Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Ранние изменение состояния тимоцитов при стрессовых воздействиях на организм

ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Ранние изменение состояния тимоцитов при стрессовых воздействиях на организм"

чУ

НАУЧНО ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ ФИЗИКО - ХИМИЧЕСКОЙ МЕДИЦИНЫ ЫИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РФ

На правах рукописи

ПРЕОБРАЖЕНСКИЙ АЛЕКСАНДР БОРИСОВИЧ

РАННИЕ ИЗМЕНЕНИЯ СОСТОЯНИЯ ТИМОЦИТОВ ПРИ СТРЕССОВЫХ ВОЗДЕЙСТВИЯХ НА ОРГАНИЗМ •03. 00. 02. - биофизика

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Москва 1993

Работа выполнена в .Научно-производственном центре "Тидробиос" Министерство здравоохранения РФ.

Научный руководитель - старший научный сотрудник

к.й.и. Б.В. Рубцов.

Официальные оппоненты:

доктор физ. мат. наук Г.Е. Добрецов,

доктор мед. наук Е.В. Никушкин.

Ведущее научное учраздение - Российский Государственный медицинский университет км. Н.И. Пирогова.

Зщита диссертации состоится ".Д »ЩфГТ*-. 1993 г. на заседании специализированного Учёного совета Д 084 66 01 Научно исследовательского института физико-химической медицины по адресу: Москва, ул. Малая Пироговская, д. 1а.

С диссертацией мошю ознакомиться в библиотеке НИИ ФХМ.

Автореферат разослан ." ф г.

Учёный секретарь специализированного совета

М.А. Мурина

1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

АКТУАЛЬНОСТЬ ПРОБЛЕМЫ. Явление стресса известно угв более 50 лет, но проблема защиты организма от повревдающих последствий стресса до сих пор остаётся нерешённой. Под влиянием сильных стрессовых воздействий развиваются патологические изменения во многих органах, системах органов и тканях организма. Причиной этих изменений является чрезмерная активация стресс-реализующих систем организма (Меерсон Ф. 3. , Пшенникова Ы. Г. 1988). Результатом неблагоприятных последствий стресса являются такие тямёлые заболевания, как ишемическая болезнь сердца, язвенная болезнь желудка, вторичные иммунодефицитные состояния, возрастает риск онкологических заболеваний.

Поэтому, остро стоит проблет поиска веществ, ограничивающих действие стресс-реализующих систем и предупреждающих, таким образом, развитие неблагоприятных последствий стресса. Такие вещества называются адаптогенами.

Применяемые в настоящее время методы оценки адаптогенного действие веществ, не позволяют провести быструю и одновременно адекватную оценку -их активности. Поэтому, необходимы новые экспресс-методы скрининга адаптогенов, позволяющие быстро и эффективно проводить их отбор из широкого спектра биологически активных веществ С БАБ).

ЦЕЛЬ И ЗАДАЧИ РАБОТЫ. Основной целью данной, работы являлась разработка экпресс-метода скрининга адаптогенов.'

Для разработки метода скрининга адаптогенов необходимо выбрать тест-объект, адекватно отражающий развитие стресса и влияние

на него адаптогенов, найти параметры, быстро и обязательно меняю, щиеся при изменениях физиологического состояния этого тест-объекта и метод,с-помощью которого удобно регистрировать эти изменения.

В качестве тест-объекта были выбраны клетки тимуса. В тимусе, являющимся центральным органом иммунитета, наиболее рано и ярко проявляются морфологические изменения при стрессе (Селье 1936). Поэтому, функциональные изменения состояния тимоцитов, предшествующие морфологическим, должны проявляться в ещё более ранние сроки развития стрессовой реакции, и могут служить удобным параметром для её экспресс оценки.

Параметрами, которые одними из первых меняются при изменении функционального состояния клеток, являются трансмембранные потенциалы на плазматической мембране клеток и мембранах их митохондрий (Miles P. R. 1981,Гуковская А. С. 1984).

Для исследования трансмембранных потенциалов нами был ■ выбран удобный, широко применяемый для этих целей, метод флуоресцентных бондов (Владимиров Ю, А., Добрецов Г.Е. 1980, Косников ЕЕ 1990).

Таким образом, на основании всего вышесказанного для достижения цели нашей работы были поставлены следующие задачи:

- исследовать с помощью потенциалчувствительных зондов изменения трансмембранных потенциалов на плазматических мембранах Т'имОпитое и их митохондрий в первые два часа развития стрессовой реакции,

- исследовать зависимость этих изменений от силы стрессового воздействия,

- оценить влияние адаптогенов на эти параметры.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА РАБОТЫ. Флуоресцентный зонд 4 - (п - димети-ламиностирил) -1- метилпиридиний толуолсульфонат (ДСМ) быд впер-

вые применён для исследования развивающихся in vivo изменений трансмембранного потенциала митохондрий тимоцитов.

В работе впервые было обнаружено изменение функционального состояния тимоцитов, развивающееся в первые 60 минут стрессовой реакции и выражающееся снижением трансмембранного потенциала митохондрий тимоцитов ( дй:

В результате проведённого исследования был разработан новый экспресс-метод скрининга адаптогенов.

С помощью разработанного метода впервые обнаружена адапто-генная активность иммуномодулятора кукумариозида.

ПРАКТИЧЕСКОЕ ЗНАЧЕНИЕ РАБОТЫ. Разработан новый экспресс-метод скрининга адаптогенов, с помощью которого можно проводить быстрый первичный отбор веществ, обладающих адаптогенной активностью.

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ. Основные положения диссертации были дололя-ны и обсуждены на семинаре Научно исследовательской лаборатории биологически активных веществ гидробионтов (НИЛ БАВГ) МЗ РФ (1992), на конференциях молодых учёных НИЛ БАВГ МЗ СССР (1986, 1988), на -Î конференции Международного общества патофизиологов (Москва, 1991), на Всесоюзном совещании "Биологически активные вещества гидробионтов - новые лекарственные, лечебно-профилактические и технические препараты" (Владивосток, 1991).

ПУБЛИКАЦИИ. По материалам диссертации опубликовано 5 работ.

СТРУКТУРА И ОБЪЕМ РАБОТЫ. Диссертация содержит следующие разделы: введение, обзор литературы (3 раздела), материалы и методы, результаты и обсуждение, заключение, выводы, список литературы. Список литературы включает 157 ссылок (112 работ на русском и 45 на английском языках). Текст диссертации набран на компьютере и распечатан на принтере на 122 страницах. Диссертация иллюстрирована 1 таблицей и 23 рисунками.

II. СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ Обзор литературы включает три раздела в которых' рассмотрены следующие вопросы: 1. Стресс ( в разделе описаны процессы развития стрессовой реакции, рассмотрены изменения, развивающиеся в организме на разных уровнях во все фазы стрессовой реакции). 2. Адаптогены (рассматриваются стресс-лимитирующие системы организма и механизмы действия известных адаптогенов). 3. Трансмембранные потенциалы и флуоресцентные эонды.

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

2.1. ФЛУОРЕСЦЕНТНЫЕ ЗОНДЫ В работе применялись следующие флуоресцентные бонды: потенци-алчувствительный, положительнозаряженный 4 - (п - диметилами-ностирил ) - 1 - метилпиридиний толуолсульфонат , синтезированный в институте органического синтеза АН Латвийской ССР, г. Рига, и любезно предоставленный для проведения исследований Г. Е. Добрецо-вым, и 3,3' - дипропил - 2,2'- тиодикарбоцианин, (сИ5-Ц,-(5)) синтезированный в Институте Биофизики АН СССР, г. Пущино на Оке.

2.2. БИОЛОГИЧЕСКИЙ,МАТЕРИАЛ В экспериментах использовались крысы (самки) породы"*1зЬаг, массой 160 - 180 г.. Мыши самцы П СВА/С57В1аск.

2. 3. МОДЕЛИРОВАНИЕ СТРЕССОВОЙ СИТУАЦИИ И СТРЕССОВОЙ РЕАКЦИИ У

ЖИВОТНЫХ

Эмоционально-болевой стресс у крыс вызывали иммобилизацией на дощечке с фиксацией за конечности в положении животом вниз. Животных подвергали иммобилизации 15, 40, 60 и 90 минут.

В качестве стрессовых воздействий применялись также такие стрессорные факторы, как: внутрибрюшинная инъекция физиологического раствора (ФР) объемом О,Б мл. и имитация инъекции - внут-рибрюшинное кратковременное введение иглы шприца, без последующего впрыскивания содержимого.

Затем крыс обезглавливали на гильотине, извлекали тимус и выделяли из него тимоциты.

2. 4. СПОСОБ ВВЕДЕНИЯ И ДОЗЫ БАВ

Исследуемые БАВ вводили внутрибрюшинно крысам в следующих до-sax; а) продигиозан 0,25 мкг/кг, 25 мкг/кг, б) сапарал 0,25 мкг/кг и 5 мкг/кг; в) кукумариозид 0,25 мкг/кг, 5 мкг/кг; мышам в следующих дозах: а) сапарал 2,5 мкг/кг; 25 мкг/кг; 0,25мг/кг; 2,5 мг/кг; б) кукумариовид 2,6 мкг/кг; 25 мкг/кг; 0,25 мг/кг; 2,5 мг/кг; в) гидрокортизон 25 мкг/кг; 0,25 мкг/кг;-

2. 5. ФЛУОРИМЕТРИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.5.1. ИССЛЕДОВАНИЕ ИНТЕНСИВНОСТИ ФЛУОРЕСЦЕНЦИИ ДСМ В СУСПЕНЗИИ

ТИМОЦИТОВ

Тимоциты крыс ( 20 х 104в 1 мл суспензии) помещали в бюкс объёмом 4 мл и инкубировали в течении 25 минут с ДСМ ( в концентрациях .0,5 мкЫ или 2,5 мкМ ). Интенсивность флуоресценции ДСМ измеряли в круглой кварцевой кювете объемом 0,7 мл на спект-рофлуориметре Hitachi rrpf-4 или в квадратной кварцевой кювете

объёмом 4 мл на спектрофлуориметре СФЛ - 1 (СССР, г. Минск), под углом 90".

Флуоресценцию ДСМ возбуждали при длине волны 470 нм и регистрировали при длине волны 555 нм. Ширина щелей на монохрома-торах возбуждения и флуоресценции составляла 4 нм.

2.5.2. ИССЛЕДОВАНИЕ ФЛУОРЕСЦЕНЦИИ dlS - С}- (5) В СУСПЕНЗИИ

ТИМОЦИТОВ

Тимоциты ( 1.5 х ю'в ш суспензии ) помещали в квадратную кварцевую кювету объёмом 4 мл и .при перемешивании на магнитной мешалке, добавляли diS- Cj- (5) до конечной концентрации 3x10'м. • Флуоресценцию вонда возбуждали черев интерференционный, светофильтр с максимумом пропускания 630 нм и и регистрировали черев светофильтр НО-19 с передней стенки кюветы под углом 30° на флуо-•риметре "Квант-2",-

2. б. ДЕПОЛЯРИЗАЦИЯ ПЛАЗМАТИЧЕСКОЙ МЕМБРАНЫ И МЕМБРАН МИТОХОНДРИЙ

ТИМОЦИТОВ

Частичной или полной деполяризации плазматической мембраны тимоцитов добивались следующим образом. Для этого после разовой отмывки в растворе Хенкса на центрифуге ( 200 g, 10 мин. ), тимоциты помещали в растворы сходного состава, но с различным содержанием ионов калия,

После этого приступали к флуориметрическим исследованиям, как описано в 2.5..

Деполяризации мембран митохондрий в тимоцитах добивались до-^ ¿j

бавлением 1x10' M карбонилцианид-П-хлорфенилгидразона (С1ССР) к суспензии тимоцитов, находившихся в среде с содержанием ионов калия 148 мМ (условие, полной деполяризации мембран тимоцитов .).

После этого приступали к флуориметрическим исследованиям,, как описано в п. 2.5.1.

2. 7. ПОЛЯРОГРАФИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

Полярографические исследования проводились с применением хлор-серебряного электрода типа электрода Кларка. В качестве регистрирующего блока испольэовали кислородомер Т - М 5221 (ПНР) с выводом на самописец Н- 399 (cccpj t

Тимоциты выделяли по вышеописанному методу и содержали на льду до начала полярографических иследовашгй. Уровень интенсивности поглощения кислорода, тимоцитами определялся в ячейке из оргстекла объёмом 0,6 мл. Количество клеток в 1мл исследуемой суспензии составляло 6x10s . Содержание кислорода в образце исследовали в течение 30 шнут.

2.8. ИЗМЕРЕНИЕ ИАСОЫ ТИМУСА КРЫС Тимус ifpuc после выделения .взвешивали на лабораторных весах ВЯР 200. Погреиностъ измерения составляла 3 %.

2.9. ОПРЕДЕЛЕНИЕ СОДЕРЖАНИЯ ЛШЯОЩГГОВ В ТИУУСЕ И СЕЛЕЗЁНКЕ

КРЫС

В серии экспериментов определяли количество лимфоцитов в тимусе и селезёнке крыс в норме, после стрессовых воздействий и после стрессовых воздействий на фоне введения BAR Для этого, после декапитации, у животных выделяли тимус и селезёнку. Органы измельчали в стеклянном гомогенизаторе тремя поворотами пестика в растворе Хенкса. После этого клетки отделяли от строи* фильтрацией череэ два слоя капроновой шрли, оседлали на центрифуге (10

мин. , 200 д) и, после разведения в нужном соотношении раствором Хонкса, определяли их количество на гемоцитометре ГЦМК - 3 (СССР), в соответствии с прилагающейся к нему инструкцией.

2. 10. ИССЛЕДОВАНИЕ СОДЕРЖАНИЯ 11-0КСИК0РТИК0СТЕР0ИД0В В

В ряде экспериментов оценивали содержание 11-оксикортикосте-роидов в плазме крови крыс в норме, при стрессовых воздействиях и при введении БАВ. Оценку проводили стандартизированным флуоресцентным методом,описанным в справочнике "Лабораторные методы исследования в клинике'ЧЕ В. Меньшиков ред. 1987).

Результаты измерений ?осн, ?</п, массы тимуса, количества яд-росодержащих клеток в тимусе и селезёнке обработаны на микро-1:алькуляторе МК-61 и представлены как среднее значение параметра в исследуемой группе животных, нормированное к среднему значению' этого параметра в группе интактных животных. В качестве доверительных интервалов указаны . или т, где 6 - ошибка

ности попадания среднего значения исследуемого параметра в доверительный интервал равной 97,5 %; ЗА /я - 99,7%.

Достоверность результатов исследования выживания мышей в экстремальных условиях оценена с помощью применения непараметрического критерия Вилкоксона - Манна - Уитни ( Гублер Е. К , Ген-ким Л. Л. .1973).

ПЛАЗМЕ КРОВИ КРЫС

2.11. МАТЕМАТИЧЕСКАЯ ОБРАБОТКА РЕЗУЛЬТАТОВ

2 & т соответствует степени вероят-

III. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

3.1. ИЗМЕНЕНИЯ Ft>t* В ТИМОЦИТАХ КРЫС В ФАЗУ ТРЕВОГИ СТРЕССОЬ

РЕАКЦИИ

На первом этапе работы в соответствии с поставленной задаче', исследовали изменения интенсивности флуоресценции ДСМ (Fee*) в тимоцитах крыс на самых ранних стадиях развития стрессовой реакции (фаза тревоги). Фаэу тревоги стрессовой реакции моделировали 1 часовой иммобилизацией крыс, как описано в 2.3..

Через 60 минут после начала иммобилизации наблюдалось достоверное снижение среднего значения F«t« в тимоцитах подопытных крыс, рис. 1. А.. При этом в те же сроки масса тимуса подопытных животных (параметр по снижению которого оценивают развитие стресса) не отличалась от массы тимуса интактных животных, рис. 1.Б.

Таким образом в первые 60 минут после начала стрессового воздействия с помощью потенциалчувствительного флуоресцентного зонда ДСМ было зарегистрировано изменение состояния тимоцитов, в сроки в которые ешр не развиваются морфологические изменения в тимусе. В соответствии с поставленными нами задачами, необходимо было в последующих экспериментах оценить зависимость этого эффекта от силы стрессового воздействия.

3.2. ЗАВИСИМОСТЬ Fp<« В СУСПЕНЗИИ ТИМОЦИТОВ КРЫС ОТ СИЛЫ

СТРЕССОВОГО ВОЗДЕЙСТВИЯ

Для того, чтобы исследовать возможность оценки развития стрессовой реакции с помощью обнаруженных изменений состояния тимоцитов, было проведено исследование Fo<m в тимоцитах крыс при стрессовых воздействиях различной силы

Оказалось, что при самом сильном из применённых воздействий (иммобилизация в течении 1 часа), среднее значение F»(« в тимоцитах снижалось по сравнению с контролем на 45%, при более слабом

Т.. Мт

' л

{сс-

ор-

ш-

¿Б *

Л

Рпс.1. А. Интенсивность Ллуорссцонции ДСМ в суспензии тимоцитов /£„/ и Б. масса тимуса /Мт/ у штактных /I/ крыс и крис после I часа иммобилизации /2/. Результаты нормированы к средним

значениям параметров у интактннх животных. А. Концентрация ДСМ

б

в пробе - 0,5 мкМ. Содержание клеток в пробе - 20 х 10 в мл.

3 -г

Рис.2. Зависимость интенсивности флуоресценции ДСМ о* силы стрессового воздействия. I в тимоцитах интактных крис, 2 -/ъ** поело I часа иммобилизации, 3 после внутрибршшшой инъекции ФР, 4 - после имитации инъекции. Время после начала воздействия - I час. Концентрация ДСМ в пробе - 0,5 мкМ. Содержание клеток в пробе -20 х 10* в мл.

стрессовом воздействии (внутрибрюшинная инъекция физиологического раствора 0,5 мл), F¡>ч* снижалось на 28%, и при самом слабом воздействии (иммитация инъекции кратковременным введением иглы шприца на 1-2 сек. в брюшную полость крыс.),.... среднее значение Fit* снижалось на 25%.

Причём, если при иммобилизации и внутрибркшнной инъекции достоверность отличий Fее» в опытных группах от величины этого параметра у интактных животных'более 95%, то при имитации инъекции лишь немногим более 45%, рис. 2.

Сопоставление этих результатов указывает на зависимость регистрируемых нами изменений от силы стрессового воздействия. Это позволяет количественно оценивать развитие стрессовой реакции организма.

3.3. ЗАВИСИМОСТЬ ИЗМЕНЕНИЯ ?ьсм В ТИМОЦИТАХ КРЫС ОТ ВРЕМЕНИ ПРОШЕДШЕГО ПОСЛЕ НАЧАЛА СТРЕССОВОГО ВОЗДЕЙСТВИЯ

Экспресс-метод скрининга БАВ предполагает быстрое получение информации б биологическом действии БАЕ Кроме того, эффект вещества должен быть хорошо выражен. Поэтому, в целях определения оптимального времени регистрации изменения состояния тимоцитов при стрессовых воздействиях, нами была исследована динамика изменений Fьем в первые 2 часа после начала действия стрессогенного фактора.

Оказалось, что эффект снижения Fee* в тимоцитах крыс развивается уже через 40 минут после начала стрессового воздействия,наиболее выражен через 60 минут, но достоверное снижение Fее* наблюдается и черев 120 минут после начала стрессового воздействия.

Изменений массы тимуса крыс в эти сроки развития стрессовой реакции не наблюдалось.

Таким образом, изменения Fьсм через 60 мин. после начала ст^ссового воздействия - удобный критерий, по которому можно 0<5рнить изменения состояния тимоцитов на ранней фазе стрессовой реакции и, следовательно, может быть взят за основу для разработки экспресс-метода скрининга БАВ с антистрессовой и адаптогенной 'активностью.

3. 4. ВОЗМОЖНЫЕ ПРИЧИНЫ СНИЖЕНИЯ Fec* В ТИМОЦИТАХ КРЫС НА РАННИХ

СТАДИЯХ СТРЕССА

Для выяснения природы функциональных изменений тимоцитов, развивающихся на ранних стадиях стресса, мы исследовали возможные причины снижения F»tu в клетках.

Наиболее вероятной • причиной снижения интенсивности флуоресценции потенциалчувствительного 80нда ДСМ в тимоцитах является снижение величины одного из трансмэкбранных потенциалов: на плазматической мембране клетки (&?п) или на мембране митохондрий (Д&0(Добрецов Г. Е., Косников ЕЕ, 1986.). Однако, существуют и другие возможные причины снижения Fым в тимоцитах крыс при стрессовом воздействии. В первую очередь к ним можно отнести возможные изменения заряда на поверхности тимоцитов. Однако, показано, что при стрессовом воздействии такие изменения заряда тимоцитов развиваются не ранее 2-3 суток после начала стрессового воздействия ( Тарасова И. Е 1985) и регистрируются при гораздо более высоких концентрациях (15 мкМ) ДСМ, чем применяли мы в наших исследованиях (0,5мкМ). Поэтому, снииение Fв«« вследстивие изменения поверхностного заряда клеток маловероятно и в дальнейшем не рассматривалось.

Второй возможной причиной является миграция тимоцитов с наи-.ьшим значением интенсивности Fнем из тимуса в переферическое

кровяное русло, так как показано, что клетки тимуса значительно отличаются друг от друга по показателю Рес«(Косников КЕ, 1986). Однако, миграция тимоцитов из тимуса наблюдается не ранее чем через 6 часов после 1 часовой иммобилизации крыс (Темпов А. В., 1984). Поэтому снижение Носм в суспензии тимоцитов подопытных крыс за счёт миграции клеток из тимуса, тоже маловероятно. Это было подтверждено в наших последующих исследованиях.

3.5. ИССЛЕДОВАНИЕ ИЗМЕНЕНИЯ ?г=сп В ОТДЕЛЬНЫХ КЛЕТКАХ ТИМУСА ПРИ СТРЕССОВОЙ ВОЗДЕЙСТВИЯ

При мнкрофлуорнмэтрическом исследовании ¥ьс.ц в отдельных клетках тимуса било показано, что снижение Yix.it в суспензии тимоцитов при стрессе происходит не из-за шграцга ¡теток с наиболее высокими показателями этого параметра в 1фовяное русло, а вследствие сннгзнпя з болызинстве тимоцитов при стрессовом

воздействии. Полученные данные были подтверждены исследованиями количества ядросодержащих меток (ЯСК) в тимусе. У стрессирован-ных ¡фыс через 60 минут после начала воздействия количество ЯСК в тимусе было таким же что и у интатстных лпютньк.

3.6. ПОДБОР УСЛОВИЙ ДЛЯ НЕЗАВИСИМОЙ РЕГИСТРАЦИИ ИЗМЕНЕНИЙ ДЙ> И А'/п В ТИМОЩГГАХ.

Для решения вопроса, изменение какого из потенциалов или д!> (или обоих вместе) является причиной снижения в тшгоцл-тах стрессованных крыс, необходимо было подобрать такие условия при которых возмог:о адекватное и независимое исследование А& и Д&.

Исследовать величину одного из этих потенциалов независимо от другого можно при условии равенства одного из потенциалов пула

Проще всего добиться деполяризации плазматической мембраны в среде с высоким содержанием йонов К*. В таких условиях равен нулю, и флуоресценция ДСМ в тимоцитах зависит только от величины Ati Добрецов Г. Е., Косников ЕЕ, 1986).

В результате исследований нами было показано, что наиболее удобная и адекватная концентрация ДСМ для исследования А%> в тимоцитах с деполяризованной плазматической мембраной - 2,5 мкМ. В то же время, концентрация, при которой F*«« адекватно отражает изменения Afn и А^т в интактных тимоцитах/- 0,5 мкМ.

Таким образом, было показано, что концентрация ДСМ при которой были зарегистрированы изменения Fee./» в тимоцитах (0,5 мкМ) является адекватной для исследования и А¥м в интактных клетках. И были подобраны адекватные условия для исследования с помощью ДСМ A?* в тимоцитах независимо от А

3. 7. ИССЛЕДОВАНИЕ В ТИМОЦИТАХ ИНТАКТНЫХ КРЫС И КРЫС ПОДВЕРГАВШИХСЯ СТРЕССОВОМУ ВОЗДЕЙСТВИЮ Чтобы выяснить изменяется лиА& в тимоцитах крыс в первые 60 минут стрессового воздействия, мы исследовали Fы,н в тимоцитах с деполяризованной плазматической мембраной.

Как видно из рис. 3, в тимоцитах с деполяризованной плазматической мембраной полученных от крыс, подвергавшихся 1 часовой им-.мобилизации,. среднее злачение Fьсм достоверно ниже чем в тимоцитах интактных животных. Следовательно стрессовое воздействие в первые 60 минут после его начала приводит к снижению AY*.

3. 8. ИССЛЕДОВАНИЕ Aft В ТИМОЦИТАХ ИНТАКТНЫХ КРЫС И КРЫС ПОДВЕРГАВШИХСЯ СТРЕССОВОМУ ВОЗДЕЙСТВИЮ Цель данного исследования заключалась в исследовании измене-

ний в первые 60 минут после начала стрессового воздействия.

Обязательным условием исследования являлось независимость регистрируемого параметра от дУ*. Для этой цели мы применяли флуоресцентный зонд сИБ-С3-(5) в концентрации 3x10"^! при содержании тимоцитов в пробе 1,5х10Лв мл. При этих условиях, как было показано, интенсивность чувствительна к изменениям дУ* и н^ чувствительна к изменениям Л&СГуковская А. С. ,1985).

Как видно из рис. 4,среднее значение в тимоцитах крыс,

подвергавшихся 60 минутной иммобилизации,не отличается от среднего значения ^¿а в тимоцитах интактных животных. Поэтому, можно сделать вывод о том, что в течении первых 60 минут после начала действия стрессового фактора не происходит изменений ДУл, и, следовательно, причиной снижения ?ьсн в эти сроки развития стрессовой реакции является снижение

£

Щ

дю-

I

ж

1,00-

0,10-

ШШ

^_1_

Рис.3.Изменение интенсивности 'Тшуоросценции ДОМ в ти-

моцитах с деполяризованной плаз,магической мембраной при стрессовом воздействии. I-тактнне кивотнне, 2- после I часа иммобилизации. Конц. ДСМ - 2,5:лкХ

Рис.4.Интенсивность (ччуорес-ценцпи в тимоцитах

I- интактних крнс, 2в тимоцитах крно после I часа иммобилизации.

3. 9. ИССЛЕДОВАНИЕ ВЛИЯНИЯ ВВЕДЕНИЯ КОРТИКОСТЕРОИДОВ НА СОСТОЯНИЕ МЕМБРАННЫХ ПОТЕНЦИАЛОВ ТИШШТОЕ В разделах 3.7 и 3.8 с помощью зондов ДСМ и diS-Cj-(5) было показано, что в фазу тревоги стрессовой реакции наблюдается снижение потенциала на мембранах митохондрий тимоцитов. Остаются, однако, не выясненными физиологические и биохимические аспекты этого явления.

Известно, что морфологические изменения, развивающиеся в тимусе, являются следствием выброса в кровь КС (Селье Г. , 1936,Горизонтов П. Д, 1983), поэтому возможно, что зарегистрированные нами с помощью ДСМ изменения функционального состояния тимоцитов также является кортизонзависимым.

Для проверки этого предположения было исследовано влияние, введения гидрокортизона (ГК) на Ft>t* в тимоцитах крыс. Показано, что ГК приводит к отмене снижения Fы*, развивающегося в ответ на внутрибрюшинную инъекцию как стрессовое воздействие, а в дозе 260 мкг/кг к противоположным стрессу изменениям Fot* - увеличению его среднего значения в тимоцитах подопытных животных.

В дополнительных исследованиях аналогичных описанным в разделах 3.7. , 3.8. было показано, что увеличение Fтн в ответ на введение ГК является следствием увеличения ДЙ» тимоцитов.

Таким образом,внутрибрюшинное введение гидрокортизона привело к изменению состояния тимоцитов формально противоположным стрессовым изменениям.

3.10. ИССЛЕДОВАНИЕ КЛЕТОЧНОГО ДЫХАНИЯ ТИМОЦИТОВ ПРИ ИНЪЕКЦИИ ГИДРОКОРТИЗОНА И СТРЕССОВОМ ВОЗДЕЙСТВИИ Данные флуориметрических исследований были подтверждены результатами исследования клеточного дыхания тимоцитов. Показано,

что уровень поглощения кислорода тимоцитами крыс после введения ГК в дозе 250 мкг /кг в 1,6 раза выше уровня поглощения кислорода тимоцитами интактных крыс. В то же' время, иммобилизация животных в течении 1 часа снижала уровень клеточного дыхания тимоцитов в 1,8 раза по сравнению с тимоцитами интактных крыс.

Поскольку, интенсивность поглощения клетками кислорода пропорциональна в отсутствии разобщителей уровню процессов окислительного фосфорилирования в митохондриях и, следовательно, потенциалу на их мембранах, можно заключить, что полученные нами данные полярографического исследования подтверждают, что стрессовое воздействие приводит через 60 минут после его начала к снижению , а инъекция ГК к увеличению А Ут.

3.11. ИССЛЕДОВАНИЕ ВЛИЯНИЕ ФАРМАКОЛОГИЧЕСКИХ ПРЕПАРАТОВ, ОБЛАДАЮЩИХ АДАПТОГЕННЫМ ДЕЙСТВИЕМ,НА СОСТОЯНИЕ ТИШЦИТОВ, ОЦЕНИВАЕМОЕ ПО УРОВНЮ Т»ет

Главная цель нашего исследования - создание метода скрининга адаптогенов'на основе экспресс оценки стрессовой реакции. В рамках этой работы не было возможности апробировать разрабатываемый наш метод в широком спектре адаптогенов, но необходимо было показать принципиальную возможность скрининга адаптогенов этим методом на примере иввестных адаптогенов различного происхождения.

В качестве таких веществ нами были выбраны продигиоэан - ЛПС, получаемый из клеточных стенок В. РгоШ^югит и сапарал - суммарная фракция тригерпеновых гликозидов из корней Аралии Маньчжурской.

Сапарал и продигиозан (фармакологические препараты с выращенной антистрессовой и адаптогенной активностью) через 60 мин.

после внутрибрюшинной инъекции отменяли те изменения Fte«, которые наблюдаются в эти сроки при стрессовом воздействии (рис.Б), а при введении сапарала в дове 0,25 Мкг/кг наблюдалась тенденция к увеличению среднего значения F*c« в тимоцитах подопытных крыс.

Таким образом, указанные препараты отменяли результат стрессового воздействия, и их эффект (отмену снижения Fв ответ на внутрибрюшинную инъекцию или увеличение этого параметра) формально можно рассматривать как антистрессовый.

На следующем этапе работы необходимо было оценить возможность исследования с помощью данного метода адаптогенных свойств вещества, для которого адаптогенная активность только предполагалась. Если такие свойства исследуемого вещества будут обнаружены в данном тесте и будут подтверждены в дополнительных исследованиях другими методами, - можно считать, что метод в принципе подходит для отбора адаптогенов.

3.12. ИССЛЕДОВАНИЕ АНТИСТРЕССОВЫХ СВОЙСТВ КУКУЫАРЖХЗИДА 1ГО ОЦЕНКЕ F*<* В ТИМОЦИТАХ КРШ Веществом, биологически активные свойства которого давно исследуются в нашей лаборатории, является кукуыариоэид <КЫ) -суммарная фракция тритерпеновых гликозидов из голлотурии Cucumarla Japónica (Еляков Г. Б., Стоник В. А. ,1986). На период наших исследований для КМ было показано иммуномодулируицее, адь-ювантное и неспецифически протективное действие к инфекционным

г

заболеваниям . Исходя из его структурного сходства с известными адаптогенами растительного происхождения (семейство аралиевых) и широкого спектра неспецифических защитных свойств, можно предположить наличие у КМ адаптогенной и антистрессовой активности.

Исследования показали, что через 60 минут после внутрибршин-

йВ>.

Рис.5. Интенсивность ¡Тяуорес-ценции в тимоцитах крыс через I час после введения адаптогенов: I-интактныа животние, 2- после введения сапарала /5мкг/кг/, 3- после введения сапарала /0,25 мкг/кг/, 4- после введения продигиозана /25 мкг/кг/. Концентрация ДСМ в пробе - 0,5 мкМ. Содержание клеток в пробе 20 х Ю4 в мл.

»- —«

Рис.6. Интенсивность |Тшуорес-ценции ДСМ в тимоцитах крыс после введения кукумариозида. I- интакт-ние животние, 2,3- через I час после введения, 4,5- через 2 часа после введения; 2,4 - введённая доза 5 мкг/кг,' 3,5 - введённая доза 0,25 мкг/кг. Кощентрация ДСМ в пробе 0,5 мкМ. Содоржание клеток в пробе - 20 х 10* в мл.

ного введения КМ в концентрации 5 мкг/кг отменяется снижение Ften, сопровождающее внутрибрюшинную инъекцию как стрессогенный фактор, . а в концентрации 0,25 мкг/кг приводит к увеличению среднего значения F*t» в 1,5 раза. Эффект сохраняется и через 2 часа после инъекции КМ (рис. 6).

Эффект адаптогенов сохранялся и при более сильных стрессовах воздействиях. Так введение непосредственно перед иммобилизацией КМ, также как и сапарала в одинаковой дозе 0,25 мкг/кг отменяло снижение F»с-н в тимоцитах, сопровождающее это стрессовое воздействие .

Если адаптогенные свойства КМ обнаруженные в данном тесте будут подтверждены другими методами, эффект отмены снижения в ответ на стрессовое воздействие можно будет считать характерным для адаптогенов, а предлагаемый нами метод - адекватным методом скрининга веществ с адаптогенной активностью.

3.13. ВЛИЯНИЕ КУКУМАРИОЗИДА НА ВОССТАНОВЛЕНИЕ КЛЕТОЧНОГО СОСТАВА ТИМУСА И СЕЛЕЗЕНКИ ПОСЛЕ СИЛЬНОГО СТРЕССОВОГО ВОЗДЕЙСТВИЯ, ПРИВОДЯЩЕГО К ДИССТРЕССУ

Адаптогенные свойства КМ оценивали по его влиянию на восстановление клеточного состава тимуса и селезёнки после 20 часовой иммобилизации крыс. Было показано, что КМ также как и сапарал ускорял восстановление клеточного состава тимуса и селезёнки по сравнению с контролем. Так на пятые сутки после иммобилизации на фоне введения КМ количество ЯСК в тимусе достигало 90% от исходного а в селезёнке 83%, в то время как в группе интактных животных лишь 55% и 69% соответственно. Полное востановление клеточного состава тимуса и селезёнки наблюдалось к 9 суткам после воздействия в то время как в контроле содержание ЯСК в тимусе и се-

- 21 -

лезёнке было значительно ниже нормы.

Таким образом и в данном тесте КМ проявлял антистрессовые свойства.

3.14. ИССЛЕДОВАНИЕ АДАПТОГЕННОЙ АКТИВНОСТИ КУКУМАРИОЗИДА ПРИ ВЫЖИВАНИИ МЫШЕЙ В ЭКСТРЕМАЛЬНЫХ УСЛОВИЯХ

Адаптогенные свойства ЮЛ исследовались также в тесте на общеукрепляющее адаптогенное действие, характерное для фитоадаптоге-нов полученых ив корней и вегетативных частей семейства аралиевых. С этой целью исследовали влияние КМ и сапарала на сроки выживание мышей в экстремальных условиях (без пиши и питья).

КМ, также как и сапарал, в доэе 250 мкг/кг продлевал среднее время жизни мышей без пищи и питья до б суток по сравнению с В сутками в контроле ( определённая по критерию Вилкоксона - Манна - Уитни Р<0,05), и, следовательно, оказывал явное адаптогенное действие.

На основании данных представленных в двух последних разделах можно сделай вывод, что для КМ характерны адаптогенные свойства аналогичные свойствам сапарала.

Таким обравом,свойства адаптогена, проявленные КМ в предлагаемом нами флуоресцентном экспресс-тесте, подтверждены при исследовании адаптогенной активности кукумариовида другими методами. А, следовательно; можно сделать вывод о пригодности предлогаемого нами теста для скрининга адаптогенов.

В то же время, сходство эффектов, проявляемых в нашем тесте кортикостероидами (гормоны стресса) и адаптогенами, ставят новый вопрос об адекватности метода скрининга ПЬиску причины сходства эффектов адаптогенов и ГК был посвящен следующий этап работы.

3.15. ВЛИЯНИЕ ВВЕДЕНИЯ АДАПТОГЕНОВ И ГИДРОКОРТИЗОНА НА УРОВЕНЬ 11 - ОКСИКОРТИКОСТЕРОИДОВ В ПЛАЗМЕ КРОВИ КРЫС

На основании сходства эффектов, проявляемых в тесте, нами' было сделано предположение, что введение ГК и адаптогенов приводит к одинаковым изменениям гормонального статуса организма. Поэтому было проведено исследование содержания 11-ОКС в плазме крови ин-тактных крыс, через час после инъекций адаптогенов и после 1 часа иммобилизации.

Введение сапарала, кукумаиозида в дозе 0,25 мкг/кг и гидрокортизона в дозе 250 мкг/кг приводило к снижению среднего значения концентрации 11-окс в среднем на 20% через час после инъекции, иммобилизация приводила к резкому увеличению более чем в 1.5 раза концентрации И-ОКС в плазме.

Таким образом , введение адаптогенов кукумариозида и сапарала в отсутствии действия сильных стрессовых факторов приводит к снижению уровня 11-оксикортикостероидов в плазме крови крыс. К такому же эффекту приводит в те же сроки введение гидрокортизона который сам является представителем 11 - оксикортикостероидов. По видимому это сходство влияния адаптогенов и гидрокортизона на уровень и-оксикортикостероидов лежит в основе сходства эффектов этих веществ в предлагаемом нами тесте.

Выяснение механизмов снижения адаптогенами и гидрокортизоном уровня КС, должно стать темой самостоятельной работы.

4. ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Таким образом, в результате проведённой работы, зарегистрировано в первые 40 - 60 минут действия стрессорного фактора изменение состояния тимоцитов, выражающееся снижением Л^л Эффект зависит от силы стрессового воздействия и отменяется введением

адаптогенов различного происхождения: продигиозаном, сапаралом и кукумариозидом. Отмена снижения в ответ на стрессовое воздействие является следствием снижения уровня КО в крови подопытных крыс при введении адаптогенов. Всё вышесказанное позволило разработать адекватный метод скрининга адаптогенов, основанный на регистрации с помощью флуоресцентного зонда ДОМ изменений ЛУя в тимоцитах крыс. С помощью предлагаемого теста можно проводить быстрый первичный скрининг адаптогенов из большого числа исследуемых веществ.

6. ВЫВОДЫ

1.0 помощью потенциалчувствительных флуоресцентных зондов ДСМ и сПБ - - (5) впервые показано, что на ранних стадиях стрессовой реакции развивается снижение потенциала митохондрий тимоцитов, которое зависит от силы стрессового воздействия и позволяет количественно оценить развитие стресса.

2. Внутрибрюшинное введение крысам непосредственно перед стрессовым воздействием адаптогенов (продигиозана и сапарала), а также гидрокортизона отменяло эффект снижения трансмембранного потенциала митохондрий тимоцитов, вызываемый стрессом.

3. Обнаруженное сходство эффектов адаптогенов и гидрокортизона является следствием снижения концентрации 11-оксикортикостероидов в крови крыс через 60 минут после введения как адаптогенов, так и гвдрокортизона. ■

4. Возможность быстрой оценки адаптогенного действия БАВ с помощью потенциалчувствительного флуоресцентного зонда ДСМ была положена в основу экспресс-метода скрининга адптогенов.

5. С помощью этого метода впервые обнаружена адаптогенная активность у иммуномодулятора кукумариозида. Адаптогенные свойства кукумариозида подтверждены в' других тестах.

СПИСОК РАБОТ ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕШ ДИССЕРТАЦИИ

1. Преображенский А. Б. , Рубцов Б. Е , Горина Е. А. Ранние изменения состояния тимоцитов при стрессовом воздействии на организм. Москва, 1989, Деп. в ВИНИТИ. 06.06.89, N 3715 - Е Реф. в Вюл. экспер. биол. мед., 1989, т. 58, N 12, с. 763.

2. Преображенский А. Б. , Рубцов Б. Е Исследование трансмембранных потенциалов на плазматической мембране и мембранах митохондрий тимоцитов крыс в ранние сроки развития стрессовой реакции с помощью потенциалчувствительных флуоресцентных эондов. Биофизика, 1991, т. 36, N 4, с. 628 - 631.

3. Преображенский А. Б., Рубцов Б. Е Исследование антистрессовой активности кукумариозида при кратковременном и длительном ' стрессовом воздействии на крыс. Всесоюзн. совещ. "Биологически активные вещества гидробионтов - новые лекарственные, лечебно-профилактические и технические препараты", Владивосток, 1991, с. 92.

4. Преображенский А. Б. , Рубцов' Б. Е , Шарова Л. В. , Седов А. М. Исследование адаптогенных свойств кукумариозида при выживании мышей в экстремальных условиях. Всесоюзн. совещ, " Биологически активные вешэства гидробионтов - новые лекарственные, лечебноп-рофилактические и технические препараты. "Владивосток, 1991, с. 96.

5. Preobrazhensky А. В., Rubtsov В. V. Transmembrane potential of rat thymocyte mitochondria following the short time stress (method of the fluorescent probe). Constitutuent congress

I

International society for pathophysiology, Moscow, 1991, P. 216.