Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Спиновая диффузия как метод исследования динамики глобулярных белков

ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Спиновая диффузия как метод исследования динамики глобулярных белков"

С А

д российская академия наук

институт теоретической и экспериментальной биофизики

На правах рукописи УДК 577.322.7

кутышенно виктор павлович

спиновая диффузия как метод исследования динамики глобулярных белков

(03.00.02 - Биофизика)

Автореферат диссертации на соискание учбной степени доктора физико-математических наук

Пущино - 1993

Работа выполнена в Институте теоретической и экспериментальной биофизики РАН Официальные оппоненты: доктор физико-математических наук профессор С.И.АксЗнов доктор химических наук профессор И.А.Василенко доктор физико-математических наук вед. н. с. D.A.Лазарев

Ведущая организация: Казанский институт биологии РАН

Защита состоится "ZI1993 г. в /Ц часов на заседании Специализированного ученого совета Д.200.22.01 при ИТЭБ РАН по адресу: 142292, г.Пущино Московской области, проспект Науки, ИТЭБ

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ИТЭБ РАН.

Я,

Автореферат разослан "X'i/fcQcÁíf 1993 года. Ученый секретарь Совета /

/ i/ Щ/tÚiiúísu,

наук

кандидат биологических / [ л /, - /П.А.Нвлипович/

у I

(J

общая характеристика работы

введение.

Актуальность работы. Глобулярные белки являются одним из наиболее важных молекулярных компонентов биологических систем, играющих огромную функциональную роль в жизнедеятельности клетки. Они осуществляют такие важнейшие функции, как катализ многочисленных химических реакций, протекающих в организме, транспорт веществ, передачу и преобразование энергии и информации, и многие другие функции.

Функциональные свойства белков обусловлены их уникальными структурными особенностями. Это относится как к их химической первичной структуре, так и пространственным: вторичной, третичной и четвертичной структурам. Функционирование белков тесно связано также с присущими им динамическими свойствами и конформационными перестройками, которые позволяют считать их эволюционно приспособленными и выделенными в результате естественного отбора молекулярными машинами.

Изучению физических, химических и биологических свойств белков уделялось и уделяется огромное внимание в мировой науке в течение уже многих десятков лет. Оно выделилось в большое самостоятельное направление фундаментальных и прикладных исследований, в которых структурные исследования занимают значительное место.

Структурные исследования белков осуществляются с помощью всех известных -видов спектроскопии. Однако наиболее сильным методом является рентгеноструктурный анализ, способный дать детальную информацию о структуре, основанную на точном знании координат всех атомов полипептидной цепи. Но такую информацию можно получить

толкко для кристалла белка, вырастить который очень не простая и не всегда возможная задача. Кроме того, на современном этапе исследований интересна ухе не структура как таковая, а еб изменения при функционировании белков, связанные, главным образом, с их конформационной изменчивостью, ' конформационной динамикой. Такую информацию можно получить только в растворе - среде наиболее близкой к естественным условиям функционирования большинства белков.

Эта задача может решаться только современными методами 2Б-ЯМР спектроскопии, которые позво-ияют получить столь же детальную информацию о структуре (на уровне отдельных атомов), как и рентге-ноструктурный анализ при любых значениях рН, температуры, ионной, силы и других параметров раствора, оставляющих белок в нативном состоянии. Нативное состояние содержит в спектре 1Н-ЯМР высокого разрешения сигналы, которые имеют положения несколько отличающиеся от определяемых химической природой за счёт дополнительных взаимодействий между протонами, участвующими в образовании вто-ричой и третичной структуры. Именно благодаря им и оказывается возможным получение структурной информации. Если же спектр, в результате каких-то изменений в белке, не содержит эти сигналы, то и 2Б-ЯМР спектроскопия оказывается бессильной установить пространственную структуру такой молекулы.

• Аналогичные трудности в изучении деталей структуры методом ЯМР высокого разрешения могут возникнуть и в случае исследования крупных белков (>50кБ).

Исследования белкового фолдинга, являпциеся в настоящее время одной из центральных тем, показали, что молекула белка может пребывать в стабильных промежуточных состояниях, по компактности и

по содержанию вторичной структуры мало отличающихся от нативного состояния, но не импцих многих свойств, характерных для нативной молекулы. К их числу относится и отсутствие в спектрах ЯМР высокого разрешения сигналов, ответственных за структурные взаимодействия.

Таким образом, один из сажх действенных аналитических методов, в ряде важных случаев выпадает из арсенала исследовательских средств. С этим трудно смириться и поэтому возникает интересная и актуальная задача адаптации метода ЯМР высокого разрешения к такого рода исследованиям.

Для решения этой задачи имеются определбнные предпосылки, поскольку ЯМР-параметры (в частности, времена релаксации) очень чувствительны к молекулярному движению, что позволяет изучать самые разнообразные внутримолекулярные динамические процессы - кон-формационные перестройки, подвижность отдельных групп и больших фрагментов, процессы самосборки, денатурации, связывания лигандов и др.

В данной работе предложен способ адаптации метода ЯМР высокого разрешения к исследованию белков в состояниях с нарушенной нативной структурой, основанный на известном явлении спиновой диффузии и поэтому названный методом спиновой диффузии.

Этот метод лишён возможности следить за отдельным протоном вполне определённого аминокислотного остатка, но дабт возможность проследить за дальнейшей эволюцией всей молекулы или какой-то её части после потери или до приобретения ею нативных свойств. Цель и задачи исследования. Цель настоящей работы состояла в том, чтобы установить взаимные соответствия мевду свойствами спиновой диффузии и свойствами белков и экспериментально обосновать уни-

версальность метода спиновой диффузии.

При этом решались следующие задачи:

- исследование свойств спиновой диффузии в процессе тепловой денатурации ряда глобулярных белков;

- исследование свойств спиновой диффузии в процессе денатурации глобулярных белков сильными денатурантами;

- исследование свойств спиновой диффузии в зависимости от молекулярной массы глобулярных белков;

- исследование ассоциации белков при тепловой денатурации;

- исследование состояния расплавленной глобулы кислых форм кар-боангидразы и а-лактальбумина;

- исследование холодовой денатурации апомиоглобина и р-лактгло-булина;

- термодинамическое обоснование метода спиновой диффузии;

- исследование возможностей метода спиновой диффузии в определении структурных особенностей белков.

Научное значение и новизна. В работе впервые : - предложен метод исследования глобулярных белков, основанный на известных явлениях: ядерном эффекте Оверхаузера и спиновой диффузии - метод спиновой диффузии, позволяющий исследовать конформа-ционые изменения не только в нативном состоянии, но, в отличие от большинства существующих в настоящее время методов, и в состояниях, которые по спектрам ЯМР и данным других методов определяются как денатурированные;

-показана возможность метода качественно и количественно исследовать процесс ассоциации белковых молекул; определять наличие стабильных промежуточных состояний в процессе тепловой или иной денатурации; достаточно быстро определять молекулярную массу или е8

изменения, связанные с модификацией белковой глобулы или при взаимодействии еЭ с другими молекулами; получить информацию о конфигурации глобулы;

- экспериментально показано, что холодовая денатурация приводит к конечному состоянию, близкому к состоянию "расплавленная глобула", в отличие от тепловой денатурации, при которой конечным является разупорядоченное состояние;

- показано, что состояние "расплавленная глобула" с ростом температуры подвергается разрушению, которое происходит монотонно, без особенностей, а с ростом концентрации мочевины - по типу "всЭ или ничего".

Практическая ценность. Результаты, полученные с помощью метода спиновой диффузии, наиболее црямо и убедительно свидетельствуют о наличии ярко выраженных промежуточных состояний между уникальной нативной структурой и полностью разупорядоченной полипептидной цепью многих глобулярных белков в процессе любых типов денатурации.

Цредложенный метод спиновой диффузии и полученные с его помощью результаты могут быть использованы в различных областях биохимии, молекулярной биологии и биофизики.

Публикации. Основные результаты представленной диссертации опубликованы в 21 печатной работе, включающей 17 статей в отечественных' и международных журналах.

Апробация. Материалы диссертации докладывались на: симпозиуме "йгаико-химические свойства биополимеров в растворах и клетках" (Пущино,1985); 17-ом Югославском симпозиуме по биофизике (Кумро-вец,1986); 19-ом Югославском симпозиуме по биофизике (Сараево -Игмант,1Э88); международном семинаре "Приложения ЯМР спектроско-

пии" (Москва,1990); IX-ом всесоюзном симпозиуме "Биофизика и биохимия подвижности" (Тбилиси,1990); рабочем совещании с участием варубежных учбных "Магнитный резонанс и динамика белков" (Казань, 1991); Советско-Германском симпозиуме "Protein - nucleic acid interaction: atructural and pharmacological aspects" ( Ленинград, 1991); VII-ой конференции по спектроскопии биополимеров (Харьков, 1991).

Структура диссертации. Диссертация состоит из введения, где сформулирована научная проблема и перечислены основные задачи исследования; семи глав, включающих экспериментальный материал и его обсуждение; выводов и списка цитируемой литературы из 171 наименований. Диссертация содержит 185 страниц, включая 163 страниц машинописного текста, 93 рисунка и I таблицу. ¡¡^

На защиту выносятся:

1.Разработка метода спиновой диффузии для исследования белков.

2.Установление закономерностей в поведении спиновой диффузии в белках при разных типах денатурации.

3.Результаты и выводы, полученные при исследовании холодовой денатурации, состояния расплавленной глобулы и ассоциации белков.

4.Результаты и выводы, полученные при исследовании спиновой диффузии в зависимости от молекулярной массы глобулярных белков.

Данная работа представляет собой попытку систематического исследования явления спиновой диффузии в глобулярных белках при воздействии на них температуры, рН и денатурантов.

результаты и обсуждение

Первая глава представляет собой краткий обзор литературы по

спиновой диффузии и теоретическому обоснованию этого явления. На основе анализа приведЭнных литературных данных выбран способ фиксации спиновой диффузии с помощью стационарного ядерного эффекта Оверхаузера (ЯЭО).

Чисто внешне эффект спиновой диффузии для глобулярных белков проявляется в удивительном сходстве обзорных спектров и спектров ЯЭО, что иллюстрируется рисунком I.

Рис.1. Обзорный спектр - А И спектр ЯЭО - В в области поглещения ароматически! протонов рибонуклеазы А.

(В20;рН 3,2; Т=293К)

Метод спиновой диффузии, описываемый и применяемый в даннйй работе основан на получении спектров ЯЭО при насыщении на частоте протонов основного метального пула, для глобулярных белков это соответсвует положению в спектре ~0,9 мд.

Метальный пул для этих целей выбран по следующим причинам. I.Сигналы метилов даже в нативных глобулярных белках с уникальной упаковкой боковых групп аминокислотных остатков, в спектре являются обособленными и достаточно хорошо сгруппированными в сравнительно узкой области (~0,2мд), так что насыщение радиочастотной энергией этой области вызывает минимальное возмущение в области поглощения алифатических протонов и совершенно не затра-

6.5

гивает область поглощения ароматических протонов. 2. Сигналы метальных групп в указанной области поглощения могут принадлежать, большей частью, только остаткам валинов, лейцинов и изолейцинов поэтому отклики, присутствующие в спектре ЯЭО, происходят, в основном, за счбт передачи энергии мевду пространственно сближенными группами различных участков полипептидной цепи, а не по химическим связям первичной последовательности. Таким образом,полу-ченный спектр ЯЭО содержит в себе информацию о структурно-дина мических свойствах молекулы, что является принципиальным для описываемого метода.

3. Метальные группы являются основными релаксационными стоками : белках, поэтому, подаваемая энергия идбт по "естественному" дл; данной молекулы релаксационному пути, но в обратной последова тельности.

4. Немаловажным фактором является и то, что метальный пул пред ставлен в спектре самым интенсивным сигналом, а чем интенсивна! насыщаемый сигнал, тем интенсивнее будет отклик в спектре ЯЭО что уменьшает время эксперимента.

Для количественной оценки эффективности спиновой диффузии з спектрах ЯЭО глобулярных белков был введбн параметр жбсткости который представляет собой отношение интегральных интенсивносте:-для сигналов, измеренных в любой области спектра ЯЭО и в той ж области обзорного спектра. Причбм, измерение указанных величи производится относительно интегральной интенсивности сигнала ме тильного пула, что уменьшает ошибку измерения до 4-5%.

В данной работе параметр жесткости измерялся в области погло щения протонов боковых групп ароматических аминокислотных остат ков (7,5+6,5 мд) - С^., и для метиленовых груш алифатически

аминокислотных остатков (3,2+1,2 мд) - С^ц.

Следует отметить, что таким образом можно определить параметр жЭсткости для любой части спектра или отдельного сигнала, но в данной работе рассматривались именно эти, потому что боковые группы ароматических остатков, как правило, являются основой гидрофобных областей глобулярного белка, в то время как метиленовые группы алифатических остатков, большая часть которых принадлежит гидрофильным аминокислотам, отражает поведение пер^фгрийных областей. Таким образом, выбирая эти параметры жёсткости, мы имеем возможность наблюдать как за внутренними областями, так и за молекулой в целом.

Спиновая диффузия и параметр «Зсткости зависят только от структуры молекулы и мало чувствительны к тому в какой воде -лЗгкой или тяжЭлой - растворйн белок.

В этой же -главе описаны технические подробности всех экспериментальных методик, применяемых в данной работе, охарактеризованы белки и другие препараты, а так же приборы, с помощью которых проводились исследования.

Во второй главе представлены результаты исследования спиноеой диффузии в различных глобулярных белках при воздействии на них высоких температур. Были исследованы: небольшие белки - 6 + 7кД -кардиотоксин, Сго-репрессор фага Л. и его мутанты; "классические" белки, содержащие Б-Б связи - лизоцим и рибонуклеаза А; средние белки - 12+16кД - апомиоглобин, полностью а-спиральный белок, би-биназа из ВасИиз 1тЛегтеб.1па р7, р-структурный белок без Б-Б связей; крупные белки - 25+30кД - карбоачгидраза В, суперспиральный фрагмент а-тропомиозина. Кроме того, были исследованы белки, которые по данным других методов не имеют структуры: лизоцим и

рибонуклеаза с восстановленными Э-Б связями, а так же апоцитохром С.

Зависимости параметра ж9сткости от температуры для большинства указанных белков, при используемом в работе тэмпературнвм разрешении, представляют собой вогнутые монотонно-убывающие кривые Сдр и причём, значения Сдг лежат, почти для всех белков, выше

значений вд-^. При определенных температурах, как правило, соответствующих концу денатурационного перехода на калориметрических кривых, значения Сд^ и СА1 становятся равными.

Однако даш некоторых белков зависимости параметра жесткости от температуры проявляют монотонность не во всем температурном диапазоне. Так например, для рибонуклеазы А наблюдается небольшой скачок уменьшения значений Сд^, при температуре, соответствующей полупереходу на калориметре (рис.2), после чего температурные из-

Рис.2. Зависимость параметра жесткости от температуры для рибонуклеазы А (В20; рН 3,2). А - 0А1;

В-°Аг-

менения оказываются вновь монотонно убывающими, но значения становятся меньше значений Сд^, указывая на то, что сближенность участков полипептидной цепи, которые состоят, в основном, из алифатических аминокислотных остатков становится несколько больше, чем для участков, содержащих ароматические аминокислотные остатки.

Для суперспирали фрагмента а-тропомиазина, наблюдаются зависи-

мости другого типа, не вогнутые, а выпуклые (рис.3) с явными отличиями в поведении между (}. и б,-,, что указывает на несимбат-

ность теплового разворачивания в разных частях суперспирали. Как было выяснено, такой характер поведения параметра жёсткости, связан с тем, что процесс расплетания суперспирали (тепловой денатурации) проходит ряд последовательных стадий, каждая из которых может быть охарактеризована жесткой конформацией, определяемой окружением единственного тирозина-67.

Вогнутые зависимости параметра жесткости от температуры имеют так же мутантный аналог Сго-репрессора фага у которого в 55 положении валин заменён на цистеин, и в димере две мономерных един ицы скреплены Б-Б связью. В отличие от димера из дикого типа, у мутантного аналога на 10К увеличивается термостабильность, и появляется еще один калориметрический пик при более высоких температурах.

С помощью двумерной ЯМР спектроскопии удалось показать, что гантелеобразная структура мутантного димера, практически иденти-

чна структуре димера дикого типа. Поэтому увеличение термостабильности и появление второго калориметрического типа связано с мощным стабилизирующим действием Б-Б связи в поддержании структуры С-концевой части голипептидной цепи, которая в этом случае становится обособленным субдоменом, способным плавиться кооперативно.

Обращает на себя внимание увеличение термостабильности в одной области молекулы за счет структурных изменений в других областях. Так, образование Б-Э связей в С-концевой части мутантного Сго-репрессора увеличивает термостабильность глобулярной части. Точечные аминокислотные замены в другом аналоге - Сто 07, так же приводят к заметному увеличению термостабильности. Аналогичное, как бы индуцированное, влияние отмечено и при разворачивании суперспирали фрагмента СШ А а-тропомиозина.

Таким образом, если процесс тепловой денатурации проходит без промежуточных стадий, форма кривой температурной зависимости параметра жесткости - вогнутая, если есть промежуточные стадии, то - выпуклая.

Для некоторых нативннх белков (карбоангидраза, апомиоглобин, а -лактальбумины) нельзя получить полную температурную зависимость параметра жесткости, потому что начиная с некоторых температур происходит сильная агрегация. Тем не менее, начальный участок температурной зависимости представляет собой вогнутую кривую. Такие же характеристики получены для алифатических протонов апомио-глобина в присутствии 6,7М гуанидингидрохлорида.

Все эти данные говорят о том, что при тепловом воздействии существует процесс, как бы внешний, общий для всех белков, модулирующий внутримолекулярное, индивидуальное для каждого белка тем-

пературное поведение.

Таким процессом может быть только движение молекулы, как целого, определяемого временем вращательной корреляции тс, которое в свою очередь согласно соотношению Стокса-Эйнштейна, пропорционально вязкости и обратно пропорционально температуре: тс~т)(Т)/Т.

Вязкость, в частности, вязкость воды также является функцией температуры. Зависимость т0 от Т довольно легко можно представить в координатах С и Т, как это показано на рис.4. Эту зависимость представляет самая верхняя кривая, изображенная толстой линией, а далее представлены зависимости параметра жесткости от температуры, для разных белков и разных состояний белков. Сравнивая все Рис.! Зависимости параметра жесткости от температуры для разных белков. Самая верхняя (утолщенная) кривая -Ар (Е-В) фрагмент РтЫ А; 2- Аг чел. лактальбуыиа, рН 2; 3- Аг Сго (ЗУ; А- Аг апомиоглобин рН 3,7; 5- Аг ША рНЗ,4; 6- А1 апомиоглобин 6,4М 6(111(31; 7- Аг лизин рН 1,9, восстав. Э-Б связи.

173 II] 293 303 313 333 333 3*3 353 363 Т

эти кривые видим, что, действительно, общая тенденция монотонно убывающей, вогнутой зависимости определяется температурным поведением вязкости раствора для плотного молекулярного шарика. А различия связаны с внутренними структурными особенностями белков.

Таким образом зависимость параметра жесткости от температуры отражает процессы внутренней динамики белковой молекулы. При температуре тепловой денатурации значения параметра жесткости, изме-

ренные по ароматической части спектра, становятся равными значениям, измеренным по алифатической части спектра: сдг=сдх^°

Заметная разница в значениях параметров кЭсткости - Сдр > вд^, при общем их высоком уровне, характерна только для белков обладающих структурной упорядоченностью: наличием гидрофобных областей, в которые часто входят ароматические аминокислотные остатки.

Следует отметить, что существуют белки у которых СД1 > Сдр. В этом случае ароматические аминокислотные остатки не входят в обособленные гидрофобные кластеры, а как бы распределены го перифи-рии глобулы, но, по-видимому, такие белки являются редкими, из исследованных в данной работе, только биназа обладает указанными свойствами. Интересно, что даже апоцитохром С, не имепций ни какой структуры по данным других методов, имеет бдр > СА1, т.е. гидрофобное ядро, соответствующее 1/3 веса всей молекулы. Отсюда следует вывод, что не вся молекула представляет собой неупорядоченный клубок, параметр жесткости определяется нэ только стабильной структурой типа а-спиралей и р-структуры, р фиксированными" водородными связями, но и более слабыми взаимодействиями, способными компактизовать какие-то участки полипептидной цепи.

Температурная зависимость параметра жбсткости, такая же как для большинства белков, а ^дг=Од1ИО при 316К. То есть, при 316К молекула апоцитохрома С приобретает свойства денатурированной молекулы. Условие Сд^Сд^,I означает, что в кавдый данный момент времени может существовать пространственная сближенность опреде-л8нных участков голипетидной цепи, которая может быть топологически близкой нативным элементам, но при больших временах, необходимых для получения спектра, вероятность существования каждого из элементов становится одна и таже. То есть, это условие означа-

вт усреднЗнную по ансамблю, одинаковую вероятность существования различных, возможно нативоподобных элементов, имеющихся в структуре нативной молекулы. ОпределЭнное таким образом состояние можно обозначить как неупорядоченный клубок, имея ввиду и одинаковое для всех участков полипептидной цепи время корреляции, равное времени корреляции белка как целого.

В наших экспериментах зафиксировано три возможных продолжения температурной эволюции неупорядоченного клубка. Первое - условие ^*Аг=СА1 сохраняется до самых высоких температур, т.е. неупорядоченный клубок является конечной стадией эволюции белковой глобулы. Второе - при более высоких температурах: вдр^дх■ т-е- сохранение некоторой остаточной сближенности (остаточной структуры) каких-то участков полипептидной цепи, содержащих, в основном, алифатические аминокислотные остатки. Третье - сдг=сд1=0. и ПРИ высоких температурах наблюдается инверсия знака ЯЭО для сигналов протонов метиленовых групп, непосредственно связанных с метилами в остатках валинов, изолейцинов и лейцинов. Это означает, что неупорядоченный клубок, характеризуемый как единая кооперативная система единым временем корреляции молекулы как целого, при более высоких температурах приобретает очень высокую подвижность отдельных участков полипептидной цепи, и эти участки проявляют свойства как бы отдельных малых молекул ( ытс<<1 ), не связанных друг с другом в единую кооперативную систему и поэтому проявляющих положительный эффект Оверхаузера.(см. рис.5.).

Инверсия знака ЯЭО наблюдается при тепловой денатурации су-персшрали США а-тропомиозина, лизоцима, однако не наблюдается для апоцитохрома, апомиоглобина, рибонуклеазы А даже при восстановлении Б-Б связей.

Рис.5. Спектр ЯЭО лизоциыа (Б^О, рН 1,4; Т=353К) в области поглощения протонов метальных и иегаленовых групп боковых цепей алифатических аминокислотных остатков.

2.0 1.5 1.0 0.5 РРМ

В третьей главе представлены результаты исследования спиновой диффузии в белках, при воздействии на них различных денатурантов.

Рибонуклеаза А, лизоцим, апомиоглобин проявляют в спектрах ЯЭО спиновую диффузию при низких и комнатных температурах в присутствии более 6 Ы гуанидингидрохлорида. Апоцитохром С так же проявляет спиновую диффузию в присутствии более 6 М мочевины.

Характерным является понижение уровня спиновой диффузии с увеличением температуры. Но вот инверсии знака ЯЭО, ожидаемой для более "денатурированной" гуанидином рибонуклеазы не отмечено, даже восстановление S-S связей и присутствие 6 М мочевины не приводит к этому эффекту, также как и в случае апоцитохрома С и апоми-оглобина в присутствии высоких концентраций денатурантов. Однако, этот эффект наблюдается для карбоангидразы при Т=345К в присутствии 6,4 М гуанидингидрохлорида.

Таким образом, инверсия знака ЯЭО, не зависит ни от молекулярной массы, ни от наличия S-S связей, ни от присутствия сильных денатурантов, а зависит только от подвижности определенных участков полипептидной цепи, определяемой последовательностью амино-

18

кислотных остатков. Как показано на примере лизоцима, если этот эффект проявляется для нативного белка при тепловом воздействии, то он есть и в присутствии денатурантов и при разрушении Б-5 связей, причем температура, при которой происходит инверсия знака ЯЭО во всех этих случаях меняется незначительно. Если же этот эффект не наблюдается при тепловой денатурации нативного белка (или белка не обладающего уникальной структурой, но без каких-либо дополнительных денатурантов), то, по всей видимости, никакие дена-туранты или химические модификации, не нарушающие целостности полипептидной цепи, не приведут к этому эффекту.

При титровании нативного белка мочевиной наблюдаются зависимости параметра жесткости от концентрации денатуранта, характерные для кооперативного разворачивания белка, получаемые любым другим методом - сигмоиды (рис.6).

Рис.6. Зависимость параметра жесткости от

с

концентрации мочевина: 1а- и 16- 0А1 для с рибонуклеазы А; За-О^, и 26- для Сго-реп- с рессора фага X.

Рибонуклеаза А проявляет высококооперативные свойства, весь переход завершается между 2,7 и 3,1 М мочевины, причем так же как и в случае тепловой денатурации в конце перехода - сдх>саг"

Сго-репрессор фага проявляет более пологие характеристики перехода из нативного в денатурированное состояние, но так же как

и при тепловой денатурации, конечное состояние характеризуется условием Сдр ~ Сд^.

Из рассмотрения зависимостей параметра жесткости от концентрации денатурантов следует, что конечные денатурированные состояния является такими же, как и при тепловой денатурации, хотя путь перехода может быть разным в том и другом случае. Кроме того, становится очевидным, что если белок обладает стабильной структурой, то разрушение денатурантами изменяет параметр жесткости сигмои-дально. А вот в апоцитохроме С, который не обладает вторичной структурой, хотя, как показывает метод спиновой диффузии, имеет заметное количество сближенных участков полипептидной цепи, составляющих, как бы, ядро, - при добалении мочевины, вто ядро начинает плавиться сразу же и при концентрации 0,24 М. уровень параметра жесткости уменьшается в/двое (рис.7).

Т = 293 К).

Т.е. это ядро стабилизировано очень слабыми силами и, вероятно, эта стабилизация имеет энтропийный характер.

По характеру температурных зависимостей параметра жесткости, такого вывода делать нельзя, хотя низкий уровень параметра жесткости для данного белка может говорить именно об этом.

В четвертой главе представлены результаты исследования спиновой диффузии в глобулярных белках при их ассоциации, стимулированной теплом.

Исследование температурного поведения параметра жесткости для апомиоглобина, проявляющего характеристики нативного глобулярного белка (рН>5), выявило возрастание параметра жесткости при температурах близких к температурам полуперехода отмечаемого калори-мером. Однако из-за высокоэффективной агрегации, полную температурную зависимость получить не удалось. Тем не менее, стало ясно, что при ассоциации параметр жесткости, измеренный по ароматической и алифатической части спектра, может возрастать.

Наиболее характерным является поведение параметра жесткости при тепловой ассоциации биназы - бактериальной рибонуклеазы из Вас Низ 1г^егте<Циз Р7.

Интересно, что до концентрации 8 - 11мг/мл, биназа не проявляет склонность к агрегации в диапазоне температур 273К - 365К, и имеет характеристики обычные для глобулярных белков, хотя в отличии от всех остальных исследованных белков уровень значений оказывается больше уровня значений С^. Однако, как и для всех белков существует температура при которой СД1=0Дг, и эта температура соответствует полупереходу на калориметрических термограммах.

При концентрациях больше 15 мг/мл, по спектрам ЯМР можно отметить лишь тепловую денатурацию, с температурой полуперехода ~328К, а вот параметр жесткости проявляет необычное поведение, указывающее на то, что при температурах вблизи полуперехода начинается межмолекулярная ассоциация, приводящая к увеличению параметра жесткости (рис.8). При температуре полуперехода в процессе ассоциации участвует половина молекул, т:к. значения параметра жесткости, приобрели лишь половину своего максимального значения, которое достигается в конце калориметрического перехода. Это оз-

начает, что в процесс ассоциации вовлекаются только денатурированные молекулы. Кроме того, становится ясно, что ассоциаты имеют несколько иные принципы построения, чем нативные молекулы, потому что разрушаемые внутренние области молекулы, для которых параметр жесткости больше, чем для периферии (сд1>0др)> в ассоциате оказываются периферийными, а области, бывшие периферийными в нативной молекуле, становятся внутренними ) в молекулярном ассоци-

ате.

Зная численные значения параметра жесткости, можно, оценить среднюю величину числа мономеров, составляющих ассоциат. В данном случае ассоциат построен из 5-7 молекул биназы.

Малые молекулы, компоненты буферов (такие, например, как ацетат) проявляют сигнал в спектре ЯМР, но в спектры ЯЭО они вклады не дают. Это означает, что, как и положено буферам, они не взаи-мо/действуют с белком. Так это было и в случае нативной биназы. Однако, при образовании ассоциата, в спектре ЯЭО появляется сигнал ацетата при "2 мд показывающий, что ацетат взаимодействует с молекулярным комплексом. По-видимому, ассоциат имеет микрополос-

ти, способные удерживать молекулы ацетата или вода, что является необходимым в поддержании структуры данного молекулярного комплекса.

Похожая картина сопровоадает и тепловую денатурацию (Е-В)-фрагмента протеина А. (Е-Б)-фрагмент представляет собой небольшую часть протеина А, состоящую из Е и Б субдоменов, связанных между собой в единую полипептидную цепь. В этом случае рост параметра жесткости также связан с ассоциацией. Однако, если график температурной зависимости параметра жесткости для биназы имеет центральную симметрию, то в случае (Е-Б)-фрагмента, такая симметрия отсутствует, т.к. достигнув максимального значения, параметр жесткости начинает падать не сразу, а сохраняет этот уровень при повышении температуры. Такая затяжка связана с денатурацией лишь одного из доменов, что и приводит к образованию ассоциатов, а при более высоких температурах денатурирует другой домен, но его денатурация не приводит к образованию ассоциатов, а, возможно, и ослабляет способность к ассоциации.

Следует отметить, что в этом случае, при образовании молекулярного ассоциата, не существует полостей, которые бы удерживали ацетат, имеющийся в растворе.

Выяснилось, что яри ассоциации происходит сближение и увеличение значений СД1 и Сд^, поскольку при межмолекулярном взаимодействии растет жесткость тех участков молекул, которые.осуществляют межмолекулярную связь. Этот процесс как правило, кооперативный, и участки молекул, которые участвуют в межмолекулярных связях, могут быть иными, чем те, которые образуют гидрофобные области в нативном состоянии.

В пятой главе изложены результаты исследования спиновой диффу-

зии в белках в состоянии расплавленной глобулы.

Карбоангидраза В при рН $ 4, апомиоглобин при рН « 4,8 и а-лактальбумины коровы и человека при рН~2 находятся в состоянии расплавленной глобулы. В спектрах ЯМР это проявляется в отсутствии вторичных химических сдвигов, что характерно для денатурири-рованного состояния. Однако значения параметра жесткости при температуре 293К в этом состоянии мало отличаются от значений в на-тивном состоянии. Таким образом, жесткость и, по-видимому, компактность молекулы в состоянии расплавленной глобулы такая же как для нативной, хотя внутренность расплавленной глобулы доступна для растворителя, что хорошо проявляется в спектрах ЯМР по исчезновению сигналов 1Ш-цротонов при дейтерозамещении. Это означает,

что расплавленная глобула представляет собой структуру, в которой

*

боковые цепи аминокислотных остатков имеют подвижность большую чем в нативном состоянии, в результате чего возможно проникновение воды во внутрь глобулы, которая может, с одной стороны, ослабить водородные связи, присущие структуре данного белка, а с другой стороны, сама стать стабилизирующим фактором в структуре нового состояния.

По-видимому баланс сил между водородными связями, удерживающими структуру и дистабилизирующим влиянием на них молекул воды, создаЭт этот динамический тип структуры - расплавленная глобула. На то, что это динамический тип структуры, указывает отсутствие характерных сигналов в области поглощения а-протонов р-структуры, хотя имеет место широкий сигнал, представляющий собой огибающую уширенных сигналов.

Такой же вывод можно сделать из рассмотрения температурного поведения спектров ЯМР для а-лактальбуминов. Дело в том что, даже

при высоких концентрациях денатурантов и высокой температуре а-лактальбумины имеют остаточную структуру, в которую входит один из тирозиновых остатков, сигналы которого расположены обособленно и хорошо наблюдаются. При низких и комнатных температурах эти сигналы уширены настолько, что их невозможно детектировать. По мере повышения температуры уширение уменьшается. При температуре выше 345К, происходит тепловая денатурация, в результате чего разрушаются все структурные элементы, кроме указанного, а полуширина сигналов тирозинового остатка, становится нормальной.

Температурная зависимость параметра жесткости для состояния расплавленной глобулы мало чем отличается от таковой для нативно-го состояния и так же имеет температуру, при которой <* сА1 и эта температура близка к температуре конца денатурации для натив-ных форм.

Только для а-лактальбумина человека эта температура существенно меньше чем для нативного состояния и соответствует температуре денатурации ароформы а-лактальбумина коровы. Это может означать, что у кислой формы а-лактальбумина человека сильно ослаблены ли-гандные связи, удерживающие кальций, что и приводит к дополнительной дестабилизации.

Температурная зависимость параметра жесткости для карбоангид-разы имеет хотя и монотонную, но выпуклую форму кривой, что может быть связано с существованием более жестких комформаций при более высоких температурах, то есть, переход в состояние неупорядочного клуба проходит через промежуточные более жесткие конформации.

На то, что состояние расплавленной глобулы, так же как и на-тивное, отделено от состояния- неупорядоченого клубка достаточно высоким энергетическим барьером, может указывать сигмоидальная

форма зависимости параметра жесткости от рН, полученная для апо-миоглобина (рис.Э). Эта зависимость показывает, что молекула апо-

Рис.9. Зависимость параметра жесткости от рН для апомиоглобина (В^О, Т=- 29ЭК).

А " °Аг' В " °А1'

миоглобина в состоянии расплавленной глобулы, действительно обл а-дает структурой, поскольку для а-спиральных белков в спектре ЯМР нет простых критериев существования вторичной структуры, особенно в отсутствии вторичных химических сдвигов. На существование структуры может указывать лишь высокий, такой же как в нативном состоянии, уровень параметра жбсткости.

Значительное изменение параметра жесткости, с рК~3,2 связано с разрушением большой части а-спиралей и ослаблением субдоменных взаимодействий, нулевого значения параметр не достигает ни при высоких температурах, ни при высоком содержании гуанидингидрохло-рида. Это указывает на возможное содержание флуктуирующих а-спиралей, т.е. на существование элементов топологически близких на-тивным.

Данные, полученные для кислой форты а-лактальбумина человека при титровании мочевиной, так же говорят о существовании заметного энергетического барьера между состояниями расплавленной глобулы и неупорядоченного клуба (рис.10).

Ряс.10. Зависимость

с

параметра жесткости от концентрации мо-

о.

чевины для а- л акт-альбумина человека, о.:

Лх- 0^, А1- 0А1; ^

(рн а, т=гэзк). 1 2 " * 5 «7 « 9>

Параметр жесткости меняется кооперативно в области концентраций мочевины 5,8 - 7,2М и не достигает уровня в ~0,12 даже при 9Ы мочевины. Это означает, что структура расплавленной глобулы а-лактальбумина очень прочная и не может быть полностью разрушена. Разрушается только около половины всей структуры, причВм наиболее глубоким изменениям подвергаются области, включающие ароматические остатки, как и для нативной формы рибонуклеазы Д.

Таким образом, близкий к нативному уровень параметра жбсткости, при отсутствии в спектре вторичных химических сдвигов, является достаточным условием для существования некоторой части вторичной структура и глобулярной укладки полипептидной цепи.

Вторичная структура не является столь же стабильной, как в нативной форме, что приводит к недостаточному внутри- и межсубдо-менному взаимодействию и является препятствием к образованию нативной - уникальной, для каждого белка, структур!.

В шестой главе представлены результаты исследования спиновой диффузии при холодовой денатурации апомиоглобина и р-лактглобули-на.

Дпомиоглобин (рН ~ 5) по спектрам ЯМР представляет собой нати-воподобное состояние с уникальной структурой, следствием которой является наличие вторичных химических сдвигов.

При понижении температуры происходит эволюция спектров ЯМР -такая же как и в случае повышения: исчезновение вторичных химических сдвигов. Калориметрические исследования показали, что имеет место фазовый переход первого рода.

Исследование этого процесса с помощью метода спиновой диффузии обнаружило, что температурное поведение параметра жесткости при рН 5,15 и при рН 4,05 (в нативоподобном и в состоянии расплавленной глобулы, соответственно) оказалось идентичным, и не при какой из температур не наблюдалось равенства и СД1. Это означает, что состояние неупорядоченного клубка при холодовой денатурации не достигается и конечным состоянием для апомиоглобина при низких температурах является состояние расплавленной глобулы.

При рН 2 и ЗМ мочевины р-лактглобулин при нормальных температурах проявляет физикохимические характеристики нативного белка. В спектрах ЯМР нет разницы для белка в данных условиях и для белка при рН 2 или рН 7 без мочевины. Однако при указанных условиях р-лактглобулин испытывает холодовую денатурацию, которая хорошо проявляется в спектрах ЯМР (рис.11).

Рис.II. Спектры 1Н-ШП> р-

Зависимость параметра жЗсткости от температуры проявляет ряд особенностей, которые не отмечались для других белков (рис.12). Так, вблизи 282К проявляется особенность в виде максимума, харак-

лактглобулина (Б^О, рН 2, 2М игеа). А - Т= 306К, В-Т= 273К.

жесткости от температуры для р-лактглобулина (D20, рН 2, 2IÍ urea). Аг - G. , Al - G..

Рис.12. Зависимость параметра 0

Аг

'Al" .

тарная для разрывных функций и, около температуры 305Н, наблюдается сближение значений и СД1 При температурах меньше 280К р-лактглобулин по всем своим физико-химическим параметрам проявляет свойства денатурированного белка, но значения и заметно различаются, что по критериям метода спиновой^Фйгзии не соответствует состоянию неупорядоченного клубка. Полностью неупорядоченное состояние проявляет незначительный рост параметра жЗсткос-ти при понижении температуры, но никогда не превышает уровня 0,3, причем значения и СД1 близки во всем диапазоне температур, так что разность Iсаг~сах I + 0.05, как например, в случае р-лактглобулина в присутствии 9,5 мочевины или апоцитохрома С при 7М мочевины.

Таким образом, состояние в которое переходит р-лактглобулин при холодовой денатурации проявляет свойства расплавленной глобулы, т.е. часть вторичной структуры сохраняется и является основной для сохранения глобулы.

Возможно ли разрушение вторичной структуры низкой температу-

рой? Возможно, но при дополнительной дестабилизации молекулы мочевиной. Так, при концентрации мрчевины ~6М р-лактглобулин при комнатных температурах, в спектрах ЯМР не содержит вторичных химических сдвигов, указывая на потерю уникальной структуры. Параметры жбсткости указывают на то( что часть молекул сохраняет вторичную структуру, которая плавится (G^" G¿1).при высоких и низких температурах (рис.13).

G

Рис.13. Зависимость

0,3

параметра кесткости от температуры для 0-г в-лактглобулина (рН

0,1

2, 5,6М urea, DgO).

Исследуя апомиоглобин при переходе в состояние расплавленной глобулы под действием температуры и рН, было обнаружено, что разрушение уникальной структуры никак не отражается на параметре жесткости. Казалось бы, молекула^приобретая уникальную структуру, получает дополнительную стабилизацию структуры всей молекулы, ведь как следует из калориметрии - холодовая денатурация, так же как и тепловая - фазовый переход первого рода с почти одинаковыми энергетическими затратами. Поскольку параметр жёсткости лучше всего отражает жёсткость и компактность молекулы, то, вероятно, в апомиоглобине они не меняются за счёт компенсации при взаимодействии с растворителем.

В р-лактглобулине вклад сил в стабилизацию глобулы, поддерживающих уникальную струтуру более значительный, поэтому параметр жёсткости проявляет указанные выше особенности. Так^ сближение значений и при Тт=306К (температура максимальной стабиль-

ности) и характерный изгиб кривой показывающий изменение

крутизны, связан с изменением всех термодинамических параметров при переходе через температуру максимальной стабильности (Тш) уникальной структуры, близкую к температуре инверсии, при которой энергия Гиббса перестаЭт возрастать и начинает убывать с ростом температуры. При Тщ разность энтропии перехода из нативного в денатурированное состояние обращается в нуль.

Другая особенность, при температуре меньше 280К, происходит из-за разрушения уникальной структуры, но с сохранением вторичной и глобулярности. Жесткость и компактность этого состояния несколько меньше, что и отражается в параметре жесткости.

Итак, кроме факта существования явления холодовой денатурации, показанного экспериментально, при исследовании этого явления оказалось, что конечным состоянием, в которое переходит белок из нативного, является состояние раплавленной глобулы. Как следует из калориметрических данных, этот переход является фазовым переходом первого рода.

В пятой главе сделана попытка показать, что переход из состояния расплавленной глобулы в неупорядоченное состояние также фазовый переход и, если это справедливо, то состояние расплавленной глобулы есть стабильное фазовое состояние на пути перехода из нативного в неупорядоченное и обратно.

Кроме того из представленных данных следует, что фазовый переход первого рода может происходить благодаря разрушению только уникальной структуры и возрастанию подвижности боковых групп и элементов, составляющих вторичную и третичную структуру, которые могут сохраняться и иметь топологию близкую к нативной, как это, судя по параметру жбсткости, имеет место для апомиоглобина.

В седьмой главе представлены экспериментальные результаты, связанные с измерением молекулярной массы, анализом конфигураций белковых молекул и предпринята попытка термодинамического обоснования параметра жбсткости.

При исследовании спиновой диффузии в различных глобулярных нативных белках было обнаружено, что е5 эффективность зависит от того насколько молекула большая и тяжблая. Зная, что плотность упаковки глобулярных белков величина почти постоянная, а значит молекулярная масса однозначно определена через объбм белковой глобулы, который определяет время корреляции движения молекулы как целого через соотношение Стокса-Эйнштейна, появилась возможность связать молекулярную массу с параметром жбсткости. Дело в том, что параметр жбсткости, являясь, по сути, мерой стационарного эффекта Оверхаузера, в случае больших молекул (ы^т2>>1), оказывается также прямо связанным с тем же временем корреляции.

Зависимость параметра жбсткости от молекулярной массы в логарифмических координатах хорошо аппроксимируется линейной зависимостью и состоит из двух участков с разной крутизной (рис.14).

Рис .14. Зависимость параметра i.s жесткости от молекулярной мае- 11 сы различных глобулярных бел- 1.1 ков в логарифшческих координатах. RNA - рибонуклеаза А, РОК - фосфоглицераткиназа, 05 IgG - иммуноглобулин; (DgO, 03 Т=293К). 01

».S 9.0 ».5 И.0 W.S 11.0 11.S In

Аналитическое соотношение, связывающее параметр жЭсткости и

>

молекулярную массу, очень простое: 0-(М/Мо) , где показатель степени - к для более крутого участка оказывается порядка 0,83; М0-молекулярная масса такого белка, параметр жесткости которого равен единице. Для участка с к ~0,83 Мо=44000 дальтон. Однако параметр жЗсткости, измеренный для фосфоглицераткиназы (Мр= 45000), оказался значительно меньше единицы, то же относится и к иммуноглобулину (1^=150000), поэтому они расположены на участке с меньшей крутизной. Несоответствие между ожидаемым и реальным результатом объясняется тем, что, начиная с молекулярной массы ~30000 Дальтон (точка изменения крутизны на зависимости рис.14), в белковой глобуле появляются области с очень низкой подвижностью, что в спектре ЯМР проявляется в виде очень широкого малоинтенсивного сигнала, интегральная интенсивность которого не может быть зафиксирована на фоне интенсивных сигналов от высокоподвижных протонов.

О ростом молекулярной массы этот процесс усиливается, так, например, для фосфоглицераткиназы высокоподвижными можно считать 70% от общего числа всех протонов, а для иммуноглобулинов - лишь 25%.

Спиновая диффузия может иметь место лишь в тех участках полипептидной цепи, которые сближены и достаточно жбстко связаны между собой. Если часть цепи подвижна и не связана с основной глобулой образуя "хвост" или "ручку гантели", то спиновая диффузия на таком участке прервЗтся, и значит параметр жЗсткости может умень-: шиться. Поэтому, если для белка известнамолекулярная масса, и она оказывается на несколько килодальтон больше, чем получающаяся на основе параметра жЗсткости, то это означает, что часть массы

"уносится" подвижным участком полипептидной цепи по типу "хвоста" или "ручки гантели" (спектроскопический деффект массы- СДМ).

Исследуя спиновую диффузию (Е-В)-фрагмента протеина А и Сго-репрессора, был обнаружен СДМ в 3-4 кД, что связывается с ганте-леподобной конфигурацией этих молекул. Для мономерного аналога Сго-репрессора также обнаружен СДМ ~ 1,5 кД. Эта величина "уносится" за счВт подвижного "хвоста", образующегося при блокировании С-конца белка определённым пептидом, который и препятствует димеризации.

О другой стороны, можно наблюдать и увеличение массы, как ето имеет место при образовании молекулярных ассоциатов или при взаимодействии белка и другой достаточно крупной (~1кД) молекулы.

При исследовании состояния расплавленной глобулы было обнаружено, что параметр жёсткости сохраняется практически неизменным при переходе из натинного в расплавленную глобулу для а-лакталь-буминов, что говорит сохранении компактности и жёсткости глобулы. В то время как для карбоангидразы, в процессе такого перехода, параметр жёсткости уменьшается, что может говорить о приобретении глобулой одной из двух упомянутых конфигураций.

Таким образом, сравнительное исследование различных глобулярных белков и их различных состояний показало, что спиновая диффузия существует только в тех участках полипептидной цепи, которые достаточно жестки и компактны, т.е. упорядочены. Упорядоченность характеризуется энтропией, поэтому между параметром жёсткости и энтропией должна существовать связь. Точной зависимости не установлено, но из представленных экспериментальных результатов следует, что значения параметра жёсткости уменьшаются при денатурации, т.е. при увеличении неупорядоченности. Поэтому параметр

жбсткости можно попытаться представить обратно пропорциональным энтропии. Термодинамический анализ экспериментальных результатов, сделанный в предположении: 0 ™ 1 /Б не противоречит ни одному из полученных результатов и выводов, поэтому наличие функциональной связи меаду параметром жЭсткости и энтропией можно считать достаточно обоснованной.

вывода

1.На основе известных явлений спиновой диффузии и ядерного эффекта Оверхаузера (ЯЭО) предложен новый вариант ЯМР-экспериментов для исследования структурно-динамических свойств глобулярных белков, названный методом спиновой диффузии.

Показано, что спиновой диффузии, проявляющейся в спектрах ЯЭО глобулярных белков можно поставить в соответствие такое реальное физическое свойство исследуемой молекулы, как пространственная сближенность различных участков полипептидной цепи, элементы которых имеют ограниченную взаимную подвижность. В нативном состоянии спиновая диффузия связана с такими свойством как компактность.

Для измерения эффективности спиновой диффузии введена величина - параметр жбсткости (С), которая может быть функцией любого внешнего воздействия, вызывапцего изменения в структуре молекулы.

Параметр жЭсткости представляет собой отношение интегральной интенсивности сигналов, измеренной в какой-либо части спектра спиновой диффузии, к интегральной интенсивности, измеренной в той же части обзорного спектра.

В работе использовались параметры жбсткости: и

3Аг и 3А1 интегральные интенсивности сигналов,

измеренные в спектрах спиновой диффузии в области поглощения протонов боковых цепей ароматических аминокислотных остатков ("7,5+ 6,5 мд) и в области поглощения метиленовых протонов алифатических аминокислотных остатков ("2,9+1,4 мд), соответственно. и - те же характеристики, но измеренные в обзорных спектрах.

2.Для большинства глобулярных белков справедливо следующее соотношение между параметрами жёсткости: > СД1, которое отражает тот факт, что ароматические аминокислотные остатки связаны с менее подвижными структурными образованиями, чем метиленовые группы алифатических остатков.

При нагревании растворов белков происходит уменьшение значений параметров жбсткости, обусловленное как увеличением внутримолекулярной подвижности, так и увеличением подвижности белковой молекулы как целого, за счбт уменьшения вязкости растворителя. Одновременно происходит и сближение значений парметров жбсткости С^ и СД1. При температурах денатурации состояние молекулы характеризуется соотношением: С^о-С^, что связано с ослаблением внутримолекулярных связей. Для одних белков это состояние оказывается конечным и дальнейшее повышение температуры его не изменяет. Другие белки при увеличении температуры характеризуются соотношением: что указывает на существование остаточной структуры. Третий тип белков, при увеличении температуры, характеризуется изменением знака ЯЭО, что связано со значительным возрастанием межпротонных расстояний и внутримолекулярной подвижности, и, по-видимому, наилучшим образом соответствует состоянию неупорядоченного клубка.

3.При увеличении концентрации денатурантов в растворах нативных белков значения параметров жбсткости меняются сигмоидально по ти-

цу "вс5 или ничего", что определяется кооперативным возрастанием межпротонных расстояний и внутримолекулярной подвижности.

Для некоторых белков, в растворе 6М гуанидингидрохлорида при температурах: 275К - 293К, наблвдается спиновая диффузия, которая связана с сохранением пространственной сближенности некоторых участков полипептидной цепи и только значительное повышение температуры может е8 разрушить.

4.Значения парметров жбсткости для нативного состояния и состояния расплавленной глобулы близки и заметно больше значений, характеризующих денатурированное состояние. Однако в отличие от нативного, состояния - расплавленной глобулы и денатурированное -не проявляют вторичных химических сдвигов в спектрах ЯЫР высокого разрешения.

Для состояния расплавленной глобулы наблвдается кооперативное увеличение межпротонных расстояний и внутримолекулярной подвижности при увеличении концентрации денатурантов, как и в случае нативного состояния.

5.При тепловой денатурации некоторых белков, наблюдается образование белковых ассоциатов, которое сопровождается резким возрастанием значений параметров жбсткости в узкой области температур, середина которой совпадает с температурой полуперехода на термограмме денатурации соответствующего белка. Причбм меньший по значениям параметр жбсткости, определяпцйся периферийными областями молекулы' растбт значительнее, указывая на резкое уменьшение подвижности тех участков полипептидной цепи, которые участвуют в межмолекулярных взаимодействиях.

6.Для некоторых белков можно наблюдать денатурацию при низких температурах - холодовую денатурацию, сопровождапцуюся фазовым

переходом первого рода как и при тепловой денатурации. Однако в отличий от тепловой денатурации, при холодовой денатурации белок имеет характеристики близкие к состоянию расплавленной глобулы.

Это означает, что при холодовой денатурации разрушается, по-видимому, только уникальная структура глобулярного белка, которая в спектрах ЯМР характеризуется наличием вторичных химических сдвигов, а значительная часть вторичной структуры сохраняется. 7.На основе исследования разных по весу глобулярных белков получена линейная, в логарифмических координатах, зависимость параметра жбсткости от молекулярной массы. Это дабт возможность достаточно точно оценить молекулярную массу глобулярного белка, а также контролировать еб изменения в процессе различных модификаций, превращений и взаимодействий белковой глобулы.

ЛИТЕРАТУРА

1 .Kutyshenko V.P. NMR studiea of с^-microglobulln. 17 Yugosloven-skl almpozij iz bioiizike. Book ol abstracta SFRYu 1986, L-11. 2.Frivalov F.Ii., Grilco Yu.V., Venyaminov S.Yu., Kutyshenko V.P. Cold denaturation oi mioglobin. // J.Mol.Biol. 1986-v.190.-p.487-498.

3.Semisotnov G.V., Radionova N.A., Kutyshenko V.P., Ebert В., Blank J., Ptisyn O.B. Sequental mechanism oi reiolding of carbonic Inhydrase B.// FEBS lett. 1987-у.224-р.9-13.

4.Грико D.M., Привалов П.Л., Веньяминов O.D., Кутышенко В.П. Термодинамическое исследование структуры апомиоглобина. // Биофизика 1988-т.ЗЗ-с.18-26.

5.Griko Yu.V., Privalov Р.1., Venyaminov S.Yu., Kutyshenko V.P. Thermodynamic study of the apomioglobln structure.// J.Mol.Biol. 1988-Y.202-p.127-138.

6. Kutyshenko V.P., KhechinashYili N.N. Proton NMR studies of the denatured state of globular proteins. I.I. The state of thermally denatured rlbonuclease A and lysozime. // Stud. Blophis. 1989-y. 131-p.145-154.

7.Kutyshenko V.P., KhechinashYili N.N. Proton HMR studies of the denatured state of globular proteins. I.II. The state of rlbonuclease A and lysozime In 6M guanidine hydrochloride solution.// Stud. Blophis. 1989-y. 131-p.155-160.

8.Семисотнов Г.В., Кутышенко В.П., Птицын О.В. Внутримолекулярная подвижность белка в состоянии расплавленная глобула. Исследование карбоангидразы В методом 1Н-ЯМР.// Мол.Биология I989-T.23-c.808-815.

9.Радионова Н.А., Семисотнов Г.В., Кутышенко В.П., Уверский В.Н., Болотина И.А., Бычкова В.Е., Птицын О.Б. Стадийность разворачивания карбоангидразы В сильными денатурантами.// Мол.Биология 1989 -т.23-с.683-692.

10.Кутышенко В.П. Исследование апоцитохрома с из сердца лошади.// Биофизика I990-T.35-C.407-409.

11 .Kutyshenko V.P. Spin diffusion as a method to study protein dlnamlcs. Thermal denaturatlon of rlbonuclease A.// Stud. Blophis. 1990-y.139-p.37-42.

12.KlYaeYa L.S., Kutyshenko V.P. On the influence of Internal dlnamlcs on ring curent chemical shifts of the methyl protons In protein 1H NMR spectra.// Preprint 1991 Pushchino.

13.Kutyshenko V.P. Study of sperm-whole apomloglobln by high resolution 1H-NMR method.// Stud. Blophys. 1991-Y.140-p.37-46.

14.Gitelson G.I., Griko Yu.V., Kurochkin A.V., RogoY V.V., Kutyshenko V.P., KirplchnikOY M.P., 'PriYaloY P.L. Two-stage thermal

unfolding of [Cys55]-substituted Ого repressor of bacteriophage X..// PEBS lett. 1991 -y.289-p.201 -204.

15.Кутышенко В.П., Потехин С.А., Смалла К.-Х. Изучение денатурации N-концевого фрагмента а-тропомиозина методом ЯМР спектроскопии.// Биофизика I99I-T.36-C.762-769.

16.Киваева Л.О., Кутышенко В.П. Исследование динамики олигопепти-дов методом ЯМР высокого разрешения.// Деп.ВИНИТИ-* II52-B-9I.

■15с. 15.03.91.

17.Kivaeva L.S., Kutyshenko V.P. Investigation of oligopeptide linamics by high resolution 1H ram.// Preprint 1991-Pushchlno.

18.Кутышенко В.П. Применение метода ЯМР для измерения молекулярной массы глобулярных белков.// Биофизика 1991-т.Зб-с.754-757.

19.Кутышенко В.П. исследование динамики тепловой денатурации му-тантного Сго-репрессора с помощью спиновой диффузии.// Докл. Академ. Наук. 1992-т.322-с.786-790.

20.Klvaeva L.S., Kutyshenko V.P. Anallsls of expanded wings of spectral lines In protein 1H HMH spectrum. 10th Europ. Symp. Po-lym. Spectr.// Abstracts 1992-p.-B26.

27.05.93 r. 3air.5730P. Тир. 100 виз. Уч.-изд.л. 2.0

Отпечатано на ротапринте в ОНТИ ПНЦ РАН