Исследование ненативных форм глобулярных белков методом ЯМР

Прохоров, Дмитрий Анатольевич

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Исследование ненативных форм глобулярных белков методом ЯМР
ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Исследование ненативных форм глобулярных белков методом ЯМР"

На правах рукописи

ПРОХОРОВ ДМИТРИЙ АНАТОЛЬЕВИЧ

ИССЛЕДОВАНИЕ НЕНАТИВНЫХ ФОРМ ГЛОБУЛЯРНЫХ БЕЛКОВ МЕТОДОМ ЯМР

03.00.03 - молекулярная биология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Пущино - 2009

о ч С Г.1 71

003460238

Работа выполнена в Институте теоретической и экспериментальной биофизики РАН

Научный руководитель: доктор физико-математических наук,

Кутышенко Виктор Павлович

Официальные оппоненты: доктор физико-математических наук,

Семисотнов Геннадий Васильевич

доктор биологических наук, Железная Людмила Алексеевна

Ведущая организация: Институт биоорганической химии

им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН (Москва)

Защита диссертации состоится «19» февраля 2009 г. в — часов на заседании диссертационного совета Д.002.038.01 при Институте биофизики клетки РАН по адресу: 142290 г. Пущино, Московской области, ИБК РАН.

С диссертацией можно ознакомиться в Центральной библиотеке ПНЦ РАН. Автореферат разослан « » января 2009 г. Ученый секретарь

диссертационного совета Д.002.038.01, кандидат биологических наук

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Несмотря на 40-летнюю историю, проблема самоорганизации белков остается одной из «горячих точек» молекулярной биологии. Одним из актуальных и важных этапов данного направления является исследование частично денатурированных (ненативных) промежуточных состояний глобулярных белков. В последние годы также существенно возрос интерес к исследованиям, посвященным самоассоциации и агрегации белков. Это связано с тем, что широкий диапазон заболеваний человека, известных как заболевания, связанные с нарушением конформации белка или его сворачивания, проистекают из-за неспособности специфических пептидов или белков принимать нативную конформацию, необходимую для нормального функционирования белка. Накопленные к настоящему времени данные свидетельствуют в пользу модели, в которой формирование фибрилл белков протекает через образование относительно развернутой амилоидогенной конформации, включая многочисленные нейродегенеративные нарушения и амилоидозы. В тоже время множество белков, не имеющих отношения к амилоидной дистрофии, также образуют фибриллы при определенных условиях. Эти белки используют в качестве модели для изучения процессов, приводящих к нарушению сворачивания белков, олигомеризации и образованию фибрилл. Поэтому исследование молекулярных механизмов ассоциации белков и роли растворителя в таких процессах является актуальной задачей для понимания причин образования амилоидов и амилоидо-подобных структур. Однако только ограниченное число экспериментальных методов способно фиксировать влияние растворителя (воду и компоненты, образующие растворитель) на процессы агрегации или самоассоциации белков. Среди них выделяется метод ЯМР высокого разрешения, способный отслеживать взаимодействие молекул растворителя с молекулами белка в режиме реального времени и даже установить некоторые количественные характеристики при таком взаимодействии.

Цель и задачи работы. Основной целью настоящей работы является исследование динамики межмолекулярных процессов, происходящих с частично денатурированными глобулярными белками при взаимодействии с молекулами денатурантов и воды методом ЯМР.

Соответственно цели были поставлены следующие научно-методические задачи:

-методом 'Н-ЯМР провести исследование взаимодействия денатурантов (гуанидинхлорида, мочевины ) с ненативными формами а-лактальбумина человека и карбоангидразы В коровы.

-используя комплекс физических методов ('Н-ЯМР, круговой дихроизм, синхротронное малоугловое рентгеновское рассеяние) провести изучение динамики формирования ассоциатов негативных форм белков, условий, приводящих к самоассоциации, роли растворителя в этом процессе.

-в ходе выполнения работы разработать новые методические подходы для изучения процесса самоассоциации белков и получения информации о коллективных и индивидульных свойствах, входящих в состав ассоциатов, белковых молекул и растворителя.

Научная новизна. В данной работе впервые:

-показано различие в молекулярных механизмах взаимодействия мочевины и гуанидингидрохлорида с белковой молекулой.

-исследована степень и характер вовлечения молекул растворителя в состав ассоциатов в процессе разворачивания белка.

-показан динамический характер взаимодействия молекул белка и растворителя в белковом ассоциате и сделано предположение о причинах, препятствующих образованию протяженных белковых ассоциатов (агрегатов), подобным амилоидным фибриллам.

о коллективных, так и индивидульных свойствах ассоциатов и входящих в их состав белковых молекул и растворителя.

Практическое значение работы. Рассмотренная в работе система карбоангидраза В коровы-растворитель может быть использована в качестве удобной модели в дальнейших исследованиях по выяснению молекулярных механизмов образования амилоидов, приводящих к прионным заболеваниям человека и животных, а как следствие, устранению причин их вызывающих. Таким образом, в перспективе, результаты работы найдут свое применение в биомедицине. Реализованный в работе новый методический подход «внерезонансного возбуждения спиновой диффузии» будет полезен исследователям, занимающихся изучением межмолекулярных процессов в растворе с использованием ЯМР.

Апробация работы и публикации. Основные результаты работы были представлены на: 7-ом международном семинаре по магнитному резонансу. Ростов-на-Дону, 6-9 сентября, 2004; 12-ой всероссийской конференции «Структура и динамика молекулярных систем». Йошкар-Ола-Уфа-Казань-Москва, 27 июня-2 июля, 2005; 4-ом международном симпозиуме "ЯМР в гетерогенных системах", Санкт-Петербург, 2007.

По материалам диссертации опубликовано 9 печатных работ, в том числе 6 статей.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, трех глав, включая литературный обзор, заключения и выводов. Общий объем работы составляет 116 страниц текста, содержит 31 рисунок, 5 таблиц и список литературы из 184 наименований.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Глава 1. Обзор литературы.

В литературном обзоре представлены данные по спиновой диффузии (СД)- от краткой теории до ее использования в исследовании нативных и нентативных состояний белков. Дается представление о параметре жесткости, характеризующим СД и о его связи с компактностью белковой глобулой.

Глава 2. Материалы и методы.

В качестве объектов исследования были использованы хорошо изученные белки- а-лактальбумин человека и карбоангидраза В коровы, любезно предоставленные Н.В. Котовой (Институт белка РАН).

Все ЯМР-эксперименты проведены на спектрометрах WM-400 и "AVANCE 600" фирмы "Брукер" с рабочей частотой для протонов 400 и 600 МГц, соответственно.

Спектры кругового дихроизма регистрировали на спектрополяриметре JASCO-600 в термостатируемых кварцевых кюветах с длиной оптического пути 0.1 и 2.0 мм в дальней и ближней УФ-области, соответственно.

Измерение экспериментальных кривых малоуглового рентгеновского рассеяния синхротронного рассеяния исследуемых растворов карбоангидразы В проводились на малоугловой камере BL-15A Фотонной фабрики (г.Цукуба, Япония).

Глава 3. Результаты и обсуждение.

Известно, что обзорный спехтр (СО) ЯМР белка, находящегося в частично денатурированном состоянии (расплавленной глобулы) становится вырожденным и качественно близким к спектру денатурированного состояния. Для исследования таких промежуточных состояний в рамках ЯМР высокого разрешения был предложен метод спиновой диффузии, который основан на двух хорошо известных явлениях: спиновой диффузии и ядерном эффекте Оверхаузера (ЯЭО). При исследовании белков на современных спектрометрах всегда выполнимо условие со2тс2 » 1 (где тс - время корреляции вращательного движения молекулы, со-частота спектрометра). В этом случае спектры ЯЭО, регистрируемые при длительном (>0.5сек) времени насыщения сигналов метального пула радиочастотным импульсом, содержат сигналы лишь от достаточно жестких участков молекулы. Такие спектры получили название спектров спиновой диффузии (ССД).

Для белковых структур, сигналы которых регистрируются в ССД, выполняются условия Гу< 4 Â; &А,/ »1, г,- межпротонные расстояния, со -частота спектрометра,ту - время межпротонной корреляции. Таким образом,

ССД содержит информацию о структуре и динамических свойствах белковой

макромолекулы. Количественной характеристикой этого является параметр

жесткости О, определяемый как

отношение интегральной

интенсивности сигналов в ССД к

интегральной интенсивности тех же

сигналов в СО.

Для глобулярных белков

в нативном состоянии характерна

величина в = 0,6-И),45. В случае

нативных белков величина в

определяется характером

уникальной упаковки

полипептидной цепи в компактную

глобулу. Вместе с тем, оказалось,

что для белков, находящихся в

состоянии расплавленной глобулы 9876543210 м.д.

характерны относительно высокие

Рис. 1 1Н - ЯМР -спектры нативного

а-лактальбумина человека, /-спектр значения параметра жесткости, что спиновой диффузии (ССД) свидетельствует о наличии

полученный при насыщении сигналов

метальных протонов в течении 2 сек. компактности молекулы. 2- обзорный спектр (СО).

1. Связь параметра жесткости с компактностью ненативных состояний

глобулярных белков а-лактальбумин человека- глобулярный белок, состоящий из 123 аминокислотных остатков и имеющий молекулярную массу 14,2 кДа. При рН=7.(Ь-3.0 он сохраняет нативную структуру. При рН < 2.0 переходит в состояние расплавленной глобулы. При этом ССД белка становится качественно близким к спектру денатурированного состояния рис.2. Вместе с тем, можно видеть, что имеет место эффективная СД. Это обстоятельство дает

£ _ ^ссд

со

1ссд А

1СО

ША.^}

я «К

ил

"■]■■.......).........|'""""1"

возможность измерить параметр жесткости в. В данном случае интегральные интенсивности измерялись в области поглощения протонов ароматических аминокислотных остатков (8ч-6 м.д.), относительно интегральной

интенсивности сигнала метального пула - области возбуждения спиновой диффузии. Оказалось, что расплавленная глобула а-лактальбумина также характеризуется высоким значением параметра жесткости: С=/ссд//со=0,42.

При дальнейшим разворачивании

расплавленной глобулы растворами мочевины зависимость О от концентрации денатуранта имеет характерный Б-образный вид с полупереходом при 6,5М мочевины и характеризует кооперативный переход из компактного в развернутое состояние (рис. 3). Интересно заметить, что даже в

развернутом состоянии в ССД

8 6 4 2 0 М-Д-

Рис. 2. Спектр СД расплавленной глобулы а-лактальбумина человека (рН=1,9; Т=298К).Время насыщения метальных сигналов 2 сек.

0,5 п 0,4 0,3 0,2 -\ ОД

присутствует достаточно

большое количество сигналов, что свидетельствует о наличии остаточной «сближенности» некоторых участков

полипептидной цепи. При этом сохраняется их жесткость и фиксация друг относительно

Рис.3. Зависимость параметра жесткости

/ / тг 1 г» друга, по всей видимости, (и) для расплавленной глобулы (рН= 1,9)

а-лактальбумина от концентрации благодаря сохранившимся Б-Б

мочевины

связям.

Еще одна характерная особенность молекул белка в состоянии расплавленной глобулы заключается в их способности связывать молекулы

—I--1-1-г-

2 4 6 8 Мочевина, Моль/л

компонентов растворителя. Спектр спиновой диффузии расплавленной глобулы а-лактальбумина (рис. 4), содержит сигнал воды при 4.7 м.д. В то время, как в спектре спиновой диффузии нативного состояния (рис. 1-7) такого сигнала не содержится. Это справедливо и по отношению к молекулам денатуранта, сигналы которых присутствуют в ССД, указывая на их сближенность с молекулами белка. Участвуя в протонном обмене с водой, как мочевина, так и ОиНС1 имеют почти равные с водой спин-решеточные времена релаксации. Например, в спектре СД а-лактальбумина, при рН=1,9 и 4,4 М гуанидингидрохлорида, как показано на рис. 4, сигнал СиНС1 (6.9 м.д.), так же как и сигнал воды, заметным образом увеличивается при увеличении времени возбуждения СД с 2 до 10 сек.

Таким образом, в случае белков с утерянной третичной структурой, метод спиновой диффузии позволяет количественно отслеживать

изменения компактности таких состояний при изменении рН, температуры или концентрации денатуранта. Компактность же в свою очередь можно рассматривать, как естественный параметр, отличающий промежуточное состояние от нативного и полностью развернутого. В случае а-лактальбумина

компактность белка в состоянии расплавленной глобулы определяется наличием остаточной вторичной структуры. В этом случае метод спиновой диффузии даёт информацию аналогичную той, что содержится в спектрах дальнего КД

\аА

0 мл.

Рис. 4. Спектры СД расплавленной глобулы а-лактальбумина в присутствии 4,4 М виНО (рН 1,9; Т=298К). Время возбуждения спиновой диффузии: 2 сек -1 и 10 сек - 2. Черта на сигнале воды указывает уровень амплитуды для спектра -1.

(рис. 3). Кроме того, в ССД содержится информация о взаимодействии белка с водой, денатурантом или любой другой молекулой. Возможность одновременного наблюдения всех компонент раствора: воды, денатуранта, буферных компонент и др., является уникальной особенностью этого метода.

2. Разворачивание расплавленной глобулы карбоангидразы В гуанидингидрохлоридом

Связывание компонентов растворителя молекулами белка в состоянии

расплавленной глобулы дает возможность наблюдать изменение состава

сольватной оболочки белка при его

дальнейшем разворачивании

денатурантами.

При рН=8.0-4.0 карбоангидраза

В сохраняет нативную структуру.

Конформационное состояние,

реализующееся в интевале 3.0 < рН <

3.9, идентифицировано как состояние

расплавленной глобулы. Так же, как и

в случае а-лактальбумина, переход в

это состояние сопровождается

исчезновением спектров ближнего

КД, при наличии ярко выраженного

__спектра дальнего КД, что

7 6 5 4 3 2 1 м,д-

свидетельствует о наличии развитой

Рис.5 1- ССД карбоангидразы В в ВТОрИ™ОЙ структуры. ССД состоянии расплавленной глобулы карбоангидразы В в состоянии

(рН=3.5). 2- ССД карбоангидразы В „

-Л^л//- „г.. / тт расплавленной глобулы не содержит

в присутствии 3.2 М ииНС1 (рН=3.5). 1 J с

вторичных химических сдвигов и указывает на наличие эффективной внутримолекулярной спиновой диффузии (рис.5-/). Следовательно, компактность данного промежуточного состояния определяется наличием развитой вторичной структуры.

Можно видеть, что эффективность внутримолекулярной спиновой диффузии для карбоангидразы В в присутствии 3.2 М ОиНС1 существенно снижается (рис.5-2). Такое изменение ССД отражает декомпактизацию расплавленной глобулы карбоангидразы В в присутствии ОиНС1. Оба спектра содержат сигналы поглощения воды при 4,76 м.д. (Рис.5-1,2) и СиНС1 при 4,76 м.д. (Рис.5- 1,2) и ОиНС1 при 6,94 м.д. (Рис.5-2). Этот факт отражает наличие близких и достаточно долго существующих контактов части молекул воды и денатуранта с белком. Время их контакта с молекулами белка должно быть равным или больше времени корреляции белка как целого тс, определяемого из соотношения со2тс2»1.

При изменении концентрации денатуранта интегральные интенсивности синалов (ИИС) воды и ОиНС1 изменяются. Отношения ИИС ОиНС1 к ИИС воды, полученные из обзорных СО, достаточно хорошо аппроксимируются линейной функцией рис.6-/. Однако отношения ИИС гуанидина к ИИС воды, полученные из ССД, имеют, нелинейный характер рис.6-2.

Таким

0,16

5 0,12

"2. 0,08 -и ' 33

0 0,04 и

1 0,00 -

-0,04

-1-1-г-1-1-

0 12 3 4 СиНС1, Моль/л

Рис.6 Зависимость отношения ИИС денатурант/вода от концентрации ОиНС1 (рН=3,5). 1-СО, 2-ССД

образом, поведение молекул

свободного растворителя отличается от поведения, молекул растворителя,

находящимися в контакте с молекулами белка.

Поскольку ИИС в СО прямо пропорциональны количеству протонов и концентрации, от которых происходит этот сигнал, такие

эксперименты позволяют оценить концентрации воды и денатуранта, в сольватной оболочке белка..

В таблице 1 представлены результаты расчетов и измерений. Все представленные данные имеют размерность Моль/литр.

Таблица 1.

концентрация GuHCl концентрация Н20 концентрация Н20 (ССД) концентрация GuHCl (ССД)

0.0 55.50 0.340 0.000

2.8 44.75 0.370 0.010

3.2 42.75 0.280 0.011

3.5 41.55 0.250 0.011

3.7 40.75 0.130 0.008

3.9 39.95 0.074 0.007

4.1 39.54 0.035 0.005

4.5 37.54 0.032 0.005

По мере увеличения концентрации денатуранта в растворе концентрация воды в нем уменьшается. С ростом концентрации денатуранта количество молекул воды, находящихся в сольватной оболочке белка, уменьшается и при 4,5 М ОиНС1 становится на порядок меньше. Число молекул связанного денатуранта тоже уменьшается, но не так значительно, поэтому их отношение, как показано на рис.6-2. представляет собой возрастающую нелинейную

зависимость. Молекулы

денатуранта как бы внедряются в сольватную оболочку белка, вытесняя из нее молекулы воды.

0,25 0,20 -0,15 -

Ц о,ю

0,05 0,00

—1-1-1—

1 2 3 GuHCl, Моль/л

Рис.7 Зависимость параметра жёсткости и отн ошение концентраций ОиНС1/ вода от концентрации ОиНС1. /-0,37хС,

2- Ссина/Сшо

На рис. координатах зависимости жесткости в концентраций концентрациям полученных из ССД (СсиПа /Сн2о)'

7 в одних представлены

параметра и отношения GuHCl к воды

Обе зависимости имеют «сигмоидальный» характер с достаточно узким переходом, характерным для "two state''-переходов. Интересно отметить тот факт, что декомпактизация расплавленной глобулы и изменение состава

сольватной оболочки белка происходят в том же интервале изменения концентраций денатуранта. Данное обстоятельство позволяет рассматривать эти процессы как сопряженные и связанные между собой, а именно: изменения в соотношении воды и денатуранта, в близи молекулы белка, приводят к разворачиванию полипептидной цепи. При концентрациях гуанидингидрохлорида меньших 2,8М раствор белка сильно агрегирует и поэтому точки на графике не представлены. Агрегация при выбранном значении рН 3,5 (условия существования расплавленной глобулы) обусловлена, по-видимому, экранированием большого заряда белка ионами гуанидиния и хлора и слипания части белковых молекул из-за межбелкового гидрофобного взаимодействия. При 2,8М денатуранта, межбелковые гидрофобные взаимодействия компенсируются, в то время как внутримолекулярные гидрофобные взаимодействия остаются. Вероятно, это происходит вследствие того, что в состоянии расплавленной глобулы лишь относительно небольшая часть гидрофобных остатков молекулы белка оказывается экспонированной в растворитель, образуя небольшие гидрофобные кластеры на её поверхности. Основная же часть гидрофобных остатков остается по-прежнему вовлечённой в формирование гидрофобного ядра глобулы.

Таким образом, при разворачивании расплавленной глобулы карбоангидразы В растворами ОиНС1 внедрение молекул денатуранта в сольватную оболочку белка происходит в относительно узком интервале концентрации денатуранта и сопровождается разворачиванием белка. Вплоть до достижения критической концентрации молекулы дена1уранта преимущественно исключаются из сольватной оболочки. Дальнейшее увеличение концентрации денатуранта ведет к вытеснению воды из ее состава и сопровождается разворачиванием белка.

Создается впечатление, что для возрастающей концентрации денатуранта не хватает воды в балк-растворителе и, чтобы полностью обеспечить условия его растворения, вода отбирается из сольватной оболочки бежа. Тем самым, меняется соотношение связанной воды и виНС! в пределах сольватной

оболочки в пользу увеличения виНС!, что и приводит к разворачиванию полипептидной цепи.

5. Разворачивание пативной карбоангидразы В растворами мочевины. Самоассоциация компактного ненативного состояния

Известно, что в процессе разворачивания сильными денатурантами

карбоангидраза В проходит через состояние расплавленной глобулы (N <-» I <-» U). В таком состоянии белок склонен к агрегации и при высоких концентрациях она становится заметной (I о Jagg). При рН=5,5 белок находится в нативном состоянии, что

подтверждается обзорным спектром (Рис.8-7). Однако уже при концентрации

и !

—г 8

0 м.д.

Рис.8 /-lM-спектр карбоангидразы В (рН=5,7; Т=298К), 2-1М-спектр карбоангидразы В (рН=5,7; Т=298К; 6,6 Моль мочевины)

0,8 0,6 0,4 0,2 0,0

мочевины 6,6 М белок денатурирует, что приводит к вырождению обзорного спектра (Рис. 8-2) и характерному изменению параметра жесткости О (рис.9). Точка полуперехода лежит в районе 5 М мочевины.

Рис. 9. Зависимость в от концентрации мочевины. Параметр жесткости скорректирован на вязкость раствора мочевины.

1 2 3 4 5 6 7 Мочевина, Моль/л

8 9

На рис. 10 представлены зависимости отношения ИИС мочевины к ИИС воды от концентрации мочевины в растворе, измеренные в СО и ССД.

Обе зависимости с ростом концентрации мочевины представляют собой монотонно возрастающие кривые. Интересно отметить, что с точностью до

ошибки измерений эти соотношения совпадают.

Это означает, что соотношения концентраций воды и мочевины вблизи молекул белка остаются такими же, как в среднем по раствору на протяжении всего процесса денатурации нативной карбоангидразы. Следовательно, включение молекул денатуранта (мочевины) в сольватную оболочку нативного белка происходит постепенно по мере роста концентрации мочевины в растворе, а не скачком, как это наблюдалось при разворачивании расплавленной глобулы карбоангидразы В растворами GuHCl. Эти данные указывают на различия молекулярных механизмов взаимодействия мочевины и GuHCl с поверхностью белка в составе сольватной оболочки.

Детектирование образования ассоциированных форм в процессе денатурации проводилось методом спиновой диффузии в сочетании с экспериментальным приемом внерезонансного возбуждения (off-Resonance Irradiation). В этом случае спиновая диффузия возбуждалась на частотах, удаленных от сигналов имеющихся в обзорном спектре.

Возбуждение СД вдали от сигналов регистрируемого спектра, предполагает наличие очень широкого сигнала «подложки», представляющего собой огибающую вероятностного распределения водно-белковых ассоциатов по размерам. На этой «подложке» хорошо видны сигналы белка и воды. В том случае, если комплексы имеют динамический характер (т.е., молекула белка

0,5

g 0,4

0,3 -

в 0,2 «

S" о

Ö "-1

0,0

2 4 6 Мочевина, Моль/л

Рис. 10. Зависимость отношения интегральных интенсивностей сигналов воды и мочевины от концентрации мочевины, и- в обзорных спектрах (СО), о- в спекрах спиновой диффузии (ССД).

или воды через какое-то время может покинуть ассоциат и перейти в свободное состояние и, наоборот), в спектре спиновой диффузии должен наблюдаться отклик. Причем, чем дальше будет сдвинута частота возбуждения от сигналов обзорного спектра, тем меньше будет доля, отражающая индивидуальные свойства ассоциата и больше доля, отражающая коллективные свойства ассоцитов в измеряемых параметрах. Такая огибающая, полученная в широком диапазоне частот возбуждения, представляет собой симметричную, колоколообразную кривую с максимумом для белковой компоненты при ~540 Гц, а для водной компоненты солвент-белкового ассоциата при ~2820 Гц. Поэтому достаточно получить лишь правую или левую ветвь кривой, чтобы иметь полную информацию об объекте исследования этим методом.

Характер межмолекулярного взаимодействия белок- белок и белок -растворитель при денатурации белка наблюдается более отчетливо, если б* полученные данные представить в

| __| левый участок кривой (0 -г 4 М

О 2 4 6 8 10 мочевины) заметно выше правого Мочевина, Моль/л

0,6 ->

0,5 -

зависимости от концентрации мочевины. Все кривые нормированы к значению 0*гаах= в для каждой концентрации

мочевины, которое имеет место на частоте возбуждения СД ~540 Гц. Кривые имеют отчетливый максимум при 5 М мочевины, хотя

Рис. 11. Зависимость в* от

концентрации мочевины для разных частот возбуждения:

(6 + 8 М мочевины) для частоты -1000 Гц, ближайшей к частоте метального пула белка.

1- -1000 Гц, 2- -2000 Гц, 3- -4000 Гц, 4- -6000 Гц, 5 - - 8000 Гц, 6- -10000 Гц. Мощность возбуждения СД 50 дБ

Кривая 1 для в* начинает проявлять изменение в поведении при 3,5 М мочевины (рис. 11) - уменьшение значения С*, как при денатурации (рис.9). Однако при 4,2 М мочевины начинается процесс противоположный денатурации, но не для индивидуальной молекулы, которая продолжает денатурировать (рис.9), а для группы белковых молекул - появление

значительного количества крупных ассоциатов (рис.12). Поскольку экстремум наблюдается при частотах возбуждения СД вне спектра, то увеличение параметра связано с увеличением заселенности состояний вероятностного распределения,

определяемых большими размерами.

Рис.12 Ассоциаты образуются из ПРИ дальнейшем увеличении негативных молекул белка. концентрации мочевины, эти крупные

белковые ассоциаты распадаются, а индивидуальные молекулы окончательно разворачиваются, что отмечается резким падением амплитуды в*. Уровень С* (кривая 1, рис.11) заметно выше в области концентраций мочевины 0 -ь 3,5 М, чем в области - 6,6-^8,1 М, что характерно для сигмоиды (рис.9). Разница между этими двумя уровнями уменьшается по мере удаления частоты возбуждения от сигналов белка в СО (кривые 2 - 6 на рис.11). Чем дальше частота возбуждения СД от сигналов в СО, тем менее чувствителен параметр й* к индивидуальным свойствам молекул белка. При этом, он все более отражает коллективные свойства белковых ассоциатов.

Изменение параметра 8* характеризующего растворитель в зависимости от концентрации мочевины представлены на рис. 13.

0,8 0,6 0,4 0,2 0,0

Все кривые так же нормированы к значению 8*тах для каждой концентрации мочевины, которое имеет место на частоте возбуждения СД -540 Гц. Параметр Б* достигает своих максимальных значений в области концентраций мочевины 4 5 М, при этом ни для каких частот возбуждения СД не отмечается разных уровней в левом и правом участках основания кривых. Параметр Б*, отражающий свойства растворителя, имеет максимум в той же области концентраций мочевины 4 6.2 М, что указывает на участие растворителя в образовании белкового ассоциата - солвент-белковый ассоциат (СБА). Практически не изменяющаяся амплитуда экстремума в используемом диапазоне частот возбуждения (рис.13)

—I-1-—1-1-1—

0 2 4 6 8 Мочевина, Моль/л

Рис. 13. Зависимость Б* от концентрации мочевины для разных частот возбуждения: 1- -1000 Гц, 2- -2000 Гц, 3--4000 Гц, 4--6000 Гц, 5--8000 Гц, 6--10000 Гц. Мощность возбуждения СД 50 дБ.

л-

указывает на

растворителя

малоподвижную

то, что часть образовала структуру. Такая структура возникает благодаря тесньм взаимодействиям между белковыми '<=•6 молекулами. В результате таких взаимодействий образуется

пространственная сеть, внутри которой заключены молекулы воды рис.14.

Рис.14. В белковые ассоциаты вовлекаются молекулы компонентов растворителя. Светлым обозначены молекулы воды, черным - мочевины.

Именно на эти молекулы и передается энергия при возбуждении СД в белке.

Таким образом установлено, что при денатурации натнвной карбоангидразы В включение мочевины в сольватную оболочку белка происходит постепенно по мере роста-концентрации денатуранта в растворе. Поведение мочевины в данном случае резко отличается от описанного выше поведения туанидингидрохлорида. Этот результат позволяет сделать вывод, что механизмы денатурации белков мочевиной и гуанидингидрохлоридом различны. Разработанный в процессе этого исследования метод оЙ-К1, позволил изучать коллективные свойства водно-белковых и солвент-белковых ассоциатов.

4. Исследование ассоциатов промежуточного состояния карбоангидразы В при концентрации мочевины 4.2М

При исследовании образования СБА было обнаружено отличие в свойствах свежеприготовленного препарата и препарата инкубированного через некоторое время после приготовления (0, 48 и 95 часов). Д1Я более детального исследования процесса ассоциации, свойств образующихся ассоциатов а так же характера вовлечения растворителя в их состав был исследован процесс передачи энергии возбуждения СД с метальных протонов (частота возбуждения СД) на растворитель. Исследовались образцы с различными концентрациями белка (С/2, С, 2С, где С=З.Ы0"4 МУл) и при разных временах, прошедших с момента их приготовления.

Были получены зависимости параметра 80.5 (рис.15), характеризующего степень вовлеченности растворителя в состав ассоциатов от задержки перед 90° обзорным импульсом, (индекс 0.5 при параметре Б означает, что время насыщения метильного пула белка в данной серии экспериментов составило 0.5 сек). Все зависимости с хорошей точностью аппроксимируется биэкспоненциальной функцией вида: у = а»ехр(-к1»1) + Ь'ехр^кг«!), ошибка для всех входящих параметров составляет менее 5 %. Зависимость 1 получена для концентрации 2С после -48 часов с момента приготовления раствора (2С, 48ч).

Зависимости: 2 - 2С, 0 ч; 3 - С, 95 ч; 4 - С, 48 ч; 5 - С, 0 ч; 6 - 1/2С, 48 ч; 7 -1/2С, 0 ч.

Биэкспоненциальная зависимость кинетики развития СД указывает на то, что в исследуемой системе присутствует не менее двух резервуаров, между которыми происходит обмен энергией. Один резервуар - белковый, другой состоящий из молекул растворителя. Возбуждение этой системы достаточно коротким импульсом затрагивает оба резервуара сразу, но поскольку релаксационные характеристики сброса энергии для белковой компоненты (~1с) значительно меньше, чем для компоненты растворителя (~7с), то в течение некоторого времени может происходить накопление энергии, а значит

и возрастание сигнала

SO.5

0,06 0,05 -0,04 -0,03 -0,02 -0,01 0,00

10 15 Время, сек

Рис. 15. Зависимости параметра Sos от времени задержки перед 90°-имульсом. Символы - измеренные величины, линии - результат подгонки согласно аналитическим функциям. 1 -2С,48ч; 2-2С, 0ч; 3-С,95ч; 4-С, 48 ч; 5 - С, 0 ч; 6 - 1/2С, 48 ч; 7 - 1/2С, 0 ч.

растворителя в ССД. На коротких временах возбуждения СД

регистрируется сброс энергии с белковых молекул на молекулы растворителя, которые непосредственно связаны с белком в СБА. В таблице 2 заселенность состояния, характеризующая этот процесс, определяется коэффициентом а. Характеристическая скорость этого процесса определяется экспоненциальным множителем к| (сек"1).

Таблица 2. Значения предэкспоненциальных и экспоненциальных коэффициентов.

8 0.5

1/2С С 2С

1 0 часов 48 часов 0 часов 48 часов 95 часов 0 часов 48 часов

а -5.2349е-3 -5.1572е-3 -0.0130 -0.0127 -0.0143 -0.0270 -0.0278

Ь 7.4225е-3 0.0123 0.0182 0.0275 0.0323 0.0552 0.0704

к, 0.8864 2.3586 0.9840 2.0461 3.2165 2.2176 4.2133

к2 0.1398 0.1275 0.1401 0.1402 0.1424 0.1593 0.1703

Значения коэффициента а внутри одной концентрации практически не меняются, и, значит, от времени приготовления образца они не зависят. При увеличении концентрации вдвое, они увеличиваются, примерно, вдвое. Это говорит о том, что с увеличением концентрации увеличивается заселенность некоторого начального состояния, образующего СБА. Скорость сброса энергии к! растет от времени с момента приготовления раствора, указывая на то, что она зависит от конечного состояния. Заселенность этого состояния определяется коэффициентом Ь, который заметным образом зависит от концентрации белка и времени с момента приготовления раствора, указывая на изменения, связанные с СБА. Скорость релаксации конечного состояния кг слабо меняется (табл. 2), указывая на то, что она определяется, скорее всего, обменом молекул растворителя с балк-раствором.

Таким образом, по характеру вовлечения растворителя в состав ассоциатов обнаруживается существование двух типов ассоциированного состояния начальное и конечное. Начальное состояние, представлено «персистентными» единицами, которые не меняются со временем и концентрация которых (заселенность начального состояния СБА) прямо зависит от концентрации белка. В конечном состоянии персистентные единицы формируют трехмерную структуру типа геля, связывая дополнительное количество растворителя. Процесс формирования геля, измеряется десятками часов.

5. Особенности внутреннего строения сольвент-белковых ассоциатов карбоангидразы В в присутствии 4,2 Ммочевины

Известно, что при определённых условиях самоассоциация может рассматриваться как дополнительный структуро-формирующий фактор, ведущий к возникновению новых «структурных уровней» частично свернутого белка. Для исследования структурных особенности белковой компоненты в составе СБА были использованы круговой дихроизм и синхротронное малоугловое рентгеновское рассеяние (СМУРР). Круговой дихроизм, дает информацию о структуре белкового партнера ассоциата. Синхротронное

малоугловое рентгеновское 40 и рассеяние, дает представление о

0 о, супермолекуле в целом.

•г*

-40 ч Зависимости параметра

г „

- -80 г»4 жесткости О, характеризующего г

- -120 ^ компактность белковой глобулы -160 ^ и эллиптичности в ближнем

~ ультрафиолете, от концентрации

0 2 4 6 8 Мочевина, Моль/л

Рис. 16. Зависимость параметра жесткости в (о) и эллиптичности при 270 нм (•) от концентрации мочевины.

мочевины представлены на рис. 16.

Каждая из этих зависимостей имеет

вид сигмоиды - кривой, обычной для

денатурационных процессов, с

полупереходом из нативного в денатурированное состояние вблизи 5М

мочевины. Совместный анализ этих данных позволяет заключить, что

компактность нативного состояния определяется характером уникальной

упаковки глобулы и непосредственно связана с ее третичной структурой.

Отличие в концентрациях мочевины, характеризующее полупереход по данным

ближнего КД и ЯМР (рис. 16), связано с разными, хотя и сопутствующими

механизмами, которые регистрируются этими методами-, разрушение

пространственной ориентации ароматических остатков и уменьшение

компактности глобулы. Отсюда ясно, что эти два процесса происходят не

симбатно, и не всегда потеря внутренней пространственной упорядоченности белка приводит к заметному изменению компактности молекулы.

На рис.17 представлены зависимости параметра жесткости в*, характеризующего белок в составе ассоциатов, и эллиптичности в дальнем

ультрафиолете, от

концентрации мочевины. Тот -2 | факт, что максимум ¡5-

Я структурной эллиптичности -3 'л гхтпяляет с

Л совпадает

максимумом

§ заселенности ассоциированного

состояния, свидетельствует о

I- -5

2 4 6 Мочевина, Моль/л

-I- -6 10

Рис. 17. Зависимость параметра О* (о,<>,□..) и эллиптичности при 220 нм (•) от концентрации мочевины.

том, что ассоциация индуцирует образование

© дополнительной Р-структуры, которая, по- видимому, имеет межмолекулярный характер. Повышение концентрации до 8 М приводит к резкому уменьшению эллиптичности - разрушению вторичной структуры (рис.17). Максимум, соответствующий наличию ассоциатов исчезает, что означает разрушение ассоциатов при дальнейшей денатурации белка.

Дополнительная информация о средних размерах ассоциатов и их внутренней структуре была получена методом СМУРР.

На рис.18 приведены кривые рентгеновского рассеяния в координатах Гинье для двух препаратов белка, один из которых, при концентрации 2С, инкубировался более месяца, а второй, при концентрации С - несколько дней с момента приготовления. Данный график позволяет оценить размеры объекта, его молекулярную массу и полидисперсность.

Видно, что кривые подобны и отличие наблюдается только в области малых углов рассеяния, где кривая для второго препарата спадает более круто. Сильная нелинейность графика для о.оо 001 0.02 о.оз о.о4 о.о5 о.об малых углов рассеяния указывает на

полидисперсность образцов по молекулярной массе.

Анализ СМУРР данных, приведенных на рис.18 позволил сделать некоторые оценки размеров

02(А"2)

Рис.18 Кривые малоуглового рентгеновского рассеяния в координатах Гинье карбоангидразы В при 4.2 М мочевины: 1 - концентрация 2С, 2 - концентрация С.

объектов, имеющихся в растворе. Для первого образца (2С) оценка средней молекулярной массы из начальной ординаты дала значение 190 кДа, а для второго (С) образца - 220 кДа. Оценка средних размеров частиц из величины начального наклона кривых дала значения для радиуса инерции 70А в первом случае, и 75А - во втором. Эти данные показывают, что в растворе присутствуют макрообъекты в виде ассоциированного белка. Поскольку молекулярная масса мономера карбоангидразы составляет 29 кД, то ассоциаты состоят, в среднем, из 7 ±1 мономеров для обоих образцов и не зависят от начальной концентрации белка и времени инкубации.

Для более детального анализа вклада в рассеяние от p-структуры, было проведено моделирование параллельной и антипараллельной (J-структуры на основе координат атомов реального Р-тяжа прионоподобного белка Sup35. Оценка толщины р-слоя дала значение 8.7А, очень близкое к величине 8.3А, полученной для нашего объекта.

выводы

1. На примере а-лактальбумина, показано что компактность ненативной формы, как правило, определяется остаточной вторичной структурой.

2. Показан динамический характер взаимодействия молекул белка и растворителя в белковом ассоциате. Установлено, что взаимодействие мочевины и гуанидингидрохлорида с белковой молекулой происходит по разным механизмам, как и процесс денатурации.

3. Обнаружено, что размеры ассоциатов карбоангидразы В не зависят от концентрации белка и они остаются стабильными в течении длительного времени. Показано, что Р-структура является основным элементом регулярной вторичной структуры ненативной формы белка в составе ассоциатов и именно межмолекулярная Р-структура определяет структуру ассоциатов. Образованию протяженных белковых агрегатов, подобных амилоидным фибриллам, препятствует замыкание одного из центров роста межмолекулярной Р-структуры.

4. В рамках метода ЯМР высокого разрешения предложен новый методический подход- «внерезонансное возбуждение спиновой диффузии», позволяющий исследовать молекулярную ассоциацию и дающий возможность получить информацию о как коллективных, так и индивидульных свойствах ассоциатов и входящих в их состав белковых молекул и растворителя.

СОДЕРЖАНИЕ ДИССЕРТАЦИИ ИЗЛОЖЕНО В СЛЕДУЮЩИХ

РАБОТАХ:

1. Кутышенко В.П. Прохоров Д.А. // 2003. Разворачивание расплавленной глобулы карбоангидразы гуанидингидрохлоридом. Молекулярная биология. Т. 37. № 6, С. 1055-1060.

2. Кутышенко В.П., Прохоров Д.А., Христофоров B.C. // 2004. Спиновая диффузия в глобулярных белках: а-лактальбумин. Биофизика. Т. 49. №4, С.601-607.

3. Прохоров Д.А., Кутышенко В.П., Христофоров B.C. // 2005. Взаимодействие карбоангидазы В с водой и мочевиной. Молекулярная биология. Т. 39. № 3, С. 497-503.

4. Кутышенко В.П., Прохоров ДА., Христофоров B.C. // 2005. Исследование взаимодействия карбоангидазы В с водой и мочевиной. 1. Параметры спиновой диффузии, определяющие индивидуальные и коллективные свойства молекул. Биофизика. Т. 50. № 4. С. 641-647

5. Кутышенко В.П., Прохоров Д.А., Христофоров B.C. // 2006. Исследование взаимодействия карбоангидазы В с водой и мочевиной. 2. Спиновая диффузия ассоциатов промежуточного состояния белка при 4.2 М мочевины. Биофизика. Т. 51. № 1.С. 24-31.

6. Prokhorov D., Timchenko A., Uversky V., Khristoforov V., Kihara H., Kimura K., Kutyshenko V. // 2008. Dynamics of oligomer formation by denatured carbonic anhydrase И. ВВА. V. 1784. P. 834-842.

7. Прохоров Д.А., Христофоров B.C., Кутышенко В.П. // Межмолекулярное взаимодействие в системе белок-вода- денатурант. Материалы 7-го международного семинара по магнитному резонансу. Ростов-на-Дону, 6-9 сентября, 2004, с. 212.

8. Прохоров Д.А., Христофоров B.C., Кутышенко В.П. // Динамика образования амилоидоподобных структур при ассоциации карбоангидразы В. Тез. докл. 12-ой всероссийской конференции «Структура и динамика молекулярных систем». Йошкар-Ола - Уфа-Казань-Москва, 27 июня-2 июля, 2005, с. 174.

9. Kudrevatykh Yu.A., Prokhorov D.A., Timchenko A.A., Kihara H., Khristoforov V.S., Kutyshenko V.P. // The dynamics of amyloid-like structures formation at the association of carbonic anhydrase B. Abstract. 4RD meeting "NMR in Heterogeneous Systems", 2007, Saint Petersburg, p. 83.

Подписано в печать: 12.01.2009

Заказ № 1462 Тираж -100 экз. Печать трафаретная. Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (499) 788-78-56 www.autoreferat.ru

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Прохоров, Дмитрий Анатольевич

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Тепловое равновесие в системе спинов.

1.2. Спиновая диффузия в диамагнитных ионных кристаллах.И

1.3. 'Н-ЯМР- спектры нативных белков.

1.4. Условия возникновение и распространения спиновой диффузии в белках.

1.5. Динамические характеристики нативных белков.

1.6. Равновесные промежуточные состояния белков.

1.7. Связь плотности упаковки белков с экспериментальными параметрами.

1.8. Спиновая диффузия и интегральные структурно-динамические характеристики глобулярных белков. Спектр спиновой диффузии.

1.9. Параметр жесткости и компактность глобулярных белков.

1.10. Применение метода спиновой диффузии к исследованию ненативных состояний белков.

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

2.1. Список используемых сокращений и обозначений.

2.2. Объекты исследования и материалы.

2.3. 'Н-ЯМР - спектроскопия.

2.3.1. Спектры спиновой диффузии.

2.3.2. Метод внерезонансного возбуждения спиновой диффузии.

2.3. Малоугловое диффузное рассеяние рентгеновских лучей в растворе.

2.4. Спектроскопия кругового дихроизма.

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

3.1. Исследование а-лактальбумина человека методом спиновой диффузии.

3.2. Разворачивание расплавленной глобулы карбоангидразы В гу анидингидрохлоридом.

3.3. Параметры спиновой диффузии, определяющие индивидуальные и коллективные свойства молекул.

3.4. Разворачивание нативной карбоангидразы В растворами мочевины. Самоассоциация компактного ненативного состояния.

3.5. Исследование ассоциатов промежуточного состояния карбоангидразы В при концентрации мочевины 4.2М.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Исследование ненативных форм глобулярных белков методом ЯМР"

Актуальность темы. Несмотря на 40-летнюю историю, проблема самоорганизации белков остается одной из «горячих точек» молекулярной биологии. Важным и актуальным этапом данного направления является исследование частично денатурированных (ненативных) промежуточных состояний глобулярных белков. Характерной чертой большинства белков, находящихся в промежуточных ненативных состояниях, является их склонность к ассоциации или агрегации [1-6]. Белки в ненативном состоянии часто формируют тела включения (специфические ш vivo агрегаты), существенно осложняющие выделение многих рекомбинантных белков [7, 8]. Также известно, что ренатурация белков часто сопровождается ассоциацией частично свернутых интермедиатов [1-4, 9]. При определённых условиях самоассоциация может рассматриваться как дополнительный структуро-формирующий фактор, ведущий к возникновению новых «структурных уровней» частично свернутого белка [6, 10, 11]. В течение длительного времени к агрегации белка не относились серьезно, рассматривая ее как экспериментальный артефакт. Однако, в последние годы существенно возрос интерес к исследованиям, посвященным самоассоциации и агрегации белка. Это связано с тем, что широкий диапазон заболеваний человека, известных как заболевания, связанные с нарушением конформации белка или его сворачивания, проистекают из-за неспособности специфических пептидов или белков принимать нативную конформацию, необходимую для нормального функционирования белка [12-16]. Накопленные к настоящему времени данные свидетельствуют в пользу модели, в которой формирование фибрилл белков протекает через образование относительно развернутой амилоидогенной конформации, включая многочисленные нейродегенеративные нарушения и амилоидозы. Переход белка в «прионное» состояние, как правило, сопровождается существенным 4 увеличением доли ^-структуры в его составе. Возникающая межмолекулярная p-структура стабилизирует ассоциат, приводя в конечном счете к образованию высокоупорядоченных фибрилл (амилоидов). В тоже время множество белков, не имеющих отношения к амилоидной дистрофии, также образуют фибриллы при определенных условиях [17-19]. Способность белков формировать амилоиды зависит от их заряда и гидрофобности [20] и, по-видимому, является общим свойством полипептидных цепей, поскольку in vitro в условиях частичной денатурации многие пептиды и белки образуют подобные структуры [21, 22]. Эти белки используют в качестве моделей для изучения процессов, приводящих к нарушению сворачивания белков, олигомеризации и образованию фибрилл. Важное место в них отводится изучению роли воды, или, в общем случае, растворителя [23, 24]. Молекулярный механизм взаимодействия белков с растворителем до сих пор не до конца понятен и является предметом многих исследований [25-28] с использованием различных физических методов [29-31]. Поэтому изучение молекулярных механизмов ассоциации белков и роли растворителя в таких процессах является актуальной задачей для понимания причин образования амилоидов и амилоидоподобных структур. Однако только ограниченное число экспериментальных методов способно фиксировать влияние растворителя (воду и компоненты, образующие растворитель) на процессы агрегации или самоассоциации белков. Среди них выделяется метод ЯМР высокого разрешения, способный отслеживать взаимодействие молекул растворителя с молекулами белка в режиме реального времени и даже установить некоторые количественные характеристики при таком взаимодействии [32, 33].

В качестве объектов исследования были выбраны глобулярные белки, способные легко переходить в состояние расплавленной глобулы: карбоангидраза В коровы (Мг=29 кДа) [34-36] и а-лактальбумин человека (Мг=14.2 кДа) [37, 38]. Недавно нами было показано, что при определенных условиях карбоангидраза В способна формировать амилоидоподобные структуры [39]. Также известны условия, при которых а-лактальбумин человека формирует амилоидные фибриллы [40]. Характерно, что в большинстве описанных случаев, образованию амилоидов in vitro предшествует ассоциация частично денатурированных форм белка.

Соответственно цели были поставлены следующие научно-методические задачи:

-методом 'Н-ЯМР провести исследование взаимодействия денатурантов (гуанидинхлорида, мочевины) с ненативными формами а-лактальбумина человека и карбоангидразы В коровы.

-используя комплекс физических методов Сн-ямр, круговой дихроизм, синхротронное малоугловое рентгеновское рассеяние) провести изучение динамики формирования ассоциатов ненативных форм белков, условий, приводящих к самоассоциации, роли растворителя в этом процессе.

Научная новизна и практическая значимость. В данной работе впервые [33, 41,44-46]:

-в рамках ЯМР высокого разрешения предложен новый методический подход- «внерезонансное возбуждение спиновой диффузии», позволяющий исследовать молекулярную ассоциацию и дающий возможность получить информацию, как о коллективных, так и индивидульных свойствах ассоциатов и входящих в их состав белковых молекул и растворителя.

Рассмотренная в работе система карбоангидраза В коровы-растворитель может быть использована в качестве удобной модели в дальнейших исследованиях по выяснению молекулярных механизмов образования амилоидов, приводящих к прионным заболеваниям человека и животных, а как следствие, устранению причин их вызывающих. Таким образом, в перспективе, результаты работы найдут свое применение в биомедицине. Реализованный в работе новый методический подход «внерезонансного возбуждения спиновой диффузии» будет полезен исследователям, занимающихся изучением межмолекулярных процессов в растворе с использованием ЯМР.

Работа выполнена в группе «ЯМР-исследований биосистем» Института теоретической и экспериментальной биофизики РАН.

Заключение Диссертация по теме "Молекулярная биология", Прохоров, Дмитрий Анатольевич

ВЫВОДЫ

3. Обнаружено, что размеры ассоциатов карбоангидразы В не зависят от концентрации белка и они остаются стабильными в течении длительного времени. Показано, что (3-структур а является основным элементом регулярной вторичной структуры ненативной формы белка в составе ассоциатов, а именно: межмолекулярная Р-структура определяет структуру ассоциатов. Образованию протяженных белковых агрегатов, подобных амилоидным фибриллам, препятствует замыкание одного из центров роста межмолекулярной (3-структуры.

Благодарности

Автор выражает глубокую благодарность и признательность своему научному руководителю д. ф.-м. н. Виктору Павловичу Кутышенко, к.ф.-м.н. Христофорову Владимиру Сергеевичу за постоянное внимание и помощь в течение всей работы над диссертацией.

Приношу свою глубокую благодарность сотрудникам Институт белка РАН: Котовой Н.В. за предоставление белков для исследований, к.ф.-м.н. Мельнику Б.С. за помощь в интерпретации спектров кругового дихроизма, к.ф.-м.н. Тимченко A.A. за помощь в получении и интерпретации данных малоуглового рентгеновского рассеяния.

Искренняя благодарность всему коллективу нашей лаборатории за помощь в выполнении экспериментальной работы и плодотворное обсуждение результатов.

Автор благодарен Российскому Фонду Фундаментальных Исследований за поддержку настоящей работы.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Прохоров, Дмитрий Анатольевич, Пущино

1. Tanford С. Protein denaturation //Adv. Protein Chem. 1968. Vol. 23. P.121-282.

2. London, J., C. Skrzynia, and M. E. Goldberg. 1974. Renaturation of Escherichia coli tryptophanase after exposure to 8 M urea. Evidence for the existence of nucleation centers. Eur. J. Biochem. 47:409-415.

3. Fink, A. L. 1995a. Molten globules. Methods Mol. Biol. 40:343-360.

4. Fink, A. L. 1995b. Compact intermediate states in protein folding. Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 24:495-522.

5. Ptitsyn, О. B. 1995. Molten globule and protein folding. Adv. Protein Chem. 47:83-229.

6. Uversky, V. N. 1998. Equilibrium unfolding of partially folded staphylococcal nuclease A2- and A3-forms is accompanied by the formation of anintermediate state. Biochemistry (Moscow). 63:470-475.

7. Marston, F. A. 1986. The purification of eucariotic polypeptides synthesized in Escherichia coli // Biochem. J. 240:1-12.

8. Schein, С. H. 1989. Solubility as a function of protein structure and solvent components // Biotechnology. 7:1141-1149.

9. Uversky, V. N., and A. L. Fink. 1998a. Structural effect of association on protein molecule in partially folded intermediates. Biochemistry (Moscow). 63:456-462.

10. Uversky, V. N., and A. L. Fink. 1998b. Structural properties of staphylococcal nuclease in oligomeric A-forms. Biochemistry (Moscow). 63:463^469.

11. Taylor, J.P., Hardy, J. & Fischbeck, K.H. Toxic proteins in neurodegenerative disease. Science 296, 1991-1995 (2002).

12. Nussbaum, R.L. & Ellis, C.E. Alzheimer's disease and Parkinson's disease. N. Engl. J. Med. 348, 1356-1364 (2003).

13. Ross, C.A. When more is less: pathogenesis of glutamine repeat neurodegenerative diseases. Neuron 15, 493-496 (1995).

14. Protein Misfolding, Aggregation and Conformational Diseases: Part A: Protein Aggregation and Conformational Diseases. Edit Uversky, V. N., and A. L. Fink.// Springer, 2006

15. Protein Misfolding, Aggregation, and Conformational Diseases Part B: Molecular Mechanisms of Conformational Diseases. Edit Uversky, V. N., and A. L. Fink.// Springer Science+Business Media, LLC, 2007

16. Dobson, C. M., Principles of protein folding, misfolding and aggregation. Semin. Cell Dev. Biol., 2004, 15, 3-16.

17. Selkoe, D.J. 2003 Folding proteins in fatal ways. Nature, 426, 900-904.

18. Michelitsch, M.D., and Weissman, J.S. (2000) A census of glutamine/asparagine-rich regions: implications for their conserved function and the prediction of novel prions. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 97, 11910-11915.

19. Chiti, F., Stefani, M., Taddei, N., Ramponi, G., and Dobson, C.M. (2003) Rationalization of the effects of mutations on peptide and protein aggregation rates. Nature, 424, 805-808.

20. Dobson, C.M. (1999) Protein misfolding, evolution and disease. Trends Biochem. Sci., 24, 329-332.

21. Dobson, C.M. 2001 The structural basis of protein folding and its links with human disease. Philos. Trans. R. Soc. Lond. B Biol. Sci., 356, 133-145.

22. Schiffer C.A., Dotsch V. 1996. The role of protein-solvent interactions in protein unfolding. Curr Opin Biotechnol. 7(4), 428-32.

23. Costenaro L, Ebel C. 2002. Thermodynamic relationships between protein-solvent and protein-protein interactions. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 58 (Pt 10 Pt 1), 1554-1559.

24. Kita Y., Arakawa Т., Lin T.Y., Timasheff S.N. 1994. Contribution of the surface free energy perturbation to protein-solvent interactions. Biochemistry. 33(50), 1517815189.

25. Murugan R. 2003. Competitive model on denaturant- mediated protein unfolding. Biophys. J. 84, 770 774.

26. Denisov V.P., Jonsson B.-H., Holle B. 1999. Hydration of denatured and molten globule proteins. Nat. Struct. Biol. V. 6. P.253 260.

27. Tarer M., Tobias D.J. 2002. Single- particle collective dynamics of protein of protein hydration water: A molecular dynamics study. Phys. Rev. Letters. V.89. P. 275501-1 -275501-4.

28. Gottschalk M., Nilsson H., Roos H., Halle B. 2003. Protein self-association in solution: the bovine (3-lactoglobulin dimer and octamer. Protein Sci. 12(11). 24042411.

29. Lund M., Jonsson B. 2003. A mesoscopic model for protein-protein interactions in solution. Biophys J. 85(5):2940-2947

30. Brnjas-Kraljevic J., Pifat G., Maricic S. 1979. Quaternary structure, hydration, and self-association of hemoglobin. A proton magnetic relaxation study. Physiol Chem Phys. 11(4), 371-376.

31. Kutyshenko V.P., Cortijo M. 2000. Water-protein interaction in the molten-globule state of carbonic anhydrase b: an NMR spin-diffusion study. Prot. Science. 9, 15401547.

32. Кутышенко В.П., Прохоров Д.А., Христофоров B.C. // 2005. Исследование взаимодействия карбоангидазы В с водой и мочевиной. 1. Параметры спиновой диффузии, определяющие индивидуальные и коллективные свойства молекул. Биофизика. Т. 50. № 4. С. 641-647

33. Uversky, V. N., Semisotnov, G. V., Pain, R. H. and Ptitsyn, О. B. (1992) 'All-or-none' mechanism of the molten globule unfolding. FEBS Lett. 314, 89-92.

34. Uversky, V. N. and Ptitsyn, О. B. (1996) Further evidence on the equilibrium "pre-molten globule state": four-state guanidinium chloride-induced unfolding of carbonic anhydrase В at low temperature. J. Mol. Biol. 255, 215-228.

35. Kuwajima К (1996) The molten globule state of alpha-lactalbumin. FASEB J 10, 102-109.

36. Arai M & Kuwajima К (2000) Role of the molten globule state in protein folding. Adv Protein Chem 53, 209-282

37. Rana A, Gupta TP, Bansal S, Kundu B. Formation of amyloid fibrils by bovine carbonic anhydrase. // Biochim Biophys Acta. 2008 Jun;1784(6):930-5. Epub 2008 Mar 18.

38. Mark R.H. Krebs, Ludmilla A. Morozova-Roche, Katie Daniel, Carol V. Robinson and Christopher M. Dobson Observation of sequence specificity in the seeding of protein amyloid fibrils.// Protein Sci. 2004 13: 1933-1938

39. Прохоров Д.А., Кутышенко В.П., Христофоров B.C. // 2005. Исследование взаимодействия карбоангидазы В с водой и мочевиной. Спиновая диффузия при разворачивании нативного белка мочевиной. Молекуляр. биология. Т. 39. № 3. С. 497-503.

40. Кутышенко В.П., Прохоров Д.А., Христофоров B.C. // 2006. Исследование взаимодействия карбоангидазы В с водой и мочевиной. 2. Спиновая диффузия ассоциатов промежуточного состояния белка при 4.2 М мочевины. Биофизика. Т. 51. № 1. С. 24-31.

41. J.-Ch. Horng, S. J. Demarest, and D. P. Raleigh. pH-dependent stability of the human a-lactalbumin molten globule state: contrasting roles of the 6-120 disulfide and the P-subdomain at low and neutral pH// Protreins 2003. v. 52, p. 193-202.

42. Prokhorov D, Timchenko A, Uversky V, Khristoforov V, Kihara H, Kimura K, Kutyshenko V. // 2008. Dynamics of oligomer formation by denatured carbonic anhydrase II. ВВА. V. 1784. P. 834-842.

43. Кутышенко В.П. Прохоров Д.А. // 2003 Разворачивание расплавленной глобулы карбоангидразы гуанидингидрохлоридом. Молекуляр. биология. Т. 37. С. 1055-1060.

44. Кутышенко В.П., Прохоров Д.А., Христофоров B.C. // 2004. Спиновая диффузия в глобулярных белках: а-лактальбумин. Биофизика. Т. 49. №4. С.601-607.

45. А. Абрагам. Ядерный магнетизм. ИЛ, М., 1963.

46. Bloembergen N., Purcell Е.М., Pound R.V. (1948) Relaxation Effects in Nuclear Magnetic Resonance Absorption // Phys. Rev.,V 73, № 7 p. 679-712.

47. А. Керрингтон, Э. Мак-Лечлан. Магнитный резонанс и его применение в химии. М., Мир, 1970.

48. Bloembergen N. On the interaction of nuclear spins in a crystalline lattice. Physica XV, no 3-4, Mei 1949.

49. Wiithrich, K. and Wagner, G. (1978) Internal motion in globular proteins. Trends Biochem. Sci. 3, 227-230.

50. Dwek R.A., Cambell I.D., Richards R.E., Williams R.J.P. Eds. NMR in biology. Acad, Press, London, 1977.

51. McDonald C.C., Phillips W.D. Proton magnetic resonance spectra of proteins in random-coil configurations//J.Am.Chem.Soc.-1969-v.91 .-p. 1513-1521.

52. Sternlicht, H., Wilson, D. (1967) Magnetic resonance studies of macromolecules. I. Aromatic-methyl interactions and helical structure effects in lysozyme // Biochemistry, v 6, p 2881-2892.

53. Wishart, D.S., Sykes, B.D. & Richards, F.M. (1992) The Chemical Shift Index: A Fast and Simple Method for the Assignment of Protein Secondary Structure through NMR Spectroscopy // Biochemistry V. 31P. 1647-1651.

54. D.S. Wishart and B.D. Sykes. (1999) Chemical Shifts as a Tool for Structure determination// Methods in enzymology V. 239. Acad. Press. N.Y. 1994. p 363-416.

55. Gabriel Cornilescu, Frank Delaglio, and Ad Bax: Protein backbone angle restraints from searching a database for chemical shift and sequence homology // J. Biomol. NMR v. 13, p 289-302.

56. Berjanskii,M.V., Neal,S. and Wishart,D.S. (2006) PREDITOR: a web server for predicting protein torsion angle restraints // Nucleic Acids Res., 34 2006, Vol. 34 Web Server issue W63-W69 (http://wishart.biology.ualberta.ca/preditor/).

57. Berjanskii,M. and Wishart,D.S. (2006) NMR: prediction of protein flexibility // Nat. Protocols, 1, 683-688.

58. Berjanskii,M. and Wishart,D.S. The RCI server: rapid and accurate calculationof protein flexibility using chemical shifts // Nucleic Acids Research, 2007, Vol. 35, Web Server issue W531-W537 (http://wishart.biology.ualberta.ca/rci/).

59. Wuthrich K. NMR of Proteins and Nucleic Acids. N.Y.: J. Wiley & Sons, 1986.

60. Kutyshenko V.P., Khechinashvili N.N. Proton NMR studies of the denatured globular proteins.! The state of thermally denatured ribonuclease A and lysoslme.// Stud.biophys. 1989. v. 131. p. 145-154.

61. Kutyshenko V.P., Khechiriashvili N.N. Proton NMR studies of the globular proteins. II. The state of the ribonuclease A and lisozime in 6M guanidlne hydrochloride solution//Stud.Biophys. 1989-v.l31.-p.l55-160.

62. Breslow E., Beychok S., Hardman K.D.„ Gund F.R.N. Relative comformations of sperm whale metmyoglobin and apomyoglobln in solution // J.Blol.Chem. 1964. v.240. p. 304-309.

63. Breslow E., Beychok S. Changes in side chain reactivity accompanying the binding of heme to sperm whole apomyoglobln.// J.Biol. Chem.-1964-v.239.-p.486-496.

64. Wuthrich K. NMR in biological research: peptides and proteins.// American elsevier, New-York, 1976.

65. Solomon J. Relaxation processes in a si stem of two spins//Phys. Rev.-1955-v. 99. -p. 559-565.

66. Kalk A., Berendsen H.J.G. Proton magnetic relaxation and spin diffusion in proteins // J.Magn.Res.-1976-V.24.-p.343-366.

67. Кутышенко В. П., Христофоров В. С, Завьялов В. П. 'Н-ЯМР-исследование пептида, соответствующего АКТГ-подобной последовательности вариабельной части тяжёлой цепи иммуноглобулина G1 Ей человека // Биофизика-1986-т.31 .-с.958-960.

68. Kivaeva L.S., Kutyshenko V.P. Investigation of oligopeptide dlnamics by high resolution 1H NMR//Preprint-1991 -Pushchino.

69. Nogle J.H., Schirmer R.E. The nuclear Overhauser effect // N.-Y. : Academic Press 1971-p.279.

70. Wagner G., Wuthrich K. Truncated driven nuclear Overhauser effect (TOE). A new technique for studies of selective 'Н-'Н Overhauser effect in the presence of spin diffusion//J.Magn.Res.-1979-v. 33. -p. 675-680.

71. Финкельштейн А. В., Птицын О. Б.// Физика белка: Курс лекций. 3-е изд., М.,: 2005.

72. AKasaka К. Spin diffusion and the dinamic structure of protein. Streptomycea subtilisin inhibitor//J. Magn. Res.-1983-v.51.-p.l4-25.

73. Akasaka K. Intermolecular spin diffusion as method for studies macromolecule-llgand interactions // J. Magn. Res. 1979. v.36. p.135-140.

74. Akasaka K. Longitudinal relaxation of protons under cross saturation and spin diffusion // J. Magn. Res.-1981-v.45.-p.337-343.

75. G. Lipari, A. Szabo. Model-free approach to the interpretation of nuclear magnetic resonance relaxation in macromolecules. 1. Theory and range of validity // J.Am.Chem.Soc. 1982. - Vol. 104. - P. 4546-4559.

76. G. Lipari, A. Szabo. Model-free approach to the interpretation of nuclear magnetic resonance relaxation in macromolecules. 2. Analysis of experimental results // J. Am. Chem.Soc. 1982. Vol. 104. P. 4559-4570.

77. Коржнев Д.М. Изучение внутримолекулярной динамики белков и пептидов методами гетероядерной 'H-15N релаксации // Канд. диссертация, 1999, Долгопрудный.

78. Kuwajima К., Nitta К., Yoneyama М., Sugai S. Three-state denaturation of alpha-lactalbumin by guanidine hydrochloride // J. Mol. Biol. 1976. Vol. 106. P.359-373

79. Nozaka M., Kuwajima K., Nitta K., Sugai S. Detection and characterization of the intermediate on the folding pathway of human alpha-lactalbumin // Biochemistry. 1978. Vol. 17. P.3753-3758.

80. Wong K.-P., Tanford C.J. Denaturation of bovine carbonic anhydrase В by guanidine hydrochloride. A process involving separable sequential conformational transitions // J. Biol. Chem. 1973. Vol. 248. P.8518-8523.

81. Wong K.-P., Hamlin L.M. Acid denaturation of bovine carbonic anhydrase В // Biochemistry. 1974. Vol.13. P.2678-2683.

82. Holladay L.A., Hammonds R.G., Jr., Puett D. Growth hormone conformation and conformational equilibria//Biochemistry. 1974. Vol. 13. P. 1653-1661.

83. Robson В., Pain R.H. The mechanism of folding of globular proteins. Suitability of a penicillinase from Staphylococcus Aureus as a model for refolding studies // Biochem. J. 1976a. Vol. 155. P.325-330.

84. Bychkova V.E., Ptitsyn O.B. The molten globule in vitro and in vivo. // Chemtracts: Biochem. Mol. Biol. 1993. Vol. 4. P. 133-163.

85. Bychkova V.E., Ptitsyn O.B. The state of unfolded globules of protein molecules is more quickly becoming a rule, rather than an exception. // Biofizika. 1993. Vol. 38. P.58-66.

86. Damaschun G., Gernat C, Damaschun H., Bychkova V.E., Ptitsyn O.B. Comparison of intramolecular packing of a protein in native and "molten globule" states // Int. J. Biol. Macromol. 1986. Vol. 8. P.226-230.

87. Dolgikh D.A., Gilmanshin R.I., Brazhnikov E.V., Bychkova V.E., Semisotnov G.V., Venyaminov S.Yu., Ptitsyn O.B. Alpha-Lactalbumin: compact state with fluctuating tertiary structure? // FEBS Lett. 1981. Vol. 136. P.311-315.

88. Gast K., Zirwer D., Welfle H., Bychkova V.E., Ptitsyn O.B. Quasielastic light scattering from human a-lactalbumin: comparison of molecular dimensions in native and "molten globule" states //Int. J. Biol. Macromol. 1986. Vol. 8. P.231-236.

89. Kataoka M., Hagihara Y., Mihara K., Goto Y. Molten globule of cytochrome c studied by small angle X-ray scattering // J. Mol. Biol. 1993. Vol. 229. P.591-596.

90. Pfeil W., Bychkova V.E., Ptitsyn O.B. Physical nature of the phase transition in globular proteins. Calorimetric study of human alpha-lactalbumin // FEBS Lett. 1986. Vol. 198. P.287-291.

91. Yutani K., Ogasahara K., Kuwajima K. Absence of the thermal transition in apo-alpha-lactalbumin in the molten globule state. A study by differential scanning microcalorimetry // J. Mol. Biol. 1992. Vol. 228. P.347-350.

92. Acharya K.R., Ren J.S., Stuart D.I., Phillips D.C., Fenna R.E. Crystal structure of human alpha-lactalbumin at 1.7 A resolution // J. Mol. Biol. 1991. Vol. 221. P.571-581.

93. Hua Q.-X., Kochoyan M., Weiss M.A. Structure and dynamics of des-pentapeptide-insulin in solution: the molten-globule hypothesis // Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 1992. Vol. 89. P.2379-2383.

94. Hua Q.-X., Ladbury J.E., Weiss M.A. Dynamics of a monomeric insulin analogue: testing the molten-globule hypothesis // Biochemistry. 1993. Vol. 32. P. 1433-1442.

95. Peng Z., Kim P.S. A protein dissection study of a molten globule // Biochemistry. 1994. Vol. 33.P.2136-2141.

96. Baum J., Dobson CM., Evans P.A., Hanly C Characterization of a partly folded protein by NMR methods: studies on the molten globule state of guinea pig alpha-lactalbumin//Biochemistry. 1989. Vol. 28. P.7-13.

97. Chyan C.-L., Wormald C, Dobson C.M., Evans P.A., Baum J. Structure and stability of the molten globule state of guinea-pig alpha-lactalbumin: a hydrogen exchange study //Biochemistry. 1993. Vol. 32. P.5681-5691.

98. Dobson C.M., Hanley C, Radford S.E., Baum J.A., Evans P.A. // Conformations and Forces in Protein Folding / Eds. B.T. Nail., K.A. Dill. Washington D.C.: Am. Assoc. Adv. Sci. 1991. P. 175-181.

99. Hughson F.M., Wright P.E., Baldwin R.L. Structural characterization of a partly folded apomyoglobin intermediate // Science. 1990. Vol. 249. P. 1544-1548.

100. Jeng M.F.,Englander S.W., Elove G.A., Wand A.J., Roder H. Structural description of acid-denatured cytochrome c by hydrogen exchange and 2D NMR // Biochemistry. 1990. Vol. 29. P. 10433-10437.

101. Ohgushi M, Wada A. "Molten-globule state": a compact form of globular proteins with mobile side-chains // FEBS Lett. 1983. Vol. 164. P.21-24.

102. Chaffotte A.F., Guijarro J.I., Guillou Y., Delepierre M., Goldberg M.E. The "pre-molten globule," a new intermediate in protein folding. // Journal of Prot. Chem. 1997. Vol. 16. P.433-439.

103. Uversky V.N., Ptitsyn O.B. "Partly folded" state, a new equilibrium state of protein molecules: four-state guanidinium chloride-induced unfolding of beta-lactamase at low temperature. //Biochemistry. 1994. Vol. 33. P.2782-2791.

104. Potekhin S., Pfeil W. Microcalorimetric studies of conformational transitions of ferricytochrome с in acidic solution. // Biophys. Chem. 1989. Vol. 34. P. 55-62.

105. Barrick D., Baldwin R.L. Three-state analysis of sperm whale apomyoglobin folding. //Biochemistry. 1993. Vol. 32. P.3790-3796.

106. Jennings P.A., Wright P.E. Formation of a molten globule intermediate early in the kinetic folding pathway of apomyoglobin. // Science. 1993. Vol. 262. P.892-896.

107. Котова H.B., Семисотнов Г.В. Сворачивание глобулярных белков in vitro. // Успехи биологической химии. 1998. Т. 38. С.199-223.

108. Privalov P.L. Stability of proteins. Small globular proteins // Adv. Protein Chem. 1979. Vol. 33.P.167-241.

109. Privalov P.L. Stability of proteins. Proteins which do not present a single cooperative system. // Adv. Protein Chem. 1982. Vol. 35. P. 1-104.

110. Privalov P.L. Physical basis of the stability of the folded conformations of proteins // Protein Folding // Ed. Т.Е. Creighton. New York: Freeman. 1992. P.83-126.

111. Родионова H.A., Семисотнов Г.В., Кутышенко В.П., Уверский В.Н., Болотина И.А., Бычкова В.Е., Птицын О.Б. Стадийность равновесного разворачивания карбоангидразы В сильными денатурантами // Молекулярная биология. 1989. Т. 23. С.683-692.

112. Семисотнов Г.В., Кутышенко В.П., Птицын О.Б. Внутримолекулярная подвижность белка в состоянии "расплавленной глобулы". Исследование карбоангидразы В методом !Н-ЯМР // Молекулярная биология. 1989. Т. 23. С.808-815.

113. Ptitsyn О.В., Semisotnov G.V. // Conformations and Forces in Protein Folding / Eds. B.T. Nail, K.A. Dill. Washington D.C.: Am. Assoc. Adv. Sci. 1991. P. 155-168.

114. Ptitsyn O.B. The molten globule state // Protein Folding / Ed. Т.Е. Creighton. New York: Freeman. 1992. P.243-300.

115. Semisotnov G.V., Uversky V.N., Sokolovsky I.V., Gutin A.M., Razgulyaev O.I., Rodionova N.A. Two slow stages in refolding of bovine carbonic anhydrase В are due to proline isomerization// J. Mol. Biol. 1990. Vol. 213. P.561-568.

116. Privalov P.L., Tiktopulo E.I., Venyaminov S.Yu., Griko Yu.V., Makhatadze G.I., Khechinashvili N.N. Heat capacity and conformation of proteins in the denatured state. // J. Mol. Biol. 1989. Vol. 205. P.737-750.

117. Semisotnov G.V., Rodionova N.A., Razgulyaev O.I., Uversky V.N., Gripas A.F., Gilmanshin R.I. Study of the molten globule intermediate state in protein folding by a hydrophobic fluorescent probe. // Biopolymers. 1991. Vol. 31. P. 119-128.

118. Richards F.M. The interpretation of protein structures: total volume, group volume distributions and packing density. // J. Mol. Biol. 1974. Vol. 82. P. 1-14.

119. Finney J.L. Volume occupation, environment and accessibility in proteins. The problem ofthe protein surface // J. Mol. Biol. 1975. Vol. 96. P.721-732.

120. Benz F.W., Roberts G.G.K. Nuclear magnetic resonance studies of the unfolding of pancreatic ribonuclease. I.Thermal and acid unfolding // J. Mol. Biol. 1975. V.91. p.345-365.

121. Кутышенко В.П. Исследование апоцитохрома С из сердца лошади методом ^-ЯМР высокого разрешения // Биофизика. 1990. т.35.-с.407-409.

122. Кутышенко В. П. Спиновая диффузия как метод исследования динамики глобулярных белков // Доктор, диссертация, 1993, Пущино.

123. Kutyshenko V.P. Molecular interactions between protein and water by highresolution NMR spectroscopy // Molecular Biology (Moscow). 2001, v. 35. p. 90-99.

124. Kutyshenko V.P. Study of sperm-whale apomyoglobln by high resolution 1H-NMR method // Stud.bioph.-1991-v.l40.-p.37-46.

125. Кутышенко В.П., Потехин C.A. Смалла K.-X. Изучение денатурации N-концевого фрагмента а-трогомиозина методом ЯМР спектроскопии // Биофизика. 1991.Т.36.-С.762-768.

126. Kutyshenko V.P. Spin diffusion as a method to study protein dinamics. Thermal denaturation of rlbonuclease A // Stud.biophys.-1990-v.l39.-p.37-42.

127. Vincent C, Bouic P., Revilard J.P. Characterization of rat оц microglobulin // Bioch.Bloph.Res.Coram.-l 983-v. 116.-p. 180-188.

128. Кутышенко В.П., Вучелич Д. Исследование ai -микроглобулина методом Н-ЯМР высокого разрешения // Тез.докл. симпозиума "Физико-химические свойства биополимеров в растворе и клетках." Пущино-1985-с.70.

129. Волъкенштейн М.В. Биофизика.- "Наука"-1981-е. 109.

130. Adler A.J., Greenfield N.J., and Fasman G.D. Circular dichroism and optical rotatory dispersion of proteins and polypeptides // Methods Enzymol. 1973. 27D. P. 675-735.

131. Griko Yu.V., Privalov P.L., Venyaminov S.Yu., Kutyshenko V.P. Thermodinamic study of the apomyoglobln structure // J.Mol.Biol. 1988. v.202. P.127-135.

132. Трико Ю.В., Привалов П.Л., Венъяминов С.Ю. Кутышенко В.П. Термодинамическое исследование структуры апомиоглобина // Биофизика. 1988-Т.ЗЗ.-С.18-26.

133. Трико Ю.В., Веньяминов С.Ю., Привалов П. Л. Сравнительное термодинамическое исследование тепловой и холодовой денатурации лактоглобулина//Мол. Биология. 1992. т.26.-выл.2.-с.285-292.

134. Koenig S.H., Bryant R.G., Halenga K., Jacob G.S. 1978. Magnetic cross-relaxation among protons in protein solutions. Biochemistry. 17, 4348-4358.

135. Grad J., Bryant R.G. 1990. Nuclear magnetic cross-relaxation spectroscopy. J. Magn. Res. V. 90. P. 1-8.

136. Caines G.H., Schleich T., Rydzevski J.M. 1991. Incorporation of magnetization transfer into the formalism for rotating-frame spin-lattice proton NMR relaxation in the presence of an off-Resonance-Irradiation field. J. Magn. Res. V. 95. P. 538-566.

137. Caines G.H., Schleich T. 1991. Incorporation of saturation transfer into the formalism for rotating-frame spin-lattice proton NMR relaxation in the presence of an off-Resonance-Irradiation field. J. Magn. Res. P. 95. P. 457-476.

138. Kuwata K., Brooks D., Yang H., Schleich T. 1994. Relaxation- matrix formalism for rotating-frame spin-lattice proton relaxation and magnetization transfer in the presence of an off-resonance irradiation field. J. Magn.Res. B, V. 104. P. 11-25.

139. Armstrong J.M., Hopper K.E., McKenzie H.A., Murphy W.H. On the column chromatography of bovine whey proteins // Biochim Biophys Acta. 1970. V.214. P. 419-426.

140. Phillips N.I., Jenness R. Isolation and properties of human alpha-lactalbumin //Biochem. Biophys. Acta.l971.V.229. P.407 -410.

141. Armstrong J.McD., Myers D.V., Verpoorte J.A., Edsall J.T. 1966. Purification and properties of human erythrocyte carbonic anhydrases // J. Biol. Chem. V. 241. P 5137-5149.

142. John B. C. Findlay, Keith Brew 1972. The Complete Amino-Acid Sequence of Human a-Lactalbumin // Eur. J. Biochem. V. 27. P. 65-86 .

143. Wong KP, Tanford C. 1973. Denaturation of bovine carbonic anhydrase B by guanidine hydrochloride // J. Biol. Chem. V. 248. P. 8518-8523.

144. Pace C.N. Determination and analysis of urea and ganidine hydrochloride denaturation curves. Meth. Enzimol.1986. v. 131.pp 266-280.

145. Kawahara K, Tanford C. 1966. Viscosity and Density of Aqueous Solutions of Urea and Guanidine Hydrochloride // J. Biol. Chem. v.241. pp 3228-3232.

146. Debye P. (1927) Über die Zerstreuung von Röntgenstrahlen in amorphen Körpern. Physik. Z. 28, 135-141.

147. Guinier, A. 1939. Diffraction of x-rays of very small, angles-application. To the study of ultramicroscopic phenomena. Ann. Phys. 12:161-237

148. Guinier A. and G. Fournet, Small-Angle Scattering of X-rays, Wiley, New York, 1955, p. 68;.

149. Feigin, L.A., Svergun, P.I. 1987. Structure Analysis by Small Angle X-ray and neutron scattering, (eds. Taylor JW.) pp. 94-99. Plenum Press, NY.

150. Svergun D.I., Stuhrmann H.B. New developments in direct shape determination from small-angle scattering 1. Theory and model calculations. Acta Crystallogr. 1991, A47:736-744.

151. Svergun D.I., 1991. Mathematical methods in small-angle scattering data analysis. J. Appl. Cryst. 24: 485-492.

152. Svergun D.I., Volkov V.V., Kozin M.B., Stuhrmann H.B., Barberato C., Koch MHJ: Shape determination from solution scattering of biopolymers.

153. J. Appl. Crystallogr. 1997, 30:798-802.

154. Svergun, D. I., Petoukhov, M. V., Koch, M. H. J. (2001) Determination of Domain Structure of Proteins from X-Ray Solution Scattering. Biophys J., Vol. 80, p. 2946-2953

155. Svergun D.I., Volkov V.V., Kozin M.B., Stuhrmanh H.B.: New developments in direct shape determination from small-angle scattering 2. Uniqueness. Acta Crystallogr. 1996, A52:419-426.

156. Pavlov, M.Yu., Fedorov, B.A. 1983. Improved technique for calculating X-ray scattering intensity of biopolymers in solution: evaluation of the form, volume, and surface of a particle. Biopolymers. V. 22. P. 1507-1522.

157. Perkins, S.J., Ashton A.W., Boehm M.K., Chamberlain D. 1998. Molecular structures from low angle X-ray and neutron scattering studies. Int. J. Biol. Macromol. V. 22. P. 1-16.

158. Pavlov, M.Yu., Sinev, M.A., Timchenko, A.A., Ptitsyn, O.B. 1986. A study of apo- and holo-forms of horse liver alcohol dehydrogenase in solution by diffuse x-ray scattering. Biopolymers V. 8. P. 1385-97.

159. Timchenko A.A., Ptitsyn O.B., Dolgikh D.A., Fedorov B.A. 1978. The structure of ribonuclease in solution does not differ from its crystalline structure. FEBS Lett. V. 88. P. 105-108.

160. Sinev, M.A., Razgulyaev, O.I., Vas, M., Timchenko, A.A., Ptitsyn, O.B. 1989. Correlation between enzyme activitv and hinge-bendincr domain displacement in 3-phosphoglycerate kinase. Eur. J. Biochem. V. 180. P. 61-66.

161. Y. Amemiya, K. Wakabayashi, T. Hamanaka, T. Wakabayashi, T. Matsushima, H. Hashizume (1983) Design of a small-angle X-ray diffractometer using synchrotron radiation at the photon factory //Nucl. Instrum. Methods V. 208. P. 471-477.

162. A.A. Timchenko, B.S. Melnik, H. Kihara, K. Kimura, G.V. Semisotnov (2000). GroES cochaperonin small-angle X-ray scattering study shows ring orifice increase in solution, FEBS Lett. V. 471. P. 211-214.

163. Фрайфельдер Д. // Физическая биохимия. М.: Мир. 1980. с. 383-405.

164. Provencher S.W., and Glockner J. Estimation of globular protein secondary structure from circular dichroism. // Biochemistry. 1981. Vol. 20. P.33-37.

165. Yang J.T., Wu C.-S.C, and Martinez H.M. Calculation of protein conformation from circular dichroism. //Methods Enzymol. 1986. Vol. 130. P.208-269.

166. Brahms S., and Brahms J. Determination of protein secondary structure in solution by vacuum ultraviolet circular dichroism. // J. Mol. Biol. 1980. Vol. 138. P.149-178.

167. Болотина И.А. 1987. Определение вторичной структуры белков из спектров кругового дихроизма. V. Вторичная структура белков в состоянии "расплавленной глобулы" //Молекулярная Биология. Т. 21. С. 1625-1635.

168. Manning М.С., and Woody R.W. (1989) Theoretical study of the contribution of aromatic side chains to the circular dichroism of basic bovine pancreatic trypsin inhibitor// Biochemistry. Vol. 28. P.8609-8613.

169. Jagannadham M.V., and Balasubramanian D. (1985) The molten globular intermediate form in the folding pathway of human carbonic anhydrase В // FEB S Lett. Vol. 188. P.326-330.

170. Уверский B.H., Семисотнов Г.В., Птицын О.Б. (1993) Разворачивание расплавленной глобулы сильными денатурантами протекает по правилу "все-или-ничего // Биофизика. Т. 38. С.37-46.

171. Bychkova V.E., Berni R., Rossi J.-L., Kutyshenko V.P., and Ptitsyn O.B. Retinol-binding protein is in the molten globule state at low pH // Biochemistry. 1992. Vol. 31.P.7566-7571.

172. Птицын О .Б., Долгих Д.А., Гильманшин Р.И., Шахнович Е.И., Финкелыитейн А.В. Флуктуирующее состояние белковой глобулы // Молекулярная биология. 1983. Т. 17. С.569-575.

173. Chandra N., Brew К., Acharya K.R. 1998 Structural evidence for the presence of a secondary calcium binding site in human lactalbumin. Biochemistry, V. 37 p. 4767.

174. Saito R., Sato Т., Ikai A., Tanaka N. Structure of bovine carbonic anhydrase II at 1.95 A resolution. Acta Cryst. 2004. V. 60. P. 792-795.

175. Сликтер 4. 1981. Основы теории магнитного резонанса. М.: Мир.

176. Van-Quynh A., Willson S., Bryant R.G. 2003. Protein reorientation and bound molecules measured by magnetic spin-lattice relaxation. Biophys. J. 84, 558-563.

177. Kjellsson A., Sethson I., Jonsson B.-H. 2003. Hydrogen exchange in a large 29kD characterization of molten globule aggregation by NMR. Biochemistry. V. 42. P. 363-374.

178. Nelson R., Sawaya M.R., Balbirnie M., Madsen A.O., Riekel C., Grothe R., Eisenberg D. Structure of the cross-beta spine of amyloid-like fibrils. Nature, 2005, v.435, p. 747-749.

Информация о работе

Прохоров, Дмитрий Анатольевич
кандидата биологических наук
Пущино, 2008
ВАК 03.00.03

Диссертация

Исследование ненативных форм глобулярных белков методом ЯМР - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы