Термостабильная лихеназа Clostridium thermocellum для фундаментальных и прикладных исследований

Комахин, Роман Александрович

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Термостабильная лихеназа Clostridium thermocellum для фундаментальных и прикладных исследований
ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Термостабильная лихеназа Clostridium thermocellum для фундаментальных и прикладных исследований"

На правах рукописи

КОМАХИН РОМАН АЛЕКСАНДРОВИЧ

ТЕРМОСТАБИЛЬНАЯ ЛИХЕНАЗА Clostridium thermocellum ДЛЯ ФУНДАМЕНТАЛЬНЫХ И ПРИКЛАДНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ

03.00.03 - Молекулярная биология

АВТОРЕФЕРАТ ДИССЕРТАЦИИ на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва - 2095 •

Работа выполнена в лаборатории функциональной геномики

Института общей генетики им. Н.И. Вавилова РАН

НАУЧНЫЕ РУКОВОДИТЕЛИ: Доктор биологических наук, профессор, член-корреспондент РАН Доктор биологических наук

А.А. Жученко И.В. Голденкова

ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ: доктор биологических наук, профессор кандидат биологических наук

Н.К. Янковский П.А. СломинскиЙ

ВЕДУЩАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ: Институт молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН.

Зашита состоится « »_2005 г. в_часов на заседании

Диссертационного совета Д.217.013.01 при Государственном научно-исследовательском институте генетики и селекции промышленных микроорганизмов по адресу: 117545, Москва, 1-й Дорожный проезд, д.1.

С диссертацией можно ознакомится в библиотеке Государственного научно-исследовательского института генетики и селекции промышленных микроорганизмов по адресу: 117545, Москва, 1-й Дорожный проезд, д.1.

Автореферат разослан « »_2005 г.

Ученый секретарь Диссертационного совета, кандидат биологических наук

В.И. Щербакова

¿&6-Ч и&Ш/

4ок ~>ь ,

1. Общая характеристика работы

Актуальность темы диссертационной работы.

В последние годы в биотехнологии уделяется большое внимание использованию термостабильных ферментов, особенно гликозилгидролаз. Гликозилгидролазы термофильных бактерий являются удобными модельными объектами и для изучения многих фундаментальных проблем: молекулярных основ термостабильности, укладки (фолдинга) белковых молекул, функций структурных и функциональных элементов каталитических и некаталитических модулей ферментов и ряда других. Ранее в нашей лаборатории был клонирован ген, кодирующий термостабильную Р-1,3-1,4-глюканазу (лихеназу) Clostridium thermocellum, и было показано, что этот ген является удобным репортерным геном для клеток про- и эукариотических организмов. Ген термостабильной лихсназы транзиентно и стабильно экспрессируется в клетках бактерий, цианобактерий, дрожжей, растений и млекопитающих с образованием активного и термостабильного фермента, а уровень экспрессии бактериального гена лихеназы зависит от регуляторного элемента, контролирующего его экспрессию. Активность термостабильной лихеназы может быть определена простыми, быстрыми, чувствительными качественными и количественными методами, которые не требуют дорогостоящего оборудования и реактивов.

Области использования термостабильной лихеназы для фундаментальных и прикладных исследований могут быть расширены, поскольку она обладает уникальными свойствами - высокой удельной активностью и термостабильностью. Поэтому изучение структуры и свойств термостабильной лихеназы, модификация ее последовательности, а также конструирование на ее основе гибридных белков и белков-носителей являются перспективными направлениями исследований

Цель исследования: изучить возможности использования гена термостабильной лихеназы в качестве транскрипционного, трансляционного репортера и репортериоп) белка-носителя ^ .

Исходя из цели работы, были поставлены следующие задачи БИБЛИОТЕКА I

! S^fZ/f/.1

1 Изучить возможность использования гена термостабильной лихеназы в качестве транскрипционного репортера для изучения функциональной значимости некодирующих последовательностей геномов, для этого'

- разработать дрожжевую векторную конструкцию, содержащую два противоположно ориентированных репортерных гена (термостабильной лихеназы и ß-глюкуронидазы) и некодирующую последовательность генома человека (LTR HERV-K);

- изучить экспрессию репортерных генов, находящихся под контролем LTR HERV-K, в клетках низших эукариот - дрожжах Saccharomyces cerevisiae.

2. Изучить возможность использования термостабильной лихеназы в качестве трансляционного репортерного белка для клеток про- и эукариот, для этого.

- сконструировать гибридные гены, в которых последовательность 1ена лихеназы слита в рамки считывания с последовательностями бактериальных генов сгуЗа и сгуЗаМ Bacillus thuringiensis, а также reck и recA\ Е coli;

- провести сравнительный анализ экспрессии нативных и гибридных генов в клетках про- и эукариот.

3. Изучить возможность использования термостабильной лихеназы в качестве репортерного белка-носителя случайных и антигенных пептидов, для этого:

провести анализ трехмерной структуры термостабильной лихеназы и выбрать в молекуле лихеназы петлевые участки, которые могли бы использоваться для интеграции последовательностей пептидов; провести молекулярный дизайн последовательности гена термостабильной лихеназы, за счет которого сконструировать модифицированные варианты фермента, у которых в области петлевых участков добавлен линкер, и «циклически перестановленные» варианты, у которых С- и N-концевые области нативного фермента соединены линкером, а новые С- и N-концевые участки сформированы в петлевых участках;

провести сравнительный анализ биохимических свойств модифицированных и «циклически перестановленных» вариантов лихеназы;

сконструировать гибридные гены, в которых

последовательность, кодирующая случайный пептид (EGFP), встроена в последовательности модифицированных и «циклически перестановленных» вариантов лихеназы как внутренний гетерологичный модуль фермента;

провести сравнительный анализ биохимических свойств гибридных белков.

Научная новизна диссертационной работы Впервые показана возможность использования гена термостабильной лихеназы как транскрипционного репортера в оригинальной дрожжевой векторной системе для изучения регуляторных функций некодирующих последовательностей геномов эукариот Продемонстрирована возможность использования термостабильной лихеназы как трансляционного репортерного белка для бактериальных белков СгуЗа и СгуЗаМ B.thurmgiensis, а также RecA и RecAl Ecoli. Показано, что присутствие лихеназы в составе гибридных белков облегчает анализ их экспрессии в трансгенных организмах. Метод энзимограмм позволяет точно определять молекулярные массы гибридных белков, в состав которых входит лихеназа. Термостабильная лихеназа успешно использована в качестве репортерного белка-носителя пептидов, поскольку два модифицированных и два «циклически перестановленных» варианта лихеназы могут выдерживать значительные внутренние достройки с сохранением основных свойств фермента. Научно-практическое значение результатов исследования. Полученные результаты позволяют использовать термостабильную лихеназу для изучения структурно-функциональных особенностей геномов организмов про- и эукариотического происхождения Модифицированные и «циклически перестановленные» варианты лихеназы могут быть использованы в качестве белков-носителей случайных и антигенных пептидов при разработке вакцин. Апробация результатов работы. Результаты диссертационной работы были представлены на конференции молодых ученых ИОГен им. Н.И. Вавилова РАН (Москва, 2003), на Международной конференции «Клеточные ядра и пластиды: биохимия и биотехнология» (Минск. 2004), на III Съезде генетиков и селекционеров России «Генетика в XXI веке' современное состояние и перспективы

развития» (Москва, 2004), на Международной научной конференции «Молекулярная генетика, геномика и биотехнология» (Минск, 2004), на семинарах лаборатории функциональной геномики ИОГен им H И Вавилова РАН. Структура и объем диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, результатов и обсуждения, заключения, а также выводов и списка цитируемой литературы Работа изложена на

_ страницах машинописного текста, включая _ таблиц и _ рисунков

Список цитируемых литературных источников включает_наименования

2. СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

2.1. Материалы и методы исследования.

Бактериальные и дрожжевые штаммы Е coli XLl-Blue ("Stratagene", USA)- recAl endAl gyrA96 thi-\ hsdR17 supE44 relAl lac [F' pro А В lacFZ/b, M15 Тп10(Тй*)]; BL21(DE3) ("Novagene", USA) F" dem ompT hsdS(rB- mB-) gal X(DE3), штамм Saccharomyces cerevisiae Y PH 857 (Mata ade 2-101 lys 2-81 ига 3-52 trp 1-63 leu 2-1 his 3-200).

Процедуры молекулярного клонирования В работе использовали стандартные процедуры молекулярного клонирования, которые проводили согласно методическим руководствам [Маниатис и др , 1984, Sambrook et al., 1989]

Плазм иды. В качестве источника гена лихеназы С. íhermocellum, гена egfp Aequorea victoria и гена и id К Е coli использовали полученные ранее плазмиды pQfc-/¡cBM2-KM2-Mys25, pQE-egfp и pQE-gi«, соответственно.

Получение и очистка белковых препаратов. Белковые лизаты из E.coli получали разрушением клеток в течение часа 8М мочевиной, приготовленной на 50мМ трис-HCI, pH 8.0, с последующим центрифугированием при 12000g в течение 20 минут при 4°С и диализом против 50мМ трис-HCI, pH 8.0 буфера в течение 12ч при 4°С.

Дрожжевые клетки осаждали и отмывали водой К осадку добавляли равный объем Glass beans 425-600 микрон ("Sigma", USA) и 200-400 мкл 50мМ трис-HCI буфера, pH 8 0 Белковые лизаты получали разрушением дрожжевых клеток при помощи дезинтегратора (В Braun Melsungen, Germany) в течение 90с, с последующим центрифугированием при 12000 g в течение 30 мин при 4°С

Активность лихеназы определяли методом восстанавливающих

Сахаров, освобождающихся из субстрата (лихенан), согласно Wood & Bhat (1988), с модификациями. За единицу активности принимали количество фермента, образующее 1 мкмоль восстанавливающих Сахаров (как эквивалент глюкозы) за 1 мин. Удельную активность рассчитывали на суммарное количество белка, с учетом денситометрирования.

Метод энзимограмм. Активность определяли по модифицированному нами методу Schwarz et al (1987) Энзимограммы получали окрашиванием геля 0,5% раствором Конго красного после разделения белков в 12% или в градиентном 8-16% ПААГ в присутствии ДСН, содержащем лихенан (0,1%) На месте активного белка обнаруживается просветленная область, так как краситель связывается только с негидролизованным лихенаном.

Метод чашечного теста проводили согласно Teacher&Wood (1982).

Определение pH оптимума ферментов проводили в цитратно-фосфатной (pH 3,7-7,9), трис-HCI (pH 7,1-8,9) и в глицин-NaOH (pH 7,6-11,2) буферных системах.

Количество белка в препаратах определяли по методу Bradford (1976), используя Bio-Rad Dye реагент ("BioRad", USA) и БСА ("Sigma", USA) для построения калибровочной кривой

Электрофорез препаратов белков проводили по методу Laemmli (1970) в денатурирующих условиях в ПЛАГ

Вестерн блоттинг Белковые экстракты подвергали электрофорезу в 12% ПААГ с ДСН Белковые полосы без фиксации переносили на нитроцеллюлозную мембрану Искомые белки выявляли иммунохимически с помощью поликлональных кроличьих антител к СгуЗа белку с последующей инкубацией с овечьими антителами против IgG кролика, конъюгированными с пероксидазой хрена.

Активность ß-глкжуронидазы (GUS) определяли по методу Джефферсона с соавт. [FahnestockS R Etal, 1997], используя п-нигрофеюл-Р-О-глюкуронид в качестве субстрата (1 мМ; p-NPG; "Sigma" N-1627, USA) Реакцию проводили при 37°С и продукт гидролиза, 4-«ерт-нитрофенол (p-NP), определяли спектрофотометрически при 415 нм.

Флуоресценцию EGFP определяли с помощью

спектрофлюориметра Сагу Eclipse (Varían В V , Австралия)

Определение способности белков связывать оц-ДНК (одноцепочечную ДНК). К оц-ДНК фага X добавляли АТР, ацетат Mg и белковый лизат. Полученную смесь инкубировали в течение 40 мин при температуре 37°С и затем добавляли S1 нуклеазу. Реакцию гидролиза проводили в течение 40 мин при 37°С Образцы анализировали методом электрофореза в агарозном геле

3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ 3.1. Термостабильная лихеназа как транскрипционный репортер в оригинальной дрожжевой векторной системе для изучения регуляторных функций некодирующих последовательностей геномов эукариот

Для изучения функциональной значимости некодирующих последовательностей геномов исследователи часто используют методологию репортерных систем Для проведения таких исследований нами разработана оригинальная дрожжевая векторная система, содержащая два противоположно ориентированных репортерных гена. В качестве репортеров были выбраны термостабильная лихеназа и В-глюкуронидаза, поскольку для этих систем разработаны быстрые и простые методы определения активности, сравнимые по чувствительности В качестве модельной некодирующей последовательности использован фрагмент последовательности LTR HERV-K 22-19 области 7р22 хромосомы человека, так как LTR-последовательности потенциально могут содержать набор регуляторных элементов. Поскольку последовательность LTR является частью эукариотического генома, то для изучения ее промоюрной активности были использованы клетки низших эукариот - S cerevisiae Первоначально были созданы векторные конструкции pLTRf-/icBM2 и pLTRr-//сВМ2 для трансформации клеток дрожжей, которые содержат фрагмент последовательности LTR 22-19 в прямой и обратной ориентации по отношению к рспортерному гену лихеназы, соответственно (рис. 1).

р1.ТМ-/1сВМ2:

рЬТЯг-//сВМ2: р-//сВМ2:

LTR

//сВМ2

!.ТЯ

/1СВМ2

//сВМ2

Рис. 1. Схема дрожжевых экспресснонных векторов: р1ЛТМ-й'сВМ2, рЬТ11г-/|'сВМ2 и р-/¿сВМ2- обозначения плазмил; йсВМ2 - последовательность гена лихеназы. ЬТИ -последовательность длинного концевого повтора НЕКУ-К.

Анализ экспрессии репортерного гена лихеназы в соответствующих дрожжевых трансформантах показал, что последовательность ЬТИ 22-19 управляет экспрессией репортера, находясь как в прямой, так и обратной ориентации по отношению к нему При этом промоторные активности ЬТЯ 22-19 в прямой и обратной ориентации сравнимы (данные в автореферате не приводятся).

Поскольку ЬТЯ 22-19 инициирует транскрипцию, находясь как в прямой, так и в обратной ориентации относительно репортерного гена, возникает вопрос может ли эта последовательность управлять транскрипцией репортных генов в двух направлениях одновременно? Для ответа на этот вопрос мы сконструировали дрожжевые векторные конструкции р-£тм-ЬТН.Г-/гсВМ2 и р-£гм-ЬТ11г-/;сВМ2 (рис 2).

р-де-ЬТЯМ/свМг: див ия \ А/СВМ2

р-диБ-1ТЯг-ПсВМ2: див / /1СВМ2

р-ди5-//сВМ2: див //сВМ2

Рис. 2. Схема дрожжевых экспресснонных векторов: р-^ш-ЬТШ-йсВШ, р-вих-ЬТИг-//еВМ2 и р-£1М-//сВМ2~ обозначения плазмид; Л'сВМ2, gus - последовательности генов лихеназы и р-глюкуронндазы. ЬТИ - фрагмент последовательности длинного концевого повтора НЕИУ-К.

Эти системы содержат два противоположно ориентированных репортерных гена, экспрессия которых управляется фрагментом последовательности ЬТИ Об участии 1ЛП 22-19 в регуляции экспрессии репортерных генов судили по активности репортерных белков (табл 1) Как видно из представленных результатов, активности как лихеназьг, так и В-глюкуронидазы практически одинаковы в дрожжевых трансформантах.

Таблица 1. Активность лихеназы (ЫсВМ2) и (3-глюкуронидазы (СГЯ) в экстрактах, полученных из клеток дрожжей 5. сетЫае, трансформированных соответствующими экспрессиоииыми векторами. __

Используемые векторные Относительная Относительная

конструкции активность лихеназы, активность Р-

% глкжуронидазы, %

р-^-ьтемсВмг 100+11 95+15

р-£И5-ЬТКг-//сВМ2 83+11 100± 15

р-£!«-/гсВМ2 0 0

Наши результаты продемонстрировали, что ЫИ, как промотор, не является специфичным только для клеток человека и обладает промоторной активностью в клетках низших эукариотов - дрожжах Таким образом, для изучения регуляторных функций некодирующих последовательностей нами разработана оригинальная дрожжевая векторная система, которая содержи 1 два противоположно ориентированных репортерных гена. Эта система обладает рядом преимуществ, поскольку позволяет одновременно получить ответ на ряд вопросов о регуляторных функциях изучаемой последовательности, а именно, определить, обладает ли она промоторной активностью, сравнимы ли уровни промоторной активности в зависимости от ориентации последовательности к рспортерным генам, способна ли управлять экспрессией двух репортеров одновременно Помимо этого, разработанная нами векторная система позволяет получать данные о регуляторных функциях некодирующих последовательностей с использованием простых, быстрых, чувствительных качественных и количественных методов, которые не требуют дорогостоящего оборудования и реактивов, а также значительных временных затрат исследователя

3.2. Термостабильная лихеназа как трансляционный репортер

Ранее было показано, что лихеназа сохраняет активность и термостабильность при значительных достройках в К- и С- концевых областях (Голденкова, 2002). Эти результаты позволили предложить термостабильную лихеназу в качестве удобного трансляционного репортера.

1 2

105

• ЛГ- Г*/ ■

ч/ ' " %*р

\ 'й

► т

W:-

Рис. 3. Эичимограмма (а) и Вестерн-блотгинг (б) бактериальных белковых .iinaroR. М -маркер Ми. я: I - LicBM2; 2 - Cry3a-LicBM2; 3- контроль (рЕТ32). б: I - СгуЗа; 2 - СгуЗа-LicBM2.

Для проверки данного предположения были получены конструкции, в которых последовательность лихеназы была слита в рамки считывания с последовательностями сгуЗа и егуЗаМ В thuringiensis, а также reck и reckI Е coli Методом энзимограмм была установлено, что молекулярная масса гибридных белков, соответствует теоретической рассчитанной для гибридного белка СгуЗа-LicBM2 - 105 кДа (рис. За), для RecA-LicBM2 и RecAl-LicBM2 - 67 кДа (рис 4а,б) Для сравнения приведены результаты Вестерн-блоттинга, на котором показаны СгуЗа и Cry3a-LicBM2 белки (рис 36) Кроме этого, показано, что RecA в составе гибридного белка сохраняет свое свойство связываться с одноцепочечной ДНК (рис. 4в).

М 1 2 3 4 5 1 2 3 1234 5 6 7

Рис. 4. Электрофореграмма (а,в) н эизимограмма (б) бактериальных белковых лизатов. М - маркер Мм. а: 1 - ВЬ21(ОЕЗ); 2 - КесА; 3 - КесА!; 4 - КесА-1лсВМ2; 5 - ЯесА1-1ЛсВМ2; б: 1 - ЯесА-исВШ; 2- КесА1-1ЛсВМ2, 3 - Ь'юВМ2. в: способность белковых экстрактов, полученных из трансформантов Е.соП, защищать одноцепочечиую ДНК от вЬнуклеазы. 1 - оцДНК; 2 - оцДНК + в!; 3 - оцДНК + ВЬ21(ОЕЗ) + 4 - оцДНК + ИесА + 81; 5 - оцДНК + КесА1 + 6 - оцДНК + НесА-ЬкВМ2 + 7- оцДНК + КесА1-ЫсВМ2

Полученные результаты по изучению экспрессии гибридных генов, содержащих репортерный ген термостабильной лихеназы, в клетках про- и эукариот позволяют заключить, что присутствие лихеназы в составе гибридных белков облегчает анализ их экспрессии в трансгенных организмах. Метод энзимограмм позволяет точно определять молекулярные массы гибридных белков, в состав которых входит лихеназа.

3.3 Термостабильная лихеназа как репортерный белок-носитель для случайных и антигенных пептидов

На основании трехмерной структуры молекулы и основных свойств термостабильной лихеназы С ЛегтосеИит (высокой удельной активности и термостабильности) была выдвинута гипотеза, что этот белок может использоваться в качестве удобного репортерного белка-носителя для случайных и антигенных пептидов, а именно:

1 молекула лихеназы имеет на своей поверхности неструктурированные участки, в которые возможны достройки последовательностей случайных или антигенных пептидов, без потери основных свойств фермента;

2. по активности фермента можно судить о концентрации белка или о его сохранности;

3. свойство термостабильности может использоваться при очистке рекомбинантных белков.

Для того, чтобы использовать лихеиазу как репортерный белок-носитель, методом молекулярного клонирования был получен делеционный вариант гена, кодирующий только каталитический модуль нативной лихеназы и обозначенный нами 1лсВМЗ. Следует отметить, что УсВМЗ сохраняет основные свойства (активность и термостабильность) нативного фермента, имеет меньшую молекулярную массу (25 кДа) и более высокий уровень экспрессии в клетках Е.соИ, в экспрессионной системе векторов рОЕ примерно в 2,5-3 раза (данные в автореферате не приводятся).

Для того, чтобы выбрать в молекуле лихеназы районы, в которые могли бы проводится достройки последовательностей случайных и антигенных пептидов без потери ферментом основных свойств, мы проанализировали предположительную трехмерную структуру (http://www.expasy.org/swissmod/SWISS-MODEL.html) молекулы лихеназы. Анализ позволил выделить на ее поверхности несколько петлевых структур, три из которых, в области 53, 99 и 141 а о , были использованы в дальнейших исследованиях. Кроме того, в качестве дополнительного контроля для работы была использована область р-структуры, между каталитическими а о. (условное название 106) (рис. 5). В качестве экспериментального подхода мы применили стратегию конструирования белков с циклическими перестановками («циклически перестановленные» белки) «Циклически перестановленные» белки это белковые молекулы, у которых и С-концы нативной молекулы соединены линкером, а новые концы создаются в той позиции, которая интересует исследователя. В большинстве случаев вновь созданные концы белковой молекулы располагаются в поверхностных петлях.

N-конец

Каталитические а.о.

С-конец

Рис. 5. Предположительная 3D структура белковой молекулы LicBM3 (по данным http://wiim.exDasv.ore/swisgmod/SWISS-MODEL.htnil). Цифрами показано положение соответствующего а.о. в области петли или ß-структуры.

Методами молекулярного клонирования были получены гены, кодирующие четыре «циклически перестановленных» и четыре модифицированных варианта лихеназы (LicBM3) (рис 6). Модификация заключалась в том, что на уровне ДНК в последовательность гена лихеназы вводился сайт рестрикции, который на уровне белка реализовывался в два дополнительных а.о. Эти два добавленных а о. служили прототипом последовательности случайного или антигенного пептида

Первоначально методом чашечного теста была выявлена лихеназная активность у пяти вариантов CN53, NC53, CN99, NC99 и NC141 (данные в автореферате не приводятся)

Методом электрофореза в ПААГе доказано, что в клетках Е coli происходит синтез белковых продуктов молекулярная масса которых соответствует теоретически рассчитанной для всех вариантов (рис 7а,б) Кроме юю, методом энзимограмм, показано, что четыре варианта сохранили лихеназную активность в геле Отсутствие активности у пятого варианта NC 141, возможно, объясняется его неспособностью ренатуриовать до активной формы в геле после ПААГ -электрофореза в присутствии ДНС (рис. 76)

нативиый LicBM3

«циклически перестановленные» варианты модифицированные варианты

CN53

NC53

CN99

CN106

»1

CN141

N L ** С

NC99

N h С

NC106

N *Мг С

NC141

N ** 1 С

Рис. 6. Схема «циклически перестановленных» н модифицированных вариантов белка ЫсВМЗ. ЫсВМЗ, N0141, €N141, N0106, €N106, N€99, €N99, N€53 и €N53 - обозначение соответствующих вариантов. Звездочками отмечено положение каталитических а.о. Серым цветом показаны места, по которым проводилась модификация с добавлением двух а.о.

М 12345 6789 10 М 123 45 6789 10 118' " . 732

ья- --чвй-^У Tt ** ШЯШя

а* Ш £

WWwmWmm' "WW м

111- S fciffifi

зз 2f 2(

Рнс. 7. Элестрофореграмма (а) и энзимограмма (б) бактериальных белковых лнзатов. М - маркер Мм, 1 - LicBM2,2 - CN53,3- NC53,4 - CN99, 5 - NC99,6 - CN106,7 - NCI Об, 8 -CN141,9 - NC141 и 10 - отриц. контроль.

Для того чтобы проверить, повлияла ли модификация фермента на его основные свойства, было проведено сравнительное изучение удельной активности, температурного оптимума, рН-оптимума и термостабильности пяти вариантов фермента, у которых сохранился уровень активности, достаточный для проведения исследований (табл 2).

Таблица 2. Сравнительный анализ основных биохимических свойств «циклически перестановленных» и модифицированные вариантов лихеназы.

Удельная активность, % Торг, °с рНор! Термостабильность за 4ч, %

Т=65°С Т=75°С

УсВМ2 100 ±3 70 8,0 86 ±5 66 ±3

1лсВМЗ 107 ±4 70 8,0 80 ±5 68 ±4

СЫ53 66 ±3 70 8,0 79 ±3 0

Ж!53 66 ±3 70 8,0 86 ±4 29 ±5

СШ9 1,2 ±0,1 70 8,0 77 ±5 0

ЫС99 15 ± 1 70 8,0 81 ±5 49 ±5

СШ06 - - - - -

N006 - - - - -

СШ41 0,1 - - - -

N041 1,1 ±0,1 70 8,0 74 ±7 0

Сравнительный анализ показал, что удельная активность во всех образцах уменьшилась: для вариантов с модификацией петли в области 53 а.о. не существенно, примерно в 1,5 раза; для вариантов с модификаций петли в области 99 а о. в 7 и 80 раз, соответственно для модифицированного и «циклически перестановленного» варианта; и более существенно для вариантов с модификацией петли в области 141 а.о (более чем 90 раз). Температурный и рН оптимумы не изменились ни для одного из вариантов и составили 70°С и 8 ед., соответственно. Все варианты при температуре 65°С остаются термостабильными (на 80%) в

течение длительного времени (4ч). При 75°С термостабильными (на 30-50%) остаются только два модифицированных варианта: NC53 и NC99.

Таким образом, сравнительный биохимический анализ основных свийив модифицированных и «циклически перестановленных» вариантов лихеназы позволил установить, что области

1 в районе 53 а о в большей степени важны для термостабильности и в меньшей степени для активность фермента,

2 в районе 99 а о в большей степени важны для активности, чем для термостабильности фермента,

3 в районе 141 а о являются критическими как для проявления активности, так и для термостабильности фермента,

4 в районе 106 а о (ß-структура) необходимы для активности фермента, модификации в них нежелательны,

5. полученные результаты по «циклически перестановленным» и модифицированным вариантам ферментов подтвердили, что трехмерная структура молекулы лихеназы, полученная нами с сайта

http://www.expasv.org/swissrnod/SWlSS-MODHI. html, является достаточно точной и корректной.

Основываясь на полученных результатах, нами выдвинута гипотеза, что лихеназа может выдерживать более существенные достройки В качестве модели случайного пептида использовался зеленый флуоресцентный белок - EGFP. На рис 8 приведена схема полученных гибридных белков на основе «циклически перестановленных» и модифицированных вариантов LicBM3 и нативного EGFP * (последовательность EGFP для удобства обозначена В). Гибридные варианты

получали за счет интеграции последовательности egfp на уровне ДНК в «циклически перестановленные» и модифицированные варианты лихеназы, сохранившие термостабильность и активность.

Первоначально методом чашечного теста выявлена активность у четырех гибридных вариантов- CBN53, NBC53, CBN99 и NBC99 (данные в автореферате не приводятся).

Гибридные белки на основе Гибридные белки на основе

«циклически перестановленных» ваоиантов

модифицированных вариантов

СВ№3

ЕвРР

СРМ99.

К С | | N

ЫВСБЗ

■ ЕСРР | а С

N8099

N 1 ЕСРР 1* С

N80141

N ** | ЕСРР с

Рис. 8. Схема гибридных белков на основе лихеназы и ЕСП\ N80141, N8099, CBN99, N8053 и СВ^З - обозначение соответствующих вариантов. Звездочками отмечено положение каталитических а.о. Серым цветом показаны места, по которым проводилась модификация с добавлением двух а.о.

Рис. 9. Электрофореграмма (а) и энзимограмма (б) белковых лизатов, полученных из Е. сои-, а: М - маркер мол. масс, 1 - С^З, 2 - СВМЗ, 3 - N8053, 4 - СВГО9, 5 - N8099, 6 -N80141,7 - ЕСП» и 8 - отриц. контроль, б: 1 - СВШЗ, 2 - N8053,3 - CBN99,4 - N8099,5 -N80141,6 - ЕСП1,7 - СМЗ и 8 - отриц. контроль.

Методом электрофореграмм и энзимограмм показано, что, в клетках Е coli происходит синтез гибридных белков, молекулярная масса которых в целом соответствует теоретически рассчитанной (рис. 9)

Для того чтобы проверить, оказывает ли влияние на основные свойства лихеназы инсерция последовательности EGFP, проведено сравнительное изучение удельной активности и 1ермостабильности четырех гибридных белков (табл 3). Результаты анализа показывают, что в целом данные коррелируют с данными, которые были получены при анализе «циклически перестановленных» и модифицированных вариантов, а именно- варианты с модификацией (инсерциия EGFP) в области 53 а о. сохранили достаточно высокий уровень активности, а варианты с модификацией в области 99 а.о. сохранили достаточно высокий уровень термостабильности. Инсерция EGFP в петлю в области 141 а о. привела к полной потере лихеназной активности.

Таблица 3. Сравнительный анализ основных биохимических свойств гибридных вариантов белка.

Удельная Термостабильность за Зч, %

активность, % Т=50°С Т=60°С Т=70°С

CBN53 80 ±6 47 ±3 32 ±3 0

NBC53 100 ±8 89 ±5 46 ±3 0

CBN99 1,9 ± 0,1 74 ±6 70-t3 13 ± 2

NBC99 1,8 ± 0,2 82 ±4 74 ±7 25 ±2

NBC141 - - - -

Поскольку важно, чтобы случайные (в данном случае ЕОРР) или антигенные пептиды также сохраняли правильную конформацию в составе гибридных белков, мы измерили флуоресценцию ЕОРР в белковых лизатах. Во всех вариантах была обнаружена флуоресценция ЕОРР Небольшое отклонение наблюдалось лишь в

случае варианта N80141, где уровень флуоресценции был слабо выражен (данные в автореферате не приводятся).

Таким образом, два модифицированных (N053 и N099) и два «циклически перестановленных» (€N53 и €N99) варианта лихеназы могут выдерживать значительные внутренние достройки и предлагаются в качестве репортерных белков-носителей для случайных и антигенных пептидов.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Таким образом, представленные результаты исследований позволяют заключить, что лихеназа может использоваться как в фундаментальных исследованиях, в качестве транскрипционного и трансляционного репортера, так в прикладных исследованиях, в качестве репортерного белка-носителя для случайных и антигенных пептидов.

Для изучения регуляторных функций некодирующих последовательностей разработана оригинальная дрожжевая векторная система, которая содержит два противоположно ориентированных репортерных гена. Эта система обладает рядом преимуществ, поскольку позволяет одновременно получить ответ на ряд вопросов о регуляторных функциях изучаемой последовательности, а именно, определить, обладает ли она промоторной активностью, сравнимы ли уровни промоторной активности в зависимости от ориентации последовательности к репортерным генам, способна ли управлять экспрессией двух репортеров одновременно. Помимо этого, разработанная нами векторная система позволяет получать данные о регуляторных функциях некодирующих последовательностей с использованием простых, быстрых, чувствительных качественных и количественных методов, которые не требуют дорогостоящего оборудования и реактивов, а также значительных временных затрат исследователя.

определять молекулярные массы гибридных белков, в состав которых входит лихеназа Следует отметить высокую чувствительность этого метода, он позволяет выявить активность лихеназы в гибридных белках при использовании образцов с суммарным содержанием белка от 300 до 600 нг, по сравнению с методом Вестерн-блоттинга, для которого необходимо использовать от 5 до 20 мкг суммарного белка и специфические антитела к исследуемому белку. Метод энзимограмм предлагается вместо Вестерн-блоттинга при использовании лихеназы в качестве трансляционного репортерного белка.

Термостабильная лихеназа может использоваться как репортерный белок-носитель при создании вакцин, поскольку выдерживает значительные внутренние достройки с сохранением основных свойств фермента: активности и термостабильности. Важно отметить, что в гибридых белках сохраняется достаточный уровень термостабильности, что может быть использовано для очистки рекомбинантных белков

выводы

1. Термостабильная лихеназа успешно использована как транскрипционный репортер в составе оригинальной дрожжевой векторной системы для изучения регуляторных функций некодирующих последовательностей генома эукариот.

2. Сравнительный анализ экспрессии сконструированных гибридных генов, в которых последовательность гена лихеназы слита в рамки считывания с последовательностями бактериальных генов сгуЗа и сгуЗаМ В thuringiensis, а также reck и recA\ Еcoli, показал, что термостабильная лихеназа может быть использована в качестве трансляционного репортерного белка, поскольку в составе гибридных белков как лихеназа, так и слитые с ней белки (Cry За и RecA) сохраняют свои свойства, и присутствие лихеназы в составе гибридных белков облегчает анализ их экспрессии в трансгенных организмах

3 Делеционный вариант термостабильной лихеназы (LicBM3) сохраняет основные биохимические свойства нативного фермента (температурный и pH оптимумы, стабильность, активность).

4 Сравнительный биохимический анализ основных свойств четырех модифицированных и четырех «циклически перестановленных» вариантов лихеназы позволил установить, что область в районе 53 а о в большей степени важна для термостабильности и в меньшей степени для активности фермента, область в районе 99 а о в большей степени важна для активности, чем термостабильности лихеназы, область в районе 141 а о является критической как для проявления активности, так и для термостабильности фермента, а область в районе 106 а о (ß-структура) необходима для активности фермента

5 Показано, что два модифицированных и два «циклически перестановленных» варианта лихеназы могут выдерживать значительные внутренние достройки с сохранением основных свойств фермента: активности и термостабильности. На основании этих свойств термостабильная лихеназа предлагается в качестве удобного репортерного белка-носителя для случайных и антигенных пептидов

ПУБЛИКАЦИИ ПО МАТЕРИАЛАМ РАБОТЫ

1. Р. А Комахин, И А. Авдеева, ГР Салехи Джузани, ИВ Голденкова, А А Жученко. Термостабильная лихеназа как трансляционный репортер. Генетика. 2005. Т. 41, №1. с. 31-39.

2. Г.Р Салехи Джузани, Р.А Комахин, Э С Пирузян. Сравнительный анализ экспрессии нативного и модифицированного генов сгуЗа Bacillus thuringiensis в прокариотических и эукариотических клетках. Генетика 2005. Т. 41, №2. с 171177.

3. Голденкова И.В., Мусийчук К.А., Комахин Р.А, Абдеев P.M. Новые репортерные системы, основанные на термостабильности лихеназы Clostridium thermocellum, для растений В сборнике материалов V съезда Общества физиологов растений России и Международной конференции «Физиология растений - основа фитобиотехнологии». Пенза, 2003, с. 484485.

4. Р.А. Комахин, И.А. Авдеева, Н.Ю. Ковальская, И.В. Голденкова. Термостабильная лихеназа - удобная репортерная система для разработки методов трансформации различных видов растений. В сборнике материалов Международной конференции «Клеточные ядра и пластиды: биохимия и биотехнология». Минск. 2004. с. 145-150.

5. Р.А. Комахин, К А. Мусийчук, С.А. Брускин, Н.В. Ковальская, Д.В. Сотченков, И.В. Голденкова. Термостабильная лихеназа Clostridium thermocellum -новый транскрипционный и трансляционный репортерный белок для про- и эукариотических организмов. В сборнике материалов III Съезда генетиков и селекционеров России. «Генетика в XXI веке: современное состояние и перспективы развития». Москва. 2004. T.I с. 335.

6. Р.А. Комахин, И В. Голденкова Создание векторных конструкций, несущих нативный и гибридный бактериальный ген гесА, для индукции генетической изменчивости растений. В сборнике материалов III Съезда генетиков и селекционеров России. «Генетика в XXI веке' современное состояние и перспективы развития». Москва. 2004. T.I. с. 489.

7. Э С Пирузян, P.M. Абдеев, И.В. Голденкова, К.А Мусийчук, Р.А. Комахин, И.А Абдеева. Конструирование трансгенных растений как методология

функциональной геномики. В сборнике материалов III Съезда генетиков и селекционеров России «Генетика в XXI веке' современное состояние и перспективы развития». Москва 2004. T.I. с. 478.

8. Р А. Комахин, И.В. Голденкова. Термостабильная лихеназа Clostridium thermocellum для фундаментальных и прикладных исследований. В сборнике материалов Международной научной конференции «Молекулярная генетика, геномика и биотехнология». Минск. 2004. с. 333-335.

Напечатано с готового оригинал-макета

Издательство ООО "МАКС Пресс" Лицензия ИД N 00510 от 01.12.99 г. Подписано к печати 24 02 2005 г. Формат 60x90 1/16. Усл.печ л 1,5. Тираж 100 экз. Заказ 081. Тел. 939-3890. Тел./факс 939-3891. 119992, ГСП-2, Москва. Ленинские горы, МГУ им. М.В Ломоносова, 2-й учебный корпус, 627 к

р-45 Об

РНБ Русский фонд

2006-4 10453

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Комахин, Роман Александрович

ГЛАВА 1. ТЕРМОСТАБИЛЬНАЯ ЛИХЕНАЗА Clostridium thermocellum КАК ПРЕДСТАВИТЕЛЬ БАКТЕРИАЛЬНЫХ ГЛИКОЗИЛГИДРОЛАЗ:

СВОЙСТВА И СТРУКТУРА.

ГЛАВА 2. ГЛИКОЗИЛГИДРОЛАЗЫ В ФУНДАМЕНТАЛЬНЫХ И ПРИКЛАДНЫХ ИССЛЕДОВАНИЯХ.

2.1. Современные направления белковой инженерии: рациональный дизайн и направленная эволюция ферментов и белков.

2.2. Изучение молекулярных основ термостабильности и фолдинга белков с использованием ферментов термофильных организмов.

2.3. Термостабильные гликозилгидролазы в прикладных исследованиях.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Термостабильная лихеназа Clostridium thermocellum для фундаментальных и прикладных исследований"

Впервые термофильная анаэробная бактерия Clostridium thermocellum была описана Viljoen в 1926 году [МсВЕЕ, 1954]. С. thermocellum секретирует белки, объединяющиеся в высокомолекулярные мультиферментные комплексы, структура которых способствует быстрому гидролизу кристаллической целлюлозы.

Изучением ферментов целлюлолитического комплекса С. thermocellum занимаются во многих странах мира: В Израиле в Вейцмановском институте и в Биотехнологическом центре Тель-Авивского Университета, во Франции в Институте им. Пастера, в Германии в Институте Микробиологии Мюнхенского технологического университета, в Англии в Институте животноводства (Кембридж). В России эти работы были начаты в начале 80-х годов под руководством профессора Э.С. Пирузян со штаммом Ф7 С. thermocellum и далее продолжены в лаборатории молекулярной генетики анаэробов в Институте молекулярной генетики РАН и в лаборатории функциональной геномики Института общей генетики РАН [Пирузян и др., 1985; Пирузян и др., 1990; Bumazkin В.К. et al., 1990; Tuka et al., 1992; Голденкова, 2002].

Актуальность темы диссертационной работы. В последние годы уделяется много внимания использованию термостабильных ферментов, особенно гликозилгидролаз, в биотехнологии. Помимо этого, гликозилгидролазы термофильных бактерий являются удобными моделями и для изучения многих фундаментальных проблем: молекулярных основ термостабильности, укладки (фолдинга) белковых молекул, функциональных элементов каталитических и некаталитических модулей ферментов и ряда других. Ранее в нашей лаборатории был клонирован ген, кодирующий термостабильную 0-1,3; 1,4-глюканазу (лихеназу) С. thermocellum, и было показано, что ген термостабильной лихеназы является удобным репортерным геном для клеток про- и эукариотических организмов. Ген термостабильной лихеназы транзиентно и стабильно экспрессируется в клетках бактерий, цианобактерий, дрожжей, растений и млекопитающих с образованием активного и термостабильного фермента, а уровень экспрессии бактериального гена лихеназы зависит от регуляторного элемента, контролирующего его экспрессию. Активность термостабильной лихеназы может быть определена простыми, быстрыми, чувствительными качественными и количественными методами, которые не требуют дорогостоящего оборудования и реактивов.

Цель исследования: изучить возможности использования гена термостабильной лихеназы в качестве транскрипционного, трансляционного репортера и репортерного белка-носителя случайных или антигенных пептидов. Исходя из цели работы, были поставлены следующие задачи:

Изучить возможность использования гена термостабильной лихеназы в качестве транскрипционного репортера для изучения функциональной значимости некодирующих последовательностей геномов, для этого:

- разработать дрожжевую векторную конструкцию, содержащую два противоположно ориентированных репортерных гена (термостабильной лихеназы и p-глюкуронидазы) и некодирующую последовательность генома человека (LTR HERV-K);

- изучить экспрессию репортерных генов, находящихся под контролем LTR HERV-K, в клетках низших эукариот - дрожжах Saccharomyces cerevisiae. Изучить возможность использования термостабильной лихеназы в качестве трансляционного репортерного белка для клеток про- и эукариот, для этого:

- сконструировать гибридные гены, в которых последовательность гена лихеназы слита в рамки считывания с последовательностями бактериальных генов сгуЪг. и сгуЪъМ Bacillus thuringiensis, а также гесА и гесРЛ E.coli;

- провести сравнительный анализ экспрессии нативных и гибридных генов в клетках про- и эукариот.

Изучить возможность использования термостабильной лихеназы в качестве репортерного белка-носителя случайных и антигенных пептидов, для этого:

- провести анализ трехмерной структуры термостабильной лихеназы и выбрать в молекуле лихеназы петлевые участки, которые могли бы использоваться для интеграции последовательностей пептидов;

- провести молекулярный дизайн последовательности гена термостабильной лихеназы, на основе которого сконструировать модифицированные варианты фермента, у которых в области петлевых участков добавлен линкер, и «циклически перестановленные» варианты, у которых С- и N-концевые области нативного фермента соединены линкером, а новые С- и N-концевые участки сформированы в петлевых участках; провести сравнительный анализ биохимических свойств модифицированных и «циклически перестановленных» вариантов лихеназы; сконструировать гибридные гены, в которых последовательность, кодирующая случайный пептид (EGFP), встроена в последовательности модифицированных и «циклически перестановленных» вариантов лихеназы как внутренний гетерологичный модуль фермента; провести сравнительный анализ биохимических свойств гибридных белков.

Заключение Диссертация по теме "Молекулярная биология", Комахин, Роман Александрович

выводы

2. Сравнительный анализ экспрессии сконструированных гибридных генов, в которых последовательность гена лихеназы слита в рамки считывания с последовательностями бактериальных генов сгуЗа и сгуЪгМ В. thuringiensis, а также reck и recA\ E.coli, показал, что термостабильная лихеназа может быть использована в качестве трансляционного репортерного белка, поскольку в составе гибридных белков как лихеназа, так и слитые с ней белки (Cry За и RecA) сохраняют свои свойства, и присутствие лихеназы в составе гибридных белков облегчает анализ их экспрессии в трансгенных организмах.

3. Делеционный вариант термостабильной лихеназы (LicBM3) сохраняет основные биохимические свойства нативного фермента (температурный и рН оптимумы, стабильность, активность).

4. Сравнительный биохимический анализ основных свойств четырех модифицированных и четырех «циклически перестановленных» вариантов лихеназы позволил установить, что область в районе 53 а.о. в большей степени важна для термостабильности и в меньшей степени для активности фермента, область в районе 99 а.о. в большей степени важна для активности, чем термостабильности лихеназы, область в районе 141 а.о. является критической как для проявления активности, так и для термостабильности фермента, а область в районе 106 а.о. (^-структура) необходима для активности фермента.

5. Показано, что два модифицированных и два «циклически перестановленных» варианта лихеназы могут выдерживать значительные внутренние достройки с сохранением основных свойств фермента: активности и термостабильности. На основании этих свойств термостабильная лихеназа предлагается в качестве удобного репортерного белка-носителя для случайных и антигенных пептидов.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Полученные результаты по изучению экспрессии гибридных генов, содержащих репортерный ген термостабильной лихеназы, позволяют заключить, что присутствие лихеназы в составе гибридных белков облегчает анализ их экспрессии в трансгенных организмах. Метод энзимограмм позволяет точно определять молекулярные массы гибридных белков, в состав которых входит лихеназа. Следует отметить высокую чувствительность этого метода: он позволяет выявить активность лихеназы в гибридных белках при использовании образцов с суммарным содержанием белка от 300 до 600 нг, по сравнению с методом Вестерн-блоттинга, для которого необходимо использовать от 5 до 20 мкг суммарного белка и специфические антитела к исследуемому белку. Метод энзимограмм предлагается вместо Вестерн-блоттинга при использовании лихеназы в качестве трансляционного репортерного белка.

Термостабильная лихеназа может использоваться как репортерный белок-носитель, поскольку выдерживает значительные внутренние достройки с сохранением основных свойств фермента: активности и термостабильности.

По активности фермента можно судить о его сохранности. Достаточный уровень термостабильности может быть использован для очистки рекомбинантных белков.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Комахин, Роман Александрович, Москва

1. Голденкова И.В. (2002) Репортерные системы: возможности для изучения различных аспектов регуляции экспрессии генов.// Успехи современной биологии.- Т. 122(6).- С.515-526.

2. Голденкова И.В. (2002а) Новые репортерные систему для изучения регуляции экспрессии генов// Дисс. док. биол. наук. ИОГен РАН. Москва.

3. Голденкова И.В., Мусийчук К.А., Пирузян Э.С. (2003) Бифункциональные репортерные гены: конструирование и экспрессия в клетка про- и эукариотП Молекулярная биология.- Т.37(2).- С. 1-9.

4. Евстратова В.В., Калиев А.Б., Андрианов В.М., Пирузян Э.С. (1988) Использование векторных плазмид Agrobacterium для переноса в растения генов делта-эндотоксина из Bacillus thuringiensis Н Вестник с.х. науки.-Т.384.- С.71-77.

5. Зверлов В.В. (1993) Изучение структуры гена лихеназы Clostridium thermocellum Ф7 и характеристика продукта данного гена.// Дисс. канд. биол. наук. ИМГ РАН, Москва.

6. Мусийчук К.А., И.В.Голденкова., P.M. Абдеев, Н.С. Кобец, Пирузян Э.С. (2000) Получение и свойства делеционных вариантов лихеназы Clostridium thermocellum и создание на их основе бифункциональных гибридных белков.// Биохимия.- Т.65(12).- С.1659-1665.

7. Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Д. (1984) Молекулярное клонирование, М., Мир.

8. Патрушев Л.И. Экспрессия генов (2000) М.: Наука. 527с.

9. Ю.Патрушев Л.И. Искусственные генетические системы (2004) М.: Наука.

10. Пирузян Э.С., Могутов М.А., Великодворская Г.А., Акименко В.К. (1985)

11. Клонирование и экспрессия структурного гена целлюлазы се17целлюлолитического комплекса Clostridium thermocellum в клетках Escherichia coli.il Докл. АН СССР.- Р.963-965.

12. Пирузян Э.С., Могутов М.А Великодворская Г.А., Зверлов В.В., Лаптев Д.А., Метт В.Л. (1990) Клонирование и некоторые свойства гена lihl, кодирующего новую эндоглюканазу Clostridium thermocellum Ф1Н Биотехнология.- N4.- С. 18-19.

13. Попов Е.М. Структура и функция белка. (2000) Т.4. М.: Наука.,

14. Салехи Джузани Г.Р., Комахин Р.А., Пирузян Э.С. (2005) Сравнительный анализ экспрессии нативного и модифицированного генов сгуЪг. Bacillus thuringiensis в прокариотических и эукариотических клетках.// Генетика. Т.41(2). С.171-177.

15. П.Свердлов Е.Д. (1999) Ретровирусные регуляторы экспрессии генов в геноме человека как возможные факторы его эволюции.// Биоорг. химия.-Т.25(11).- С.821-827.

16. Янике Р. (1998) Что можно узнать о стабилизации ультрастабильных глобулярных белков.//Биохомия.- Т.63,- С.370-380.

17. Aguilar C.F., Sanderson I., Moracci M. (1998) Crystal structure of the |3-glycosidase from the hyperthermophilic Archaeon Sulfolobus solfataricus: resilience as a key factor in thermostability// J. Mol. Biol.- V.271.- P.789-802.

18. Alam J., Cook J.L. (1990) Reporter genes: application to the study of mammalian gene transcription// Analytical Biochemestry.- VI88.- P.245-254.

19. Atassi M.Z., Lee C.L. (1978) The precise and entire antigenic structure of native lysozyme.// Biocheem. J.-V.171.- P.429.

20. Atassi M.Z., Saplin B.J. (1968) Immunochemistiy of sperm whale myoglobin: I. The specific interaction of some tiyptic peptides and of peptides containing all the reactive regions of the antigen.// Biochemistry- V.7.-P.688.

21. Atassi M.Z., Singhal R.P. (1970) Immunochemistry of sperm whole myoglobin: 8. Specific interaction of peptides obtained by cleavage at proline peptide bonds// Biochemistry- V.9.-P.3854.

22. Ay J., GO F., Borriss R., Heinemann U. (1998) Structure and function of the Bacillus hybrid enzyme GluXyn-l:Native-like jellyroll fold preserved after insertion of autonomous globular domain// Proc. Natl. Acad. Sci. USA.- V.95.-P.6613-6618.

23. Bamberger A.M., Erdmann I., Bamberger C.M., Jenatschke S.S., Schulte H.M. (1997) Transcriptional regulation of the human 'leukemia inhibitory factor' gene: modulation by glucocorticoids and estradiol.// Mol Cell Endocrinol.-V.127(l).- P.71-79.

24. Bayer E.A., Chanzy H.R., Lamed R., Shoham Y. (1998) Cellulose, Cellulases and Cellulosome.// Current Opinion in Structural Biology.- V.8.- P.548-557.

25. McBEE R.H. (1954) The characteristics of Clostridium thermocellum./I J Bacteriol.- V.67(4).- P.505-506.

26. Bradford M.M. (1976) A rapid sensitive method for the action of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding// Anal Biochem.- V.72.- P.248-254.

27. Вгактапп E.S., Johnsson K. Directed evolution of proteins, or how to improve enzymes for biocatalysis. (2002) N. Y.: Wiley.

28. Brandes C., Plautz J.D., Stanewsky R., Jamison C.F., Straume M., Wood K.V., Kay S.A., Hall J.C. (1996) Novel features of drosophila period transcription revealed by real-time luciferase reporting.// Neuron.-VЛ 6(4).- P.687-692.

29. Brauner-Osborne H., Brann M.R. (1996) Pharmacology of muscarinic acetylcholine receptor subtypes (ml-m5): high throughput assays in mammalian cells.// Eur J Pharmacol.- V.295(l).- P.93-102.

30. Bryant F.R. (1988) Construction of a recombinase-deficient mutant recA protein that retains single-stranded DNA-dependent ATPase activity.// J Biol Chem.- V.263(18).- P.8716-8723.

31. Brejc K.A., Sixma Т.К., Kitts P.A., Kain S.R., Tsein R.Y., Ormo M., Remington S.J. (1997) Structural basis for dual excidation and photoisomerization of the Aequorea victoria green fluorescent protein.// Proc. Natl. Acad. Sci. USA.- V.94.- P.2306-2311.

32. Bumazkin B.K., Velikodvorskaya G.A., Тика K., Mogutov M.A., Strongin A.Ya. (1990) Cloning of Clostridium thermocellum endoglucanase genes in Escherichia coli.ll Biochem Biophys Res Commun.AI. 167(3).- P. 1057-1064.

33. Burton J., Wood S.G., Pedyczak A. and Siemion I.Z. (1989) Conformation Preferences of Sequential Fragments of the Hinge Region of Human IgAl Immunoglobulin Molecule. II.// Biophis. Chem.- V.33.- P.39-45.

34. Bushuev V.N., Gudkov A.T., Liljas A. and Sepetov N.F. (1989) The Flexible Region of Protein L12 from Bacterial Ribosome Studied by Nuclear Magnetic Resonance.// J. Biol. Chem.- V.264.- P.4498-4505.

35. Chalfie M., Tu Y., Euskirchen G., Ward W.W., Prasher D.C. (1994) Green fluorescent protein as a marker for gene expression.// Science.- V.263(5148).-P.802-805.

36. Cody C.W., Prasher D.C., Westler W.M., Prendergast F.G., Ward W.W. (1993) Chemical structure of the hexapeptide chromophore of the Aequorea green-fluorescent protein.//-S/oc/jem/sfrj.- V.32.- P.1212-1218.

37. Crabb D.W., Dixon J.E. (1987) A method for increasing the sensitivity of chloramphenicol acetyltransferase assays in extracts of transfected cultured cells Л Anal. Biochem.- V.163(l).- P.88-92.

38. Craig F.F, Simmonds A.C., Watmore D., McCapra F., White M.R.H. (1991) Membrane permeable luciferin esters for assay of firefly luciferase in living eels.// Biochem. J.- V.276.- P.637-641.

39. Cubitt A.B., Heim R., Adams S.R., Boyd A.E., Gross L.A., Tsien R.Y. (1995) Understanding, improving and using green fluorescent proteins.// Trends Biochem. Sci.- V.20.- P.448-455.

40. Davies J.M. (2000) Introdaction: Epitope Mimicry as a Component of Autoimmune Disease// Cellular and Molecular Life Sciences- V.57.- P.523-526.

41. Domansky A.N., Kopantzev E.P., Snezhkov E.V., Lebedev Y.B., Leib-Mosch C., Sverdlov E.D. (2000) Solitary HERV К LTRs possess bi-directional promoter activity and contain a negative regulatory element in the U5 region.// FEBSLetters.- V.472.- P.191-195.

42. Endebrecht J., Silverman M. (1984) Identification of genes and gene products necessary for bacterial bioluminescence.// Proc. Natl. Acad. Sci. USA.-V.81(13).- P.4154-4158.

43. Eastman E.M., Durland R.H. (1998) Manufacturing and quality control of plasmid-based gene expression systems.// Adv Drug Deliv Rev.- V.30(13).-P.33-48.

44. Farris A.D., Keech C.L., Gordon T.P., McGluskey J. (2000) Epitope Mimics and Determinant Spreading: Pathways to Autoimmunity// Cellular and Molecular Life Sciences- V.57.- P.569-578.

45. Ferrari S., Moro E., Pettenazzo A., Behr J.P., Zacchello F., Scarpa M. (1997) ExGen 500 is an efficient vector for gene delivery to lung epithelial cells in vitro and in vivo.// Gene Ther.- V.4(10).- P. 1100-1106.

46. Ferreira L.M.A., Durrant A.J., Hall J., Hazlewood G.P. and Gilbert H.J. (1990) Spatial Separation of Protein Domains is not Necessary for Catalyc Activity or Substrate Binding in a XylanaseJI Biochem. J.- V.269.- P.261-264.

47. Fodor S.P., Read J.L., Pirrung M.C., Stryer L., Lu A.T., Solas D. (1991) Light-Directed, Spatially Adressable Parallel Chemical Synthesis// Science- V.251 .-P.767.

48. Fradkov A.F., Chen Y., Ding L., Barsova E.V., Matz M.V., Lukyanov S.A. (2000) Novel fluorescent protein from Discosoma coral and its mutants possesses aunique far-red fluorescence.// FEBS Lett-V.479(3).- P.127-130.

49. Frank R. (1992) SPOT Synthesis: an Easy Technique for the Positionally Addressable, Parallel Chemical Synthesis on a Membrane Support// Tetrahedron-V A&.~ P.9217.

50. Geysen H.M., Tainer J.A., Rodda S.J., Mason T.J, Alexander H., Getzoff E.D., Lerner R.A. (1987) Chemistry of Antibody Biding to a Protein// Science-V.235.- P.1184.

51. Geysen H.M., Rodda S.J., Mason T.J, Tainer J.A., Alexander H., Getzoff E.D., Lerner R.A. (1988) Antigenesity of Myohemeiythrin// Science-V.238.- P.1584.

52. Gordon T. (2000) Multipin Peptide Libraries for Antiboby and Receptor Epitope Screening and Characterization// J. Immunol. Methods- V.267.- 27-35.

53. Gorman C. (1985) DNA cloning II-A Practical Approach (Glover D.M., Ed.): 143-190.

54. Gurskaya N.G., Savitsky A.P., Yanushevich Y.G., Lukyanov S.A., Lukyanov K.A. (2001) Color transitions in coral's fluorescent proteins by site-directed mutagenesis.// BMCBiochem.- V.2(l).- P.6.

55. Le Grice S.F., Matzura H. (1980) Localisation of the transcription initiation site of the chloramphenicol resistance gene on plasmid pAC184.// FEBS Lett.-V.l 13(1).- P.42-46.

56. Guivarc'h A., Caissard J.C., Azmi A., Elmayan Т., Chriqui D., Tepfer M. (1996) In situ detection of expression of the gus reporter gene in transgenic plants: Ten years of blue genes.// Transgenic Research.- V.5.- P.281-288.

57. Hahn M., Pons J., Planas A., Querol E., Heinemarin U. (1995) Crystal Structure of Bacillus lichenoformis l,3;l,4-p-D-Glucan-4-Glucanohydrolase at 1.8 A Resolution.// FEBS Lett- V.374(2).- P.221-224.

58. Hahn M., Piotukh K., Borriss R., Heinemann U. (1994) Native-like in vivo folding of a circularly permuted jellyroll protein shown by crystal structure analysis.// Proc. Natl. Acad. Sci. USA.- V.91.- P. 10417-10421.

59. Hough D.W., Danson M.J. (1999) Extremozymes// Curr. Opin. Chem. Biol.-V.3.-P.39-46.

60. Houghten R.A., Pinilla C., Blondelle S.E., Appel J.R., Dooley C.T., Cuervo J.H. (1991) Generation and Use of Synthetic Peptide Combinatorial Libraries for Basic Research and Drug Discovery// Nature- V.357.- P.84.

61. Hughes J.F., Coffin J.M. (2001) Evidence for genomic rearrangements mediated by human endogenous retroviruses during primate evolution.// Nature Genetics. V.9.- P.487-489.

62. Hughes J.F., Coffin J.M. (2002) A Novel Endogenous Retrovirus-Related Element in the Human Genome Resembles a DNA Transposon: Evidence for Evolutionary Link?// Genomics,.- V.80.- P.453-455.

63. Jacobson R.H., Zhang X.J., DuBose R.F., Matthews B.W. (1994) Three-dimensional structure of beta-galactosidase from E. coli.ll Nature.- V.369.-P.761-766.

64. Jefferson R.A. (1989) The GUS reporter gene system.// Nature.- V.342(6251).-P.837-838.

65. Jefferson R.A. (1987) Assaying chimeric genes in plants: the GUS gene fusion system.// The Plant Molecular Biology Reporter.- V.4(4).- P.387-405.

66. Jefferson R.A., Bevan M., Kavanagh T. (1987a) The use of the Escherichia coli beta-glucuronidase as a gene fusion marker for studies of gene expression in higher plants.// Biochem Soc Trans.-V Л5(\).- P.17-18.

67. Jefferson R.A., Burgess S.M., Hirsh D. (1986) p-glucoronidase from Escherichia coli as a gene-fusion marker.// Proc. Natl. Acad. Sci. USA.- V.83.-P.8551-8557.

68. Jefferson R.A., Kavanagh T.A. and Bevan M.W. (19876) GUS fusions: beta-glucuronidase as a sensitive and versatile gene fusion marker in higher plants.// EMBOJ.- V.6(13).- P.3901-3907.

69. Jensen L.G., Olsen О., Kops О., Wolf N., Thomsen K.K., von Wettstein D. (1996) Transgenic barley expressing a protein-engineered, thermostable (1,3-l,4)-beta-glucanase during germination.// Proc Natl Acad Sci USA.- V.93(8).-P.3487-3491.

70. Joshi M.D., Sidhu G., Pot I., Brayer G.D., Withers S.G. and Mcintosh L.P. (2000) Hydrogen Bonding and Catalysis: A Novel Explanation for How a Single Amino Acid Substitution Can Change the pH Optimum of a Glycosidase//./ Mol. Biol- V.299.- P.255-279.

71. Kapitonov V.V., Jurka J. (1999) The long terminal repeat of an endogenous retrovirus induces alternative splicing and encodes an additional carboxy-terminal sequence in the human leptin receptor.// J Mol. Evol.- V.48.- P.248-251.

72. LaemmIi U.K. (1970) Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4.// Nature. V.227.-P.680-685.

73. Lam K.S., Salmon S.E., Hersh E.M., Hruby V.J., Kazmierski W.M., Knapp R.J. (1991) A New Type of Syntetic Peptide Library for Identifing Ligand-Binding Activity// Nature-V .354.- P.82.

74. Lane D.P., Stephen C.W., Midgley C.A., Sparks A., Hupp T.A., Danieks D.A., Greaves R., Reid A., Vojtesek В., Piccksley S.M. (1996) Epitope Analysis of the Murine p53 Tumor Suppressor Protein// Oncogene- V. 12.- P.2461.

75. Li-Chu Tsai, Lie-Fen Shyur, Shu-Hua Lee, Su-Shiang Lin and Hanna S. Yuan (2003) Crystal Structure of a Natural Circularly Permuted Jellyroll Protein: 1,3-1,4-b-D-GIucanase from Fibrobacter succinogeneslt J. Mol. Biol.- V.330.-P.607-620.

76. Loi L., Barton P.A., Fincher G.B. (1987) Survival of Barley (1-3,1-4)-beta-Glucanase Isoenzymes during Kilning and Mashing.// J. Cereal Sci.- V.5.-P.45-50.

77. Luzi P., Victoria Т., Rafi M.A., Wenger D.A. (1997) Analysis of the 5' flanking region of the human galactocerebrosidase (GALC) gene.// Biochem Mol Med.-V.62(2).- PI59-164.t 84.Maeji N.G., Bray A.M., Geysen H.M. (1990) Multipin Peptide Syntesis

78. Strategy for T-Cell Determinant Analysis/Л/. Immunol. Methods- V.134.- P.23.

79. Manen D., Pougeon M., Damay P., Geiselmann J. (1997) A sensitive reporter gene system using bacterial luciferase based on a series of plasmid cloning vectors compatible with derivatives of pBR322.// Gene.- V.186(2).- P.197-200.

80. Matz M.V., Fradkov A.F., Labas Y.A., Savitsky A.P., Zaraisky A.G., Markelov M.L., Lukyanov S.A. (1999) Fluorescent proteins from nonbioluminescent

81. Anthozoa species.//Nat Biotechnol.-V. 17(10).- P.969-973.

82. Misteli Т., Spector D.L. (1997) Applications of the green fluorescent protein in <- cell biology and biotechnology.// Nat Biotechnol- V.15(10).- P.961-964.

83. Pazzagli M., Devine J.H., Peterson D.O., Baldwin Т.О. (1992) Use of bacterial and firefly luciferases as reporter genes in DEAE-dextran-mediated transfection of mammalian cells Л Anal Biochem.- V.204(2).- P.315-323.

84. Perlak F.J., Deaton R.W., Armstrong T.A., Fuchs R.L., Sims S.R., Greenplate J.T., Fischhoff D.A. (1990) Insect resistant cotton plants.// Biotechnology.-V.8(10).- P.939-943.

85. Petsko G.A. (2000) Enzyme evolution: Design by necessity// NatureV.403.-P.606-607.

86. Piruzian E.S., Monzavi-Karbassi В., Darbinian N.S., Goldenkova I.V., Kobets N.S., Mochulsky A.V. (1998) The use of a thermostable p-glucanase gene from Clostridium thermocellum as a reporter gene in plants.// Mol Gen. Genet.-V.257.- P.561-567.

87. Planas A. (2000) Bacterial 1,3-1,4-L-glucanases: structure, function and protein engineering// Biochimica et Biophysica Acta V.1543.- P.361-382.

88. Reiss В., Klemm M., Kosak H., Schell J. (1996) RecA protein stimulates homologous recombination in plants // Proc Natl Acad Sci USA.- V.93(7).-P.3094-3098.

89. Rodda S.J. (1996) T-cell Epitope Mapping with Synthetic Peptides and Peripheral Blood Mononuclear Cells. In: Morris, G.E. (Ed.), Epitope Mapping Protocols.// Mehtods Mol. Biol.-V.66(3Q).- P.363. Humana Press, Totowa, NJ.

90. Rossi F., Charlton C.A., Blau H.M. (1997). Monitoring protein-protein interactions in intact eukaryotic cells by P-galactosidase complementation.// Proc. Natl. Acad. Sci. USA.- V.94.- P.8405-8410.

91. Russel R.J.M., Gerike U., Danson M.J. (1998) Structural adaptations of the cold-active citrate synthase from an Antartic bacterium// Structure.- V.6.-P.351-361.

92. Rutter G.A., Kennedy H.J., Wood C.D., White M.R.H., Tavare J.M. (1998) Real-time imaging of gene expression in single cells.// Chemistry & Biology.- V.5.- P.285-290.

93. Rutter G.A., White M.R., Tavare J.M. (1995) Involvement of MAP kinase in insulin signalling revealed by non-invasive imaging of luciferase gene expression in single living cells.// Curr Biol.- V.5(8).- P.890-899.

94. Sambrook J., Fritch E.F., Maniatis T. (1989) Molecular cloning A laboratory manual. 2nd Edition. Cold Spring Harbour Lab. Press. N.Y.

95. Scott J.K., Smith G.P. (1990) Searching for Peptide Ligands with an Epitope Library// Science- V.249.- P.386.

96. Sheehan J., Himmel M. (1999) Enzymes, Energy, and the Environment: a Strategic Perspective on the U.S. Department of Energy's Research and Development Activities for Bioethanol.// Biotechnol. Prog.- V.l 5.- P.817-827.

97. Sniezko I., Dobson-Stone C., Klein A. (1998) The trek gene of Bacillus subtilis is a suitable reporter gene for the archaeon Methanococcus voltae.ll FEMSMicrobiol. Lett.- V.164.- P.237-242.

98. Solon D.N., Voigt C.A., Mayot S.L. (2002) De novo design of biocatalysts// Curr. Opin. Chem. Biol.- V.6.- PI25-129.

99. Strathdee C.A., McLeod M.R., Underhill T.M. (2000) Dominant positive and negative selection using luciferase, green fluorescent protein and 0-galactosidase reporter gene fusions.// BioTechniques.- V.28.- P.210-214.

100. Sugimoto J., Nobuo M., Kinjo Y., Takasu N., Oda Т., Jinno Y. (2001) Transcriptionally Active HERV К Genes: Identification, Isolation and Chromosomal Mapping.// Genomics.- V.72.- P.137-144.

101. Sverdlov E.D. (2000) Retroviruses and primate evolution.// BioEssays.-V.22.- P.161-171.

102. Tauriainen S., Virta M., Chang W., Karp M. (1999) Measurement of firefly luciferase reporter gene activity from cells and lysates using Escherichia coli arsenite and mercury sensors.// Anal. Biochem.- V.272.- P.191-198.

103. Terskikh A.V., Fradkov A.F., Zaraisky A.G., Kajava A.V., Angres B. (2002) Analysis of DsRed Mutants. Space around the fluorophore accelerates fluorescence development.// J Biol Chem.- V.277(10).- P.7633-7636.

104. Tissier A.F., Marillonnet S., Klimyuk V., Patel K., Torres M.A., Murphy G., Jones J.D. (1999) Multiple independent defective suppressor-mutator transposon insertions in Arabidopsis: a tool for functional genomics. Plant Cell., 11(10): 1841-1852.

105. Topell S., Henneckel J., Glockshuber R. (1999) Circularly permuted variants of the green fluorescent proteinI/ FEBS Letters.- V.457.- P.283-289.

106. Triantafyllou В., Tribbick G., Maeji N.J., Geysen H.M. (1992) Use of the Multipin Peptide Syntesis Tecchnique for the Generation of Antipeptide Sera// Cell Biophys.- V.21.- P.33.

107. Van de Burg В., Vriend G., Veltman O.R. (1998) Engieneering an enzyme to resist boiling/I Proc. Nat. Acad. Sci. USA- V.95.- P.2056-2060.

108. Vanniasinkam Т., Barton M.D., Heuzenroeder M.W. (2001) B-cell Epitope Mapping of the VapA Protein of Rhodococcus equi: Implications for Early Detection of R. equi Desiase in Foals// J. Clin. Microbiol V.39.-P.1633.

109. Verkhusha V.V, Lukyanov, K.A. (2004) The molecular properties and applications of Anthozoa fluoreczent proteins and chromoproteins// Nature Biotechnol.- V.22.- P.289-296.

110. Watson A., Mazumder A., Stewart M., Balasubramanian S. (1998) Technology for microarray analysis of gene expression. Current Opinion in Biotechnology.- V.9.- P.609-614.

111. White A., Rose D.R. (1997) Mechanism of catalysis by retaining p-glycosyl hydrolases.// Current Opinion in Structural Biology.- V.7(5).- P.645-651.

112. White K.A., Skuzeski J.M., Li W., Wei N. Morris T.J. (1995) Immunodetection, expression strategy and complementation of turnip crinkle virus p28 and p88 replication components.// Virology. V.211(2).- P.525-534.

113. White W.B., Bird H.R., Sunde M.L., Marlett J.A. (1983) Viscosity of beta-D-Glucan as a Factor in the Enzymatic Improvement of Barley for Chicks.// Poult. Sci.- V.62.- P.853-862.

114. Wildt S., Deuschle U. (1999) cobA, a red fluorescent transcriptional reporter for Escherichia coli, yeast and mammalian cells.// Nature Biotechnology.- V.17.- P.l 175-1178.

115. Wiznerowicz M., Fong A.Z., Mackiewicz A., Hawley R.G. (1997) Double-copy bicistronic retroviral vector platform for gene therapy and tissue engineering: application to melanoma vaccine development.// Gene Ther V.4(10).- P.1061-1068.

116. Wood T.M., Bhat K.M. (1988) Methods for measuring cellulase activities.// Methods Enzymology. V.160.- P.87-112.

117. Yip K.S.P., Britton K.L., Stillman T.J. (1998) Insights into the molecular basis of thermal stability from the analisis of ion-pair networks in the glutamate dehydrogenase familyИ Eur op. J. Biochem.-V.255.- P.336-346.

Информация о работе

Комахин, Роман Александрович
кандидата биологических наук
Москва, 2005
ВАК 03.00.03

Диссертация

Термостабильная лихеназа Clostridium thermocellum для фундаментальных и прикладных исследований - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы