре беременности и в день родов. На 5-е сутки после родов у самок крыс сохраняется состояние гипокоагуляции, у потомков регистрируется активация тромбоцитарного звена гемостаза.

3. В модели экспериментальной гиперкоагуляции, в условиях гипергомоцистеинемии, увеличиваются количество, размеры и величина агрегации тромбоцитов со всеми индукторами; происходит увеличение степени омоложения тромбоцитов периферической крови взрослых самок крыс и их потомков. На 5-е сутки после родов у самок крыс сохраняется состояние гиперкоагуляции, у потомков регистрируется снижение агрегационной активности тромбоцитов и омоложения пула тромбоцитов периферической крови.

4. Состояние гемостаза матери во время беременности определяет морфофункциональное состояние тромбоцитов периферической крови потомков за счет особенностей фето-плацентарного кровообращения матери и

плода во время беременности. В ранний послеродовый период развития состояние тромбоцитарного звена гемостаза потомков крыс определяется продолжительностью жизни тромбоцитов в периферической крови, эффективностью тромбоцитопоэза и адаптацией к внеутробной жизни новорожденного.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Экспериментально полученные новые данные об особенностях морфо-функциональных параметров тромбоцитов рекомендуется использовать при составлении прогностических таблиц оценки состояния плодов при беременности, сопровождающейся тромбогеморрагическими нарушениями, и для поиска мер, предупреждающих развитие этих осложнений.

2. Применение схемы исследования функциональных и морфометрических параметров тромбоцитов при мониторировании нарушений тромбоцитарного звена гемостаза в Ш триместре беременности и родах может дать возможность оценить эффективность медикаментозной коррекции.

3. Полученные данные влияния тромбоцитарного гемостаза матери при развитии тромбогеморрагических осложнений беременности и родов на состояние плода целесообразно включить в соответствующие разделы программ по физиологии, акушерству и гинекологии, клинической лабораторной диагностики, биохимии и других дисциплин при подготовке специалистов медико-биологического профиля.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Шаталова, Г. Ю. Закономерности изменений состояния гемостаза в системе «мать - ребенок» при неосложненной беременности и тромбофшши / Т. П. Бондарь, А. Ю. Муратова, Г. Ю. Шаталова // Вестник СГУ. - 2010. - № 4. -С. 187-195.

2. Шаталова, Г. Ю. Изменение показателей гемостаза у женщин с тромбогеморрагическими осложнениями в акушерской практике / А. Ю. Муратова, Т. П. Бондарь, Г. Ю. Шаталова // Биоразнообразие, биоресурсы, новые материалы и здоровье населения региона : материалы 55-й науч.-метод. конф. - Ставрополь, 2010. - С. 128-132.

3. Изменения тромбоцитарных показателей крови экспериментальных животных в течение нормально-протекающей беременности и родов / Г. Ю. Шаталова, А. Ю. Муратова, Л. Н. Юшкова, Т. П. Бондарь // Биоразнообразие, биоресурсы, новые материалы и здоровье населения региона: материалы

55-й науч.-метод. конф. - Ставрополь, 2010. - С. 138-141.

4. Шаталова, Г. Ю. Морфо-функциональные показатели тромбоцитов у детей, рожденных от матерей с тромбогеморрагическими нарушениями (экспериментальное исследование) / Г. Ю. Шаталова, Т. П. Бондарь // Здоровая женщина - здоровый новорожденный: Материалы V междисциплинарной конф. по акушерству, перинатологии, неонатологии. - СПб., 2010.

5. Шаталова, Г. Ю. Влияние различного рациона питания на питьевой режим у крыс / А. А. Власов, В. В. Чекменева, Г. Ю. Шаталова // Здоровье и образование в XXI веке. Научные и прикладные аспекты здоровья и здорового образа жизни: материалы XI Междунар. контр. - М., 2010. - С. 462-463.

6. Шаталова, Г. Ю. Влияние лекарственных препаратов на состояние тромбоцитарного гемостаза у лабораторных животных / Г. Ю. Шаталова,

Т. П. Бондарь, А. Ю. Муратова // Вестник Север. Кавказа. - 2011. - № 4,- С. 7281.

7. Шаталова, Г. Ю. Динамика изменения морфометрических показателей тромбоцитов в родах (экспериментальные исследования) / Г. Ю. Шаталова, Т. П. Бондарь, А. Ю. Муратова // Современные проблемы науки и образования. -

2011. - № 6, www.rae.ru.

8. Шаталова, Г. Ю. Оценка медикаментозного воздействия на морфомегрическое состояние тромбоцитов лабораторных животных / Т. П. Бондарь, Г. Ю. Шаталова // Биоразнообразие, биоресурсы, новые материалы и здоровье населения региона: материалы 56-й науч.-метод. конф. - Ставрополь, 2011.-С. 31-33.

9. Шаталова, Г. Ю. Изменение функциональной активности тромбоцитов у экспериментальных животных под влиянием лекарственных препаратов / Г. Ю. Шаталова // Материалы VII ежегодной науч. конф. студентов и аспирантов

базовых кафедр Южного научного центра РАН. - Ростов-на-Дону, 2011. - С.

55-56. ^ ■

10. Шаталова, Г. Ю. Лабораторно-клиническая оценка тромбоцитов у детей, рожденных от матерей с тромбогеморрагическими нарушениями в эксперименте / Г.Ю. Шаталова // Фундаментальные исследования в биологии и медицине: Сборник научных трудов - Ставрополь. Мир данных, 2011, Вып. 9. - С. 74-78.

Список принятых сокращений

АДФ - аденозиндифосфат

АПТВ - активированное парциальное тромбопластиновое время ИОТр - индекс омоложения тромбоцитов Тр - тромбоцит

Подписано в печать 14.12.2011 Объем 1 печ. л. Тираж 100. Заказ № 56 Отпечатано в типографии ООО «Скайрей» по адресу: 410054 г. Саратов, ул. Политехническая, д. 122