Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Котрансляционное сворачивание белка

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Колб, Вячеслав Адамович

ВВЕДЕНИЕ

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Глава I. КОТРАНСЛЯЦИОННОЕ СВОРАЧИВАНИЕ БЕЛКОВ

1.1. Гипотеза Анфинсена

1.2. Гипотеза котрансляционного сворачивания белков

1.3. Котрансляционное формирование ферментативно и иммунологически активной конформации

1.4. Котрансляционное образование дисульфидных связей

1.5. Связывание лигандов растущими полипептидными цепями

1.6. Котрансляционное формирование устойчивых к протеолизу доменов растущего белка

1.7. Котрансляционная олигомеризация растущих цепей

1.8. Ферментативная активность синтезированных белков после высвобождения из рибосомы

1.9. Ферментативная активность белков, связанных с рибосомой

1.10. Котрансляционное сворачивание белков в клетках про- и эукариот

Глава II. ЛЮЦИФЕРАЗА СВЕТЛЯЧКА РНОТШиБ РУМЬЕ

2.1. Свойства фермента

2.2. Люцифераза как объект исследований сворачивания белков

Глава III. РИБОСОМНЫЙ КАНАЛ ДЛЯ РАСТУЩЕГО

ПОЛИПЕПТИДА

3.1. Визуализация внутририбосомного туннеля методом криоэлектронной микроскопии

3.2. Визуализация внутририбосомного туннеля с помощью рентгеноструктурного анализа

3.3. Величина скрытого в рибосоме участка растущего полипептида

3.4. Конформация пептида в рибосомном канале

3.5. Форма рибосомного канала: туннель или желоб?

3.6. Резюме

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Глава IV. СВОРАЧИВАНИЕ СВЕТЛЯЧКОВОЙ ЛЮЦИФЕР АЗЫ В

ПРОЦЕССЕ СИНТЕЗА В БЕСКЛЕТОЧНОЙ СИСТЕМЕ

4.1. Синтез активной люциферазы в бесклеточной системе из зародышей пшеницы

4.2. Координированное накопление полноразмерного полипептида люциферазы и нарастание её ферментативной активности

4.3. Длительность пост-трансляционной фазы сворачивания синтезированной de novo люциферазы

Глава V. РЕНАТУРАЦИЯ СВЕТЛЯЧКОВОЙ ЛЮЦИФЕРАЗЫ ИЗ

ПОЛНОСТЬЮ РАЗВЁРНУТОГО СОСТОЯНИЯ

5.1. Кинетика ренатурации люциферазы в эукариотическом цитозоле

5.2. Вклад цис-транс изомеризации Х-Про пептидных связей в скорость ренатурации люциферазы

Глава VI. ЭНЗИМАТИЧЕСКАЯ АКТИВНОСТЬ СВЯЗАННОГО С

РИБОСОМОЙ РАСТУЩЕГО ПОЛИПЕПТИДА

6.1. Приобретение энзиматически активной конформации люциферазы при выходе полипептида из рибосомы

6.2. Экспонированность синтезируемого полипептида на поверхности рибосомы

6.3. Синтез люциферазы с С-концевым удлинением в бесклеточной системе трансляции

6.4. Энзиматическая активность удлинённой люциферазы, связанной с 80S рибосомой

Глава VII. КОТРАНСЛЯЦИОННОЕ СВОРАЧИВАНИЕ

ЛЮЦИФЕРАЗЫ В ПРОКАРИОТИЧЕСКОМ И ЭУКАРИОТИЧЕСКОМ ЦИТОЗОЛЕ

7.1. Накопление полноразмерной люциферазы и её ферментативно активной формы при синтезе фермента в бактериальной бесклеточной системе трансляции

7.2. Длительность пост-трансляционной фазы сворачивания люциферазы, синтезированной в бактериальной системе трансляции

7.3. Кинетика ренатурации люциферазы в прокариотическом цитозоле

7.4. Энзиматическая активность растущего полипептида люциферазы на бактериальной рибосоме

7.5. Скорость перехода от неактивной к энзиматически активной конформации полипептидной цепи люциферазы на рибосоме

7.6. Удельная ферментативная активность люциферазы, синтезированной в различных бесклеточных системах трансляции

7.7. Влияние молекулярных шаперонов семейств вгоБЬ и БпаК на котрансляционное сворачивание люциферазы

Введение Диссертация по биологии, на тему "Котрансляционное сворачивание белка"

Сворачиванием (фолдингом) белка называют процесс приобретения полипептидной цепью уникальной для данного белка пространственной структуры (конформации). Приобретение белком его уникальной пространственной структуры является необходимым условием осуществления его биологической функции. Удивительная способность линейного полимера принимать устойчивую пространственную конформацию, называемую также правильной или нативной и способную выполнять строго определённые биологические функции, является важнейшим свойством белковой молекулы, без которого было бы невозможно осуществление белком его функций в клетке.

Поскольку полипептидная цепь состоит из множества аминокислотных остатков (нескольких сотен, как правило), число теоретически возможных конформаций белка огромно. Тем не менее, сворачивание белка в единственную, строго определенную конформацию происходит быстро, в пределах десятков секунд. Проблема сворачивания белков, сформулированная Полингом в тридцатые годы, наиболее ярко отражена в так называемом парадоксе Левинталя [1], подсчитавшего, что если бы сворачивание происходило путем случайного перебора конформаций и поиска наиболее выгодной, белку длиной в 100 аминокислотных остатков потребовалось бы 10й лет для достижения нативного состояния. К настоящему времени выполнено огромное количество работ, посвященных проблеме сворачивания белков, но механизм этого процесса, равно как и управляющие им законы, остаются невыясненными, несмотря на разнообразные экспериментальные подходы, разработанные и применяемые для изучения сворачивания уже более полувека.

Пристальный интерес к данной проблеме вызван не только тем, что сворачивание белка - самый непонятный в настоящее время этап в процессе передачи наследственной информации от ДНК к функциональному белку («вторая половина генетического кода»). Сейчас известно, что многие наследственные заболевания связаны с мутациями, нарушающими сворачивание какого-либо белка. В частности, с нарушением сворачивания коллагена связаны многие болезни соединительной ткани [2]. К болезням, вызванным неправильным сворачиванием белков, относят также болезнь Альцгеймера, так называемые «прионовые заболевания» [3].

Неоспоримо также значение понимания механизмов сворачивания белков для белковой инженерии и биотехнологии. Известно, что суперэкспрессия чужеродных генов часто увеличивает уровень ошибок сворачивания белков в клетках-продуцентах, что, в свою очередь, приводит к образованию крупных агрегатов, называемых «телами включения» [4]. Это является серьёзным ограничением в получении больших количеств биологически активных рекомбинантных белков в условиях их суперпродукции. Успешное развитие белковой инженерии (дизайн и синтез белков с заранее заданными свойствами) также требует достоверного предсказания пространственной структуры белка на основе его аминокислотной последовательности.

Подходы к исследованию сворачивания белка разнообразны и многочисленны. Однако подавляющее большинство этих исследований относится к сворачиванию полноразмерных полипептидных цепей в нативную структуру, когда в качестве исходного состояния цепи выступает полностью или частично денатурированный белок. Несомненно, эта методология позволила выяснить основные принципы организации структуры белка и внесла огромный вклад в знания о белках. Тем не менее, очевидны и существенные недостатки этого направления. Уже тот факт, что в процессе синтеза белка сначала появляется Ы-концевой сегмент растущего полипептида, в то время как его С-концевая часть прикреплена к транслирующей рибосоме (обладающей гигантской по сравнению с пептидом массой), выявляет различия между сворачиванием синтезируемого de novo белка и его ренатурацией in vitro, происходящей в присутствии обеих терминальных последовательностей, способных свободно перемещаться в пространстве друг относительно друга. Таким образом, изучение сворачивания белков в процессе их синтеза, в условиях максимального приближения к природной ситуации, должно привести к более адекватным представлениям об этом процессе. По нашему мнению, прогресс в понимании механизмов сворачивания наиболее вероятен именно в этом направлении исследований.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Заключение Диссертация по теме "Молекулярная биология", Колб, Вячеслав Адамович

выводы

1. Разработан оригинальный метод для непрерывного измерения и регистрации энзиматической активности синтезируемого в бесклеточной системе трансляции белка.

2. На примере светлячковой люциферазы получена количественная оценка длительности пост-трансляционной фазы сворачивания и показано, что сворачивание синтезируемого белка происходит в процессе его синтеза на рибосоме.

3. Обнаружено, что синтезируемый белок приобретает энзиматическую активность непосредственно при выходе из рибосомы, не требуя времени на пост-трансляционное сворачивание.

4. Впервые продемонстрировано, что формирование структуры активного фермента может быть завершено до освобождения белка из рибосомы при условии достраивания С-конца полипептидной цепи дополнительными аминокислотными остатками.

5. Определена величина дополнительного С-концевого пептидного сегмента, позволяющего растущему полипептиду проявить энзиматическую активность нативного белка, находясь на рибосоме в виде пептидил-тРНК.

6. Показано, что энзиматическая активность синтезируемого на рибосоме белка проявляется во время синтеза дополнительного С-концевого сегмента полипептидной цепи.

7. Продемонстрирована принципиальная возможность котрансляционного сворачивания многодоменного эукариотического белка в бактериальном цитозоле.

8. Обнаружено отсутствие влияния молекулярных шаперонов на котрансляционное сворачивание люциферазы в бактериальном цитозоле.

9. Выдвинуто предположение о эволюционно древнем происхождении и универсальном характере котрансляционного сворачивания.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В исследованиях формирования пространственной структуры белков во время их синтеза на рибосоме использован обширный набор методов, включающий в себя использование антител, узнающих определенную конформацию растущего белка [2831], измерение энзиматической активности растущего полипептида и связанных с ним субъединиц того же белка (Р-галактозидазы) [25-27], обнаружение внутримолекулярных дисульфидных связей в растущем полипептиде [32-35], связывание лигандов растущим белком [37-40] и некоторые другие (см. Главу I).

Все эти работы поддерживают точку зрения на сворачивание белка как на котрансляционный процесс. Однако выводы каждого из процитированных исследований основывались на длительных экспериментальных процедурах выделения рибосом и растущих полипептидов. За время эксперимента растущие пептиды вполне могли приобрести подобную нативной конформацию, что существенно снижает ценность полученных результатов. Более того, некоторые из использованных методик неоднозначны по сути. Например, использование антител, узнающих определенную конформацию растущего белка. Известно, что антитела могут индуцировать формирование специфической пространственной конформации, против которой они были получены, и тем самым помогать сворачиванию белка.

Единственным ферментом, для которого была продемонстрирована энзиматическая активность в связанном с рибосомой виде была до последнего времени (3-галактозидаза, которая проявляет свою активность только в форме тетрамера. Этот факт делает любое обнаружение активности р-галактозидазы на рибосоме весьма трудным для интерпретации, поскольку ферментативная активность могла быть обеспечена свободными субъединицами белка, связавшимися с растущей цепью после предположительно пост-трансляционного формирования нативной структуры. Поэтому результаты таких экспериментов и не рассматривались как прямое доказательство котрансляционного сворачивания.

В наших исследованиях был использован фермент, проявляющий энзиматическую активность в форме мономера. Разработанный новый экспериментальный подход позволял следить за состоянием синтезированного de novo белка по его ферментативной активности без какой-либо задержки на процедуры выделения и измерения активности. Это давало возможность прямо измерять посттрансляционную фазу сворачивания белка в процессе его синтеза.

С помощью такого подхода было продемонстрировано, что остановка трансляции ведет за собой немедленную остановку накопления активного фермента, т.е. пост-трансляционная фаза оказалась очень короткой. В то же время ренатурация полностью развернутой люциферазы в условиях, идентичных условиям трансляции, является медленным процессом с характеристическим временем в 14 минут. Столь значительная продолжительность процесса ренатурации могла бы быть объяснена цис-транс изомеризацией пептидных связей с участием пролина во время инкубации белка в растворе денатуранта. Однако нами было показано, что скорость ренатурации в данном случае не зависит от времени пребывания белка в контакте с денатурантом. Это означает, что при ренатурации люциферазы из полностью денатурированного состояния изомеризация пролиновых связей не лимитирует скорость протекания процесса.

Таким образом, только несколько секунд (если не меньше) требуется освобожденной из рибосомы люциферазе для достижения нативной пространственной структуры, в то время как восстановление этой же структуры из состояния беспорядочного клубка происходит как минимум на два порядка медленнее. Описываемые экспериментальные данные могут рассматриваться как прямое доказательство того, что сворачивание люциферазы происходит в процессе построения ее полипептидной цепи и что рибосому покидает уже практически свернутый белок.

Несмотря на то, что полноразмерная люцифераза не проявляет активности, будучи связанной с рибосомой в виде пептидил-тРНК, удалось показать принципиальную возможность завершения ее сворачивания на рибосоме. Добавление к С-концу полипептидной цепи 26 и более аминокислотных остатков (вне зависимости от их последовательности) приводило к формированию нативной структуры у фермента, находящегося на рибосоме в виде пептидил-тРНК. Роль такого дополнительного пептида состоит, вероятно, в том, что он либо позволяет С-концу белка занять правильное положение в структуре белка, либо открывает доступ субстратов к активному центру фермента, меняя его расположение относительно рибосомы, либо позволяет произойти каким-то другим структурным подгонкам, приводящим к возникновению активной конформации.

Важным является и тот факт, что котрансляционное сворачивание оказалось универсальным, присущим в равной степени эукариотическому и прокариотическому надцарствам. Обнаружено, что сворачивание люциферазы происходит котрансляционно как в эукариотическом, так и в прокариотическом цитозолях. Более того, удельная активность синтезированного в разных транслирующих системах фермента оказалась одинаковой, что говорит об одинаковой эффективности котрансляционного сворачивания в этих системах.

Опубликованные к настоящему времени данные согласуются с нашими результатами. Так, котрансляционный характер сворачивания люциферазы был независимо показан в работе [72]. Приобретение синтезируемым белком нативной конформации прямо на рибосоме было воспроизведено с другими белками: ферментом роданезой [49] и одноцепочечными антителами [50, 51]. В этих работах был использован аналогичный подход с удлинением С-концевой части фермента и получены сходные результаты.

Показательна также работа, подтвердившая вывод об отсутствии влияния молекулярных шаперонов на сворачивание синтезируемой de novo люциферазы [149]. Авторы этого биотехнологического исследования получили бесклеточную систему трансляции из отдельных компонентов, очищенных до гомогенного состояния. Для этого последовательности всех факторов трансляции и аминоацил-тРНК-синтетаз (sic!) из Е. coli были модифицированы олигогистидиновыми трактами для аффинной очистки рекомбинантных белков. Белки были выделены и из них была составлена система трансляции, в которой молекулярные шапероны гарантированно отсутствовали. Синтез светлячковой люциферазы в такой системе проходил с достаточно высоким выходом ферментативно активного белка, что полностью согласуется с нашими данными, но противоречит результатам [71, 72]. Сопоставление данных о необходимости молекулярных шаперонов для сворачивания люциферазы, синтезируемой в эукариотических системах [71, 72], и необязательности шаперонов для сворачивания этого белка при синтезе в прокариотической системе трансляции приводит к предположению о присутствии неизвестного ингибитора сворачивания в эукариотической транслирующей системе. Но против этого предположения говорят как одинаковые величины удельной активности люциферазы, полученной в разных системах трансляции, так и результаты исследования её сворачивания в протеолипосомах [150].

Авторы названной работы сравнивали эффективность сворачивания люциферазы, синтезированной de novo в эукариотическом цитозоле, а также при котрансляционной транслокации растущей цепи люциферазы в микросомы и в протеолипосомы, лишённые микросомальных молекулярных шаперонов и катализаторов сворачивания, присутствующих во внутреннем пространстве эндоплазматического ретикулума. Оказалось, что сворачивание синтезируемой люциферазы одинаково успешно происходит как в цитозоле (система трансляции из ретикулоцитов кролика), так и в лишённом шаперонов пространстве протеолипосом [150]. Более того, эффективность сворачивания в микросомах (т.е. в присутствии шаперонов) была значительно ниже (судя по выходу активного фермента, но не по скорости процесса), и лишь ингибирование молекулярных шаперонов 8-азидо-АТФ с последующим УФ-облучением позволило вывести эффективность сворачивания на уровень, наблюдаемый в цитозоле. Ингибирование пептидилпролил цис-транс-изомеразы (PDI) на выход активного фермента не влияло. По всей видимости, данные о необходимости молекулярных шаперонов для котрансляционного сворачивания светлячковой люциферазы [71, 72] следует признать ошибочными.

Таким образом, справедливость вывода об отсутствии влияния молекулярных шаперонов на котрансляционное сворачивание люциферазы была подтверждена в двух независимых исследованиях.

Особого внимания достойно исследование сворачивания капсидного белка вируса SFV [52]. В этой работе прямо показан котрансляционный характер сворачивания вирусной протеазы, причём идентичные результаты были получены как в прокариотической, так и в эукариотической системах трансляции. Более того, авторам названной работы удалось продемонстрировать котрансляционное сворачивание белка не только in vitro, но и in vivo, что позволяет аргументировано поставить точку в дискутируемом вопросе об универсальности котрансляционного сворачивания.

В то же время ряд вопросов остаётся открытым в исследовании котрансляционного сворачивания. Среди них следующие: а) На каком этапе синтеза (при какой величине синтезируемого на рибосоме полипептида) возникают элементы вторичной структуры, и каковы они? б) Продолжает ли полипептидная цепь синтезируемого на рибосоме белка оставаться флуктуирующим образованием вплоть до завершения синтеза белкового домена, стабилизированного внутренними кооперативными взаимодействиями? в) Какова пространственная структура синтезируемого на рибосоме домена белка: имеет ли он укладку, свойственную этому домену в нативном белке, и при какой величине синтезируемого полипептида она возникает? г) Вносит ли закрепление С-конца пептида на массивной рибосоме вклад в стабилизацию пространственной структуры растущей цепи и в путь её сворачивания?

Представленные в настоящей работе данные прямо доказывают, что сворачивание белка происходит во время его синтеза на рибосоме, и что сворачивание может быть завершено до освобождения полипептидной цепи из рибосомы. Обнаруженная закономерность заставляет искать новые подходы к решению проблемы сворачивания. По всей видимости, решить эту проблему без учёта поэтапного сворачивания белка по мере его синтеза вряд ли возможно.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

МАТЕРИАЛЫ

Использованные в работе ферменты и реактивы перечислены в таблице 3: Таблица 3.

Ферменты и реактивы Фирма-производитель

Сайт-специфические эндонуклеазы Stu I, Xho I, Ecl1361, Pst I, Hind III, EcoR I и Sac I, Tth ДНК-полимераза, РНК-полимераза фага SP6 Fermentas

Сайт-специфические эндонуклеазы Nde I, BaJ I, Sal I, плацентарный рибонуклеазный ингибитор (РНКазин), ДНК-лигаза фага Т4, лизат ретикулоцитов кролика Promega

СТФ, ГТФ, УТФ, тРНК суммарная дрожжевая, люцифераза Photinus pyralis, экстракт зародышей пшеницы, люциферин, дезоксирибонуклеаза I Boehringer Mannheim

Сефадекс, рибонуклеаза Н из Escherichia coli, плацентарный рибонуклеазный ингибитор (РНКазин), [14С]фенилаланин, [35S]MeTHOHHH, [14С]лейцин, флуорографический реагент Amplify, плазмида pTZ 19R Amersham Pharmacia Biotech

Люциферин, акриламид, метиленбисакриламид, ДТТ, персульфат аммония, HEPES, аминокислоты, АТФ, полиуридиловая кислота, дезоксирибонуклеозид трифосфаты, ТЕМЕД Sigma

SDS, Трис, КОН, CaCI2, ацетат натрия, ацетат калия Merck

NaCI, Кумасси бриллиантовый голубой G-250, М5,М10-метилен-фолиновая кислота, этилацетат, MOPS Fluka

-меркаптоэтанол, двунатриевая соль ЭДТА, данзилаланин, данзилглицин, данзилфенилаланин, олигофенилаланиновые пептиды (ди-, три-, тетра- и пентамер) Serva трицин, мочевина, этидий бромид Bio-Rad

Т7 РНК-полимераза Roche Molecular Biochemicals

Жидкость сцинтилляционная Supersolve X, тритон-ХЮО Koch Light LTD

Бакто-триптон, дрожжевой экстракт, агар Difco

MgCI2, NaH2P04, (NH4)2S04, NaOH, HCl, н-бутанол, ацетонитрил, мочевина, борная кислота, хлорид цезия, хлорид лития, толуол Реахим, категории «ос.ч.», «ч.д.а.»

Рибонуклеаза А, агароза, ацетат магния USB

МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

1. Плазмиды

Плазмида pGEM luc, содержащая ген люциферазы под контролем промотора ДНК-зависимой РНК-полимеразы фага SP6, была приобретена у фирмы Promega.

Плазмида pGEM luc(-stop) была создана на основе pGEMluc следующим образом: сайт рестрикции Nde I бьш введен в исходную плазмиду сайт-направленным мутагенезом с помощью ПЦР на место люциферазного стоп-кодона. В результате исходная последовательность 5'-ТАА AATG-3' была заменена на 5'-ТСA TATG-3'. Таким образом природный терминирующий кодон люциферазы, UAA, бьш заменен на кодирующий триплет серина, UCA. Трансляция мРНК, полученной с помощью этой плазмиды, приводила к синтезу люциферазы, удлиненной на С-конце случайной (неприродной) полипептидной последовательностью, являющейся результатом трансляции последовательности полилинкера плазмиды.

Плазмида pTZ luc(-stop) была сконструирована на основе вектора pTZ 19R (приобретен у Pharmacia Biotech). Для этого с помощью гидролиза эндонуклеазами Hind III и Sac I бьш получен фрагмент плазмиды pGEM luc(-stop), содержащий ген люциферазы. Фрагмент затем бьш субклонирован в вектор pTZ 19R, обработанный теми же ферментами Hind III и Sac I. Полученная плазмида была использована только для конструирования плазмиды pTZ luc(NPT II).

Для создания плазмиды pTZluc(NPT II) бьш использован ген неомицин фосфотрансферазы II (NPT II) из транспозона tn5 [151] (ДНК-матрица для ПЦР была любезно предоставлена М. Земсковой, Институт биохимии и физиологии микроорганизмов РАН). Кодирующий район NPT II без двух первых N-концевых ко донов был амплифицирован с помощью 30 циклов стандартной полимеразной цепной реакции (ПЦР) с Tth ДНК-полимеразой.

Олигонуклеотиды 5' -TTCCATATGAACA AGATGGATTGC-3' и 5'-CTTCATATGCCCAGAGTCCCG-3' бьши использованы как верхний и нижний праймеры, соответственно. Оба праймера содержали сайты рестрикции Nde I (подчёркнуты в приведенных последовательностях олигодезокси-рибонуклеотидов) на их 5'-концах. После того, как продукт ПЦР был обработан рестриктазой Nde I, образовавшийся фрагмент был лигирован по Nde I сайту в плазмиду pTZ luc(-stop). Получившаяся в результате плазмида содержала рекомбинантную последовательность, состоящую из полного гена люциферазы без стоп-кодона, слитого с геном NPT II при сохранении рамки считывания. Два N-концевых аминокислотных остатка неомицин фосфотрансферазы бьши заменены на серин и тирозин вместо природных метионина и изолейцина.

Плазмида рТ7 luc(NTPII) для экспрессии гена люциферазы в бактериальной системе трансляции была сконструирована с помощью клонирования последовательности слитого химерного белка люциферазы - неомицин фосфотрансферызы по Nde I сайту плазмидного вектора рТ7-7 (любезно предоставлен авторами конструкции [152]). Последовательность химерного белка была сначала амплифицирована с помощью ПЦР с 5'

GCCCATCACCATCACCATCATATGGAAGACGCCAAAAAC-3' (верхний) и 5'-СТТСATATGCCCAGAGTCCCG-3' (нижний) праймерами (сайты рестрикции Nde I подчёркнуты). Продукт ПЦР был подвергнут ограниченному гидролизу эндонуклеазой Nde I так, чтобы крупный фрагмент сохранил внутренний сайт Nde I, находящийся точно между последовательностями люциферазы и неомицин фосфотрансферазы.

Ориентация вставки в вектор рТ7-7 была определена с помощью рестрикционного анализа.

Для конструирования плазмиды рТ7 luc плазмиду pGEM luc обработали эндонуклеазами Sal I и EcoR I, что привело к появлению фрагмента, содержащего последовательность С-концевой части люциферазы. Образовавшийся фрагмент выделили и очистили. Плазмиду рТ7 luc(NPT II) подвергли гидролизу теми же эндонуклеазами. Образовавшийся фрагмент, содержащий последовательность С-концевой части люциферазы и последовательность неомицин фосфотрансферазы, удалили. На его место дотировали фрагмент pGEMluc, кодирующий только С-концевую часть люциферазы. В результате плазмида рТ7 luc содержала под контролем промотора РНК-полимеразы фага Т7 полную последовательность гена люциферазы с его природным терминирующим кодоном.

Все препараты плазмидной ДНК очищали с помощью центрифугирования в градиенте плотности хлорида цезия.

2. ДНК-матрицы для транскрипции

Для получения мРНК удлиненной люциферазы плазмидную ДНК pGEM lucí-stop), pTZ luc(NPT И) и рТ7 luc(NPT II) предварительно обрабатывали соответствующими сайт-специфическими эндонуклеазами в условиях, рекомендованных фирмами-производителями соответствующих ферментов.

В случае удлинения люциферазы последовательностью, закодированной в полилинкере плазмиды pGEM luc(-stop), использовали следующие эндонуклеазы:

1) Nde I - удлинение на 1 аминокислотный остаток,

2) Stu I - на 19 остатков,

3 )Xho I - на 21 остаток,

4) Ecl 1361 - на 26 остатков,

5) Bal I - на 31 остаток.

С-концевое удлинение люциферазы аминокислотными остатками последовательности неомицин фосфотрансферазы получали, использовали два подхода - обработка плазмид pTZ luc(NPT II) и рТ7 luc(NPT II) сайт-специфическими эндонуклеазами, а также ПЦР для получения ДНК-матриц. Обе плазмиды давали возможность получить следующие удлинения при использовании соответствующих эндонуклеаз:

1) Nde I - удлинение на 1 аминокислотный остаток,

2) Pst I - на 59 аминокислотных остатков.

ПЦР проводили с плазмидой pTZ luc(NPT II), используя универсальный Т7 верхний праймер и один из нижних праймеров, синтезированных для получения люциферазы, удлиненной на 12, 19, 27 или 42 кодирующих триплета. Плазмида pTZluc(NPT II) была предварительно линеаризована ферментом Pst I, после чего амплифицирована 30 циклами ПЦР с Tth ДНК-полимеразой, включающими в себя 1 мин. денатурации при 94°С, 1 мин. отжига при 50°С и 2,5 мин. интервал для синтеза при 72 °С, увеличивающийся на 4 секунды в каждом последующем цикле. В каждом эксперименте проводили 3 независимых амплификации с целью избежать эффектов, вызываемых возможными мутациями, произведенными Tth ДНК-полимеразой.

ПЦР была использована и для получения ДНК-матрицы, кодирующей полноразмерную люциферазу без терминирующего кодона: линеаризованную ферментом Pst I плазмиду рТ7 luc(NPT II) амплифицировали в реакции с 5'-TAATACGACTCACTATAGGG-3' (верхний) и 5'-TACAATTTGGACTTTCCG-CC-3' (нижний) праймерами.

5. Приготовление мРНК

Матричную РНК получали с помощью транскрипции с ДНК-зависимыми РНК-полимеразами фагов SP6 или Т7. Транскрипцию проводили по методике [153]. Реакционная смесь объёмом в 100 мкл содержала 80 мМ HEPES-KOH (pH 7,5), 16 мМ MgCl2, 2 мМ спермидина, 20 мМ дитиотреитола, по 3 мМ каждого из четырех нуклеозидтрифосфатов, 50 единиц рибонуклеазного ингибитора из плаценты, 3 мкг линеаризованной ДНК-матрицы и 400 единиц фаговой РНК-полимеразы. Реакцию проводили при 37°С в течение 2 часов и останавливали стандартной экстракцией смесью фенола с хлороформом. Транскрипт очищали этанольным переосаждением с последующей гель-фильтрацией на сефадексе G-25, либо осаждением 3 М хлоридом лития. В системы трансляции добавляли водные растворы мРНК с концентрацией в 1 мг/мл. Чистоту мРНК и размер транскрипта контролировали с помощью электрофореза в полиакриламидном геле, содержащем 7 М мочевину.

4. Получение укороченной мРНК

Укорачивание люциферазной мРНК, полученной транскрипцией плазмиды pGEMluc, линеаризованной ферментом Xho I, проводили с помощью гидролиза рибонуклеазой Н из Е. coli. К 1 мкг мРНК добавляли 50-кратный молярный избыток 20-членного олигодезоксирибонуклеотида и 0,5 единицы рибонуклеазы Н. Реакцию проводили при 37° в течение 15 минут прямо в трансляционной смеси без экстракта зародышей пшеницы. Смесь затем охлаждали до 25 °С и добавляли компоненты смеси для трансляции, доводя конечный объём до 25 мкл. Были использованы следующие олигодезоксирибонуклеотиды (подчёркнуты нуклеотиды, комплементарные терминирующему кодону гена люциферазы) :

5'-TA-CAA-TTT-GGA-CTT-TCC-GCC-3' (комплементарен двум основаниям терминирующего кодона и ещё шести значащим кодонам гена) и

5'-ААТ АС AGTT АС АТТ-ТТА-С АА-3' (комплементарен З'-нетранслируемой области, терминирующему кодону и последнему значащему кодону гена).

В контрольных опытах был использован некомплементарный 20-членный олигодезоксирибонуклеотид.

S. Трансляция в бесклеточных системах

В настоящей работе были использованы четыре различных варианта бесклеточных систем трансляции: система из зародышей пшеницы, из ретикулоцитов кролика, система на основе S30 экстракта Е. coli и т.н. S-100 система, включающая в себя безрибосомную белковую фракцию и очищенные рибосомы Е. coli. Синтез люциферазы всегда проводили при 25°С, поскольку низкая термостабильность этого фермента не позволяет проводить трансляцию мРНК люциферазы при более высокой температуре.

Для экспериментов с удлиненной люциферазой синтез фермента проводили в в объёме 100 мкл. Трансляцию в ячейке люминометра осуществляли в объёме 25 мкл. В экспериментах по непрерывному измерению активности синтезируемой люциферазы в трансляционную смесь добавляли люциферин до концентрации в 0,1 мМ. Для радиоактивного мечения синтезируемого белка в бесклеточную систему вводили [358]метионин или [14С]лейцин, исключая соответствующую [12С]аминокислоту. Конечная концентрация мРНК составляла в разных опытах от 40 до 120 мкг/мл. в эукариотических системах трансляции использовали коммерческий экстракт из зародышей пшеницы фирмы Boehringer Mannheim (впоследствии Roche Molecular Biochemicals) приготовленный в соответствии с методикой [154], а также лизат ретикулодитов кролика, поставляемый фирмой Promega и содержащий АТФ, ГТФ и трифосфат-регенерирующую систему.

Для синтеза люциферазы в бактериальной системе на основе S30 экстракта Е. coli, последний был приготовлен по методике [155].

Синтез олигофенилаланина в системе из Е. coli проводили в присутствии единственной аминокислоты, [14С]фенилаланина, при 25°С в объёме 2 мл. Безрибосомная белковая фракция S-100 была получена по методике [156], описание методики получения рибосом приведено в разделе 11 настоящей главы.

Состав компонентов бесклеточных транслирующих систем приведен в таблицах 4-7.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Колб, Вячеслав Адамович, Москва

1. Levinthal C. (1968) Are there pathways for protein folding? J. Chim. Phys. 65,44 45.

2. Baum J., Brodsky B. (1999) Folding of peptide models of collagen and misfolding indisease. Curr. Opin. Struct. Biol. 9,122- 128.

3. Kelly J.W. (1998) The alternative conformations of amyloidogenic proteins and theirmultistep assembly pathways. Curr. Opin. Struct. Biol. 8,101-106.

4. Mitraki A., King J. (1989) Protein folding intermediates and inclusion body formation.

5. BioTechnology, 7, 690 697.

6. Anfinsen C.B., Haber E., Sela M., White F.H. Jr. (1961) The kinetics of formation of nativeribonuclease during oxidation of the reduced polypeptide chain. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 47,1309-1315.

7. Anfinsen C.B. (1973) Principles that govern the folding of protein chains. Science, 181,223 230.

8. Anfinsen C.B., Scheraga H.A. (1975) Experimental and theoretical aspects of proteinfolding. Adv. Protein Chem. 29,205 300.

9. Creighton T.E., Goldenberg D.P. (1984) Kinetic role of a meta-stable native-like twodisulfide species in the folding transition of bovine pancreatic trypsin inhibitor. J. Mol. Biol. 179,497-526.

10. Ikai A., Tanford C. (1971) Kinetic evidence for incorrectly folded intermediate states in therefolding of denatured proteins. Nature, 230,100 102.

11. Ikai A., Fish W.W., Tanford C. (1973). Kinetics of unfolding and refolding of proteins. II.

12. Results for cytochrome c. J. Mol. Biol. 73, 185 197.

13. Epstein H.F., Schechter A.N., Chen R.F., Anfinsen C.B. (1971) Folding of staphylococcalnuclease: kinetic studies of two processes in acid denaturatioa J. Mol. Biol. 60, 499 -508.

14. Tanford C., Aune K.C., Ikai A. (1973) Kinetics of unfolding and refolding of proteins.

15. Results for lysozyme. J. Mol. Biol. 73,185 197.

16. Wright P.E., Dyson H.J., Lerner R.A. (1988) Conformation of peptide fragments ofproteins in aqueous solution: implications for initiation of protein folding. Biochemistry, 27,7167-7175.

17. Teale J.M., Benjamin D.C. (1977) Antibody as immunological probe for studyingrefolding of bovine serum albumin. Refolding within each domain. J. Biol. Chem. 252, 4521-4526.

18. Fedorov A.N., Baldwin Т.О. (1997) Cotranslational protein folding. J. Biol. Chem. 272,32715-32718.

19. Blond-Elguindi S., Goldberg M.E. (1990). Kinetic characterization of early iminunoreactive intermediates during the refolding of guanidine-unfolded Escherihia coli tryptophan synthase P2 subunits. Biochemistry, 29,2409 2417.

20. Спирин, A.C. 1984 Котрансляционное сворачивание, компартментализация и модификация белка. Молекуляр. Биология, 18, 1445 1460.

21. Lim V.I., Spirin A.S. (1986) Stereochemical analysis of ribosomal transpeptidation.

22. Conformation of nascent peptide. J. Mol. Biol. 188, 565 574.

23. Kolb V.A., Makeyev E.V., Kommer A., Spirin A.S. (1995) Cotranslational folding ofproteins. Biochem. Cell Biol. 73,1217-1220.

24. Dice J.F., Goldberg A.L. (1975) Relationship between in vivo degradative rates andisoelectric points of proteins. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 72,3893-3897.

25. Chantrenne, H. (1961) In Alexander, P. and Bacq, Z. (eds.), The Biosynthesis of Protein.

26. Modern Trends in Physiological Science. Pergamon Press, London, p. 122.

27. Phillips D.C. (1967) The hen egg-white lysozyme molecule. Proc. Natl. Acad. Sci. USA,57,484-495.

28. De Coen J.L. (1970) Folding of the polypeptide chain during biosynthesis. J. Mol. Biol.49,405-414.

29. Bogacheva E.N., Gol'danskii V.I., Shishkov A.V., Galkin A.V., Baratova L.A. (1998)

30. Tritium planigraphy: from the accessible surface to the spatial structure of a protein. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95, 2790 2794.

31. Cowie D.B., Spiegelman S., Roberts R.B., Duerksen J.D. (1961) Ribosome-bound |3galactosidase. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 47,114 122.

32. Zipser D., Perrin D. (1963) Complementation on ribosomes. Cold Spring Harbor Symp.1. Quant. Biol. 28, 533 537.

33. Kiho Y., Rich A. (1964) Induced enzyme formed on bacterial polyribosomes. Proc. Natl.

34. Acad. Sci. USA, 51, 111-118.

35. Hamlin J., Zabin I. (1972) p-galactosidase: immunological activity of ribosome-bound,growing polypeptide chains. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 69,412 416.

36. Fedorov A.N., Friguet B., Djavadi-Ohaniance L., Alakhov Y.B., Goldberg M.E. (1992)

37. Folding on the ribosome of Escherichia coli tryptophan synthase p subunit nascent chains probed with a conformation-dependent monoclonal antibody. J. Mol. Biol. 228, 351 -358.

38. Friguet B., Djavadi-Ohaniance L., King J., Goldberg M.E. (1994). In vitro and ribosomebound folding intermediates of P22 tailspike protein detected with monoclonal antibodies. J. Biol. Chem. 269,15945 15949.

39. Clark P.L., King J. (2001) A newly synthesized, ribosome-bound polypeptide chainadopts conformations dissimilar from early in vitro refolding intermediates. J. Biol. Chem. 276,25411-25420.

40. Bergman L.W., Kuehl W.M. (1979). Formation of an interchain disulfide bond on nascentimmunoglobulin light chains. J. Biol. Chem. 254, 8869 8876.

41. Bergman L.W., Kuehl W.M. (1979) Formation of intramolecular disulfide bonds onnascent immunoglobulin polypeptides. J. Biol. Chem. 254, 5690 5694.

42. Peters T. Jr., Davidson L.K. (1982) The biosynthesis of rat serum albumin. J. Biol. Chem.257,8847-8853.

43. Chen W., Helenius J., Braakman I., Helenius A. (1995) Cotranslational folding andcalnexin binding during glycoprotein synthesis. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92, 6229 -6233.

44. Ryabova L.A., Desplancq D., Spirin A.S. Pluckthun A. (1997) Functional antibodyproduction using cell-free translation: effects of protein disulfide isomerase and chaperones. Nature Biotechnol. 15, 79-84.

45. Mullet J.E., Klein P.G., Klein R.R. (1990) Chlorophyll regulates accumulation of theplastid-encoded chlorophyll apoproteins CP43 and D1 by increasing apoprotein stability. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87, 4038 4042.

46. Komar A.A., Kommer A., Krasheninnikov I.A., Spirin A.S. (1993) Cotranslational hemebinding to nascent globin chains. FEBS Lett. 326,261-263.

47. Komar A.A., Kommer A., Krasheninnikov I.A., Spirin A.S. (1997) Cotranslationalfolding of globin. J. Biol. Chem. 272,10646-10651.

48. Mouat M.F. (2000) Dihydrofolate influences the activity of Escherichia coli dihydrofolatereductase synthesized de novo. Int. J. Biochem. Cell Biol. 32, 327 337.

49. Frydman J., Erdjument-Bromage H., Tempst R., Hartl F.U. (1999) Cotranslational domainfolding as the structural basis for the rapid de novo folding of firefly luciferase. Nature Struct. Biol 6, 697 705.

50. Lin L., DeMartino G.N., Greene W.C. (1998) Cotranslational biogenesis of NF-kB p50 bythe 26S proteasome. Cell, 92, 819 828.

51. Gilmore R., Coffey M.C., Leone G., McLure K., Lee P.W.K. (1996) Cotranslationaltrimerization of the reovirus cell attachment protein. EMBO J. 15,2651 2658.

52. Yeis A., Leibovich S.J., Evans J., Kirk T.Z. (1985) Supramolecular assemblies of mRNAdirect the coordinated synthesis of type I procollagen chains. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82,3693 3697.

53. Veis A., Kirk T.Z. (1989). The coordinate synthesis and cotranslational assembly of type Iprocollagen. J. Biol. Chem. 264, 38841 3889.

54. Kolb V.A., Makeyev E.V., Spirin A.S. (1994) Folding of firefly luciferase duringtranslation in a cell-free system. EMBO J. 13, 3631 3637.

55. Fedorov A.N., Baldwin T.O. (1995) Contribution of cotranslational folding to the rate offormation of native protein structure. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92,1227 1231.

56. Makeyev E.V., Kolb V.A., Spirin A.S. (1996) Enzymatic activity of the ribosome-boundnascent polypeptide. FEBSLett. 378, 166 170.

57. Kudlicki W., Chirgwin J., Kramer G., Hardesty B. (1995). Folding of an enzyme into anactive conformation while bound as peptidyl-tRNA to the ribosome. Biochemistry, 34, 14284-14287.

58. Hanes J., Pluckthun A. (1997) In vitro selection and evolution of functional proteins byusing ribosome display. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94,4937-4942.

59. Makeyev, E.V., Kolb, V.A., Spirin, A.S. (1999) Cell-free immunology: construction andin vitro expression of a PCR-based library encoding a single-chain antibody repertoire. FEBSLett. 444,177-180.

60. Nicola A.V., Chen W., Helenius A. (1999) Co-translational folding of an alphaviruscapsid protein in the cytosol of living cells. Nature Cell Biol. 1, 341-345.

61. Netzer W., Hartl F.U. (1997) Recombination of protein domains facilitated by cotranslational folding in eukaryotes. Nature, 388, 343 349.

62. Zipser D. (1963) Studies on the ribosome-bound p-galactosidase of Escherichia coli. J.1. Mol. Biol. 7, 739-751.

63. Kolb V.A., Makeyev E.V., Spirin A.S. (2000). Co-translational folding of an eukaryoticmultidomain protein in a prokaryotic translation system. J. Biol. Chem. 275, 16597 -16601.

64. Frydman J. (2001) Folding of newly translated proteins in vivo: the role of molecularchaperones. Annu. Rev. Biochem. 70, 603 647.

65. White E.H., McCapra F., Field G.F., McElroy W.D. (1961) The structure and synthesis offirefly luciferin. J. Am. Chem. Soc. 83,2402 2403.

66. Ugarova N.N. (1989) Luciferase of Luciola mingrelica fireflies, kinetics and regulationmechanism. J. Biolumin. Chemilumin. 4,406 418.

67. Shimomura O., Goto T., Johnson F.H. (1977) Source of oxygen in the CO2 produced inthe bioluminescent oxidation of firefly luciferin. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74, 2799 -2802.

68. Seliger M.M, McElroy W.D. (1960) Spectral emission and quantum yield of fireflybioluminescence. Arch. Biochem. Biophys. 88, 136-141.

69. DeLuca M., McElroy W.D. (1974) Kinetics of the firefly luciferase catalyzed reactions.

70. Biochemistry, 13, 921 925.

71. Seliger H.H, McElroy W.D. (1964) The colors of firefly bioluminescence: enzymeconfiguration and species specificity. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 52, 75 81.

72. Baldwin T.O. (1996) Firefly luciferase: the structure is known, but the mystery remains.1. Structure, 4, 223 228.

73. De Wet J.R. Wood K.V., DeLuca M., Helinski D.R., Subramani S. (1987) Fireflyluciferase gene: structure and expression in mammalian cells. Mol. Cell. Biol. 1, 725 -737.

74. Denburg J.L., McElroy W.D. (1970) Catalytic subunit of firefly luciferase. Biochemistry,9, 4619-4624.

75. DeLuca M., McElroy W.D. (1978) Purification and properties of firefly luciferase.

76. Methods Enzymol. 57, 3 15.

77. Sala-Newby G., Kalsheker N., Campbell A.K. (1990) Removal of twelve C-terminalamino acids from firefly luciferase abolishes activity. Biochem. Biophys. Res. Commun. 172, 477-482.

78. Sala-Newby G.B., Campbell A.K. (1994) Stepwise removal of the C-terminal 12 aminoacids of firefly luciferase results in graded loss of activity. Biochim. Biophys. Acta, 1206,155- 160.

79. Conti E., Francs N.P., Brick P. (1996) Crystal structure of firefly luciferase throws lighton a superfamily of adenylate-forming enzymes. Structure, 4, 287 298.

80. Gould S.J., Subramani S. (1988) Firefly luciferase as a tool in molecular and cell biology.1. Anal. Biochem. 175, 5-13.

81. Nimmesgern E., Hartl F.U. (1993) ATP-dependent protein refolding activity in reticulocyte lysate. Evidence for the participation of different chaperone components. FEBSLett. 331, 25 30.

82. Frydman J., Nimmesgern E., Ohtsuka K., Hartl F.U. (1994) Folding of nascentpolypeptide chains in a high molecular mass assembly with molecular chaperones. Nature, 370,111-117.

83. Schroder H., Langer T., Hartl F.-U., Bukau B. (1993) DnaK, DnaJ and GrpE form acellular chaperone machinery capable of repairing heat-induced protein damage. EMBO J. 12,4137-4144.

84. Buchberger A., Schroder H., Hesterkamp T., Schonfeld H.-J., Bukau B. (1996) Substrateshuttling between the DnaK and GroEL systems indicates a chaperone network promoting protein folding. J. Mol. Biol. 261, 328 333.

85. Hesterkamp T., Bukau B. (1998) Role of the DnaK and HscA homologs of Hsp70chaperones in protein folding in E. coli. EMBO J. 17, 4818 4828.

86. Herbst R., Schafer U., Seckler R. (1997) Equilibrium intermediates in the reversibleunfolding of firefly (Photinuspyralis) luciferase. J. Biol. Chem. 272,7099 7105.

87. Bernabeu C., Lake J.A. (1982) Nascent polypeptide chains emerge from the exit domainof the large ribosomal subunit: Immune mapping of the nascent chain. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79, 3111-3115.

88. Bernabeu C., Tobin E.M., Fowler A., Zabin I., Lake J.A. (1983) Nascent polypeptidechains exit the ribosome in the same relative position in both eukaryotes and prokaryotes. J. Cell Biol. 96, 1471 1474.

89. Malkin L.I., Rich A. (1967) Partial resistance of nascent polypeptide chains to proteolyticdigestion due to ribosomal shielding. J. Mol. Biol. 26, 329 346.

90. Blobel G., Sabatini D.D. (1970) Controlled proteolysis of nascent peptide in rat liver cellfractions. J. Cell Biol. 45,130 145.

91. Smith W.P., Tai P.C., Davis B.D. (1978) Interaction of secreted nascent chains withsurrounding membranes in Bacillus subtilis. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75, 5922 -5925.

92. Lührmann R., Bald R., Stöffler-Meilicke M., Stöffler G. (1981) Localization of thepuromycin binding site on the large ribosomal subunit of Escherichia coli by immunoelectron microscopy. Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 78,7276 7280.

93. Olson H.M., Grant P.G., Cooperman B.S., Glitz D.G. (1982) Immunoelectron microscopic localization of puromycin binding on the large subunit of the Escherichia coli ribosome. J. Biol. Chem. 257, 2649 2656.

94. Spinn A.S., Vasiliev V.D. (1989) Localization of functional centers on the prokaryoticribosome: immuno-electron microscopy approach. Biol. Cell. 66,215 223.

95. Arad T., Piefke J., Weinstein S., Gewitz H.S., Yonath A., Wittman H.G. (1987) Threedimensional image reconstruction from ordered arrays of 70S ribosomes. Biochimie, 69, 1001 1005.

96. Yonath A., Leonard K.R., Wittmann H.G. (1987) A tunnel in the large ribosomal subunitrevealed by three-dimensional image reconstruction. Science, 236, 813-816.

97. Milligan R.A., Unwin P.N.T. (1986) Location of the exit channel for nascent proteins in80S ribosomes. Nature, 319, 693 696.

98. Radermacher M., Wagenknecht T., Verschoor A., Frank J. (1987) Three-dimensionalstructure of the large ribosomal subunit from Escherichia coli. EMBO J. 6, 1107 1114.

99. Eisenstein M., Sharon R., Berkovitch-Yellin Z., Gewitz H.S., Weinstein S., Pebay

100. Peyroula E., RothM., Yonath A. (1991) The interplay between X-ray crystallography, neutron diffraction, image reconstitution, organo-metallic chemistry and biochemistryin structural studies of ribosomes. Biochimie, 73, 879 886.

101. Yonath A., Wittmann H.G. (1989) Challenging the three-dimensional structure ofribosomes. Trends Biochem. Sei. 14, 329 335.

102. Stark H., Mueller F., Orlova E.V., Schatz M., Dube P., Erdemir T., Zemlin F.,

103. Brimacombe R., van Heel M. (1995) The 70S Escherichia coli ribosome at 23 Â resolution: fitting the ribosomal RNA. Structure, 3, 815 821.

104. Stark H., Orlova E.V., Rinke-Appel J., Jünke N., Mueller F., Rodnina M., Wintermeyer

105. W., Brimacombe R., van Heel M. (1997) Arrangements of tRNAs in pre- and posttranslocational ribosomes revealed by electron cryomicroscopy. Cell, 88,19-28.

106. Frank J., Zhu J., Penczek P., Li Y., Srivastava S., Verschoor A., Radermacher M.,

107. Grassucci R., Lata R.K., Agrawal R.K. (1995) A model of protein synthesis based on cryo-electron microscopy of the E. coli ribosome. Nature, 376, 441 444.

108. Frank J., Verschoor A., Li Y., Zhu J., Lata R.K., Radermacher M., Penczek P., Grassucci

109. R., Agrawal R.K., Srivastava S. (1995) A model of the translational apparatus based on a three-dimensional reconstruction of the Escherichia coli ribosome. Biochem. Cell Biol. 73, 757 765.

110. Yonath A., Berkovitch-Yellin Z. (1993) Hollows, voids, gaps and tunnels in the ribosome.

111. Curr. Opin. Struct. Biol. 3,175-181.

112. Verschoor A., Srivastava S., Grassucci R., Frank J. (1996) Native 3D structure ofeukaryotic 80S ribosome: morphological homology with E. coli 70S ribosome. J. Cell Biol. 133, 495 505.

113. Verschoor A., Warner J.R., Srivastava S., Grassucci R., Frank J. (1998) Threedimensional structure of the yeast ribosome. Nucleic Acids Res. 26, 655 661.

114. Morgan D.G., Ménétret J.-F., Radermacher M., Neuhof A., Akey I.V., Rapoport T.A.,

115. Akey C.W. (2000) A comparison of the yeast and rabbit 80S ribosome reveals the topology of the nascent chain exit tunnel, inter-subunit bridges and mammalian rRNA expansion segments. J. Mol. Biol. 301,301 321.

116. Dube P., Weiske M., Stark H., Schatz M., Stahl J., Zemlin F., Lutsch G., van Heel M.1998) The 80S rat liver ribosome at 25 Â resolution by electron cryomicroscopy and angular reconstitution. Structure, 6, 389 399.

117. Beckmann R., Bubeck D., Grassucci R., Penczek P., Verschoor A., Blobel G., Frank J. (1997) Alignment of conduits for the nascent polypeptide chain in the ribosome-Sec61 complex. Science, 278,2123 2126.

118. Miyaguchi K., Reese T.S. (1996) Direct visualization of a transmembrane channel associated with ribosomes. J. Struct. Biol. 116, 413 417.

119. Gabashvili I.S., Agrawal R.K., Grassucci R., Squires C., Dahlberg A.E., Frank J. (1999) Major rearrangements in the 70S ribosomal 3D structure caused by a conformational switch in 16S ribosomal RNA. EMBOJ. 18, 6501 6507.

120. Gabashvili I.S., Agrawal R.K., Spahn C.M.T., Grassucci R.A., Svergun D.I. Frank J., Penczek P. (2000) Solution structure of the E. coli 70S ribosome at 11.5 A resolution. Cell, 100, 537 549.

121. Ban N., Freeborn B., Nissen P., Penczek P., Grassucci R.A., Sweet R., Frank J., Moore P.B., Steitz T.A. (1998) A 9 A resolution X-ray crystallographic map of the large ribosomal subunit. Cell, 93,1105 1115.

122. Ban N., Nissen P., Hansen J., Capel M., Moore P.B., Steitz T.A. (1999) Placement of proteins and RNA structures into a 5 A-resolution map of the 50S ribosomal subunit. Nature, 400, 841 847.

123. Ban N., Nissen P., Hansen J., Moore P.B., Steitz T.A. (2000) The complete atomic structure of the large ribosomal subunit at 2.4 A resolution. Science, 289, 905 920.

124. Nissen P., Hansen J., Ban N., Moore P.B., Steitz T.A. (2000) The structural basis of ribosome activity in peptide bond synthesis. Science, 289, 920-930.

125. Cate J., Yusupov M.M., Yusupova G.Zh., Earnest T.N., Noller H.F. (1999) X-ray crystal structures of 70S ribosome functional complexes. Science, 285, 2095 2104.

126. Yusupov M.M., Yusupova G.Zh., Baucom A., Lieberman K., Earnest T.N., Cate J.H.D., Noller H.F. (2001) Crystal structure of the ribosome at 5.5 A resolution. Science, 292, 883 896.

127. Harms J., Schluenzen F., Zarivach R., Bashan A., Gat S., Agmon I., Bartels H., Franceschi F., Yonath A. (2001) High resolution structure of the large ribosomal subunit from a mesophilic eubacterium. Cell, 107,679 688.

128. Schlunzen F., Zarivach R., Harms J., Bashan A., Tocilj A., Albrecht R., Yonath A. (2001) Structural basis for the interaction of antibiotics with the peptidyl transferase center in eubacteria. Nature, 413, 814-821.

129. Sarimo S.S, Pine M.J. (1969) Taxonomic comparison of the amino termini of microbial cell proteins. J. Bacteriol. 98,368 374.

130. Waller J.-P.( 1963) The NH2-terminal residues of the proteins from cell-free extracts of E. coli. J. Mol. Biol. 7,483 496.

131. Hunt T., Hunter A.R., Munro A.J. (1968) Control of haemoglobin synthesis: distribution of ribosomes on the messenger RNA for alpha and beta chains. J. Mol. Biol. 36, 31 36.

132. Jackson R., Hunter T. (1970) Role of methionine in the initiation of haemoglobin synthesis. Nature, 227, 672 676.

133. Yoshida A., Watanabe S., Morris J. (1970) Initiation of rabbit hemoglobin synthesis: methionine and formilmethionine at the N-terminal. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 67, 1600-1607.

134. Palmiter R.D., Gagnon J., Walsh K.A. (1978) Ovalbumin: A secreted protein without a transient hydrophobic leader sequence. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75,94 98.

135. Adams J.M. (1968) On the release of the formyl group from nascent protein. J. Mol. Biol. 33, 571 589.

136. Takeda M., Webster R. E. (1968) Protein chain initiation and deformylation in B. subtilis homogenates. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 60,1487 1494.

137. Ball L.A., Kaesberg P. (1973) Cleavage of the N-terminal formylmethionine residue from a bacteriophage coat protein in vitro. J. Mol. Biol. 79, 531 537.

138. Housman D., Gillespie D., Lodish H.F. (1972) Removal of formyl-methionine residue from nascent bacteriophage £2 protein. J. Mol. Biol. 65,163 166.

139. Strous G.J.A.M., Berns A.J.M., Bloemendal H. (1974) N-terminal acetylation of the nascent chains of alpha-crystallin. Biochem. Biophys. Res. Commun. 58, 876 884.

140. Kasten-Jolly J., Taketa F. (1982) Biosynthesis and amino terminal acetylation of cat hemoglobin B. Arch. Biochem. Biophys. 214, 829 839.

141. Wiedmann B., Sakai H., Davis T.A., Wiedmann M. (1994) A protein complex required for signal-sequence-specific sorting and translocation. Nature, 370,434 440.

142. Moller I., Beatrix B., Kreibich G., Sakai H., Lauring B., Wiedmann M. (1998) Unregulated exposure of the ribosomal M-site caused by NAC depletion results in delivery of non-secretory polypeptides to the Sec61 complex. FEBS Lett. 441,1-5.

143. Wang S., Sakai H., Wiedmann M. (1995) NAC covers ribosome-associated nascent chains thereby forming a protective environment for regions of nascent chains just emerging from the peptidyl transferase center. J. Cell Biol. 130, 519 528.

144. Ryabova L.A., Selivanova O.M., Baranov V.I., Vasiliev V.D., Spirin A.S. (1988) Does the channel for nascent peptide exist inside the ribosome? Immune electron microscopy study. FEBS Lett. 226,255 260.

145. Hardesty B., Picking W.D., Odom O.W. (1990) The extension of polyphenylalanine and polylysine peptides on E. coli ribosomes. Biochim. Biophys. Acta, 1050,197 202.

146. Picking W.D., Odom O.W., Tsalkova T., Serdyuk I., Hardesty B. (1991) The conformation of nascent polylysine and polyphenylalanine peptides on ribosomes. J. Biol. Chem. 266,1534- 1542.

147. Odom O.W., Picking W.D., Tsalkova T., Hardesty B. (1991) The synthesis of polyphenylalanine on ribosomes to which erythromycin is bound. Eur. J. Biochem. 198, 713-722.

148. Picking W.D., Picking W.L., Odom O.W., Hardesty B. (1992) Fluorescence characterization of the environment encountered by nascent polyalanine and polyserine as they exit Escherichia coli ribosomes during translation. Biochemistry, 31, 2368 -2375.

149. Crowley K.S., Reinhart G.D., Johnson A.E. (1993) The signal sequence moves through a ribosomal tunnel into a noncytoplasmic aqueous environment at the ER membrane early in translocation. Cell, 73,1101-1115.

150. Crowley K.S., Liao S., Worrell V.E., Reinhart G.D., Johnson A.E. (1994) Secretory proteins move through the endoplasmic reticulum membrane via an aqueous, gated pore. Cell, 78, 461-471.

151. Hamman B.D., Chen J.-C., Johnson E.E., Johnson A.E. (1997) The aqueous pore through the translocon has a diameter of 40-60 A during cotranslational protein translocation at the ER membrane. Cell, 89, 535 544.

152. Ramachandiran V., Willms C., Kramer G., Hardesty B. (2000) Fluorophores at the N terminus of nascent chloramphenicol acetyltransferase peptides affect translation and movement through the ribosome. J. Biol. Chem. 275,1781 1786.

153. Stade K., Riens S., Bochkariov D., Brimacombe R. (1994) Contacts between the growing peptide chain and the 23 S RNA in the 50S ribosomal subunit. Nucleic Acids Res. 22,1394- 1399.

154. Stade K., Junke N., Brimacombe R. (1995) Mapping the path of the nascent peptide chain through the 23S RNA in the 50S ribosomal subunit. Nucleic Acids Res. 23,2371 — 2380.

155. Choi K.M., Brimacombe R. (1998) The path of the growing peptide chain through the 23S rRNA in the 50S ribosomal subunit; a comparative cross-linking study with three different peptide families. Nucleic Acids Res. 26, 887 895.

156. Choi K.M., Atkins J.F., Gesteland R.F., Brimacombe R. (1998) Flexibility of the nascent polypeptide chain within the ribosome. Contacts from the peptide N-terminus to a specific region of the 30S subunit. Eur. J. Biochem. 255,409 413.

157. Tenson T., Ehrenberg M. (2002) Regulatory nascent peptides in the ribosomal tunnel. Cell, 108, 591 594.

158. Nakatogava H., Ito K. (2002) The ribosomal exit tunnel functions as a discriminating gate. Cell, 108, 629 636.

159. McPhie P. (1982) Swine pepsinogen folding intermediates are highly structured, motile molecules. Biochemistry, 21, 5509 5515.

160. Semisotnov G.V., Uversky V.N., Sokolovsky I.V, Gutin A.M., Razgulyaev O.I., Rodionova N.A. (1990) Two slow stages in refolding of bovine carbonic anhydrase B are due to proline isomerization. J. Mol. Biol. 213, 561 568.

161. Yusupov M.M., Spirin A.S. (1986) Are there proteins between the ribosomal submits? Hot tritium bombardment experiments. FEBS Lett. 197,229 233.

162. Shimizu Y., Inoue A., Tomari Y., Suzuki Т., Yokogawa Т., Nishikawa K., Ueda T. (2001) Cell-free translation reconstituted with purified components. Nature Biotechnol. 19,751-755.

163. Reiss В., Sprengel R., Schaller H. (1984) Protein fusions with the kanamycin resistance gene from transposon Tn5. EMBOJ. 3, 3317-3322.

164. Tabor S., Richardson C.C. (1985) A bacteriophage T7 RNA polymerase/promoter system for controlled exclusive expression of specific genes. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82,1074-1078.

165. Gurevich V.V., Pokrovskaya I.D., Obukhova T.A Zozulya S.A. (1991) Preparative in vitro mRNA synthesis using SP6 and T7 RNA polymerases. Anal. Biochem. 195, 207213.

166. Roberts B.E., Paterson B.M. (1973) Efficient translation of tobacco mosaic virus RNA and rabbit globin 9S RNA in a cell-free system from commercial wheat germ. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 70,2330-2334.

167. Zubay G. (1973) In vitro synthesis of protein in microbial systems. Annu. Rev. Genet. 7, 267-287.

168. Гаврилова Л.П., Смолянинов B.B. (1971) Изучение механизма транслокации в рибосомах. 1. Синтез полифенилаланина в рибосомах Escherichia coli без участия гуанозин-5'-трифосфата и белковых факторов трансляции. Молекуляр. Биология, 5, 883-891.

169. Staehelin T., Maglott, D.M., Monro R.E. (1969) On the catalytic center of peptidyl transfer: a part of the 50 S ribosome structure. Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 34,39-48.

170. Niederwieser A. (1972) Thin-layer chromatography of amino acids and derivatives. Methods Enzymol. 25, 60-99.

171. Laemmli U.K. (1970) Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature, 227, 680-685

172. Глубоко благодарен В.Д. Васильеву, |А.С. Гиршовичу! А.Б. Четверину, A.B. Финкелынтейну, И.А. Крашенинникову, A.B. Шишкову и академику A.A. Богданову за интерес к моей работе и плодотворные дискуссии.

173. Хотелось бы также выразить искреннюю благодарность моей няне

174. Наталье Андреевне Струц за её удивительную доброту, мудрость и понимание.

175. Приношу глубокие извинения тем, кто не попал в настоящий список по причине моей забывчивости и прочих недостатков.