Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Определение размеров и оптических свойств тромбоцитов методом лазерной дифракционной спектроскопии

ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Содержание диссертации, кандидата физико-математических наук, Космовский, Сергей Юрьевич

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1 Строение и свойства тромбоцитов.

1.2 Процессы характеризующие активацию тромбоцитов.

Адгезия тромбоцитов.

Реакция высвобождения.

Агрегация тромбоцитов.

Изменение концентрации и размера тромбоцитов.

1.3 Рассеяние и поглощение света малыми частицами.

Метод лазерной дифракционной спектроскопии для определения распределения частиц по размерам.

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

2.1 Метод лазерной дифракционной спектроскопии.

Прибор "Mastersizer Micro". Блок схема.

Восстановления исходного распределения частиц по размерам из картины светорассеяния.

Объемная концентрация рассеивающих частиц.

2.2 Определение размеров и оптических свойств тромбоцитов.

2.3 Индукторы активации тромбоцитов.

2.3 Выделение тромбоцитов.

2.4 Определение концентрации тромбоцитов на счетчике клеток.

2.5 Турбидометрический метод исследования агрегации тромбоцитов.

2.6 Метод сканирующей электронной микроскопии для исследования количества и морфологии адгезированных тромбоцитов.

2.7 Схема проведения эксперимента.

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.

3.1 Выбор экспериментальных условий для измерения углового распределения рассеянного на тромбоцитах света.

3.2 Определение размеров и оптических свойств тромбоцитов.

Выбор модели анализа и презентации с помощью минимизации коэффициента невязки.

Вычисление среднего объема тромбоцитов.

Вычисление концентрации тромбоцитов.

Использование концентрации тромбоцитов для выбора презентации.

Процедура получения распределения тромбоцитов по размерам, вычисления СОТ и концентрации тромбоцитов здорового донора.

3.3 Изменения оптических свойств тромбоцитов под действием индукторов активации.

Сдвиговое напряжение.

Изменение рН.

Хранение в тромбоцитарных контейнерах.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Определение размеров и оптических свойств тромбоцитов методом лазерной дифракционной спектроскопии"

Биосовместимость медицинских изделий, предназначенных для кратковременного или длительного контакта с кровью, во многом определяется реакцией тромбоцитов, играющих важную роль в поддержании гемостаза и сохранении агрегатного состояния крови [13]. Несмотря на прогресс в изучении отдельных этапов и механизмов активации тромбоцитов различными внешними факторами, описание процессов, характеризующих реакцию клеток, носит часто качественный или полуколичественный характер. В значительной степени это связано с ограниченным количеством имеющихся методов исследования.

Известно, что концентрация тромбоцитов в организме поддерживается постоянной, и ее существенное изменение клинически проявляется рядом тяжелых заболеваний [16]. Более того, основными отрицательными эффектами при использовании систем искусственного и вспомогательного кровообращения являются тромбозы, тромбоэмболии, тромбоцитопения и т.д., обусловленные взаимодействием тромбоцитов с чужеродной поверхностью.

Традиционно функциональное состояние тромбоцитов связывают с их способностью к адгезии, агрегации и высвобождению внутриклеточных биологически активных веществ [19, 13].

К сожалению, количество адгезированных тромбоцитов и их морфология не могут дать объективной информации о влиянии поверхности на клетки. Так, например, на контактирующей с потоком крови поверхности изделия не всегда удается найти адгезированные тромбоциты, но при этом активация клеток в объеме крови может инициировать образование тромбоэмбол.

Степень активации тромбоцитов часто оценивают по реакции высвобождения внутриклеточных биологически активных веществ (АДФ, серотонин, тромбин и т.д.). Однако такой метод является дорогостоящим, а полученные результаты не отличаются хорошей воспроизводимостью.

Широко распространенным методом анализа функциональных свойств тромбоцитов является изучение их агрегационной активности. Метод основан на увеличении светопропускания суспензии тромбоцитов под действием индукторов агрегации физической или химической природы [28]. Следует заметить, что измеряемый эффект может быть связан не столько с уменьшением количества рассеивающих объектов в результате агрегации клеток, сколько с изменением индивидуальных размеров тромбоцитов и их оптических свойств - коэффициентов преломления и поглощения.

В связи с этим, поиск новых экспериментально определяемых количественных параметров, характеризующих функциональное состояние тромбоцитов, является актуальной и практически важной задачей, имеющей большое фундаментально-прикладное значение.

Для измерения оптических свойств и размеров тромбоцитов был выбран метод лазерной дифракционной спектроскопии. Несмотря на сложность метода, связанного с необходимостью математического решения обратной задачи рассеяния света и выбором начальных данных о параметрах распределения по размерам и оптических свойствах рассеивающих частиц, он достаточно часто применяется для определения размеров объектов не биологической природы (суспензии, эмульсии, аэрозоли).

Учитывая высокую чувствительность метода лазерной дифракционной спектроскопии к выбору оптических свойств объектов для определения их размеров, нами было высказано предположение о возможности использования данного метода для определения размеров и оптических свойств тромбоцитов как показателей, характеризующих их функциональное состояние.

В связи с этим, целью настоящей работы является разработка на основе лазерной дифракционной спектроскопии метода измерения размеров и оптических свойств тромбоцитов человека.

Исходя из поставленной цели, основные задачи работы сводились к следующему:

1) найти экспериментальные условия для измерения углового распределения рассеянного на тромбоцитах света (картины светорассеяния);

2) доказать возможность использования метода лазерной дифракционной спектроскопии для определения размеров и оптических свойств тромбоцитов (коэффициенты преломления и поглощения);

3) оптимизировать экспериментальную процедуру определения размеров и коэффициента преломления тромбоцитов человека методом лазерной дифракционной спектроскопии;

4) исследовать влияние скорости сдвига, рН среды и контакта с чужеродной поверхностью на размер и коэффициент преломления тромбоцитов.

Заключение Диссертация по теме "Биофизика", Космовский, Сергей Юрьевич

ВЫВОДЫ

1. Разработан и экспериментально обоснован метод измерения размеров и оптических свойств тромбоцитов на основе лазерной дифракционной спектроскопии.

2. Предложена и оптимизирована процедура вычисления среднего объема и коэффициента преломления тромбоцитов по картине светорассеяния.

3. Обоснован выбор коэффициента поглощения со значением, близким к нулю. Определены средний объем и коэффициент преломления тромбоцитов, соответственно равные 5,9 ± 0,4 мкм3 и 1,388 ± 0,004. Найденное значение среднего объема тромбоцитов (СОТ) соответствует значениям СОТ, полученным методом кондуктометрии.

4. Для характеристики функционального состояния тромбоцитов предложен новый количественный параметр - коэффициент преломления тромбоцитов. У

Доказано влияние сдвигового напряжения от 5 до 10 дин/см , уменьшения рН от 7,1 до 6,1 и наличие контакта с поверхностью полимерного материала на значения СОТ и коэффициента преломления.

5. Показано, что в ряде случаях увеличение светопропускания суспензии тромбоцитов, регистрируемое агрегометром, может быть связано с изменением размеров и оптических свойств тромбоцитов, а не с уменьшением количества рассеивающих объектов в результате их агрегации.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В представленной работе впервые показана возможность использования метода лазерной дифракционной спектроскопии для определения размеров и оптических свойств тромбоцитов. Предложенный подход позволяет также регистрировать изменение размеров и оптических свойств тромбоцитов после слабых воздействий, не вызывающих адгезии или агрегации клеток.

Показано, что изменение светопропускания суспензии тромбоцитов под действием индукторов, традиционно измеряемое агрегометрами, можно объяснить изменением размеров и оптических свойств тромбоцитов, а не уменьшением количества рассеивающих объектов с одновременным увеличением их размеров вследствие слипания клеток друг с другом (агрегации).

Разработанный метод определения размеров и оптических свойств тромбоцитов показывает возможность использования лазерной дифракционной спектроскопии для разработки высокочувствительного метода оценки тромборезистентных свойств биоматериалов по реакции клеток в объеме. В пользу этого говорит продемонстрированная в работе высокая чувствительность предложенных параметров метода (СОТ и коэффициент преломления тромбоцитов) при исследовании изменений функциональных свойств тромбоцитов после слабых воздействий. Поэтому, продолжением работы будет определение взаимосвязи предложенных параметров тромбоцитов с их функциональными свойствами, что в дальнейшем может привести к возможности их использования для оценки гемосовместимости материалов.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата физико-математических наук, Космовский, Сергей Юрьевич, Москва

1. Борен К., Хафмен Д., Поглощение и рассеяние света малыми частицами, Пер. с англ., Мир, Москва, 1986.

2. Васин С. JI., Титушкин И. А., Прокопенко Р. А., Розанова И. Б., Севастьянов В. И., Методика получения и цифровой обработки изображений адгезированных клеток, Медицинская техника, 1, 6-9, 1998;

3. Вашкинель В.К., Петров М.Н., Ультроструктура и функция тромбоцитов человека, Л., 1982.

4. Верхуша В.В., Вржещ П.В., Варфоломеев С.Д., Математическое описание кинетики агрегации тромбоцитов, Вестник АМН СССР, 10, 20 27, 1991.

5. Гаврилов Б.В., Ховратович В.И., Биофизические механизмы и кинетика агрегации тромбоцитов, Цитология, t.XXVI, № 12, г. Минск, Институт фотобиологии, 25-29,1975.

6. Галанова Е.П., Балакина Т.А., Витюк Д.В., Гарбунова Н.А., Способ определения скорости процесса агрегации тромбоцитов, Цитология, т. XXVIII, г. Минск, Институт фотобиологии, 15, 13- 15, 1976.

7. Гемосовместимость полимерных материалов и первичные стадии их взаимодействия с кровью. Диссертация на соискание ученой степени доктора биологических наук. Севастьянов ВИ. Москва, 1984.

8. Е. А. Захария, М. В. Кинах, Упрощённый способ определения агрегации и дезагрегации тромбоцитов, Лаб. дело, 1, 36 38,1989.

9. Летов В.А., Регирер С.А., Шадрина Н.Х., Реология крови, Москва "Медицина", 53-66, 1982.

10. Петрищев Н.Н., Папаян Л.П., Гемостаз: физиологические механизмы, принципы диагностики основных форм геморрагических заболеваний, уечбное пособие, Санкт-Петербург, 1999.

11. П.Самаль А.Б., Агрегация тромбоцитов: Методы изучения и механизмы, Минск, "Университетское", 1990.

12. Севастьянов В.И., Беломестная З.М., Дубович Т.И., Петров М.В. О предварительной оценке тромборезистентности полимерных материалов. Ж. Высокомо-лек. Соед.,23, 1864-1867, 1981.

13. Севастьянов В.И., Общие представления о процессах взаимодействия чужеродной поверхности с кровью, Биосовместимость, Под ред. Севастьянова В.И., М., 1999.

14. Тучин В.В., Оптика биотканей: основы лазерной диагностики и дозиметрии, Медицинская физика, 4, 1997 (www.telemedica.ru)

15. Физиология человека. Под редакцией Шмидта Р. и Тевса Г., т. 2, Мир, Москва, 1996.

16. Шитикова А.С., Тромбоцитарный гемостаз, Санкт-Петербург, 2000.

17. Abe Т., Nishizawa J., Kazama М., The mathematical analysis of the human platelet aggregation mechanism and its clinical application, Platelet aggregation in the pathogenesis of cerebrovascular disorders, 1, 17-26, 1977.

18. Adams G.A., Platelets: physiology and pharmacology, Ed G.L. Longenecker, Orlando, San Diego, 15-47, 1985.

19. Anderson J.M., Kottke-Marchant K., Platelet interactions with biomaterials and artificial devices, CRC Critical Reviews in Biocompatibility, 1(2), 111-204, 1985.

20. Ashby В., Daniel J.L., Smith J.B., Mechanisms of platelet activation and inhibition, Hematol., Oncol. Clin. N. Amer., 4, 1-26, 1990.

21. Bath P.M.W., Butterworth R.J., Platelet size in vascular disease, Eur. J. Clin. Invest., 25,34, 1995.

22. Bath P.M.W., Butterworth R.J., Platelet size: measurement, physiology and vascular disease, Blood Coagulation and Fibrinolysis, 7, 157-161, 1996.

23. Bath P.M.W., Missouris C.G., Bukenham Т., MacGregor G.A., Increased platelet volume and platelet mass in patients with atherosclerotic renal artery stenosis, Clin. Sci., 87, 253-257, 1994.

24. Baumgartner, H. R. and Muggli, R., Adhesion and aggregation: morphological demonstration and quantitation in vivo and in vitro, in Platelets in Biology and Pathology, Gordon J. L., Ed., Elsevier, Amsterdam, 1976.

25. Bohren C.F., Hunt A.J., Scattering of electromagnetic waves by a charged sphere, Can. J. Phys., 55, 1930-1935, 1977.

26. Bolton A.E., Ludlam C.A., Moore S., Three approaches to the radioimmunoassay of human b-thromboglobulin, Br. J. Haematol., 33, 233, 1976.

27. Bolton A.E., Ludlam C.A., Pepper D.S., A radioimmunoassay for platelet factor 4, Tromb. Res. 8, 51, 1976.

28. Born G. V. R. Aggregation of blood platelets by adenosine diphosphate and its reversal, Nature, 194, 4832, 927 929, 1962.

29. Boyum A., Stormorken N., Lund-Riise A., Electronic platelet counting, Scand. J. Clin. Lab. Invest., 28, 429, 1971.

30. Brown A.S., Hong Y., de Belder A., et al., Diabetics with peripheral vascular disease have an increased mean platelet volume megacaryocyte ploidy, Br. Heart J., 71, 178, 1994.

31. Cavallero F., Quantitative valuation of platelet aggregation curves through the calculation of a numerical index, Platelet aggregation in the pathogenesis of cerebrovascular disorders, 1,27-32,1977.

32. Cenni E, Cavedagna D, Falsone G, Mari G, Pizzoferrato A., Numerical and functional modifications in platelets induced by polyester coated by a hydrophilic polymer, Bio-materials, Jul, 14(8), 588-90, 1993.

33. Chesterman C.N., McGready J.R., Doyle J.J., Morgan F.J., Plasma level of platelet factor 4 measured by radioimmunoassay, Br. J. Haemmatol., 40, 489, 1978.

34. Detwiler T.C., Feinman R.D., The lumi-aggregometer: a new instrument for simultaneous measurement of secretion and aggregation by platelets, J. Lab. Clin. Med., 90, 125, 1977.

35. Fristma G.A., Haemostasis and thrombosis, Eds Corriveau D.M, Fristma G.A., Philadelphia, 206-228,1988.

36. Frojmovic M.M., Milton J.G., Physical, chemical and functional changes following platelet activation in normal and "giant" platelets, Blood Cells, 9, 359-382,1983.

37. Gabassov Z.A., Popov E.G., Gavrilov I.Yu., Posin E.Yu, Platelet aggregation: the use of optical density fluctuations to study microaggregate formation in platelet suspension, Thromb. Res., 54(3), 215-23, 1989.

38. Harms С., Laboratory evaluation of platelet function, in Platelet Function, Triplett D. A. Ed., American Sociaty of Clinical Pathologists, Chicago, 35, 1978.

39. Hawiger J.J., Mechanisms involved in platelet vessel wall interaction, Thromb. Hae-most., 74, 369-372, 1995.

40. Holmsen H., Storm E., Day H.J., Determination of ATP and ADP in blood platelets: a modification of the firefly luciferase assay for plasma, Anal. Biochem., 46, 489, 1972.

41. Ingerman C.M., Smith J.В., Silver M.J., Direct measurement of platelet secretion in whole blood, Thrombosis Research, 16, 335-344, 1979.

42. Ito Y, Sisido M, Imanishi Y. Platelet adhesion onto protein-coated and uncoated poly-etherurethaneurea having tertiary aminogroups in the substituents and its derivatives. JBMR, 23, 191-206, 1989.

43. Jagroop 1.А., Clatworthy I., Lewin J., Mikhailidis D.P., Shape change in human platelets: measurement with a channelyzer and visualisation by electron microscopy, Platelets, 11, 28-32, 2000.

44. Jenkins C.S., Cate J.W., Clemetson K.J., Platelet membrane glycoproteins: a role in the haemostatic process, Neth. J. Med., 19(6), 291-295, 1976.

45. Karpatkin S., Heterogeneity of human platelets. VI. Correlation of platelet function with platelet volume, Blood, 2, 307-316, 1978.

46. Karpatkin S., Platelet sizing, CRC Handbook Series in Clinical Laboratory Science, Section I: Hematology, 1,409, 1979.

47. Kinlough-Rathbone R.L., Mustard J.F., Platelet in biology and pathology, III, Eds. MacJntyre D.E., Gordon J.L., Amsterdam et al., 239-267, 1987.

48. Kroll M.H., Thrombosis and hemorrahge, Eds Loscalzo J., Schafer A.I., Boston et al, 247-277, 1994.

49. Latimer P., Brunsting A., Pyle B.E., Moore C., Effects of aspherecity on single particle scattering, Appl. Opt., 17, 3152 58,1978.

50. Lind S.E., Thrombosis and hemorrahge, Eds J.Loscalzo, A.I. Schafer, pp. 201-218, Boston, 1994.

51. Ludlam C.A., Moore S., Bolton A.E., Pepper D.S., Cash J.D., The releas of a human platelet specific protein measured by a radioimmunoassay, Thromb. Res., 6, 543, 1975.

52. Martin J.F., Daniel T.D., Trowbridge E.A., Acute and clinic changes in platelet volume and count after cardiopulmonary bypass induced thrombocytopenia in man, Thromb and Haemostas, 57,1-4,1987.

53. Muszbeck L., Adany R., Blood vessel wall and thrombosis, V.l, Ed. Machovich R., 159-196, 1988.

54. Niewiarowski S., Platelet release reaction and secreted platelets, Haemostasis and thrombosis, Edinburgh e. a., 73 83, 1981.

55. O'Brien J. R. Platelet aggregation. Part 2. Some results from a new method of study, 15(2), 452-458, 1962.

56. O'Malley Т., Ludlam C.A., Fox K.A., Elton R.A., Measurements of Platelet Volume using a variety of different anticoagulant and antiplatelet mixtures, Blood Coagul Fibrinolysis, 7, 431-436, 1996 Jun.

57. Packham M.A., Mustard J.F., Progress in hemoatatis and thrombosis, v.7, Ed T.H.Spaet., New-York, 15-47, 1984.

58. Penington D.G., Lee N.L.Y., Roxburch A.E., McGready J.R. Platelet density and size: The Interpretation of heterogeneity. British J.of Haematology, 34, 365-376, 1976.

59. Pizzoferrato A, Arciola CR, Cenni E, Ciapetti G, Sassi S., In vitro biocompatibility of a polyurethane catheter after deposition of fluorinated film, Biomaterials, Mar, 16(5), 361-7, 1995.

60. Purcell E.M., On the absorption and emission of light by interstellar grains, Astrophys. J., 158,433-440,1969.

61. Reininger A.J., Korndorfer M.A., Wurzinger L.J., Adhesion of ADP-activated platelets to intact endothelium under stagnation point flow in vitro is mediated by the integrin alphallbeta3, Thromb Haemost., 79(5), 998-1003, 1998.

62. Ruggeri Z.M., Mechanisms of shear-induced platelet adhesion and aggregation, Thromb. Haemost., 70, 119-123, 1993.

63. Shvalov A.N., Soini J.T., Chernyshev A.Y., Tarasov P.A., Soini E., Maltsev V.P., Light-Scattering Properties of Individual Erythrocytes, Applied Optics, 38, 230-235, 1999.

64. Siess W, Molecular mechanisms of platelet activation, Physiol. Rev., 69, 58-178, 1989.

65. Slack S.M., Cui Y., Turitto V.T., The effects of flow on blood coagulation and thrombosis, Thromb. Haemost., 70, 129-134, 1993.

66. Soini J.T., Chernyshev A.V., Haminen P.E., Soini E., Maltsev V.P., A New Design of the Flow Cuvette and Optical Set-Up for the Scanning Flow Cytometer, Cytometry 31(2), 78-84, 1998.

67. Tsai W.C., Pogorzelski R.J., Eigenfunction solution of the scattering of beam radiation fields by spherical objects, J. Opt. Soc. Am., 65, 1457- 1463, 1975.

68. V.P. Maltsev, A.V. Chernyshev, Method and device for determination of parameters of individual microparticles, US Patent Number: 5,650,847. Date of patent: Jul. 22, 1997.

69. Waples L. M., Olorundare О. E., Goodman S. L., Lai Q. J. and Albrecht R. M., Platelet polymer interactions: Morphologic and intracellular free calcium studies of individual human platelets, Journal of Biomedical Materials Research, 32, 65-76, 1996.

70. Washington C., Particle size analysis in pharmaceutics and other industries. Theory and practice, Ellis Horwood Ltd, 1992.

71. White J.G., An overview of platelet structural physiology, Scanning microscopy, 1, 1677-1700, 1987.

72. White J.G., Cell biology and secretory process, Ed. Cantin M., Basel, 546-570, 1984.

73. White J.G., Clawson C.C., Gerrard J.M., Platelet ultrastructure, Haemostasis and thrombosis, Edinburgh e. a., 22-49,1981.

74. White J.G., Ultrastructural modification in platelet membranes and cytoskeleton following activation, Blood Cells, 9, 237-261, 1983.