Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Исследование влияния мембранной поверхности на конформационное состояние глобулярных белков

ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Исследование влияния мембранной поверхности на конформационное состояние глобулярных белков"

На правах рукописи

БАСОВА ЛИАНА ВЛАДИМИРОВНА

ИССЛЕДОВАНИЕ ВЛИЯНИЯ МЕМБРАННОЙ ПОВЕРХНОСТИ НА КОНФОРМАЦИОННОЕ СОСТОЯНИЕ ГЛОБУЛЯРНЫХ БЕЛКОВ

03.00.02 - биофизика

АВ'1 ОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

ПУЩИНО - 2004

Работа выполнена в Путинском государственном университете на базе Института белка РАН и Института биофизики клетки РАН

Научиые руководители:

доктор физико-математических наук Бычкова Валентина Егоровна доктор физико-математических наук, профессор Печатников Владимир Алексеевич

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук Посшикова Галина Еорисовна доктор физико-математических наук, профессор Харако ; Дмитрий Петрович

Ведущая организация

Институт биоорганической химии им М М. Шемякина и Ю А Овчинникова РАН

Защита состоится 28 октября 2004 г в 14 час 00 мин на заседании диссертационно! о совета Д 002 038 01 в Институте биофизики клетки РАН по адресу 142290, I Пушино Московской области, Институтская ул , 3

С диссертацией можно ознакомиться п Центральной библиотеке Путинского НЦБИ РАН

Автореферат разослан «27» сентября 2004 г

Ученый секретарь диссертационного совета кандидат биологических наук

Т И, Смолихина

Оаоь-ч ч^оъ

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. В последние годы генетические заболевания человека, связанные с дефектами в сворачивании белков или их агрегацией, привлекают пристальное внимание ученых Было показано, что в эти процессы вовлекаются промежуточные состояния различных белков, не имеющих жесгкой нативной структуры и способных адаптироваться к различным усчовиям в клетке Поэтому выяснение причин, приводящих к вощикновению ненативных промежуточных сосюяний белков в клетке, является весьма актуальным Изучение устовий, приводящих к конформационным изменениям в белках, может помочь в поиске решения для устранения образования агрегатов и дефекте в сворачивании белков. Сюда же примыкают и проблемы выяснения механизмов белок-белковых взаимодействий, деградации белков в лизосомах, обмена лигандами (см. обзор ВусЬкоуа & РШэуп, 1993) Ранее было предположено, что наряду с такими естественными денатурирующими факторами, как пониженное рН в ряде ор!анелл и возникновение тепловых, солевых и других стрессов, отрицательно заряженная мембранная поверхность може1 служить умеренно денатурирующим агентом в клетке, благодаря заряду мембраны и усилению электростатических взаимодействий на границе раздела водной и неполярнои фаз Представляемая работа посвящена выяснению особенностей воздействия отрицательно заряженной мембранной поверхности на конфорчационпое состояние белков, функционирующих в ее непосредственной б'шзости Проведено изучение структурных изменений, которые могут произойти с нативными белками, имеющими различный суммарный заряд, вблизи мембраны при нейтральных значениях рН

Цель и задачи исследования. Основной целью исследования является изучение влияния отрицательно заряженной мембраны на конформационное состояние глобулярных белков при нейтральных значениях рН В задачи исследования входило-

1) охарактеризовать третичную и вторичную структуру слабо положительно заряженных холо- и апомиоглобинов и отрицательно заряженного водорастворимого фрагмента цитохрома Ьз в присутствии отрицагелыю заряженных фосфолипидных везикул,

2) изучить взаимодействие с мембраной белков, имеющих различный суммарный заряд;

3) сравнить структурные изменения белков в присутствии фосфолипидных везикул и в условиях, моделирующих ближайшее окружение мембраны (в водно-спиртовых смесях при умеренно низких значениях рН).

Научная новизна работы. Впервые проведено исследование влияния отрицательно заряженной мембранной поверхности на конформационное состояние водорастворимых

глобулярных белков при нейтральных pH. При нейтральных pH раствора в отсутствие мембран все исследованные белки имеют нативную конформацию с жесткой третичной структурой. Показано, что в присутствии отрицательно заряженных фосфолипидных везикул слабо положительно заряженные холо- и атгомиоглобины, а также отрицательно заряженный водорастворимый домен цитохрома Ы претерпевают переход из нативного состояния в промежуточное, которое имеет свойства, сходные с расплавленной глобулой, описанной для различных белков в водных условиях, но не идентично ему Полученное нами промежуточное состояние характеризуется отсутствием жесткой третичной структуры при сохранении ярко выраженной вторичной структуры Для разрушения третичной структуры каждого исследуемого белка требуется определенная концентрация фосфолишвдов, зависящая от суммарного заряда и структурной организации белка В промежуточном состоянии, возникающем под влиянием мембранной поверхности, все исследованные белки связываются с мембраной благодаря электростатическим и гидрофобным взаимодействиям. Флуктуирующая структура белков в непосредственной близости от мембранной поверхности может быть необходима для выполнения их функции В случае миоглобина это может способствовать более легкому отщеплению кислорода и обмену с другими лигандами, а в случае водорастворимого фрагмента цитохрома Ь5 - облегчению его взаимодействия с белками-партнерами при переносе электрона.

Сопоставление конформационно!о поведения белков в присутствии мембран и в модельных условиях показало, что основные черты воздействия мембранной поверхности на белки хорошо воспроизводятся в водно-спиртовых смесях при умеренно низких значениях pH Это подтверждает гипотезу о способе воздействия мембран на белки, связанную с усилением электростатических взаимодействий вблизи ее поверхности

Апробация работы Материалы диссертации были представлены на международных конференциях' "International Conference in Honor of Alexander Spirin" (Пущино, Московская область, 2001), XIV winter international youth scientific school (Москва, 2002), 16th European Experimental NMR Conference (Prague, Czech, 2002), 48 th Annual Meeting Biophysical Society (Baltimore, USA, 2004), International Summer School "Understanding Protein Stability" (Huddinge, Sweden, 2004); на российских конференциях: на II Съезде Биофизиков России (Москва, 1999), на конференции молодых ученых (Пущино, Московская область, 1999), на школе-конференции "Горизонты физико-химическои биологии" (Пущино, Московская область, 2000), Открытый семинар кафедры Молекулярной биофизики физического факультета СПБГУ (Санкт-Петербург, 2001), на третьем Всероссийском биохимическом Съезде (Санкт-Петербург, 2002), на Ш Съезде Биофизиков России (Воронеж, 2004), на

ежегодных научных конференциях Института белка РАН (Пущино, Московская область, 1999,2000,2004).

Публикации. Основные результаты диссертации опубликованы в 16 печатных работах, в том числе в 3 статьях

Структура диссертации Диссертация состоит из "Введения", пяти глав, "Заключения", "Выводов" и "Списка литературы" Работа содержит 29 рисунков и 4 таблицы

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Для исследования влияния поверхности мембран на структуру холоформы (holoMb) и апоформы (ароМЬ) миоглобипов кашалота и водорастворимого фрагмента цитохрома b5 (Cyt bi) использовали фосфолипидные бистойные везикулы (диаметром 300-500А), прш отовленные из отрицательно заряженных ненасыщенных фосфолипидов (1-пальмитоил-2-олеил-фоофа1Идилглицерин, POPG) Изучение конформационною состояния белков проводилось при различных молярных соотношениях POPG/белок для двух значений рН для миоглобина - 25 1, 50 1, 100 1, 200 1 при рН 72 и 62, для циюхрома Ъ< - 25 1, 50 1, 100.1, 200'1, 500.1 при рН 7 2 и 5 5 при 22°С При этих значениях рН белки в водном растворе имеют нативную фетичную структуру Выбор рН был обусловлен тем, что локальное значение рН вблизи мембранной поверхности может понижаться минимум на 2 единицы (Prats et al., 1986) Тогда, при рН 7 2 все белки должны сохранить третичную структуру даже при ожидаемом локальном рП 5 2 При рН 6 2 (re ожидаемом рП 4 2) апомиоглобин окаже!ся в состоянии расплавленной глобулы, а холомиоглобин при рН 6 2 и цитохром 1)5 при рН 5 5 должны окаться в начале их рН-зависичого перехода /(ля приготовления растворов использовали 0 01 М фocфaтF^ый буфер с соответствующим значением рН.

Конфорчационное состояние белков в присутствии отрицагетьно заряженных везикул изучено методами сканирующей микрокалориметрии, круювого дихроизма в ближней и дальней УФ области, спектроскопии 'lI-ЯМР высокого разрешения, триптофаиовой флуоресценции, поглощения в полосе гема высокоэффективной гель-хромато1 рафии, макроскопической диффузии и ограниченного протеоли ia

1. Исследование миоглобина.

В клетке чиоглобин существует в холо- и апоформах Холомиоглобин (17812 Да) является глобулярным высокоспиральным белком с плотно упакованным гидрофобным ядром и нековалентно связанным гемом Основной функцией миог габина явтяется связывание кислорода и его транспорт к мембране митохондрии Апомиоглобин (17200 Да)

не содержит гема и приобретает его на внешней мембране митохондрии Таким образом, как холомиоглобин, так и апомиоглобин могут испытывать воздействие отрицательно заряженной мембраны митохондрии, что подтверждает актуальность исследования влияния отрицательно заряженных фосфолипидных везикул на конформационное состояние этих слабо положительно заряженных (суммарный заряд +2 при рН 7 2) белков

Фосфолипидные везикулы вызывают нарушение третичной структуры миоглобина

Спектры кругового дихроизма п ближней УФ области для холомиоглобина при молярном соотношении РОРв/ЬоЬМЬ 200:1 при рН 7.2 и 25 1 при рН 6.2 (рис 1) не имеют

особенностей спектра, характерных для

25:1, рН 7.2 50-1, рН7 2 100-1, рН 7.2

нативного белка (N), спектр которого

представлен для сравнения Амплитуды

этих спектров близки к нулю, что указывает

на нарушение жесткой третичной структуры

белка в присутствии везикул. При более

низких концен грациях фосфолипидов (а

значит и везикул) особенности спекгра

нативного белка частично сохраняются, что

можно объяснить наличием молекул белка,

2» мо ¡70 2«о 2м зоо ло 320 у которых еще сохраняется плотная Длина волны, им

0 , г- , „ „^ упаковка боковых групп Спектр КД

Рис I Спектры кругово! о дихроизма в б тижней УФ - f

области холомиоглобина в присутствии апоМиоглобина в ближней УФ области (не фосфолипичных везикул при различных молярных

соотношениях POPG/белок и рН, указанных цифрами преде швлен) имеет меньше особенностей и около соответствующих кривых Спектр белка в

нативном состоянии (ЛО представлен для сравнения более низкое значение эллиптичности, чем спектр холоформы Однако в присутствии везикул при молярном соотношении РОРО/ароМЬ 25 1 при рП 7 2 форма спектра ближнего КД в области 250-320 нм также заметно меняется, и величина эллиптичности становится близкой к нулю Это свидетельствует о разрушении плотной упаковки боковых групп в структуре аПомиоглобина при существенно меньшей концентрации фосфолипидов.

Холоформа миоглобина содержит гем, что позволяет следить за конформационными перестройками его ближайшего окружения в присутс!вии офицательно заряженных везикул (рис 2) Спектр поглощения холомиоглобина в нативном состоянии имеет хорошо выраженный максимум в области 409 нм (полоса Соре), а в промежуточном состоянии (Г) характерное поглощение гема отсутствует (для этого белка не доказано, что I идентично расплавленной глобуле, как это показано для апомиоглобина) Для холомиоглобина в

присутствии везикул наблюдается падение интенсивности поглощения в полосе Соре при одновременном ее уширении с появлением ярко выраженного плеча в области 375 нм (рис. 2), что свидетельствует об исчезновении окружения гема, хараюерного для нативною белка. Сюит отметить, что понижение рН системы от 7 2 до 6 2 вызывает конформационные изменения в молекуле холомиоглобина в присутствии меньшей концентрации

присутствии фосфолипидных везикул при различных фосфолипидов, а именно, полоса

молярных соо-, ношениях POPG/holoMb, указанных ГЮГЛищения при соотношении POPG/holoMb цифрами около соогветствующих кривых, при рН 7 2

и 62 Для сравнения приведены спектры белка в 25 1 при рН 6 2 ClановиIСЯ близкой к нативном (N, рН 7 2) и промежуточном (/ рН 3 6)

состояниях в водном буфере таковой для соотношения 200 1 при рН 7 2

Два инварианшых тришофановых остатка миоглобина (Тгр7 и Ттр14 на спирали А), находящихся в N-концевой части молекулы, дают возможность следить за изменением конформации белка по их флуоресценции Интенсивность флуоресценции холомиоглобина в нативном состоянии (N) очень мала (рис За), что связано с наличием гема и окружающих аминокислотных остатков, вызывающих ^шение тришофановой флуоресценции Полное разворачивание холомиоглобина при 6 0 M гуанидингидрохлорида приводит к увеличению интенсивности флуоресценции и смещению максимума к 355 нм (рис За) При pli ^ 4 2 максимум флуоресценции тришофанов холомиоглобина смешается в область 340 им, что является промежуточным значением между величинами для нативною (325 нм) и полностью развернутого состояний (355 нм) (рис За) Спектры флуоресценции холомиоглобина в присутствии отрицательно заряженных везикул регисгрировались для молярных соотношений POPG/holoMb от 25.1 до 200 1 при рН 7 2 и 25 1, 100 1 при рН 6 2 (рис За) При рН 7 2 увеличение концентрации фосфолипидов при постоянной концентрации белка приводи: к сильному возрастанию ин!енсивности флуоресценции триптофанов При молярном соотношении POPG/holoMb 200 1 величина интенсивное! и флуоресценции становится близкой к сс значению для белка в промежуточном (/) и развернутом (U) состояниях. Понижение рН до 6.2 приводит к более резкому возрастанию флуоресценции, и при POPG/holoMb 100 1 интенсивность превышает се величину для промежуточного состояния в водном буфере Положение максимума флуоресценции при всех молярных соотношениях POPG/holoMb и рН одинаковое (338 нм), что близко к положению максимума

N Л ^25-1, рН 7.2

^100:1, рН 7.2

25:1, рНб.2.. Il lT "50 1, рН 6 2 j/^Vj 200:1, рН 7 2

- -Л fess\ \ i —i

МО 325 350 375 4M 425 450 475 600

Длина волны, нм Рис 2 Спектры поглощения холомиоглобина в

Рис 3 Спектры триптофановой фтуоресценпии холо- (а) и апомиоглобина (б) в ггрисутствии фосфолипидкых везикут при рН 7 2 и 6 2 Молярные соотношения РОРв/белок и значения рН указаны цифрами около соответствующих кривых Для сравнения представлены спектры флуоресценции в нативных (Л'-, рН 7 2) и развернутых (У 6 О М ОиНС! (а) и 6 О М мочевины (6), рН 7 2) состояниях, а также в промежуточных состояниях при рН 3 6 для холоформы (7) и при рН 4 2 для апоформы (ШТ)

флуоресценции для промежуточного состояния В случае апомиоглобина (рис 36), интенсивность флуоресценции при молярном соотношении РОРО/ароМЬ 25 1 при рН 7 2 превышает ее значение как для нативного {Щ и развернутого (Ц) состояний белка, так и его состояния расплавленной глобулы (МО) Увеличение молярной концентрации фосфолипидов, шкже как и понижение рН до 6 2, не приводит к замегному росту интенсивности флуоресценции, по сравнению с 25'1 Положение максимума спектра флуоресценции апомиоглобина в присутствии отрицательно заряженных фосфолипидных везикул во всех случаях соответствует 340 нч, что характерно для расплавтенной глобулы эгого белка растворе Это означает, что локальное понижение рН вбчизи мембранной поверхности в условиях низкой ионного силы, составляет порядка 3 единиц рН Можно заключить, что холо- и апоформы миоглобина в присутствии отрицательно заряженных фосфолипидных везикул не имеют специфичного окружения триптофановых осштков, характерного для нативного белка В случае холомиоглобина меняется взаимная ориентация и расстояние между гемом и фиптофанами Положение максимума спектров и сильный рост интенсивности флуоресценции триптофанов можно объяснить как влиянием гидрофобного слоя мембраны, особенно для апомиоглобина, так и сохранением компактной структуры белка

Приведенные эксперимешальные данные четко указываю! на то, что пространственная сгруктура холо- и апомиоглобинов в присутствии отрицательно заряженных фосфолипидных везикул нарушается при обоих значениях рН При этом исчезает плотная упаковка боковых групп и нарушается специфичное окружение

6

тритттофановых остатков и гема Это состояние по свойствам, полученным спектральными методами, похоже на промежуточные состояния этих форм в растворе, но не идентично расплавленной глобуле, хотя проявляет ее основные свойства Подобное промежуточное состояние обеих форм миоглобина наблюдается в водно-спиртовых смесях при умеренно низких значениях рН Полное исчезновение особенностей третичной структуры для холомиоглобина в присутствии везикул наблюдается при молярном соотношении РОРв/МоМЬ 200-1 при рН 7 2 и 25-1 при рН 6 2, в то время как для апомиоглобина - при более низком соотношении РОРСг/ароМЬ (25:1 при рН 7 2)

Об уменьшении жесткости третичной структуры миоглобина в присутствии везикул свидетельствует также увеличение доступности белка протсазам (трипсину) в этих условиях по сравнению с нативным белком в растворе

Вторичная структура миоглобина « присутствии фосфолипидных везикул сохраняется

Спектры КД в дальней УФ области холомиоглобина в присутствии везикул (рис 4а) приобретают форму, похожую на таковую для промежуточного состояния (Г) этою белка в растворе (происходит изменение соотношения величины эллиптичности в минимумах спектров) Однако значение величины эллиптичности на длине волны 220 нм меняется незначительно и при больших концентрациях фосфолипидов не становится меньше величины эллиптичности для промежуточного состояния, а также по всем характеристикам отличается от белка в полностью рашернуточ состоянии (Ц) Ого указывает на сохранение

Рис 4 Спектры круювого дихроизма холомиоглобина (а) и апомиоглобина (б) в дальней УФ области при разных молярных соотношениях РОРС/белок и рН, указанных цифрами около соответствующих кривых Для сравнения приведены спектры белка нативных (..V, рН 7 2) и развернутых {// 6 0 VI ОиНО! (а) и 6 0 М мочевины (б), рН 7 2) состояниях, а также в промежуточных состояниях при рН 3 6 для холоформы (/) и при рН 4 2 для апоформы (МО)

выраженной спиральной вторичной структуры холомиоглобина в присутствии везикул В случае апомиоглобина изменения спектров еще менее выразительны, значение эллиптичности на 220 нм близко к таковому нативного белка (.¡V) (рис 46) и при этом сильно отличается от спектра белка в полностью развернутом состоянии При рН 6.2 для холо- и алоформ миоглобина в присутствии везикул наблюдается картина, сходная с таковой при рН 7.2. Однако для достижения тех же конформационных изменений при рН 6 2 требуется существенно меньшее количество фосфолипидов, т е даже столь незначительное изменение рН в растворе для нативного белка приводит к его более эффективной денатурации в присутствии везикул.

Из вышесказанного следует, что вторичная структура миоглобина в присутствии отрицательно заряженных фосфоляпидных везикул сохраняет свою спиральную природу, а изменение формы спектров связано с конформационными перестройками в молекуле белка в этих условиях Таким образом, для обеих форм миоглобина в присутствии веиткул при нейтральных рН происходит нарушение нативной третичной структуры при сохранении вторичной

Денатурация миоглобина, вызываемая фосфолипидными везикулами, приводит к взаимодействию белка с их поверхностью

Анализ результатов, полученных спектральными методами, показывает, что при молярном соотношении РОРО/МоМЬ 200:1 при рН 72 и 25 1 при рН 6 2 все молекулы холомиоглобина утрачивают плотную упаковку боковых групп При меньших концентрациях присутствует смесь молекул белка с нативными свойствами и в денатурированном состоянии С целью определения локализации молекул белка, находящихся в присутствии везикул в различных состояниях были использованы методы высокоэффективной гель-хроматографии, макроскопической диффузии и 'П-ЯМР высокого разрешения

Профили эшоции белка в присутствии везикул при обоих ¡начениях рП обнаруживают два пика' один соответствует выходу нативного белка, друтой - выходу везикул (рис 5) Пик в области выхода везикул может появиться только в случае, если беток связан с везикулами или находится в больших агрет атах, т к регистрация проводилась на длине волны 280 нм, характерной для 1Ю1 лощения белка, а фосфолшшдные везикулы поглощают на 226 нм Однако последнее исключается, так как при использовании спектральных методов агрегации не наблюдалось При соотношении РОРО/Ъо1оМЬ 25 1 и рП 7 2 наблюдается ботьшой по площади (-75%) пик в области выхода нативного белка (Лг), что соответствует доле несвязанного белка в данной системе Увеличение концентрации

фосфолипидов приводит к уменьшению этого пика при одновременном увеличении поглощения пика элюции в области выхода везикул Полное исчезновение пика несвязанного белка при рН 7.2 происходит при молярном соотношении РОРО/1ю1оМЬ 200 1 (рис 5), а при рН 6 2 - РОРО/Ьо1оМЬ 50 1, т.е. в этих условиях все молекулы белка оказываются связанными с везикулами В случае апомиоглобина полное исчезновение | особенностей фетичной сфуктуры [

Время элюции, ми

происходит уже при молярном соотношении Рис 5 Ирофили элюции ХШЮМИОглобиш

присутстш

вязи с этим

молярных

на полученных профилях

РОРО/ароМЬ 25 1 при рН 7.2. В связи с этим ПРИСУТСТВИИ фосфолипидных везикул при различных г г молярных соотношениях (указанных цифрами около

ЭТЮЦИИ соответствующих кривых) при рН 7 2 и 6 2 Для сравнения приведен профиль элюции белка в апомиоглобина в этих условиях поглощение натаяно« состоянии (/V рН 7 2) Стрелками указаны

объемы выхода везикут и маркерных бстков Колонка нативной формы белка отсутствует, а весь Бирегаех 75 НИ/Ю/ЗО

белок регистрируется в объеме выхода везикул (рисунок не представлен) При более высоком соотношении РОРО/ароМЬ кривые элюции совпадают с таковыми для соотношения 25 1. Следовательно, апомиоглобин полностью взаимодействует с везикулами уже при малом молярном соотношении РОРО/ароМЬ при рН 7 2, тк увеличение концентрации везикул и понижение рН до 6 2 не приводят к изменениям профиля элюции Это указывает на образование промежуточного состояния в этих условиях, т.к белок в нативном состоянии не имеет сродства к мембране

Коэффициенты диффузии, полученные при помощи метода макроскопической диффузии для холомиоглобина в присутствии везикул при соотношении РОРв/ЬоЬМЬ 25'1

при рН 7 2, а также для

Таблица 1. Макроскопическая диффузия

холомиоглобина при различных условиях

Состояния/условия Коэффициент диффузии Dx10 (см2/сек) Диаметр молекулы А

Нативное состояние (/V, рН 7 2) 14+1 32

РОРЭ/Ьо1оМЬ 25 1 рН 7 2 6 5±0 5 67

Р0РЗЛю1оМЬ 200 1 рН 7 2 диффузии белка нет

РОРЭ (везикулы) рН 7 2 1 5 ± 0 5 300

нативного состояния, позволили рассчитать диаметр молекул свободного белка (Таблица 1) При оценке площади под кривой диффузии белка в присутствии везикул оказалось, что она на 25% меньше площади под кривой для белка в нативном состоянии В данном методе площадь под

кривой диффузии пропорциональна концен фации белка, следовательно, уменьшение

площади для белка без везикул на 25% позволяет сделать вывод, что это количество молекул

белка связалось с везикулами Коэффициент диффузии несвязанного белка в присутствии

везикул по величине оказался в два раза меньшим, чем для нативного белка. В данном

случае, замедление диффузии белка в присутствии везикул и, как следствие, сильное

увеличение коэффициента диффузии может быть связано с ассоциацией белка, вызванной

его дестабилизацией, кроме этого сами везикулы могут препятствовать свободной диффузии

белка Поэтому, оценка гидродинамических размеров несвязанного белка в присутствии

везикул требует дополнительных исследований При молярном соотношении POPG/hoIoMb

200'1 при рН 7 2 диффузия свободного белка вообще не наблюдается, т.е все молекулы

белка уже связаны везикулами. Эксперименты по диффузии апомиоглобина в присутствии

везикул не проводились, т к по данным гель-хроматографии белок при всех молярных

соотношениях связывается с везикулами

Для характеристики состояния несвязанного холомиоглобина, который наблюдается

при низких концеп фациях фосфолипидов, был использован метод 'Н-ЯМР высокого

разрешения с рабочей частотой 400 МГц (рис

6) Дисперсия химических сдвигов указывает

на то, что холомиоглобин в растворе при рН

7 2 имеет достаточно жесткую третичную

структуру Характерные высоко- и

низкопольные резонансы холомиоглобина

незначительно перекрываются с сигналами

фосфолипидов (POPG) (рис 6), что позволяет

оценить состояние белка, имеющего

специфичные резонансы в этих областях Для

измерения были выбраны условия с

минимально (POPG/ holoMb 25 1 при рН 7 2)

и максимально (POPG/holoMb 70.1 при рН

6.2) возможным эффектом воздействия

мембраны на белок В первом случае Рис 6 Спектры 'Н-ЯМР высокого разрешения

холомиоглобина в присутствии фосфолипидных происходит уменьшение интегральной везикул при рН 7 2 и 6 2 Молярные соо гношения

указаны около соо.ветствуюших кривых Спектры площади прогонных резонансов белка как в

белка в нативном состоянии и везикул в отсутствие ^ ,

белка приведены для сравнения ароматической, так и в алифатическои

области спектра на -30% по сравнению с нативным белком, а в оставшемся количестве белка

набчюдаются специфичные резонансы, похожие на таковые для нативного белка Во втором

случае, резонансы в спектре ЯМР, характерные для аромагических и алифатических групп белка, не обнаруживаются, следовательно, нативиый белок в сисгемс отсутствуез Интегральные площади в области резонансов СН2-]рупп фосфолипидов в обеих исследуемых системах увеличиваются, что косвенно свидетельствует о нарушении исходной структуры бислоя, т е указывает на связывание белка с везикучами

Суммируя данные, полученные методами жидкостном гель-хроматографии, макроскопической диффузии и 'Н-ЯМР, можно заключить, что при молярном соотношении РОРй/Ьо1оМЬ 25'1 при рН 7 2 примерно третья часть молекул белка связана с везикулами и не имеет жесткой третичной структуры Остальные молекулы белка находятся в свободном состоянии и проявляют свойства, характерные для нативного состояния при комнатной температуре При молярном соотношении РОРО/1ю1оМЬ 200 1 при рН 7 2 и 70 1 при рН 6 2 белок не имеет жесткой третичной структуры и полностью связан с вешкулачи, что приводит к нарушению упаковки фосфолипидов в бислое

Стабильность структуры миоглобина в присутствии фосфолипидных везикул

Для характеристики конформационной стабильности белка в присутствии фосфолипидных везикул использовали меюд сканирующей микрокалориметрии Хорошо известно, что белок в промежуточном состоянии, I е не имеющий нативной третичной

структуры, не обнаруживает пиков теплоии лощения. Ненасыщенные

фосфолипиды (РОРв), из которых были получены везикулы, имеют фазовый переход гель-жидкий кристалл при температуре 271 К (-2°С), что находится далеко за пределами температурного п гавления белка В связи с этим при плавлении белка в присутствии везику I мы наблюдаем только за изменением кривых теплопоглощения белка При молярном соотношении РОРО/Ьо1оМЬ 25 1 при рН 7 2 (рис 1) наблюдается пик тсплопоглощения белка, который смещен в сюрону более низких температур (на ~20°С), по сравнению с нативным белком (¿V) Значение энтальпии при эюм уменьшается

Рис 7 Зависимость избыточной парциальной теплоемкости от температуры холомиопобина в присутствии фосфолипидных везикул при разных молярных соотношениях РОРОЛю1оМЬ, угнанных цифрами около соответствующих кривых, при рН 7 2 Для сравнения представлена кривая теплопоглощения белка в нативном состоянии (Н рН 7 2)

о 500 кДж/моль (для нативного белка) до 280 кДж/моль, очевидно, за счет уже денатурированных и связанных -25% молекул белка. Снижение температуры максимума пика теплопоглощения может быть вызвано дестабилизацией нативного белка и стабилизацией денатурированных молекул белка за счет связывания с везикулами. При молярном соотношении РОРО/Ьо1оМЬ 50' 1 и выше (до 200.1) при рН 7 2, а также при всех молярных соотношениях при рН 6.2, пик теплопоглощения холомиоглобина отсутствует, что характерно для молекул белка без плотной упаковки боковых групп По изучению КД в ближней УФ области при РОРО/Ьо1оМЬ 50 1 при рН 7 2 часть белка сохраняет третичную структуру, однако это не противоречит калориметрическим данным, т к температура в этих условиях является дополнительным денатурирующим фактором Апомиоглобин в присутствии фосфолипидных везикул при всех молярных соотношениях при рН 7.2 и 6.2 не имеет пиков теплопоглощения, те жесткая третичная структура белка отсутствует. Это согласуется с данными, полученными другими методами

2. Изучение водорастворимого фрагмента цитохрома Ь5

Цитохром - это периферический мембранный белок, который имеет

водорастворимый домен (12000 Да), содержащий, как и миоглобин, нековалентно связанный гем, и неполярный мембраносвязываемый участок (3000 Да) Отрицательно заряженный водорастворимый фрагмент цитохрома Ь5 (суммарный заряд -6 при рН 7 2) функционирует в поте мембраны эндоплазматического ретикутума, участвуя в переносе электрона своим партнерам В связи с этим изучение конформационного поведения водорастворимого фрагмента цитохрома Ь5 (для краткости далее цитохрома Ь5) вблизи мембранной поверхности важно для понимания механизма его функционирования.

Нарушение нашивных взаимодействий в третичной структуре цитохрома Ъ; в присутствии фосфолипидных везикул

Калориметрическое изучение цитохрома в присутствии отрицательно заряженных везикул было проведено при различных молярных соотношениях РОРО/Суг Ьб от 50:1 до 500 1 при рН 7 2 и 25'1 при рН 5 5 (рис 9) Из рис 9а видно, что цитохром Ь5 в присутствии везикул при молярном соотношении РОРО/Суг Ь5 50 1 и рН 7 2 имеет хорошо выраженный пик теплопоглощения с максимумом при температуре 342 К (69°С), такой же, как для нативного белка (Ы) - 341 К (68°С) Однако энтальпия денатурации белка в присутствии везикуч снизилась до 208 кДж/моль с 390 кДж/моль (для нативного белка) Наличие пика теплопоглощения свидетельствует о плавлении белковых молекул, имеющих третичную структуру, а уменьшение энтальпии денатурации указывает на снижение количества

$»

ж *

е< £ 20

а

- рН 7.2

РОРв/Суг Ьв 50:1

РОРв/Су^ Ь, 100 1 и I 1 1 1

г зо

4

¿Г 20

V, рИ 5 5

РОРв/СуГ 65 25 1

Температура, К

320 340

Температу ра, К

Рис 9 Температурная зависимость избыточной парциальной клшоечкости цитохрома и; в присутствии отрицательно заряженных фосфотипидных везикул при различных молярных соотношениях РОРП/Су! Ь5, указанных цифрами около соответствующих кривых, при рН 7 2 (а) и 5 5 (б) Спектры белка в отсутствие везикул (Л9 при двух значениях рН приведены для сравнения

белковых молекул, имеющих плотную упаковку боковых групп, и появление ненативного

белка При более высоких молярных соотношениях РОРСт/Су! Ы при рН 7 2 пики

теплопоглошения белка отсутствуют, что связано с денатурацией большей части молекул

белка в присутствии везикул, а также при дополнительном воздействии температуры При

рН 5 5 кривая теплопоглощения цитохрома Ь; в отсутствие везикул отличается от гаковой

при рН 7 2 (рис 96) Причиной этого может

являться известная зависимость

стабильности нативных молекул белка О! рН

Увеличение концентрации фосфолипидов в

этих условиях не приводит к изменениям в

кривых теплопоглощения бечка

Рсзу ¡ьтаты, полученные с помощью

метода КД в ближней УФ области для

цитохрома Ы в присутствии везикул в тех же

условиях (рис 10), что и в экспериментах по

микрокалориметрии, подтверждают

Длина волны, им

Рис 10 Спектры круговою дихроизма в б шжней УФ 01сутсгвис третичной структуры при

области цитохрома Ь5 в присутствии фосфолипидных молярном соотношении РОРО/С}Л Ь5 500 1 везикул при различных молярных соотношениях

РОРО/Сут Ь5 и рН, указанных цифрами около ПрИ рн 7 2 и при всех соотношениях при рН соответствующих кривых Спектр белка в нативном

состоянии (К рН 7 2) представлен для сравнения 5 5 При РОРО/Су1 Ь5 50" 1 при рН 7 2 спектр

« 06 о

ч

кругового дихроизма белка сохраняет основные особенности спектра нативного белка (-/V) и

лишь незначительно уменьшается по амплитуде, что свидетельствует о наличии части

мо шкул белка, не имеющих жесткой третичной структуры (рис 10) Увеличение молярного

соотношения РОРО/Су( Ь5 приводит к более заметным изменениям формы спектра, при этом

абсолютное значение эллиптичности во всем исследуемом диапазоне длин волн стремится к

нулю, что указывает на нарушение плотной упаковки боковых групп

Спектр поглощения цитохрома Ь; в присутствии отрицательно заряженных

фосфолипидных везикул при молярном соотношении РОРв/Су! Ьв 50' 1 и рН 7 1 по форме и

значению поглощения на длине волны 412 нм близок к нативному (¿V) (рис 11). Увеличение

молярного соотношения до 500 1 дает более заметные изменения спектра в полосе Соре и

сопровождается появлением плеча на 380 нм. которое соответствует состоянию белка с

ненативным окружением гема. При рН 5 5

уже при РОРО/Суг Ь5 50:1 форма спектра

приобретает черты, характерные для

ненативного белка (рис 11). Увеличение

концентрации фосфолипидов не приводит к

изменению полосы поглощения тема Таким

образом, изменения спектров поглощения

цитохрома 1?5 в ирису 1Ствии везикул

свидетельствуют о появлении ненативного

окружения гема и денатурации белка в

"*» зя «» «ю 500 целом, но не о его разворачивании При Длина волны, нч

,, ,, этом спектры поглощения в присутствии

Рис 11 Изменение поглощения в полосе тема г '

цитохрома Ь5 в присутствии фосфптипияных вешкул везИкул сильно отличаются от спектра при раз 1ичных молярных соотношениях РОРО/Су1 Ь5,

указанных цифрами около соответствующих кривых, белка в состоянии расплавленной глобулы при рН 7 2 и 5 5 Спектры белка в нативном состоянии

(.V, рН 7 2) и в состоянии расплавленной г шбулы {МО, ШО) при рН ^ 0, что указывает на различие рН 3 0) приведены для сравнения

окружения гема в присутствии мембран и в

водном окружении для этого белка

Флуоресценция цитохрома Ь5 в нативном состоянии имеет низкую интенсивность и слабо выраженный максимум в области 335 нм (рис 12), что является следствием тушения единственного триптофанового остатка гемом и аминокислотными остатками из его окружения, как это наблюдалось в с^гучае холомиоглобина. Максимум спектра флуоресценции белка в полностью развернутом состоянии (£/) смещается к 360 нм, а интенсивность флуоресценции возрастает Для белка в присутствий везикул при молярном соотношении РОРО/С)Т Ь5 50.1 при рН 7 2 интенсивность флуоресценции еще остается

А*

200 1, рН 5 5

50 1, рН 5 5 \

500-1, рН 7 2 V .200-1, рН 7 2 ' '//

501, рИ 7 2 /КУ/ ! М

/У \\\

— | х и Л К I

Длина волны, им

низкой, те окружение триптофапового остатка меняется незначительно (рис. 12). При

увеличении концентрации фосфолипидов до соотношения POPG/Cyt bs 200 1 и выше при рН

7 2 происходит рост интенсивности триптофановой флуоресценции, однако по величине она

составляет лишь половину от таковой для полностью развернутого состояния Значение

длины волны в максимуме при всех

молярных соотношениях соответствует 340

нм, что близко к таковому для цитохрома Ь5

в нативном состоянии (N) Это може) быть

связано как с влиянием гидрофобной части

везикулы, так и с присутствием в

денатурированном белке достаточно

компактной структуры При молярном

соотношении POPG/Cyt b5 50 1 при рН 5 5

происходит резкое возрастание

интенсивности флуоресценции (рис 12),

которая по значению даже выше, чем при Рис 12 Изменение триптофановой флуоресценции

ицтохрома Ь5 в присутствии фосфолипидных везикул максимально используемом молярном

при различных молярных соотношениях POPG/Cyt b5 г. _ - п

ц , _ ,, . ' cooi ношении при рН 7 2 Дальнейшее

при рН 7 2 и 5 5, указанных цифрами около 1 г

соответствующих кривых Спектры белка в нативном увеличение концентрации фосфолипидов (N, рН 7 2) и в полностью развернутом состоянии (V,

60МGuHCl) приведены для сравнения ПрИ рН 5 5 приводи) лишь к

дополнительному увеличению ишенсивности Положение максимума cneKipa флуоресценции цитохрома bs в присутствии везикул в этих условиях немною смещается в коротковолновую область, что указывает либо на усиление действия гидрофобной части мембраны, либо на возникновение незначительной ассоциации белка Таким образом, увеличение интенсивности флуоресценции указывает на изменение расстояния и взаимной ориентации между гемом и единственным триптофаном, т е происходит нарушение жесткой третичной структуры белка, но разворачивания молекулы при лом не наблюдается

Изучение третичной структуры цитохрома b¡ в присутствии отрицательно заряженных фосфолипидных везикут при рН 7 2 по',вотяе1 сделать вывод, что плотная упаковка боковых групп нарушается и окружение триптофана и гема становится ненативным При рН 5 5 денатурирующее действие мембраны более эффективно вследствие наблюдаемой дестабилизации структуры наивного белка в зависимости от рН

Для цитохрома bs также было изучено влияние везикул из смеси ненасыщенных отрицательно заряженных (POPG) и насыщенных незаряженных (DPPC) фосфолипидов на его конформационное состояние при рН 7 2 Обнаружено, что воздействие везикул из смеси

фосфолипидов на структурные изменения белка оказалось более эффективным, чем только из отрицательно заряженных фосфолипидов. Цитохром Ь5 полностью утрачивает жесткую третичную структуру уже при молярном соотношении ПРРС РОРС (50'50)/Су1 Ь5 100:1 при рН 7 2, в то время как в присутствии отрицательно заряженных везикул лишь при РОРО/Су1 Ь$ 200' 1 при этом же значении рН.

Сохранение вторичной структуры цитохрома Ь5 в присутствии фосфолипидных везикул

Спектр кругового дихроизма в дальней УФ области цитохрома Ь5 в присутствии

отрицательно заряженных везикул при молярнои соотношении РОРв/Су! Ы 50:1 при рН 7.2

по всем характеристикам близок к нативному (Щ (рис 13), следовательно, вторичная

структура бетка меняется незначительно При увеличении концентрации везикул до

соотношения 500'1 при рН 7.2 происходит

изменение формы спектра, который

становится похож на спектр белка в

состоянии расплавленной глобулы в водных

условиях (МО) Понижение рН до 5 5

приводит к увеличению абсолютного

значения (на 220 нм) эллиптичности спектра

для цитохрома Ъ5 в присутствии везикул по

сравнению со спектром белка в

промежуточном состоянии (рис 13), что

. свидетельствует об увеличении содержания

длиня волны, нм

Рис 13 Спектры кругового дихроизма в дальней УФ вторичной структуры. Аналогичное

области цитохрома Ь, в присутствии фосфолипидных изменение спектров наблюдае1СЯ для

везикул при различных молярных соотношениях

РОРС/СуТ Ь, при рН 72 и 5 5, указанных цифрами цитохрома Ь5 при больших конценфациях около кривых Для сравнения приведены спектры

белка в нагивном (л?, оН 7 2) и полностью метанола. Это можно объяснить увеличением развернутом (С/, 6 0 М СиНС]) состояниях, а также в

состоянии расплавленной глобулы (МО рН 3 0) стабильности водородной связи внуфи

полипептидпой цепи при попадании белка в более гидрофобное окружение. При этом все спектры белка в присутствии везикул отличаются от спектра белка в полностью развернутом состоянии (ГУ) (рис 13), следовательно, белок сохраняет хорошо выраженную вторичную структуру

Взаимодействие цитохрома Ь; с фосфолипидными везикулами

Нами показано, что миоглобин при разрушении его пространственной структуры связывается с везикулами, поэтому, используя высокоэффективную гель-хроматографию,

было также проверено взаимодействие цитохрома Ь5 с везикулами При молярном соотношении POPG/Cyt b5 50 1 при pli 7 2 высота пика элюции по сравнению с таковой для нативного белка (N) уменьшается незначительно (на ~20%), но одновременно появляется

небольшой пик в области элюции везикул (рис. 14) Увеличение концентрации фосфолипидов приводит к уменьшению высоты пика в области элюции нагивного цитохрома 1>5 при одновременном возрастании площади под пиком в области выхода везикул Регистрация элюции проводится на длине волны 280 нм, где фосфолипиды не поглощают, поэтому, наблюдаемое поглощение соответс т вует выходу белка, связанного с везикулами. Связывание всех молекул белка при рН 7 2 происходит лишь при молярном

Рис 14 Профили элюции цитохрома Ь5 в присутствии

фосфолипидных везикул при различных молярных соотношении POPG/ Cyt bs 500.1 (рис. 14), а соотношениях POPG/Cyt b5 и рН, указанных цифрами IT , г ~ПА , . . „

около соответствующих кривых Стрелками указаны ПРИ РН 5 5 " ПРИ 200'' (РИС 14' КРИВая места выхода везикул и маркерных белков совпадает с кривой 500.1, рН 7 2) 1аким

образом, цитохром bs также может взаимодействовать с везикулами, как и миоглобин, однако для этого требуется более высокая молярная концентрация фосфолипидов, чем для холомиоглобина Понижение рН до 5 5 приводит к облегчению взаимодействия белка с везикулами за счет ¡ависичосги стабильности нативной структуры бетка от pli

Сравнительная характеристика конформационного поведения исследуемых белков в присутствии фосфолипидных везикул

Экспериментально показано, что обе формы миоглобина и водорастворимый фрагмент цитохрома Ьз, несмотря на их структурное различие и различие в суммарном заряде, в присутствии отрицательно заряженных фосфолипидных везикул при нейтральных значениях рН претерпевают нарушение жесткой третичной структуры Отрицательно заряженный фрагмент цитохрома Ь5 оказался билее устойчив к денатурирующему действию везикул, чем слабо положительно заряженный холомиоглобин, тк плотная упаковка боковых групп цитохрома Ь; разрушается при более высоких молярных конценфациях фосфолипидов Денатурирующее воздействие везикул на структуру апомиопобитта еще более эффективно, чем в случае холомиоглобина, что можно объяснить дестабилизацией структуры молекулы

вследсгвие отсутствия тема Для всех исследуемых белков в присутствии везикул сохраняется регулярная вторичная структура, т е. белки переходят в промежуточное состояние, которое отличается как от нативного, так и полностью развернутого состояний Однако полученное нами промежуточное состояние хо!я и не идентично состоянию расплавленной глобулы белка в водных условиях, тк. сложно оценить его размеры, но обнаруживает его основные свойства В этом ненативном состоянии все белки связываются с отрицательно заряженными везикулами, нарушая исходную упаковку фосфолипидов в бислое Однако данные по трипсинолизу позволяют предположить, что связанный с везикулами белок сохраняет некоторую компактную структуру, т.к. холомиоглобин в присутствии везикул не обнаруживает полного протеолиза и распадается на фрагменты, аналогичные образующимся при трипсинолизе его аноформы без везикул Следует напомнить, что апомиоглобин имеет гидрофобное ядро и является достаточно компактным В процессе взаимодействия белка с мембраной принимают участие как электростатические, так и гидрофобные взаимодействия, связанные с зарядами фосфолипидиых головок и возможным погружением амфифильных участков белков в верхнюю часть бислоя Сходные конфорчационные изменения для этих белков наблюдаются и в водно-спиртовых смесях при умеренно низких значениях рН Это указывает на то, что прос/ейшая модельная система достаючно достоверно отражает основной денатурирующий эффект мембранной поверхности, который связан с локальным понижением рН и диэлектрической проницаемости около поверхности мембраны, при этом последнее проявляется в усилении электростатических взаимодействий Такой же эффект достигается при кислых рН (рН ~ 23), когда структура многих белков совершает переход в состояние расплавленной глобулы, а в присутствии отрицательно заряженных везикул денатурация белков наблюдается даже при нейтральных рН.

Образование ненативных молекул белка в непосредственной близости от мембранной поверхности может быть необходимо для выполнения их функции В стучае миоглобина актуальным остается вопрос о механизме отщепления кислорода от оксимиоглобина Как нами было показано (описано в диссертации), вблизи отрицательно заряженных везикул происходит ускорение процесса автоокисления миоглобина, которое протекает одновременно с изменением конформации белка, тестируемым другими методами. Приобретение более гибкой структуры водорастворимым фрагментом цитохрома Ь5, возможно, необходимо для взаимодействия с его белками-партнерами в окислительно-восстановительных реакциях

выводы

1 Показано, что отрицательно заряженная мембранная поверхность оказывает денатурирующее действие на структуру слабо положительно заряженных холо- и апомиоглобинов и отрицательно заряженного водорастворимого фрагмента цитохрома Ьб даже при нейтральном значении рН При злом происходит переход из нативного состояния в промежуточное, характеризующееся отсутствием нативной третичной структуры, но сохранением ре!улярной вюричной

2 В промежуточном состоянии изучаемые белки связываются с мембраной, однако водорастворимому фрагменту цитохрома Ь5 для этого требуется большая концентрация фосфолипидов, чем холомиоглобину Связывание апомиоглобина происходи! при еще более низкой концентрации фосфолипидов, чем связывание его холоформы.

3 Конформационные изменения белков в присутствии отрицагельно заряженных фосфолипидных везикул и в водно-спиртовых смесях при умеренно низких рН срсды носят сходный характер. Это подтверждает гипотезу о возможном механизме воздействия мембран на белки, связанном с локальным понижением рН и диэлектрической проницаемости около поверхности мембраны, при этом последнее проявляется в усилении электростатических взаимодействий

Список работ, опубликованных по теме диссертации:

1 Басова JIВ, Ильина Н Б, Василенко К С., Гиктопуло Е.И, Бычкова В Е Конформационные состояния водорастворимого фрагмента цитохрома bs рН-зависимая денатурация. Молекулярная биология. 2002. Том 36, N5, с. 891-900

2 Басова Л В., Тиктопуло Е И., Кашпаров И.А, Бычкова В Е Конформационное состояние апомиоглобина в присутствии фосфолипидных везикул при нейтральных рН Молекулярная биология 2004 Том 38, N2, с. 323-332

3 Basova L V, Tiktopulo ЕI, Klenin S.I, Bychkova V E Negatively charged phospholipid vesicles affect tertiary structure of holomyoglobin at neutral pH Biophysical Journal 2004 V 86, N1, p. 617.

4 Басова JI В , Тиктопуло E И , Бычкова В Е Влияние модельных мембран на структуру холочиоглобина конформационные изменения при рН 6 2 Молекулярная биология 2005 Т 39, ООО (в печати).

5 Басова Л В, Тиктопуло Е И, Бычкова В Е Фосфолипидные мембраны вызывают конформационные изменения в водорастворимом фрагменте цитохрома bs при рН 5 5 Тезисы докладов III съезда биофизиков России, Т 1, С. 8-9, Воронеж, Россия, 24 06-29 06, 2004.

6 Басова Л.В., Тиктопуло Е.И., Ильина Н Б, Бычкова В Е Конформационное поведение альфа-лактальбумина человека в прису icibhh искусственных мембран 1 езисы докладов III съезда биофизиков России, Т 1, С. 10, Воронеж, Россия, 24 06-29.06, 2004

7 Basova L V , Tiktopulo Е I, Bychkova V Е The effect of model membrane on myoglobin conformational state at neutral pH. International Summer School "Understanding Protein Stability" May 8-14, 2004, Huddinge, Sweden. Abstract book, p 45.

8. Басова Л.В, Тиктопуло Е.И., Ильина Н Б, Бычкова В.Е Сравнительное изучение конформационного состояния цитохрома bs и холомиоглобина в присутствии фосфолипидных везикул. Тезисы научных докладов 3-его Съезда Биохимического общества, с 477, Санкт-Петербург, Россия, 26 06-01 07,2002

9 Бычкова В Е , Дюйсекина А Е, Басова Л.В , Фантуцци А., Росси Дж.-Л , Тиктопуло Е.И., Кленин С И Конформационное поведение белков с различным зарядом в присутствии фосфолипидных везикул Тезисы научных докладов 3-его Съезда Биохимического общества, с 481, Санкт-Петербург, Россия, 26 06-01.07,2002

10 Bychkova V Ь., Basova L V , Tiktopulo ЕI Membranes can induce partial unfolding of proteins. Book of Abstracts, Abstract N PB71, 16th European Experimental NMR Conference Prague, Czcch, June 9-14, 2002.

11 Басова Л В , Тиктопуло F И , Бычкова В Е Влияние мембранной поверхности на конформационное состояние гпобутярных белков Тезисы докладов и «ендовых сообщений, с 27, XIV Зимняя международная молодежная научная школа, 11-15 февраля, 2002, Москва, ИБХ РАН

12 Бычкова В Е , Дюйсекина А Е , Басова Л В , Фантуцци А , Росси Дж -Л , Тиктопуло Е И , Кленин С И., Уверский В Н, Птицын О Б. Конформационные состояния белков в присутс!вии фосфолипидных везикул сравнение со свойствами белков в растворе Сборник тезисов, с 16, Oí крытого семинара кафедры Молекулярной биофизики физического факультета СПбГУ, ) 5 июня 2001 г, С Петербург

13 Basova L V , Trofimova Е К , Пуша N В , 1 iktopulo Е I, Bychkova V.F. Partial unfolding of proteins in the presence of membranes- myoglobins and cytochrome bs Abstracts of International Conference "Protein Biosynthesis", p 58 Pushchino, 27 08-01 09, 2001 Institute of Protein Research, RAS

14 Басова Л В , Ильина Н Б , Тиктопуло F И . Василенко К С., Бычкова В Е Сравнение конформационного поведения цитохрома bs в модельной системе и в присугсгвии фосфолипидных везикул 1езисы Школы-конференции «Горизонты физико-химической биологии», с 21-22, Пущино, 2000

15 Басова Л В , Ильина Н Б , Васи генко К С , Дюйсекина А Е , Бычкова В Е Изучение рН-швисимых переходов в водорастворимом фрагменте цитохрома bs Тезисы докладов IV Путинской конференции молодых ученых, с 21, Пущино, 1999

16 Дюйсекина А Е , Уверский В Н , Басова Л В , Бычкова В Е , Птицын О Б Промежуточные конформационные состояния белков в клетке, моделирование действия поверхности мембраны Тезисы докладов II Съезда биофизиков России, том 1, с 31 Москва, 23-27 08, 1999.

Принято к исполнению 27/09/2004 Исполнено 27/09/2004

Заказ № 342 Тираж 100 экз

ООО «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 Москва, Балаклавский пр-т, 20-2-93 (095) 747-64-70 (095)318-40-68 www autoreferat ru

РНБ Русский фонд

2006-4 4703

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Басова, Лиана Владимировна

Список использованных сокращений и обозначений.

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР.

1.1. Ненативные состояния белков в живой клетке.

1.2. Заряженная поверхность мембраны как денатурирующий агент in vivo.

1.3. Белки и мембраны. Возможные пути взаимодействия.

1.4. Водно-спиртовые смеси как модель влияния поля мембраны на структуру белков.

1.5. Пространственная структура и функции миоглобина.

1.6. Структура и свойства цитохрома Ь5.

1.7. Краткая характеристика структуры а-лактальбумина.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Исследование влияния мембранной поверхности на конформационное состояние глобулярных белков"

Актуальность проблемы. В последние годы генетические заболевания человека, связанные с дефектами в сворачивании белков или их агрегацией, привлекают пристальное внимание ученых. Было показано, что в эти процессы вовлекаются промежуточные состояния различных белков, не имеющих жесткой нативной структуры и способных адаптироваться к различным условиям в клетке. Поэтому, выяснение причин, приводящих к возникновению ненативных промежуточных состояний белков в клетке, является своевременным и актуальным на современном этапе. Изучение условий, приводящих к конформационным изменениям в белках, может помочь в поиске решения для устранения дефектов в сворачивании белков и образования агрегатов. Сюда же примыкают и проблемы выяснения механизмов белок-белковых взаимодействий, транслокации белков через мембраны, деградации белков в лизосомах, обмена лигандами (см. обзор Bychkova & Ptitsyn, 1993). Ранее нами было предположено, что наряду с такими естественными денатурирующими факторами, как пониженное рН в ряде органелл и возникновение тепловых, солевых и других стрессов, отрицательно заряженная мембранная поверхность может служить умеренно денатурирующим агентом в клетке, благодаря усилению электростатических взаимодействий на границе раздела водной и неполярной фаз. Представляемая работа посвящена выяснению особенностей воздействия отрицательно заряженной мембранной поверхности на конформационное состояние белков, функционирующих в ее непосредственной близости. Проведено изучение структурных изменений, которые могут произойти с нативными белками, имеющими различный суммарный заряд, вблизи мембраны при нейтральных значениях рН. Ранее были опубликованы работы по исследованию взаимодействия белков с мембранами, но в условиях, когда белки уже находились в промежуточном состоянии типа расплавленной глобулы или при функционировании должны с ней связываться.

Цель и задачи исследования. Основной целью исследования является изучение влияния отрицательно заряженной мембраны на конформационное состояние глобулярных белков при нейтральных значениях рН. В задачи исследования входило:

1) охарактеризовать третичную и вторичную структуру слабо положительно заряженных апо- и холомиоглобинов и отрицательно заряженного водорастворимого фрагмента цитохрома Ь5 в присутствии отрицательно заряженных фосфолипидных везикул;

2) изучить взаимодействие с мембраной белков, имеющих различный суммарный заряд;

3) сравнить структурные изменения белков в присутствии фосфолипидных везикул и в условиях, моделирующих ближайшее окружение мембраны (в водно-спиртовых смесях при умеренно низких значениях рН).

Научная новизна работы. Впервые проведено исследование влияния отрицательно заряженной мембранной поверхности на конформационное состояние водорастворимых глобулярных белков при нейтральных рН. При нейтральных рН раствора в отсутствие мембран все исследованные белки имеют нативную конформацию с жесткой третичной структурой. Показано, что в присутствии отрицательно заряженных фосфолипидных везикул слабо положительно заряженные холо- и апомиоглобины, а также отрицательно заряженный водорастворимый домен цитохрома Ь5 даже при нейтральных рН претерпевают переход из нативного состояния в промежуточное, которое имеет свойства, сходные с расплавленной глобулой, описанной для различных белков в водных условиях, но не идентично ему. Полученное нами промежуточное состояние характеризуется отсутствием жесткой третичной структуры при сохранении ярко выраженной вторичной структуры. Для разрушения третичной структуры каждого исследуемого белка требуется определенная концентрация фосфолипидов, зависящая от суммарного заряда и структурной организации белка. В промежуточном состоянии, возникающем под влиянием мембранной поверхности, все исследованные белки связываются с мембраной благодаря электростатическим и гидрофобным взаимодействиям. Флуктуирующая структура белков в непосредственной близости от мембранной поверхности может быть необходима для выполнения их функции. В случае миоглобина это может способствовать более легкому отщеплению кислорода и обмену с другими лигандами, а в случае водорастворимого фрагмента цитохрома Ь5 -облегчению его взаимодействия с белками-партнерами при переносе электрона.

Сопоставление конформационного поведения белков в присутствии мембран и в модельных условиях показало, что основные черты воздействия мембранной поверхности на белки хорошо воспроизводятся в водно-спиртовых смесях при умеренно низких значениях рН. Это подтверждает гипотезу о способе воздействия мембран на белки, связанную с усилением электростатических взаимодействий вблизи ее поверхности.

Диссертационная работа состоит из "Введения", пяти глав, "Заключения", "Выводов" и "Списка литературы". Во "Введении" представлено описание актуальности изучаемой проблемы и цели исследования, а также отражена научная новизна работы. Глава 1 посвящена описанию и анализу литературных данных, отражающих современное положение исследований ненативных состояний белка в клетке и полученных в модельных системах. В главе 2 описаны материалы и методы, используемые в данной работе. В главе 3 представлено экспериментальное исследование структурных свойств апо- и холомиоглобинов в присутствии фосфолипидных везикул. В главе 4 описано конформационное поведение водорастворимого фрагмента цитохрома Ь5 в присутствии фосфолипидных везикул. В главе 5 представлены структурные данные, полученные для человеческого а-лактальбумина, а также проводится сравнительное описание конформационного состояния различных белков в присутствии везикул и в водно-спиртовых смесях. Раздел "Заключение" содержит основные итоги работы. В конце диссертации приведены основные выводы данной работы и список Цитируемой литературы в алфавитном порядке.

Основные результаты данной диссертационной работы отражены в 16 публикациях, в том числе в 3 статьях в рецензируемых отечественных и международных научных журналах.

Заключение Диссертация по теме "Биофизика", Басова, Лиана Владимировна

выводы

Показано, что отрицательно заряженная мембранная поверхность оказывает денатурирующее действие на структуру слабо положительно заряженных холо- и апомиоглобинов и отрицательно заряженного водорастворимого фрагмента цитохрома Ь5 даже при нейтральном значении рН. При этом происходит переход из нативного состояния в промежуточное, характеризующееся отсутствием нативной третичной структуры, но сохранением регулярной вторичной.

В промежуточном состоянии изученные белки связываются с мембраной, однако водорастворимому фрагменту цитохрома bs для этого требуется большая концентрация фосфолипидов, чем холомиоглобину. Связывание апомиоглобина происходит при еще более низкой концентрации фосфолипидов, чем связывание его холоформы.

Конформационные изменения белков в присутствии отрицательно заряженных фосфолипидных везикул и в водно-спиртовых смесях при умеренно низких рН среды носят сходный характер. Это подтверждает гипотезу о возможном механизме воздействия мембран на белки, связанном с локальным понижением рН и диэлектрической проницаемости около поверхности мембраны, при этом последнее проявляется в усилении электростатических взаимодействий.

Благодарности.

Большая часть данной работы выполнена в лаборатории физики белка Института белка РАН.

Хочу выразить огромную благодарность [О. Б. Птицыну| за обсуждение постановленной задачи и внимание на начальном этапе моей работы. Выражаю свою признательность и безграничную благодарность моему научному руководителю доктору физико-математических наук Валентине Егоровне Бычковой за постоянное внимание, помощь и заботу. Профессору Владимиру Алексеевичу Печатникову за постоянную поддержку на протяжении всей работы.

Особая благодарность профессору Алексею Витальевичу Финкельштейну и д.ф.-м.н. Геннадию Васильевичу Семисотнову за неоднократные и неустанные обсуждения моей работы и ценные советы.

Сердечная благодарность Е. И. Тиктопуло за неоценимую помощь в измерениях микрокалориметрии и обсуждениях полученных данных, В. П.

Кутышенко за помощь в измерениях ЯМР, |С.И. Кленину|, совместно с которым проводились измерения макроскопической диффузии. Отдельное спасибо И.А. Кашпарову и Н.Б. Ильиной за помощь в выделении и очистке белков.

Огромное спасибо всем сотрудникам лаборатории физики белка и сотрудникам Института белка РАН, чья помощь, моральная поддержка и благожелательное отношение способствовали плодотворной работе и оказали немалое влияние на ход работы.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В клетке существует множество факторов, приводящих к возникновению ненативных состояний белков. Как предполагалось ранее, мембрана может быть одним из денатурирующих факторов в клетке благодаря локальному понижению рН и диэлектрической проницаемости среды около поверхности мембраны, что проявляется в усилении электростатических взаимодействий на границе раздела водной и неполярной фаз. К настоящему времени эта гипотеза нашла свое подтверждение в работах по исследованию конформационного состояния белков в водно-спиртовых смесях при умеренно низких значениях рН (Bychkova et al., 1996, 1998; Kamatari et al., 1999; Babu & Douglas, 2000; Wang et al., 1999 и др.), которые моделируют окружение мембранной поверхности. В отличие от других работ, в данной работе проведена экспериментальная проверка предложенной гипотезы на глобулярных белках в присутствии отрицательно заряженных фосфолипидных везикул при нейтральных значениях рН среды. В качестве объектов исследования использовались слабо положительно заряженный миоглобин, который отдает кислород вблизи мембраны митохондрии; отрицательно заряженный водорастворимый домен цитохрома bs, участвующий в окислительно-восстановительных реакциях; отрицательно заряженный а-лактальбумин, который в процессе биосинтеза связывается с мембраной. Таким образом, все исследованные белки в процессе функционирования в клетке могут испытывать воздействие мембраны.

В данной работе показано, что отрицательно заряженные фосфолипидные везикулы оказывают денатурирующее действие на белки, имеющие различный суммарный заряд, даже при нейтральных значениях рН. Следует отметить, что при нейтральных значениях рН все исследованные белки имеют жесткую третичную структуру в водном растворе. Полученные результаты подтверждают ранее выдвинутое предположение о денатурирующем воздействии поверхности мембраны благодаря локальному понижению рН и понижению диэлектрической проницаемости среды. Все исследованные белки в присутствии везикул утрачивают жесткость третичной структуры, в то время как вторичная структура сохраняется. О степени компактности имеются лишь косвенные данные, такие как положение максимума спектра флуоресценции (340 нм), образование больших фрагментов белка при протеолизе, высокое содержание вторичной структуры. Тем не менее, все эти белки под влиянием везикул приобретают основные черты, характерные для промежуточных состояний этих белков в растворе. В этом состоянии все исследованные белки связываются с везикулами, нарушая упорядоченную упаковку фосфолипидов в бислое. Связывание белков с мембраной на первом этапе обусловлено электростатическими взаимодействиями, а после проникновения в мембрану присоединяются гидрофобные взаимодействия. При незначительном понижении рН денатурация облегчается вследствие зависимости стабильности нативного состояния белковой молекулы от рН. Общая тенденция структурных изменений белков в присутствии везикул одинакова, однако для каждого белка существуют свои особенности, связанные с их различиями в структуре и суммарном заряде. В частности, апомиоглобин и бескальциевая форма а-лактальбумина, вследствие дестабилизации из-за отсутствия лиганда, денатурируют и связываются с мембраной при минимально используемой концентрации везикул (POPG/белок 25:1), хотя теоретически, площади поверхности везикул, необходимой для связывания, недостаточно. При еще более низкой концентрации везикул в случае апомиоглобина наблюдается агрегация. Миоглобин и цитохром Ь5 содержат гем, который, стабилизируя структуру, осложняет процесс денатурации. Нарушение третичной структуры для всех молекул миоглобина происходит лишь при молярном соотношении POPG/holoMb 200:1, а для цитохрома Ь5 -при 500:1 при рН 7.2, где по теоретическим расчетам площадь поверхности везикул существенно превышает площадь всего белка. Такое различие в денатурации и связывании этих белков можно объяснить и различием их суммарного заряда. Так, миоглобин имеет небольшой положительный заряд (+2) и легче взаимодействует с отрицательно заряженной мембраной, чем отрицательно заряженный цитохром bs (-6). Однако, несмотря на нюансы денатурации различных белков в присутствии везикул, достоверно можно говорить о денатурирующем воздействии мембраны, что приводит к появлению белка с флуктуирующей третичной структурой. Увеличение флуктуаций у миоглобина может облегчать выход кислорода и обмен другими лигандами, у цитохрома bs облегчать взаимодействие с белками-партнерами в окислительно-восстановительных реакциях. Сравнивая конформационное состояние белков в присутствии фосфолипидных везикул и в водно-спиртовых смесях при умеренно низких рН, можно заключить, что механизм денатурации носит сходный характер, и водно-спиртовые смеси в основных чертах моделируют воздействие поверхности мембраны на белки. Это подтверждает гипотезу о возможном механизме воздействия мембран на белки, связанном с локальным понижением рН и диэлектрической проницаемости около поверхности мембраны, при этом последнее проявляется в усилении электростатических взаимодействий.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Басова, Лиана Владимировна, Пущино

1. B.Е. Конформационные состояния водорастворимого фрагмента цитохрома Ь5: рН-зависимая денатурация. // Мол. Биол. 2002. Т. 36, N5. С. 891-900.

2. Басова Л.В., Тиктопуло Е.И., Кашпаров И.А., Бычкова В.Е. Конформационное состояние апомиоглобина в присутствии фосфолипидных везикул при нейтральных рН. // Мол. Биол. 2003. Т. 38, N2. С. 323-332.

3. Бендзко П., Пфайль В., Ениг Г.-Р., Рукпауль К. Роль гидрофобного фрагмента цитохрома Ь5 при взаимодействии с цитохромом Р-450. // Боорган. Химия 1983. Т.9, N4. С. 450-461.

4. Болотина И.А., Лугаускас В.Ю. Определение вторичной структуры белков из спектров кругового дихроизма. IV. Учет вклада ароматических аминокислотных остатков в спектры кругового дихроизма белков в пептидной области.//Мол. Биол. 1985. Т. 19. С. 1409-1421.

5. Бычкова В.Е., Бартошевич С.Ф., Кленин С.И. Сравнительное исследование коэффициентов диффузии а-лактальбуминов и лизоцима с помощью поляризационного интерферометра. // Биофизика. 1990. Т.35.1. C.242-248.

6. Бычкова В.Е. О функциональной роли ненативных белков. // Сб. "Успехи биологической химии". 1997. Т.37. С. 49-99.

7. Ландау Л.Д., Лившиц Е.М. Теоретическая физика. Т. 8. М.: Наука. 1982. С.60.

8. Лакович Дж. Основы Флуоресцентной Спектроскопии. // Мир. Москва. 1986.

9. Лебедь О.И., Стефанов А.В., Примак "Р.Г. Влияние условий ультразвуковой обработки на характеристики формирующихся липосом. // Укр. Биохим. Журн. 1989. Т. 61. С. 96-101.

10. Остерман Л.А. Хроматография белков и нуклеиновых кислот. // М.: Наука. 1985.536 с.

11. Постникова Г.Б. Изучение конформационных переходов в миоглобиновой структуре методом флуоресценции. // Биохимия. 1997. Т. 64. С. 326-346.

12. Постникова Г.Б., Целикова С.В. Миоглобин и митохондрии: изучение кинетики отщепления кислорода от оксимиоглобина в растворе митохондрий. // Биофизика. 2004. ООО (в печати).

13. Семисотнов Г.В., Кутышенко В.П., Птицын О.Б. Внутримолекулярная подвижность белка в состоянии "расплавленной глобулы". Исследование карбоангидразы В методом 'Н-ЯМР. // Молекулярная биология. 1989. Т.23. С. 808-815.

14. Скулачев В.П. Энергетика биологических мембран. 1989. М.: Наука.564с.

15. Цветков В.Н., Эскин В.Е., Френкель С .Я. Структура макромолекул в растворе. М.: Наука. 1964. С. 720.

16. Цветков В.Н., Кленин С.И. Диффузия фракций полистирола в дихлорэтане. //Докл. Акад. Наук СССР. 1953. Т. 88. С. 49-52.

17. Acharya K.R., Ren J.S., Stuart D.I., Phillips D.C., Fenna R.E. Crystal structure of human a-lactalbumin at 1.7 resolution. // J.Mol.Biol. 1991. V.221. P.571-581.

18. Ahn Т., Kim J.-S., Lee B.-C., Yun C.-H. Effects of lipids on the interaction of Sec A with model membranes. // Arch. Biochem. Biophys. 2001. V. 359. P. 14-20.

19. Antonini E., Brunori M. Hemoglobin and myoglobin in their reactions with ligands. Frontiers of Biology. // Eds. Neuberger A., Tatum E.L. Amsterdam-London: North-Holland Publishing Company. 1971. 21. 436 p.

20. Babu K.R., Douglas D.J. Metanol-Induced conformation of myoglobin at рН 4.0. // Biochemistry. 2000. V.39. P. 14702-14710.

21. Bismuto E., Colonna G., Savy F., Irace G. Myoglobin structure and regulation of solvent accessibility of heme pocket. // Int. J. Peptide Protein Res. 1985. V. 26. P. 195-207.

22. Bochkareva E.S., Lissin N.M., Girshovich A.S. Transient association of newly synthesized unfolded proteins with the heat-shock GroEL protein. // Nature. 1988. V. 336. P. 254-257.

23. Brahms S., Brahms J. Determination of Protein Secondary Structure in Solution by Vacuum Ultraviolet Circular Dichroism. // J. Mol. Biol. 1980. V. 138. P. 149-178.

24. Bryson E.A., Rankin S.E., Carey M., Watts A., Pinheiro T.J.T. Folding of apocytochrome с in lipid micelles: formation of alpha-helix precedes membrane insertion. //Biochemistry. 1999. V. 38. P. 9758-9767.

25. Bychkova V.E., Pain R. H., Ptitsyn O.B. The "molten globule" state is involved in the translocation of proteins across membranes? // FEBS Lett. 1988. V. 238. P. 231-234.

26. Bychkova V.E., Berni R., Rossi G.L., Kutyshenko V.P., Ptitsyn O.B. Retinol-binding protein is in the molten globule state at low pH. // Biochemistry. 1992. V.31. P. 7566-7571.

27. Bychkova V.E., Ptitsyn O.B. The Molten Globule in Vitro and in Vivo. // Chemtracts Biochem. and Mol. Biol. 1993. V. 4. P. 133-163.

28. Bychkova V.E., Dujsekina A.E., Klenin S.I., Tiktopulo E.I., Uversky V.N., Ptitsyn O.B. Molten globule-like state of cytochrome с under conditions simulating these near the membrane surface. // Biochemistry. 1996. V. 35. P. 6058-6063.

29. Bychkova V.E., Dujsekina A.E., Ptitsyn O.B., Fantuzzi A., Rossi G.L. Release of retinol and denaturation of its plasma carrier, retinol-binding protein. // Folding & Design. 1998. V. 3. P. 285-291.

30. Cannon J.B., Kuo F.S., Pasternack R.F., Wong N.M., Muller-Eberhard U. Kinetics of the interaction of hemin liposomes with heme binding proteins. // Biochemistry. 1984. V. 23. P. 3715-3721.

31. Cavard D., Sauve P., Heitz F., Pattus F., Martinez C., Dijkman R., Lazdunski C. Hydrodynamic properties of colicin A. Existence of a highaffinity lipid-binding site and oligomerization at acid pH. // Eur. J. Biochem. 1988. V. 172. P. 507-512.

32. Chirita C.N., Necula M., Kuret J. Anionic micelles and vesicles induce tau fibrillization in vitro. // J. Biol. Chem. 2003. V.278. P. 25644-25650.

33. Cocco M J., Lecomte J.T. The native state of apomyoglobin described by proton NMR spectroscope: the A-B-G-H interface of wild-type sperm whale apomyoglobin.//Proteins. 1996. V. 25. P. 267-285.

34. Critchley P., Kazlauskaite J., Eason R., Pinheiro T.J.T. Binding of prion proteins to lipid membranes. // Biochim. and Biophys. Res. Com. 2004. V.313. P. 559-567.

35. Davidson W.S., Jonas A., Clayton D.F., George J.M. Stabilization of alpha-synuclein secondary structure upon binding to synthetic membranes. // J. Biol. Chem. 1998. V. 273. P. 9443-9449.

36. Day P.J., Pinheiro T.J.T, Roberts L.M., Lord J.M. Binding of ricin A-chain to negatively charged phospholipids vesicles leads to protein structural changes and destabilizes the lipid bilayer. // Biochemistry. 2002. V. 41. P.2836-2843.

37. Dufour E., Bertrand-Harb C., Haertle T. Reversible effects of medium dielectric constant on structural transformation of {3-lactoglobulin and its retinol binding. // Biopolymers. 1993. V. 33. P.589-598.

38. Eilers M., Schatz G. Protein unfolding and the energetics of protein translocation across biological membranes. // Cell. 1988. V. 52. P. 481-483.

39. Eilers M., Endo Т., Schatz G. Adriamycin, a drug interacting with acidic phospholipids, blocks import of precursor proteins by isolated yeast mitochondria. // J. Biol. Chem. 1989. V. 264. P. 2945-2950.

40. Eisenberg M., Gresalfi Т., Riccio Т., McLaughlin S. Absorption of monovalent cations to bilayer membranes contai-ning negative phospholipids. // Biochemistry. 1979. Vol. 18. P.5213-5223.

41. Endo Т., Eilers M., Schatz G. Binding of a tightly folded artificial mitochondrial precursor protein to the mitochondrial outer-membrane involves a lipid-mediated conformational change. // J. Biol. Chem. 1989. V. 264. P. 2951-2956.

42. Endo Т., Schatz G. Latent membrane perturbation activity of a mitochondrial precursor protein is exposed by unfolding. // EMBO J. 1988. V. 7. P. 1153-1158.

43. Fischer G., Schmid F.X. The mechanism of protein folding. Implications of in vitro refolding models for de novo protein folding and translocation in the cell. //Biochemistry. 1990. V. 29. P. 2205-2212.

44. Gacon G., Lostanlen D., Labie D., Kaplan J-C. Interaction between cytochrome b5 and hemoglobin: Involvement of рбб (ЕЮ) and p95 (FG2) lysyl residues of hemoglobin. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1980. V.77. P. 19171921.

45. Gething M.J., Sambrook J. Protein folding in the cell. // Nature. 1992. V. 355. P. 33-45.

46. Glick В., Schatz G. Import of proteins into mitochondria. // Annu. Rev. Genet. 1991. V. 25. P. 21-44.

47. Griko Yu.V., Privalov P.L., Venyaminov S.Yu., Kutyshenko V.P. Thermodynamic study of the apomyoglobin structure. // J. Mol. Biol. 1988. V. 202. P. 127-138.

48. Guiles R.D., Basus V.J., Kuntz I., Waskell L. Sequence specific 'H and I5N resonance assignments for both equilibrium forms of the soluble heme binding domain of rat ferrocytochrome b5. // Biochemistry. 1992. V. 31. P. 11365-11375.

49. Halskau O., Froystein N.G., Muga A., Martinez A. The membrane-bound conformational of a-lactalbumin studied by NMR-monitored 'H-exchange // J. Mol. Biol. 2002. V. 321. P. 99-110.

50. Harrison S.C., Blout E.R. Reversible conformational changes of myoglobin and apomyoglobin. // J.Biol.Chem. 1965. V. 240. P. 299-303.

51. Hapner K.D., Bradshaw R.A., Hartzell C.R., Gurd F.R.N. Comparison of myoglobins from harbor seal, porpoise, and sperm whale I. Preparation and characterization. // J. Biol. Chem. 1968. V. 243. P. 683-689.

52. Hay R., Bohni P., Gasser S. How mitochondria import proteins. // Biochim. Biophys. Acta. 1984. V. 779. P. 65-87.

53. Hildebrandt A.G., Estabrook R.W. Evidence for the participation of cytochrome b5 in hepatic microsomal mixed function oxidation reactions. // Arch. Biochem. Biophys. 1972. V. 143. P. 66-79.

54. Hultquist D.E., Passon P.G. Catalysis of methemoglobin reduction by erythrocyte cytochrome b5 and cytochrome b5 reductase. // Nature New. Biol. 1971. V. 229. P. 252-254.

55. Hughson F.M., Wright P.E., Baldwin R.L. Structural characterization of a partly folded apomyoglobin intermediate. // Science. 1990. V. 249. P. 15441548.

56. Jennings P., Wright P.E. Formation of a molten globule intermediate early in the kinetic folding pathway of apomyoglobin. // Science. 1993. V. 262. P. 892-896.

57. Jiang J.X., Abrams F.S., London E.I. Folding changes in membrane-inserted Diphtheria toxin that may play important roles in its translocation. // Biochemistry. 1991. V. 30. P. 3857-3864.

58. Kamatari Yu.O., Ohji S., Konno Т., Seki Ya., Soda K., Kataoka M., Akasaka K. The compact and expanded denatured conformations of apomyoglobin in the methanol-water solvent. // Protein Sci. 1999. V.8. P. 873882.

59. Kawano M., Shirabe K., Nagai Т., Takeshita M. Role of carboxyl residues surrounding heme of human cytochrome b5 in the electrostatic interaction with NADH-cytochrome b5 reductase. // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1998. V. 245. P. 666-669.

60. Keyes S.R., Cinti D. L. Biochemical properties of cytochrome b5-dependent microsomal fatty acid elongation and identification of products. // J. Biol. Chem. 1980. V. 255. P. 11357-11364.

61. Kim J., Kim H. Fusion of phospholipid vesicles induced by alpha-lactalbumin at acidic pH. // Biochemistry. 1986. V. 25. P. 7867-7874.

62. Kim J.G., Kim H.M. Interaction of alpha-lactalbumin with phospholipid-vesicles as studied by photoactivated hydrophobic labeling // Biochim. Biophys. Acta. 1989. V. 983. P. 1-8.

63. Martin J., Horwich A.L., Hartl F.U. Prevention of protein denaturation under heat stress by the chaperonin Hsp60. // Science. 1992. V. 258. P. 995998.

64. Martin J., Langer Т., Boteva R., Schramel A., Horwich A.L., Hartl F.U. Chaperonin-mediated protein folding at the surface of GroEL through a 'molten « globule'-like intermediate. // Nature. 1991. V. 352. P. 36-42.

65. Mathews F.S., Czerwinski E.W. Cytochrome b5 and Cytochrome b5-reductase from chemical and X-ray diffraction viewpoint. // 1985. Wiley. New York

66. Mathews, F.S., Levine, M., Argos, P. Three-dimensional fourier synthesis of calf liver Cytochrome b5 at 2.8 A resolution. // J. Mol. Biol. 1972. V. 64. P. 449-464.

67. Matouschek A. protein unfolding-an important process in vivo? // Curr.Opinion in Struct. Biol. 2003. V.13. P. 98-109.

68. Mauk M.R., Mauk A.G., Weber P.C., Matthews J.B. Electrostatic analysis of the interaction between cytochrome с with native and dimethyl ester heme 4 substituted cytochrome b5. // Biochemistry. 1986. V. 25. P. 7085-7091.

69. Mauk M.R., Barker P.D., Mauk A.G. Proton linkage of complex formation between cytochrome с and cytochrome b5: Electrostatic consequence of protein-protein interactions. // Biochemistry. 1991. V. 30. P. 9873-9881.

70. Mauk A.G., Mauk M.R., Moore G.R., Northrup S.H. Experimental and theoretical analysis of the interaction between cytochrome с and cytochrome b5. // J. Bioenerg. Biomembr. 1995. V. 27. P. 311-330.Щ

71. Merrill A.R., Cohen F.S., Cramer W.A. On the nature of the structural change of the colicin-El channel peptide necessary for its translocation competent state. // Biochemistry. 1990. V. 29. P. 5829-5836.

72. Mitoma J., Ito A. The Carboxy-terminal 10 amino acid residues of cytochrome b5 are necessary for its targeting to the endoplasmic reticulum. // EMBOJ. 1992. V.ll. P. 4197-4203.

73. Muga A., Gonzalez-Manas J.M., Lakey J.H., Pattus F., Surewicz W.K. pH-dependent stability and membrane interaction of the pore-forming domain of colicin AM J. Biol. Chem. 1993. V. 268. P. 1553-1557.

74. Muskett F.W., Kelly G.P., Whitford D. 1996. The solution structure of bovine ferricytochrome bs determined using heteronuclear NMR methods. // J. Mol. Biol. V. 258. P. 172-189.

75. Nishii I., Kataoka M., Goto Y. Thermodynamic stability of the molten globule states of apomyoglobin. // J. Mol. Biol. 1995. V. 250. P. 223-238.

76. Perutz M.F. Myoglobin and haemoglobin: role of distal residues in reactions with haem ligands // Trend Biochem. Sci. 1989. N14. P. 42-44.

77. Pinheiro T.J.T., Watts A. Resolution of individual lipids in mixed phospholipids membranes and specific lipid-cytochrome с interactions by magic-angle spinning solid-state phosphorus-31 NMR. // Biochemistry. 1994. V.33. P. 2459-2467.

78. Pinheiro T.J.T., Elove G.A., Watts A., Roder H. Structural and kinetic description of cytochrome с unfolding induced by the interaction with lipid vesicles. //Biochemistry. 1997. V. 36. P. 13122-13132.

79. Pfeil W., Bychkova V.E., Ptitsyn O.B. Physical nature of the phase transition in globular proteins // FEBS Lett. 1986. V. 198. P. 287-291.

80. Pinheiro T.J.T., Cheng H., Seeholzer S.H., Roder H. Direct evidence for the cooperative unfolding of cytochrome с in lipid membranes from H-2H exchange kinetics. //J. Mol. Biol. 2000. V.303. P. 617-626.

81. Postnikova G.B., Komarov Yu., Yumakova E.M. Fluorescence study of the conformational properties of myoglobin structure 2. pH and ligand-induced conformational changes in ferric- and ferrousmyoglobins. // Eur. J. Biochem. 1991. V. 198. P. 223-232.

82. Poulos T.L., Mauk A.G. Models for complexes formed between cytochrome b5 and subunits of methemoglobin. // J. Biol. Chem. 1983. V. 258. P. 7369-7373.

83. Prats M., Teissie J., Toccane J.F. Lateral proton conduction at lipid-water interfaces and its implications for the chemiosmotic-coupling hypothesis. // Nature. 1986. V. 322. P. 756-758.

84. Privalov P.L. Stability of proteins. Small globular proteins. // Adv. Protein Chem. 1979. V. 33. P. 167-241.

85. Privalov P.L., Potekhin S.A. Scanning microcalorimetry in studying temperature-induced changes in proteins. // Methods Enzymol. 1986. V. 131. P. 4-51.

86. Privalov P.L., Griko Yu.V., Venyaminov S.Yu., Kutyshenko V.P. Cold denaturation of myoglobin. //J. Mol. Biol. 1986. V. 190. P. 487-498.

87. Ptitsyn O.B. Protein Folding: hypotheses and experiments // J. Prot. Chem. 1987. V.6. P. 273-293.

88. Ptitsyn O.B. The molten globule state. // In Protein Folding, editor Т.Е. Creighton, New York, 1992. P. 243-299.

89. Ptitsyn O.B. Molten globule and protein folding. // Adv. Protein Chem. 1995. V. 47. P. 83-229.

90. Quarfoth G.J., Jenness R. Isolation, composition and functional properties of a-lactalbumin from several species //Biochim. Biophys. Acta. 1975. V. 379. p. 476-487.

91. Roberts G.C.K., Jardetzky О. Nuclear magnetic resonance spectroscopy of amino acids, peptides, and proteins. // Adv. Protein Chem. 1970. V. 24. P.447-545.

92. Randall L.L. and Hardy S.J.S. Correlation of competence for export with lack of tertiary structure of the mature species. A study in vivo of maltose-binding protein is Escherichia coli. // Cell. 1986. V. 46. P. 921-928.

93. Rankin S.E., Watts A., Roder H., Pinheiro T.J.T. Folding of apocytochrome с induced by the interaction with negatively charged lipid micelles proceeds via a collapsed intermediate state. // Protein Sci. 1999. V.8. P. 381-393.

94. Sanghera N., Pinheiro T.J.T. Unfolding and refolding of cytochrome с driven by the interaction with lipid micelles. // Protein Sci. 2000. V.9. P. 11941202.

95. Sanghera N., Pinheiro T.J.T. Binding of prion protein to lipid membranes and implications for prion conversion. //J. Mol. Biol. 2002. V. 315. P. 12411256.

96. Silvestro L., Axelsen P.H. Membrane-induced folding of cecropin A. // Biophys. J. 2000. V. 79. P. 1465-1477.

97. Sherman M.Y., Goldberg A.L. Involvement of the chaperonin DnaK in the rapid degradation of a mutant protein in Escherichia coli. // EMBO J. 1992. V. 11. P. 71-77.

98. Shin I., Silman I., Weiner, L. Interaction of partially unfolded forms of Torpedo acetylcholinesterase with liposomes. // Protein Sci. 1996. V. 5. P. 4251.

99. Shin I., Silman I., Bon C., Weiner L. Liposome-catalyzed unfolding of acetylcholinesterase from Bungarus fasciatus. // Biochemistry. 1998. V. 37. P. 4310-4316.

100. Spatz, L., Strittmatter P. A Form of Cytochrome bs That Contains an Additional Hydrophobic Sequence of 40 Amino Acid Residues. // Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 1971. V. 68. P. 1042-1046.

101. Stayton P.S., Fisher M.T., Sligar S.G. Determination of cytochrome b5 association reactions. Characterization of metmyoglobin and cytochrome P-450 binding to genetically engineered cytochrome b5. // J. Biol. Chem. 1988. V. 263. P. 13544-13548.

102. Stayton P.S., Poulos T.L., Sligar S.G. Putidaredoxin competitively inhibits cytochrome b5 cytochrome P-450cam association: a proposed molecular model for a cytochrome P-450cam electron-transfer complex. // Biochemistry. 1989. V. 28. P. 8201-8205.

103. Strittmatter P, Spatz L., Corcoran D., Rogers M.J., Setlow В., Redline R. Purification and properties of rat liver microsomal stearyl coenzyme A desaturase. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1974. V.71. P. 4565-4569.

104. Szoka F., Papahadjopoulos D. Comparative properties and methods of preparation of lipid vesicles (liposomes). // Ann. Rev. Biophys. Bioeng. 1980. V. 9. P. 467-508.

105. Teale F.W.J. Cleavage of the heme-protein link by acid methylethylketone. // Biochim. Biophys. Acta. 1959. V. 35. P. 543.

106. Thorolfsson M., Doskeland A.P., Muga A., Martinez A. 2002. The binding of tyrosine hydroxylase to negatively charged lipid bilayers involves the N-terminal region of the enzyme. // FEBS Lett. V. 519. P. 221-226.

107. Tsurudome M., Gluck R., Graf R., Falchetto R., Schaller U., Brunner J. Lipid interactions of the hemagglutinin HA2 NH2-terminal segment during influenza virus-induced membrane-fusion. // J. Biol. Chem. 1992. V. 267. P. 20225-20232.

108. Van der Goot F.G., Gonzales-Manas J.M., Lakey J.H., Pattus F. A molten-globule membrane-insertion intermediate of the pore-forming domain of colicin A. //Nature. 1991. V. 354. P. 408-410.

109. Van der Goot F.G., Lakey J.H., Pattus F. The molten globule intermediate for protein insertion or translocation through membranes. // Trends Cell Biol. 1992. V. 2. P. 343-348.

110. Van der Vies S. M., Viitanen P.V., Gatenby A.A., Lorimer G.H., Jaenicke R. Conformational states of ribulosebisphosphate carboxylase and their interaction with chaperonin 60. // Biochemistry. 1992. V.31. P. 3635-3644.

111. Vassilenko K.S., Uversky V.N. Native-like secondary structure of molten globules. // Biochim. Biophys. Acta. 2002. V. 1564. P. 168-177.

112. Veitch N.C., Concar D.W., Williams R.J.P., Whitford D. Investigation of the solution structures and mobility of oxidized and reduced cytochrome b5 by 2D NMR spectroscopy. // FEBS Letters. 1988. V. 238. P. 49-55.

113. Venyaminov S. Yu., Yang J.T. Determination of protein secondary structure. In circular dichroism and the conformational analysis of biomolecules. // Fasman G.D., ed. Plenum Press, New York. 1996. P. 69-108.

114. Verner K., Schatz G. Protein translocation across membranes. // Science. 1988. V. 241. P. 1307-1313.

115. Vestweber D., Schatz G. A chimeric mitochondrial precursor protein with internal disulfide bridges blocks import of authentic precursors into mitochondria and allows quantitation of import sites. // J. Cell Biol. 1988. V. 107. P. 2037-2043.

116. Viitanen P.V., Gatenby A.A., Lorimer G.H. Purified chaperonin 60 (GroEL) interacts with the normative states of a multitude of Escherichia-coli proteins. //Protein Sci. 1992. V. 1. P. 363-369.

117. Wang G., Guo R., Bartlam M., Yang H., Xue H., Liu Y., Huang L., Rao Z. Crystal structure of a DNA binding protein from the hyperthermophilic euryarchaeon Methanococcus jannaschii II Protein Sci. 2003. V.12. P. 28152822.

118. Wang Z.-Q., Wang Y-H., Quan W., Wang H.-H., Chunyu L.-J., Xie Yi, Huang Z.-X. Metanol-induced unfolding and refolding of cytochrome b5 and its P40V mutant monitored by UV-visible, CD, and fluorescence spectra. // J. Prot. Chem. 1999. V.18. P. 547-555.

119. Wang Y., Grabwski G.A., Qi X. Phospholipid vesicle fusion induved by saposin C. // Arch, of Biochem. and Biophys. 2003. V. 415. P. 43-53.

120. Weinreb G.E., Mukhopadhyay K., Majumder R., Lentz B.R. Cooperative roles of factor V(a) and phosphatidylserine-containing membranes as cofactors in prothrombin activation. // J. Biol. Chem. 2003. V. 278. P. 5679-5684.

121. Whitford D. The identification of cation binding domains on the surface of microsomal cytochrome b5 using !H NMR paramagnetic difference spectroscopy. //Eur. J. Biochem. 1990. V. 203. P.211-213.

122. Wilkinson K.D., Mayer A.N. Alcohol-induced conformational changes of ubiquitin. // Arch. Biochem. Biophys. 1986. V. 250. P. 390-399.

123. Wuthrich K. NMR in Biological Research: Peptides and Proteins. // Elseiver, Amsterdam. 1976. P. 95-118.

124. Zhao J.-M., London E. Conformation and model membrane interactions of Diphtheria toxin fragment A. // J. Biol. Chem. 1988. V. 263. P. 1536915377.