Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Мембраноактивные свойства терпеноидов растений рода Ferula

ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Мембраноактивные свойства терпеноидов растений рода Ferula"

АКАДЕМИЯ НАУК РЕСПУБЛИКИ УЗБЕКИСТАН ИНСТИТУТ ФИЗИОЛОГИИ И БИОФИЗИКИ

рг5 оа i 6 шоп

I w ,l,v На правах рукописи

УДК 577. 352.465 АБРАМОВ Андрей Юрьевич

МЕМБРАНОДКТИВНЫЕ СВОЙСТВА ТЕРПЕНОИДОВ РАСТЕНИЙ РОДА

Ferula

(03.00. 02 - биофизика)

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации па соискание ученой стелит кандидата биштогпческпх наук

ТАШКЕНТ-1998

Работа выполнена на кафедре биофизики биолого-почвенного факультета ТашГУ им. М Улугбека и в институте физиологии и биофизики АН РУз. : I ,

Научный руководитель: к. 0. н., доц. М. К Замараева

Официальные оппоненты: д.б,н.,проф£. А. Салахутдинов

д. 0. н., фоф. Р. К Ахмеров

Ведущая организация: Институт биохимии АН РУз.

Защита состоится" " 1998 г. в №

часов на заседании специализированного совета Д 015. 01. 01 по защите диссертаций на соискание ученой степени доктора наук при Институте физиологии и биофизики АН РУз по адресу. 700095, Ташкент, ул. Ниязова, 1.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института физиологии и биофизики АН РУз.

Автореферат разослан " ЪгО " МйЯ__1998 г.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Мембраноактивные соединения, способные избирательно модифицировать структуру и проницаемость биологических мембран, успешно используются при решении фундаментальных проблем физико-химической биологии, а также некоторых прикладных вопросов медицины, сельского хозяйства и др. [Овчинников, 1987; Таамухамедов.и др., 1987].

Наличие у соединений мембраноактивных, в том числе и ионо-форных свойств,, обеспечивает их высокую биологическую и фармакологическую активность. Так в последнее время обнаружены Са2+-ио-нофорные свойства у., ряда фармакологических препаратов (анальгетиков, противовоспалительных и гипоглккемических агентез) и пестицидов [Chavez et al., 1993; Neigh, Ananthanarayanan, 1995; Bakka-li et al., 1S95J. ■

Терпеноиды являются обширным классом природных соединений, представители которого обнаружены во всех живых организмах. Биологическая активность многих терпеноидов обусловлена мембраноак-тивными свойствами и в ряде случаев сходна с эффектами Са2+-ионо-форов на целостном организме. В частности, терпеноиды, выделенные из растений рода Ферула проявляют зстрогенную активность и эффективно влияют на обмен Са2+ и Са2+-зависимые процессы в организме САхмедходжаева, 1987; Игнатков и др., 19903. Однако их действие на уровне клеток и мембран не изучено.

Дель и задачи исследования. Целью настоящей работы является исследование мембраноактивных свойств у терпеноидов, выделенных из растений рода Ferula. D связи с поставленной целью были определены следующие задачи.

1. Изучить влияние терпеноидов из Ферулы - ферутинина, феру-тидина, тенуферидина, лапидина и ладиферина на проводимость пленарных бислойных липидных мембран;

2. исследовать действие терпеноидов на проницаемость внутренних мембран митохондрий для катионов;

3. исследовать эффекты терпеноидов на уровень внутриклеточного кальция в основных внутриклеточных Са2+-пулах тимоцитов;

4. изучить влияние различных доз терпеноидов на энергетический метаболизм тимоцитов;

5. рассмотреть зависимость мембраноактивкых свойств терпено-идов от особенностей их химической структуры.

Научная новизна работы. В настоящей работе впервые исследованы мембраноактивные свойства нескольких терпеноидов - сложных зфиров сесквитерпеновых спиртов каротанового ряда, выделенных из растений рода Ферула, выявлены некоторые важнейшие закономерности взаимосвязи "структура - активность".

На БЛМ и мембранах митохондрий впервые продемонстрирована Са2+-ионофорная активность у ферутинина, ферутидина и тенуфериди-на.

С помощью Са2+- чувствительных флуоресцентных зондов (хлор-тетрациклина и Рига-2АМ) впервые исследовано действие указанных терпеноидов на уровень свободного и мембраносвязанного Са2+, обнаружена способность ферутинина, ферутидина и тенуферидина увеличивать ССа2+]1П. с помощью селективных ингибиторов впервые показано дозозависимое влияние терпеноидов растении рода Ферула на аккумуляцию Са2+ во внутриклеточных компартментах и активность кальмодулин-зависимых реакций.

Научно-практическое значение работы. Проведенные исследования существенно расширяют имеющиеся представления о механизме действия применяемого в акушерстве и гинекологии препарата те-фэстрол (феругинин), а также паноферода (смеси растительных терпеноидов из растений рода Ферула), используемого в птицеводстве. Выявленные особенности мембраноактивных свойств ферутинина, ферутидина и тенуферидина создают предпосылки применения данных соединений и в других областях медицины, сельского хозяйства, а также в практике научных исследований.

Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на Международной научной конференции "Влияние физико-химических факторов на метаболические процессы б организме" (Андижан, 1997), на 2 Конференции молодых ученых, посвященной памяти акад. С.Ю.Юнусо-ва (Ташкент, 1998).

Публикации. По теме диссертационной работы опубликованы 2 статьи и 1 тезис.

Структура диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора, литературы (гл.1), описания материалов и методов исследования (гл.2), изложения полученных результатов и их обсуждения (гл.З), заключения, выводов и списка цитируемой литературы, вклю-

чзюдбго 147 ссылок. - Работа-, изложена., ка. .127. страницах msskkoiikcko-го текста и иллюстрирована 24 рис. и 5 таблицами.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Эксперименты проводились на самцах белых беспородных крыс массой 100-150 г. В работе были использованы терпеноиды растений рода Ferula, выделенные в ИХРВ АН РУз, Их структурные формулы приведены на рис.1. —

Планарные бислойные липидные мембраны (БЛМ) формировали по методу Montai, Mueller (1Q72>-из обвдк липидов мозга быка. Катион-анионную селективность модифицированных мембран оценивали по величинам потенциалов- нулевого тока в- присутствии близкого к трехкратному градиента хлоридов одно- и двухвалентных катионов (50/150 мМ; цис/транс и 5/15 мМ; цис/транс, соответственно). Ка тион-катионная селективность БЛМ оценивалась по величинам биион-ных потенциалов в системе 20 мМ/10 мМ при сравнении одновалентных и двухвалентных катионов и 10 мМ/Ш Ш в ряду двухвалентных.

Взаимодействие терпеноидов с биомембранами определяли по изменению интенсивности флуоресценции АНС СДобрецов, Владимиров, 19801 на спектрофлуориметре ОФР-1 (Россия) в среде, содержащей 100 мМ КС1, 30 мМ трис-HCl, рН 7,0.

Выделение фрагментов мембран саркоплазматического ретикулума производили до методу Гитова,, Мурзахметовой (1932).

Тимоциты выделяли кз тимуса крыс по ранее описанному методу ССукочева, 1996] в среде А, содержащей 4,6 ¡¿V, КС1, 145 NaCÏ, 10 мМ 'ilepes, 1 ы>,! KH2PO4, 10 MM пирувата "a, 1 ¡.S.! СаС1у> (или без него); рН 7,4. В течение эксперимента клетки хранили на ледяной бане. Дыхание гиыоцитов регистрировали полярографически б среде А, при 37° С с помощью кислородного электрода Кларка ГМохова и др., 19873.

Для измерения количества мембраносвязанного к клеткам, помещенным в среду А, добавляли 20 мкМ ХТЦ и инкубировали 60 мин. Флуоресценцию ХТЦ регистрировали на спектрофлуориметре СФР-1, при длине волны возбуждения - 405 нм, регистрации - 530 км.

Для- измерения уровня' цитозольного кальция - [Са2+3 i п тимоци -тов использовали флуоресцентный зонд Fura-2AM. ГСа2+]1П рассчитывали, как описано ранее [Суконева, 1997].

С Н, CHT_

/"•А*"".......X y^l"'

v-^ <:Нз О- сн'

нет"! Н « нсГ| Н i „

А Ö-C-f ОН Л _°

Н.С СН. Д --HjC сн, О

сн»

К---0 V- сн»

но Л " ¿-с он

н,с сн, £ '

3

о

о .. „ о-с-сн»

Н»с 1 Н.С V

< j '"■•>- СИ, < I с и,

+•-__..-' Gib V--K_ОН,

! L Г" I нп'1 м Г~Г _ I

НО л Н 6-С-С-СН но Л н ¿-с-г.-сн

Н,С СН, <5 CHj Н.С сн- ¿к.

Рис. 1. Структурные формулы сложных эфиров сесквитерпено-вых сгофтов каротанового ряда. 1 - ферутинин; 2 - ферути-дкн; 3 - тенуфервдин; 4 - лапидин; 5 - лапифермн.

Б таблицах и рисунках представлены средние значения ип ь-fi ловторностей.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

1. Влияние терпеноидов на проводимость БЛМ.

В ^г/'неркментах на БЛМ нами установлено, что не .чявиеимо от ионного состава омывающих БЛМ растворов» добавление лапидина или лапиферина- (в концентрациях до £¡00 мкМ) не влияло на проводимость биолоев. Однако в присутствии ферутинина, тенуф>фидина или /рерути-дина проводимость WIM начиная с й-5 мнМ терпеноидов до:-теависимо

увеличивалась (рис.2). Конечная величина проводимости бислоя зависела от того, с одной или с двух сторон был добавлен терпеноид, в последнем случае проводимость была значительно выше.

Вольт-амперные характеристики БЛМ, модифицированных ферутинином, ферутидином или тенуферидином, были линейными и симметричными относительно нуля потенциалов в области от -150 до +150 мВ.

Изучение катион-анионной избирательности бислоев, модифицированных терпеноидамн, показало, что мембраны преимущественно катион-селективны при использовании растворов как одно-, так и двухвалентных электролитов. Так, потенциал нулевого тока (V*) при трехкратном градиенте концентрации NaCl (50мМ/150мМ; цис/транс) был равен 13,4+0,2 мВ для ферутинина, 13,9+0,1 мВ для ферутидина и- 12,8+0*2-для тенуферидина. Установленные значения V* примерно вдвое меньше ожидаемых (*-26 мВ) для мембран с идеальной катионной селективностью. Катион-анионная селективность модифицированных липидных бислоев была значительно выше, когда бислой разделял растворы 2:1-электролитов. Потенциал нулевого тока в системе 5 мМ (цис)715 мМ (транс) СаС1г равнялся 12,5+0,5 мВ, если БЛМ были модифицированы ферутинином. В аналогичных условиях для мембран, модифицированных ферутидином и тенуферидином измеренные величины V*. были несколько меньше и составляли 9,9+0,5 мВ и 9,7+0,7 мВ, соответственно, при теоретически ожидаемом значении 12,5 мВ для данного градиента CaClg. Следовательно, модифицированные тенуферидином и ферутидином мембраны высоко селективны для ионов Са2+, тогда как модифицированные ферутинином - селективны идеально.

При проведении сравнительного анализа селективности модифицированных мембран для различных ионов было установлено, что из меренные биионные потенциалы в системе 10 мМ CaClg (цис)/20 ММ NaCl (транс) были равны: -9,2±0,4 мВ, -б,7±0,2 мВ и - Э,4±0,3 мВ, а в системе 10 мМ СаС1г (ЦИс)/20 мМ КС1 (транс): -5,5±0,5 мВ, -5,9±0,3 мВ и -7,0±0,1 мВ для тенуферидина, ферутидина и ферутинина, соответственно. Численные значения коэффициентов проницаемости для бислоев, модифицированных ферутинином, тенуферидином и ферутидином составляли 1,0:0,55:0,52; 1,0:0,57:0,52 и 1,0:0,57:0,56, соответственно. Согласно приведенным данным, исследуемые катионы в порядке уменьшения коэффициента их проницаемости располагаются в ряд: PCa2+>FK+>PNa+.

Оценку относительной проницаемости различных двухвалентных

1-3(0. нс/см2 в ■ 5 ■ 4 •

3

г 1

/ , //

/

/У

л; у

/ V

1

г |-9(с). ««м

Рис. '¿. Зависимость проводимости ВЛК от концентрдции ■№})-пеноидав. 1 - ферутинин: 2 - ферутидин; 3 - -генуферидин Терпеноидн вносились в оба отсека экспериментальном ячейки Среда- Ь мМ СаСД, 1 иИ трис-Н(Л. рН 7.5. Концентрации терпеиоидов даны на оси абсцисс.

Ыд(б) пй/мп §-

43г-

. 5

Аг

//

Л

4 ткМ

Рис. .4 навмсикость ороиодимости модмфицироканны* кяй от концентрации ионов са- ' Среда: 1 мМ трно-НЙ, рН У,Ь. 'Конечная концентрация терпеноидов 40 мкМ. 1 - ферутидин- и -тенуферидин•, - ферутинин.

катионов, проводили на модифицированных терпекоидами ВЯЛ, которая разделяла 10 мМ растворы 2:1-электролитов, один из которых (в цис-отсеке экспериментальной ячейки) всегда был раствором СаИг.

Для ЕЛМ, модифицированных любым из трех мембраноактивных терпеноидов, испытуемые катионы по их способности проникать через бислой располагаются в ряд:

2п2+ >Са2+ > Ме2+ > Ва2+ > Зг2+. Однако сами по себе значения коэффициентов проницаемости зависели от конкретного -терпеяоида г составляли: 1,11 : 1,0 : 0,86 : 0,81 : 0,70 для ферутинина, 1,7 : 1,0 : 0,89 : 0,85 : 0,69 для ферутидина, 1,17 : 1,0 : 0,88 г- О¿86 г 0,49 для тенуферидина. Полученные результаты позволяют заключить, что модифицированные терпеноидами мембраны хорошо-дискриминировали одно- и двухвадент-ные ионы, а их Са2+/Мг2+- селективность была даже выше, чем у мембран, модифицированных такими кальциевыми ионофорами как А 23187 и X 537-А.

Для оценки минимального числа молекул терпеноидов, образующих комплекс ионофор:катион, мы изучали зависимость стационарной проводимости БЛМ от концентрации ферутинина, ферутидина или тенуферидина. В условиях, когда терпеноиды добавлялись в оба отсека ячейки, установлено, что зависимость стационарной проводимости БЛМ от концентрации исследованных соединений (6-60 мкМ) была линейна в двойных логарифмических координатах (рис. 2), Тангенс угла наклонов равнялся 2,1±0»2.двя ферутидина».. 2,8±0»3 - для тенуферидина и 2,9±0,3 - для ферутинина. Полученные результаты позволяют предположить, что как минимум 2 молекулы терпеноидов формируют токо-переносящую структуру.

Однако для установления возможной стехиометрии комплекса необходимо знание о количестве переносимых ионов одной токо-переносящей структурой. Анализ стационарной проводимости модифицированных ВШ от концентрации Са2+ показывает (рис.3), что эти зависимости были линейны в двойных логарифмических координатах и имели величину наклонов 1,44 для ферутидина, 1,92 для тенуферидина и 1,88 для ферутинина. Полученные данные позволяют предположить, что в формировании токо-переносящего комплекса принимают участие 2--3-молекулы терпеноидов и 1-2 иона Са2+. Не исключено, что эти комплексы образуют структуру типа "сэндвича", аналогично другим известным Са2+-монофоров - А 23187 и X 537А СТпЛег, 1976]. Одна-

КО В ОТЛИЧИб ОТ КЗрбОКСИЛЗхКЫл ИОпОфОрОБ, ОСуЩёСТЕЛЯВЩИХ

Са2+/2Н+-обмен, мембраноактивные терпеноиды работают б электрогенном режиме и генерируют трансмембранный потенциал.

С целью выявления взаимосвязи особенностей структуры и мембранной активности нами было проведено исследование ыембранотроп ности терпеноидов с использованием флуоресцентного зонда поверх ностной локализации АНС. Было показано, что добавление терпеноидов к мембранам саркоплазматического ретикулума (СР) приводило к снижению интенсивности флуоресценции АКС на 33%, 25% и 2СХ для ферутинина, тенуферидина и ферутидина соответственно. Соединения с алифатическими заместителями мембранотропкыми эффектами практи чески не обладали. Так, лалидин уменьшал интенсивность флусрес Ц&НЦдо! А11С только на 7%, а ланиферин вообще не влиял на флуоресценцию данного зонда. Уменьшение уровня флуоресценции АНС, очевидно, обусловлено вытеснением АНС из мембран СР гидрофобными соединениями. По-видимому/ наличие ароматических групп в молекулах терпеноидов придает им необходимую липофильность и, соответственно, оптимизирует процесс встраивания в мембраны.

Таким образом, нами показано, что соединения, проявляющие эстрогекную активность - ферутинин, ферутидин, тенуферидин, обладают ионофорными свойствами. Предполагается, что данные эффекты обусловлены наличием в структуре этих терпеноидов ароматических заместителей, т.к. близкие по строению лапидин и лапиферин, во имеющие в качестве заместителей алифатические кислоты, ионофорной и эстрогенной активностями не обладали.

2. Влияние терпеноидов на проницаемость меыбрая митохондрий

Исследование мембранной активности терпеноидов в условиях регистрации кинетики энергонезависимого набухания митохондрии в растворах нитрата кальция показало, что лапидин и лапиферин так же, как и в экспериментах на БЛМ, мембраноактивными свойствами не обладали. С другой стороны, соединения с ароматическими заместителями (ферутинин, ферутидин и тенуферидин) в концентрации 25 мкМ увеличивали пассивную проницаемость мембран митохондрий для ионов Са2+ в 3-5 раз (рис. 4). Скорость набухания митохондрий в растворе нитрата Са2+ растет линейно в присутствии 1-25 мкМ терпеноидов, при дальнейшем увеличении концентрации наблюдается постепенный эффект насыщения.

А/А в

Г-

И -5-

3

г-1 -о

2,5 6.35 12,5 »5 Э7.3

[С] прпенсидов, мкМ

Ию. 4. Действие терпеноидоа на энерпженаяисимое набухание митохондрий в растворе нитрата кальция. 1- лапт»»: 2 - лапиферин; я - ферутндин4 - тенуферидин ь - Ферути-нин. На оси ординат относительное изменений проницаемости мембран митохондрий А/До, где А и До - скорости напухания в опыте и контроле-соответственна.

Рис {.». Клияни« растительны« тери^номдо» на иите««;ивв<ч:ть КГЦ флуоресценции суспеиаии тимонитов в среде, содержащей Саг-< при добавлении г мМ 31ТА. я - контроль; О - Ферути-нин; в - ферутидин; г - тенуферидии; Цифрами обозначены концентрации используемы» веществ: 1 - 1') мкМ; P-P.fi мкМ: 3-50 мкМ; 4 - 100 тМ. ((редставлены данные одного из трех аналогичных экспериментов. ;

Исследаванныг.саединения. существенно слабее влияли на проницаемость мембран митохондрий в средах с нитратами одновалентных катионов. При этом индуцированная ими проницаемость (при концентрации 25 мкМ терпеноидов) относительно Са2+ может быть представлена отношением:

Са2+: К+: Н+ - 1,0 : 0,3 : 0,2 : 0,18

(Увеличение проницаемости по Са2+ было принято за 1) Достаточно высокая селективность к ионам кальция наблюдается и в сравнении с другими двухвалентными катионами. Относительный ряд проницаемости мембран митохондрий, индуцированных терпеноида-ми, для двухвалентных катионов выглядит следующим образом: Са2+ : : Ва2+ : а:2+ - 1,0 : 0,56 : 0,55 : 0,17

Таким образом, изучение влияния терпеноидов растений рода Ферула на пассивную проницаемость внутренних мембран митохондрий показало, что соединения с ароматическими кислотами (ферутинин, ферутидин и тенуферидин) индуцируют проницаемость для двухвалентных катионов с высокой селективностью к ионам Са2+. Ряд селективности для всею трех мембраноактивных сесквитерпеиов в основном совпадает с таковым на БЛМ.

3. Влияние терпеноидов на внутриклеточный Са2+.

При исследовании влияния терпеноидов на уровень мембраносвя-занного кальция в тимоцитах, регистрируемый по флуоресценции ХТЦ, нами было установлено, что большему, снижению интенсивности флуоресценции при добавлении 2 мМ ЗГТА к тимоцитам, стимулированным ферутинином, ферутидином или тенуферидином, соответствуют большие . количества мембраносвязанного Са2+, доступного для ЗГТА (рис.5). Следует отметить, что данные эффекты наблюдались только в том случае, когда среда содержала 1 мМ СаС1г. Исходя из этого можно заключить, что вызванное исследуемыми соединениями увеличение связывания Са2+ на плазматической мембране обусловлено поступлением его извне.

В экспериментах," выполненных на тимоцитах с помощью зонда П1га-2АМ, было показано, что ферутинин, ферутидин и тенуферидин в диапазоне концентраций 2-100 мкМ дозозависимо увеличивали уровень цитозольного кальция, (рис.. б) . При этом максимальные значения 1п составляли - 230 нМ, 245 нМ и 275 нМ для 100 мкМ ферути-дина, тенуферидина и ферутинина соответственно. Обработка тимоци-

тов блокаторами Са2+-каналов верапашлом (0,1 мМ) и N'i2+ (0,1 мМ), а также SH-реагентом тимеросалом (рис.7), не влияла на повышение [Ca2+]jn, стимулированное терпеноидами.

Терпеноиды с алифатическими заместителями - лапидин и лапи-ферин не влияли на уровень [Са2+]щ тимоцитов, не зависимо от наличия Са2+ в среде.

Увеличение уровня [Са2+Эт, индуцированное терпеноидами на фоне действия блокатора кальмодулина (3 мкМ кальмидазолиума, R24) было несколько выше, чем в случае добавления терпеноидов в отсутствие ингибитора. Это связано, по-видимому, с тем, что в присутствии R24 не -проявляется активирующий эффект комплекса Са2* -кг-,ймодулин на Са2+-АТФазу плазмалеммы, так как известно, что кальмодуяин-влияет на ряд клеточных процессов и активностей, в том числе - Са2+-ДТФазу плазмалеммы CCarafoll, 1892]. Данные результаты можно объяснить следующим образом - увеличение уровня цитозольного Са2+, вызванного действием терпеноидов, включает капьмодулин-зависимые механизмы откачивания Саг+ из цитозоля (в частности; Саг*-АТФаза плазмалеммы). Вклад их в поддержание Са2+-гомеостаза клетки тем выше, чем на большую величину растет lCa¿+l\n в присутствии ингибиторов кальмодулина.

Обработка тимоцитов тенуферидином в диапазоне концентраций от 2 до 50 мкМ в среде, не содержащей 1 Ш CaClg, не сопровождалась заметным повышением [Са2+]1п. Однако при увеличении концентрации терпеноида до 75 мкМ и выше происходило увеличение уровня цитозольного Са2+, регистрируемое по повышению интенсивности флуоресценции Fura-2AM. Аналогичные результаты были получены для фе-рутинина. В случае ферутидина увеличение уровня цитозольного кальция отмечалось при концентрации 50 мкМ и выше.

Таким образом, стимулированное ферутинином, ферутидином, тенуферидином повышение CCa2+]jn при высоких концентрациях терпеноидов обусловлено не только переносом Са2+ данными соединениями через плазматическую мембрану, но и влиянием на внутриклеточные компартменты.

В связи с приведенными выше данными, представляло интерес исследовать с помощью Fura-2AM и ХТЦ влияние терпеноидов на расп ределение Са2+ во внутриклеточных Са2+ депо.

Величину мктохондриального пула Са2+, как в экспериментах с Fura 2АМ. так и с использованием ХТЦ, определяли по изменек'иВ га

20В ,

\ /

■Х N \

I 1 1 1 I 1 1 1

АО 19" 10 0

|С| фсрувщик. *«М

Нис. 6. Завксниосге каменения (Са химопитой «и- «он-центрацяи ферутидичэ, 1 - увеличение 10а;. ;3 - я лтнот на добавление Перутидина: й - инмененик Н'-я ' ь.. фнрутидикс-тимулировэнных тимоцдаг® в от^ет на доГктление 1 мкМ янти-тмцина А; -Ч - изменение <0а I ■. ферутидансткмулировднных тммоцнтов в ответ на добавление :< ыкМ №(„'. Ородл инкубации А. Цредгтавяени средние значения Ь экспериментов.

200..

100

Рио. 7. Изменение 1«э;-''1:. тикоцитов при ооследиватяльиом добавлении 0.1 мМ верапамила или 0.1 мМ Ыг " (3), ИЬ миМ ферутинина (Ф) и тимеропалэ (Т) 1 - мхМ флрутмнинлт ? - 1 мкМ тимерос:злэ *• 2Ь мкМ ферутинина; У - К\ <1.1 мМ * 26 мкМ Ферутинина. Представлены ианнче одного из трех экспериментов.

ТёКСКВНОСТИ цмТу'ОреСЦеКцИИ Б ОТБсТ КЯ 1 ЫлМ аНТйМИЦИНсг А. р'/ТИ' няи, ферутидин и хенуферидин в среде содержащей 1 мМ СаС1г способствовали аккумуляции Са2+ в митохондриях при концентрации 25 мкМ и выше (рис.6), а в бескальциевой среде аналогичный эффект наблюдался при концентрации ферутнзява и тенуферидина 75 мкМ и выше (ферутидин - 50 мкМ).

Полученные нами результаты по аккумуляции Са2+ б митохондриях согласуются с данными о регуляции терпеноидами дыхания тимоци тов крыс. Было показано, что внесений терпеноидов с ароматическими заместителями в полярографическую ячейку вызывало дозо;>ависи-мую стимуляцию дыхания и разобщение окислительного фосфорилирова-ния. Активация дыхания тимоцитов стимулированных терпеноидами на фоне ионов Сай+-коррелирует с аккумуляцией Са2+ в митохондриях.

Терпеноиды с алифатическими заместителями (лапидин и лапифе-рив) в наших экспериментах не оказывали влияния на дыхание и окислительное фосфоршшрование тимоцитов крыс.

Стимуляция клеток митогеном кошсававалином А (20 мкг/мл) сопровождается ' изменением содержания арахидоновой кислоты и ее метаболитов, "опустошением" немитохшдриалышх пулов Са2+, что приводит к повышению уровня [Са2+3т. Как было показано нами, фе-рутинин, ферутидин, тенуферидин в концентрациях 25-50 мкМ, т.е. в дозах, приводящих к увеличению как [Са^Зт, так и количества аккумулированного Са2+ во внутриклеточных органеллах, блокировали ССа2+]1п-повышающий эффект конканавадква А.

Известно, что в присутствии ингибиторов Са2+ АТФазы ретику-лума ортованадата (0,5 мМ) или ВИЧ (10 мкМ) происходит выход Са2+ из ЗПР в цитозоль, что регистрируется как уменьшение интенсивности флуоресценции ХТЦ или увеличение флуоресценции Гига-2.

Действие исследованных терпеноидов на немитохондриальный Оаг+-пул было разнонаправленным в зависимости от использованной их концентрации (рис.6). Так, при 25 и 50 мкМ ферутинин и тенуферидин (ферутидин только при 25 мкШ способствовали увеличению аккумуляции Са^в ЗПР. При увеличении концентрации терпеноидов до 75-100 мкМ (для ферутидина - начиная с 50 мкМ) наблюдался значительный выброс Са2+ из немитохондриального пула. Аккумуляция Са2+ в зндоплазматическом ретикулуме, индуцированная сесквитерпенами обусловлена, по-видимому, клеточным ответом на повышение уровня цитозольного Са2+. Увеличение концентрации исследуемых соединений

Рис. 8. Изменение [Са2+3}П тимоцитов при последовательном добавлении: 1. 50 нЫ иономицина, 1 шкМ Антимицина А, 10 мнМ В®}. Среда инкубации А. К - контроль.

приводит либо к ингибированию Саг+-АТФазы ретикулума, либо к действию данных веществ как Са2+-ионофоров, т.е. переносу Са2+ по ионному градиенту из ретикулума в цитозоль, подобно тому, как действуют ионофоры иономицин и А 23187 (рис. 8). В последнем случае, однако, достаточно сложно объяснить устойчиво высокий уровень Са2+ в митохондриях, который сохранялся даче в присутствии значительных концентраций терпеноидов.- Это различие может быть объяснено с учетом того, - что как ферутинин и тенуферидин (75 мкМ ; и' выше), так и ферутидин (50 мкМ и выше), ингибируют Са21"-АТФазу ' эндоплазматического ретикулума, аналогично тому, как это показано для Са2+-АТФазы саркоплазматического ретикулума Г2ашагаеуа et а!., 1898; Левицкая и др., 19983.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Согласно полученным з настоящей работе данным, биологическая активность исследованных соединений из группы сложных зфиров сесквитерпенсвьк спиртов каротанового ряда: ферутинина, ферутиди-на и тенуферидина, коррелирует с наличием у них ионофорных свойств по ряду катионов, и, что особенно ватою, - с высокой селективностью к ионам кальция.

В выполненной нами работе были использованы пять близких по структуре терпеноидов, выделенных из растений рода Ферула: феру-тиаин, ферутидин, тенуферидин, лапидин и лапиферин. Основным различием между ними является природа заместителей, в соответствии с которой исследуемые терпеноиды можно разделить на две основные группы: (1) соединения, имеющие в качестве заместителей ароматические кислоты (ферутинин, ферутидин и тенуферидин); (2) соединения, имеющие в качестве заместителей алифатические кислоты (лапидин и лапиферин).

Терпеноиды первой группы проявляли ионоферные свойства как на биологических, так и искусственных мембранах, тогда как лапидин и лапиферин мембраноактивных свойств не проявляли. Мембравот-ропные свойства исследуемых соединений обусловлены наличием ароматических заместителей, которые придают молекуле необходимую ли-пофильность. Это предположение подтверждают эксперименты по вытеснению терпеноидами зонда поверхностной локализации АБС из мембран саркоплазматического ретикулума.

Изучение ионной селективности ферутинина, ферутидина и тенуферидина показало, что эти соединения преимущественно катион-селективны. Все три ионофора проявили высокую избирательность к двухвалентным катионам: Са2+> Ма"1"» К+> Н+. Ряд селективности по двухвалентным катионам имел следующий вид: 2п21">Са2+ > Мг2+ > Ва2+ > Бг2+.

Небольшие различия в структуре терпеноидов первой группы не влияли на ионофорные свойства. Ряд селективности, полученный на митохондриях и на ЕДМ, для всех трех соединений совпадает, небольшие изменения наблюдаются лишь в численных значениях этого ряда и в стехиометрии комплекса ионофор Са2+. Для ферутинина и тенуферидина (заместитель п-оксибензойная кислота) это значение близко к 3:2, а для ферутидина (метоксибензойная кислота) - 2:1.

Результаты,, полученные нами с использованием Са'^"1"- чувствительных флуоресцентных зондов, позволяют предполагать, что ионо-форные свойства ферутшшна, ферутидина и тенуферидина на уровне целостной клетки проявляются преимущественно на плазматической мембране, что приводило к повышению [Са2+]1П. В силу особенностей растворимости в воде и липидах концентрация терпеноидов, которая создается во внутриклеточных мембранах, по-видимому, существенно низке той, которая имеет место на плазматической мембране. В результате повышения ССа2+]1п происходило накопление Са2+ во внутриклеточных депо, что регистрировалось как. увеличение митохондри-ального и немитохондриального Са2+-пула. Повышение [Са^Зщ приводило также к активации кальмодулин-зависимых систем "уборки" Са2+ из цитозоля. В связи с вышеизложенным, увеличение [Са2+31П, индуцированное терпеноидами было меньше, чем в случае А 23187 и иономицина [Макаров, 1984; Сурин и др., 19923. В присутствии классических кальциевых ионофоров происходит выход Са2+ по концентрационному градиенту из митохондрий и ЗПР в цитозоль Сбикоуэ-кауа еЪ а1., 1983; 1986; Сурин и др., 19923. Терпеноиды не проявляли подобных свойств на мембранах внутриклеточных органелл, по-видимому, из-за обсуждавшейся низкой их концентрации во внутриклеточных мембранах. Данной особенностью, по-видимому, объясняется также низкая токсичность исследуемых терпеноидов.

Изучение влияния терпеноидов на энергетический метаболизм тимоцитов показало, что соединения,.....проявляющие ионофорные свойства (ферутинин, ферутидин и тенуферидин), изменяли параметры дыхания и окислительного фосфоршшрования, а лапидин и лапиферин на... них не влияли. Активация дыхания и разобщение ОФ коррелирует с аккумуляцией Са2+ в митохондриях при использовании аналогичных концентраций терпеноидов.

Особености ионофорных свойств" терпеноидов, в силу своей растворимости действующих преимущественно на Са2+-проницаемость плазматических мембран, по-видимому, обусловливают обнаруженную ранее эстрогенную активность.'

рнрпду.1

1. Исследованы мембраноактивные свойства 5 сложных эфиров сесквитерпеновых спиртов каротанового ряда, имеющих в качестве заместителей ароматические кислоты (ферутинин, ферутидин и тену-

феркднн) и алифатические кислоты .(лапвдин.и лапиферик) на проницаемость искусственных (БЛМ) и биологических мембран, внутриклеточное распределение Са2+ и энергетику тимоцитов.

2. Обнаружена ионофорная активность ферутинина, ферутидина, тенуферидина по двух- и.одновалентным катионам на БЛМ , мембранах митохондрий и интактных тимоцитах. Показано, что данные терпенои-ды обладают высокой избирательностью к двухвалентным катионам в соответствии со следующим рядом: Zn2+> Са2+ > Mg2+ > Ва2+ > Sr2+.

3. Установлено, что ферутинин, ферутидин, тенуферидин в диапазоне концентраций 2-60 мкМ осуществляют на БЛМ электрогенный перенос катионов. Потенциал нулевого тока в системе 5 мМ/15 мМ СаСЬг равнялся 12,5+0,5 мВ; 9,9+0,5 MB; 9,7+0,7 мВ для ферутинина, ферутидина и тенуферидина соответственно. Зависимость стационарной проводимости от концентрации терпеноидов, а также от концентрации Саг+ при фиксированном значении терпекоида (40мкМ) линейна в двойных логарифмических координатах. В соответствии с значением угла наклона предполагается стехиометрия комплекса тер-пеноид:Саг* для ферутидина 2:1, а для ферутинина и тенуферидина

о. о

О. к.

4. Установлено, что лапидин и лапиферин в концентрациях до 200 мкМ не изменяют проницаемость БЛМ и мембран митохондрий, а также не влияют на энергетический метаболизм тимоцитов.

5. Показано, что соединения с ароматическими заместителями - ферутинин,.. ферутидин и тенуферидин, в отличие от соединений с алифатическими заместителями, обладают большей мембранотропностью о чем свидетельствует вытеснение данными соединениями зонда по верхностной локализации АНС из мембран СР.

6. Ферутинин, ферутидин, тенуферидин (5 100 мкМ) на интактных тимоцитах проявляют ионофорные свойства на плазматической мембране, ч то сопровождается увеличением [Са' Jin мембранссвя занного Са*+ плагмалеммы. Наблюдающаяся аккумуляция кальция в митохондриях и ЗПР, индуцированная низкими концентрациями терпене;; доб, обусловлена повышением [Са^т. При увеличении концентрации терпеноидов (50-75 мкМ) наблюдалось уменьшение Са2+-пула ЭПР и дальнейшее увеличение митохондриального Са2+-пула.

7. Установлено дозозависимое влияние терпеноидов на энергетический метаболизм тимоцитов. Терпеноиды, обладающие ионофорными свойствами, активировали дыхание тимоцитов за счет разобщения

СКИС^уП*еЛ1ЬКрГО'фОСфОрИЛИрОВа£ИЯ. Б ПРИСУТСТВИИ ТврибКОИДСВ В Са2+-содержадей среде активация дыхания тимоцитов, индуцированная терпеноидами, коррелирует с аккумуляцией- кальция в митохондриях.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Замараева М.В., Гагельганс А.И., Абрамов А.Ю., Антонова О.В. Влияние терпеноидов растений рода Ферула на проницаемость внутренних мембран митохондрий. // Материалы международной науч. конференции "Влияние физико-химических факторов на метаболические процессы в организме". Андижан Г. 997. Т. 2. С.21-22

2. Zamaraeva M.V., Hagelgans А.I., Abramov A.Y., Ternovskiy V.I., Merzlyak P:G., Tashmukhamedov B.A., Saidkhodzjaev A.I. Io-nophoretic properties of ferutinin.//Cell Calcium. 1997. V.22. N.4. P.235-243.

3. Абрамов А.Ю., Замараева М.В., Гагельганс А.И., Саидходжа-ев А.И. Влияние терпеноидов растений рода Ферула на транспорт и перераспределение мембраносвязанного Са2+ в тимоцитах// Хим. природ, сое Д.1998. Спец. выпуск. С. 139-141.

Ferula авлоди усимидиклари терпеноидларининг мембраноакткв хусусиятлари А.Ю.Абрамав

Ferula авлодига ыансуб 5-та терпеноидларнинг мембран актив хусусиятлари сунъий ва биологик мембраналар утказувчанлигида, хужайра ичидаги Са2+ таксимотида, каламуш тимоцитлари энергетик метабсшизмида урганилди.

Ферутинин, ферутидин ва тенуферидинларнинг икки ва бир ва-лентли катионларга нисбатан ионофор фаолликлари БЛМда митохондрия мембраналарида ва тимоцитларда аникланди. Уабу терпеноидлар селективлик катори куйидагича: Zn2+>Ca2+>Mg2+>Ba2+>3r2+. Ферутинин, ферутидин ва тенуферидин учун катион-анион селективлик кур-саткичлари катионлар буйича идеал курсатгичларга якин булди.

Лапидин ва лапиферин 200 мкМ концентрациягача БЛМ, митохондрия- ва тимоцитларда ионофорлик хусусиятларни курсатмади. Ферутинин, ферутидин ва тенуферидин 5-100 мкМ концентрацияларда базаль CCa2+]in даражасини оширди, бу эса терпеноидлар паст кон-

yeHTpaixHSJiapfla (50 MKMraua) MiiTOxoHSpHiuiap Ba 3Hfl0iuia3MaT№ pe-THKY-ayM Ca-RenocKHHHr OEMarara Ba KeiwrnaMK MWTOxaHHpHaapKaaapfla Ca2+ aracyMyjiHUHScHHHHr awxwra. ojmS yigzz'a.

TepneiiouRJiapKviKr TtfMOUHTJiap 3HepreTHK weTaCojiKswura nosara 6orjiHK Tatcupn amiiuaimM. TaprasOwfla Ca2+ CyjiraH Myxiirra $epyxn-hhh Kynmraima Ha$ac ojntamMHr <JaoJUiiirn MiiToxoHHptiaJiapra Ksoaum aKKyMyxaiWHCH 6miaH MyB03aaaTjia yijw.

Membrane-active properties of the 5 terpenoids isolated from the plants of Ferula genus on permeability of artificial and biological membranes, inracellular Ca2+ destributicn and energetic metabolism of the rat thymocytes were investigated.

Ionophoretic activity of the ferutinin,. ferutidin, tenufe-ridin for mono- and divalent cations was found. These terpenoids showed high selectivity for divalent cations. Permeability ratio is the following: Zn2+>Ca2+> Mg^? Ba^ Sr2+. Value of the cation-anion selectivity for ferutinin, tenuferidin and ferutidin close to ideal for cations.

Lapidin and lapiferin in concentration 1-200 pM on BLM. membranes of mitochondria and thymocytes did not posses ionopho retic activity.

Ferutinin, ferutidin and tenuferidin (5-100 ilV) increase the level [Ca2+lin of thymocytes. As a consequents small concentration (5-50 fiM) of the terpenoids increase Ca^-pcols of mitochondria and endoplasmic-reticulum. At the concentration of terpenoids more than 50 mM Ca2+ accumulation in mitochondria and releasing of Ca2+ from endoplasmic reticulum took place.

Dose-dependent influence of terpenoids on respiration and oxidative phosphorylation of thymocytes were shown. Under effect of terpenoids in Ca2+-contaning medium, activation of respirati on correlate with accumul "' .tochondria.

Ifembrane-active prorerties of the terpenoids of plant Ferula genus A.Y.Airamov

Подписано в печать 19.05.98. формат 60x841/16, оперативная печать, бумага № 1 , усл. п. л. 1 уч.изд.л., тираж.100, заказ №344. Отпечатано в типографии ТашГТУ. Ташкент, Вузгородок, ул. Талабалар, 54.