Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Влияние денатурантов на конформацию и ферментативную активность рибонуклеазы

ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Влияние денатурантов на конформацию и ферментативную активность рибонуклеазы"

МОСКОВСКИЙ ОРДЕНА. ЛЕНИНА, ОРДЕНА ОКТЯБРЬСКОЙ РЕВОЛЩИИ И ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСЙОГО сНАМЕНИ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ им. М.В.ЛОМОНОСОВА

БИОЛОГИЧЕСКИЙ ФАКУЛЬТЕТ

На правах рукописи

КАСУМОВ ЭЛЬДАР АЛИШ ОГЛЫ

ВЛИЯНИЕ ДШАТУРАНТОВ НА КОНФОБШЩ) И ФЕМЕНТАТИВНУЮ АКТИВНОСТЬ РИБОНУКЛЕАЗЫ

(03.00.02 - биофизика)

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Иосква-1991

Работа выполнена в Институте химической физики им. Н.Н.Семенова АН СССР

Научные руководители - академик

В.И.ГольданскиЙ

кандидат химических наук А.В.Волынская

Официальные оппоненты - доктор биологических наук

$.И.Брагинская

кандидат физико-математических наук И.В.Упоров

Ведущее учреждение- Институт биофизики Минздрава СССР (Москва]

Защита состоится " 5 " аАъа/Гр ■? .1991 года в /5" часов на заседании Специализированного 'Совета К.053-.05-.68 по присуждению ученой степени кандидата наук по специальности "биофизика" в Московском государственном университете им. М.В.Ломоносова по адресу: 119899, Москва, Ленинские горы, МГУ, Биологический факультет.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Биологического факультета МГУ.

Автореферат разослан " <^9 " <жгя<?рЛ 1991 г.

Ученый секретарь Специализированного Совета К.053.05.68

доктор биологических наук Б.А.Гуляев

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность теш. Работа посвящена исследованию влияния денатурирующих агентов на структуру и ферментативную активность рибо-зуклеазы А с целью установления корреляции между ними- Хорошо из-эестно, что биологическая, в частности, ферментативная активность 5елка определяется его уникальной пространственной структурой, од-4ако, природа этой взаимосвязи на сегодняшний день остается непонятой, в особенности это касается той большей части глобулы, которая 1е является активным центром фермента. Достоверно известным можно ¡читать лишь тот факт, что молекула фермента не способна выполнять тталитичеекие функции,если её пространственная структура полностью эазрушена. Таким образом, один из аспектов проблемы связан с попыткой установить, какие именно параметры макромолекулы фермента как зизико-химической системы и каким образом определяют её способность рункционировать. Для решения этой проблемы существует несколько юдходов, один из которых основан на прямом сопоставлении изменения ¡труктуры фермента и его каталитических свойств при изменении пара-(етров окружающей среды (температуры, рН, состава растворителя). [опытки провести такого рода исследования предпринимались ранее не-щнократно, однако, в большинстве случаев оказались безуспешными, юскольку, ферментативная активность, как правило, полностью исчезла в отсутствие сколько-нибудь заметных структурных изменений. Это :вязано с тем, что методы,используемые для регистрации конформаци->нных изменений, фиксируют только глобальный переход - порядок-бес-юрядон и не чувствительны к небольшим изменениям структуры, кото-ме, возможно и являются причиной ингибирования ферментативной ак-ивности. Предпосылкой для постановки такой задачи в данной работе вляется уникальная возможность метода тритиевой метки обнаруживать чень небольше конформациоиные изменения, заключающиеся в изменении терической доступности аминокислотных остатков в составе глобулы елка. Возможность сопоставить такого рода конформационные измене-ия с изменениями ферментативной активности представляет двоякий нтерес. С одной стороны, это может пролить свет на роль конформа-ионных изменений в биокагализе, а с другой стороны,дает возмож-ость исследовать механизм и путь влияния пертурбирующгос агентов вплоть до денатурации) на конфорыацив белка. Оба вопроса являются есьма актуальными на сегодняшний день.

Цель и задачи исследования. Целью работы является установление корреляции между структурой и ферментативной активностью рибонук-леазы А. Сущность предлагаемого для этой цели подхода заключается в том, что с помощью метода тритиевой метки проведено сопоставление изменения доступности аминокислотных остатков рибонуклеазы А для атомов трития с изменениями ферментативной активности при добавлении к раствору фермента пертурбирующих агентов - хлорида лития и гуанидина, мочевины. При этом были поставлены следующие конкретные задачи: выяснить, во-первых, существуют ли промежуточные состояния при денатурации рибонуклеазы А; во-вторых, идет ли идентичным путем денатурация белка под влиянием различных денатурантов; в-третьих, существует ли связь между изменениями конформации в растворах денатурантов и функциональной активностью фермента. Самостоятельный интерес представляет исследование изменений структуры и ферментативной активности в процессе повторного свертывания.

Научная новизН» работы. Методом тритиевой метки обнаружены структурные переходы рибонуклеазы А неденатурационного характера, выражающиеся в уменьшении или увеличении доступности аминокислотных остатков, вызываемые незначительными изменениями состава растворителя. Уменьшение доступности, наблюдаемое для остатков, расположенных на или вблизи поверхности глобулы, трактуется как сжатие её внешней оболочки, увеличение - наиболее заметное для гидрофобных остатков, составляющих ядро глобулы, как переход в предденатураци-онное состояние типа "расплавленная" глобула. Как сжатие, так и расширение глобулы сопровождается ингибированием ее ферментативной активности. Существование прямой и обратной корреляции между доступностью остатков (или, что, то же самое, свободным объёмом) глобулы и ее ферментативной активностью свидетельствует о критическом характере взаимосвязи между ними: максимальной ферментативной активности соответствует определенный оптимальный свободный объем глобулы. Результаты по установлению корреляции между структурой и ферментативной активностью получены впервые. В литературе также нет данных о сжатии глобулы в растворах солей.

Теоретическое и практическое значение работы. Основное научное значение работы заключается в том, что используемый в работе подход - параллельное исследование структуры и функции белка под дей-

ствием пертурбирующих агентов - открывает перспективы для решения фундаментальных проблем, расширяющих представления о явлении биокатализа. Во-первых, появляется возможность установить, какие параметры структуры и каким образом определяют способность белка быть биокатализатором химических реакций, какова при этом роль конформа-ционных перестроек белка.Установление корреляции между доступностью аминокислотных остатков и ферментативной активностью показывает,что одним из таких параметров является свободный объем глобулы,который, как видно из результатов работы,должен иметь определенное оптимальное значение для проведения максимальной ферментативной активности. Поскольку свободный объем непосредственно связан с внутримолекулярной подвижностью глобулы, то следует ожидать,что тот же критический характер взаимосвязи должен существовать между динамикой белка и его ферментативной активностью. Во-вторых, расширение круга пертур-бирующих агентов открывает возможность исследовать механизм и путь влияния компонентов окружающего растворителя на ферментативную активность белка, установить общие принципиальные механизмы инактивации ферментов.

Другой аспект научного значения работы связан с обнаружением неизвестного до сих пор типа изменения структуры белка, заключающегося в сжатий внешней оболочки глобулы в растворах солей физиологических концентраций. Если это явление имеет общий характер (эффект обнаружен и для других белков и солей в лаборатории структурной организации биологических систем Отдела строения вещества ИХФ АН СССР), то можно предположить, что ионная сила может выступать в качестве регуляторного фактора ¡л Ыъо . и не только в процессах биокатализа, но и других функций белка.

И,наконец, в работе получено экспериментальное подтверждение гипотезы, согласно которой ферментативная активность белка определяется не его глобальной "грубой" (по Птицыну) структурой, а особенностями его "детальной" структуры, поскольку ингибирование ферментативной активности, наблюдаемое в работе, происходит на фоне сохранения "нативности" пространственной структуры белка (вторичная структура, размер молекулы, её спектральные характеристики остаются неизменными в условиях эксперимента).

Практическое значение работы, прежде всего, может быть связано

ci проблемами белковой и, в частности, ферментной инженерии. Кроме того, результаты работы представляют интерес для исследователей в области физико-химии белков и ферментов. Сильная зависимость структуры и активности фермента от присутствия в растворе солей даже в небольших концентрациях ( ~ 0,5 М) диктует необходимость тщательно учитывать состав используемых буферных смесей. На практике этому придается мало значения, поскольку всем кажется, что соли не изменяют структуру белка, и, по-видимому, это часто является причиной получения противоречивых результатов.

Апробация работы. Основные результаты работы докладывались на: Международной конференции „Химическая физика ферментативного катализа", Таллинн, 1987; Втором Всесоюзном совещании по проблеме "Физиологически активные соединения, меченные радиоактивными и стабильными изотопами", Звенигород, 1988; Совещании по проблеме "Физическая химия ферментов", Одесса, 1988; Конференции молодых ученых Октябрьского района г, Москвы "КПМ-88", Москва, 1988; 19-ой научной конференции мол. ученых биол. факультета МГУ "Проблемы современной биологии", Москва, 1988; Конференции молодых ученых ИХФ АН СССР, Москва, 1987; Всесоюзной конференции ВОФР "Мембраны растительных клеток, проблемы и перспективы", Чернигов, 1989; Международной конференции "Влияние воды на молекулярно-динамические процессы в биосистемах и их связь с метаболизмом", Лагодехи, Ï989.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 5 работ.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 158 страницах машинописного текста и включает введение, обзор литературы, описание методов исследования, изложение результатов и их обсуждение, заключение, выводы и список литературы. Работа иллюстрирована 32 рисунками, б таблицами и I схемой. Список цитированной литературы содержит 109 наименований.

СОДЕРЖАНИЕ ДИССЕРТАЦИИ

Метод тритиевой метки. В основе метода тритиевой метки лежит хорошо известное свойство горячих атомов водорода (т.е. атомов, кинетическая энергия которых выше средней энергии при данной температу ре реакционной среды) вступать в химическую реакцию с молекулами углеводородов при первом же столкновении с образованием продукта замещения.В данном методе мы имеем дело с горячими атомами трития -

- радиоактивного изотопа водорода, и реакция замещения приводит к образованию меченого соединения,химически тождественного исходному. Ряд особенностей выгодно отличает метод от других методов различных меток, зондов, репортерских групп и т.д.. Во-первых, тритиевая метка тотальна (замещаться могут все атомы водорода в составе макромолекулы) и дает информацию как о всей глобуле, так и об отдельных аминокислотных остатках. Во-вторых, вследствие малого свободного пробега (несколько Я) атомов трития в конденсированной фазе мечению ими подвергаются только аминокислотные остатки,, составляющие периферический слой или доступную поверхность глобулы. Величина включенной метки (удельная радиоактивность) для нативного состояния пропорциональна доступной для молекул растворителя площади поверхности аминокислотных остатков в составе глобулы. Таким образом, на-тивное состояние с помощью метода тритиевой метки характеризуется однозначно: величина радиоактивности эквивалентна доступности остатков молекулам растворителя (воды). При изменении условий окружающей среды и переходе в ненативное состояние пропорциональная связь между радиоактивностью и доступностью воде нарушается из-за существенной разницы в размерах атома трития и молекулы воды (радиус атома трития приблизительно в 3 раза меньше молекулы воды), однако именно эта разница и обусловливает чувствительность метода к малым структурным изменениям. Достаточно небольшого раздвижения остатков, чтобы глобула стала "проницаемой" для атомов трития, тогда как для воды, при этом,' все остается без изменений. Понятно, что в ненатив-ннх условиях величина радиоактивности будет эквивалентна доступности остатков атомам трития. Доступная по отношению к "пробам" любого размера характеризует плотность внутримолекулярной упаковки,и, следовательно, свободный объём глобулы.

Условия эксперимента. Введение тритиевой метки в замороженные (77 К) 1%-нне растворы белка проводили в реакционных сосудах с давлением трития 8-Ю-^ торр. и при температуре вольфрамовой спирали 2000 К. Удаление меченой воды и лабильного трития проводили с помощью гель-фильтрации на колонке с сефадексом (5-25.

Меченые белки гидролизовали в течение 24 часов при температуре Г08°С в 6н НИ и полученную смесь анализировали на автоматическом аминокислотном анализаторе. Затем измеряли радиоактивность каждой аминокислотной фракции на жидкостных сцинтилляционных счетчиках.

Ферментативную активность РНКаэн определяли используя цитидин-2':3*-циклический фосфат в качестве субс.трата. Концентрацию продукта (цитидин 3'-фосфата) определяли спекгрофотометрически при длине волны 284 нм.

Влияние различных денатурирующих агентов на структуру и ферментативную активность РНКазы А

I. Влияние мочевины. Результаты исследования денатурации рибо-нуклеазы А в растворах мочевины от 0 до Ш показывают, что во веет случаях, когда в системе присутствует третий компонент (в данном случае мочевина, но это относится и к другим добавкам) распределение тритиевой метки по аминокислотным остаткам отличается от распределения в нативном белке, что свидетельствует об изменении доступности остатков атомам трития. Зависимость суммарной удельной радиоактивности аминокислотных остатков от концентрации мочевины показана на рис. I (кружочки). Как видно из этого рисунка, суммарная удельная радиоактивность аминокислотных остатков постепенно увеличивается в концентрационном интервале мочевины 0-5 М, тогда как в области 6-8 М радиоактивность растет более резко.

Увеличение удельной радиоактивности и, следовательно', доступности аминокислотных остатков в интервале концентраций от 0 до 6 и свидетельствует о конформационном переходе, сущность которого заключается в набухании белковой молекулы.'При этом доступность гидрофобных остатков увеличивается больше, чем гидрофильных, что свидетельствует о большем набухании "ядра" глобулы, чем её внешней оболочки.

Набухание глобулы без изменения ее компактности и упорядочении вторичных структур (согласно литературным данным) отвечает 1фитери-ям перехода белка в состояние "расплавленной" глобулы (по Птицы-ну), которое является промежуточным между нативным и денатурированным состояниями. Однако, наши результаты, по-видимому, нельзя однозначно интерпретировать как указание на переход в состояние "расплавленной" глобулы ("расплавленная" глобула является единственным промежуточным состоянием на пути развертывания и переход в это состояние является фазовым переходом первого рода). Судя по нашим данным, процесс развертывания проходит через ряд промежуточных форм с постоянно возрастающей доступностью аминокислотных ос-

татков и уменьшающейся плотностью внутримолекулярной упаковки, хотя строго говоря, довольно большой разброс экспериментальных точек не позволяет сделать однозначный выбор между двумя возможностями. Обратим внимание, что в интервале концентраций от 3 до 6 М распределение меткичпо аминокислотным остаткам примерно одинаково, что может свидетельствовать о существовании одной предденату-рационной формы в этих условиях. По-видимому, с достаточной степенью достоверности результаты по денатурации рибонуклеазы мочевиной могут свидетельствовать только о самом факте существования промежуточных (или промежуточной формы) форм в процессе развертывания .

Мочевина , М

Рис. I. Зависимость суммарной удельной радиоактивности аминокислотных остатков (кружочки) и ферментативной активности (квадратики) РНКазы А от концентрации мочевины.

Более резкое увеличение доступности остатков в интервале 6-8 М

указывает на крупные конформационные изменения в структуре РНКазы

А, которые можно квалифицировать как развертывание глобулы. Об

этом свидетельствуют литературные данные. Спектральными и оптичес-17«?

ними, гидродинамическими методами, методом ЯМР, электрофореза в градиенте мочевины и методом протеолиза показано, что в этих условиях структура РНКазы претерпевает большие изменения, заключающиеся в уменьшении степени внутримолекулярной упорядоченности, количества вторичных структур, увеличении объема глобулы, доступности отдельных остатков и т.д.. Средняя концентрация денатурационного перехода равна 6,5 М, что хорошо согласуется с литературными данными. О развертывании глобулы свидетельствует и характер изменения доступности остатков: гидрофобные остатки делаются доступными не только атомам трития, но, вероятно, и воде, что является одним из главных признаков развертывания.

Итак, главным итогом этой части работы является обнаружение конформационных изменений в структуре РНКазы А в виде набухания белковой молекулы, происходящих под влиянием мочевины при низких концентрациях. В соответствии с главной задачей работы - установлением корреляции между структурой и функцией белка - было исследовано влияние мочевины на ферментативную активность РНКазы А.

Зависимость ферментативной активности РНКазы А от концентрации мочевины показана на рис. I (квадратики). Как видно из этого рисунка, существует прямая связь между обнаруженными нами изменениями структуры и ферментативной активности. Подавление ферментативной активности в низкоконцентрированных растворах мочевины является следствием перехода молекулы фермента из компактного состояния. в состояние с более рыхлой структурой.

Для выяснения характера ингибирования мы исследовали изменение ферментативной активности в зависимости от концентрации субстрата в присутствии 2 М, 4 14 и 6 М мочевины. Результаты исследования показывают, что при указанных концентрациях мочевины ингибирование ферментативной активности РНКазы А не является конкурентным.

Таким образом, совокупность полученных данных : неконкурентный характер ингибирования активности РНКазы А, расширение молекулы и подавление ферментативной активности под действием мочевины показывает, что ферментативная активность РНКазы А подавляется в результате структурных изменений фермента и ферментативная активность непосредственным образом связана с объемом молекулы или, другими словами, с плотностью внутримолекулярной упаковки. Уменьшение плотности внутримолекулярной упаковки, которое фиксируется по увеличе-

нию общей радиоактивности молекулы, а также изменение координат отдельных остатков, о чем свидетельствует изменение внутримолекулярного распределения трития, приводят к изменениям биологической активности.

Подводя итог можно отметить, что, во-первых, денатурация РНКазы А мочевиной происходит не по принципу "всё или ничего", а через промежуточное (расширенное) состояние и, во-вторых, увеличение объема глобулы вызывает уменьшение ферментативной активности белка. Для подтверждения этих выводов мы исследовали влияние на структуру и ферментативную активность РНКазы А другого денатуранта -- гуанидингидрохлорида, который по своему химическому строению аналогичен мочевине, но в отличие от нее является солью.

2. Влияние гуанидингидрохлорида. Зависимость суммарной удельной радиоактивности аминокислотных остатков от концентрации гуанидингидрохлорида представлена на рис. 2а. Как видно на рисунке вид зависимости отличается от приведенных в предыдущем параграфе для мочевины наличием минимума в области низких (между 0,2 и 0,5 М) концентраций гуанидингидрохлорида . Анализ данных показывает, что для всех видов остатков наблюдается уменьшение доступности в области концентраций 0 - 0,2 М гуанидингидрохлорида, причем в наибольшей степени уменьшается доступность остатков, расположенных на или вблизи поверхности глобулы (все полярные, а также Ала, Про, Гли и Вал, который в РНКазе имеет большую доступность воде по данным Ли й Ричардса). Очень незначительно изменяется доступность Фен и Иле -остатков, расположенных, в основном, внутри глобулы.

Такой характер изменения доступности аминокислотных остатков, по всей видимости, свидетельствует о переходе глобулы в более компактное "Сжатое" состояние, причем сжатию подвергается, главным образом, внешняя оболочка глобулы. Известно, что глобулярные белки упакованы достаточно плотно, однако, плотность упаковки для различных участков глобулы неодинакова. Наиболее плотно упаковано "ядро" глобулы, внешняя же оболочка более "рыхлая" и подвижная. Поэтому существует принципиальная возможность сжатия этой оболочки в "нормальных" (в смысле температуры и давления) условиях, хотя экспериментально подобное явление никогда не наблюдалось. Поскольку главное отличие гуанидингидрохлорида от мочевины заключается в том, что первый является солью, то естественно предположить, что

Рис. 2. Зависимость суммарной удельное радиоактивности (а) и ферментативной ав тивности (5, открытые кружочки) РНКазь А от концентрации гуанидингидрохлори-да.

I 2 з

Гуанидингидрохлорид 1. М )

различный характер действия этих денатурантов на белок (при малых концентрациях де'натуранта) объясняется именно ионной природой гуанидингидрохлорид а. Можно также предположить, что сжатие оболочки имеет чисто электростатическую природу и связано с нейтрализацией зарядов на поверхности глобулы. Известно, что независимо от вида соли и белка, заряды полностью нейтрализуются при ионной силе 0,15-0,20. Это как раз соответствует интервалу концентраций, в котором происходит сжатие глобулы. Однако, объяснить наблюдаемый эффект только нейтрализацией зарядов вряд ли возможно. Этому, прежде всего, препятствует достаточно большая величина эффекта - общая доступность остатков атомам трития уменьшается при 0,2 М гуанидин-гидрохлорида в 4 раза. Очевидно, чтобы объяснить такой большой эффект только нейтрализацией зарядов, необходимо предположить, что поверхность глобулы достаточно равномерно покрыта кластерами из

-и -

одноименных зарядов, что мало вероятно. Возможно другое.объяснение влияния гуанидингидрохлорида, на, конформацию белка, (мы обсудим это в следующем разделе). :

Возвращаясь к концентрационной..зависимости, следует отметить, что при более высоких концентрациях.(начиная с 0,5 М) вид зависимостей для обоих денатурантов. ( мочевина, и. гуанидингидрозрюрид), делается похожим. Начиная от. 0,3-0,5. М. гуанидингидрохлорида. . доступность всех остатков, увеличивается, достигает постоянного, значения в области 1-2 М, и затем^.снова-резко,,,.,увеличивается,.., Немонотонный, характер увеличения доступности , остатков при...возрастании.., концентрации гуанидингидрохлорида.мы.объясняем существованием преддена-турационного состояния в, интервале,1-2 М, после чего наступает денатурация, средняя точка которой (2,5 М) совпадает с литературными данными. Предденатурационная форма .в,, растворе гуанидингидрохлорида так же, как и в растворах,мочевины.характеризуется большей доступностью остатков, а,следовательно,и.большей величиной свободного объема, чем нативная. Кроме,того, в этом.концентрационном.интервале молекула РНКазы сохраняет присущие нативному состоянию' компактность и вторичную структуру. Таким образом, как и при денатурации мочевиной, переход в, денатурационное состояние под действием гуанидингидрохлорида происходит не по механизму двух состояний, а через промежуточную форму, которая по своим свойствам близка.к "расплавленной" глобуле. Следует отметить, что.денатурационный переход как для мочевины, так и. для гуанидингидрохлорида сопровождается очень большим увеличением доступности непалярных. остатков, что указывает на разрушение гидрофобного,,, ядра глобулы. Именно такой механизм денатурирующего действия этих агентов на белки и предполагался большинством исследователей, однако прямое экспериментальное доказательство этого получено... методом тритиевой метки.Весьма вероятно, что конформационные состояния в предценатурационных формах неодинаковы для мочевины и гуанидингидрохлорида. В самом деле сравнение изменений радиоактивности при переходе от нативного к одномолярному раствору ,, показывает, что в обоих денатурантах более всего становятся доступными гидрофобные остатки, но ,в гуанидингид-рохлориде это относится к Вал, Иле и Лей, а в мочевине к Ала,

Фен и Тир. .....-

Существование предценатурационных состояний, постулируемое неми

на основании рассмотренных здесь экспериментальных данных, вполне удовлетворяет условиям, сфорцулированным в виде тестов Бравдтсом. Мы имеем в виду сложный (немонотонный) характер денатурационных кривых, а также несовпадение кривых перехода по отдельным параметрам (например, по изменению доступности и оптических или спектральных свойств,или по изменению доступности для отдельных видов остатков).

Зависимость ферментативной активности от концентрации гуани-дингидрохлорида показана на рис. 26 (открытые кружочки). Как видно из этого рисунка добавление гуанидингидрохлорида приводит к резкоцу уменьшению ферментативной активности РНКазы А в концентрационном интервале 0-0,1 М, после чего ход зависимости становится более плавным. При концентрации гуанидингидрохлорида 0,32 М фермент имеет всего В% активности и при 0,5 М ферментативная активность РНКазы А полностью подавляется. При концентрациях денатуранта 1,0 М, 2,0 М и 3,0 М активность фермента также равна нулю.

На рис. 26 сопоставлены изменение ферментативной активности (о-р-крытые кружочки) и радиоактивности глобулы (черные кружочки), начальная ветвь кривой рис. 2а . Хорошо видно, что резкое уменьшение доступности остатков, отражающее, как мы видели, сжатие оболочки глобулы, приводит к столь же резкому уменьшению ферментативной активности белка. Таким образом, как в случае с мочевиной, тритиевая метка фиксирует изменения структуры белка, связанные с изменением ферментативной активности и не имеющие отношения к денатурации. Исследование характера ингибирования показывает, что как и для мочевины, ингибирование неконкурентное, что подтверждает вывод о влиянии изменения структуры фермента на его активность.

Сравнения действия обоих денатурантов на структуру и ферментативную активность, с одной стороны, еще сильнее подчеркивает существование корреляции между изменениями этих характеристик, а с другой стороны, показывает, что структурные перехода, приводящие к инактивации фермента, совершенно различны. В самом деле, в присутствии мочевины переход глобулы в денатурированное состояние сильно "растянут" по концентрационной оси. Также постепенно и по-этапно уменьшается ферментативная активность. Видно, что расширенная форма обладает ферментативной активностью, хотя и меньшей, чем нативная. Для гуанидингидрохлорида сжатие оболочки и инактивация происходит очень резко, а следующее за сжатием расширение глобулы не приводит

к восстановлению ферментативной активности. По-видимому, при расширении после сжатия глобула не восстанавливает нативную конформа-цию. Это хорошо видно при сопоставлении данных по распределению метки в относительных единицах (проценты от суммарной радиоактивности) для различных состояний белка; нативного, денатурированного (3 М гуанидингидрохлорид), ренатурированного (повторное свертывание после денатурации в 3 М гуанидингидрохлориде), промежуточного (I М гуанидингидрохлорид) и максимально сжатого (0,2 М гуанидингидрохлорид) .

В противоположность литературным данным о полном восстановлении структуры белка в процессе ренатурации (по оптическим,спектральным и каталитическим свойствам), данные тритиевой метки показывают, что структура белка не возвращается в исходное нативное состояние, а остается в расширенной форме. Из таблицы хорошо видно,что нативное состояние отличается от денатурированного более низкой доступ-

Таблица

Распределение метки по аминокислотным остаткам РНКазы А в относительных единицах

а.к. ос-к ренат, от 3 М гуан. натив. ! 1 денат. в 3 М гуан. промеж. I М гуан. 0,2 М гуан

Асх 1,1 1,3 0,5 0,8 0,7

Тре 6,4 5,4 3,7 3,2 3,8

Сер 3,6 2,2 1,4 1,7 0,9

Глх 2,2 1,3 1,3 1,1 1,9

Про 14,4 12,8 10,2 15,6 15,1

Гли 4,0 5,1 1,6 3,3 4,7

Ала 5,4 6,3 12,7 5,6 4,7

Вал 3,7 4,7 6,3 9,3 1,9

Иле 5,9 4,7 18,1 14,8 11,3

Лей 14,8 11,9 15,2 17,7 11,3

Тир 2,0 2,7 1,3 1,4 2,8

Фен 6,6 5,2 5,0 5,2 9,4

Лиз 5,7 4,9 4,2 4,1 3,8

Гис 6,7 Н,4 8,4 6,6 13,2

Арг 17,3 19,9 10,2 9,3 14,1

ностью полярных остатков и более высокой - гидрофобных. Кроме того, за немногими исключениями, распределение - метки ( в относительных единицах) одинаково для ренатурирова'кного и нативного состояния, с одной стороны, и для денатурированного;и предцёнатурированного - с другой. Можно'предположить, чторенатурированная форма - это изотропно "расширенное" нативное состояние,: тогда как предценатуриро-ванная -"это как бы "сжатое денатурированное "состояние. Специальными опытами было установлено,что ферментативная активность рена-турированной формы не отличается от нативной. Из приведенных данных следует, что увеличение объема глобулы сильно влияет на ферментативную активность белка, если;оно сопровождается существенными изменениями положений остатков . • - V .

Уменьшение ферментативной активности в области низких концентраций гуанидингидрохлорида также сопровождается кроме уменьшения объема изменением координат атомов в молекуле белка; распределение метки в 0,2 М растворе гуанидингидрохлорида действительно заметно отличается от нативного. По всей вероятности, объемный и структурный эффект не разделимы и оба. определяют, способность глобулы функционировать, но сжатие глсбулы приводит к более сильным искажениям структуры, чем расширение, с чем и может быть связана более резкая инактивация фермента в присутствии гуанидингидрохлорида. Однако, поскольку мы имеем дело со системой, содержащей ионные соединения (белок, субстрат, соль), мы не имеем права сбрасывать со счетов вклад электростатических эффектов в наблюдаемые явления. Подробнее мы обсудим этот вопрос в следующем параграфе.

3. Влияние хлористого лития. Влияние хлористого лития на структуру РНКазы А было исследовано в концентрационном интервале 0-8 М. Зависимость суммарной удельной радиоактивности аминокислотных остатков РНКазы А от концентрации хлористого лития показана на рис. За. Как видно из этого рисунка, при увеличении концентрации хлористого лития доступность остатков РНКазы А сначала уменьшается, а затем увеличивается, т.е. кривая имеет минимум в том же интервале концентрации, как и при денатурации гуанидингидрохлоридом. Такое же поведение наблюдается и для всех видов аминокислотных остатков. Как и в предыдущем случае доступности полярных остатков уменьшается в большей степени, чем неполярных, что свидетельствует о сжатии поверхностного слоя белковой молекулы. Напомним, что представление о

Концентрация хлористого дития ( И )

Бис. 3. Зависимость суммарной удельной радиоактивности (а) и ферментативной активности (б,открытые кружочки) РНК-азы А от концентрации хлористого лития.

плотной упаковке белковых глобул касается, главным образом, ее гидрофобного ядра, полярные же группы, как показывает рентгенострук-турный анализ, не только неплотно упакованы и обладают высокой подвижностью, но и иногда не имеют фиксированных пространственных координат .

Так же, как и в растворах гуанидингидрохлорида, ферментативная активность РНКазы резко уменьшается в области низких концентраций хлористого лития (рис. 36, открытые кружочки), причем, инактивация белка происходит параллельно с уменьшением доступности аминокислотных остатков. Ингибирование активности фермента имеет неконкурентный характер. Совокупность этих данных, как и в случае с гуанидин-гидрохлоридом, позволяет предположить, что инактивация белка связана с изменениями его кон$ормации. Об этом же косвенным образом свидетельствует и тот факт, что инактивация хлоридом лития проходит

более резко для РНКазы 5 , структура которой по данным тритиевой

-16 -

метки менее компактна, чем РНКазы А.

При увеличении концентрации хлористого лития от 0,2 М до 8 М удельная радиоактивность всех аминокислотных остатков увеличивается в разной степени. Например, при концентрации 8 М удельная радиоактивность остатков Глх, Про, Гли, Гис, Лиз и Apr достигает уровня, характерного для нативного белка. Остатки Асх, Тре и Сер имеют меньшие, а гидрофобные аминокислотные остатки Ала, Тир, Вал, Лей, Фен и Иле большие значения радиоактивности, чем нативная РНКаза А.

Таким образом, при высоких концентрациях хлористого лития увеличивается, в основном, доступность атомам трития гидрофобных остатков. Это свидетельствует о разворачивании белковой глобулы при высоких концентрациях хлористого лития. По всей видимости такое раз*-вернутое состояние молекулы РНКазы А отличается от развернутого состояния белка, вызываемого гуанидингидрохлоридом и мочевиной'при высоких концентрациях тем, что разворачивание белковой молекулы хлоридом лития происходит в меньшей степени, чем в растворах мочевины и гуанидингидрохлорида. Эти данные согласуются с выводом Хип-пеля и Вонга о том, что гуанидингидрохлорид (а также другие соли гуанидина) и мочевина способствуют переходу рибонуклеазы в состояние статистического клубка в отличие от действия различных нейтральных солей.

Сравнение результатов действия гуанидингидрохлорида и хлористого лития приводит к заключению, что хотя в общих чертах и в главном (эффект сжатия) эти соли влияют на белок похожим образом, в деталях наблюдаются различия. Это особенно хорошо видно на рис. 4, где показано изменение ферментативной активности в зависимости от изменения доступности аминокислотных остатков для всех исследованных денатурантов: гуанидингидрохлорид более эффективно действует на структуру и активность фермента. Следующее за сжатием увеличение объёма глобулы также происходит более резко в растворах гуанидингидрохлорида. Увеличение объёма в растворах хлористого лития происходит плавно вплоть до концентрации 8 М. Такой ход зависимости не позволяет сделать какие-либо предположения о существовании пред-денатурациооных форм, как это было сделано в случае гуанидингидрохлорида и мочевины.

Указанные различия, вообще говоря, свидетельствуют о том, что роль чисто электростатических эффектов, связанных с экранировкой

IX-IJi ХЛ

Рис. 4. Зависимость изменения ферментативной активности от изменения доступности аминокислотных остатков РНКазы А в присутствии мочевины, гуанидингидрохлорида и LiCl.

зарядов мала, если вообще есть, в наблюдаемом нами влиянии солей на структуру и активность фермента, поскольку эти электростатические эффекты не зависят от вида ионов. Совокупность полученных в этой работе результатов и литературных данных позволяет сделать предположение, что механизм действия солей на белок сводится к изменениям в гидратном слое глобулы, приводящим либо к увеличению гидратации, например, за счет увеличения плотности этого слоя из-за изменения структуры гидратной воды, либо к уменьшению гидратации за счет замещения некоторого количества молекул воды катионами. Понятно, что и в том, и в другом случае это приведет к изменению взаимодействия белковых групп с водой, а следовательно, к нарушению баланса сил, стабилизирующих нативную структуру.

Итак, главным итогом настоящей работы следует считать установление корреляции между изменениями структуры и активности фермента. Совокупность полученных результатов и литературных данных приводит к выводу, что изменения конформации, приводящие к потере ферментативной активности связаны не с глобальным, крупномасштабным разрушением пространственной структуры белка (денатурацией), а с более тонкими конформационными переходами, происходящими на "высших" уровнях структурной организации. Возможно, что структурные перехо-

ды, регистрируемые методом тритиевой метки, являются изменениями "детальной", по терминологии Птицына, структуры белка, которая определяется плотной упаковкой атомных групп внутри глобулы и стабилизируется более короткодействующими,чем гидрофобные, ван-дер-ва-альсовыми взаимодействиями.

Изменения детальной структуры глобулы, как видно, проявляются не только в уменьшении плотности внутримолекулярной упаковки (переход в расширенное состояние), но и в сжатии оболочки белковой молекулы. В последнем случае (при сжатии) изменения структуры имеют более резкий характер, чем при расширении, и так же резко изменяется функциональная активность белка (рис. 4).

Симбатное изменение общей доступности аминокислотных остатков и ферментативной активности в растворах солей и антибатный ход этих зависимостей в растворах мочевины свидетельствуют об определяющей роли свободного объема глобулы в проявлении ею функциональной активности. Как видно, нативная функционирующая молекула белка должна иметь оптимальное значение величины свободного объема.

ВЫВОДЫ

1. Методом тритиевой метки обнаружены структурные переходы ри~ бонуйлеазы А неденатурационного характера, выражающиеся в уменьшении или увеличении доступности аминокислотных остатков, вызываемые небольшими изменениями состава растворителя. Уменьшение доступности наблюдаемое для остатков, расположенных на или вблизи поверхности глобулы, трактуется как сжатие ее внешней оболочки, увеличение -наиболее заметное для гидрофобных остатков ядра глобулы - как переход в предденатурационное состояние.

2. Как сжатие, так и расширение глобулы сопровождается ингиби-рованием ее ферментативной активности. Ингибирование имеет неконкурентный характер.

3. Существование прямой и обратной корреляции между свободным объемом глобулы (доступностью остатков) и ее ферментативной активностью свидетельствует о критическом характере взаимосвязи между ними: максимальной ферментативной активности соответствует оптимальное значение свободного объема.

4. Обнаружено,что повторное свертывание (после денатурации гу-анидингидрохлоридом) не приводит к восстановлению исходной струк-

туры белка. Конформационное состояние ренатурированного белка характеризуется меньшей плотностью упаковки, чем исходный белок, но близкой к нему укладкой полипептидной цепи. Ферментативная активность при повторном свертывании восстанавливается полностью.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО МАТЕРИАЛАМ ДИССЕРТАЦИИ

1. Касумов Э.А., Волынская А.В., Шишков А.В. Получение меченных тритием белков - РНКазы А и РНКазы S // Тез. докл.,II Всесоюзное совещ. "Физиологически активные соединения,меченные радиоактивными

и стабильными изотопами", Звенигород, 1988. С. 60.

2. Касумов Э.А., Волынская А.В., Гольданский В.И. Взаимосвязь между доступностью молекулам воды и радиоактивностью аминокислотных остатков в молекулах белков, меченных тритием. M. 1988. 14 с. -Деп. в ВИНИТИ от 03.06.88, » 4398-В88.

3. Касумов Э.А. Влияние гуанидингидрохлорида на структуру и ферментативную активность'рибонуклеазы А // В сб. научн.трудов 19 --ой науч. конр. мол. ученых биол. фак. МГУ " Проблемы современной биологии". M. 1988. Часть 2. С. 165-169. -Деп. в ВИНИТИ-от 24.08.88, » 67II-B88.

4. Зайцева М.Г., Касумов Э.А., Касумова И.В. Аккумуляция катионов и информационные изменения белков, их возможная роль в изменениях объемов митохондрий//Физиология расте..шй. 1991. Т. 38. Вып. 4. С. 708-714.

5. Kaeumov Е.А., Volynskaya A.V., Shishkov А.У., Goldanskii.

V.I. Changea of structure and enzymatic activity of ribonuclease A in. solutions of dénaturants // Studia "biophysica. 1990. V.136. N 2-3. P.167-170.