Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Бифункциональные репортерные системы для про- и эукариот на основе делеционного варианта термостабильной лихеназы Clostridium thermocellum

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Мусийчук, Константин Анатольевич

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1 ПОДХОДЫ К ИЗУЧЕНИЮ РЕГУЛЯЦИИ

ЭКСПРЕССИИ ГЕНОВ

2 РЕПОРТЕРНЫЕ СИСТЕМЫ

2.1. Основа методологии использования репортерных генов

2.2. Требования, предъявляемые к репортерным генам

2.3. Хлорамфеникол ацетилтрансфераза (CAT) Е. coli

2.4. Бактериальные люциферазы V.harveyi и V.fishery и люцифераза из светлячка Photinus pyralis (Lux).

2.5. Р-галактозидаза (LacZ) E.coli

2.6. Р-глюкуронидаза (GUS) E.coli

2.7. Зеленый флуоресцентный белок (GFP) Aequoria victoria

2.8. Репортерная система LicB

2.9. Недостатки используемых репортерных генов 27 3. ГЛИКОЗИЛГИДРОЛАЗЫ

3.1. Классификация О-гликозилгидролаз

3.2. Механизмы гидролиза гликозидных связей

3.3. Целлюлосомная организация целлюлолитических ферментов

ГЛАВАII. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

ГЛАВА III. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

1. Анализ структуры лихеназы (LicB) Clostridium thermocellum

2. Получение делеционного варианта лихеназы С. thermocellum и сравнительное изучение его биохимических свойств

3. Индуцибельная экспрессия гена licSMl в клетках Escherichia coli

4. Конститутивная и индуцибельная экспрессия 7;сВМ в клетках дрожжей

5. Экспрессия гена &ВМ2 в клетках млекопитающих

6. Получение бифункциональных белков

6.1. Слияние последовательности гена //сВМ2 с последовательностью гена p-глюкуронидазы (GUS) E.coli

6.2. Слияние последовательности гена //сВМ2 с последовательностью гена gfp А. victoria

Введение Диссертация по биологии, на тему "Бифункциональные репортерные системы для про- и эукариот на основе делеционного варианта термостабильной лихеназы Clostridium thermocellum"

В последнее время большие успехи достигнуты в определении последовательности геномов многих организмов (вирусов, про- и эукариот) [http://vvww.ncbi.nlm.nih.gov:80/entxez/query.fcgi?db=Genome]. Секвенированы геномы более 800 организмов, среди которых геномы дрожжей, дрозофилы и арабидопсиса [The Arabidopsis Genome Initiative, (2000]. Знание последовательности пар оснований не всегда дает полное представление об ее функциональном значении. Так, обнаружено множество открытых рамок считывания, но функции кодируемых ими белков не определены. В геномах находится множество (около 60% для арабидопсиса) некодирующих последовательностей, роль которых неизвестна, хотя высказываются предположения об их защитных и регуляторных функциях.

В геноме эукариотического организма имеется около 1,5*104 - 2,5*104 генов, и только небольшая часть из них экспрессируется постоянно. Другая часть представлена генами, которые экспрессируются только в определенный момент роста, развития, при изменении внешних условий окружающей среды или при атаке патогенами.

Стали известны последовательности генов, кодирующих многие белки и ферменты, а также выполняемые ими функции. Но все еще очень мало данных о тонких механизмах регуляции экспрессии генов.

Таким образом, накоплено множество структурной информации, но остаются невыясненными многие вопросы ее реализации. Для понимания механизмов функционирования организма важным представляется изучение регуляции экспрессии генов. Экспрессия генов может регулироваться на разных уровнях: организации хроматина, транскрипции, трансляции и процессинга. Для изучения этих механизмов существуют различные методические подходы. Так, на первых двух этапах используется методология репортерных генов. Основа методологии репортерных систем заключается в том, что все гены имеют промоторные последовательности, регулирующие их транскрипцию. Используя методы молекулярной биологии, промоторы можно выделить и разместить в начало гетерологичного репортерного гена. Репортерные гены кодируют белки или ферменты, обладающие уникальными свойствами, что позволяет легко определять их активность. Такая конструкция (промотор-репортер) может быть введена в клетки, и за активностью продукта репортерного гена можно проследить, используя различные методы. Наиболее распространенные и используемые репортерные системы - это J3-галактозидаза (LacZ) для клеток бактерий и млекопитающих, (3-глюкуронидаза (GUS) для растений, и зеленый флуоресцентный белок (GFP) для большинства организмов. Для LacZ и GUS имеются субстраты, позволяющие проводить точное определение активности и гистохимическое окрашивание тканей. Главная особенность GFP - это возможность следить за экспрессией гена in vivo (без разрушения клето) и без использования субстратов.

Однако все существующие репортерные системы, наряду с достоинствами, имеют и недостатки. Так, LacZ теряет активность при достройках в N-концевой области, в некоторых организмах обнаружена эндогенная (3-галактозидазная активность; гликозилированная форма GUS не активна, фермент имеет длительный период полужизни; для созревания GFP необходимы посттрансляционные модификации и высокий уровень экспрессии, затруднено количественное тестирование флуоресценции белка. Эти недостатки ограничивают использование репортерных генов в некоторых исследованиях. Поэтому поиск и разработка новых или улучшение старых репортерных систем - актуальное направление исследований.

Ранее была предложена новая репортерная система для растений [Piruzian et al., 1998], основанная на термостабильности бактериальной лихеназы (LicB). Этот фермент имеет широкий диапазон оптимума рН, температурный оптимум (Топт.) -65°С, период полужизни при Топт. более 4 часов, во многих организмах отсутствуют субстраты и фоновые активности для этого фермента, методы количественного определения активности просты и чувствительны. Представленная работа направлена на расширение круга организмов, в которых возможно использование репортерной системы LicB, а также на получение бифункциональной репортерной системы LicB-GFP, объединяющей преимущества двух репортерных белков, а именно -количественные методы тестирования активности (LicB) и возможность слежения за экспрессией in vivo (GFP).

Цель исследования: показать возможность использования репортерной системы LicB для бактерий, дрожжей и млекопитающих, и создать бифункциональные репортерные белки, объединяющие преимущества двух репортерных белков LicB и GFP.

Задачи исследования:

1. Провести модификацию последовательности гена ИсВ и провести сравнительный анализ основных биохимических свойств модифицированных белков.

2. Сконструировать экспрессионные векторы, в которых модифицированный ген //сВМ2 находится под контролем различных регуляторных элементов, для трансформации клеток про- и эукариот, и проанализировать экспрессию гена /гсВМ2 в клетках бактерий, дрожжей и млекопитающих.

3. Создать бифункциональные репортерные белки LicBM2-GFP и GFP-LicBM2.

4. Сконструировать экспрессионные вектора, в которых последовательности, кодирующие бифункциональные белки, находятся под контролем различных регуляторных элементов, для трансформации клеток про- и эукариот, и проанализировать экспрессию слитых генов в клетках бактерий, дрожжей и млекопитающих.

Заключение Диссертация по теме "Молекулярная биология", Мусийчук, Константин Анатольевич

выводы

1. Делеционные варианты лихеназы LicBMl и LicBM2 сохраняют основные биохимические свойства полноразмерного фермента (температурный и рН оптимумы, стабильность, активность).

2. Ген //сВМ2 стабильно экспрессируется в клетках бактерий, дрожжей и млекопитающих.

3. Быстрые изменения ферментативной активности лихеназы, при воздействии соответствующими индукторами и/или репрессорами на индуцибельные промоторы, контролирующие экспрессию гена ИсВМ2. позволяют использовать фермент в кинетических исследованиях.

4. В составе бифункциональных гибридных белков лихеназа сохраняет основные свойства - термостабильность и активность, что позволяет использовать ее в экспериментах по изучению экспрессии слитых генов.

5. На основании полученных результатов лихеназа, а также бифункциональные репортерные белки, сконструированные на ее основе, предлагаются в качестве новых удобных репортеров при изучении регуляции экспрессии генов в про- и эукариотах.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Таким образом, представленные результаты исследования позволяют заключить, что удаление лидерной последовательности, а также частичная (LicBMl) и полная (LicBM2) делеции целлюлосомосвязывающего домена лихеназы не приводят к значительным изменениям основных свойств фермента - сдвигу оптимума рН и температуры, или к изменению активности и стабильности. Более того, в некоторых отношениях (отмеченных в главе III, раздел 2) делеционный вариант LicBM2 имеет ряд преимуществ для использования его в качестве репортерного белка, а также для получения гибридных бифункциональных белков.

Методы определения активности лихеназы являются высокочувствительными, быстрыми и не требуют дорогостоящего оборудования и реактивов.

Количественный анализ позволяет определить до 25 нг лихеназы за 10 минут инкубации. За счет высокой стабильности лихеназы при 65°С (по крайней мере, в течение 5 часов) можно увеличить время инкубации, что даст возможность увеличить чувствительность количественного метода определения активности фермента

Качественные методы позволяют определить до 100 нг фермента за 1 час инкубации геля (метод зимограмм) и такое же количество лихеназы за 16 часов инкубации (метод чашечного теста).

LicBM2 показывает чувствительность и диапазон измерений, эквивалентный |3-галактозидазе, для тестирования промоторных активностей количественными и качественными методами. Как и для других широко используемых репортеров, таких как Р-галактозидаза, люцифераза, CAT, |3-глюкоронидаза и Р-лактамаза, лихеназа также требует добавления субстрата.

Как показали результаты чашечного теста, ген лихеназы может быть предложен в качестве потенциального селективного маркера при отборе трансформантов бактерий и дрожжей. Поскольку продукты гидролиза лихенана LicEM2 не окрашиваются Конго красным, в отличие от не гидролизованного субстрата, лихенан может быть удобным субстратом для отбора бактериальных и дрожжевых колоний, экспрессирующих lic&Ml ген под контролем как конститутивных, так и индуцибельных промоторов. Подобная селекция клонов является очень удобной для быстрого отбора бактериальных и дрожжевых трансформантов. И, возможно, после проведения дополнительных исследований, ген лихеназы может быть предложен как селективный для этих клеток.

Не обнаружено фоновых активностей, а также изменений в росте трансформированных клеток ни в одной из используемых модельных систем.

Таким образом, анализ экспрессии бактериального гена ИсВ в E.coli, клетках дрожжей и млекопитающих показал, что бактериальная лихеназа обладает многими свойствами, необходимыми для репортера. Так, термостабильность лихеназы позволяет легко тестировать экспрессию бактериального гена ИсВ качественными и количественными методами на фоне термолабильных ферментов этих организмов. Во всех клетках лихеназа продуцируется в активной форме. Лихеназа выдерживает значительные достройки в N- и С-концевых областях и может быть использована для трансляционного слияния с последовательностями исследуемых белков. Так, в составе бифункциональных белков лихеназа остается активной, и полосы ее активности соответствуют молекулярным массам гибридных белков (96 кДа - для GUS-LicBM2 и LicBM2-GUS; 56 кДа - для GFP-LicBM2 и LicBM2-GFP). Это позволяет предложить использовать метод зимограмм для лихеназы вместо Вестернблот гибридизации. Данные о сохранении основных свойств лихеназы (активность) и GFP (флуоресцентность) в составе бифункциональных гибридных белков дают основание предложить их в качестве бифункциональных репортеров для изучения регуляции экспрессии генов.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Мусийчук, Константин Анатольевич, Москва

1. Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Д. (1984) Молекулярное клонирование, М., Мир.

2. Зверлов В.В. (1993) Изучение структуры гена лихеназы Clostridium thermocellum Ф7 и характеристика продукта данного гена. Дисс. канд. биол. наук, ИМГ РАН, Москва.

3. Пирузян Э.С., Могутов М.А., Великодворская Г.А., Акименко В.К. (1985) Клонирование и экспрессия структурного гена целлюлазы се17 целлюлолитического комплекса Clostridium thermocellum в клетках Escherichia соИ,Докл. АН СССР. 281, 4: 963-965.

4. Пирузян Э.С., Шигапова Н.В., Кобец Н.С., Голденкова И.В., Лось Д.А. Приоритет от 23 июня 1998 года, С12Н 15/65.

5. Armstrong J.A., Emerson B.M. (1998) Transcription of chromatin: these are complex times. Current Opinion in Genetics & Development, 8:165-172.

6. Arnim A.G., Deng X.W., Stacey M.G. (1998) Cloning vectors for the expression of green fluorescent protein fusion proteins in transgenic plants Gene. 221, 35-^43.

7. Audoly L.P., Le Т.Н., Coffman T.M. (2000) What can knockout mice contribute to an understanding of hypertension? Curr. Hypertens Rep., 2(2): 192-197.

8. Ay J., Gotz F., Borriss R., Heimann U. (1998a) Structure and function of the Bacillus hybrid enzyme GluXyn-l:Native-like jellyroll fold preserved after insertion of autonomous globular domain. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95: 6613-6618.

9. Ay J., Hahn M., Decanniere K., Piotukh K., Borriss R., Heinemann U. (19986) Crystal structures and properties of de novo circularly permuted 1,3-1,4-beta-glucanases. Proteins Struct. Funct. Genet., 30: 155-167.

10. Azpiroz-Leehan R., Feldmann K.A. (1997). T-DNA insertion mutagenesis in Arabidopsis: going back and forth. Trends Genet., 13(4):152-6.

11. Bayer E.A., Morag E., Lamed R. (1994) The cellulosome a treasure-trove for biotechnology. TrendsBiotechnol., 12: 378-386.

12. Bayer E.A., Shimon L. J. W., Shoham Y., Lamed R. (1998a) Cellulosomes structure and ultrastructure. J. Struct. Biol, 124:221-234.

13. Bayer E.A, Chanzy H.R., Lamed R., Shoham Y. (19986) Cellulose, cellulases and cellulosomes. Current Opinion in Structural Biology, 8: 548-557.

14. Begiun P. (1983) Detection of cellulase activity in polyacrylamide gels using Congo red-stained agar replicas. Anal. Biochem., 131(2): 333-6.

15. Beguin P., Lemaire M. (1996) The cellulosome: an exocellular, multi-protein complex specialized in cellulose degradation. Crit. Rev. Biochem. Mol. Biol., 31: 201-236.

16. Berk A., Mattaj I.W. (1997) Nucleus and gene expression. Current Opinion in Cell Biology, 9: 307-309.

17. Bevan M.W., Barnes W., Chilton M.D. (1983). Structure and transcription of nopaline synthase gene region ofT-DNA. Nucleic. Acid Res., 11: 369-385

18. Clostridium thermocellum cellulosome can be attributed to previously unknown domains of

19. XynY andXynZ. Journal of Bacteriology., 182(5): 1346-1351.

20. Boisset C., Chanzy H., Henrissat В., Lamed R., Shoham Y. and Bayer E.A. (1999). Digestion of crystalline cellulose substrates by the Clostridium thermocellum cellulosome: structural and morphological aspects. Biochem. J., 340: 829-835.

21. Bradford M.M. (1976) A rapid sensitive method for quantification of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal. Biochem., 72: 248-254.

22. Brejc K.A., Sixma Т.К., Kitts P.A., Kain S.R., Tsein R.Y., Ormo M., Remington S.J. (1997) Structural basis for dual excitation and photoisomerization of the Aequorea victoria green fluorescent protein. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94: 2306-2311.

23. Bruening, G. (1998). Plant gene silencing regularized. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95: 13349-13351.

24. Chalfie M„ Tu Y„ Euskirchen G., Ward W.W., Prasher D.C. (1994) Green fluorescent protein as a marker for gene expression. Science, 263 (5148): 802-805.

25. Cohen A., Mayfield S.P. (1997) Translational regulation of gene expression. Current Opinion in Biotechnology, 8: 189-194.

26. Cody C.W., Prasher D C., Westler W.M., Prendergast F.G., Ward W.W. (1993) Chemical structure of the hexapeptide chromophore of the Aequorea green-fluorescent protein. Biochemestry, 32: 1212-1218.

27. Corneille S., Lutz K., Maliga P. (2000) Conservation of RNA editing between rice and maize plastids: are most editing events dispnsable? Mol. Gen. Genet., 264: 419-424.

28. Coughlan, M. P., Hon-nami K., Hon-nami H., Ljungdahl L.G., Paulin J.J., Rigsby W.E. (1985) The cellulolytic enzyme complex of Clostridium thermocellum is very large. Biochem. Biophys. Res. Commun, 130: 904-909.

29. Coughlan M.P., Ljunghah L.G. (1988) In Biochemistry and Genetics of Cellulose Degradation, FEMS Symposium, Academic Press, 43, 11-30.

30. Crebelli R. (2000). Threshold-mediated mechanisms in mutagenesis: implications in the classification and regulation of chemical mutagens. Mutation Research/Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis, 464(1): 129-135

31. Crennel S.J., Garman E.F., Laver W.G., Vimr E.R., Taylor G.L. (1993) Crystal structure of a bacterial sialidase (from Salmonella typhimurium LT2) shows the same fold as an influenza virus neuraminidase. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 9852-9856.

32. Cubitt A.B., Heim R., Adams S.R., Boyd A.E., Gross L.A., Tsien R.Y. (1995) Understanding, improving and using green fluorescent proteins. Trends Biochem. Sci., 20: 448-455.

33. Davies G., Henrissat B. (1995) Structures and mechanisms of glycosyl hydrolases. Structure, 3: 853-859.

34. De Greeve H, Dhaese P., Seurinek J., Lemmers M., Van Montagu M., Schell J. (1982) Nucleotide sequence and transcript map of the Agrobacterium tumifaciens Ti plasmid encoded octopine synthase gene. J. Mol. Appl Genet., 1: 499-517.

35. Drees B.L. (1999) Progress and variations in two-hybrid and three-hybrid technologies. Current Opinion in Chemical Biology, 3 (1): 64—70.

36. Endebrecht J., Silverman M. (1984) Identification of genes and gene products necessary for bacterial bioluminescence. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81 (13): 4154-4158.

37. Fanutti, С., T. Ponyi, G. W. Black, G. P. Hazlewood, and H. J. Gilbert. (1995) The conserved noncatalytic 40-residue sequence in cellulases and hemicellulases from anaerobic rumen fungi functions as a docking domain. J. Biol. Chem. 270: 29314-29322.

38. Felix C.R., Ljungdahl L,G. (1993) The cellulosome the exocellular organelle of Clostridium. Annu. Rev. Microbiol., 47: 791-819.

39. Flint H.J., Martin J., McPherson C.A., Daniel A.S., Zhang J.X. (1993) A bifunctional enzyme, with separate xylanase and beta(l,3-l,4)-glucanase domains, encoded by the xynD gene of Ruminococcus flavefaciens. J. Bacteriol, 175 (10): 2943-2951.

40. Gallie D.R. (1998) Controlling gene expression in transgenics. Current Opinion in Plant Biology, 1: 166-172.

41. Gatz C., Lenk I., 1998) Promoters that respond to chemical inducers. Trends in Plant Science, 3(9): 352-358.

42. Gorman С. (1985) DNA cloning II-A Practical Approach (Glover D.M., Ed.): 143-190.

43. Green L.A., Tischler A. (1976) Establishment of a nonadrenergic clonal line of rat adrenal pheochromocytoma cells which respond to nerve growth factor. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 73: 2424-2428.

44. Guivarc'h A., Caissard J.C., Azmi A., Elmayan Т., Chriqui D., Tepfer M. (1996) In situ detection of expression of the gus reporter gene in transgenic plants: Ten years of blue genes. Transgenic Research, 5: 281-288.

45. Hansen S.A. (1975)/. Chromatogr., 105: 388-390.

46. Hahn M., Piotukh K., Borriss R., Heinemann U. (1994) Native-like in vivo folding of a circularly permuted jellyroll protein shown by crystal structure analysis. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91: 10417-10421.

47. Hein R., Prasher D.C., Tsein R.Y. (1994) Wavelength mutations and posttranslational autooxidation of green fluorescent protein. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91: 12501-12504.

48. Helliwell C.A., Webster C.I., Gray J.C. (1997) Light-regulated expression of the pea plastocyanin gene is mediated by elements within the transcribed region of the gene. Plant J12: 499-506.

49. Henrissat B. (1991). A classification of glycosyl hydrolases based on amino-acid sequence similarities. Biochem. J., 280: 309-316.

50. Henrissat В., Bairoch A. (1993). New families in the classification of glycosyl hydrolases based on amino-acid sequence similarities. Biochem. J., 293: 781 -788.

51. Henrissat В., Bairoch A. (1996) Updating the sequence-based classification of glycosyl hydrolases. Biochem. J., 316: 695-696.

52. Henrissat В., Davies G. (1997) Structural and sequence-based classification of glycoside hydrolases. Curr. Opin. Struct. Biol., 7: 637-644.

53. Henrissat B. (1998) Enzymatic cellulose degradation Cellulose Commun., 5: 84-90.

54. Hirose Т., Kusumegi Т., Tsudzuki Т., Sugiura M. (1999) RNA editing sites in tobacco chloroplast transcripts: editing as a possible regulator of chloroplast RNA polymerase activity. Mol Gen Genet., 262: 462-467.

55. Iglesias V.A., Moscone E.A., Papp I., Neuhuber F., Michalowski S., Phelan Т., Spiker S., Matzke M., Matzke A.J.M. (1997) Molecular and cytogenetic analyses of stably and unstably expressed transgene loci in tobacco. Plant Cell, 9:1251-1264.

56. Jacobson R.H., Zhang X.J., DuBose R.F., Matthews B.W. (1994) Three-dimensional structure of beta-galactosidase from E. coli. Nature, 369:761-766.

57. Jefferson R.A., Burgess S.M., Hirsh D. (1986) P-glucoronidase from Escherichia coli as a gene-fusion marker. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 83: 8557-8451.-9468. Jefferson R.A. (1987a) Assaying chimeric genes in plants: the GUS gene fusion system. The

58. Plant Molecular Biology Reporter, 4(4): 387-405.

59. Jefferson R.A., Kavanagh T.A. and Bevan M.W. (1987b) GUS fusions: beta-glucuronidase as a sensitive and versatile gene fusion marker in higher plants. EMBOJ., 6(13): 3901-3907.

60. Karimova G., Pidoux J., Ullmann A., Ladant D. (1998). A bacterial two-hybrid system based on a reconstituted signal transduction pathway. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95: 5752-5756.

61. Kohring S., Wiegel J., Mayer F. (1990) Submit composition and glycosidic activities of the cellulase complex from Clostridium thermocellum JW20. Appl. Environ. Microbiol., 56: 3798-3804.

62. Kuroki R., Weaver L.H., Matthews B.W. (1995) Structure-based design of a lysozyme with altered catalytic activity. Nat. Struct. Biol., 2(11): 1007-1011.

63. Laemmli, U.K. (1970) Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature, 227: 680-685.

64. Lake B.D., Goodwin H.J. (1976) Chromatographic and electrophoretic tehniques, 1: 345366.

65. Lamed R, Setter E., Kenig R., Bayer E.A. (1983) The cellulosome a discrete cell surface organelle of Clostridium thermocellum which exhibits separate antigenic, cellulose-binding and various cellulolytic activities. Biotechnol. Bioeng., 13: 163-181.

66. Li X.L., Chen H., Ljungdahl L.G. (1997) Two cellulases, CelA and CelC, from the polycentric anaerobic fungus Orpinomyces strain PC-2 contain N-terminal docking domains for a cellulase-hemicellulase complex. Appl. Environ. Microbiol., 63: 4721-4728.

67. Lytle В., Wu J. H. D. (1998) Involvement of both dockerin subdomains in assembly of the Clostridium thermocellum cellulosome. Journal of Bacteriology, 180(24): 6581-6585.

68. Maniatis Т., Fritch E.F., Sambrook J. (1982) Molecular cloning: A laboratory Manual., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N. Y.

69. Matthews B.W., Remington S.J. (1974) The three-dimensional structure of lysozyme from bacteriophage T4. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 71: 4178-4182.

70. Mett Y.L., Lochhead L.P., Reynolds P.H.S. (1993) Copper controllable gene expression system for whole plants. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 4567-4571.

71. Naylor L.H. (1999) Reporter gene technology: The future looks bright. Biochemical Pharmacology, 58: 749-757.

72. Ni M., Cui D., Einstein J., Narasimhulu S., Yergara C. (1995) Strength and tissue specificity of chimeric promoters derived from the octopin and mannopine sythase genes. The Plant Journal, 7(4): 661-676.

73. Nicol F., Hofte H. (1998) Plant cell expansion: scaling the wall. Current Opinion in Plant Biology, 1: 12-17.

74. Olsen О., Thomsen K.K., Weber J., Duus J.O., Svendsen I., Wegener C., von Wettstein D. (1996) Transplanting two unique beta-glucanase catalytic activities into one multienzyme, which forms glucose. Biotechnology (NY). 14(1): 71-76.

75. Orengo C.A., Jones D.T., Thornton J.M. (1994) Protein superfamilies and domain superfolds. Nature, 372(6507): 631-634.

76. Ormo M., Cubitt A.B., Kallio K., Gross L.A., Tsien R.Y., Remington S J. (1996) Crystal structure of the Aequorea victoria green fluorescent protein. Science, 273: 1392-1395.

77. PeitschM.C. (1995) Protein modelling by E-Mail. Bio/Technology, 13: 658-660.

78. Piruzian E.S., Monzavi-Karbassi В., Darbinian N.S., Goldenkova I.Y., Kobets N.S., Mochulsky A.V. (1998) The use of a thermostable P-glucanase gene from Clostridium thermocellum as a reporter gene in plants. Mol. Gen. Genet., 257: 561-567.

79. Rossi F., Charlton C.A., Blau H.M. (1997). Monitoring protein-protein interactions in intact eukaryotic cells by P-galactosidase complementation. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94: 8405-8410.

80. Rutter G.A., Kennedy H.J., Wood C.D., White M.R.H., Tavare J.M. (1998) Real-time imaging of gene expression in single cells. Chemistry & Biology, 5:285-290.

81. Sambrook J., Fritch E.F., Maniatis T. Molecular cloning A laboratory manual. 2nd Edition. (1989), Cold Spring Harbour Lab. Press. N.Y.

82. Schaefer, D. G. & Zryd, J.P. (1997) Efficient gene targeting in the moss Physcomitrella patens. Plant J., 11: 1195-1206.

83. Eur. J. Biochem., 204: 13-19.

84. Sieburth L.E., Meyerowitz E.M. (1997) Molecular dissection of the AGAMOUS control region shows that cis elements for spatial regulation are located intragenically. Plant Cell, 9: 355-365.

85. Sniezko I., Dobson-Stone C., Klein A. (1998) The tre A gene of Bacillus subtilis is a suitable reporter gene for the archaeon Methanococcus voltae. FEMS Microbiol. Lett., 164: 237-242.

86. Soni R., Carmichael J.P., Murray J.A. (1993) Parameters affecting lithium acetate-mediated transformation of Saccharomyces cerevisiae and development of a rapid and simplified procedure. Curr. Genet., 24: 455-459.

87. Spiker S., Thompson W.F. (1996) Nuclear matrix attachment regions and transgene expression in plants. Plant Physiol., 110: 15-21.

88. Sprey B, Uelker A. (1992) Isolation and properties of a low molecular mass endoglucanase from Trichoderma reesei. FEMS Microbiol. Lett., 71(3): 253-7.

89. Strathdee C.A., McLeod M.R., Underhill T.M. (2000) Dominant positive and negative selection using luciferase, green fluorescent protein and (5-galactosidase reporter gene fusions. BioTechniques, 28: 210-214.

90. Tauriainen S., Yirta M., Chang W., Karp M. (1999) Measurement of firefly luciferase reporter gene activity from cells and lysates using Escherichia coli arsenite and mercury sensors. Anal. Biochem., 272: 191-198.

91. Teather R., Wood P. (1982) Use of Congo red-polysaccharide interactions in enumeration and characterization of cellulolytic bacteria from the bovine rumen. Appl. Environm. Microbiol., 43(4): 777-780.

92. The Arabidopsis Genome Initiative. (2000) Analysis of the genome sequence of the owering plant Arabidopsis thaliana. Nature, 408: 796-815.

93. Tissier A.F., Marillonnet S., Klimyuk V., Patel K., Torres M.A., Murphy G., Jones J.D. (1999) Multiple independent defective suppressor-mutator transposon insertions in Arabidopsis: a tool for functional genomics. Plant Cell., 11(10): 1841-1852.

94. Topfer R., Matzeit V., Gronenborn В., Schell J., Steinbiss H.H. (1987) A set of plant expression vectors for transcriptional and translational fusions Nucl. Acid Res., 15 (14): 5890.

95. Uptain S.M., Kane C.M., Chamberlin M.J. (1997). Basic mechanisms of transcript elongation and its regulation. Annu. Rev. Biochem., 66: 117-172.

96. Velden A.W., Thomas A.A.M. (1999) The role of the 5 untranslated region of an mRNA in translation regulation during development. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology, 31: 87-106.

97. Watson A., Mazumder A., Stewart M., Balasubramanian S. (1998) Technology for microarray analysis of gene expression. Current Opinion in Biotechnology, 9: 609-614.

98. White A., Rose D.R. (1997) Mechanism of catalysis by retaining P-glycosyl hydrolases. Current Opinion in Structural Biology, 7(5): 645-651.

99. Wildt S., Deuschle U. (1999) cob A, a red fluorescent transcriptional reporter for Escherichia coli, yeast and mammalian cells. Nature Biotechnology, 17: 1175-1178.

100. Wood T.M., Bhat K.M. (1988) Methods for measuring cellulase activities. Methods Enzymology, 160: 87-112.

101. Xie G, Ito E Maruyama K., Suzuki Y., Sugano S., Sharma M., Pietruck C., Palmer P.P. (1999) The promoter region of human prepro-nociceptin gene and its regulation by cyclic AMP and steroid hormones. Gene, 238: 427-436.

102. Zhu Т., Peterson D.J., Tagliani L., St. Clair G., Baszczynski C.L., Bowen B. (1999). Targeted manipulation of maize genes in vivo using chimeric RNA/DNA oligonucleotides. Proc. Natl Acad. Sci. USA, 96(15): 8768-73.-102