Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Влияние ионизирующего излучения на функциональные параметры мембран тимоцитов крыс

ВАК РФ 03.00.01, Радиобиология

Автореферат диссертации по теме "Влияние ионизирующего излучения на функциональные параметры мембран тимоцитов крыс"

МОСКОВСКИЙ ОРДЕНА ЛЕНИНА, ОЗДИА ОКТЯБРЬСКОЙ РЕВОЛЮЦИИ И ОРДЕНА ТШОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ ЮСУДАРСТВЕНННЙ УНИВЕРСИТЕТ им.М.В.ЛОМОНОСОВА

На арабах рзгкописп

Павделова Кованна Гворгаэвна

ВЛИЯНИЕ йОЩЗШЩШ ИЗЛУЧЕНИЯ НА ФУНКЦИЮНАЛЬНЫЕ ПАРАМЕТРЫ МЕМБРАН ТКМОЩПЯВ Ж1С,

03.00.01. - рздкобиологад

' АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискнлио у^ено! стешеяп кавдндата бкологлтоскнх на^гк

Ш>снва - 1993

Работа выполнена в лаборатории радиационной биофизики биологического факультета Московского государственного университета им. М.В.Ломоносова.

доктор биологических наук, ведущий научный сотрудник Е.Н.Гончарекко кандидат биологических наук, старший-научный ••сотрудник, ТЛ.1Удэь <.

доктор биологи«ских наук, профессор 13 Л1. Пелевина; доктор биологических наук, профессор Н.И.Рябченко

Всесоюзный кардиологический

центр АМН ССОР Защита состоится ^ мСёт/и? 1991 г. в 15 ча

сов на заседании специализированного совета Д.С53.05.74 по

адресу. Москва 119899, Ленинские горы. Биологический факул

тет -МГУ. ■

С диссертацией мсшю .ознакомиться в библиотеке Биологе ческого факультета 'МГУ..

Автореферат »разослан• ".//Г,'.'. 1991 г. -

(

Научный руководитель:.

Научный консультант:.,

Официальные оппоненты: . -

Ведущая организация:1

Ученый секретарь специализированного совета доктор биологических наук

С.Р.Кольс

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА. РАБОТЫ.

Актуальность теш. Внясяение механизма действия ионизирующего излучения на клетку является одной пз центральных проблем радиобиологии. Лимфоциты периферической крови и тимуса, играющие ведущую роль в клеточном иммунитете и ответственные за пострадиационную ¡тамунодепрессп», представляют в этом плана большой интерес. ■

В настоящее время показано, что реакция лимфоцитов на действие радиации выражается в активации клеток, юс диффэренциров-ке, усилений секреции гуморальных факторов, однако, доминируй— щзй является гибель клеток (Яршш.4,1989)«

Большинство исследователей считает, что оскозкой причиной: гибели лшлфоцитов, в частности тимоцитоз при действии ионизирующего излучения, являются процессы, происходящие в лдре. Ряд данша свидетельствует о топ, что эддонуйлеолиз хро^зтска, со-вровоздавдийся межяуклесеокяой деградацией ДНК с образование« полядезокоинуклеотвдов (ПЕН) и накоплением их з клетке, играет осиовкув роль среди'процессов, приводящих клетку к гибели. Образование ЦЦН связано с активацией СаМу -зпбисе-.-ой эвдонуклез-зн, ответственной за разрывы нитей ДНК.

Следует отметить, что существует, пэ-стдайлу, ясская связь между собитшсак,происходящими в ядре и прсляцаемосгью плазматической мембраны для ионов. Так, одно из ранних проявлений действия ионизирующего излучеяяя на тпмоцити - ото нарушение проницаемости плазматической мембраны для ионов К' и вкход их из клеток ( сьаргжп" Д974).

Кроме того, ионошщин, ионофор, обеспечивающий вход ионов кальция через плазматические мембрану и последующее увеличение вяугршслеточкой конн? играют Са" . вчзнвал меккукхеосош>.ую де-

градацию ДНК и накопление ЩЩ в тклоцкт&х ( smith et ai. , 1989 Полагают» что одним из начальных этапов прохождения сигнала, приводящею к деградации ДНК и интерфазной гибели тимоцитов, является вход Са2+ в клетки через канал плазматической мембраны; Таким образом, можно думать, что на ранних этапах после ра диационного воздействия, задолго до существенных повреждений в структуре ДНК, происходят сдвиги баланса ионов в тимоцитах!' Поддержание ионных градиентов в клетке ~ зчергозависимый процесс, осуществляемый различными АТФ-азамп, тесно связанный с функционированием митохондрий, одного ез основных источников AT® Б метке. Поэтому, представлялось вакныы изучить влияние . ионизирующего излучения иа энергетический обмен тимоцитов.

Цель и основные задачи работы. Целью настоящей работы бы ло изучение влияния ионизирующего излучения на энергетический обаен тимоцитов, включая функционирование сопрягающих мембран: плазматической и внутренней мотохондрпальной г.ембраны.

В задачи работы входило:'

1. Изучение аяиянпя ионизирующего излучения на:

а) потребление кислорода изолированна,ш тпыоцитами;

Q) функционирование штохоядрий, связанное с обеспечением синтеза АТФ;

в) АТФ-зависимые процессы в тикоцатах;

г) системы защиты тшоцигов от своооднорадшсальннх состояний кислорода.

2. Исследование влияния ионизирующего излука ния на перэ-тшепое окисление липвдов в изолированных гидоцггах.

3. Исследование мехшшзьа действия гвдроперезогсеГ: яа примере органической гидроперекиси на ьнергегпчееккй обмен '.грпо-цитов, включая:

- 3 -

а) функционирование митохондрий;

б) АТФ-зависимые процессы в клетках.

4. Изучение сочетанного действия ионизирующего излучения и гидроперекисей.

Научная новизна. Впервые проведено исследование влияния ионизирующего излучения в дозах 6 Гр» 8 Гр, Ю Гр на дыхание изолированных тимоцитов; Установлено, что облучение ускоряет процесс потребления кислорода метками, что обусловлено изменениями в синтезе белка и балансе uomiux градиентов Na+, К+ и Са+. Применение тчуноспецифического адаптагена ffflffi-Ka предотвращало эффект повреждающего действия ионизирующего излучения. .

Впервые исследовано влияние ионизирующего излучения в дозах 8 и 10 Гр на системы защиты от свободяорадвкалышх состоя-нийнислорода в клетке. Показано, что действие радиации приводят к снижению активности супероксиддисиутазы. Профилактическое применение радиопротектора цистомина предотвращало пострадиационное снижение активности супероксидцисмутазы. Существенных изменений в глутатирнпероксидазной системе не наблюдалось.

Впервые исследовано влияние гидроперекиси на изолированные темоциты на примере органической гидроперекиси кумола (ШК). Показано, что ПЖ в концентрациях до 100 мкМ, не активируя процесс ПОЛ в тимоцитах: I) торуозпт окисление субстратов в дыхательной цеци митоходцрий; 2) инициирует электрогенные утечки во внутренней митохондриальаой мембране, подавляя тем самым синтез АТФ; ингибирует АТФ-зависимые процессы, в частности Na+ К+ -АТФ-азу в клетке.

Впервые показано, что сочетанное действие ионизирующего излучения и гидроперекиси приводит к усилению- повреждающего действия облучения.

Теоретическое и практическое значение работы. Проведенные исследования расширяют представления о механизме действия ионизирующего излучения и гидроперекиси на тимоциты. Полученные данные могут быть использованы для оптимизации целенаправленного поиска средств защиты организма от ионизирующего излучения.

Среди средств, повышающих устойчивость тимоцитов к действию ионизирующего излучения, наиболее перспективными могут быть ищуноспецифический адаятоген АМТИ-К, а также соединения, активирующие Na+ К+-АТФ-азу и предотвращающие активацию неспецифической проницаемости внутренней мембраны митохондрий тимодатов.

Апробация работы. Диссертационная работа апробирована в лаборатории радиационной биофизики кафедры биофизики Биологического факультетами им,М.В.Ломоносова.

Публикации. По материалам исследования опубликовано 2 работы.

Структура диссертации; Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследований, изложения и обсуждения результатов в трех главах, выводов и списка цитируемой литературы. Диссертация содержит 10 рисунков и 6 таблиц;

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Тимоциты выделяли из тимуса, белых беспородных крыс по стандартной методике в среде, содержащей: 145 мМ HaCI; 5,6 мМ KCl, 8 мМ HEFE ; 1,3 мМ СаС12; 10 мМ глюкозу; рН=7,3.

Клетки в концентрации Ю8 в мл облучали на установке РУМ-П с двумя фильтрами: Си(Х мм) и А1(0,5 мм). Напряжение 180 кВ, сила тока 15 мА, мощность дозы 0,5 Гр/мин.

Скорость дыхания тимоцитов измеряет полярографнчески с помощь® электрода Кларка при t=37öC. (На рисунках цифрами указа-

о

на скорость потребления (>£ в нмоль С^'Ю клеток.

Активность супероксвдцисмутазы определяли по модифицированному методу (ВеаиоЬатр et а1. ).

Глут а? ко н п ерок с ида з кую и глутатионредуктазкуз активности определяли по методу ( ?гсПав!*а et »к ,1976).

Уровень небелковых тиолов определяли по методу С 8е<иа;: о4 а1. ,1968).

Содержание продуктов липопероксцдацяя в гямоцитах определяли с помощью михрометода ( Уаа! ,1982), в сыворотке крови по модифицированное методу ( Авакатга а!,1989),

•ЛонцентрацЕЮ белка определяли по методу (Лоури,1951).

Результаты экспериментов обрабатывались статистически, достоверность различай оценивали по критэргаэ Отьюдента.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОЕОТДЕНИБ Глава I. Влияние ионизирующего излучения па скорость дтаания тт»ощтов.

Потребление кислорода суспензией неаятгашрсвглтах тшопу1~ тов обусловлено функционированием глитохоцдрий, т.к. практически полностью подавляется цианидом и другими ингибиторами злект-роитранспортноЯ цепи митохондрий (Мохова Е.Н.,1287Ь/Действительно, как видно из рисунка I, при внесении клеток в среду инкубации /содержащую субстрат окисления - глюкозу/ наблюдается потребление кислорода, которое практически полностью подавляется ротеноном - ингибитором транспорта электронов в дкхатель-пой це:л! митохондрий на ус-овне НАДН-дегидрогеназы, Потребление кислорода-клетка™ в условиях эксперимента является комплексным параметром) Отражающие соотношение процессов с-штеза АТФ и электрогенных утечек через внутреннюю мембрану митохондрий.

¡клетки

I мин время

Рас.1 Влияние олагоыицина и ротенона на дыхание тимсцнтов.

Добавки: олигомвдин - 0,03 мкг/ыл; рсгекон - 2 мк1.1.

В необлученных тшоцнтах дцхание на 65$ обусловлено энергегс-ческши затратами на синтез АТФ. Это ввдно по снияени» скорости дыхания клеток при внесения ингибитора АТФ-еинтетазы - оле-хомицвда (рис.I , табл.2).

Как видно из таблицы I, через I час после облучения суспензии 1'шлощггов в дозах 6,8 и 10 Гр происходигдостоверное ускорение потребления кислорода.

Таблица I

Скорость дыхаюдя тимоцитов через I час после действия рентгеновского излучения в различных дозах.

Доза ! ! Скорость дыхания (%) ! . *п \ ! i ? 1 j

6 Гр 112 + 5,2 6 • <0г05

8 Гр 122 + 5,1 18 <0,01

Ю Гр 114 + 5,0 5 <0,05

Среда инкубации см. Материалы и методы исследования. За 100% принята скорость дыхания необлученннх тимоцитов (20,2 + 3,0 в ямоль 02 мин"1/!*)8 кл, п=28).

Наблюдаемое в эксперименте пострадиационное увеличение потребления кислорода тимоцитами может быть обусловлено несколькими возможностями: во-первых, разобщением дыхания и фосфорили-роваяия штохоадрий; во-вторых, повышением потребления кислорода в процессах, не связанных с переносом электронов в дыхательной цепи митохондрий (например, при внемитохондркальной генерации супероксвда, перекиси водорода); в-третьих, усилением АТФ-потребляющих процессов, которые тем самым активируют синтез

АТФ ( Bleue et al.,1984; Müller ,1986).

Поскольку дыхание полностью блокируется ротеноном как в необлученннх, так н в облученных тимоцитах, «то указывает на отсутствие усиления потребления кислорода в процессах, не связанных с переносом электронов в дыхательной цепи» Тог фант, что после добавления олигомицина скорости потребления кислорода не

различаются в опыте и контроле (табл.2), говррит о том, что не происходит разобщение окислительного фосфорилирования. А полное снятие эффекта пострадиационного ускорения потребления кислорода олигомицином свидетельствует в пользу того, что этот аффект связан с увеличением синтеза АТФ, в ответ на активацию АТФ-по-требляющих процессов в тимоцитах.

В дальнейшей работе, с помощью ингибиторного анализа, мы попытались выяснить, активация каких АТФ-зааисимых процессов приводит к пострадиационному ускорению потребления кислорода тимоцитами. Известно, что АТФ-потребляющие процессы в клетке (такие как синтез белка, транспорт ионов и др.) в условиях, когда синтез АТФ не лимитирован мощностью дыхательной цепи митохондрий, контролируют синтез АТФ независимо друг от друга ( Siems et ai. Д984; MuUer ДЭ86). Ингибирование потребления АТФ по одному пути (например, в процессе синтеза белка) вызывает стехиометрическое снижение потребления кислорода, сопряженного с синтезом АТФ. Мы использовали ингибиторы: Ml t. К+-АТФ-азы - оуабаин ( Hart ,1973), Са2+-АТФ-азы -La3* ( Feirumdee-Belûa ,1988), синтеза белка - циклогексимид ( Оог don- ,1982), синтеза лейкотриенов (ингибитор липооксигена-зы - нордигидрогуаретиковую кислоту - НД1К ( Irvine ,1982).

Как видно из таблицы 2, каждое из этих соединений вызывает ингибирование потребления кислорода необлученными тимоцитами. В случае добавления к клеткам двух ингибиторов вместе яаблвда-ется суммация эффектов, что подтверждает тезис о независимости регуляции синтеза АТФ отдельными процессами ого,утилизации. В результате рентгеновского облучения клеток происходит усиление янгибирующего действия трех используемых нами соединений: оуабашш, Ьа^" и циклогексимида. Этот факт указывает на пост-

Таблица 2

Влияние ингибиторов на скорость потребления кислорода ткмоцитами.

Ингибирование скорости потоебления кисло-Ингибиторы рода (в % от контроля)_

Необлученгше Облученные

тимоциты тимоциты (доза 8 Гр)

оуабаин (I мМ) 8.0 + х.з (8) 15,0 ± 4,8 (5)

Ьа3+ (1мМ) 3,2 + 1.7 (5) 15,6 ± 2,4 (4)

оуабаин +Ьа^+ 22,0 + 2,7 (3) -

циклогексимид (40 мкМ) 9,3 + 1.7 (5) 18.8 ± 2,0 (5)

НДПС (Ю мкМ) 19,0 4,3 (4) 16,0 ± 1,6 (4)

олигомицин (0,03 мкг/мл) 64;5 + 1.8 (8) 68,0 ± 1Д (8)

радиационные изменения в транспорте ионов К+, Са^4" череп плазматическую мембрану и в синтезе белка в тимоцитах.

Суммируя полученные данные, следует отметить» что уже на самых ранних этапах после воздействия рентгеновского излучения в тимоцитах наблюдаются изменения в синтезе белка и балансе - ионных потоков. Нормализация этих сдвигов э метаболизмеклет требует дополнительных энергетических затрат, тем салаги увеличивается нагрузка на митохондрии. Рентгеновское изучение по влияет на активность переносчиков электронов в дыхательной цепи и электрогенные утечки через внутреннюю мембрану митохондрий тгдюцитов, а мощности дыхательной цепи достаточно длЯ сбео-

- 10 - .

печения повышенных потребностей в энергии клеток.

Гяава 2. Влияние ионизирующего излучения на ферментативную систему защиты от активных фор! О2 в тимоцитах.

Тот факт, что в результате действия ионизирующего излучения увеличивается потребление тимоцитами указывает на возможность сдвигов в системе образования и утилизации активных форм кислорода.

В норме концентрация в клетках поддерживается на очень низком стационарном уровне ( 10""*%),} Это связано с существованием равновесия между процессами образования С^- и работой систем его утилизации, к которым относятся фермент супероксиддисму-таза и глутатионпероксидазная система. В настоящее время в литературе отсутствуют данные, касающиеся влияния ионизирующего излучения на работу систем утилизации С^- в тимоцитах. Предполагаемое нами незначительное усиление генерации (^"после облучения может не изменить равновесную концентрацию С^" в клетке, если только активность СОД не снижена в результате действия ионизирующего излучения; В связи с этим мы исследовали действие ионизирующего излучения на активность 00Д и глутатионпероксидазной системы (глутатионпероксзадазы, глутатионредуктазы и уровень содержания глутатиона).

Мы исследовали уровень активности СОД в облученных в дозах 8 и 10 Гр и необлученных изолированных тимоцитах.

Как видно из таблица 3, активность 00Д сниаается через I час после облучения в этих дозах. Использование' радиопротектора' цистамина полностью предотвращало снижение активности СОД при действии ионизирующего излучения. Препарат вводили в дозе .183

мг/кг, животных забивали через 15 мин в период максимального радиозащитного действия.

Таблица 3

Вариант опыта ! Активность СОД ! Количество ! Р !

I {%) .¡- ОПЫТОВ | I

8 Гр 67,5 + 6,6 4 <0,05

Ю Гр 69.0 +Ц.4 3 <0,01

н/о + цистамин 108,0 + 9,2 5 >0,Ю

8 Гр + цистамин 117,0 +23,0 5 >0,10

10 ГР + цистамин 106,0 +20,0 3 >0,10.

За 100$ пргаята удельная активность СОД необлученных тимоцитов, равная ед.активности на I мг бежа 14,5+ 3,9 ( ).

Можно предположить, что наблюдаемое снижение активности ООД связано либо с нарушениями в системе синтеза и деградации фермента, либо с ингибированием активного центра фермента, возможно в результате накопления эндогенных токсических веществ. Такими токсическими для активности СОД соединениями мохут быть HgOg ( Hodgson at ai. ,1975) или гидроперекиси ненасыщенных жирных кислот (Литвинова, 1983). Именно накоплением гидроперекисей ненасыщенных жирных кислот автор объясняет уменьшение активности СОД в печени облученных животных.

При измерении активности глутатионпероксэдазной системы значительных изменений не наблюдалось.

Полученные нами данные о снижении активности СОД при облучении клеток в дозах 8 и Ю Гр (~ на 305?) в условиях предполагаемого нами незначительного усиления генерации 02~ (~на 1%) ■

указывает на то, что равновеснач концентрация мокет, в приа-ципе, возрасти в клетках, облученных In vitro . Следствием увеличения концентрации 02~ может являться интенсификация процесса липопероксидации как это было показано для клеток печени крыс, облученных в дозах 8 и 10 Гр. Следующим этапом нашего, исследования было изучение влияния ионизирующего излучения яа процесс ЮЛ.

Глава 3. Влияние ионизирующего излучения на процесс ПОЛ.

В развитии основных реакций, происходящих•при лучевом поражении, активное участие принимают липиды (Тарусов Б.Н.,1962). Так известно,что ионизирующее излучение вызывает образование в клетках и тканях облученных животных токсических веществ ли-пвдкой природы (Тарусов Б.Н.,1965;_Мочалкна А.С.,1966). Сни представляют собой продукты окисления ненасыщенных жирных кио-лот (НЖК) - гидроперекиси, перекиси, эпоксиды, альдегиды и кето-нк (Астахова Т.А.). Динамика накопления продуктов перекисного окисления при развитии лучевого поражения была исследована в работах лаборатории Ю.Б.Кудряшова. Было показано, что по сравнению с другими органами и тканями максимальное количество липвдных радиотоксинов обнаруживается в печени после общего однократного рентгеновского облучения животных (Кудршов,1966).

Мы регистрировали уровень гидроперекисей НЖК в тимоцитах, используя высокочувствительный флуоресцентный метод, предложенный Яги ( Vagi Д987).

Однако, при облучении суспензии тимоцитов в дозе 8 Гр через I час после облучения не наблюдалось изменении в содержании гидроперекисей (онс[составляло 95 + 8,2/., ?>С,1).

- 13 -

Можно полагать, что отсутствие пострадиационных изменений в уровне гидроперекисей обусловлено эффективной работой систем защиты от свободнорадикальных состояний в клетках (СОД, глутатион-пероксидазяая система).

Хорошо известно, что в большинстве тканей и органов облученного организма наблюдается повышение уровня гидроперекисей ненасыщенных жирных кислот.

Пострадиационное увеличение содержания гидроперекисей в органах и тканях ставит лучевое поражение в один ряд с другими патологиями, которые характеризуются интенсификацией свободнорадикальных реакций в липидах биомембран . К таким патологиям относятся атеросклероз, ишемическая болезнь сердца, диабет, ожоговая болезнь. Одной из важных характеристик такого рода патологических состояний организма является повышение содержания гидроперекисей НЖК в плазме крови.

Нами было исследовано изменение уровня гидроперекисей ненасыщенных жирных кислот в плазме крови после рентгеяовсвого облучения дивотных в дозе 8 Гр в разные сроки после облучения.

Таблица 4

Изменение концентрации гидроперекиси в сыворотке крови крыс в разные сроки облучения (%)

Время после ! облучения (ч)! Содержание гидроперекисей (%) ! Количество 1 опытов ( ) 1 Р 1 ! 1

I 112 + 2,4 6 <0,01

2 117 + 4,1 8 СО ,01

4 123 + 4,0 8 <с,01

24 1ЭС + 5,1 ,6 <0,01

За ЮС$ принята концентрация гидроперекисей в сыворотке крови не облученных крыс: С,3(М>,С;3 |Й§с$$кй <п=8).

- 14 -

Как видно из таблицы 4, увеличение содержания гидроперекисей в плазме крови крыс происходит уже через I час после облучения - на 12/о от необлученного контроля и продолжает увеличиваться в течение 24 часов, достигая 30%.

По-видимому, образующиеся в результате действия ионизирующего излучения гидроперекиси, поступая с кровью в различные органы, в частности в тимус, ммут влиять на жизнедеятельность клеток органа, что может приводить к их различным нарушениям в метаболизме.

В связи с этим, мы исследовали влияние органической гидроперекиси - гидроперекиси кумола, хорошо имитирующей свойства природных липидных гидроперекисей, на энергетический обмен тимоцидов.

Глава -4. Влияние органической гидроперекиси на тимоцеты в норме и при облучении.

Мы исследовали влияние органической гидроперекиси (гидроперекиси кумола - ШК) на тимоциты, регистрируя потребление кислорода клетками.

Как уже отмечалось ранее,. большая часть потребления кислорода клетками - это дыхание, сопряженное с синтезом АТФ, которое отражает равновесие между АТФ-потребляющими процессами в митохондриях и цитоплазме и.синтезом АТФ митохондриями. Меньшая часть потребления кислорода клетками расходуется на внемитохондриальные'(^-потребляющие процессы и отработку дыхательной цепью митохондрий электрогенных утечек через внутреннюю митохондриальную мембрану.

Как видно из рисунка 2 (кривая I), около 70% общего потребления кислорода тимоцитами сопрякено с синтезом АТФ в митохондриях (поскольку ингибитор АТФ-синтет&зы олигомицин подавляет дыхание приблизительно на 70%); оставшееся несопряженное дыхание обуслов-

клетки

?ис,2; Влияние ШК на скорость сопряженного дыхания тимоцитов (3) и дыхания в присутствии олиго-мицина (2), кривая I - контроль;8 Добавки: олигомицин - 0,03 мкг/мл; ШК - 50 С1ССР - I мкМ: ротенон - 2

лено электрогенными утечками через внутреннюю мембрану митохондрий и внемитохондриальным потреблением (>2. Следует отметить, что скорость потреблениякислорода клетками далека от максимально- возможной в данных условиях, поскольку внесение разобщителя С1ССР вызывает почти двухкратную стимуляцию дыхания.

Гидроперекись кумола, в относительно низких концентрациях (20-100 мкм) проявляет, по крайней мере, £ри типа действия на дыхание тимоцитов.

В первую очередь следует отметить, что ШК в используемых нами концентрациях не вызывает инициирования процесса липоперок-сидации в тимоцитах. Как видно из рисунка 2 (кривая 2,3), добавление ингибитора транспорта электронов в дыхательной цепи мито-хоадрий ротенояа, полностью подавляет потребление кислорода в присутствие ШК. В случае инициирования лшопероксидации ШК додана была вызывать ускорение потребления кислорода, не связанное с окислением субстратов в дыхательной цепи митохондрий, и это потребление кислорода не должно подавляться ротеноном.

Как видно из рис ¡2 (кривая 2), внесение ПШ на фоне олиго-мицина, т.е. в условиях отсутствия синтеза АТФ* вызывает стимулу цию скорости дыхания в 1,5 раза!' Такое ускорение потребления свидетельствует об увеличении шгектрогеняых утечек через внутреннюю мембрану митохондрий!' Последующая добавка разобщителя стимули-рузв дыхание, однако скорость дыхания ниже, чем в контроле, по-звдимоаду, это обусловлено ингибированием ГПК окисления субстратов э дыхательной цепи митохондрий! Как видно из рис;2 (кривая 3)., 1Ш.способна аффективно подавлять также дыхание, сопряженное с синтезом ДТФ! в этом случае ингибирование дыхания обусловлено либо подавлением АТФ- потребляющих процессов, либо - синтез АТФ.

Последующее добавление разобщителя вызывает стимуляцию дыхания, хотя также как и на кривой 2, скорость стимулированного дыхания ниже, чем,в контроле. :

Таким образом, ГШ, во-первых, тормозит окисление субстратов в дыхательной цепи митохондрий тимоцитов, во-вторых, инициирует электрогенные утечки во внутренней митохондриальной мембране, в-третьих, ингибирует АТФ~зависимые процессы или синтез АТФ.

Представлялось интересным выяснить, какой из процессов в клетке наиболее чувствителен к действию гидроперекиси;

Мы исследовали эффективность IHK в подавлении окисления субстратов1'В дыхательной цепи митохондрий, т.е. ингибирование дыхания клеток ГПК в присутствие разобщителя CICCP. В концентрации до 75 мкМ ШК ингибирует максимальную скорость потребления кислорода только на 10-15$.

Поскольку подавление АТФ-зависимых процессов ПК происходит на фоне стимуляции дыхания за счет электрогенных утечек через внутреннюю мембрану митохондрий, на рисунке 3 представлена концентрационная зависимость подавления ГПК сопряженного дыхания, построенная с учетом эффекта стимуляции дыхания ШК, Видно, что уже в концентрации 20 мкМ гидроперекись подавляет процессы, связанные с синтезом АТФ на 60$.

Таким образом, наиболее чувствительными к ГПК в клетке являются процессы, связанные с синтезом АТФ.

Далее мы попытались выяснить, какие это процессы. В принципе, возможно подавление гидроперекисью АТФ-синтетазы или различных АТФ-потребляющих процессов. Экспериментально различить эти варианты достаточно сложно, особенно при работе не на выделенных митохондриях, а на интактных клетках . Нам удалось прове-

Сдд^мкМ)

Рис:з: Концентрационная зависимость подавления ПК

скорости сопрякенного дыхания пмоцитов с учетом вффекта стимуляции дыхания ШК в присутствии олигомицина;

За 100^ принята скорость дыхания еочр.яз1сеи*сЛ£ а аинггбсм АТФ ..... - ...... -

клетки

ШК

С1ССР

I дал

время

Рас.-!. Влияние оуабаина и гидроперекиси куиола яа скорость дыхания тимоцитов. Добавки: оуабаин- I мМ; ШК - 75 мкМ; С1СС? - 1 '

ркть, не является ли одним из ГПК чувствительных АТФ-потребляя-щих процессов функционирований К*На+-АТФ-азы. На рисунке 4 представлены данные по влиянию ГОК и ингибитора К+ка+-АТФ~азы - оуаба-в на на дыхание тимоцитов. Как видно из рисунка, оуабаин подавляет дыхание тимоцитов, последующее добавление ГПК не вызывает дальнейшего торможения дыхания, несмотря па то, что ПЖ, добавленная отдельно, вызывает кнгибгрованне. дыхают сравнимое с действием оуабаина.

Таким образом, можно полагать, что одним из АТФ-потребля-ющих процессов, чувствительных к ГЦК является К+Кв+-АТФ~аза тимоцитов.

На следующем этапе работы мы исследовали совместное действие гидроперекиси к ионизирующего излучения на духание тало-цитов. Постановка такой задачи очевидна, в связи с- тем, что в организме животного при воздействии проникающего ионизирующего излучения через 1-2 часа после облучения тимоциты находятся под влиянием и другого фактора - липидшзх гидроперекисей крови.

Выделенные клетки тимуса облучали в дозах 6, 8 Гр, затем через I час после облучения измеряли потребление кислорода контрольными и облученными клетками в присутствие различных концентраций ШК.

Как вздн.о из рисунка 5, достоверные различия в подавлении скорости дыхания гвдроперекнсью «езду облученными и необлучек-ными клетками наблюдается только при концентрациях ШК 75 мкМ при дозе 6 Гр и 100 мкМ при дозах 6 и 8 Гр.

Таким образом, ШК в концентрациях,'не вызывающих перекис-ного окисления липвдов , усиливает поражающее действие ионизирующего излучения на клетку.

Ряс. 51 Действие 1ПК и рентгеновского излучения на скорость дыхания тимоцитов. За принята скорость сопряженного дыхания;

- 22 -

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Ионизирующее излучение вызывает нарушение баланса ионных градиентов в клетках и снижение активности СОД. Вследствие компенсаторных реакций, направленных на поддержание исходных ионных градиентов, наблюдается увеличение потребления кислорода тимоцк-таш. При этом происходит активация г?а+К+-АТФ-азы и сопряженного с синтезом АТФ дыхания митохондрий.

Действие органической гидроперекиси, которая хорошо имитирует липщуше гидроперекиси, направлено, с одной стороны, на индукцию электрогеяных утечек через внутреннюю митохондриальную • мембрану, что сопровождается подавлением синтеза АТФ. С другой стороны, гидроперекись'Эффективно ингибирует Ка+К+-А.ТФ-азу ти~ моцитов.

В организме облученного'животного клетки тимуеа, подвергнувшиеся воздействию ионизирующего излучения, затем длительное время находятся под влиянием повышенной концентращш гидроперекисей лилидов, разносимых кровь». Вследствие- этого, действие гидроперекиси, направленное на нарушение синтеза АТФ и Пбрзкоса электронов в дыхательной цепи, препятствует клетке нормализовать свой энергетический обмен и тем самым усиливает повреждающее действие радиации. •

ВЫВОДЫ

I. Ионизирующее излучение в дозах 6 Гр, 8 Гр и Ю Гр вызывает

ускорение потребления кислорода тимоцитами, обусловленное из-:;• 'менвкиями в синтезе белка и балансе ионных потоков На+, К+ • 'и Са+. Профилактическое использование адаптогена КИШКа снижает скорость потребления кислорода у облученных клеток