Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Лимфоидная система в регуляции кроветворения в облученном организме

ВАК РФ 03.00.01, Радиобиология

Автореферат диссертации по теме "Лимфоидная система в регуляции кроветворения в облученном организме"

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ МЕДИЦИНСКИХ НАУК , ШШШСКИИ РАДИОЛОГИЧЕСКИЙ НАУЧНЫЙ ЦШГР

Г о

ОЛ .

•На правах руко:зчск ; СЕМИНА Ольга Вячеславовна

ЛИМФОВДНАЯ СИСТЕМА В РЕГУЛЯЦИИ КРОВЕТВОРЕНИЯ В ОБЛУЧЕННОМ ОРГАНИЗМЕ

03.00.01.- радиобиология

Диссертация на соискание ученой степени доктора оиологических наук в форме научного доклада, . г '

оонинск -1993

Диссертационная работа выполнена, в Медицинском радиологическом научном центре РАМН

Нзучный консультант: доктор биологических наук, профессор А. М. Поверенный

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор,'

член-корреспондент АЕН РФ И Я Арион доктор биологических наук, профессор И. Е Яилилпович доктор медицинских наук, профессор Г. Ф. Палыга

Ведущая организация: Институт иммунологии Ю РФ, Москва

Зашита диссертации состоится "/о" и<аЬТ& 1994 г. в 11 часов на заседании специализированного Совета Л 001.11.01 в Медицинском радиологическом научном центре РАМН (249020, г. Обнинск Калужской области, ул. Королева, 4)

С диссертацией молшо ознакомиться в библиотеке Медицинского радиологического научного центра РАМЕ

Научный доклад разослан " " 1994 г. V .'

Ученый секретарь специализированного Совета доктор медицинских наук

Е А. Куликов

Использовавшие сокращения КОЕ-С - колониеобразупцие единицы селезенки; КОЕ-С-8 -колонне образующие единицы селезенки, формирующие колонии на 8 сутки роста; K0E-C-I2 - колониеобразуйте единицы селезенки,. формирующие колонии на 12 сутки роста; НКС - нормальная кроличья сыворотка; СПГММ - кроличья сыворотка против головного мозга мышей; ФИО - фактор некроза опухолей; 1К-К0Ф - грану-лоцитарно-макрофагальный колониестимулирущий фактор; ИГЛ -предшественники Т-лимфоцитов; ИЛ-1 - интерлейкин - I; ИЛ-2 -интерлейкин - 2; Кон А - конканавалин А; ОМ - оксимочевина; ДС - декстрансулъфат; в/б - внутрибрюпшнная инъекция; в/в - внутривенная инъекция.

Актуальность проблемы Повреждение пула стволовых кроветворных клеток ионизирующим излучением во многом определяет тяжесть лучевой болезни, т.к. по общему мнению эти клетки являются детерминантами выживаемости животных в костномозговом диапазоне доз облучения. Меру поражения данной популяции оценивают,как правило, методом селезеночных колоний, . исходя из постулата "одна стволовая клетка - одна колония".

Вслед за появлением в литературе сведений о несомненном вкладе Т-лим^оцитов в процессы кроветворения, об участии этих клеток в пролиферации и диф^еренцировке аллогенчых стволовых кроветворных клеток (Петров Р.В, Сеславина Л.С.,1967; Петров Р. В., Швец В.Н.,1973; Coodman, Shtnpook, 1968) нами было начато изучение взаимосвязи между лимфэидной и кроветворной системами

при сингенных пересадках костного мозга. В процессе исследований установлено наличие вспомогательных для колониеооразования клеток среди.популяции тимоцитов, которые обладают как хелпер-ными, так и супрессорными свойствами. Эти данные позволили нам предположить, что кроме центральной роли эффекторов и регуляторов в системе иммунитета т-лимфоциты способны играть такую же роль и в гемопоэзе, являясь составной частью кроветворного микроокружения. Если это так, то и формирование селезеночных колоний может определяться не только непосредственно полипо-тентными колониеобразущими клетками (КОЕ-С), но и другими популяциями, отличающимися по чувствительности к радиации и прочим поврездающим агентам. В этом, случае поражение .именно этих акцессорных клеток, изменение их способности к взаимодействию с кроветворными предшественниками может быть причиной депрессии колониеооразования. Следовательно, радиационное поражение лимфоцитов не только играет существенную роль в нарушении функционирования иммунной системы, но и способно оказать значимое влияние на развитие костномозгового синдрома в облученном организме.

это положение определяет актуальность исследований участия ликцюидных клеток в развитии костномозгового синдрома, приводящего к гибели животных и человека при умеренных дозах облучения, а поэтому разработка подходов к исследованию характеристик кроветворных .стволовых клеток, ., позволяющих оценивать вклад в проявление их свойств популяций вспомогательных '¡'--лимфоцитов, лимфокинов и цитокинов, а также попытка найти адекватную замену данным компонентам является актуальной.

- о -Цели и задачи

исновная цель раооты - исследование роли популяции 'Г-лим-фоцитов и лимфокинов в гемопоэзе, в частности, в процессах селезеночного колониеооразования, а также попытка оценить вклад этих популяция в некоторые из известных радиобиологических характеристик КОЕ-С. Реализация поставленной цели была связана с решением следующих конкретных задач:

- изучить роль акцессорных клеток в процессах селезеночного колониеооразования;

- установить возможный механизм их действия на формирование селезеночных колоний;

- изучить роль Т-супрессоров в образовании селезёночных колоний;

- рассмотреть возможную регулирующую роль акцессорных 1'-клеток в образовании колоний стволовыми клетками эмбриональной печени, а также длительной культуры костного мозга;

- охарактеризовать такие параметры КОЕ-С как радиочувствительность, миграция с точки зрения участия в колониеооразо-вании вспомогательных Г-лимфоцитов;

- исходя из гипотез об идентичных путях регуляции в иммунной и кроветворной системах, исследовать возможность участия в процессах образования колоний из облученного костного мозга лимфокинов (ИЛ-2) и цитокинов (ФИО).

Научная' новизна

Впервые в костном мозге обнаружена популяция вспомогательных или "акцессорных" клеток, присутствие которых наряду с

К.ОК-С необходимо для образования как ранних (КОЕ-С-8), так и поздних (K0E-C-I2) колоний на селезенках летально облученных мышей. Эти клетки чувствительны к СПГММ, принадлежат к ранним предшественникам лимфоцитов, их функция состоит в обеспечении нормальной скорости пролиферации гемопоэтических КОЕ-С. Клетки, подобные этим содержатся в небольших количествах и в тимусе . Впервые обнаружено регулирующее влияние Т-супрессоров на селезеночное колониеооразование. Впервые продемонстрировано, что контрольныемеханизмы регуляции КОЕ-С "хелперы-супрессоры" складываются в эмбриональных очагах кроветворения к моменту рождения. Впервые показано, что при повреждении популяции "акцессорных" для колониеобразования Т-клеток могут меняться такие характеристики КОЕ-С как радиочувствительность или миграция.. Впервые обнаружено стимулирующее действие ИЛ-2 на селезеночное колониеобразование облученным in vitro костным мозгом (до2,0Гр), которое обуславливается, вероятно, более интенсивной репарацией вызванных облучением повреждений КОЕ-С под действием данного лимфокина. Показано, что радиопротекторное действие ФНО связано с его способностью стимулировать пострадиационное восстановление КОЕ-С, во многом за счет интенсификации репарационных процессов в полипотентных K0E-C-I2.

Практическая ценность работы. Исследования, составляющие содержание данной работы, имеют фундаментальный характер. Однако полученные сведения вносят большой вклад в современные представления о механизмах ре-

гуляции начальных этапов гемопоэза, что кажется чрезвычайно важным в свете представлений о доминирующей роли стволовых кроветворных клеток в выживании животных при воздействии костномозговых доз облучения. Приведенные факты, по нашему мнению, должны учитываться при анализе характеристик поражаемости популяций стволовых кроветворных клеток. Они также открывают перспективу поиска лечебных воздействий, нормализующих кроветворение в облученном организме, а также могут быть использованы для дальнейшего изучения патогенеза лучевой болезни. Кроме того, глубокое и всестороннее изучение взаимосвязи лимфоидной и гемопоэтической систем может внести знание новых элементов в сложную модель регуляции гемопоэза, что, в свою очередь, окажется весьма полезным в клинической практике для понимания патогенеза некоторых заболеваний крови, улучшенного приживления-костномозговых трансплантатов, снижения миелотоксических эффектов радиотерапии. - . '

Представляемые данные о стимуляции лимфокинами и цитоки-нами гемопоэза в облученном организме, возможность защиты ранних гемопоэгических клеток-предшественников от действия ионизирующей радиации . с их помощью, а также известные иммуномодулирующие и противоопухолевые свойства этих препаратов могут быть использованы при разработке схем комбинированной (цитостатики+оолучение) терапии злокачественных.опухолей, которая часто лимитируется гибелью клеток, обеспечивающих кроветворение в организме. . ^

Основные положения, вшосимые на защиту I. Для образования колоний на селезенках облученных мышей необходима кооперация стволовых кроветворных клеток с ак-цесорными 'Г-лимфоцитами, чувствительными к СПГММ. Обнаруженная нами популяция акцессорных клеток в костном мозге мышей не влияет на направление дафференцировки КОЕ-С, а их функция состоит в обеспечении скорости пролиферации этих клеток. В процессах колониеооразования принимают участие и Т-клетки супрес-соры, активируемые митогеном Кон А. Механизм регуляции стволовых кроветворных клеток "хелперы-супрессоры" складывается в очагах эмбрионального гемопоэза у мышей к моменту рождения.

2. Радиобиологические характеристики КОЕ-С, определяемые методом селезеночных колоний, зависят не только от свойств этих клеток, но и от состояния акцессорных 'Г-лимфоцитов,являющихся частью кроветворного микроокружения. При рассмотрении значений выживаемости КОЕ-С после воздействия ионизирующей радиации необходимо учитывать и степень поражения акцессорных клеток.

3. Регуляция КОЕ-С Т-лимфоцитами осуществляется как путем межклеточных взаимодействий, так и посредством выделяемых микроокружением лимфокинов и других цитокинов. один из лимфокинов - ИЛ-2 обладает способностью повышать выход экзогенных селезеночных колоний из облученного in vitro костного мозга за счет стимуляции процессов репарации повреадений КОЕ-С-8, вызванных воздействием ионизирующей радиации. Радаопротекгорное действие одного из цитокинов (ФНО) связано с интенсификацией пострадаа-

- ? -

ционннх репаративных процессов K0E-C-I2.

Апробация работы

Материалы работы доложены и обсуждены на Всесоюзном симпозиуме "Радиочувствительность и процессы восстановления у животных и растений",Ташкент,1980, Всесоюзной конференции "Радиобиологические основы лучевой терапии", Ленинград, 1980, Объединенном пленуме Научных Советов АН и АМН СССР, Москва, I98Q, Международном симпозиуме "Теоретические основы модификации радиочувствительности", Алма-Ата,1980, 9-ой Всесоюзной конференции "Восстановительные и компенсаторные процессы при лучевых поражениях",Ленинград, 1983, Мевдународном симпозиуме "Стромальная и Т-клеточная регуляция кроветворных стволовых клеток", Москва,1984, Всесоюзной конференции "Управление радиочувствительностью в лучевой терапии злокачественных опухолей", Алма-Ата, 1987, Рабочем совещании "Гомеостаз при радиационном повревдении организма" Путцино, 1987, I Всесоюзном Съезде радиобиологов, Москва, 1989, Всесоюзном рабочем совещании "Эффекторные и регуляторные функции иммунной системы", Суздаль, 1989, Всесоюзной конференции "Активация кроветворения и радиорезистентность организма", Обнинск, 1990.

Отдельные разделы работы выполнены совместно с Зажирей В. Д., Коротаевым Г.К.(ВНИИТКГП, Москва), Манько В.М..Рудневой Т. Г.(Ин-т иммунологии МЗ РФ), Коробко С.А., Чувпило В.Г.(ИБХ,Москва).

- в -

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ Материалы и метода Опыты проведены на линейных мышах-самцах и самках СБА, C57BL, (СБА х C57BDP1, (СБА х DBA)F1 в возрасте примерно 2,5 мес. Облучение животных проводили гамма-лучами 60Со при мощности дозы примерно 1,0 Гр/мин. Мышей-реципиентов облучали в дозе 8,5 Гр. В работе использованы следующие препараты: окси-мочевина (Serva, ФРГ), винбластин (Рихтер, Венгрия), конкана-валин A (Calbioohem, Швеция), эндотоксин E.ooli (Difco, США), декстрансульфат (Serva,ФРГ), тимозин (НИИ технологии кровоза-менителей и гормональных препаратов), ИЛ-2 (МНГК "Биоген", Рига), ФНО - рекомбинантный получен в ИБХ РАН, Москва, а также сыворотки: кроличья иммунная сыворотка против головного мозга мышей получена по методу Golub (1972) с некоторыми модификациями, вллоиммунная сыворотка против мышиного антигена йгу-1 ,г предоставлена проф. A.A.Ярилиным (МРНЦ РАМН, Обнинск). Клетки длительной культуры костного мозга мышей получены из Российского гематологического центра, лаб'. проф.И.Л.Черткова (Москва). Основные методы исследований включали: метод экзогенные селезеночных колоний, метод эндогенных селезеночных колоний (Till, MacCullooh.,1961), определение (Г) фактора оседания КОЕ-С (Siaenovioh et al, 1963), определение времени удвоения КОЕ-С (Silasen, Edelstein, 19ВЗ), определение индекса репарации КОЕ-С (Тодрия T.B.I978), определение ядросодержащих клеток в костном мозге, селезенке, крови. За выживаемостью животных наблюдали в течение 30 сут после облучения. Некоторые методы нами модифицированы. Статистическую, обработку результатов проводи-

ли, применяя общепризнанные метода вариационной статистики. Число колоний в таблицах и в тексте дано на Ю5 клеток вводимых кроветворных взвесей.

Введение

Костномозговой синдром является непосредственной причиной гибели индивидуума в первые недали посла действия на организм излучения в дозах 3-8 Гр. Знание механизмов его развития является определяющим для понимания патогенеза лучевой болезни и, следовательно, разработки методов ее лечения.

Основополагающее свойство кроветворной системы - постоянное клеточное обновление. В последние 30 лет семоподдержание кроветворных тканей интенсивно исследуется, причем особое внимание концентрируется на стволовой кроветворной клетке, обладающей способностью самоподдерхнваться и продуцировать кооптированные к определенному пути дафференцировки предшественники. Именно их популяция обеспечивает не только клеточное обновление в норме, но и регенерацию системы после различных гемопоэтических стрессов. Знания, которыми мы располагаем в отношении стволовых, клеток, в основном, получены в результате изучения колониеобразующих единиц селезенки (КОЕ-С) с помо'щью метода, созданного ТШ& MaoCulloch. в 1961 г. КОЕ-С - это экспериментально выявленный стволовой элемент, образующий видимые колонии на селезенке и способный обеспечить все ростки кровет- • ворения (Чертков, фрвдеклтейн, -1977). Их популяция гетероген-на, в нее входят разные по пролифоративному потенциалу клетки-предшественники гемотоэза. Часть из них образуют транзиторныв

колонии на 7-8 сутки роста (КОЕ-С-8) - наиболее дифференцированные, имеющие небольшое пролиферативный потенциал. Другая часть более молодые по степени дифференшровки, обладающие большим пролиферативним потенциалом клетки, образующие колонии на селезенке на 11-12 сутки роста (К0Е-С-12).0ни способны продуцировать дочерние КОЕ-С и обеспечивать не только эритроид-ную, миелоидную, но и лим^оидную репопуляцию после облучения (bord. Dexter, 1988). При всем этом даже они не являются действительно стволовыми клетками, т.к. не способны к бесконечному самоподдерканию (Чертков, 1986). По существувдим представлениям КОЕ-С достаточно радиочувствительная популяция: DQ для нее порядка I Гр, п = 1,5 - 1,0. Причем КОЕ-С-8 и KQE-C-I2 мало отличаются по этим параметрам (Конопляншков, 1984, Ган, Ко-ношияников, 1989).

Субстратом, обеспечивающим и поддерживающим жизнедеятельность полилотентных предшественников, юс пролиферацию* и диффе-ренцировку служит кроветворное микроокружение.Регуляция проявления потенций кроветворных предшественников в этом случае является короткоранговой и реализуется через взаимодействие с его элементами - совокупностью клеток и внеклеточных факторов, составляющих строму кроветворных органов (Чертков, Гуревич, 1984). Одной из составных частей микроокружения являются Т-лимфоциты, оказывающие регуляторное воздействие на предшественники кроветворения различной степени полипотентнос- ' ти. Регуляторные функции микроокружения могут осуществляться как за счет межклеточных взаимодействий, так и посредством выделяемых цитокинов или лимфокинов.

- II -

Изучение природа и механизмов участия Т-лимфоцитов в процессах гемопоэза активно началось с коша 60-х годов. Вначале, после работ Р.В.Петрова и Л.С.Сеславиной (1967) все эксперименты проводили на несингенных стволовых клетках (феномен ал-логенного ингибирования).С использованием этой системы были подробно охарактеризованы дифференцировочные Т-лимфоциты (Манько, 1978). Позднее разработаны модели, позволяющие исследовать регулирующее воздействие на кроветворение и сингенных тимоцитов. В результате получены данные о возможности стимуляции колониеобразования облученным костным мозгом при введении его совместно с суспензией тимоцитов (Lord, Sohotield, 1973), сообщалось о потенцировании роста кроветворных колоний in vitro с помощью Т-лимфоцитов (Ketoalf, 1968). Показано также, что костный мозг от неонатально тимэктомированных или с врожденным отсутствием тимуса мышей дефектен в способности восстанавливать кроветворение у облученных реципиентов (Zipori, Trainin, 1975).

Одним из наиболее важных достижений в исследовании регуляции роста и дифБэренцкровки гемопоэтичвских клеток было открытие, очистка, получение рекомоинантных препаратов и функциональная характеристика серий секретируемых регудяторных белков (цитокинов), многие из которых' продуцируются Т-лимфоцитами (лимфокины). Вначале последние рассматривали в качестве компонентов иммунорегуляции, действующих на строго ограниченные типы лимфоидаых клеток, но в последующем выяснилось, что число клеток-мишеней этих факторов достаточно велико, среди них -кроветворные клетки-предшественники различной степени коммитиро-

ванности. К настоящему времени продемонстрировано, что основная функция цитокинов и лимфокинов в гемопоэзе заключается в поддержании пролиферации и выживания гемопоэтических предшественников, в индукция дифференцировки, наолвдаемая в данном случае, является, в большой степени, кажущейся (Огава, 1990; Viliams et al,1990; UetoaXX, 1989; Huller-Sieburg et al, 1988; Uochizuki et al, 1987). Особый интерес, проявляемый радиооио-логами к проблеме регуляторного влияния цитокинов, вызван появившимися в последнее время сведениями о радиозащитных свойствах таких препаратов как ИЛ-I, ®0, Ш-КОФ, гамма-интерферон и др. (Семина и др. 1978; Семина и др., 1974; Рогачева и др. 1990; Наta at al, 1966; Meta, Oppenheim, 1988). При облучении в дозах, вызывающих костномозговой синдром, их влияние, в значительной степени, может быть связано с участием в регуляции размножения, дифференцировки и созревания гемопоэтических предшественников. Очевидно,что для понимания функционирования компартмента стволовых кроветворных клеток в этих и других случаях недостаточно знания только внутренних свойств самих стволовых клеток, необходимо разобраться и в принципах функционирования второго партнера межклеточных взаимодействий - системы кроветворного микроокружения, в частности, популяции Т-лимфоцитов.

• I. Т-клеточная регуляция колониеобразования. 1.1. Регуляция образования селезеночных колоний вспомогательными ("акцессорными") Т-лимфоцитами. В 1972 г. Со1иЬ сообщил, что сыворотка против головного

мозга мышей , используемая обычно как антитимоцитарная, может перекрестно реагировать с гемопоэтическими стволовыми клетками, что выражается в резком уменьшении колониеобразуицей активности костного мозга, обработанного сывороткой. Некоторые исследователи попытались применить СПГММ как инструмент для изучения поверхностных маркеров стволовых клеток, считая, что антиген sc-1, обнаруженный на них с помощью сыворотки, общий с клетками головного мозга, является специфическим именно для плюрипотентных стволовых кроветворных клеток (van . den Engh, Golub, 1974). Однако, кроме активности против КОЕ-С СПГММ содержит антитела к Т и В-лимфоцитам, эритроцитам и т.д. (Golub, i973;Rodt et al, 1974; Filppi et al, 1975). Эти сведения о полиспецифичности сыворотки послужили основанием для предположения, что СПГММ может инактивировать не КОЕ-С, а иную популяцию клеток, участвующих наряду со стволовыми в процессе формирования колоний на селезенках облученных мышей.

Мы воспроизвели данные Golub и попытались выяснить, связан ли этот эффект с прямым действием антисыворотки на полило-тентные кроветворные клетки-предшественники. Для этого суспензию клеток костного мозга инкубировали с СПГММ или (НКС) в течение I ч при 37°С в следующих соотношениях: 0,1 мл суспензии клеток, 0,1 мл СПГММ или НКС, 0,1 мл комплемента'или среды 199 на р-ре Хенкса. После инкубации отмытые центрифугированием и ресуспендированные в свежей среде клетки костного мозга вводили летально облученным реципиентам.В некоторых случаях за 30 -40 мин до этого реципиенты получали инъекцию интактных тимо-цитов. Результаты опытов, представленные в таблице I.I., пока-

' - 14 -

зывают, что инкубация- клеток костного мозга с ОПТОМ вне зависимости от присутствия комплемента на 80% уменьшает колониеооразувдую активность этих клеток по сравнению с инкубацией ИКС. Некоторое уменьшение количества колоний под действием последней, по-видимому, может быть связано с неспецифическим ее эф!ектом. У мышей, получивших костный мозг, обработанный СПГММ, и тимоциты, выход колоний почти в 4 раза превышал таковой у реципиентов одного костного мозга, проинку-

Таблица 1.1.

Влияние инкубации клеток костного мозга с СПГММ на образование экзогенных селезеночных колоний.

Обработка костного Клетки Кол-во Среднее кол-во

мозга тимуса мышей колоний Р

2хЮ7кл

- - 29 12,9 4 0,9

- + 24 13,7 ± 1.2

ИКС - . 20 9,8 + 0.7

СПИМ 32 1,9 ± 0,4*

СПГММ + ■ 35 7,9 + 1,0 <0,001

СПШЫ+комплемент 19 1,9 ± 0,5

СПГИМ+комплемент + 19 9,0 ± 1,1 <0,001

комплемент . - : 20 11,9 ± 0,9

контроль облучения - 17 0,3

контроль облучения : + 14 0,7

Оированного с сывороткой, и составлял 80-85% от контрольного уровня. Полученные результаты свидетельствуют в пользу предположения, что СПГММ Инактивирует отнюдь не КОЕ-С, а популяцию вспомогательных клеток, необходимых для образования колоний и находящихся в костном мозге. функции элиминированной СПГММ популяции клеток принимают на себя тимоциты, инъецированные реципиенту. При этом эффективность восстановления колончеобразу-ющей способности костного мозга, обработанного СПГММ, зависит от дозы вводимых клеток тимуса. С ее увеличением возрастает количество колоний, достигая максимума при соотношении вводимых клеток костного мозга и тимоцитов 1:150 - 200. Дальнейшее увеличение концентрации последних приводит к уменьшению выхода колоний, что может быть обусловлено снижением эффективности взаимодействия при/ увеличении клеточной массы в системе (Monette, 1981).

Приведенные результаты, вероятно, дают основание для утверждения, что метод инактивации КОЕ-С с помощью СПГММ не пригоден для оценки выраженности SC-1 антигена на их поверхности, так как с этими клетками сыворотка не связывается более специфично, чем с другими из костного .мозга (Попов и др., 1988; Press et al, 1977; Trask, van den Engh, 1979).

. Наблюдаемая стимуляция тимоцитами подавленного СПГММ ко-лониеобразования не обусловлена изменением фактора оседания введенных КОЕ-С, что было продемонстрировано в работе Testa (Testa et ai, 1980) и воспроизведено нами. Следует отметить, что необходимость в кооперации с тимоцитами имеется лишь jr КОЕ

- 16 -

-С с высокой плотностью (1,075 г/см3) (Testa et al, 1980).

Исходя из настоящих данных можно предположить, что образованию селезеночных макроколоний предшествует прямое взаимодействие колониеобразунцей единицы и вспомогательной клетки -Т-лимфоцита. Подобное событие, вероятнее всего, реализуется на уровне костного мозга. Это предположение, в определенной мере, подтверждается результатами экспериментов, приведенными в таблице 1.2. Была исследована способность сингенных и полусинген-

Таблица 1.2.

Образование селезеночных колоний в условиях обработки костного мозга СПГММ и введения тимусных клеток от различных линий мышей.

Обработка костного мозга

Доноры тимоцитов 2хЮ7кл

Кол-во мышей

Среднее кол-во колоний

СПГММ СПГШ1 СПГММ

сшш

эндогенный фон

F1 СБА С57В1 F1 СВА С57В1

64 57 63 50 53 24 15 20

24

12,5 ± 1,2

1.2 ± 0,4*

8.3 ± 0,6 3,6 ± 0,5 2,1 ± 0,5

13.1 ± 1,3

12.4 ± 1,5

13.5 ± 1,7

0,5

<0,001 <0,05

Р

них тимоцитов восстанавливать колониеооразование из костного мозга, обработанного СПГШ. Облученным мышам-реципиентам наряду с кроветворной суспензией, проинкубированной с сывороткой, трансплантировали тимоциты мышей разных линий.Оказалось, что только тимоциты сингенных донору костного мозга мышей Р1 эффективно отменяли ингибирущее колониеооразование действие антимозговой сыворотки. Тимоциты мышей линии 057В1 ггаплотип Н-2В) не восстанавливали способность костного мозга гибридов формировать гемопоэтические колонии. Клетки тимуса мышей СВА (гаплотип Н-2К), генетически более близких к (СВА х С57В1)Р1, в незначительной степени отменяют эффект сыворотки.

Подавление сывороткой и последующее восстановление коло-ниеобразования тимоцитами происходит при тестировании колоний как на 8, так и на 12 супси роста (Таблица 1.3.). Таким образом, вспомогательные для колониеобразования клетки необходимы как для КОЕ-С с ограниченным потенциалом роста, так и для более полипотентннх КОЕ-С. Для выяснения, в каком состоянии и в какой фазе клеточного цикла находятся КОЕ-С; нуждающиеся при формирований селезеночных колоний во вспомогательной популяции, чувствительной к действию СПГММ, мы использовали ОМ, которая избирательно элиминирует клетки, находящиеся в 3-фазе. Донорам костного мозга вводили ОМ за 2 ч до взятия клеток, затем суспензию инкубировали с СШВД по стандартной схеме, инъъедаровали летально облученным реципиентам с добавлением тимоцитов иди без него, сказалось, что инкубация костно-

Таблица 1.3.

Образование колоний на селезенке после обработки костномозгового трансплантата СПГММ.

Трансплантат Среднее количество колоний

8 суточные 12 суточные

Костный мозг 11,7 ± 0,9 (31) 10,8 ± 0,6 (32)

Костный мозг+СПГММ 1,6 ± 0,3 (30) 1,6 ± 0,4 (31) Костный мозг+СПШМ р< 0,01

+ тимоциты 7,8 ± 0,7 (29) 7,2.* 0,5 (30)

мозговой суспензии от мышей, обработанных ОМ с сывороткой приводит к чуть большему, по сравдвнию с нормальным костным мозгом, подавлению селезеночного колониеобразования (0,7 ± 0,2 (94%) и 1,8 * 0,4(86%), соответственно). Аналогичный результат получен и после предварительной синхронизации клеток костного мозга двухкратным (за 16 и 2 ч) введением ОМ.

При изучении влияния СПГШ на пролиферируюций костный мозг в качестве активирующих агентов нами были взяты облучение и винбластин. Одну группу мышей-доноров облучали в дозе 4,0 Гр за 7 сут до взятия клеток костного мозга. К этому времени около 50% КОЕ-С находятся в Б-фазе клеточного цикла (Мопеие, Ветегв, 1982). Второй группе доноров за 4 сут до взятия костного мозга вводили винбластин. . Инъекция препарата в этот срок

значительно повышает содержание КОЕ-С в популяции костномозговых кариоцитов за счет их активной пролиферации (Коноплянни-ков и др., 1972). Инкубация костномозговой суспензии от обеих групп доноров с СПГММ приводит к одинаковому эффекту - подавлению селезеночного колониеоОразования на 80%.

Таким образом, популяция клеток костного мозга, чувствительная к действию СПГММ, не элиминируется ОМ, и в одинаксвоЯ пропорции представлена как в пролиферирующем, так и в нормальном костном мозге. Подобные результаты были получены Мопеде(1979) и трактовались как инактивация СПГММ непосредственно КОЕ-С.

Совокупность полученных данных дает основание для предположения, что процесс образования колоний на селезенках облученных мышей является результатом кооперации КОЕ-С и клеток, выполняющих вспомогательную роль по отношению к ним ("акцессорных"). Эффективность колониеоОразования зависит от состояния обоих популяций, их тесного взаимодействия, которое связано с распознаванием генетически детерминированных структур и требует генетической тождественности по Н-2 области контактирующих клеток. Кооперация с "акцессорными" клетками необходима как для КОЕ-С-8, так и для КОЕ-С-12, причем не зависит от стадии клеточного цикла КОЕ-С.

1.2. Вероятная природа клеточной популяции, способствующей селезеночному колониеобразованию.

Возможность восстановления колониеобразующей способности костномозговых клеток, обработанных СПГММ, интактными тимоци-

тами свидетельствует■о существовании в костном мозге и тимусе идентичных вспомогательных клеток.Мы попытались определить некоторые характеристики и природу этой акцессорной популяции.

Костный мозг мышей-доноров Р1 обрабатывали СПГММ или анти -тЪу-1,2 сывороткой. Тимоциты сингенных ¡швотных инкубировали с теми же сыворотками в присутствии комплемента.После инкубации отмытые центрифугированием тимоциты были ресуспендированы

7

в свежей среде и в количестве 2 х 1С кл на мышь вводили реципиентам за 30 - 40 мин до инъекции клеток костного мозга. Ги-мэктомированных мышей использовали через 4-5 мес после операции. Полученные результаты свидетельствуют (таблица 1.4.), что СПГММ, Истощенная головным мозгом, на уменьшает количества селезеночных колоний. Сыворотка, истощенная клетками интактного тимуса, гораздо слабее действует на колониеобразующую способность костного мозга, чем интактная СПГММ. Обработка костномозговой суспензии анти.-Г11у-1,2 сывороткой приводит к* небольшому снижению выхода селезеночных колоний. Значительный интерес представляют полученные нами данные о действии анти-тьу-1,2 сыворотки на клетки тимуса (таблица 1.4.). .Обработка ин-тактных тимоцитов этой сывороткой в присутствии комплемента и без него несколько (примерно на 2516) снижает способность клеток увеличивать колониеобразование костным мозгом, обработанным СПГММ. Обработка тимоцитов СПГММ в тех же условиях приводит к почти полной потере ими эффекта восстановления колони-еобразования. По всей видимости, й в тимусе, и в костном мозге содержатся практически идентичные популяции клеток, оказывающих хелперный эффект в отношении КОЕ-С в процессах колониеоб-

т

- ¿.I -

Таблица 1.4.

Влияние обработки костного мозга или тимусных клеток различными агентами на его колониеобразующую способность.

Костный мозг Клетки тимуса Кол-во Среднее количество (обработка) 2 х 10 кл' мышей колоний Р

- - 30 11,7 ± 0,9

• СПГММ - 33 1,4 ± 0,3*

СПГЬШ,истощенная

тимусом - 28 5,5 ± 0,8 < 0,05

СПШМ, истощенная

головным мозгом - 28 8,8 + 1,4 < 0,05

анти-Т11у-1,2 - 24 8,0 ± 0,8 < 0,05

ИКС - 23 9,3 ± 0,9 < 0,05

СПГММ + 30 8,4 + 0,8 < 0,05

СПГММ анти-ТЬу-1,2 23 6,3 + 1,0 0,05

СПГММ анга-ТЬу-1,2

+ комплемент 24 6,2 + 0,9 < 0,05

. СПШМ СПГММ 22 3,4 0,7 > 0,05

разования. Эта активная фракция тимоцитов повреждается СПШМ, относится к популяции долгоживущих тимоцитов, не элиминируемых из организма в течение 4-5 мес после тимэктомии, т.к. в результате инкубации костного мозга тимэктомированных _мышей с СПГММ мы наблюдали уменьшение количества селезеночных коло-'

' - '22

ний (интактные -3,2.t 0,6; тимэктом.- 1,1 ± 0,3). Причем, содержание их в тимусе незначительно, т.к. для устранения эффекта СПГММ на селезеночное колониеооразование треоуется большое количество тимоцитов (оптимальное соотношение 1:200).

Ми предположили (Семина и др.,1930), что клетками, обла-даидими акцессорными свойствами по отношению к колониеобразую-щим являются предшественники Т-лимфоцитов (ПТЛ) . Они содержатся как в костном мозге, так и в тимусе и несут БС-1+антиген (Nailor, Goldstein, 1979). Содержание их в костном мозге невелико - около 7-10%. Кроме того известно, что после истощения тимоцитами СПГММ реакция с последними исчезает, а с ПТЛ сохраняется, хотя и в меньшем титре(Basch, Radish, 1977). Эта гипотеза в последующем детально разработана А.А.Ярилиным .И.В.Мирошниченко .Н.А.Шаровой и др.(1985, 1987, 1989). С помощью ме-,тодов комбинированного фракционирования клеток костного мозга по скорости седиментации и маркерам они доказали, что процесс формирования селезеночных колоний осуществляется при кооперации КОЕ-С с предшественниками Т-лимфоцитов. Последние обнаружены как в костном мозге, так и в тимусе мышей, имеют фенотип sc-i+Thy-i+, скорость оседания 4,01-6,88 мм/ч. Эти ПТЛ являются более активными хелперами колониеобразования, чем с фенотипом SC-1+Thy-1~и скоростью оседания 1,63-3,62 мм/ч.

Вероятно, именно с индукцией Thy-1 на sc-i*№y-i~ клетках связана стимуляция тимозином (очищенная 5-ая фракция) колониеобразования из костного мозга, проинкубированного с СПГММ (таблица 1.5.).

Обработку костномозговой суспензии сывороткой проводили в

стандартных условиях. После отмывки клетки ресуспендировали в 10 мл раствора тимозина определенной концентрации и вновь инкубировали 30 мин. Костномозговую суспензию вводили облученным реципиентам в/в без предварительной отмывки. К увеличению выхода селезеночных зкзоколоний приводит инкубация клеток костного мозга, предварительно обработанного СПГММ, с 6, 60 и 100 мкг/мл тимозина. Внутривенная инъекция препарата не оказывает" ; положительного, действия (Семина и др.,1981).

Таблица 1.5.

Влияние тимозина на образование селезеночных колоний клетками костного мозга, обработанными СПГММ.

Инкубация Дополнительная Кол-во Среднее кол-во костного мозга инъекция реципиенту мышей колоний Р

- - 16 11,1 + 1,1

СПГММ - ' 17 1,8 + 0,4*

СПГММ тимоциты (2хЮ7 КЛ) 15 8,5 ± 0,9 <0,01

?ММ + тимозин

0,6 мкг/мл - . . 12 2,9 1,0

6,0 мкг/мл 12 3,5 ± 0,5 <0,05

60,0 мкг/мл - 14 4,1 i 0,3 <0,01

100,0 мкг/мл - 14 4,0 ± 0,8 <0,05

200,0 МКГ/МЛ 10 2,6 ± 1,0

СПГММ тимозин В/В ЗО'МКГ 12 1,5 ± 1,0

Аналогичные результаты были получены впоследствии при изучении действия тимотропина на колониеооразупдую способность смеси sc-1+и so-1"обогащенных популяций.При добавлении к sc-i~ Thy-1"фракции, содержащей, по мнению авторов, стволовые клетки, sc-1+Thy-1~ популяции, обработанной тимотропином, стимуляция колони§образования была примерно в 5 раз больше, чем при смешивании тех же, но не инкубированных с препаратом клеток Шрилин и др., 1985; Мирошниченко и др., 1987; Шарова и др.

1987). По сведениям других авторов (Попов, 1987; Попов и др.,

1988), обработка коммерческим полипептидным препаратом тимоли-ном костного мозга от тимэктомированных или интактных животных уменьшает их чувствительность к инактивирующему действию антимозговой сыворотки по тесту селезеночного колониеобразования.

• Анализируя все приведенные данные можно заключить, что среда клеток костного мозга содержится Z типа ilM:Thy-i+ и Thy -1~, где они, созревая до стадии миграции в тимус, выполняют функцию регуляции кроветворения, являясь хелперами в процессах колониеобразования. После обработки клеток костного мозга ОЩШ, вероятно, остается небольшая часть Thy-1~[TM неповрежденными, а последующее воздействие на них тимозина приводит к переходу этих клеток в более активное Ицг-1+состояние. То, что действие тимозина в отношении стимуляции колониеобразования почти в 2 раза слабее такового, оказываемого суспензией тимо-цитов, может объясняться частичной гибелью sc-t+Thy-i"клеток под влиянием СПГММ.

- 25 -

Таким образом, вероятнее всего, клетками, осуществляющими акцессорное действие по отношению КОЕ-С при образовании селезеночных колоний являются эс-1+ йту-1+ПТЛ.

1.3.Контроль пролиферации КОЕ-С клетками, чувствительными к СПГММ.

Изучали репопуляцию костного мозга и селезенки у облученных мышей, восстановленных костным мозгом, обработанным СПГММ с добавлением тимоцитов и без него. Для этого мышей-рецилиен-тов облучали в дозе 8,5 Гр и через 4 ч им инъецировали интакт-ный или обработанный СПГММ костный мозг в количестве 5 х Ю^кл на мышь. Животным одной из групп кроме костного мозга вводили тимоциты в количестве 2 х 107кл/мышь. На 4, 8, II и 14 сут у них определяли число кариоцитов в селезенке и бедренной кости. Оказалось (рис. 1.1. и рис. 1.2.), что до 4-х суток после облучения и инъекции клеток костного мозга различий между группами не отмечается. На 8 и II сутки число кариоцитов в костном мозге и селезенке мышей, получивших костный мозг, обработанный СПГММ, намного ниже, чем у контрольных животных, хотя на II сут регистрируется . небольшой подъем числа ядросодержащих клеток. К 14 суткам их содержание достигает контрольного уровня. Трансплантация тимоцитов способствует ускорению репопуляции кроветворных органов у мышей, восстановленных костным мозгом, обработанным СПГММ. Можно предположить, что между II и 14 сутками в организме реципиента, которому был инъецирован костный мозг, инкубированный с СПГММ, восстанавливается клеточная-ло-• пуляция, способствующая не только нормализации, селезеночного

40-

тс I

1

-■ч I

¿.и -1

I

Л

•/ Г

г/

/ т )

т» д / ,

Л'- 1

, ГЧ 4 А А А

4 о ii 14-Рис. 1.1.

1Л

Г-Ч

о

о 1

п 4-

л и.

11

I?

I: 1:

!■

А

Г

11

14

Рис. 1.2.

Рис 1.1., 1.2. Динамика клеточвости костного мозга бедра фис. 1.1.) и селезенки фис. 1.2.) мышей, облученных в дозе 3,5 Гр и восстановленных интактным костным мозгом (I), костным мозгом и тимоцитами (2), костным мозгом, обработанным СПГММ, (.3); и костным мозгом, обработанным СШММ, и тимоцитами (4).

По оси абсцисс - время после введения клеток костного мозга (сут); по оси ординат - количество кариоцитов (,х ХО6 ).

колониеобразования, но и ускорению постлучевой репопуляции кроветворных органов у таких животных. В более ранние сроки отсутствие этой популяции компенсируется добавлением интактных тимоцитов. О нарушении способности КОЕ-С, обработанных СПГММ, восстанавливать поврежденный гемопоэз, сообщалось и ранее (Adler et al.t 1976).

На основании полученных результатов мы предположили, что • воздействие СПГММ приводит к удалению из костного мозга клеток, необходимых для обеспечения нормального уровня пролиферации в нем. Причем эта популяция восстанавливается к 14 суткам после облучения и инъекции костного мозга, обработанного СПГММ.

Для проверки этого предположения определяли кинетики регенерации КОЕ-С в костном мозге и селезенке после введения первичным реципиентам костного мозга, обработанного СПГММ, с добавлением тимоцитов и без них (Семина и др., 1986). Для этой цели каадой груше первичных реципиентов трансплантировали ин-тактный костный мозг с добавлением тимоцитов и без них или костномозговую суспензию, обработанную СПГММ, также с добавлением тимоцитов и без них. Через 4, 7, II и 14 сут из каждой группы брали по 7-15 мышей, готовили кроветворные взвеси из селезенок и бедренных костей и вводили их летально облученным вторичным реципиентам. Учет колоний у последи-чс проводили на .10 сут после трансплантации. Скорость репопуляции КОЕ-С в селезенках мышей, получивших интактный костный мозг и обработанный СПГММ, оказалось идентичной. Время удвоения КОЕ-С в__обоих случаях составляет 38 ч (таблица 1.6.). Дополнительное введе-

ние тимоцитов реципиенту приводит к некоторому, хотя и неооль-шому, уменьшению величины времени удвоения КОЕ-С - она становится равной 31 ч. Кинетики репопуляции для КОЕ-С в бедренной кости отличаются от аналогичных в селезенке. Обработке костного мозга СПГММ приводит к резкому замедлению скорости репопуляции костномозговых КОЕ-С. Время удвоения в этом случае почти в 2 раза превышает контрольные значения. Добавление тимоцитов ускоряет ход репопуляции, время удвоения КОЕ-С в этом случае становится равным 60 ч. В таблице 1.6. приведены значения времени удвоения КОЕ-С костного мозга в бедренной кости и селезенке, полученные в двух независимых экспериментах.

Таблица 1.6.

. Время удвоения (час) КОЕ-С в костном мозге бедренной кости и селезенке «результаты получены при анализе кинетик реге-' нерации в промежутке времени 4-14 сут).

Группа Костный мозг Селезенка

I 2 I 2

Контроль 65,46 55,2 38,0 37,2

СИГМЫ 114,2 III,I 38,0 36,5

СПШМ+тимус 55,2 51,6 31,0 34,8

' Контроль+тимус 55,4 73,7 41,0 42,4

- 29 -

Эти результаты перекликаются с данными работы (Visser, Eliason, 1983), в которой была исследована кинетика регенерации костного мозга, обогащенного КОЕ-С, и показано, что скорость регенерации КОЕ-С из обогащенного костного мозга в 2 раза больше, чем КОЕ-С интактного. Добавление тимоцитов к костномозговой обогащенной суспензии нормализует скорость репопу-ляции. На основании полученных данных авторы предположили, что в процессе обогащения костного мозга полипотентными стволовыми клетками из него удаляется популяция акцессорных клеток, необходимых для обеспечения нормального уровня пролиферации КОЕ-С, аналогичная ей находится в тимусе. •

Сделанные выводы соответствуют утверждению, что пролифе-ративный контроль кроветворных предшественников осуществляется балансом стимулирующих и ингибирующих факторов и является ко-роткоранговым, т.е. находится в самой гемопоэтической ткани (Lord, Wright, 1980). Стимулирующие клетки имеют плотность

о

1,064-1,072 г/см , примерно в той же области находится и пик активности ПТЛ, которые выполняют хелперную роль при образовании колоний (Шарова, 1987).

Нами было также изучено влияние обработки СПГММ костного мозга на популяцию Т-лимфоцитов, определяющих дафференцировку КОЕ-С. Обработка костного мозга СПГММ не изменяет дифференци-ровки КОЕ-С в эритроидном направлении, наблюдается незначительное уменьшение процентного содержания колоний гранулоци-тарного типа.

Таким образом, в костном мозге нами обнаружена популяция вспомогательных или акцессорных клеток, присутствие которых

наряду с КОЕ-С необходимо для образования колоний на селезенках летально облученных мышей. Эти клетки чувствительны к действию СПГММ и принадлежат, вероятно, к ранним предшественникам лимфоцитов с фенотипом зс-1+ТЬу-1 + , не влияют на направление дифференцировки КОЕ-С, а их функция состоит в обеспечении нормальной скорости пролиферации гемопоэтических клеток-предшественников. Клетки, подобные или идентичные этим, содержатся в тимусе в очень небольших количествах.

1.4. Образование селезеночных колоний КОЕ-С длительной культуры костного мозга и эмбриональной печени в присутствии тимоцитов.

Следует отметить, что присутствие вспомогательных для КОЕ -С клеток при процессах образования колоний удается обнаружить лишь в нефизиологических условиях: обогащение костного мозга, аллогенные пересадки или при воздействии на костный мозг СПГММ. Однако поликлональность и токсичность последней не позволяют однозначна трактовать полученные результаты. В норме деятельность акцессорных клеток выявить невозможно, так как трансплантация их в составе тимоцитов облученному реципиенту с интактным донорским костным мозгом не изменяет колониеобразования. Для доказательства физиологичности характера роли Т-лимфоцитов при образовании колоний нам казалось необходимым найти такую систему, где отсутствие тимоцитов не являлось бы следствием воздействия повреждающих агентов. Этим требованиям отвечает популяция клеток длительной культуры костного мозга, не содержащая Т-клеток, а также кроветворная взвесь, приготов-

ленная из печени 13-16 дневных эмбрионов, где количество про-тимоцитов чрезвычайно мало и составляет лишь II« от их содержания в нормальном костном мозге (Чертков, Фриденштейн, 1977; Soersma, 1983). Они и оыли выоранн в качестве источника КОЕ-О.

Как видно из результатов, представленных в таолице I.V., трансплантация тимоцитов оолучешшм мышам-реципиентам параллельно с клетками длительной культуры костного мозга или эмбриональной печени, т.е. взвесями, практически не содержащими

Таблица 1.7.

Влияние тимоцитов на образование селезеночных колоний клетками длительной культуры костного мозга и эмбриональной печени.

Источник KUE-C Клетки Число Среднее количество

тимуса мышей колоний Р

Культура костного

мозга Культура костного мозга Эмбриональная

печень 'Эмбриональная печень эндогенный фон

t>2 2,7 ± 0,2*

67 4,2 ± 0,3 < 0,01

40 2,0 ± 0,2*

37 3,9 ± 0,3 < 0,01

20- 0,3

+

Т-клэток, приводит к почти двухкратному повышению выхода экзо-колоний. Для достижения эффекта соотношение клетки кроветворной взвеси:тимоциты должно Сыть 1:50 или 1:70. Полученный результат не связан с изменением количества введенных КОЕ-С, оседающих в селезенке, т.к. мы не нашли различий в значениях фактора оседания для КОЕ-С из обоих источников в присутствии и отсутствии тимусных клеток. Возможно, что стимулирующее действие тимоцитов обусловлено ускорением пролиферации КОЕ-С. Для проверки этого предположения мы определили кинетики регенерации КОЕ-С из длительной культуры костного мозга и эмбриональной печени в присутствии и отсутствии тимоцитов. Костный мозг брали у 5 - 15 первичных реципиентов через 4, 7, II и 14 сут после введения клеточных суспензий и трансплантировали вторичным реципиентам, у которых через 10 сут подсчитывали количество селезеночных макроколоний. Кинетики регенерации КОЕ-С показали снижение времени удвоения для КОЕ-С из обоих источников под влиянием тимусных клеток (таблица 1.8.). Возможно, тимоци-ты в данном случае вызывают ускорение пролиферации как более молодых, полипотентных КОЕ-С, так и образующих колонии единиц с более ограниченными потенциями роста, т.к. стимуляция коло-ниеобразования КОЕ-С из обоих источников в присутствии тимоцитов наблюдается как на 7, так и на 12 сутки роста.

При попытке определения радиочувствительности популяции тимоцитов, стимулирующих колониеобразование клетками эмбриональной печени, показано, что при облучении тимоцитов в разных дозах in vitro эффект стимуляции сохраняется до 0,8 Гр (таблица 1.9.).Следует отметить, что. dq для предшественников Т-лим-

Таблица 1.8.

Значения времени удвоения КОЕ-С длительной культуры костного мозга и эмбриональной печени.

Время удвоения (час)

Источник КОЕ-С Клетки _

тимуса I опыт ?. опыт

Культура костного

мозга Культура костного мозга

Эмбриональная

печень - 65,7

Эмбриональная

печень + 48,8

фоцитов составляет 0,75 Гр(Ярилин, 1985), и при гибели более, чем 40% клеток и нарушении оптимального соотношения кроветворные клетки: тимоциты действие последних не наблюдается.

Таким образом, полученные результаты свиде ельствуют, что тимоциты повышают эффективность клонирования в селезенке и сокращают время удвоения КОЕ-С эмбриональной печени и длительной культуры костного мозга. Их действие направлено квк—на 8-ми суточные, так и на 12-ти суточные КОЕ-С и сохраняется при воздействии облучения до 0,8 Гр. Особенно важно, что эффект

42,5

+ 27,8

118,0 41,3

наблюдается in vivo без дополнительного воздействия повреждающих факторов, а это может свидетельствовать о реальном участии Т-клеток в регуляции гемопоэза, о существовании ПТЛ-акцессор-ных клеток, функция которых - стимуляция пролиферации КОЕ-С.

Таблица 1.9.

Влияние облучения тимоцитов на образование селезеночных колоний клетками эмбриональной печени.

Доза облучения Число Среднее кол-во Трансплантат тимоцитов (Гр) мышей колоний

Эмбр. печ. - 25 0 + 0,2

Эмбр. ТОЧ.+ тимоциты ' 0,2 2? 4.3 + 0,3*

Эмбр. печ.+ тимоциты 0,4 12 4,2 ± 0,4*

Эмбр. печ.+ тимоциты 0,8 24 ■ 4,5 ♦ 0,3*

Эмбр. печ.+ тимоциты 1,2 12 2,8 ± 0,3

Эмбр. печ.+ тимоциты 1,6 20 2,6 ± 0,3

Эмбр. печ.+ тимоциты - 24 4,6 0,3*

* - Р < 0,001

Представляемые в настоящем разделе факты, по нашему мнению, служат подтверждением существованию общих механизмов регуляции иммуно- и гемопоэза.

Т

1.5. Регуляция КОЕ-С Т-лимфоцитами-супрессорами.

Регуляция пролиферации и дифференцировки кроветворных клеток-предшественников осуществляется, вероятно, цепью кле-

точных и молекулярных реакций. В их основе может лежать, по мнению ряда авторов, принцип конкурирующих взаимодействий стимулирующих и супрессирующих факторов (Lord, Wright, 1980; 1984). В таком случае, если среди тимоцитов существуют стимуляторы кроветворных предшественников, то следует ожидать и наличие ингибиторов. В качестве агента, который позволил бы проверить эту гипотезу, был выбран Кон А, препарат, специфически действующий на.Т-клетки и индуцирующий выработку супрессоров, подавляющих как гуморальный, так и клеточный иммунитет (Podesta et ai., 1982; Мурзенок, Войтенок, 1984). Известно также, что лимфоциты, стимулированные Кон А, приобретают свойства ингибировать пролиферации предшественников эритро- и миелопозза in vitro. Эти лимфоциты радиорезистентны, 0КТ8+1а~ (Harada et al.,1985).

При исследовании влияния Кон А на колониеобразующую активность костного мозга оказалось (таблица 1.Ю.), что часовая инкубация костномозговой суспензии с Кон А в дозах от 10,0 до 60,0 мкг/мл суспензии приводит к 50$ ингибированию роста колоний по сравнению с контролем (причем оптимальная доза препарата 30 мкг/мл суспензии), которое отменяется полностью дополнительным введением интактных тимоцитов. Для достижения эффекта достаточно соотношения клетки костного мозга:тимоциты 1:25 -100. Сходное действие на колониеобразующую способность клеток костного мозга оказывает и введение в/б 15 мкг/кг веса Кон А мышам донорам за 48 ч до взятия ¿остного мозга. №гьекция тимоцитов реципиентам полностью снимает 50% ингибирование колони-еобразования препаратом. Таким образом, ■ подавляющее влияние

Кон А на популяцию КОЕ-С имеет место при действии его как in vivo, так и in vitro, причем в обоих случаях этот эффект полностью отменяется дополнительным введением тимоцитов.

Таблица I.10.

Образование экзогенных селезеночных колоний из костного мозга интактных или тимэктомированных мышей, обработанного in vitro Кон А.

Донор костного мозга

Кон А Тимоциты Среднее кол-во колоний 30 мкг/мл 1x10'' кл

в сут

12 сут

интактный

интактный

интактный

тимэктомия

тимэктомия

10,4 t 0,9(36) 10,6 ± 0,6(36)

4,6 ± 0,6(36) 8,7 i 0,8(36)

11,4 ± 0,4(36) 10,2 1 0,7(36)

13,4 ± 1,3(46)

8,2 ±0,6(28)

В скобках указано количество мышей.

За счет чего же происходит ингибирование роста селезеночных колоний? Оно не связано с уменьшением процента оседания обработанных митогеном КОЕ-С в селезенке реципиента, так как фактор оседания (Г), определенный через 24 ч после первого переноса, для этих клеток вдвое превышает контрольное значение (7,8% для контроля и 15,2% для Кон А).Дополнительная инъекция тимоцитов нормализует этот показатель <8,2*).

+

Анализ результатов, полученных при изучении морфологии селезеночных, колоний, показал, что воздействие Кон А не изменяет соотношений между эригроидными и гранулоцитарными колониями по сравнению с контролем, а также не оказывает влияния на соотношение колоний других гистологических типов. Увеличивается (примерно в 3 раза) лишь процентное содержание недифференцированных колоний у мышей-реципиентов, которым врали костный мозг, обработанный Кон А (с 4,1 + 1,6$ до 13,0 ± 3,4Ж).Дополнительное введение тимоцитов снижает этот показатель в 6 раз (до 1,9 ± 1,1%). Можно заключить, что Кон А влияет на стволовые кроветворные клетки на уровн5 Т-хелперов, необходимых стволовым элементам для реализации функции колониеооразо-вания, но не на уровне Т-лимфоцитов, контролирующих дифферен-цировку КОЕ-С. Вероятнее всего, митоген затрагивает пролифера-тивный статус КОЕ-С.

Для проверки этого предположения мы провели определение значения времени удвоения КОЁ-С в костном мозге бедренной кости и селезенке мышей-реципиентов, восстановленных костномозговой суспензией, обработанной Кон А, на 4-14 сутки после трансплантации. Оказалось, что эти величины не отличаются от значений времени удвоения КОЕ-С в костном мозге и селезенке реципиентов, восстановленных суспензией от интактных животных, т.е. под действием митогенов не меняется скорость пролиферации КОЕ-С и уменьшение количества селезеночных колоний после обработки препаратом не вызвано ее замедлением.

Вполне возможно, что максимальное подавление вступления КОЕ-С в пролиферацию под влиянием Кон. А происходит на 2 сутки

после инъекции препарата в условиях in vivo, т.к. • именно на этот срок приходится двукратное снижение выхода селезеночных колоний, отменяемое дополнительным введением реципиенту Т-кле-ток. Следует также отметить, что тимоциты от обработанных Кон д за 2 сут до взятия органа мышей полностью теряют способность восстанавливать колониеооразование КОЕ-С костного мозга, обработанного СПГММ. Наблюдаемый эффект может быть отнесен к действию именно Т-супрессоров, накапливающихся в данном органе ко 2 суткам после воздействия Кон А.

Совокупность приведенных данных позволяет высказать гипотезу о возможном механизме действия Кон А на процессы селезеночного колониеобразования. Митоген способен вызывать задержку пролиферации ("арест") трансплантированных КОЕ-С, оседающих в селезенке в гораздо больших количествах, чем в контроле. Такой эффект может быть обусловлен активацией клеток-супрессоров. В пользу этого предположения свидетельствуют данные о' снижении процента ингибирования селезеночных колоний после обработки Кон А костного мозга мышей, тимэктомированных в половозрелом возрасте, по сравнению с контролем (таблица 1.Ю.). Воздействие Кон А на колониеобразование, в определенной степени, опосредуется субпопуляцией короткоживущих нециркулирующих Т-лимфоцитов. Кроме того, известно, что под воздействием Кон А Т-супрессоры могут приобретать способность выделять фактор, ингибируюций деление клеток и иммунный ответ (Aune, Pierce.1982). Возможно, снижение количества колоний после инкубации с Кон А является следствием влияния на процессы пролиферации клеток костного мозга, участвущих в образовании коло-

ний, именно таких супресссирувдих факторов. "Арест" длится не более 4-х сут, так- как время удвоения для КОЕ-С костного мозга и селезенки у облученных мышей-реципиентов, восстановленных обработанным мигогеном костным мозгом, определенное на 4-14 сутки после трансплантации, не отличается от значений этой величины в контрольной группе.

Кроме того, при оценке выхода экзогенных селезеночных колоний из костного мозга, проинкубированного с Кон А, на 8 и 12 сутки роста обнаружено, что хотя на 12 сутки и сохраняются некоторые различия в количестве селезеночных колоний между контрольной и подопытной группой, однако оно гораздо менее выражено, чем на 8 сутки в той же ситуации (таблица 1.10.). Добавление тимоцитов отменяет арест пролиферации за счет содержащихся среди них акцессорных клеток. Их действие кратковременно, т.к. уже к 12 суткам роста значения выхода селезеночных колоний в группах, где мыши получали костный мозг, обработанный Кон А без добавления тимоцитов и в их присутствии, становятся статистически незначимыми. Кажется важным тот факт, что Кон А не оказывает повреждающего действия на КОЕ-С, его инги-бирующий эффект на колониеобразование является полностью обратимым. Таким образом, совокупность приведенных данных позволяет высказать предположение о возможном механизме' действия Т-клеточных митогенов на процессы селезеночного колониеобразо-вания. Их влияние опосредуется Т-супрессорами. Через активацию этих клеток и последующее выделение ими гуморальных факторов Кон А ингибирует образование колоний, накладывая "арест"- на пролиферацию КОЕ-С, который длится не более 3 сут, далее у

костномозговых КОЕ-С темп пролиферации выравнивается с контрольным. Дополнительное введение тимоцитов нормализует эти процессы олагодаря содержащимся среди них акцессорам.

В последние годы появилось множество свидетельств в пользу лимфоидной природы активаторов и супрессоров пролиферации кроветворных клеток - предшественников. Обнаружена негативная регуляция Т-клетками нормального кроветворения с помощью элиминации костномозговых супрессорных Т-клеток антисывороткой против аллельных продуктов их специфического маркера - антигена 1-<т, что приводит к резкой активации колониеобразующей способности КОЕ-С (Санин, 1986; Санин, Николаева, 1986). Выявлено, что контроль пролиферации клеток, в том числе кроветворных, ограничение ее интенсивности - биологическая функция системы Т-супрессоров (Краскина и др., 198?; 1988).. Стимулирующее действие ПТЛ на колониеобразование связывается с активной субстанцией, продуцируемой этими клетками; кроме того, при определенных условиях они способны выделять и фактор, ингибирую-щий образование колоний (Мирошниченко и др., 1989).

1.6. Формирование контрольных механизмов кроветворения в эмбриогенезе.

Каким ке образом складываются связи между механизмами регуляции иммунитета и кроветворными клетками-предшественниками в процессе развития организма? Для ответа на этот вопрос была проанализирована возможность стимуляции тимоцитами коло-ниеобразования клетками печени в зависимости от возраста эмбриона. Введение сингенных тимоцитов параллельно с клетками пе-

чени 12-16 дневных зморионов приводило к.стимуляции выхода колония в 1,5-1,8 раза (1,8 ± 0,2 для контроля и 3,2 ± 0,2 при добавлении тимоцитов). Эффект отсутствовал в случае трансплантации тимоцитов с клетками печени 18-20-дневных эмбрионов или костного мозга новорожденных мышей, равно как и с клетками костного мозга половозрелых животных. Интересная закономерность обнаружена при исследовании влияния Кон А на селезеночное колониеобразованиэ клетками эмбриональной печени. Инкубация кроветворной взвеси от эмбрионов различного срока развития (14 - 19 сут) с митогеном не вызывала подавления роста колоний. Обработка клеточной суспензии костного мозга новорожденных мышей приводит к достоверному снижению колониеооразования (до Ь0% от контрольного уровня).

Таким образом, характерное для кроветворных клеток взрослых мшей отсутствие в норме реакции на халперный эффект и наличие на супрессорный Кон А регистрируется только к моменту рождения животных и перехода функции основного гемопоэти-ческого органа от печени к костному мозгу. ПТЛ, хотя и появляются на самых ранних стадиях эмбриогенеза, способны взять на себя акцессорные функции в отношении предшественников кроветворения лишь к окончанию развития эмбриона, вероятно, из-за своей малочисленности. Возможно, в этих условиях действует другой контрольный механизм, который с 12 до 18 дня развития обеспечивает стремительную наработку КОЕ-С с 75 до 1500 (Чертков, Фриденштейн, 1977). Как-видно из полученных нами- результатов, в этот период времени КОЕ-С эмбриональной печени способны к восприятию дополнительного стимулирующего сигнала,

в частности, от Т-хелперов, но не чувствительны к запрету т пролиферацию. Контрольный же механизм последней "хелйеры-суп-рессоры" несет функцию поддержания определенных размеров уже сложившегося пула КОЕ-С и его потомков.

2. Влияние f-клеток регуляторов на характеристики КОЕ-С (рйдаЮчувствитеЛьййсть, миграция).

Прйведейййб вше данные свидетельствуйт о той/ что формирование селезеночных колоний является результатом взаимодействия ряда клеточных популяция^ А если это так, то многие и® известных характеристик КОЕ-С, в частности р&дййбйологйческйе, могут быть отнесены не только К НИМ, Но И Ювтквм-йартнерам, например, Т-лимфоцитам. Иными словайй, реакция гемояоэтических клеток-предшественников на действие различных повреждающих агентов, в том числе радиации, не всегда отражает изменения в компартменте этих клеток, а может явиться следствием или нарушения равновесия между ними и регуляторами, или повревдения регуляторов. v .

Это положение иллюстрйруют проведенные эксперименты, в которых продемонстрировано, что после удаления из костного мозга СПГММ акцессорных клеток уменьшается не только выход колоний, но и изменяется радиочувствительность КОЕ-С.Источником последних служили клетки костного мозга, облученные in vitro в дозах 0,04-3,7 Гр. Облучение проводили на льду сразу после инкубации с СПГММ и отмывки клеток. В качестве контроля были взяты костномозговые клетки, инкубированные с ИКС. Интактные сингенные тимоциты вводили реципиентам за 30-40 мин до инъек-

цш костного мозга. Кривые до'за-эффект, характеризующие радиочувствительность КОЕ-С при облучении In vitro костного мозга в интервале доз от 0,04 до 3,7 Гр, после обработки НКС и СПГММ имеют два участка с различными наклонами (коэффициенты "а" для обоих участков кривых I и 2 (рис. 2.1.) значимо отличаются между собой; уровень значимости р< 0,05), что указывает на наличие в костном мозге двух популяций КОЕ-С, отличающихся по радиочувствительности. Так, согласно данным, приведенным на рис.2.1. и в таблице 2.1., значение dq для КОЕ-С на участке кривой в интервале доз облучения от 0,04 до 0,75 Гр после обработки НКС составляет 0,93 Гр, а после инкубации костного мозга с СПГММ - 0,33 Гр (отличие значимо, р< 0,05). Вторая часть популяции КОЕ-С значительно более резистентна, при обработке костного мозга СПГММ (интервал доз облучения 1,0-3,7 Гр) значение dq для нее равняется 1,94 Гр, а после НКС - 1,54 Гр (величины значимо не отличаются).

Таблица 2.1.

Радиочувствительность КОЕ-С в условиях обработки клеток костного мозга НКС или СПГММ.

Значения dq (Гр) в интервалах доз Группа 0,04 - 0,75 1,0 - 3,7

НКС СПГММ СПГММ + тимоциты

0,75< 0,93< 1,24 1,32< 1,54< 1,92 0,26< 0,33< 0,47 1,11< 1,94< 7,94 1,57< 1,81< 2,13

¿тис. 2.1., 2.2. Радиочувствительность KOE-C при обработке костного мозга НКС, СПШМ и ОШМ + тимоциты и облучении.

I - ИКС (I) и СПШМ (2); 2 - СПИМ + тимоциты. По оси абсцисс - доза облучения; по оси ординат - натуральные логарифмы доли выживших КоЕ-С.

Уравнения регрессии: I - Ia: -in у = -0,0107х - 0,22

1Ъ: -in у = -0,0064s -0,36 •" 2а: -In у - -Ü,0302r - 0,073 . 2b: -In у- -О,0051s - 0,770 2 - -In у - -ü,0550x - 0,580

Неоднородность по радиочувствительности популяции КОЕ-с оыла обнаружена также в работах (Швец, Шафиркин, 1979, Швец, 1983). Выживаемость около 55Ж КОЕ-С описывается экспонентой с низким значением Б0 (0,09 Гр или по другая данным 0,2 Гр), для резистентной части популяции По =1,8 -1,25 Гр. Интересно, что при добавлении интактных тимоцитов к трансфузату облученного костного мозга кривая доза-эффект видоизменялась только на начальном участке кривой, при этом значение в0 резистентной части популяции остается неизменным. Авторы полагали, что радиочувствительная фракция КОЕ-С является тимусзависимой, а наличие двух компартментов клеток, отличающихся по радиочувствительности, отражает естественную структуру популяции КОЕ-С в организме.

После элиминации СШММ из костного мозга популяции вспомогательных для колониеобразования клеток реакция КОЕ-С на облучение меняется, повышается их радиочувствительность. Такое изменение радиобиологической характеристики может быть связано не только с повреждением КОЕ-С, но и гибелью клеток-партнеров (например, т-лимфоцитов), участвующих в кооперативных процессах, необходимых для образования колоний на селезенках.

Исходя из этого, представляло интерес изучение влияния тимоцитов на радиобиологические характеристики костного мозга, обработанного СПГММ. Как видно из рис. 2.2. и таблицы 2.1., введение клеток тимуса приводит к изменению формы кривой доза-эффект, которая по своему характеру приближается к полученной в условиях обработки ИКС. Различия в наклоне кривых, характеризующих радиочувствительность КОЕ-С при облучении в низких и

высоких дозах, незначительны. Однако следует отметить, что в данном случае величина Во более радиочувствительной части популяции увеличивается до 0,76 Гр. Таким образом, добавление клеток тимуса приводит как бы к "спрямлению" кривой доза-эффект для костного мозга, обработанного СПГММ. Интересно, что при этом значение Ь0 соответствует 1,81 Гр, что значительно превышает величину Во для интактного костного мозга, составляющую примерно 1,0 Гр (Коноплянников, 1984). Из приведенных данных можно сделать вывод, что в такую важную характеристику КОЕ -С, как радиочувствительность, въосит свой вклад и кроветворное микроокружение, поддерживающее жизнедеятельность поли-потентных предшественников. Регуляция их потенций реализуется через взаимодействие с элементами микроокружения - совокупностью клеток и внеклеточных факторов. В его состав входят и Т-лимфоциты - как клетки-регуляторы предшественников различной степени полипотентности.Принцип регуляции - одна из основных характеристик класса кроветворных клеток-предшественников, и любое определение их должно учитывать это важное свойство (Чертков.Гуревич, 1984).""Все сказанное, вероятно, может относиться и к такой характеристике КОЕ-С, как радиочувствительность. Возможно, наличие нескольких фракций КОЕ-С с различной радиочувствительностью отражает степень их полипотентности (Швец, Шафиркин, 1979), которая может определяться изменением природы регуляции.

Основываясь на предположении, что образование селезеночных колоний есть кооперативный процесс, в котором кроме КОЕ-С ^участвуют и представители других клеточных популяций, в част-

ности, 'Г-лимфоциты, га попытались изучить, во всех ли случаях миграция стволовых клеток, оц„..пваемая, как правило, с помощью метода селезеночных колоний, определяется собственно перераспределением КОЕ-С. Кнтерс к этой проблеме вызван тем, что миграция стволовых гемопозтических клеток в облученном организме способствует расселению КОЕ-С, появлению множественных очагов кроветворения и, как следствие, увеличению выживаемости, что было продемонстрировано на различных видах гивотшх (Стрелин, йМидт, 1962; Стрелян и др., 1962; 1971; Стрелин, Ярмоненко, 1970).В качестве агента, вызывающего перераспределение КОЕ-С в организме, был выбран полианион декстрансульфат (ДС). При введении в организм полианионы стимулируют выброс лимфоцитов и полиморфноядерных клеток в кровь (Ross, 1972), вызывают увеличение КОЕ-С В циркулирующей крови (van der Ham et al., 1977). Введение интактным мышам этого полианиона приводит и к другим значительным изменениям в системе крови, в частности, перераспределительному лййкоцитозу (Муратходааев и др., 1979, 1981, Муратходжаев, 1983).Кроме этого, ДС обладает свойствами поликлонального стимулятора.

Мы определяли содержание КОЕ-С и их способность к колони-еобразованию в гемопозтических органах (селезенка, костный мозг, периферическая кровь) у интактных и облученных (I Гр) мышей через 3 ч после введения ДО. Именно на это время приходится пик выброса ядросодеркащих клеток в кровь, вызванное воздействием препарата на ■ интактных животных (Roes et ai.,1972). Оказалось, что через 3 ч после инъекции ДС в крови интактных мышей более чем в 3 раза увеличивается содержание

- 48 -

^ контролем (73,1 г 8,9 и 22,3 ± 4,6, соот-. в селезенке почти вдвое уменьшается (1237,3 ± 300 и 2701 ± 418, соответственно), а в костном мозге остается неизменным. В экспериментах на спленэктомированных животных выявлено, что в периферической крови через 3 ч после введения ДО увеличение количества КОЕ-С менее выражено чем у кооперированных мышей. Костный мозг в исследуемые сроки не вовлекается в реакцию на полианион (Муратходжаев и др., 1979). Полученные данные дают нам основание предположить, что селезенка является основным, хотя возможно и не единственным, источником выброса КОЕ-С в кровяное русло при воздействии ДС на интактных мышей.

При введении ДС облученным мышам (I Гр) через 3 ч, также как и у интактных животных, имеет место повышение уровня со. держания КОЕ-С в периферической крови; в селезенке относительное количество КОЕ-С не отличается от значений контроля. И если в костном мозге интактных животных после введения полианиона содержание КОЕ-С не изменяется, то при комбинации облучение + ДС наблюдается двукратное снижение содержания КОЕ-С по сравнению с костным мозгогё только облученных животных. Казалось, полученные результаты дают основание предполагать, что в облученном организме основным источником миграции КОЕ-С под действием ДС является костный мозг. Однако опыты, в которых реципиентам наряду с костномозговой суспензией от облученного и обработанного ДС донора вводили интактные тимоциты, опровергли это предположение (таблица 2.2.). Оказалось, что инъекция тимоцитов восстанавливает способность обработанного ДС .костного мозга образовывать экзогенные селезеночные колонии.

Таблица 2.2.

Образование селезеночных экзоколоний из костного мозга облученных (I Гр) мышей после инъекции ДС.

Груша Облучение Тимус 2хЮ7 Число мышей Среднее количество колоний Р

контроль - - 25 12,0 ± 0,7

ДС - - 24 12,1 ± 0,6

контроль + - 20 7,0 ± 0,7*

ДС + - 20 3,9 ± 0,5 <0,01

контроль + 18 7,6 ± 1,2

дс + + 19 7,5 4 1,2

Полученные результаты, а также данные о выраженной лимфо-цитмобилизирующей активности ДС позволяют предположить, что под влиянием этого препарата у облученных животных из костного мозга элиминируется не КОЕ-С, а популяция акцессорных клеток, вероятно, Т-лимфоцитов, необходимых для образования колоний и заменяемая клетками тимуса. Эти сведения согласуются в определенной мере с сообщениями в литературе, где показано, что миграция КОЕ-С является тимусзависимым процессом, контроль над которым осуществляется на уровне костного мозга с помощью Т-лимфоцитов (Петров и др. 1976).

Касаясь вопроса об истинном источнике увеличения в периферической крови КОЕ-С у нормальных и облученных животных

следует отметить, что им является, в основном, селезенка. Через з ч после обработки дс в селезенка! облученных и необлу-ченных мышей резко сокращается численность КОЕ-С. Тимоциты, введенные параллельно с суспензией селезеночных клеток от не-облученных доноров, получивших дс, не отменяли эффекта снижения выхода колоний под действием полианиона, т.е. из селезенки происходит выброс именно КОЕ-С, а не каких-то других клеток.

Приведенные данные позволяют заключить, что в ряде случаев результаты, полученные при изучении процессов миграции стволовых клеток из костного мозга с помощью определения количества колоний на селезенках, не могут безоговорочно трактоваться как свидетельство изменения содержания стволовых клеток в этой популяции.

в литературе также имеется ряд сведений, подтверждающих возможность модификации радиобиологических характеристик КОЕ-О с помощью тимоцитов. Например, показано, что у тимэктомирован-ных во взрослом состоянии мышей способность КОЕ-С к репарации суолетальных радиационных повреждений резко снижается через 35 мес после операции. Трансплантация тимуса снимает эффект ти-мэктомии. при этом делается вывод о необходимости тимуса для нормального функционирования стволовых клеток, в частности, для обеспечения их способности к репарации радиационных повреждений (Тодрия,1Э78).

Таким образом, при определении характеристик КОЕ-С методом селезеночных колоний необходимо учитывать тот факт, что образование колонии - это процесс кооперативный, в котором кроме стволовой кроветворной клетки участвуют и представители

других клеточных популяций, в частности, предшественники Т-лимфоцитов. Поэтому получаемые в эксперименте значения этих характеристик, вероятно, отнюдь не всегда относятся непосредственно к КОЕ-С, а могут отражать процессы взаимодействия последних с клетками, составляющими их микроокруже-кие, результатом которого и является образование селезеночных колоний. Нужно, кроме того, учитывать, что регуляция КОЕ-С при кооперации со вспомогательными клетками может осуществляться не только за счет межклеточных взаимодействий, но и посредством короткоранговых гуморальных факторов. В пользу этого утверждения свидетельствует способность ГГГЛ продуцировать фактор, регулирующий как экзогенное, так и эндогенное ко-лониеобразовыание, а также увеличивать выживаемость облученных мышей (Мирошниченко и др.,19891.

3. ЛимЗюкины, цитокиш и реакция КОЕ-С на облучение.

Установление факта регуляция стволовых кроветворных клеток со стороны иммунной системы подразумевает участие в этом процессе не только клеток-регуляторов лимфоидной природы, но и гуморальных медиаторов, секретидуемых ими. К последним относятся лимфокины и цитокины, играющие ведущую роль во многих физиологических ответах и являющихся в определенной мере терапевтическими агентами. В связи с этим открылась перспектива направленного поиска факторов, позволяющих активно воздействовать на различные этапы гемопоэза после пребывания животных или человека в неблагоприятных условиях, например, после воздействия ионизирующего излучения.

Полагают, что первичная функция лимфокинов и цитокинов в гемопоэзе заключается в регуляции пролиферации и поддержания выживания кроветворных клеток-предшественников, основными стимуляторами в этом отношении являются ИЛ-I, ИЛ-3, ИЯ-6, выделенные в группу раннедействуицих линейнонеспецифических лимфокинов llhle, 1982; Moohizuki et al, 1987; Neta et al, 1987; Metoalí, 1989; Hirano et al, 1990; Огава, 1990]. Способность к ингибированию пролиферации кроветворных клеток-предшественников обнаружена у нескольких цитокинов: интерферонов ( у - иммунный,а- лейкоцитарный, р-фиробластный), а также фактора некроза опухолей- (ФИО) (Gidali et al., 1981; Eliason, YaBsall, 1988; Kotnik, Plelsohman, 1990). Интерес, проявляемый исследователями к интерлейкинам и цитокинам связан, отчасти, и с появившимися сведениями о радиозащитных свойствах этих факторов, а качестве достаточно эффективного протектора использовали интерферон и интерфероногены при введении за 2 сух до оолучения (Семина и др., 1976; Roes et al, 1984). ИЛ-I, инъецированный за 20 ч до оолучения в костномозговом диапазоне доз увеличивает выживаемость животных до íüü % (Meta et al., 1986; Neta, Oppenheim, 1988). Обнаружены радиопротекторные свойства и у ФНо при той же схеме применения, хотя и более слабые, чем у йЛ-1 (Meta, Oppenheim, 1988). Появились сведения и о радиотерапевтическом действии одного из колоннестимулирующих факторов Ш-КСФ, инаекции которого в течение 6 сут после облучения в дозе 9,7 Гр увеличивали выживаемость животных до эо% (Рогачевг» и др., 1990).

- 53 -

3.1.Стимуляция интерлейкином-2 колониеобразования облученным in vitro костным мозгом. ИЛ-2 является высокоактивным стимулятором Т-клеточной пролиферации, это фактор роста для всех Т-ликфэцитов, в том числе и их предшественников. Однако о действии ИЛ-2 на предшественники кроветворения как in vivo, так и in vitro сведения отсутствуют. Существуют только данные о повышении синтеза ИЛ-2 в организме под действием облучения;- что, как полагают, во

многом способствует восстановлению поврежденной иммунной

i

системы (Шарый и др., 1986; Gerber et al., 1985). Предполагают наличие радиозащитного действия у ЮГ-I и Ш-2 в отношении ти-моцитов, и, более того, известно о таковом для ИЛ-2 по отношению к естественным киллерам (Ярилин, 1988).

Исходя из положения о тесной взаимосвязи и взаимном влиянии иммунной и кроветворной систем, мы попытались оценить воздействие рекомбинантного ИЛ-2 на процессы кроветворения в облученном организме. •

Проводили исследование влияния КЛ-2 на рост селезеночных колоний из костного мозга, облученного в дозе 0,5 Гр. Наибольший эффект при восстановлении колониеобразования давало введение 10 ед/мышь препарата в/в в 0,2 мл 199 среды на р-ре Хенк-са. Оказалось, что инъекция Ш-2 облученным мышам-реципиентам за 30-40 мин до трансплантации облученных in vitro (0,5 - 2,5 Гр) клеток костного мозга способствует повышению его колони-еобразующей активности примерно в 2 раза при всех взятых дозах облучения, причем после 0,5 Гр колониеобразование восстанавливается до контрольного уровня (рис. 3.1.) (Семина и др., 1988). .

и.От

I

?

I

1

_ 1 ^ -!-1--1---4--;-!—-:---:-1—

0,0 0.5 '1,0. 1.5 2,0 2,5 3.0

Рис 3.1. Радиочувствительность КОЕ-С в условиях облучения клеток костного мозга 1л ¿иго и последующего их введения летально облученным реципиентам, обработанным ИЛ-2.

По оси абсцисс - доза облучения, Гр; по оси ординат - десятичные логарифмы доли выживших КОЕ-С; I - интактные мыши-реципиенты, уравнение регрессии: у = -0,Э2х - 0,052;

£ - мыши-реципиенты, обработанные ИЛ-2, уравнение регрессии:

1« у = -0,31 + 0,18

- 55 -

Какова же природа наблюдаемого явления? Полученные значения фактора оседания, определяемые через 24 ч после первого переноса, свидетельствуют о том, что эффект не связан с перераспределением КОЕ-С в организме реципиента. Причиной наблюдаемого явления может быть изменение состояния пролиферации популяции КОЕ-С под влиянием ШГ-2. Основанием для такого предположения послужили представленные ранее данные о возможности регуляции Т-лимфоцитами скорости пролиферации КОЕ-С в случае вывода ее из состояния равновесия. Вполне вероятно, что Ю1-2, являясь продуктом Т-клеток и в то же время индуктором их пролиферации, взяв на себя функции Т-клеток акцессоров, побуждает выжившие после облучения КОЁ-С к ускорению деления. Однако, как показало изучение кинетики регенерации этих клеток, ИЛ-2, введенный летально облученному реципиенту до инъекции in vitro облученных (I Гр) клеток костного мозга, не меняет картину регенерации популяции КОЕ-С. При этом время удвоения размеров популяции в костном мозге не только не увеличивается, а.даже несколько уменьшается, оставаясь неизменным в селезенке.

Увеличение выхода колоний из облученного костного мозга в присутствии Ш-2 может быть также результатом более эффективной репарации радиационных повреждений, возникших в популяции КОЕ-С. Как показал анализ кривых выживаемости КОЕ-С, при отсутствии существенных различий в их радиочувствительности (контроль: D0 = 1,32 + 0,12 Гр, п = 0,89 + 0,074; ИЛ-2: DQ = 1,4 ± 0,023 Гр, п = 1,51 ± 0;02б - рис. 3.1.), . наблюдается двухкратное увеличение значения экстраполяционного числа (п) в группе животных, получивших ИЛ-2. TaKjM образом, можно пола-

- об -

гать, что Ш-Z способствует оолее интенсивной репарации лучевых повреждений кок-с.

следует отметить, что воздействие M-Z на костный мозг, облученный нейтронами в дозах, соответствующих примененному в предыдущих опытах гамма-оолучению, оказалось неэффективным в' отношении стимуляции роста колоний. Считывая тот факт, что при воздействии плотноионизируицих излучений способность клеток репарировать суолетальные радиационные повреждения в значительной мере ослаоляется или даже полностью исчезает, а эта закономерность характерна и для клеток стволового типа в кроветворных тканях (Коношшнников, 1УВ4; Field, Hornsey, 1979), можно сделать вывод, что положительное действие йЛ-<: на поврежденную гамма-оолучением популяцию кок-и не связано с прямой стимуляцией процессов пролиферации, а скорее всего, обусловлено более интенсивной репарацией повреждений KOE-G под действием лимфокина.

По-видимому, именно этим объясняется особенность течения процесса репопуляции кроветворных органов в присутствии HJI-2 у летально облученных мышей, защищенных облученным in vitro (1 Гр) костным мозгом (рис.3.Z., 3.3.). Обнаружено, что в костном . мозге продолжительность лаг-периода не изменяется, но начальный уровень падения численности кариоцитов в течение первых 4 суток после введения клеток бал менее выражен на фоне Wi к 7-м суткам разница становится меньше, а экспоненциальный рост клеточности происходит вне зависимости от tti-2. При репопуляции селезенки : положительное влияние ИЛ-2 сказывается в фазе -. экспоненциального роста - процесс идет более интенсивно и ко-

а -1

3 -1 7 н

с I <-> 1

5

4 31 Н

ч

г

0

-■а

1 >

7 /■ °//

/Л /

' / А / л

Л £ / / •

> / г/ / / /

я

/*■ ) / / ! (

'У'

4 6 3 101214

¿о ■

¿."Г 90

'20 18 16 14 12 10

3 6

4

п

л

г !

I

I I

I »

- ./ * ! Г I /I I И ! И ! И 7 И И // / <■ / I II / X/ п I X!

//У . (/ •

" I»

- / / / I !

о / / /' //

Рис. 3.2.

0 2 4 6 8 1012 14 Рис. 3.3. .

¡^ис. 3.2., 3.3. Динамика клеточности костного мозга (рис. 3.2.) и селезенки (рис.3.3.) мышей, облученных в дозе 8,0 Гр и восстановленных интактным костным мозгом (I), облученным (I Гр) костным мозгом (2) и облученным костным мозгом с дополнительной инъекцией ИЛ-2 (3). . '

По оси абсцисс - время после введения клеток костного мозга (сут); по оси ординат - рис. 3.2. - количество миелока-риоцитов (х 10е), рис. 3.3. - количество спленоцитов (х 10').

личество кариоцитов к 14 суткам превышает значения в контрольных группах (защищенных нормальным костным мозгом и костным мозгом, облученным в дозе I Гр). Важно отметить, что инъекция ИЛ-2 не меняет картины репопуляции кроветворных органов у облученных мышей, восстановленных нормальным костным мозгом.

Повышение количественного порога КОЕ-С, с которого начинается репопуляция костного мозга под влиянием ИЛ-2 может быть также связана с угнетением деятельности клеток-супрессоров, тормозящих вступление КОЕ-С в период активной пролиферации в первые часы после облучения. Известно, что воздействие на мышей-доноров низких доз ионизирующего излучения (до 1,5 Гр) приводит к длительному пострадиационному падению численности КОЕ-С в костном мозге и селезенке, следствием чего является более медленное восстановление популяции КОЕ-С, чем при облучении в больших, дозах. Причиной наблюдаемого явления полагали активацию низкими дозами, популяции клеток-супрессоров, деятельность которых и приводит к выраженному лаг-периоду в пролиферации КОЕ-С (В1аоке-и,ч Во^ок, 1981).

Косвенным доказательством того, что ИЛ-2 способен ослаблять действие супрессоров служат данные об отмене угнетающего влияния на колониеобразование стимулятора супрессоров Кон А. Костномозговую суспензию инкубировали с Кон А в условиях, описанных вше, ИЛ-2 вводили мышам-реципиентам в/в за 30-40 мин до инъекции костного мозга. Оказалось, что ИЛ-2 полностью отменяет ингибирующий эффект Кон А, увеличивая выход колоний до контрольных значений(Кон А - 5,0 ± 0,6; Кон А + ИЛ-2 - 10,7 ± 0,8). Можно предположить, что способность ИЛ-2 подавлять дея-

' - ЭУ -

тельность супрессоров также вносит своя вклад в положительное влияние лим^окина на стимуляцию колониеооразования облученным з низких дозах костным мозгом.

Представляло также интерес выяснить, какие именно по степени полипотентности KUtí-G испытывают на себе влияние ИЛ-2 в процессе формирования колоний на селезенках. Оказалось, что Ш1 -2 стимулирует рост только 8 суточных селезеночных колоний, которые, как известно, формируются КОЕ-С с ограниченным проли-Феративным потенциалом, тогда как на рост 12 суточных колоний, формируемых преимущественно полипотентными КОЕ-С, препарат влияния не оказывает.

эндотоксин, введенный в/в облученным реципиентам (10, 20, 30 мкг/мышь) не стимулировал выхода колоний из облученного In vitro 1 Гр костного мозга. Полученные результаты, как нам кажется, позволяют отнести регистрируемый стимулирующий колони-зооразование эффект ИЛ-2 за счет собственно лимфокина, а не возможных в нем примесей эндотоксина.

Необходимо подчеркнуть, что несмотря на то, что нами применялись разнообразию схемы лечения и использован спектр доз АЛ-2, не было обнаружено ни радиотерапевтических, ни радиозащитных свойств у данного препарата.. Как представляется, результат этот вполне закономерен, так как.ИЛ-2 оказывает положительное влияние на популяцию КОЕ-0 только при малых дозах облучения, иб отсутствии эффекта ИЛ-2 на выживаемость облученных в' костномозговом диапазоне доз гивотных есть сведения и в литературе (Neta et al., 1986).

Таким образом, с помощью различных экспериментальных под-

. - 60 -

ходов установлено, что действие ИЛ-2 на селезеночное колони-еобразование проявляется лишь при малых дозах облучения и заключается в том, что под влиянием препарата щгацесс репопуляции кроветворных органов донорскими клетками начинается с более высокого уровня их выживаемости, обусловленного, возможно, со-лее интенсивной репарацией вызванных облучением повреждений КОЕ-С, что при прочих равных условиях (скорость пролиферации, фактор т) и приводит к большему выходу колоний, чем при защите реципиентов только облученным костным мозгом. Причем действие лимфокина кратковременно, ограничивается первой неделей после облучения. ■

• Выявленное влияние ИЛ-2 на облученные КОЕ-С может быть как непосредственным, так и опосредованным, через активацию предшественников Т-лимфоцитов. .На поверхности половины ПТЛ присутствуют рецепторы для ИЛ-2, причем для их экспрессии не требуется предварительной стимуляции этих клеток антигенами и митогенами (Ярилин, 1986). Показано, что ПТЛ, выделенные из костного мозга, способны отвечать пролиферацией на ИЛ-2, причем интенсивность ответа рйнних и активированных ПТЛ примерно одинакова (Ярилин, 1986). Возможно, что ИЛ-2, воздействуя на выжившие после облучения ПТЛ, через посредство последних и оказывают положительный эффект на КОЕ-С облученного костного мозга. В свете полученных нами результатов приобретают большой биологический смысл сведения о повышении синтеза ИЛ-2 в организме в ответ на облучение (Шарый и др., 1986; оегЬег et а1., 1985), а также о снижении концентрации ингибитора ИЛ-2 в крови хублетально облученных мышей в первые 5 сут после воздействия

' - 61 -

радиации (свирщевская и др., 1990). По-видимому, этот лимфокин служит не только постлучевой регенерации тимуса, но способствует и восстановлению повременного гемопоэза.

¿.2. Возможный механизм радиозащитного действия ФИО.

существует ряд цитокинов, обладающие спосооностью ингиои-ровать пролиферацию кроветворных клэток-предше ственников. К им относятся система интерферонов (а-лейкощтарный, (3-фиброо-ластный и 7-ишунннй) и ФИО. йнтерфероны играют регуляторную роль в контроле пролиферации и дифференцировки клеток в культуре костного мозга, подавляя рост гранулоцитарно-макрофагаль-ных, эритроидкых и полипотентных предшественников (Vema et al., 1981; Barber et al., 1987). Полагают, что как in vivo, так и in vitro интерферон и его индукторы продуцируют преходящий, нетоксичный эффект ингибирования пролкрерации, при этом происходит накопление клеток в Оо-периоде, после чего они вызывают и начинают вновь пролиферировать (flidaii et ai., 1981; Ross et al., 1984). Действие ФН.0 на коммитированные клетки-предшественники в культуре сходно с таковым интерферона, ин подавляет пролиферацию макрофагалышх и эритроидных предшественников, а также гемопоэз в длительных культурах костного мозга (Eliason, Vassali, 1988), при совместном применении интерферона и ФИО проявляется синергизм их действия (Kotnik, Pleisctoan, 1990). Причем полагают, что влияние этих факторов регуляции на клетки -предшественники гемопоэза является прямым, неопосредованным (Barber et al., 1987). Интерферон, ин-терфероногены и ФНО обладают радиопротекторным действием при

введении их за несколько (24-48) часов до облучения (Семина 'и др., 1976; Neta, Oppenheim, 1988). Как указывалось выше, на 100% может защищать инъекция ИЛ-I за 20 ч до радиационного воздействия. Данный лимфокин стоит во главе каскада, является индуктором выработки других лимфэкинов и цитокинов, в том числе интерфэронов и ФНО. Для ИЛ-I продемонстрирован возможный механизм его радиопротекторного действия - стимуляция восстановления гемопоэза в ранние сроки после облучения (Neta, Oppenheim, 1988). Сведения же о влиянии ФНО на кроветворные клетки-предшественники в условиях облучения in vivo в сообщениях практически отсутствуют. В связи с этим представляло интерес изучение воздействия препарата на КОЕ-С различной степени коммитированности (КОЕ-С-8 и -12), а также динамики восста- • новления данной популяции после облучения.

Как известно из публикаций Neta и соавт., после в/б инъекции ФНО за 20 ч до облучения в LD 100/30 выживаемость мышей составляет около 40% при 3% в контроле. Мы воспроизвели эти результаты, получив 40%-ую выживаемость мышей, облученных в дозе 8 Гр после введений 50000 ед ФНО, по сравнению со 100% гибелью в контроле. Серия экспериментов по определению выхода эндогенных селезеночных колоний при введении ФНО в различные сроки до и после облучения в дозе 6 Гр дала неожиданные результаты. Оказалось, что. цитокин практически не приводит к увеличению-выхода эндогенных селезеночных колоний при всех испытанных сроках инъекции. Даже введение его за 20 ч до облучения, т.е. когда отмечено максимальное радиопротекторное _действие, вызывает весьма слабо выраженную стимуляцию эндоген-

ного колониеобразования. Однако показатели эндоколониального теста не всегда адекватно отражают состояние пула КОЕ-с, обеспечивающего выживаемость облученных животных, особенно в случае применения радиопротекторов, с так называемым "биологическим механизмом действия", к которым, несомненно, относится • и ФНО (Коноплякшосов, 1984). В таком случае радиационное воздействие приходится на кроветворную систему не в стационарном состоянии, а выведенную из обычного'режима функционирования. В связи с этим было проведено исследование состояния пула КОЕ-С к моменту облучения после инъекции ФНО донору за 20 ч до взятия костного мозга. Обнаружено наличие ингибирующего действия ФНО на пул 7-8 сут КОЕ-С и двукратное увеличение выхода II суточных колоний у мышей, получивших ФНО, по сравнению с контролем (таблица " 3.1.). Эти результаты полностью коррелировали с количеством КОЕ-С на бедро. Кинетика восстановления клеточнос-ти костного мозга и числа КОЕ-С-8 у мышей-доноров, получивших внутрибрюшинную инъекцию ФНО за 20 час до облучения в дозе 5 Гр, продемонстрировала (рис. 3.4., рис. 3.5.) стимулирующее влияние препарата на оба параметра. Начиная с 3-х суток после облучения, количество КОЕ-С в груше доноров, получивших ФНО, превышает контрольные значения, хотя скорость пролиферации КОЕ-С в подопытной и контрольной группах примерно одинакова. Следует отметить, что способность к репарации радиационных повреждений, тестированная с помощью метода фракционированного облучения, у КОЕ-С-8 и КОЕ-С-12 костного, мозга мышей, ■ обработанных ФНО, примерно одного порядка. Это отличает их от контрольной группы, где повышается выживаемость при фракциониро-

' Рис. 3.4. Динамика восстановления количества КОЕ-О у доноров в костном мозге после в/о инъекции ФНО за 20 ч до облучения в дозе 5,0 Гр (I - облучение, 2 - ФНО + облучение).

По оси абсцисс - время после облучения Чсут); по оси ординат - количество КОЕ-С в костном мозге бедренной кости ШО^).

Рис. 3.5. Динамика клеточности костного мозга у доноров после в/о инъекции ФНО за 20 ч до облучения в дозе 5,0 Гр.

По оси абсцисс - время после облучения (сут); по оси ординат - клеточность костного мозга (х106 ); I - облучение, 2 -ФНО + облучение. .

Банном облучении только К0Е-С-8, а полипотентные КОЕ-С-12 (таблица 3.1.) обнаруживают гораздо более слабо выраженную способность ко внутриклеточной репарации (Тодрия, 1988).Полу-

Таблица 3.1.

Определение значения индекса репарации (ИР) КОЕ-С у мышей, получивших ФНО.

Среднее количество колоний

Группа __ '• - _________

8 сут ИР 12 сут ИР

Контроль интактный ФНО

Контроль - нефракционированное облучение

Контроль - фракционированное облучение

ФНО + нефракцио-нированное облучение

ФНО + фракциони-, рованное облучение •.

9.6 1 1,0 - 9,5 ± 0,9 -

5.5 ± 0,7 - 16,1 ±0,8 -

1.7 ± 0,3 - 4,1 ± 0,2 -

.

3.6 + '0,3 2,1 ± 0,2 6,5 ± 0,4 1,6 ± 0,1*

1,8 1 0,4 - ■ 4,2 ± 0,4

4,8 1 0,6 2,6 ± 0,4 9,4 ± 0,3 2,2 ±0,1*

* - Р < 0,05

ченные результаты дают основание предположить, что радиопротекторное действие ФНО может быть связано со стимулирующим влиянием препарата на более примитивные 12 суточные КОЕ-С, возможно, за счет активации репаративных процессов в данных клетках. Кроме того, инъекция ФНО приводит к повышению, по сравнению с контролем, уровня регенерации КОЕ-С-8 начиная с 3-х суток после облучения, что обогащает организм животного в постлучевой период как коммитированными клетками-предшественниками, так и более полипотентными, которые могут обеспечить

t

пострадиационное восстановление не только гемопоэтической ткани, НО И ЛИМфОИДНОЙ (Lord, Dexter, 1988).

Это предположение подкрепляется, в определенной мере, данными о способности эндотоксина вызывать более раннюю регенерацию КОЕ-С, интенсификацию их потенций к генерации гемопоэ-тических клеток-предшественников после обработки мышей 5-фто-рурацилом, в результате которой выживают лишь ранние K0E-C-I2 (Hodgson, Bradley, 1979). А если учесть, что WO является эф-фекторной молекулой эндотоксина,, осуществляющей как защитные, так и летальные эффекты последнего, то» действительно, радиоп-ротекцшо ФНО реально можно связать с защитой этим. цитокином шлипотентных ранних K0E-C-I2. •

Заключение

Основной задачей нашей работы являлось установление роли популяции Т-лимфзцитов и лимфокинов в регуляции'начальных этапов гемопоэза, в частности, при образовании колоний на селезенках, а также попытка оценить вклад этих популяций в некото-

- 68 -

рые из известных радиобиологических характеристик КУЕ-С.

В результате проведенных исследований в костном мозге нами обнаружена популяция вспомогательных (или "акцессорных") Т-лимфоцитов, чувствительных к действ» СПГММ, присутствие которых, наряду с КОЕ-С необходимо для образования колоний на селезенках летально облученных мышей. Другими словами, процесс формирования колоний является результатом кооперации стволовой клетки и вспомогательной, выполняющей хелперную роль по отношению к первой. Эффективность колониеобразования зависит от состояния обеих популяций, их тесного взаимодействия, которое связано с распознаванием генетически детерминированных структур и треоует тождественности по Н-2 области контактирующих клеток. Кооперация с "акцессорными" клетками необходима как для коммитированных КОЕ-С-8, так и для полипотентных КОЕ-С-12, и не зависит от стадии их клеточного цикла. Клетками, осуществляющими вспомогательное действие по отношению к КОЕ-С при образовании селезеночных колоний являются 8С-1+ тиу-1ранние предшественники тимоцитов.> Они не влияют на направление диффе-ренцировки КОЕ-С, а их функция состоит в обеспечении нормальной скорости пролиферации гемопоэтических клеток-предшественников. В тимусе содержатся клетки, аналогичные по функциям и характеристикам костномозговым вспомогательным, причем в очень небольших количествах.

Получены данные о стимуляции тимоцитами процесса формирования селезеночных колоний клетками '. эмбриональной печени и длительной культуры костного мозга. Их влияние сохраняется при г,зоздействии облучения, до 0,8 Гр. Повышение эффективности кло-

нирования, как и в случае применения СПГММ, связано с ускорением пролиферации КОЕ-С. Особенно важно, что эффект наблюдается 1л vivo без дополнительного воздействия повревдающих факторов.

Также установлено, что в регуляции процесса колониеобра- • зования кроме стимулирующих тимоцитов принимают участие и Т-супрессоры. Через активацию этих клеток и последующее выделение ими гуморальных факторов Кон А ингибирует образование колоний, накладывая "арест" на пролиферацию КОЕ-С. Дополнительное введение тимоцитов нормализует эти процесса, благодаря содержащимся среди них "акцессорам". Механизм регуляции стволовых кроветворных клеток "хелперы-супрессоры" складывается в очагах эмбрионального гемопоэза у мышей к моменту рождения.

При определении характеристик КОЕ-С методом селезеночных колоний необходимо учитывать- тот факт, что образование колонии - это процесс кооперативный, в котором кроме стволовой клетки участвуют и представители других клеточных популяций, составляющих кроветворное микроокружение, в частности, предшественники Т-лимфоцитов. Поэтому многие из известных характеристик КОЕ-С, например радиобиологические, могут быть отнесены не только к ним, но и к клеткам-партнерам. Иными словами, реакция гемопоэтических клеток-предшественников на различные повреждающие агенты, в том числе и на радиацию, не всегда отражает изменения в компарТменте этих клеток, ' а может быть следствием или нарушения равновесия между ними и регуляторами, или повреждения -регуляторов. Это положение иллюстрируют проведенные эксперименты, в которых показано, что после удаления из каст-

ного мозга СПГММ вспомогательных клеток уменьшается не только выход колоний, но и увеличивается радиочувствительность КОЕ-С, облученных в интервале доз 0,04-0,75 Гр. Добавление тимоцитов нормализует этот параметр. Следовательно, в характеристики КОЕ -С вносит свой вклад и кроветворное микроокружение, поддерживающее их жизнедеятельность.

Исходя из этого положения мы попытались проверить, во всех ли случаях миграция стволовых клеток, оцениваемая, как правило, с помощью метода селезеночных колоний, определяется собственно перераспределением КОЕ-С. Оказалось, что в первые часы после облучения под влиянием ДС из костного мозга подопытных животных мигрирует вспомогательная для образования колоний популяция клеток, что выражается в снижении выхода селезеночных колоний. Они могут быть заменены тимоцитами, при этом колониеобразование восстанавливается полностью. Таким образом, в ряде случаев результаты, полученные при изучении процессов миграции стволовых клеток из костного мозга с помощью определения количества колоний на селезенках, не могут безоговорочно трактоваться-как, свидетельство изменения содержания стволовых . клеток в этой популяции. Видимо, и в этом случае, как и при изучении радаочувствительности, необходимо учитывать вклад микроокрукения, в частности, Т-лим$оцитов.

Установление факта регуляции стволовых кроветворных клеток со стороны иммунной системы подразумевает участие в этом процессе не только клеток-регуляторов лимфоидаой природы, но и гуморальных медиаторов, секретируемых ими. К последним отно-г,сятся лимфокины и цитокины. Исходя из положения о тесной взаи-

- <ч -

мосвязи и взаимном влиянии иммунной и кроветворной систем, мы попытались оценить воздействие лим$окина - рекомоинантного ИЛ-л на процессы кроветворения в ослученном организме. С помощью различных экспериментальных подходов установлено, что действие ¡4/1-2 на селезеночное колониеобразование проявляется лишь при малых дозах облучения и заключается в том, что под влиянием препарата процесс репопуляции кроветворных органов донорскими клетками начинается с более высокого уровня их выживаемости, обусловленного, возможно, более интенсивной репарацией вызванных облучением повреждений КОЕ-С, что при прочих равных условиях юкорость пролиферации, фактор f) и приводит к большему выходу колоний, чем при защите реципиентов только облученным костным мозгом, причем действие лимфоюша кратковременно, ограничивается первой неделей после облучения. Вероятно, этот лимрокин служит не только поетлучевой регенерации тимуса, но и способствует восстановлению поврежденного гемопоэза.

в отличив от ИЛ-2 Фйо, являпцийся цитокином, обладает выраженным радиопротекторным действием (Hata, Oppenheim, 1988), механизм которого практически не изучен. Мы попытались выяснить закономерности влияния ФНО на кроветворные клетки-предшественники в условиях облучения. Полученные результаты дают основание предполагать, что радиопротёкторное действие ФНО может быть связано со стимулирующим влиянием препарата на примитивные двенадцатисуточные КОЕ-С, вероятнее всего, за счет активации репаративных процессов в данных клетках. Кроме того, инъекция ФНО приводит к повышению, по сравнению с контролем, уровня регенерации КОЕ-С-8 начиная с третьих суток после оолу-

чения, что обогащает организм животного в гостлучевой период как коммитированными клетками-предшественниками, так и более полипотентными, которые могут обеспечить пострадиационное восстановление не только гемопоэтической, но и лимфоидаой ткани. -

Весь комплекс сведений, полученный к настоящему времени, позволяет сделать вывод, что система регуляции кроветворения многокомпонентна, причем, важное место в ней занимают клетки лимфоидного происховдения, что и может определить высокую радиочувствительность всей системы к действию повреждающих факторов. Следует • напомнить, что высокая радиочувствительность лимфоидаой популяции является следствием интерфазной гибели облученных лимфоцитов (Петров, 1987). Приведенные данные позволяют высказать предположение, что важнейшая роль в генезе костномозгового синдрома принадлежит лимфоидаой системе, страдающей от облучения в первую очередь . Следует также подчеркнуть, что глубокое всестороннее изучение взаимосвязи иммунной и гемопоэтической систем может внести элементы нового понимания в сложную модель регуляции гемопозза, что, в свою очередь, окажется весьма полезным и в клинической практике.

Вывода

1. Установлено, что в регуляции начальных этапов гемопоэ-за в организме принимает участие популяция Т-ликфоцитов; продемонстрирована ее важная роль в чувствительности системы кроветворения к воздействию ионизирующей радиации.

2. Показано, что эта популяция принадлежит к предшествен-

никам Г-лимфоцитов, содержится в костном мозге и тимусе; влияет на формирование селезеночных колоний КОЕ-С-8 и КОЕ-С-12, причем ее действие не зависит от стадии клеточного цикла КОЕ-С; элиминируется сывороткой против головного мозга мышей.

3. Выявленную популяцию Т-лилфэцитов можно считать попу- • ляцией вспомогательных ("акцессорных") для селезеночного коло-ниеооразования клеток; они не влияют на направление дифферен-цировки КОЕ-С, их функция состоит в обеспечении нормальной скорости пролиферации последних. Для взаимодействия КОЕ-С и акцессорной клетки требуется генетическая тождественность контактирующих клеток по Н-2 локусу.

4. Акцессорные клетки увеличивают число селезеночных колоний, формируемых КОЕ-С-8 и КОЕ-С-12, содержащихся в эмбриональной печени и длительной культуре костного мозга, сокращают их время удвоения; эффект сохраняется при облучении тимоцитов в интервале доз 0,2-0,8 Гр.

5. Контрольный механизм пролиферации кроветворных клеток-предшественников "хелперы-супрессоры" складывается в очагах гемопоэза к моменту рождения. Вплоть до 19-ого дня развития эмбрионов КОЕ-С печени способны отвечать на стимулирующее действие тимоцитов и не чувствительны к супрессирующему конка-навалина А.

наряду с акцессорными т-клетками в регуляции селезеночного колониеооразования участвуют и Т-клетки, выполняющие роль супрессоров. вероятно, действие конканавалина А, ингиои-рующее образование селезеночных колоний, проявляется через активацию этой популяции.

- 74 -

7. Элиминация сывороткой против головного мозга мышей из костного мозга популяции акцессорных Т-лимфоцитов приводит к изменению радиочувствительности КОЕ-С. Добавление тимоцитов нормализует этот показатель.

8. Установлено, что в первые часы после облучения под влиянием декстрансульфата, обладающего способностью вызывать перераспределительный лейкоцитоз, вдвое снижается колониеобра-зующая активность костного мозга, которая восстанавливается до исходного уровня после введения тимоцитов; следовательно, из костного мозга подопытных животных мигрируют в данном случае не КОЕ-С, а-вспомогательная для образования колоний на селезенках популяция. Т-лимфоцитов, заменяемая клетками тимуса.

9. При исследовании влияния лимфокинов и цитокинов на популяцию КОЕ-С обнаружено, что стимуляция интерлейкином-2 образования селезеночных колоний клетками облученного in vitro костного мозга проявляется лишь при малых дозах (до 2 Гр) и приводит к большему выходу колоний, чем при защите реципиентов только облученным костным'мозгом. Такой эффект обусловлен, возможно, более интенсивй'ой репарацией вызванных облучением

. повреждений КОЕ-С.

10. Цитокин - фактор некроза опухоли способен увеличивать выживаемость полипотентных K0E-C-I2, активируя репаративные процессы в этих клетках, а также повышать уровень регенерации КОЕ-С-8 после облучения, чем и может быть обусловлено радиопротекторное действие этого препарата.

■ - 75 -

Список работ, опубликованных по теме диссертации.

I. Семина 0.В,Поверенный A.M., Коноплянников А.Г. Влияние Кон А на участие тимусных клеток в селезеночном колониеобразо-вании// ДАН СССР.-'1975.- т.223.- N.5.- с.1248-1250.

'2. Поверенный A.M., Семина О.В., Семенец Т.Н., Ярилин . A.A. Роль тимусзависимых клеток в селезеночном колониеобразовании// БЗБМ.- 1978.- Кб.- с.708-709.

3. Поверенный A.M., Семина 0;В., Семенец Т.Н., Ярилин A.A. Роль тимусных клеток в селезеночном колониеобразовании. Сообщение I. Влияние антисыворотки к 9-антигвну не изменение в селезеночном колониеобразовании// Радиобиология.- 1978.-т.718-N4.- с.545-547.

4. Семина О.В., Семенец Т.Н., Поверенный A.M. Роль тимусных клеток в "селезеночном колониеобразовании. Сообщение 2. Перераспределение колониеобразувдих клеток в организме под влиянием Кон А//Радиобиология.- 1979,- т.19.- N2_ с.290-293.

5. Семина 0.В., Муратходжаев Ф.Н., Поверенный A.M. Роль тимусных клеток в селезеночном колониеобразовании. Сообщение 3. Особенности миграции КОЕ-С в облученном организме под влиянием декстрансульфата//.Радиобиология. - 1981.- т.21.- N4,-с.606-609.

6. Семенец Т.Н., Семина О.В., Поверенный A.M. Роль тимусных клеток в селезеночном колониеобразовании.- Сообщение 4. Восстановление эндотоксином колониеобразувдей способности клеток костного мозга, обработанного антимозговой сывороткой// Радиобиология.- 1981.- т.21.- N2.- с.277-281.

7. Поверенный A.M., Семина О.В., Семенец Т.Н., Семин Ю.А.

Днтерфазная гибель лимфоцитов - возможные механизмы и вклад в развитие лучевого синдрома; СО. "Интерфазная гибель облученных клеток." Обнинск, 1979.- с.60-63.

8. Муратходкаев Ф.Н., Семина О.В., Поверенный A.M. Миграция стволовых клеток мышей под волиянием дестрансульфата// Радиобиология.- 1979.- т.19.- N5.- с. 766-769.

9. Семина О.В., Поверенный A.M., Семенец Т.Н. Роль тимус-ных клеток в процессах кроветворения в облученном организме: Сб. "Радиочувствительность и процессы восстановления у животных и расстений". Ташкент, 1980.- с.73.

10. Муратходкаев Ф.Н., Семина ü.B. Миграция стволовых клеток под влиянием полианионов в нормальном и облученном организме: Там же.- с.76.

П.Семина О.В., Семенец Т.Н., Поверенный A.M., Зажирей В. Д., Коротаев Г.К. Влияние тимозина на образование селезеночных экзоколоний в аллогенной и сингенной системах//БЭБМ.- 1980.-N9,- с.334-336.

12. Семина О.В., Поверенный A.M. Проблемы определения радиочувствительности стволовых клеток: Сб."Радиобиологические основы лучевой терапии". Ленинград, 1980.- ч.2.- с.77-78.

13. Семина О.В., Семенец Т.Н., Поверенный A.M., Ярилин А. А. Вероятная природа клеточной популяции, способствующей селезеночному колониеооразованию// ВЭБМ.- 1981.- N4.-,с.485-487.

14 Poverenny A.M.,.Semina O.V., Semenets T.N., Yarilin A. A. Probable mechanism oí spleen colony formation supression with rabbit antimouse brain antiserum// Exp. Hematol.- 1980.-V. в.— N10,- p.1216-1221.

- 77 -

15. Poverermy A.M., Semina 0.7., Semenets T.N. Regulation of proliferation of stem blood oells and their

radiosensitivity// Studia biophyeioa.- 1981.- v.86.- N1.- p. 75-76. ' ; ;

16. Семина O.B., Поверенный A.M., Семенец Т.Н., Иванов В. . К., Шаповалова Е.В. Радиочувствительность плюрипотентных стволовых клеток, определяемая клонированием в селезенке облученных мышей// Радиобиология.- 1984.- т.24.- N1.- с.89-93.

17. Семина О.В., Семенец Т.Н.. Поверенный A.M., Манько В.

I

М. Элиминация СПГММ из костного мозга вспомогательной популяции, участвующей в пролиферации плюрипотентных стволовых кроветворных клеток// БЭБМ.- 1985.- N.11.- с.6II-6I3.

18. Семина О.В., Семенец Т.Н., Курилец Э.С., Поверенный A.M., Манько Ё.М., Руднева Т.В. Влияние Т-клеточных митогенов (ФГА, Кон А) и дефицита Т-лимфоцитов на селезеночное колони-еобразование// Цитология.- 1986.- т.28.- N10.- С.П07-1Ш.

19. Семенец Т.Н., Семина О.В., Курилец Э.С., Поверенный A.M. Влияние СПГММ на КОЕ-С активно пролиферирующего костного мозга// Радиобиология.- 1986.- т.26.- N4.- с.553-556.

20. Семина О.В., Семенец Т.Н., Манько В.М., Курилец Э.С., Поверенный A.M. Роль клеток, чувствительных к действию сыворотки против головного мозга мышей в регуляции пролиферации КОЕ-С// БЭБМ.- 1987.- N4.- С.444-446.

21. Семина О.В. Возможный механизм супрессии Т-клвточными митогенами селезеночного колониеобразования: Сб."Радиочувствительность стволовой и клоногекной клетки", Обнинск, 1966,-с.31 -37. : ...

- 78 -

22-Поверенный A.M., Семина О.В., Семенец Т.Н. Регуляция кроветворения в нормальном и облученном организме: со."Восстановительный и компенсаторные процессы при лучевых поражениях". Ленинград, 1986.- с.140-141.

23. Семина О.В., Семенец Т.Н., Поверенный A.M., Ульянова Л.П., Будагов P.C. ИЛ-2 стимулирует колониеооразущую активность облученного in vitro костного мозга// Радиобиология.-1987.- Т.27,- N3.- С.381-384.

24. Семенец Т.Н., Семина О.В..Поверенный A.M. Возможные пути стимуляции ИЛ-2 колониеобразования клетками облученного in vitro костного мозга// Радиобиология.- 1989.- т.29.- N4.-С.463- 467.

25. Поверенный A.M., Семина О.В., Семенец Т.Н. Клеточная кооперация в регуляции кроветворения в облученном организме: CO. "I Всесоюзный радиобиологический съезд", Москва, 1989. -Т.4.- С.1094.

26. Семенец Т.Н., Семина О.В., Поверенный A.M. Селезеночное колониеооразование клетками печени эмбрионов мышей различного возраста в присутствии тимоцитов// БЭБМ.- 1990.- N5. -С.464-466.

27. Семина О.В.. Семенец Т.Н., Поверенный A.M. образование селезеночных колоний КОЕ-С длительной культуры костного мозга и эмбриональной печени в присутствии тимоцитов// БЭБМ.-1УУи.- N8.- С.176-178.

28. Семецец Т.Н.,• Семина О.В., Поверенный A.M. Стимуляция тимоцитами селезеночного колониеобразования KüE-C эмбриональной печени// Иммунология.- 1991.- Н5.-с.24-27..

29. Семина О.В., Семенец Т.Н., .Поверенный A.M., Коробко В.Г, Чувпило С.А. Действие ТНФ на процессы востановления гемо-поэтических колониеобразущих клеток у облученных мышей// Радиобиология.- 19911- т.31.- N1.- С.92-96.

'30. Семина О.В., Семенец Т.Н. Действие лимфокинов на по- • пуляцию КОЕ-С в облученном организме: Сб."Активация кроветворения и радиорезистентность организма". Обнинск, 1990.-с.72-74.

31. Семина 0.В., Семенец Т.Н., Поверенный A.M. Система кроветворения - механизмы лимфоидной регуляции и радиочувствительность// Радиобиология.- 1992.- Т.32.- N2.- С.225-240.