Биосинтетическое сворачивание белков

Федоров, Алексей Николаевич

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Биосинтетическое сворачивание белков
ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Биосинтетическое сворачивание белков"

На правах рукописи

□□3477442

Федоров Алексей Николаевич

БИОСИНТЕТИЧЕСКОЕ СВОРАЧИВАНИЕ БЕЛКОВ

03.00.04-биохимия

АВТОРЕФЕРАТ диссертация на соискание ученой степени доктора биологических наук

? 4 СЕН 2009

Москва - 2009

003477442

Работа выполнена в ОАО «Всероссийский научный центр молекулярной диагностик и лечения» (ВНЦМДЛ) и ГУЗ Московский научно-исследовательский институт медицинской экологии Департамента здравоохранения г. Москвы (МНИИМЭ).

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор,

чл.-корр. РАН

Габибов Александр Габибович

доктор биологических наук, профессор Муронец Владимир Израилевич

доктор биологических наук, профессор Чернов Николай Николаевич

Ведущая организация: Институт биохимии им. А. Н. Баха РАН

Защита состоится «1С» О 2009г. в _ часов на заседай

диссертационного совета Д 212.203.13 при Российском университете дружбы народ по адресу: 117198, Москва, улица Миклухо-Маклая, д.8, Медицинский факультет.

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке Российско университета дружбы народов по адресу: 117198, Москва, улица Миклухо-Макл Д.6.

Автореферат разослан «(й_» С2-иЗ 2009г.

Ученый секретарь диссертационного совета Д 212.203.13

Профессор, доктор биологических наук р/ухгг^^^- Е. В. Лукашева

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ.

Актуальность проблемы.

Проблема, каким образом линейная аминокислотная последовательность полипептида сворачивается, чтобы принять уникальную пространственную структуру, является одной из фундаментальных проблем современной науки. Многие принципы и характеристики сворачивания белков были изучены при анализе ренатурации денатурированных полипептидов. Однако проблема сворачивания белков не может быть полностью понята без соотнесения ее с биологическим контекстом, особенно для больших, мультидоменных и мультисубъединичных, белков. Одно из основных различий между биосинтетическим сворачиванием белка и его ренатурацией является котрансляционное сворачивание - сворачивание, которое происходит во время синтеза полипептидной цепи на рибосоме. Основная отличительная черта котрансляционного сворачивания - векторное (направленное) появление полипептидной цепи из рибосомы и возможность инициации сворачивания появляющегося растущего полипептида. При этом самым существенным образом может отличаться кинетика процесса сворачивания, его пути и возможное распределение продукта между несколькими формами (например, нативная и агрегированная форма) и их относительный выход. Обеспечение эффективного сворачивания белков и есть суть биосинтетического процесса сворачивания и векторного (котрансляционного) сворачивания как его интегральной части, как мы постараемся показать в данной работе.

За последние 15-20 лет появился огромный вал работ, связанный с участием белков теплового шока, теперь обычно называемых молекулярными шаперонами или просто шаперонами. Тем не менее, даже основные принципы и механизмы действия шаперонов не являются достаточно изученными. Работы, направленные на их выяснение, являются несомненно актуальными.

Достаточно очевидна актуальность создания, исследования и возможного применения новых вариантов природных белков и искусственных полипептидов с заданной пространственной структурой как для проверки понимания самоорганизации белков, так и создания белков с определенными функциями для медицины, биотехнологии и т.д.

Внимание к изучению вируса гепатита С (ВГС) легко объяснимо. Вирусом инфицировано 3-5% населения, у 30% инфицированных развиваются терминальные болезни печени. При этом, несмотря на колоссальные усилия в течение около 20 лет после обнаружения ВГС, отсутствуют как соответствующая вакцина, так и эффективная терапия.

Создание рекомбинантной противотуберкулезной вакцины несомненно является актуальным и объявлено одним из приоритетов ВОЗ ввиду ограниченной эффективности БЦЖ.

Целями настоящей работы являются: изучение биосинтетического сворачивания белков, в том числе котрансляционного этапа и вклада молекулярных шаперонов в процесс сворачивания; разработка подходов для изучения

сворачивания, структурно-функционального и иммунологического анализа белков в бесклеточных системах экспрессии; изучение природных и искусственных белков с применением, в том числе, разработанных подходов; изучение подходов к созданию противотуберкулезной вакцины на основе молекулярных шаперонов.

Основными экспериментальными задачами данной диссертационной работы являлись: изучение этапов котрансляционного сворачивания белков; характеристика пути биосинтетического сворачивания белков и прямое сравнение с ренатурацией из денатурированного состояния; выяснение принципов действия молекулярных шаперонов в достижении белками биологически активной нативной конформации и минимизации альтернативных непродуктивных путей сворачивания. Кроме этого, задачами являлись: изучение альбебетина, искусственного белка с заранее заданной пространственной структурой, и структурных белков вируса гепатита С; изучение шаперона HSP70 М. tuberculosis как основы противотуберкулезной вакцины.

Научная новизна диссертационной работы.

Детально исследован процесс котрансляционного сворачивания полипептидов. Для этой цели разработаны целый ряд оригинальных подходов. Показано с использованием конформационно-зависимого антитела, что процесс сворачивания полипептида может начинаться до завершения синтеза соответствующего домена белка. При этом образующаяся структура рибосомо-связанного полипептида близка к структуре нативного белка.

Впервые, на примере Р субъединицы бактериальной люциферазы, изучен путь биосинтетического сворачивания белка, охарактеризован основной скорость-лимитирующий интермедиат при сворачивании и кинетика процесса. Показано, в прямом сравнении с ренатурацией денатурированной р субъединицы, что котрансляционное сворачивание вносит вклад в кинетику формирования активной люциферазы. Таким образом, доказано, что котрансляционное сворачивание полипептидов является фактором, который обеспечивает быстрое сворачивание в клетках. Показано, что ключевым для быстрой кинетики биосинтетического сворачивания является нестабильный интермедиат, освобождающийся из рибосомы после завершения синтеза.

На основании полученных результатов выдвинуты некоторые основные принципы котрансляционного сворачивания.

Изучена роль молекулярных шаперонов в биосинтетическом сворачивании белков. Показана вовлеченность шаперонов в процесс котрансляционного сворачивания полипептидов; продемонстрировано, что эти взаимодействия могут быть ключевыми для определения пути сворачивания полипептида. Показано, на примере GroEL, что шапероны могут играть активную роль в сворачивании белка, максимально повышая путь сворачивания, ведущий к биологически активной структуре белка и минимизируя альтернативные пути, приводящие к появлению биологически не значимых форм. Предложен механизм такого действия шаперонов.

Изучены эволюционные аспекты сворачивания полипептидов. Показано, что биосинтетическое сворачивание полипептида в гомологичном для него окружении может отличаться от сворачивания в гетерологичной системе.

Таким образом, совокупность полученных результатов позволяет сказать, что начато новое научное направление - изучение биосинтетического сворачивания

белков как комплексного процесса, определяемого совокупностью факторов, которые делают указанный путь сворачивания уникальным: это и векторный неравновесный характер процесса, определяемый его котрансляционной стадией, и вовлеченность шаперонов, и эволюционная адаптация для сворачивания в определенном клеточном окружении. Этот подход включает определение путей биосинтетического сворачивания и их прямое сравнение с процессом ренатурации полноразмерных полипептидов.

Предложен новый подход к структурно-функциональному и иммунологическому анализу белков - анализ белков, синтезированных в бесклеточных системах экспрессии. Данный подход позволяет изучать белки, которые затруднительно или невозможно получать традиционной наработкой в клеточных системах культивирования. Для этого предложен или адаптирован целый ряд методов. Используя данный подход, изучен искусственный полипептид альбебетин, белок с заранее заданной пространственной структурой. Проведен начальный структурно-функциональный анализ структурных белков вируса гепатита С. Изучен конъюгат шаперона HSP70 М. tuberculosis с иммуномодулятором полиоксидонием как возможная основа противотуберкулезной вакцины.

Практическая значимость диссертационной работы. Установленные закономерности биосинтетического сворачивания белков вносят заметный вклад в понимание процесса их сворачивания и самоорганизации. Полученные результаты позволяют оптимизировать продукцию рекомбинантных белков в клеточных и бесклеточных системах экспрессии, а также процедуры ренатурации в биологически активные формы.

Разработанные подходы для структурно-функционального и иммунологического анализа полипептидов, в том числе синтезированных в бесклеточных системах, могут применяться для быстрого анализа природных и искусственных полипептидов, экспрессия которых в клетках затруднена, например из-за токсичности, подверженности протеолизу и т.д. Возможности подхода продемонстрированы на начальном структурном анализе альбебетина, полипептида с заранее заданной пространственной структурой.

Большое практическое значение имеет изучение структурных белков ВГС. В настоящее время отсутствуют вакцина против ВГС. Структурные белки вируса рассматриваются как кандидаты на создание соответствующей вакцины и терапии. Их анализ и использование в данных качествах затруднены сложностью работы с этими белками. Получены несколько форм структурного белка Е2, пригодных для структурно-функционального анализа. Установлена его доменная организация.

Показано, что конъюгат шаперона HSP70 М. tuberculosis с иммуномодулятором полиоксидонием может являться основой противотуберкулезной вакцины.

Апробация работы. Результаты работы были представлены на международных конференциях: Gordon conference (USA, 1994, 1998-2000), Conference of Protein society, USA (USA, 1994-2000), Conference of Biochemical society, USA (USA, 1995, 1997-2000), Protein folding conference (USA, 1992-2000), Keystone Simposium (USA, 1995, 1996, 1997, 2000), International congress on HCV (Japan, 2004), conference of Royal Society on British-Russian scientific cooperation (UK, 2004), всесоюзной конференции биохимического общества (Тбилиси, 1989), российско-французской

конференции (Москва, 1992). Результаты работы докладывались на семинарах в Институте белка (Пущино), Институте Пастера (Франция), Центре ядерных исследований (Франция), Высшей политехнической школе (Франция), Университете Страсбурга (Франция), Техасского А и М университета (Колледж Стейшн, США), университетов Техаса в Остине, Сан-Антонио, Хьюстоне, Далласе и Гальвестоне, Университете Пенсильвании (Херши, США), Институте биологии (Бостон, США), Гарвардском университете (Бостон, США), Гарвардской школе медицины (Бостон, США), Университете Глазго (Великобритания), Отделении вирусологии медицинского исследовательского совета (Великобритания).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 20 статей в рецензируемых отечественных и международных научных журналах.

Структура диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, шестнадцати глав, заключения, выводов и списка 381 цитируемого литературного источника. Материалы диссертации иллюстрируют 69 рисунков и 4 таблицы.

Используемые сокращения. ВГС- вирус гепатита С.

HSP- белок теплового шока (heat shock protein), эти белки также называются молекулярными шаперонами.

GroEL- бактериальный белок теплового шока с молекулярной массой 60 кДа. DnaK- бактериальный белок теплового шока с молекулярной массой 70 кДа. HSP70 М. tuberculosis - белок теплового шока с молекулярной массой 70 кДа микобактерии туберкулеза.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Во введении формулируются направления и цели исследования.

Глава 1 посвящена анализу литературных данных.

I. Котрансляционное сворачивание белков.

Глава 2. Ранние стадии сворачивания белка, проходящие котрансляционно.

Сворачивание полипептидов является спонтанным процессом и может в принципе начинаться и проходить по мере синтеза белка, т.е. появления и постепенного удлинения растущей полипептидной цепи до завершения синтеза полноразмерного полипептида. С другой стороны, связь С-конца полипептида с тРНК и фиксация пептидил-тРНК на рибосоме может ограничивать конформационную подвижность растущего полипептида и влиять на сворачивание. Вопрос состоит в возможных экспериментальных подходах, способных детектировать появление тех или иных элементов структуры белка по мере синтеза полипептидной цепи на рибосоме в бесклеточных системах экспрессии при количествах синтезируемого полипептида от фентомолей до пикомолей и в окружении огромного избытка белков и других компонентов бесклеточной системы.

Анализ котрансляционного сворачивания белков возможен при использовании моноклональных антител, реагирующих с конформационно-зависимыми эпитопами. Такая работа была проведена с ß субъединицей триптофан синтазы Е. coli. Белок является гомодимером с молекулярной массой мономера 44 кДа. Белок

двухдоменный с N-концевым доменом 21 кДа. Использовали конформаиионно-зависимое моноклональное антитело, mAb19, с эпитопом в N-концевом домене. При ренатурации белка структура, узнаваемая к о н фо р ма ц и о н н о-з ав и с и м ы м антителом, появляется после завершения начальных этапов сворачивания (Blond-Elguindi, Goldberg, 1990).

При выполнении работы использовали тот факт, что при синтезе в системе трансляции из Е. coli ß субъединица триптофан синтазы образует ограниченный набор пептидов возрастающего размера. Такая особенность является характерной для многих белков. Мы показали, что антитело тлАЫ 9 взаимодействует именно с рибосомо-связанпыми пептидами ß субъединицы триптофан синтазы, выделяя рибосомную фракцию. Антитело начинает взаимодействовать с синтезируемой триптофан синтазой при достижении пептидом массы I 1.5 кДа (Рис. !А). После этого антитело взаимодействует со всеми рибосомо-связанными пептидами большей массы. Чтобы подтвердить полученные результаты, был экспрессирован рибосомо-связанный N-концевой 11,5 кДа фрагмент белка. Для создания стабильных рибосомо-связанных комплексов, несущих синтезируемый полипептид, мы разработали подход, в котором использовали мРНК, оканчивающуюся на один или два нуклеотида после последнего 3' концевого триплета. Полученный рибосомо-связаиный N-концевой 11,5 кДа фрагмент белка взаимодействует с антителом (Рис. I Б), Таким образом, на качественном уровне мы доказали, что синтезируемый пептид начинает сворачиваться по мере синтеза, задолго до появления соответствующего полноразмерного домена, т.е. мы наблюдаем внутридоменное сворачивание по ходу синтеза белка. Необходимо учесть, что около 20 С-комцевых аминокислот синтезируемого полипептида находятся внутри рибосомы, таким образом, с антителом могут взаимодействовать около 80 аминокислот. Данный N-концевой фрагмент ß субъединицы триптофан синтазы образует в нативном белке две взаимодействующие между собой альфа спирали.

Б II If

ig G - 19 - ta ï-l

Рис. I И мму но реактивность растущих цепей ß субъединицы триптофан синтазы с моноклональным антителом тАЫ9. А -синтез белка в системе из Е. coli, а-контроль иммуноадсорбции, Ь-иммуноадсорбция с шАЫ9, с-реперные белки. Б - синтез 11.5 кДа фрагмента в системе из зародышей пшеницы, а и с-синтез фрагмента со стоп кодоном и без стоп кодона, Ь и d-нммуноадсорбиия с тАЫ9.

Чтобы доказать идентичность или близость структуры в районе конформационного эпитопа у синтезируемого пептида и полноразмерного белка, нам необходимо было определить афинность взаимодействия антитела в обоих случаях. Мы разработали метод, позволяющий провести такое исследование. Его детали изложены ниже (см. главу 13). Для рибосомо-связанного 11.5 кДа пептида и антитела шАЬ19 мы получили сродство 6x108 М"1. Такое же значение было получено для 11.5 кДа фрагмента в растворе. Сродство антитела шАЫ9 к нативному гомодимеру триптофан синтазы составляет 6x108 M"1 (Friguet et al, 1986), что очень близко к полученным нами результатам.

Полученные данные о близости афинности антитела гпАЫ9 к рибосомо-связанному N-концевому фрагменту и нативному белку исключают возможность, что наблюдаемая иммунореактивность отражает конформационное равновесие между минорной фракцией иммунореактивного рибосомо-связанного пептида и мажорной фракцией пептида, не взаимодействующего с антителом. Также и в случае, если иммунореактивная конформация индуцируется антителом, афинность взаимодействия с антигеном уменьшается (Friguet et al, 1989).

Наличие структурированной конформации у фрагмента было подтверждено гель-фильтрацией и электрофорезом с горизонтальным градиентом мочевины, перпендикулярным к направлению электрофореза.

Мы показали, что р субъединица триптофан синтазы Е. coli начинает сворачиваться по мере ее синтеза на рибосоме и локальная пространственная структура, соответствующая нативной, может формироваться еще до завершения синтеза соответствующего домена.

Глава 3. Кинетика котрансляционного сворачивания.

Чтобы однозначно показать, что растущая полипептидная цепь приобретает элементы пространственной структуры действительно по ходу процесса трансляции, мы разработали процедуру пульсового радиоактивного мечения синтезируемого пептида и короткой пульсовой иммуноадсорбции полипептидных цепей р субъединицы триптофан синтазы на антителе шАЫ9. Ее наиболее важные детали состоят в следующем. Взаимодействие тАЫ9 с синтезируемыми полипептидами было ограничено 30 секундами. Анализировали связавшиеся с антителом радиоактивно меченые рибосомо-связанные полипептиды 11.5, 30 и 40 кДа.

Синтез основных пептидных фрагментов идет линейно по времени, после лага, характерного для каждого пептида. Кинетика накопления всех рибосомо-связанных цепей данного размера была сравнена с кинетикой появления иммунореактивных, т.е. свернутых, полипептидов (см. Рис. 2 для фрагментов 11.5 и 30 кДа). Для всех фрагментов время их появления совпадало со временем их синтеза. Так как использовавшийся иммунохимический пульс, 30 секунд, значительно короче времени синтеза полипептидных цепей в используемой системе, мы можем утверждать, что данный белок начинает сворачиваться задолго до завершения его синтеза.

^ o.os i x

X СЦ

S 1 0 04 8.® £ s 0.03 11

<D s g-f

0 >• 0.01

£ Б

? л

1 0

S о

Рис. 2 Сравнительная кинетика синтеза и появления иммунореактивности с шАЫ9 при синтезе фрагментов 30 кДа - А и 10.5 кДа - Б р субъединицы триптофан синтазы. Количество синтезированных фрагментов (о, правая шкала) и иммунореактивных фрагментов (•, левая шкала)

Глава 4. Влияние котрансляционного этапа на кинетику биосинтетического сворачивания белка.

Принципиальная особенность котрансляционного сворачивания полипептида состоит в том, что в ходе процесса возникающие внутрипептидные контакты могут отличаться от контактов, образующихся при сворачивании полноразмерного полипептида из денатурированного состояния. Кроме этого, может меняться порядок формирования внутрипептидных контактов. Задачей данной работы было выявить возможный вклад котрансляционного сворачивания в скорость формирования нативной структуры белка. Экспериментально это означало впрямую сравнить скорости биосинтетического сворачивания белка в бесклеточной системе трансляции со скоростью ренатурации этого же белка в аналогичных условиях. В качестве модельного белка в этой и нескольких последующих работах была выбрана бактериальная люцифераза. Белок представляет собой ар гетеродимер. р субъединица люциферазы является типичным представителем многих цитоплазматических белков: у нее отсутствуют пре- и про-последовательности. Отсутствуют выраженные взаимодействия с молекулярными шаперонами при оптимальной температуре. Чувствительность ферментативного теста позволяет следить за формированием очень небольших количеств активного гетеродимера в ходе синтеза и в процессе ренатурации. Достаточно важно, что обе субъединицы при сворачивании формируют интермедиаты, а: и р;, компетентные к последующей ассоциации в течение достаточно долгого периода времени при оптимальной температуре 29°С. Синтезировали р субъединицу в бесклеточной системе трансляции из Е, coll при оптимальной температуре в присутствии достаточно высокой концентрации ренатурированной а; субъединицы. Таким образом, появление активного гетеродимера зависит от скорости сворачивания р субъединицы и ее ассоциации с а;. Было показано, что процессы синтеза р субъединицы и появления активного ар гетеродимера протекают со схожей кинетикой, при этом между завершением синтеза полноразмерного полипептида и формированием активного гетеродимера есть лаг в 3-4 минуты (Рис.3А). Это лаг включает не только процессы сворачивания/ассоциации р субъединицы после ее

Время,

освобождения из рибосомы, но и терминацию синтеза и диссоциацию завершенного полипептида из рибосомы. Чтобы лучше оценить скорость образования нативной люциферазы, в ходе трансляции блокировали дальнейший синтез, "замораживая" растущие полипептиды на рибосоме. Любое дальнейшее увеличение ферментативной активности люциферазы должно отражать только процесс сворачивания/ассоциации р субъединицы диссоциировавшей из рибосом к моменту ингибирования синтеза. Полученные результаты показали, что плато активности люциферазы достигалось через 1-2 минуты после наложения блока.

А Б

Время, мин

Рис. 3 А - кинетика синтеза ß субъединицы люциферазы (V) и появления активного фермента (•) при трансляции в системе из Е. coli. Б - кинетика появления активного фермента при ренатурации ß субъединицы в буфере (о) и системе трансляции (•). Эксперименты проводились в присутствии ренатурированной а субъединицы.

Полноразмерная ß субъединица, ассоциированная с рибосомой в стабильном комплексе с мРНК, лишенной стоп кодона, не способна ассоциировать с а субъединицей. Чтобы впрямую сравнить скорость ренатурации ß субъединицы в тех же условиях, полипептид, денатурированный в мочевине, добавляли к буферу или системе трансляции в отсутствие мРНК. Видно, что формирование активной люциферазы начинается после лага, достигая 50% от конечной активности через 912 минут (Рис.ЗБ). Несколько более быстрая скорость ренатурации в системе трансляции может быть следствием действия молекулярных шаперонов.

Было проведено моделирование сворачивания ß субъединицы при синтезе в системе трансляции при допущениях, что котрансляционное сворачивание отсутствует, полипептид начинает сворачиваться только после завершения синтеза и скорость сворачивания аналогична скорости ренатурации в системе трансляции (Рис. 4). Результаты моделирования показывают, что в этом случае лаг между синтезом ß субъединицы и появлением активной люциферазы составлял бы 10 мин вместо наблюдавшихся 3-4, а после блокирования синтеза происходил бы очень

существенный прирост активной люциферазы и плато достигалось бы лишь через время около 17 минут. Результаты моделирования находятся в очевидном контрасте с экспериментальными данными сворачивания р субъединицы в ходе синтеза. Итак, были впрямую сравнены скорости сворачивания (3 субъединицы люциферазы при синтезе в бесклеточной системе трансляции и в ходе ренатурации. Полученные результаты позволили предположить, что полностью развернутые формы полноразмерных полипептидов отсутствуют при биосинтетическом сворачивании в клетках. Вне зависимости от взаимодействий р субъединицы люциферазы в ходе биосинтетического сворачивания, котрансляционное сворачивание полипептида на рибосоме является необходимым условием для быстрого приобретения нативной структуры.

Рис.4 Математическое моделирование сворачивания р субъединицы и образования гетеродимера активной люциферазы. Экспериментальная

кинетика синтеза р субъединицы (V). Модель кинетики формирования люциферазы при допущении, что р субъединица сворачивается со скоростью денатурированной субъединицы в аналогичных условиях (—), модель кинетики формирования люциферазы после блока синтеза при том же допущении (- -).

Р субъединицы люциферазы при биосинтетическом процессе. Его сравнение с путем сворачивания из денатурированного состояния.

Экспериментальной задачей данной работы было установление биосинтетического пути сворачивания р субъединицы люциферазы в нативный гетеродимер и его сравнение с путем ренатурации денатурированной р субъединицы. Процесс ренатурации р субъединицы может быть разбит на два основных этапа: сворачивание индивидуальной субъединицы и ассоциация с а субъединицей (г1е§1ег ею1,1993). В первую очередь, был проведен анализ скорость-лимитирующей стадии при биосинтетическом сворачивании субъединицы в активный гетеродимер. Для этого проводили эксперименты по кинетике образования люциферазы в бесклеточной системе трансляции из Е. сой, аналогичные представленным выше. Вначале р субъединица должна принять конформацию, способную к ассоциации, и затем реагировать с а субъединицей. Более медленный из этих процессов определяет скорость образования гетеродимера. Моделирование проводилось, основываясь на экспериментально наблюдавшихся скоростях образования люциферазы в бесклеточной системе и допущении, что р субъединица начинает ассоциировать с а субъединицей после диссоциации из рибосомы. В ходе моделирования каждый из двух этапов делался скорость-

ю го зо

Время, мин

Глава 5. Путь сворачивания

лимитирующим. Когда скорость-лимитирующим этапом была изомеризация, освобожд. —> р , и скорость ассоциации лимитировалась диффузией, моделирование наилучшим образом совпадало с экспериментальными данными при константе изомеризации 0.012 в"1. При моментальной скорости изомеризации, лучшее совпадение с результатами получалось при скорости ассоциации а+ р —> ар, соответствующей 5х104 М'У.

Была охарактеризована скорость-лимитирующая стадия ренатурации в аналогичных условиях. Ренатурация является достаточно медленным процессом, который протекает с одинаковой скоростью вне зависимости от того, начинается ли она с денатурированной р субъединицы или свернутым интермедиатом р^ Это демонстрирует, что в указанных условиях скорость-лимитирующая стадия находится на поздних стадиях процесса сворачивания. Кажущаяся константа ассоциации для ренатурации составляет 0.7х104 М"V, что существенно ниже аналогичного показателя для биосинтетического процесса, определенного выше. Моделирование кинетики биосинтетического сворачивания р субъединицы, основываясь на константе ассоциации, определенной для ренатурации, показало, что в этом случае процесс протекал бы существенно более медленно. Ассоциация аир субъединиц требует многочисленных и специфичных белок-белковых взаимодействий на их взаимодействующих поверхностях. Соответственно, было допущено, что механизм ассоциации субъединиц является одинаковым для биосинтетического сворачивания и ренатурации, иными словами, интермедиат р , реагирующий с а субъединицей, является общим для обоих процессов. В таком случае скорость реакции ассоциации будет определяться распределением Р субъединицы между Р; и Р , р,«->р , где Р, является более стабильной формой и, следовательно, доминирует, а Р - менее стабильная минорная форма. В соответствии с этой моделью р , которая появляется при диссоциации с рибосомы или вскоре после этого, имеет две возможности: или быстро ассоциировать с а субъединицей, или изомеризоваться в Р; форму. Модель позволяет сделать экспериментальные предсказания. Если вести трансляцию р субъединицы в отсутствие а субъединицы, чтобы позволить р субъединице находиться в течение определенного времени без напарника, и затем добавлять а, то она должна изомеризоваться в Р; и ее скорость ассоциации должна соответствовать наблюдаемому при ренатурации. Предсказание было подтверждено, когда а субъединицу добавляли после завершения и блокирования синтеза р субъединицы. С-концевой сегмент р субъединицы, который освобождается из рибосомы после завершения синтеза и появления полноразмерного полипептида в растворе, является необходимым для ассоциации, хотя и расположен вдалеке от контактирующей поверхности. Мы предположили, что формирование интермедиата р может включать промежуточные взаимодействия С-концевой части со свернутой 14-концевой частью р субъединицы после освобождения полипептида из рибосомы. В этом случае, исходя из предложенной нами модели, если освобождение Р субъединицы в раствор происходит с присутствии а субъединицы, то должна наблюдаться быстрая скорость ассоциации, характерная для р*. Добавление же а субъединицы спустя определенное время после диссоциации р субъединицы из рибосомы должно характеризоваться медленной скоростью ассоциации, типичной

для процесса ренатурации. Эксперимент, в котором синтезированную р субъединицу диссоциировали в раствор пуромицином в присутствии а субъединицы или же добавляли ее потом, подтвердил предсказания, следующие из нашей модели (Рис. 5).

Ключевым моментом в предложенной нами схеме сворачивания р субъединицы является то, что ренатурированный мономер находится в равновесии между доминирующей более стабильной формой р, и меньшей фракцией нестабильного конформера Р . В таком случае при быстром смешении свернутых субъединиц должно наблюдаться две различные кинетические фазы формирования люциферазы: более быстрая "взрывная" фаза с амплитудой, определяемой фракцией р субъединицы в форме р , за которой следует более медленная фаза, определяемая скоростью изомеризации р, в компетентную к ассоциации р*. Если, с другой стороны, реакция ассоциации протекает через р, , которая реагирует с а субъединицей с некоей фиксированной константой, то должна наблюдаться одна линейная фаза ассоциации. Для проверки данного предположения были проведены соответствующие эксперименты с "остановленным потоком" (quench-flow experiments). Суть экспериментов состояла в смешивании предварительно свернутых аир субъединиц для их ассоциации в течение заданного периода времени, после чего дальнейшая ассоциация блокировалась сильным разбавлением при пониженной температуре и немедленно измерялась активность образованной люциферазы. Эксперименты действительно выявили двухфазную кинетику реакции ассоциации (Рис. 6). В зависимости от использовавшихся концентраций Р субъединицы, начальная быстрая фаза заканчивалась в первые 1-2 секунды реакции и начиналась более медленная линейная фаза. Данные наблюдения соответствуют выдвинутой нами модели, но противоречат модели а + Pi —нхр. Мы провели далее анализ полученных результатов, определяя константы протекающих реакций, которые наилучшим образом моделируют полученные экспериментальные данные.

Рис. 5 Кинетика образования люциферазы, когда р субъединица освобождается из рибосом пуромицином в присутствии а субъединицы (•) или в отсутствие, когда а субъединица добавлялась позже (о). (■) - кинетика освобождения Р субъединицы из рибосом пуромицином.

to го зо ад

Bp t> ш.лин

Ренатурнрованная а

^■"►Инкубация ' Измерение ар

Ренат>рнрованная р Остановка

ассоциации

а - 5 мкг/мл, р - 50 мкг/мл а - 5 мкг/мл, В - 25 мкг/мл 20--—- 20,

10 20 30 40 60 0 10 20 30 40 60

Время, сек

Рис. 6 Анализ механизма ассоциации свернутой р субъединицы с а субъединицей методом остановленного потока (яиепсЬ-йош). А - схема эксперимента, Б - Д -эспериментальные результаты (х), сплошная линия представляет наилучшее приближение результатов для р модели.

Были получены следующие значения констант: Р; —>р* 4x10"4 б"1, р* —> р, 0.4 б"1, р* + а —»ар 0.9х107 М"1 б"1. Из приведенных данных видно, что равновесие Р, <->р* сдвинуто резко в сторону р, (соотношение прямой и обратной констант составляет 10"3), как мы и предполагали изначально. Реальная константа ассоциации больше чем на три порядка превышает кажущуюся константу ассоциации.

Данные, полученные для биосинтетического процесса сворачивания р субъединицы и ее ренатурации, позволяют оценить взаимоотношение между двумя процессами (Рис. 7). Биосинтетическое сворачивание и ренатурация р субъединицы сливаются при образовании интермедиата Р , который способен быстро ассоциировать с а. В контексте биосинтетического сворачивания форма р;, образующаяся в отсутствие а, является интермедиатом на альтернативном непродуктивном пути сворачивания. Медленный путь сворачивания, через образование конформера р„ попросту отсутствует. В пути сворачивания при

ренатурации Р, является продуктивным интермедиатом, через который протекает реакция.

биосинтез Р освобожденная из

рибосомы Лимитирующая

К4 (низкая) Лимитирующая стадия

(29°С<Т° <42°С)

[Ри......">] РгСгоЕ (Г >29° С)

(Г<18° С) р2

р, (Г >29° С)

Рис.7 Модель биосинтетического сворачивания и ренатурации р субъединицы люциферазы. Модель предполагает, что быстрое биосинтетическое сворачивание р субъединицы проходит через промежуточный интермедиат р , который способен быстро ассоциировать с а субъединицей. В отсутствие а, Р* изомеризуется в Р; , которая может или вернуться в р (с невысокой скоростью), или необратимо изомеризоваться в неактивные формы р2 или рх. Ренатурация из денатурированного состояния, ри, проходит через р,.

Таким образом, в случае данного белка взаимодействия С-концевого фрагмента определяют появление продуктивного для сворачивания интермедиата. Было предположено, что существуют два варианта взаимодействия С-концевой части с основной частью полипептида. Первый вариант кинетически предпочтителен в условиях биосинтетического сворачивания. Второй вариант является термодинамически более предпочтительным и доминирует в ходе ренатурации.

Глава 6. Котрансляционное сворачивание белков и его физический смысл.

На наиболее фундаментальном уровне понятно, что физические принципы сворачивания белков одинаковы как для процесса ренатурации полноразмерных денатурированных белков, так и для их биосинтетического сворачивания. В то же время, процесс биосинтетического сворачивания "больших" белков не может быть адекватно сведен к ренатурации развернутых полипептидных цепей и понят вне биологического контекста. На основании полученных результатов нами выдвинуты гипотезы относительно некоторых принципов сворачивания белков в клетке.

Векторная природа синтеза и сворачивания растущей полипептидной цепи позволяет избегать непродуктивных взаимодействий, неизбежных при ренатурации полноразмерного полипептида. Отсутствие сворачивания в ходе синтеза приводит к

тому, что сворачивание начинается с развернутого полноразмерного полипептида и схоже с процессом ренату рации денатурированных белков. Такой процесс характеризуется высоким барьером активации, а значит, медленной скоростью сворачивания. Образование промежуточных структур в ходе котрансляционного сворачивания позволяет избегать кинетических ловушек, лимитирующих скорость ренатурации у больших

белков, уменьшает барьер активации и ускоряет процесс сворачивания (Рис. 8). Мы предполагаем также, что некоторые сегменты белков могут определять котрансляционный путь сворачивания, играя роль, схожую с ролью про-последовательностей в полипетидах, которые необходимы для сворачивания в Вативную структуру.

В течение последних лет развивается новое представление о сворачивании как процессе, проходящем в конформационном пространстве, доступном данному полипептиду (ОписЫс ег а/, 1995). Сворачивание в таком случае можно представить как "скольжение" полипептида вниз по поверхности воронки, которая представляет

Рис. 8 Диаграмма модели быстрого биосинтетического сворачивания белка в контексте его медленной ренатурации. Биосинтетическое сворачивание проходит через ряд промежуточных интермедиатов (1ь 12, 13) и избегает кинетических ловушек, таких как М;. В отсутствие котрансляционного сворачивания (Гь Г3, Г3), синтезированный полипептид начинает сворачивание из полностью развернутого состояния Мщ и проходит через медленно сворачивающийся интермедиат М, сходно с реакцией ренатурации. Скорость обоих процессов лимитируется барьером активации. Полипептид, освобожденный из рибосомы М , близок к переходному состоянию ТЭ и, следовательно, быстро приобретает нативную конформацию Мп, в отличие от сворачивания Ми через М; с высоким барьером активации.

собой энергетический ландшафт данной белковой цепи. Каждый уровень поверхности соответствует определенной конформационной энергии полипептида. Нативной структуре соответствует состояние с глобальным энергетическим минимумом.

п.

и х

л в; к Я X о

2 о. о

■е*

Биосинтез без сворачивания

Котрансляциониое сворачивание

Координата реакции

Рис. 9 Схема котрансляционного сворачивания белков с использованием концепции энергетических ландшафтов сворачивания. Воронка слева представляет биосинтез в отсутствие сворачивания (энергии растущих пептидов отражены стрелками), в этом случае сворачивание начинается с появлением полноразмерного полипептида с высокой конформационной энергией М„ и идет, как отражено стрелками в воронке справа. Котрансляциониое сворачивание представлено серией тоннелей, в которых, через промежуточные интермедиаты растущих пептидов, полноразмерный полипептид появляется в форме М' с существенно меньшей конформационной энергией и быстрее и с большей эффективностью достигает нативного состояния М„. Модель является упрощением, т.к. растущие пептиды при каждом шаге синтеза формируют свои собственные энергетические ландшафты; тоннелями представлены наиболее населенные энергетические уровни сворачивающихся растущих пептидов.

Этот подход был адаптирован нами для представления процессов котрансляционного сворачивания (Рис. 9). Процессы биосинтеза и сворачивания соответствуют движению слева направо. Энергетическая поверхность слева представляет собой гипотетический случай в отсутствие сворачивания растущего полипептида. По мере роста синтезируемого полипептида на рибосоме общее количество его доступных конформаций возрастает (воронка расширяется) и, в

отсутствие сворачивания, поверхность воронки стремится вверх к более высоким энергиям. Энергетическая поверхность справа отражает нековалентные взаимодействия в ходе сворачивания полностью синтезированного, но не свернутого полипептида. Пути сворачивания указаны стрелками. Котрансляционное сворачивание представлено как тоннельный процесс, в котором растущий полипептид сворачивается по мере синтеза через серию промежуточных интермедиатов, таким образом сохраняя более низкую энергию, чем в случае синтеза без сворачивания. Когда появляется синтезируемый пептид, достаточный для начала процесса сворачивания, процесс синтеза и сворачивания полипептида покидает левую воронку и к моменту завершения синтеза переходит в правую в виде интермедиата М*. Данный интермедиат может быстро доходить до минимума конформационной энергии, т.е. приобретать нативную структуру. Данное представление котрансляционного сворачивания также явно демонстрирует, что при этом удается избегать высокого барьера активации процесса и кинетических ловушек при сворачивании денатурированного белка (представляют собой локальные провалы энергии на пути сворачивания, из которых трудно выбраться).

II. Биосинтетическое сворачивание белков и молекулярные

шапероны.

В начале 1960 годов был описан феномен теплового шока и показана его универсальная природа. Суть явления состоит в репрессии общего синтеза белка при повышении температуры у организма (или клеток) выше физиологической, называемой температурой теплового шока. При этом в клетках начинает вырабатываться ограниченный набор белков, названных белками теплового шока. В течение достаточно продолжительного времени стало ясно, что эти белки помогают справиться с появлением в клетке больших количеств денатурированных белков вследствие повышения температуры и других стрессов. Далее было показано, что и при нормальной температуре данные белки, теперь также называемые молекулярными шаперонами или просто шаперонами, участвуют в процессах сворачивания, процессинге, деградации белков, формировании иммунного ответа. Мы изучали роль двух шаперонов Е. coli: GroEL (представитель семейства HSP 60) и DnaK (представитель семейства HSP 70).

Глава 7. Взаимодействие синтезируемых полипептидов с молекулярными шаперонами.

Потенциальное взаимодействие синтезируемых полипептидных цепей, рибосомо-связанных и диссоциированных с рибосомы, изучали на ß субъединице триптофан синтазы, синтезируемой в бесклеточной системе трансляции из Е. coli. Анализ показал, что концентрации основных шаперонов, GroEL и DnaK, составляют соответственно 0.25 и 1 мг/мл в экстракте Е. coli, использовавшемся в системе трансляции. Данные концентрации являются достаточно высокими, чтобы обеспечить взаимодействие со значительной долей вновь синтезированных белков в ходе их сворачивания. Трансляцию проводили, как и в описанных выше работах по

котрансляционному сворачиванию, на мРНК без стоп кодона. Вновь синтезированные полипептидные цепи, диссоциировавшие с рибосомы и рибосомо-связанные, разделяли центрифугированием. Супернатант, содержащий диссоциировавшие полипептидные цепи, подвергали электрофорезу в неденатурирующих условиях и анализировали распределение радиоактивно меченых цепей триптофан синтазы, а также ОгоЕЬ и ОпаК (используя моноклональные антитела к ОгоЕЬ и ОпаК). Было продемонстрировано совпадение распределения цепей триптофан синтазы и этих шаперонов. Таким образом, вновь синтезированные незавершенные полипептиды, освобожденные из рибосомы, были обнаружены в стабильных высокомолекулярных комплексах, содержащих ОгоЕЬ или ОпаК. Чтобы определить, были эти комплексы образованы с пептидами до их диссоциации с рибосом или после этого, анализировали ассоциацию рибосомо-связанных полипептидов с данными шаперонами. Синтезируемые пептиды из рибосомной фракции образовывали комплексы только с ОпаК, но не с ОгоЕЬ. Таким образом, растущие рибосомо-связанные полипептиды могут образовывать комплекс с ОпаК, в то время как диссоциировавшие пептиды могут, в дополнение, реагировать с ОгоЕЬ.

Глава 8. Шаперон СгоЕЬ модулирует кинетику распределения сворачивающихся полипептидных интермедиатов между альтернативными формами белка, максимально увеличивая выход биологически активного белка.

Центральным вопросом в функционировании шаперонов является механизм, благодаря которому доля полипептидов, сворачивающихся по продуктивному пути сворачивания, может быть максимально увеличена, а непродуктивные пути сворачивания сведены к минимуму. Задачей данной работы было изучить механизм действия системы ОгоЕЬ на сворачивание и ассоциацию олигомерного белка. Для этого использовали бактериальную люциферазу. В первую очередь, было установлено распределение субъединиц в различные конечные продукты в зависимости от температуры. При оптимальной температуре 29 С° гетеродимер образуется с выходом 100%. При повышении температуры до 34 С0 выход активного фермента падает, а при 42 С0 активный фермент не образуется вовсе. Падение выхода активного гетеродимера происходит за счет инактивации субъединиц, для р субъединицы этот процесс гораздо более быстрый, чем для а. Константы инактивации для р субъединицы составляют 0.0744 мин"1 и 0.84 мин'1 , для 34 С° и 42 С0. Инактивация не зависит от концентрации субъединиц и отражает формирование альтернативных мономерных форм ах и рх, не способных к ассоциации.

ОгоЕЬ эффективно связывает как а, так и р субъединицу, при 42 С° шаперон полностью защищает связанные субъединицы от термоинактивации (Рис. 10, А, Г). Добавление полной системы, т.е. ОгоЕЬ, ОгоЕЗ и АТФ, к субъединицам поодиночке также приводило к замедлению их термоинактивации (Рис. 10). Для р субъединицы этот эффект выражен более ярко. Как мы показали, система ОгоЕЬ/Е8 не способна обращать инактивацию.

100 ео 60 40

v= 20 в4

я" о

8 100

р<

О)

■§■ 80

| 60

я 40

В 20

>4 О ^ 100 о

80 60 40 20 О

О 10 20 30 40 0 10 20 30 40

Бремя, мин

Рис. 10 Эффект GroEL и полной GroE системы на инактивацию субъединиц люциферазы при повышенных температурах. А и Г - влияние GroEL на инактивацию. Б, В, Д, Е - влияние полной системы GroE на инактивацию.

Так как концентрация свободной р субъединицы существенно падает в присутствие GroEL/ES, то скорость формирования активной люциферазы должна снижаться, поскольку зависит от концентрации. Кроме этого, логично было бы ожидать уменьшения конечного выхода активной оф люциферазы при повышенной температуре. При 34 С0, где сосуществуют два пути сворачивания, в ар гетеродимер и неактивные ос* и рх субъединицы, конечный выход активного гетеродимера, 80%, был выше этого показателя без добавления GroEL/ES (60%), а выход неактивной рх субъединицы, 20%, соответственно ниже (составлял 40% без GroEL/ES) (Рис. 11). Эти результаты очевидным образом не согласуются с

предпосылкой, что сворачивающиеся интермедиа™ ах и рх просто связываются и освобождаются из бгоБЬ без изменения своих параметров ассоциации.

Рис. 11 Эффект полной системы ОгоЕ на формирование люциферазы при повышенных температурах. А - влияние вгоЕ на гетеродимер при различных температурах, Б - влияние на образование рх при 34°С, В и Г - эффект временной инкубации субъединиц в присутствии системы вгоЕ при 42 °С на образование рх и ар. Б-Г - эксперименты в присутствии ОгоЕ (0), в отсутствие вгоЕ (•).

Простейшим объяснением этих результатов является предположение, что Р субъединица, освобожденная из вгоБЬ, отличается от р, и реагирует быстрее с а; при гетеродимеризации. Детальный количественный обсчет полученных результатов подтверждает такой вывод.

В полной системе ОгоЕЬ/ЕЗ субъединицы ведут себя поразному: а субъединица связывается относительно слабо, а р, субъединица обладает высоким сродством к СгоЕЬ. Вероятно, это не простое совпадение, что именно р субъединица, быстро образующая альтернативную мономерную структуру, обладает повышенным сродством к шаперону. Мы видим вовлечение системы СгоЕЬ/ЕБ в распределение р субъединицы между альтернативными путями сворачивания как результат эволюционной адаптации, чтобы максимально увеличить выход биологически

активной гетеродимерной формы люциферазы. Из наших экспериментальных наблюдений следует, что форма (3 субъединицы, освобождаемая из ОгоЕЬ, реагирует с а субъединицей быстрее, чем (5,. Такая форма соответствует по кинетическим свойствам (3* форме. Итак, система ОгоЕЬ/ЕБ, сдвигает равновесие Р;<=>Р*, связываясь с р, и освобождая с определенной вероятностью Р*(см. модель на Рис. 12).

Рис. 12 Схема действия системы ОгоЕ на образование люциферазы при различных температурах. Слева - образование ар гетеродимера при оптимальной температуре, в центре - образование альтернативных продуктов, ар, ах, рх, справа -образование только ах и рх. При существовании альтернативных путей сворачивания ОгоЕ сдвигает равновесие в сторону биологически активного гетеродимера; при температуре, при которой гетеродимер не может образовываться, у ОгоЕ повышается сродство к субъединицам и замедляется образование биологически инертных ах и рх.

Глава 9. Обобщенная схема действия шаперонов.

В нашей модели (Рис. 13) развернутый полипептид (11) и интермедиа™ сворачивания (I, 1мелл) могут быть субстратами для шаперонов. Связывание шаперонов с медленно или непродуктивно сворачивающимися интермедиатами (1Медл) может (частично) разворачивать неправильно сворачивающийся полипептид и возвращать его в форму, предшествующую точке разветвления в процессе сворачивания. Это дает возможность полипептиду заново пройти процесс сворачивания. Хорошо известно, что многие сворачивающиеся белки склонны к агрегации, особенно в высоких концентрациях. Связывание сворачивающегося полипептида с шапероном само по себе должно уменьшать скорость агрегации, что было отмечено разными авторами. Наиболее принципиально, наша модель предполагает возможность, что шаперон может освобождать полипептид в форме, которая способна достигнуть нативной структуры быстрее, чем форма, начально связанная шапероном.

Рх

Температура

-Л] TS _„ N

Рнс.13 Обобщенная схема возможных путей действия шаперонов на сворачивание белков, и - развернутый белок, I -интермедиа™ сворачивания, ТБ -переходное состояние белка, N - нативный белок, СН - шаперон.

ICH

Такая форма (I*) неизбежно должна обладать большей энергией, чем изначально связанная форма, т.е. являться интермедиатом с высокой энергией и приближаться к переходному состоянию полипептида. Таким образом, шаперон способен ассистировать сворачивающемуся полипептиду в преодолении барьера энергии, который определяет скорость-лимитирующую стадию процесса сворачивания. Наша модель предлагает альтернативное объяснение влияния шаперонов на кинетику сворачивания других белков, может объяснять наблюдавшееся увеличение скорости сворачивания для некоторых олигомерных белков в присутствии GroEL/ES, дает экспериментальные предсказания эффектов шаперонов на сворачивание белков для ее дальнейшей проверки и тестирования.

Глава 10. Быстрый и медленный пути биосинтетического сворачивания ß субъединицы бактериальной люциферазы.

ß субъединица бактериальной люциферазы быстро сворачивается в бактериальной бесклеточной системе из Е. coli, т.е. в близком к природному клеточном окружении. Экспериментальной задачей данной работы было изучение биосинтетического сворачивания ß субъединицы люциферазы в эволюционно отдаленном клеточном окружении. Для этого использовали эукариотическую систему трансляции из ретикулоцитов кролика. При трансляции ß субъединицы в бесклеточной системе экспрессии из ретикулоцитов кролика (в присутствии а субъединицы) наблюдается существенная задержка, около 20 минут, между синтезом полипептида и формированием активной люциферазы. После блокирования белкового синтеза в системе трансляции наблюдался дальнейший существенный рост активной люциферазы, который выходил на плато только примерно через 20 минут после остановки трансляции. Таким образом, в эукариотической системе экспрессии для ß субъединицы люциферазы характерно медленное сворачивание, в очевидном контрасте с быстрым сворачиванием в прокариотической системе. Кинетика сворачивания в эукариотической системе экспрессии сходна с кинетикой ренатурации данного полипептида. Мы предположили, что задержка вызывается взаимодействием полипептида с шаперонами в ходе синтеза или после освобождения из рибосомы. Для проверки

данного предположения р субъединицу транслировали, добавив в систему трансляции избыток необратимо денатурированного овальбумина, который хорошо связывается с шаперонами и должен вытеснять другие субстраты из комплексов с ними. Действительно, задержка между синтезом полипептида и формированием гетеродимера драматически сократилась и составила 2-3 минуты, характерные для сворачивания в бактериальной системе трансляции. С использованием антител к НБР70 было показано, что вновь синтезированная (3 субъединица в экстракте из ретикулоцитов кролика способна связываться с этим шапероном.

Взаимодействие денатурированной р субъединицы с НБР70 не сказывается на скорости сворачивания полипептида и ассоциации в активный гетеродимер, как свидетельствуют эксперименты по ренатурации в экстракте из ретикулоцитов кролика, в том числе в присутствие денатурированного овальбумина. Таким образом, связывание Н8Р70 с р субъединицей именно в процессе ее синтеза является ответственным за существенную задержку сворачивания. Как мы предполагаем, это непродуктивное взаимодействие приводит конформационным изменениям р , переводящим ее в р, форму.

медленно

аР

Рис. 14 Сравнительная схема биосинтетического сворачивания р субъединицы люциферазы в эукариотической системе трансляции в присутствии HSP70 и в прокариотической системе. Взаимодействие синтезируемых полипептидов р субъединицы с HSP70 приводит к тому, что из рибосомы полипептид освобождается в форме Pi, которая для ассоциации с а субъединицей должна медленно изомеризоваться в компетентную к ассоциации ß* форму, что определяет медленную скорость реакции. В прокариотической системе трансляции такое непродуктивное взаимодействие отсутствует, что определяет быструю скорость образования гетеродимера люциферазы.

Трансляция в системе из Е. coli с фракцией растворимых белков экстракта ретикулоцитов кролика характеризуется длительным лагом в формировании люциферазы. Можно сделать вывод, что эукариотические шапероны (HSP70) способны и в бактериальной системе взаимодействовать с синтезируемой р субъединицей, способствуя образованию ß, формы из р. Таким образом, в эукариотической системе экспрессии непродуктивное взаимодействие синтезируемого полипептида с одним из шаперонов приводит к его сворачиванию

по медленному пути, в то время как сворачивание в бактериальном окружении осуществляется по быстрому пути. Быстрый путь сворачивания и в прокариотической системе трансляции и в эукариотической (при блокировании шаперонов избытком денатурированного белка) характеризуются сходными кинетическими параметрами. Таким образом, быстрый путь сворачивания исследуемого полипептида фундаментально зависит от его котрансляционного этапа сворачивания и не может быть воспроизведен вне синтеза на рибосоме.

Глава 11. Адаптация процесса биосинтетического сворачивания белков в заданном окружении в клетках. Гипотеза.

Мы предполагаем, что процесс сворачивания белков адаптирован к их естественному клеточному окружению, т.е. наличию других белков, факторов, и т.д. Это касается и соответствующих шаперонов и ферментов, участвующих в процессе сворачивания. Процесс адаптации носит взаимный характер. Экспрессия гетерологичного белка в ином клеточном окружении может приводить к изменению эволюционно селектированного пути сворачивания. Это может приводить к изменениям в существующем пути сворачивания (например, кинетики процесса), возникновению других путей сворачивания, что может проявляться в изменении скорости и процента выхода свернутого белка, изменении соотношения между альтернативными состояниями (например, появление агрегатов вновь синтезированного белка). Очевидными примерами является образование телец включения (т.е. агрегированной формы белка) при экспрессии белков как в бактериальных, так и эукариотических клетках.

Необходимо отдельно сказать в этом контексте о шаперонах. Конечно, большинство шаперонов узнают различные белков, часто структурно весьма различные. Тем не менее, такая "неизбирательность" является продуктом эволюционной селекции в контексте всего разнообразия белков в данной клетке (или, более точно, в данном компартменте клетки).

III. Структурно-функциональный анализ белков.

Достаточно часто традиционно применяемые подходы к структурно-функциональному анализу белков оказываются малопродуктивными или неприменимыми. Это может происходить в случае белков, которые трудно или невозможно получить экспрессией в клетках, например, в силу их токсичности или из-за протеолитической деградации. Многие белки при экспрессии in vivo агрегируют, образуя тельца включения. Альтернативой является синтез белков в бесклеточных системах трансляции с их последующим анализом. Возможность получения радиоактивно меченых синтезированных полипептидов in vitro позволяет проводить анализ их чрезвычайно малых количеств. Подходы, созданные или адаптирование для радиоактивно меченых полипептидов в рамках представляемой работы, являются приложимыми к широкому кругу задач.

Глава 12. Локализация антигенных детерминант с использованием растущих полипептидов на рибосомах.

Подходы, используемые для локализации эпитопов антител на белках, включают в себя гидролиз белков с идентификацией полученных пептидов, получение библиотек фрагментов кДНК, использование дисплея фрагментов белка на фагах. Каждый из указанных подходов имеет свои ограничения. При экспрессии полипептидов в системе сопряженной транскрипции-трансляции синтез приводит к появлению дискретного набора Ы-концевых растущих пептидов увеличивающихся размеров. Простые и быстрые эксперименты позволяют определить размер наименьшего пептида, узнаваемого определенным антителом в ходе иммунопреципитации аликвоты системы экспрессии и, таким образом, определить С-концевую границу эпитопа.

Были определены С-концевые границы эпитопов для восьми антител, распределенные вдоль всей полипептидной цепи (5 субъединицы триптофан синтазы. Чтобы оценить надежность полученных результатов, эти же эпитопы были локализованы скринингом библиотеки фрагментов кДНК соответствующего гена. Кроме этого, для трех антител результаты были сравнены с результатами локализации эпитопов, полученными при химическом и протеолитическом гидролизе данного белка. Все полученные результаты хорошо согласуются между собой.

Глава 13. Измерение истинной константы связывания полипептидов с моноклональными антителами и лигандами.

Моноклональные антитела являются одним из наиболее используемых реагентов для изучения и характеристики полипептидов. Определение афинности взаимодействия антитела с соответствующим антигеном является необходимым во многих случаях. Для этого существует целый ряд методов, которые все имеют недостатки и ограничения. Как правило, требуются высокоочищенные антитело и антиген в достаточно больших количествах, часто чувствительность является недостаточной, измерения на твердой фазе могут приводить к искажению измеряемых параметров и определению "кажущегося сродства". Мы разработали новый высокочувствительный метод измерения сродства моноклональных антител (и лигандов) к антигенам.

Подход может использоваться для измерения подлинной равновесной константы связывания пары антиген-антитело в случаях, когда антиген доступен в чрезвычайно малых количествах в неочищенном виде и является радиоактивно меченым. Метод включает в себя инкубацию постоянной аликвоты антигена с различными известными концентрациями моноклонального антитела в большом избытке по отношению к антигену. После инкубации, когда достигнуто равновесие между свободным антигеном и его комплексом с антителом, концентрация свободного антигена определяется иммуноадсорбцией с тем же самым антителом, иммобилизованном на носитель (смолу). Действительно, только свободный антиген будет специфически связываться с иммобилизованным антителом. Затем определяется пропорция иммуноадсорбированного антигена по его радиоактивности, которая пропорциональна концентрации свободного антигена в

равновесии. Полученные результаты, с учетом известных концентраций антитела, позволяют определить равновесную константу связывания.

Рис 15. Измерение сродства моноклонального антитела тАЫ9 к 11.5 кДа N-концевому фрагменту ß субъединицы триптофан синтазы, связанному с рибосомой. Аликвоты системы трансляции с мРНК со стоп кодоном инкубировали с шАЫ9 в различных концентрация);. Свободный, т.е. не связавшийся с антителом 11.5 кДа фрагмент, адсорбировали на смоле со связанным тАЫ9, подвергали электрофорезу, его количество определяли по радиоактивности на ß имеджере. А - включение радиоактивности в гели, в слоты a-h добавляли соответственно О, 6x10"10, 2х 1 , 6х 10"9 , 2хIО'8 , 6x10"!, 2x10"7, 10 M антитела, слот j - контроль неспецифической адсорбции. Б - подсчет радиоактивности в (1.5 кДа фрагменте по слотам из соответствующего геля, В - график определения афинности антитела к 11.5 кДа фрагменту, 1/Y — обратное значение фракции фрагмента, связанного с тАЫ9, при использовавшихся концентрациях антитела, против обратного значения концентраций антитела, 1/[АВ]. Сплошная линия показывает наилучшее приближение экспериментальных данных методом линейной регрессии и дает значение равновесной константы диссоциации 1.62 пМ.

Метод был апробирован с использованием 11.5 кДа N-концевого фрагмента ß субъединицы триптофан синтазы, в комплексе с рибосомой и свободном виде, и моноклонального антитела тАЫ 9. В качестве контроля, фрагмент, состоящий из первых 102 аминокислот белка, был экспрессирован в Е. coli, очищен и его сродство к антителу измерено общепринятым иммуноферментным анализом, которое составляло 6x108 M"1 +/-lxl(f M". Сродство фрагмента к антителу тАЫ9 было определено предложенным нами подходом (на рис. 15 представлен результат для свободного фрагмента в растворе). Константа связывания составляла те же 6x108 М"1 +/-2xl 0S M"1. Таким образом, данные, полученные двумя независимыми методами, отлично согласуются друг с другом. Этот же фрагмент, полученный в форме комплекса растущего пептида с рибосомой, также дал близкое значение равновесной константы связывания предлагаемым нами методом. 7x10й M"' +/-lx 103 M"1 . Предложенный подход может быть использован для определения равновесной константы взаимодействия между любой макромолекулой и радиоактивно меченым

специфическим лигандом, в том числе для белок-белковых взаимодействий и взаимодействий между белками и нуклеиновыми кислотами.

Глава 14. Изучение структуры альбебетина, белка с заданной пространственной структурой.

Наиболее сильным тестом нашего понимания принципов структурной организации белков и их сворачивания является дизайн и синтез de novo (т.е. искусственных) полипептидов с определенными пространственными структурами. Целью описываемого проекта был дизайн полипептида, пространственная укладка которого не нарушала бы известные структурные правила, но не встречалась бы в природных белках. Пространственная структура создаваемого белка основывалась на разработанной О. Б. Птицыным и А. В. Финкельштейном теории пространственной н вторичной структуры белков (Finkelstein & Ptitsyn, 1987), Структура должна была представлять собой (3 слой из четырех антипараллельных р структур, прикрытый с одной из сторон двумя а спиралями (Рис. 16). Любопытно, что впоследствии похожая структура была обнаружена в природных белках (Lindahl etai, 1994).

Рис. 16 Предполагаемая структура альбебетина. Стрелками указаны тандемы ■ V/ \\ аргининов.

т / .v£-J \ X/ \ \ N

Предложенная структура представляет собой "открытый сэндвич" и состоит из дважды повторенной структурной единицы арр, в связи с чем данный белок был назван альбебетином. Полипептидная цепь из 73 аминокислотных остатков построена из двух практически идентичных половин. Начальному анализу была подвергнута и половина альбебетина, т.е предполагаемая структурная единица арр. Гены альбебетина и его половины были химически синтезированы. Радиоактивно меченый полипептид синтезировали в бесклеточной системе из зародышей пшеницы. Компактность альбебетина и его половины характеризовали хроматографически - гель-фильтрацией.

Рис. 17 Изучение структуры альбебетина электрофорезом с горизонтальным градиентом мочевины (А) и трйпсинолизом в нативных условиях (Б). Слева в Б указано положение образующихся протеолитическях фрагментов.

Подвижность альбебетина и его половины при хроматографии в нативных условиях соответствовала плотно упакованным природным белкам соответствующих молекулярных масс, а гидродинамические радиусы Стокса составляли для альбебетина и его половины 17Ä и 1IÄ. Хроматография в присутствии 9М мочевины показала увеличение радиусов Стокса до 24Ä и 16.5Ä, т.е. разворачивание полипетидов.

Стабильность структуры белка и ее кооперативность при денатурации (или ренатурации при восстановлении структуры) может быть исследована электрофорезом с горизонтальным градиентом мочевины, перпендикулярным к направлению электрофореза (Creighton, 1979). Смысл метода состоит в том, что электрофоретическая подвижность белка в нативных условиях является существенно большей (т.к. белок компактен), чем в денатуранте, где белок разворачивается и его подвижность резко падает. Электрофоретическая подвижность альбебетина показывает переход между быстро мигрирующей свернутой формой и более медленно мигрирующей развернутой формой, с началом разворачивания полипептида при 3 М мочевины и точкой полуперехода около 5.5 М мочевины (Рис. 17А). Это подтверждает, что у альбебетина в отсутствие мочевины существует компактная структура.

Наличие стабильной компактной структуры было исследовано также ограниченным трипсинолизом, В полипептидную цепь альбебетина были включены два аргининовых тандема, Apr 14-Арг15 и Арг49-Арг50. Сравнительный протеолиз в нативных условиях и 4M мочевины показал, что полипептид существенно устойчивее к трипсинолизу в нативных условиях. Была исследована кинетика трипсинолиза (Рис. 17Б) и показано, что тандем Apr 14-Арг15 существенно

стабильнее к протеолизу, чем тандем Арг49-Арг50. Так как последовательности непосредственно вокруг аргининовых тандемов идентичны, такая разница может быть вызвана только дальними взаимодействиями в компактной структуре. Таким образом, дизайн привел к созданию полипептида с достаточно стабильной и кооперативной структурой.

Глава 15. Структурно-функциональный анализ белка оболочки вируса гепатита С.

Гликопротеин оболочки Е2 вируса гепатита С (ВГС) играет важнейшую роль в морфогенезе вируса и считается кандидатом для разработки вакцины против ВГС. О его структуре и функциях известно очень мало. Одним из главных препятствий в изучении белка являются трудности получения гомогенных растворимых форм, пригодных для структурно-функционального анализа. Нами были разработаны методы получения с высоким выходом рекомбинантных форм Е2, пригодных для структурно-функционального анализа: иммобилизованной, растворимой (мета)стабильной и связанной с рибосомой. Е2 в этом случае находится в негликозилированной форме. Было показано, что полученные формы Е2 являются функциональными, в том числе взаимодействуют с рецептором для Е2 на поверхности клеток человека, С081. Иммобилизованный Е2 взаимодействует с набором моноклональных антител, полученных к нативному гликозилированному белку, в том числе к конформационно-зависимому антителу, взаимодействие с которым принято считать характеристикой нативности белка. Используя ограниченный протеолиз иммобилизованного мономера Е2, была выявлена доменная организация белка (см. Рис. 18). Кинетика появления протеолитических фрагментов позволила сделать предположение о междоменных взаимодействиях и структурных перестройках полипептидной цепи.

CD81

385 410 455 563 606 649 746

Структурный Структурный Трансмембранный

Гипер- домен 1 Структурный домен 3 домен

вариабельный домен 2 Структурный

домен домен 4

Рис. 18 Доменная организация Е2 по данным ограниченного протеолиза. Стрелками отмечены домены и галочками - экспонированные аминокислоты, принимающие участие в образовании комплекса с CD81. Номерами указаны аминокислоты, формирующие границы доменов.

Глава 16. Возможность создания субъединичной противотуберкулезной вакцины на основе молекулярного шаперона HSP 70 М. tuberculosis.

Туберкулез - болезнь, являющаяся одной из самых актуальных проблем мирового здравоохранения, ежегодно уносит жизни более 1 млн. человек. Протективный уровень вакцины БЦЖ против легочного туберкулеза значительно варьирует, необходимо создание противотуберкулезной вакцины нового поколения. Белки теплового шока М. tuberculosis, включая HSP70, являются ключевым фактором, определяющим стимуляцию иммунитета. Полиоксидоний -

иммуномодулятор, используемый в медицинской практике, является сополимером N-окиси 1,4-этиленпиперазина и N -карбоксиэтил-1,4-этиленпиперазиний бромида с молекулярной массой 100 Кд, относящийся к классу водорастворимых производных гетероцепных алифатических полиаминов. Было показано, что шаперон HSP70 М. tuberculosis индуцирует сильный гуморальный и клеточный иммунный ответ у мышей. Конъюгация с полиоксидонием приводит к значительному увеличению антигенности HSP70. Клеточный иммунитет является самым важным компонентом ответа иммунной системы на туберкулезную инфекцию. Была показана индуцированная рекомбинантным белком HSP70 и его конъюгатом пролиферация Т-лимфоцитов, установлено соотношение CD4+ и СБ8+лимфоцитов. В настоящее время изучается протективный эффект конъюгата на модели острого туберкулеза у мышей.

ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ И ВЫВОДЫ.

1. Показано с использованием конформационно-зависимого антитела, что ß субъединица триптофан синтазы Е. coli начинает сворачиваться во время синтеза на рибосоме. Процесс сворачивания начинается до завершения синтеза N-концевого домена белка. Образующаяся структура рибосомо-связанного полипептида близка к структуре нативного белка.

Сделан вывод, что котрансляционное сворачивание полипептидов может начинаться по мере их синтеза, задолго до завершения синтеза соответствующего домена.

2. Изучен процесс биосинтетического сворачивания ß субъединицы бактериальной люциферазы. Показано, в прямом сравнении с ренатурацией денатурированной ß субъединицы, что котрансляционное сворачивание вносит вклад в кинетику формирования активной люциферазы.

Таким образом, доказано, что котрансляционное сворачивание полипептидов является фактором, который обеспечивает быстрое сворачивание в клетках.

3. Изучен и охарактеризован путь биосинтетического сворачивания ß субъединицы бактериальной люциферазы. Показано, что синтезированный полипептид освобождается из рибосомы в энергетически нестабильной форме ß , которая способна очень быстро ассоциировать с а субъединицей. Этот интермедиат находится в равновесии с более стабильной, но инертной формой ßi. В отсутствие а субъединицы, большая часть ß субъединицы переходит в форму ßi.

Показано, что процесс ренатурации денатурированной р субъединицы проходит через указанный энергетически стабильный конформер (3;. Именно равновесие Р; <=> Р* определяет медленную скорость формирования нативного фермента при ренатурации.

Таким образом, впервые охарактеризован путь биосинтетического сворачивания полипептида, определена его скорость-лимитирующая стадия и показано различие между биосинтетическим путем сворачивания и его ренатурацией.

4. Сформулирована гипотеза, что котрансляционное сворачивание может приводить к появлению синтезированных полипептидов в форме интермедиатов с высокой энергией, которые близки по структуре и энергии к переходному состоянию и, значит, способны быстро формировать уникальные нативные структуры.

5. Изучено участие молекулярных шаперонов в процессе синтеза и котрансляционного сворачивания полипептидов.

Показано, что синтезируемые в бактериальной системе трансляции рибосомо-связанные полипептиды р субъединицы триптофан синтазы Е. соИ могут ассоциировать с ЭпаК, членом семейства белков теплового шока Н8Р70, но не с вгоБЬ, представителем семейства НБРбО.

6. Изучено влияние системы вгоЕЬ на сворачивание олигомерного белка на примере бактериальной люциферазы. Показано, что при повышении температуры возрастает сродство системы ОгоЕЬ к Р субъединице и она защищает полипептид от термоинактивации. Показано, что СгоЕЬ/ЕБ ускоряет сворачивание Р субъединицы в активную люциферазу и минимизирует альтернативный непродуктивный путь сворачивания.

7. Высказана гипотеза, что молекулярные шапероны могут ускорять сворачивание полипептидов, понижая энергетический барьер реакции сворачивания. При этом понижение энергетического барьера обеспечивается сдвигом равновесия от стабильных интермедиатов, имеющих высокий барьер, до переходного состояния, к кинетически нестабильным интермедиатам с высокой энергией, имеющих меньшую разницу энергии до переходного состояния.

8. Показано, что при синтезе в гетерологичной эукариотической системе трансляции из ретикулоцитов кролика р субъединица бактериальной люциферазы сворачивается по медленному пути сворачивания, характерному для процесса ренатурации денатурованного полипептида. Показано, что за перевод с быстрого пути сворачивания на медленный отвечает непродуктивное взаимодействие синтезируемого полипептида с эукариотическими шаперонами, включая Н8Р70.

9. Высказана гипотеза об адаптации сворачивания белков в своем клеточном окружении.

10. Разработаны подходы для структурно-функционального и иммунологического анализа полипептидов в количестве нанограммов в бесклеточных системах экспрессии. Данные подходы могут применяться для быстрого анализа полипептидов, экспрессия которых в клетках затруднена (из-за токсичности, нестабильности к протеолизу и т.д.)

11. Изучен альбебетин, искусственный белок с заданной пространственной структурой. Проведен структурный анализ альбебетина на основе разработанных подходов к анализу белков в бесклеточных системах экспрессии. Показано, что белок обладает стабильной структурой, совпадающей в основных элементах с заданной пространственной структурой

12. Начато изучение структурного белка оболочки Е2 вируса гепатита С. Получены формы рекомбинантного белка Е2, пригодные для его структурно-функционального анализа и показано, что они являются функциональными. Проведен структурно-функциональный анализ Е2, показано, что эктодомен белка состоит из четырех структурных доменов.

13. Изучена возможность создания рекомбинантной противотуберкулезной вакцины на основе молекулярного шаперона HSP 70 М. tuberculosis и иммуномодулятора полиоксидония. Показано, что конъюгация HSP 70 с полиоксидонием резко усиливает гуморальный и клеточный иммунный ответ.

Основные результаты диссертации опубликованы в работах:

1. Долгих Д. А., Федоров А. Н., Чемериз В. В., Чернов Б. К., Финкельштейн А. В., Шульга А. А., Алахов Ю. Б., Кирпичников М. П. и Птицын О. Б. Синтез и изучение альбебетина- белка с заданной пространственной структурой. Доклады Академии Наук СССР (1991), 320(5): 1266-9.

2. Fedorov AN, Dolgikh DA, Chemeris VV, Chernov BK, Finkelstein AV, Schulga AA, Alakhov YuB, Kirpichnikov MP, Ptitsyn OB. De novo design, synthesis and study of albebetin, a polypeptide with a predetermined three-dimensional structure. Probing the structure at the nanogram level. JMol Biol. П992). 225(4):927-31.

3. Долгих Д. А., Кирпичников M. П., Птицын О. Б., Федоров А. Н., Финкельштейн А. В. и Чемериз В. В. De novo белки с заданной пространственной структурой: новые подходы к дизайну и анализу. Молекулярная биология (1992), 26(6): 1242-50.

4. Fedorov AN, Friguet В, Djavadi-Ohaniance L, Alakhov YB, Goldberg ME. Folding on the ribosome of Escherichia coli tryptophan synthase beta subunit nascent chains probed with a conformation-dependent monoclonal antibody. J Mol Biol. (1992), 228(2):351-8.

5. Friguet B, Fedorov AN, Djavadi-Ohaniance L. In vitro gene expression for the localization of antigenic determinants: application to the E. coli tryptophan synthase beta 2 subunit.

J Immunol Methods. (1993). 158(2):243-9.

6. Friguet В, Fedorov AN, Serganov AA, Navon A, Goldberg ME. A radioimmunoassay-based method for measuring the true affinity of a monoclonal antibody with trace amounts of radioactive antigen. Analvt. Biochem. (1993), 210: 344-50.

7. Chemeris VV, Dolgikh DA, Fedorov AN, Finkelstein AV, Kirpichnikov MP, Uversky VN, Ptitsyn OB.A new approach to artificial and modified proteins: theory-based design, synthesis in a cell-free system and fast testing of structural properties by radiolabels. Protein Engineering (1994), 7(8):1041-52.

8. Fedorov AN, Baldwin TO. Contribution of cotranslational folding to the rate of formation of native protein structure. Proc Natl Acad Sci USA. (1995). 92(4): 1227-31.

9. Tokatlidis K, Friguet B, Deville-Bonne D, Baleux F, Fedorov AN, Navon A, Djavadi-Ohaniance L, Goldberg ME. Nascent chains: folding and chaperone interaction during elongation on ribosomes. Philos Trans R Soc bond В Biol Sci. (1995), 348(1323):89-95.

10. Dolgikh DA, Uversky VN, Gabrielian AE, Chemeris VV, Fedorov AN, Navolotskaya EV, Zav'yalov VP, Kirpichnikov MP. The de novo protein with grafted biological function: transferring of interferon blast-transforming activity to albebetin. Protein Engineering (1996). 9(2):195-201.

11. Fedorov AN, Baldwin TO. GroE modulates kinetic partitioning of folding intermediates between alternative states to maximize the yield of biologically active protein. J Mol Biol. (1997), 268(4):712-23.

12. Fedorov AN, Baldwin TO. Cotranslational protein folding. J Biol Chem. (1997), 272(52):32715-8.

13. Fedorov AN, Baldwin TO. Protein folding and assembly in a cell-free expression system.

Methods Enzvmol. (1998). 290:1-17.

14. Fedorov AN, Baldwin TO. Process of biosynthetic protein folding determines the rapid formation of native structure. J Mol Biol. (1999), 294(2):579-86.

15. Yurkova MS, Patel AH, Fedorov AN. Characterisation of bacterially expressed structural protein E2 of hepatitis С virus. Prot. Exp. Purif. (2004), 37:119-125.

16. Федоров A.H., Юркова M. С., Гудима Е. А, Тоневицкий А. Г. Создание и характеристика рибосомных комплексов, несущих вновь синтезированный белок Е2 вируса гепатита С. Аллергия, астма и клиническая иммунология (2003), 7:41-44.

17. Юркова М. С., Лауринавичюте Д.К., Федоров А.Н. Экспрессия, выделение и характеристика функционального негликозолированного структурного белка Е2

вируса гепатита С. Вопросы биологической, медицинской и фармацевтической

химии (2006), 4: 32-37.

18. Калюкина A.C., Лауринавичюте Д.К., Юркова М.С., Федоров А.Н., Северин Е.С. Изучение основных физико-химических параметров и влияния на пролиферативную активность Т-лимфоцитов рекомбинантного белка HSP 70 М.tuberculosis. Вопросы биологической, медицинской и фармацевтической химии

(2006), 4: 37-41.

19. Федоров А.Н., Юркова М. С. и Лауринавичюте Д.К. Начальный структурный и функциональный анализ иммобилизованного гесЕ2, белка оболочки вируса гепатита С. Вопросы биологической, медицинской и фармацевтической химии.

(2007), 3: 20-26.

20. Шарапова О. А., Федоров А.Н., Северин Е.С., Медведев С.А., Некрасов A.B. Рекомбинантный белок HSP 70 М. tuberculosis как основа для субъединичной противотуберкулезной вакцины: получение, изучение свойств. Иммунология. (2009), 2: 108-111.

Федоров Алексей Николаевич Биосинтетическое сворачивание белков.

Исследован процесс котрансляционного сворачивания полипептидов. Показано с использованием конформационно-зависимого антитела, что процесс сворачивания полипептида может начинаться до завершения синтеза соответствующего домена белка. Впервые изучен путь биосинтетического сворачивания белка, охарактеризован основной скорость-лимитируюгций интермедиат при сворачивании и кинетика процесса. Показано, что котрансляционное сворачивание вносит вклад в кинетику формирования активного белка. Показана вовлеченность шаперонов в процесс котрансляционного сворачивания полипептидов; продемонстрировано, что эти взаимодействия могут быть ключевыми для определения пути сворачивания полипептида. Показано, на примере GroEL, что шапероны могут максимально повышать путь сворачивания, ведущий к биологически активной структуре белка. Предложен новый подход к структурно-функциональному и иммунологическому анализу белков в нанограммовых количествах - анализ белков, синтезированных в бесклеточных системах экспрессии. Изучен искусственный полипептид альбебетин, белок с заранее заданной пространственной структурой. Проведен начальный структурно-функциональный анализ структурного белка Е2 вируса гепатита С. Изучен конъюгат шаперона HSP70 М. tuberculosis с иммуномодулятором полиоксидонием как основа противотуберкулезной вакцины.

Fedorov Alexey Nikolaevich Biosynthetic protein folding

The process of cotranslational protein folding is investigated. The process of polypeptide folding may start before the completion of synthesis of the corresponding domain of the protein as demonstrated with a conformation-dependent antibody. For the first time, the pathway of biosynthetic protein folding is investigated; the main rate-limiting protein intermediate and kinetics of the process are characterized. It is shown that cotranslational folding contributes to the kinetics of the appearance of the active protein. Involvement of molecular chaperones in the process of cotranslational protein folding is demonstrated; these interactions may be critical for determining pathway of protein folding. It is shown with GroEL that chaperones may maximize productive protein folding leading to the biologically active structure. A new approach to structure-function and immunological analysis of proteins at the nanogram level, based on the analysis of proteins synthesized in cell-free systems, is proposed. Albebetin, de novo polypeptide with a predetermined three-dimensional structure, is investigated. Initial structure-functional analysis of E2, structural protein of hepatitis С virus, is performed. Conjugate of chaperone HSP70 from M. tuberculosis and immuno-modulator polyoxidonium is investigated as a basis of anti-tuberculosis vaccine.

Заказ № 45-а/09/09 Подписано в печать 08.09.2009 Тираж 100 экз. Усл. п.л. 2

ООО "Цифровичок", тел. (495) 649-83-30; (495) 778-22-20 (!} www. cfr. ru ; e-mail:info@cfг. ru

Содержание диссертации, доктора биологических наук, Федоров, Алексей Николаевич

СОДЕРЖАНИЕ.

ВВЕДЕНИЕ.

ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР.

Ренатурация белков.

Котрансляционное сворачивание белков.

Ранние стадии сворачивания белка, происходящие котрансляционно.

Связывание кофакторов и лигандов.

Поздние стадии процесса сворачивания и формирование олигомерных структур.

Ферменты, катализирующие сворачивание.

Роль рибосом в сворачивании.

Неравномерность скорости трансляции и котрансляционное сворачивание

Кинетика и эффективность биосинтетического сворачивания, его моделирование.

Пермутированные белки и котрансляционное сворачивание.

Молекулярные шапероны в котрансляционном сворачивании.

Молекулярные шапероны.

Система Н8Р70.

Система НБРбО (шаперонины).

Шаперонины и иммунная система.

Существует ли эволюционный сдвиг от посттрансляционного сворачивания белков к котрансляционному при переходе от прокариот к эукариотам?. 65 Заболевания, вызываемые или ассоциированные с неправильно свернутыми белками.

Белки оболочки вируса гепатита С.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

Бесклеточные системы экспрессии.

Конструирование плазмиды, генов и их фрагментов.

Р субъединица триптофан-синтазы Е. соИ.

Р субъединица люциферазы.

Центрифугирование бесклеточных систем экспрессии в градиенте концентрации сахарозы.

Выделение рибосомной фракции из бесклеточных систем экспрессии.

Иммуноадсорбция полипептидов из систем экспрессии.

Определение равновесной константы связывания/диссоциации антитела с полипептидом из бесклеточной системы трансляции.

Определение компактности структуры полипептидов методом гельфильтрации

Измерение биолюминесцентной активности.

Методы электрофоретического разделения белков.

Анализ абсолютной радиоактивности, детектируемой на бета-имеджере.

JIAJI тест.

Иммобилизация денатурированного яичного альбумина на агарозе.

Определение иммунологической активности антигенов на мышах.

Животные.

Иммунизация.

Непрямой твердофазный иммуноферментный анализ (ИФА).

Культура клеток.

Проточная цитофлуориметрия.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

Котрансляционное сворачивание белков.

Ранние стадии сворачивания белка, проходящие котрансляционно.

Кинетика котрансляционного сворачивания.

Влияние котрансляционного этапа на кинетику биосинтетического сворачивания белка.

Путь сворачивания Р субъединицы люциферазы при биосинтетическом процессе. Его сравнение с путем сворачивания из денатурированного состояния.

Котрансляционное сворачивание белков и его физический смысл.

Биосинтетическое сворачивание белков и молекулярные шапероны.

Взаимодействие синтезируемых полипептидов с молекулярными шаперонами.

Шаперон GroEL модулирует кинетику распределения сворачивающихся полипептидных интермедиатов между альтернативными формами белка, максимально увеличивая выход биологически активного белка.

Обобщенная схема действия шаперонов.

Быстрый и медленный пути биосинтетического сворачивания ( субъединицы бактериальной люциферазы.

Адаптация процесса биосинтетического сворачивания белков в заданном окружении в клетках. Гипотеза.

Структурно-функциональный анализ синтезированных белков.

Локализация антигенных детерминант с использованием растущих полипептидов на рибосомах.

Измерение истинной константы связывания полипептидов. с моноклональными антителами и лигандами.

Изучение структуры альбебетина, белка с заданной пространственной структурой.

Структурно-функциональный анализ белков оболочки вируса гепатита С

Возможность создания субъединичной противотуберкулезной вакцины на основе молекулярного шаперона HSP 70 М. Tuberculosis.

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Федоров, Алексей Николаевич

ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ И ВЫВОДЫ

1. Показано с использованием конформационно-зависимого антитела, что ß субъединица триптофан-синтазы Е. coli начинает сворачиваться во время синтеза на рибосоме. Процесс сворачивания начинается до завершения синтеза N-концевого домена белка. Образующаяся структура рибосомо-связанного полипептида близка к структуре нативного белка.

3. Изучен и охарактеризован путь биосинтетического сворачивания ß субъединицы бактериальной люциферазы. Показано, что синтезированный полипептид освобождается из рибосомы в энергетически нестабильной форме * , которая способна очень быстро ассоциировать с а субъединицей. Этот интермедиат находится в равновесии с более стабильной, но инертной формой ßi. В отсутствие а субъединицы, большая часть ß субъединицы переходит в форму ßi.

Показано, что процесс ренатурации денатурированной ß субъединицы проходит через указанный энергетически стабильный конформер ßj. Именно равновесие ß; <=> ß* определяет медленную скорость формирования нативного фермента при ренатурации.

Показано, что синтезируемые в бактериальной системе трансляции рибосомо-связанные полипептиды ß субъединицы триптофан-синтазы Е. coli могут ассоциировать с DnaK, членом семейства белков теплового шока HSP70, но не с GroEL, представителем семейства HSP60.

6. Изучено влияние системы GroEL/ES на сворачивание олигомерного белка на примере бактериальной люциферазы. Показано, что при повышении температуры возрастает сродство системы GroEL/ES к ß субъединице и она защищает полипептид от термоинактивации. Показано, что GroEL/ES ускоряет сворачивание ß субъединицы в активную люциферазу и минимизирует альтернативный непродуктивный путь сворачивания.

7. Высказана гипотеза, что шапероны могут ускорять сворачивание полипептидов, понижая энергетический барьер реакции сворачивания. При этом понижение энергетического барьера обеспечивается сдвигом равновесия от стабильных интермедиатов, имеющих высокий барьер до переходного состояния, к кинетически нестабильным интермедиатам с высокой энергией, имеющих меньшую разницу энергии до переходного состояния.

8. Показано, что при синтезе в гетерологичной эукариотической системе трансляции из ретикулоцитов кролика ß субъединица бактериальной люциферазы сворачивается по медленному пути сворачивания, характерному для процесса ренатурации денатурированного полипептида. Показано, что за перевод с быстрого пути сворачивания на медленный отвечает непродуктивное взаимодействие синтезируемого полипептида с эукариотическими шаперонами, включая HSP70.

9. Высказана гипотеза об адаптации сворачивания белков в своем клеточном окружении.

10. Разработан набор подходов для структурно-функционального и иммунологического анализа полипептидов в бесклеточных системах экспрессии на уровне нанограммов. Данные подходы могут применяться для быстрого анализа полипептидов, экспрессия которых в клетках затруднена (из-за токсичности, нестабильности к протеолизу и т.д.)

11. Изучен альбебетин, искусственный белок с заранее заданной пространственной структурой. Проведен начальный структурный анализ* альбебетина на основе разработанных подходов к анализу белков в бесклеточных системах экспрессии. Показано, что белок обладает стабильной структурой, совпадающей в основных элементах с заданной пространственной структурой

12. Начато изучение структурных белков оболочки вируса гепатита С. Получены формы рекомбинантного белка Е2 ВГС, пригодные для его структурно-функционального анализа и показано, что они являются функциональными. Начат структурно-функциональный анализ Е2. Показано, что эктодомен белка состоит из четырех структурных доменов.

13. Изучена возможность создания рекомбинантной противотуберкулезной вакцины на основе молекулярного шаперона HSP70 М. tuberculosis и иммуномодулятора полиоксидония. Показано, что конъюгация HSP70 с полиоксидонием резко усиливает гуморальный и клеточный иммунный ответ.

БЛАГОДАРНОСТИ

Хочу выразить глубокую благодарность моим учителям, академикам A.C. Спирину и Л.П. Овчинникову, в их лабораториях я учился стилю и духу научной работы. Сама идея и инициатива заняться котрансляционным сворачиванием белков принадлежит A.C. Спирину. Эта работа и я лично многим обязан людям, к сожалению, ушедшим от нас: профессору Ю.Б. Алахову и профессору О.Б. Птицыну, с которыми связывали не только профессиональные, но и дружеские отношения. Общение с ними и всеми сотрудниками лабораторий химии белка и физики белка института Белка много дало для понимания не только подходов и методик, но и самого духа и философии науки. Выражаю благодарность всем сотрудникам лаборатории химии белка института Белка. Работа по исследованию искусственного белка, альбебетина, была бы невозможна без проф. О.Б. Птицына, академика М.П. Кирпичникова, чл-корр. A.B. Финкелыптейна, д.ф.-м.н. Д.А. Долгих.

С профессором М. Гольдбергом и Б. Фриге из института Пастера был сделан цикл работ по котрансляционному сворачиванию триптофан-синтазы. Совместно с профессором Т. Болдуиным из Техасского университета был сделан цикл работ по котрансляционному сворачиванию люциферазы и участию шаперонов в этом процессе. А. Патель из Медицинского исследовательского совета (Глазго, Великобритания) и чл-корр. РАН А.Г. Тоневицкий участвовали в работах, связанных со структурным белком Е2 вируса гепатита С. Работа по созданию противотуберкулезной вакцины на основе белка HSP70 М. tuberculosis ведется с чл-корр. РАН Е.С. Севериным, академиком Р.В. Петровым и профессором A.B. Некрасовым. Хочется выразить искреннее восхищение Е.С. Севериным, директором ВНЦМДЛ, за постоянное желание научного поиска и отсутствие боязни совершенно новых задач. Выражаю благодарность всем сотрудникам лаборатории генных технологий

ВНЦМДЛ и лаборатории химии белков МНИИМЭ за участие в проведенных работах. Особенная благодарность к. б. н. М.С. Юрковой, за участие как в работах, описанных здесь, так и всех других работах, ведущихся в лаборатории.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Научная новизна диссертационной работы

Впервые, на примере (3 субъединицы бактериальной люциферазы, изучен путь биосинтетического сворачивания белка, охарактеризован основной скорость-лимитирующий интермедиат при сворачивании и кинетика процесса. Показано, в прямом сравнении с ренатурацией денатурированной (3 субъединицы, что котрансляционное сворачивание вносит вклад в кинетику формирования активной люциферазы. Таким образом, доказано, что котрансляционное сворачивание полипептидов является фактором, который обеспечивает быстрое сворачивание в клетках. Показано, что ключевым для быстрой кинетики биосинтетического сворачивания является нестабильный интермедиат, освобождающийся из рибосомы после завершения синтеза.

Изучена роль молекулярных шаперонов в биосинтетическом сворачивании белков. Показана вовлеченность шаперонов в процесс котрансляционного сворачивания полипептидов; продемонстрировано, что эти взаимодействия могут быть ключевыми для определения пути сворачивания полипептида. Показано, на примере вгоБЬ, что шапероны могут играть активную роль в сворачивании белка, максимально повышая путь сворачивания, ведущий к биологически активной структуре белка и минимизируя альтернативные пути, приводящие к появлению биологически не значимых форм. Предложен механизм такого действия шаперонов.

Таким образом, совокупность полученных результатов позволяет сказать, что начато новое научное направление - изучение биосинтетического сворачивания белков как комплексного процесса, определяемого совокупностью факторов, которые делают указанный путь сворачивания уникальным: это и векторный неравновесный характер процесса, определяемый его котрансляционной стадией, и вовлеченность шаперонов, и эволюционная адаптация для сворачивания в определенном клеточном окружении. Этот подход включает определение путей биосинтетического сворачивания и их прямое сравнение с процессом ренатурации полноразмерных полипептидов.

Предложен новый подход к структурно-функциональному и иммунологическому анализу белков - анализ белков, синтезированных в бесклеточных системах экспрессии. Данный подход позволяет изучать белки, которые затруднительно или невозможно получать традиционной наработкой в клеточных системах культивирования. Для этого предложен или адаптирован целый ряд методов. Используя данный подход, изучен искусственный полипептид альбебетин, белок с заранее заданной пространственной структурой. Проведен начальный структурно-функциональный анализ структурного белка оболочки вируса гепатита С. Изучен конъюгат шаперона HSP70 М. tuberculosis с иммуномодулятором полиоксидонием как возможная основа противотуберкулезной вакцины.

Практическая значимость диссертационной работы

Установленные закономерности биосинтетического сворачивания белков вносят заметный вклад в понимание процесса их сворачивания и самоорганизации. Полученные результаты позволяют оптимизировать продукцию рекомбинантных белков в клеточных и бесклеточных системах экспрессии, а также процедуры ренатурации в биологически активные формы.

Большое практическое значение имеет изучение структурных белков ВГС. В настоящее время отсутствуют вакцина против ВГС. Структурные белки вируса рассматриваются как кандидаты на создание соответствующей вакцины и терапии. Их анализ и использование в данных качествах затруднены сложностью работы с данными белками. Получены несколько форм структурного белка Е2, пригодных для структурно-функционального анализа. Установлена его доменная организация.

Апробация работы

Библиография Диссертация по биологии, доктора биологических наук, Федоров, Алексей Николаевич, Москва

1. Башаров МА. (2002). Имеют ли значение искусственные белки в решении проблемы сворачивания белков? Биофизика, 47, 989-995.

2. Долгих Д.А., Кирпичников М.П., Птицын О.Б., Федоров А.Н., Финкельштейн A.B., Чемериз В.В. (1992). De novo белки с заданной пространственной структурой: новые подходы к дизайну и анализу. Молекулярная биология, 26, 1242-1250.

3. Крашенинников И.А., Комар A.A., Аджубей И.А. (1989). Роль избыточности кода в котрансляционном сворачивании белков. Биохимия, 54, 187-200.

4. Крашенинников И.А., Комар A.A., Аджубей И.А. (1989). Частота использования кодонов мРНК и кодирование доменной структуры белков. Доклады Академии Наук СССР, 305, 1006-1012.

5. Светлов М.С., Колб В.А., Спирин А.С. (2007). Фолдинг люциферазы светлячков с иммобилизованным С-концом. Мол. Биол., 41, 96-102.

6. Федоров А.Н., Юркова М.С., Гудим Е.А., Тоневицкий А.Г. (2003). Создание и характеристика рибосомных комплексов, несущих вновь синтезированный белок Е2 вируса гепатита С. Аллергия, астма и клиническая иммунология, 7, 41-44.

7. Федоров А.Н., Юркова М.С., Лауринавичюте Д.К. (2007). Начальный структурный и функциональный анализ иммобилизованного гесЕ2, белка оболочки вируса гепатита С. Вопросы биологической, медицинской и фармацевтической химии, 3, 20-26.

8. Финкелыитейн А.В., Птицын О.Б. (2002). Физика белка. Издательство Книжный Дом, Университет, Москва.

9. Юркова М.С., Лауринавичюте Д.К., Федоров А.Н. (2006). Экспрессия, выделение и характеристика функционального негликозолированного структурного белка Е2 вируса гепатита С. Вопросы биологической, медицинской и фармацевтической химии, 4, 32-37.

10. Adzhubei A.A., Adzhubei I.A., Krasheninnikov I.A., Neidle S. (1996). Non-random usage of "degenerate" codons in related to protein three-dimentional structure. FEBSLett., 399, 78-82.

11. Akanuma S., Yamagishi A. (2005). Identification and characterization of key substructures involved in the early folding events of a (beta/alpha)8-barrel protein as studied by experimental and computational methods. J. Mol. Biol., 353, 1161-1170.

12. AlexandrovN. (1993). Structural argument for N-terminal initiation of protein folding. Protein Sci., 2, 1989-1991.

13. Anderson C.W., Baum P.R., Gesteland R.F. (1973). Processing of adenovirus 2-induced probeins. J. Virol., 12,241-254.

14. Anfinsen C.B., Harrington W.F., Hvidt A., Linderstr0m-Lang K., Ottesen M., Schellman J. (1955). Studies of the structural basis of ribonuclease activity. Biochim. Biophys. Acta, 17, 141-142.

15. Anfinsen C.B., Harrington W.F., Hvidt A., Linderstr0m-Lang K., Ottesen M., Schellman J. (1989). Studies of the structural basis of ribonuclease activity. 1955. Biochim. Biophys. Acta, 1000, 200-201.

16. Arispe N., Rojas E., Pollard H.D. (1993). Alzheimer's disease amyloid beta protein forms calcium channels in bilayer membranes: blockade by tromethamine and aluminium. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89, 10940-10944.

17. Attanasio R., Pehler K., McClure H.M. (2000). Immunogenicity and safety of Mycobacterium tuberculosis culture filtrate proteins in non-human primates. Clin. Exp. Immunol., 119, 84 — 91.

18. Baker D., Agard D. (1994). Kinetics versus thermodynamics in protein folding. Biochemistry, 33, 7505-7509.

19. Bakke C.K., Jungbauer L.M., Cavagnero S. (2006). In vitro expression and characterization of native apomyoglobin under low molecular crowding conditions. Protein Expr. Purif., 45, 381-392.

20. Baldwin R. L. (1975). Intermediates in protein folding reactions and the mechanism of protein folding. Annu. Rev. Biochem., 44, 454-477.

21. Baldwin T.O., Ziegler M.M., Chaffotte A.F., Goldberg M.E. (1993). Contribution of folding steps involving the individual subunits of bacterial luciferase to the assembly of the active heterodimeric enzyme. J. Biol. Chem., 268, 10766-10772.

22. Baranov V.I., Morozov I.Yu., Ortlepp S.A., Spirin A.S. (1989). Gene expression in a cell-free system on the preparative scale. Gene, 84, 463-466.

23. Basharov M.A. (2000). The posttranslational concept of protein folding: how valid is it? Biochemistry (Mosc.), 65, 1184-1191.

24. Basharov M.A. (2000). Cotranslational folding of proteins. Biochemistry (Mosc.), 65, 1380-1384.

25. Baskakov I.V., Legname G., Stanley B. Prusiner S.B., Cohen F.E. (2001). Folding of prion protein to its native a-helical conformation is under kinetic control. J. Biol. Chem., 276, 19687-19690.

26. Beckmann P., Mizzen L.A., Welch W. (1990). Interaction of Hsp 70 with newly synthesized proteins: implications for protein folding and assembly. Science, 248, 850-854.

27. Beere H.M. (2004). "The stress of dying": the role of heat shock proteins in the regulation of apoptosis. J. Cell Sci., 117, 2641-2651.

28. Bergman L.W., Kuehl W.M. (1979). Formation of intermolecular disulfide bonds on nascent immunoglobulin polypeptides J. Biol. Chem., 254, 5690-5694.

29. Betts S., King J. (1999). There's a right way and a wrong way: in vivo and in vitro folding, misfolding and subunit assembly of the P22 tailspike. Structure Fold. Des., 7, R131-R139.

30. Bigotti M.G., Clarke A.R. (2008). Chaperonins: The hunt for the Group II mechanism. Arch. Biochem. Biophys., 474, 331-339.

31. Blond S., Goldberg M.E. (1987). Partly native epitopes are already present on early intermediates in the folding of tryptophane synthase. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84, 1147-1151.

32. Blond-Elguindi S.B., Goldberg M.E. (1990). Kinetic characterization of early immunoreactive intermediates during the refolding of guanidine-unfolded Eschrrichia coli tryptophan synthase f!2 subunits. Biochemistry, 29, 2409-2412.

33. Bobula J., Tomala K., Jez E., Wloch D.M., Borts R.H., Korona R. (2006). Why molecular chaperones buffer mutational damage: a case study with a yeast Hsp40/70 system. Genetics, 174, 937-944.

34. Bolhassani A., Rafati S. (2008). Heat-shock proteins as powerful weapons in vaccine development. Expert Rev. Vaccines, 7, 1185-1199.

35. Braig K., Otwinowski Z., Hegde R., Boisvert D.C., Joachimiak A., Horwich A.L., Sigler P.B. (1994). The crystal structure of the bacterial chaperonin GroEL at 2.8 A. Nature, 371, 578-586.

36. Brazzoli M., Helenius A., Foung S.K., Houghton M., Abrignani S., Merola M. (2005). Folding and dimerization of hepatitis C virus El and E2 glycoproteins in stably transfected CHO cells. Virology, 332, 438-453.

37. Brodsky J.L., Schekman R. (1993). A Sec63p-BiP complex from yeast is required for protein translocation in a reconstituted proteoliposome. J. Cell Biol., 123, 1355-1363.

38. Broome B.M., Hecht M.H. (2000). Nature disfavors sequences of alternating polar and non-polar amino acids: implications for amyloidogenesis. J. Mol. Biol., 296, 961-968.

39. Bruckner P., Eikenberry E.F., Prockop D.J. (1981). Formation of the triple helix of type I procollagen in cellulo. A kinetic model based on cis-trans isomerization of peptide bonds. Eur. J. Biochem., 118, 607-613.

40. Bucciantini M., Giannoni E., Chiti F., Baroni F., Formigli L., Zurdo J., Taddei N., Ramponi G., Dobson C.M., Stefani M. (2002). Inherent toxicity of aggregates implies a common mechanism for protein misfolding diseases. Nature, 416, 507511.

41. Buchner J., Schmidt M., Fuchs M., Jaenicke R., Rudolph R., Schmid F., Kiefhaber T. (1991). GroE facilitates refolding of citrase synthase by supressing aggregation. Biochemistry, 30, 1586-1591.

42. Buchner J. (1996). Supervising the fold: functional principles of molecular chaperones. FASEB J., 10, 10-19.

43. Buckingham R.H. (1994). Codon context and protein synthesis: enhancements of the genetic code. Biochimie, 16, 351-354.

44. Bukau B., Horwich A.L. (1998). The Hsp70 and Hsp60 chaperone machines. Cell, 92, 351-366.

45. Bulaj G., Goldenberg D.P. (1999). Early events in the disulfide-coupled folding of BPTI. Protein Sci., 8, 1825-1842.

46. Bulaj G., Koehn R.E., Goldenberg D.P. (2004). Alteration in the disulfide-coupled folding pathway of BPTI by circular permutation. Protein Sci., 13, 11821196.

47. Bulleid N., Freedman R.B. (1988). Defective co-translational formation of disulphide bonds in protein disulphide-isomerase-deficient microsomes. Nature, 335, 649-651.

48. Chang J.Y., Li L., Lai P.H. (2001). A major kinetic trap for the oxidative folding of human epidermal growth factor. J. Biol. Chem., 276, 4845-4852.

49. Chang J.Y. (2004). Evidence for the underlying cause of diversity of the disulfide folding pathway. Biochemistry, 43, 4522-4529.

50. Chang J.Y., Li L. (2005). Divergent folding pathways of two homologous proteins, BPTI and tick anticoagulant peptide: compartmentalization of foldingintermediates and identification of kinetic traps. Arch. Biochem. Biophys., 437, 85-95.

51. Chattopadhyay S., Das B., Dasgupta C. (1996). Reactivation of denatured proteins by 23S ribosomal RNA: role of domain V. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93, 8284-8287.

52. Chaudhuri T.K., Paul S. (2006). Protein-misfolding diseases and chaperone-based therapeutic approaches. FEBSLett., 273, 1331-1349.

53. Cheltsov A.V., Barber M.J., Ferreira G.C. (2001). Circular permutation of 5-aminolevulinate synthase. Mapping the polypeptide chain to its function. J. Biol. Chem., 276, 19141-19149.

54. Chen W., Helenius J., Braakman I., Helenius A. (1995). Cotranslational folding and calnexin binding during glycoprotein synthesis. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 92, 6229-6233.

55. Chen W., Helenius A. (2000). Role of Ribosome and Translocon Complex during Folding of Influenza Hemagglutinin in the Endoplasmic Reticulum of Living Cells. Mol. Biol. Cell, 11, 765-772.

56. Chen J., Wang J., Wang W. (2004). Transition states for folding of circular-permuted proteins. Proteins, 57, 153-171.

57. Chernoff Y.O. (2007). Stress and prions: lessons from the yeast model. FEBS Lett., 581, 3695-3701.

58. Chiti F., Mangione P., Andreola A., Giorgetti S., Stefani M., Dobson C.M., Bellotti V., Taddei N. (2001). Detection of two partially structured species in the folding process of the amyloidogenic protein p2-microglobulin. J. Mol. Biol., 307, 379-391.

59. Chiti F., Calamai M., Taddei N., Stefani M., Ramponi G., Dobson C.M. (2002). Studies on the aggregation of mutant proteins in vitro provide insights into the genetics of amyloid diseases. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 99, 16419-16426.

60. Cho B.K., Palliser D., Guillen E., Wisniewski J., Young R.A., Chen J., Eisen H.N. (2000). A proposed mechanism for the induction of cytotoxic T lymphocytes production by heat shock fusion proteins. Immunity, 12, 263-272.

61. Choukhi A., Ung S., Wychowski C., Dubuisson J. (1998). Involvement of endoplasmic reticulum chaperones in the folding of hepatitis C virus glycoproteins. J. Virol., 72, 3851-3858.

62. Chow C.C., Chow C., Raghunathan V., Huppert T.J., Kimball E.B., Cavagnero S. (2003). Chain length dependence of apomyoglobin folding: structural evolution from misfolded sheets to native helices. Biochemistry, 42, 7090-7099.

63. Christis C, Lubsen NH, Braakman I. (2008). Protein folding includes oligomerization examples from the endoplasmic reticulum and cytosol. FEBS J., 275, 4700-4727.

64. Christopher J., Baldwin T.O. (1996). Implications of N and C-terminal proximity for protein folding. J. Mol. Biol., 257, 175-187.

65. Clark A.C., Sinclair J.F., Baldwin T.O. (1993). Folding of bacterial luciferase involves a non-native heterodimeric intermediate in equilibrium with the native enzyme and the unfolded subunits. J. Biol. Chem., 268, 10773-10779.

66. Clark A.C., Raso S.W., Sinclair J.F., Ziegler M.M., Chaffotte A.F., Baldwin T.O. (1997). Kinetic mechanism of luciferase subunit folding and assembly. Biochemistry, 36, 1891-1899.

67. Clark P.L., King J. (2001). A newly synthesized, ribosome-bound polypeptide chain adopts conformations dissimilar from early in vitro refolding intermediates. J. Biol. Chem., 276, 25411-25420.

68. Clarke A.R. (2006). Cytosolic chaperonins: a question of promiscuity. Mol. Cell, 24, 165-167.

69. Clayton R.F., Owsianka A., Aitken J., Graham S., Bhella D., Patel A.H. (2002). Analysis of antigenicity and topology of E2 glycoprotein present on recombinant hepatitis C virus-like particles. J. Virol, 76, 7672-7682.

70. Clementi C., Jennings P.A., Onuchic J.N. (2001). Prediction of folding mechanism for circular-permuted proteins. J. Mol. Biol., 311, 879-890.

71. Cocquerel L., Meunier J.C., Pillez A., Wychowski C., Dubuisson J. (1998). A retention signal necessary and sufficient for endoplasmic reticulum localization maps to the transmembrane domain of hepatitis C virus glycoprotein E2. J. Virol., 72, 2183-2191.

72. Contreras Martinez L.M., Martinez-Veracoechea F.J., Pohkarel P., Stroock A.D., Escobedo F.A., DeLisa M.P. (2006). Protein translocation through a tunnel induces changes in folding kinetics: a lattice model study. Biotechnol. Bioeng., 94, 105-117.

73. Corrales F., Fersht A.R. (1996). Toward a mechanism for GroEL-GroES chaperone activity: an ATPase-gated and -pulsed folding and annealing cage. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93, 4509-4512.

74. Cortazzo P., Cervenansky C., Marin M., Reiss C., Ehrlich R., Deana A. (2002). Silent mutations affect in vivo protein folding in Escherichia coli. Biochem. Biophys. Res. Commun., 293, 537-541.

75. Craig E.A., Eisenman H.C., Hundley H.A. (2003). Ribosome-tethered molecular chaperones: the first line of defence against protein misfolding? Curr. Opin. Microbiol., 6, 157-162.

76. Cramp M.E., Carucci P., Rossol S., Chokshi S., Maertens G., Williams R., Naoumov N.V. (1999). Hepatitis C virus (HCV) specific immune responses in anti-HCV positive patients without hepatitis C viraemia. GUT, 44, 424-429.

77. Creighton T.E. (1979). Electrophoretic analysis of the unfolding of proteins by urea. J. Mol. Biol., 129, 235-264.

78. Creighton T.E. (1984). Pathways and mechanisms of protein folding. Advan. Biophys., 18, 1-20.

79. Crombie T., Swaffield J.C., Brown A J. (1992). Protein folding within the cell is influenced by controlled rates of polypeptide elongation. J. Mol. Biol., 228, 7-12.

80. Cyr D.M., Langer T., Douglas M.G. (1994). DnaJ-like proteins : molecular chaperones and specific regulators ofHsp70. Trends Biochem. Sci., 19, 176-181.

81. Daniels R., Kurowski B., Johnson A.E., Hebert D.N. (2003). N-linked glycans direct the cotranslational folding pathway of influenza gemagglutinin. Mol. Cell, 11, 79-90.

82. Deane C.M., Dong M., Huard F.P., Lance B.K., Wood G.R. (2007). Cotranslational protein folding fact or fiction? Bioinformatics, 23, 142-148.

83. De Prat Gay G., Ruiz-Sanz J., Neira J.L., Itzhaki L.S., Fersht A.R. (1995). Folding of a nascent polypeptide chain in vitro: cooperative formation of structure in a protein module. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92, 3683-3686.

84. Deuerling E., Bukau B. (2004). Chaperone-assisted folding of newly synthesized proteins in the cytosol. Crit. Rev. Biochem. Mol. Biol., 39, 261-277.

85. Dill K.A., Bromberg S., Yue K., Fiebig K., Yee D., Thomas P., Chan H.S. (1995). Principles of protein folding—a perspective from simple exact models. Protein Sci., 4, 561-601.

86. Dobson C.M. (2001). The structural basis of protein folding and its links with human disease. Philos. Trans. R. Soc. Lond. B., 356, 133-145.

87. Eder J., Rheinnecker M., Fersht A.R. (1993). Folding of subtilisin BPN': role of the pro-sequence. J. Mol. Biol., 233, 293-304.

88. Elcock A.H. (2006). Molecular simulations of cotranslational protein folding: fragment stabilities, folding cooperativity, and trapping in the ribosome. PLoS Comput. Biol, 2, e98.

89. Ellis R.J., van der Vies S.M., Hemmingsen S.M. (1989). The molecular chaperone concept. Biochem. So.c Symp. 55, 145-153.

90. Ellis R.J. (2001). Macromolecular crowding: an important but neglected aspect of the intracellular environment. Curr. Opin. Struct. Biol., 11, 114-119.

91. Ellis R.J. (2006). Molecular chaperones: assisting assembly in addition to folding. Trends Biochem. Sci., 31, 395-401.

92. Ellis J.P., Bakke C.K., Kirchdoerfer R.N., Jungbauer L.M., Cavagnero S. (2008). Chain dynamics of nascent polypeptides emerging from the ribosome. ACS Chem. Biol., 3, 555-566.

93. Erickson A.H., Blobel G. (1987). Cell-free translation of messenger RNA in a wheat germ system. Methods Enzymol., 96, 38-50.

94. Escher A., Szalay A. (1993). GroE mediated folding of bacterial luciferases in vivo. Mol. Gen. Genet., 238, 65-78.

95. Evans M.S., Clarke T.F. 4th, Clark P.L. (2005). Conformations of cotranslational folding intermediates. Protein Pept. Lett., 12, 189-195.

96. Evans M.S., Sander I.M., Clark P.L. (2008). Cotranslational folding promotes beta-helix formation and avoids aggregation in vivo. J. Mol. Biol., 383, 683-692.

97. Fedorov A.N., Baldwin T.O. (1995). Contribution of cotranslational folding to the rate of formation of native protein structure. Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 92, 1227-1231.

98. Fedorov A.N., Baldwin T.O. (1997). GroE modulates kinetic partitioning of folding intermediates between alternative states to maximize the yield of biologically active protein. J Mol Biol., 268, 712-723.

99. Fedorov A.N., Baldwin T.O. (1997). Cotranslational protein folding. J. Biol. Chem., 272, 32715-32718.

100. Fedorov A.N., Baldwin T.O. (1998). Protein folding and assembly in a cellfree expression system. Methods Enzymol., 290, 1-17.

101. Fedorov A.N., Baldwin T.O. (1999). Process of biosynthetic protein folding determines the rapid formation of native structure. J. Mol. Biol., 294, 579-586.

102. Ferreira S.T., De Felice F.G., Chapeaurouge A. (2006). Metastable, partially-folded states in the productive folding and in the misfolding and amyloid aggregation of proteins. Cell Biochem. Biophys. 44, 539-548.

103. Ferbitz L. Patzelt H., Bukau B., Deuerling E., Ban N. (2004). Trigger Factor in Complex with the Ribosome forms a Molecular Cradle for Nascent Proteins. Nature, 431, 590-596.

104. Fersht A.R. (1995). Optimization of rates of protein folding: The nucleationcondensation mechanism and its implications. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92, 10869-10873.

105. Fersht A.R. (1997). Nucleation mechanisms in protein folding. Curr. Opin. Struct. Biol., 7, 3-9.

106. Finkelstein A.V., Badretdinov A.Ya. (1997). Rate of protein folding near the point of of the thermodynamic equilibrium between the coil and the most stable chain fold. Fold. Des., 2, 115-121.

107. Fisher A.J., Raushel F.M., Baldwin T.O., Rayment I. (1995). Three-dimensional structure of bacterial luciferase from Vibrio harveyi at 2.4A resolution. Biochemistry, 34, 6581-6586.

108. Fisher M.T., Yuan X. (1994). The rates of commitment to renaturation of rhodanese and glutamine synthetase in the presence of the GroE chaperonins. J. Biol. Chem., 269, 29598-29601.

109. Flaherty K.M., DeLuca-Flaherty C., McKay D.B. (1990). Three-dimentional structure of the ATPase fragment of a 70K heat-shock cognate protein. Nature, 346, 623-628.

110. Flynn G., Beckers C., Baase W., Dahlquist F. W. (1993). Individual subunits of bacterial luciferase are molten globules and interact with molecular chaperones. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90, 10826-10830.

111. Friguet B., Djavadi-Ohaniance L., Goldberg M.E. (1986). Conformational changes induced by domain assembly within the B2 subunit of Escherichia coli tryptophan synthase analysed with monoclonal antibodies. Eur. J. Biochem., 160, 593-597.

112. Friguet B., Djavadi-Ohaniance L., Goldberg. M.E. (1989). Polypeptide-antibody binding mechanism: conformational adaptation investigated by equilibrium and kinetic analysis. Res. Immunol., 140, 355-376.

113. Friguet B., Fedorov A.N., Djavadi-Ohaniance L. (1993). In vitro gene expression for the localization of antigenic determinants: application to the E. coli tryptophan synthase beta 2 subunit. J. Immunol. Methods., 158, 243-249.

114. Friguet B., Fedorov A.N., Serganov A.A., Navon A., Goldberg M.E. (1993). A radioimmunoassay-based method for measuring the true affinity of a monoclonal antibody with trace amounts of radioactive antigen. Analyt. Biochem., 210, 344-350.

115. Frydman J., Nimmesgern E., Ohtsuka K., Hartl, F.U. (1994). Folding of nascent polypeptide chains in a high molecular mass assembly with molecular chaperones. Nature, 370, 111-117.

116. Frydman J., Hartl F.U. (1996). Principles of Chaperone-Assisted Protein Folding: Differences Between in Vitro and in Vivo Mechanisms. Science, 272, 14971502.

117. Fulton A.B., L'Ecuyer T. (1993). Cotranslational assembly of some cytoskeletal proteins: implications and prospects. J. Cell Set, 105, 867-871.

118. Furie B., Schechter A.N., Sachs D.H., Anfmsen C.B. (1975). An immunological approach to the conformational equilibrium of staphylococcal nuclease. J. Mol. Biol, 92, 497-506.

119. Gaitanaris G.A., Vysokanov A., Hung S.C., Gottesman M.E., Gragerov A. (1994). Successive action of Escherichia coli chaperones in vivo. Mol. Microbiol., 14, 861-869.

120. Gao Y., Thomas J.O., Chow R.L., Lee G.H., Cowan N.J. (1992). A cytoplasmic chaperonin that catalyses beta-actin folding. Cell, 69, 1043-1050.

121. Genevaux P., Georgopoulos C., Kelley W.L. (2007). The Hsp70 chaperone machines of Escherichia coli: a paradigm for the repartition of chaperone functions. Mol. Microbiol., 66, 840-857.

122. Gilmore R., Coffey M.C., Leone G., McLure K., Lee P.W. (1996). Cotranslational trimerization of the reovirus cell attachment protein. EMBO J., 15, 26512658.

123. Goldenberg D.P., Creighton T.E. (1983). Circular and circularly permuted forms of bovine pancreatic trypsin inhibitor. J. Mol. Biol., 165, 407-413.

124. Goldberg M.E., Semisotnov G.V., Friguet B., Kuwajima K., Ptitsyn O.B., Sugai S. (1990). An early immunoreactive folding intermediate of the tryptophan synthase 132 subunit is a 'molten globule'. FEBSLetters, 263, 51-56.

125. Goldenberg D.P., Creighton T.E. (1984). Folding pathway of a circular form of bovine pancreatic trypsin inhibitor. J. Mol. Biol., 179, 527-545.

126. Goldenberg D.P. (1992). Native and non-native intermediates in the BPTI folding pathway. Trends Biochem. Set, 17, 257-261.

127. Goloubinoff P., De Los Rios P. (2007). The mechanism of Hsp70 chaperones: (entropic) pulling the models together. Trends Biochem. Sci., 32, 372-380.

128. Grason J.P., Gresham J.S., Widjaja L., Wehri S.C., Lorimer GH. (2008). Setting the chaperonin timer: the effects of K+ and substrate protein on ATP hydrolysis. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 105, 17334-17338.

129. Grason J.P., Gresham J.S., Lorimer G.H. (2008). Setting the chaperonin timer: a two-stroke, two-speed protein machine. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 105, 1733917344.

130. Gu W., Zhou T., Ma J., Sun X., Lu Z. (2003). Folding type specific secondary structure propensities of synonymous codons. IEEE Trans. Nanobioscience, 2, 150157.

131. Guisbert E., Yura T., Rhodius V.A., Gross C.A. (2008). Convergence of molecular, modeling, and systems approaches for understanding of the Escherichia coli heat shock response. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 72, 545-554.

132. Gutsche I., Essen L.O., Baumeister W. (1999). Group II chaperonins: new TRiC(k)s and turns of a protein folding machine. J. Mol. Biol., 293, 295-312.

133. Haas E. (2008). Folding on the assembly line. ACS Chem Biol., 3, 527-529.

134. Hardesty B., Kramer G. (2000). Folding of a nascent peptide on the ribosome. Prog. Nucleic Acid Res. Mol. Biol., 66, 41-66.

135. Hardy S., Randall L.L. (1991). A kinetic partitioning model of selective binding of normative proteins by the bacterial chaperone SecB. Science, 251, 439443.

136. Hastings J.W., Baldwin T.O., Nicoli M.Z. (1978). Bacterial luciferase: Assay, purification, and properties. In: Methods in Enzymology 57 (M. DeLuca, ed.), 135152, Academic Press, N.Y.

137. Hatfield G.W., Roth D.A. (2007). Optimizing scaleup yield for protein production: Computationally Optimized DNA Assembly (CODA) and Translation Engineering. Biotechnol. Annu. Rev., 13, 27-42.

138. He M., Taussig M.J. (2002). Ribosome display: cell-free protein display technology. Brief Fund. Genomic Proteomic, 1, 204-212.

139. Hennecke J., Glockshuber R. (1998). Conversion of a catalytic into a structural disulfide bond by circular permutation. Biochemistry, 37, 17590-17597.

140. Hennecke J., Sebbel P., Glockshuber R. (1999). Random circular permutation of DsbA reveals segments that are essential for protein folding and stability. J. Mol. Biol., 286, 1197-1215.

141. Hesterkamp T., Hauser S., Lutcke H., Bukau B. (1996). Escherichia coli trigger factor is a prolyl isomerase that associates with nascent polypeptide chains. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93, 4437-4441.

142. Hirakura Y., Kagan B.L. (2001). Pore formation by beta-2-microglobulin: a mechanism for the pathogenesis of dialysis-associated amyloidosis. Amyloid, 8, 94100.

143. Hishiya A., Takayama S. (2008). Molecular chaperones as regulators of cell death. Oncogene, 27, 6489-6506.

144. Hoffmann A., Merz F., Rutkowska A., Zachmann-Brand B., Deuerling E., Bukau B. (2006). Trigger factor forms a protective shield for nascent polypeptides at the ribosome. J. Biol. Chem., 281, 6539-6545.

145. Hohfeld J., Minami Y., Hartl F.U. (1995). Hip, a novel cochaperone involved in the eukaryotic Hsc70/Hsp40 reaction cycle. Cell, 83, 589-598.

146. Horwich A. (2004). Cell biology: sight at the end of the tunnel. Nature, 431, 520-522.

147. Houghton M. (1996). Hepatitis C viruses, in: Fields Virology, 3rd edn, Edited by Fields B. N., Knipe D. M. & Howley P. M. Philadelphia: Lippincott-Raven., 1035-1058.

148. Hsu S.T., Fucini P., Cabrita L.D., Launay H., Dobson C.M., Christodoulou J. (2007). Structure and dynamics of a ribosome-bound nascent chain by NMR spectroscopy. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 104, 16516-16521.

149. Huang P., Gautschi M., Walter W., Rospert S., Craig E.A. (2005). The Hsp70 Sszl modulates the function of the ribosome-associated J-protein Zuol. Nat. Struct. Mol. Biol, 12, 497-504.

150. Huard F.P., Deane C.M., Wood G.R. (2006). Modelling sequential protein folding under kinetic control. Bioinformatics, 22, 203-210.

151. Hundley H., Eisenman H., Walter W., Evans T., Hotokezaka Y., Wiedmann M., Craig E. (2002). The in vivo function of the ribosome-associated Hsp70, Sszl, does not require its putative peptide-binding domain. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 99, 4203-4208.

152. Hunt J.F., Weaver A.J., Landry S.J., Gierasch L., Deisenhofer J. (1996). The crystal structure of the GroES co-chaperonin at 2.8 A resolution. Nature, 379, 37-45.

153. Jacobson R.H., Zhang X.J., DuBose R.F., Matthews B.W. (1994). Three-dimentional structure of beta-galactosidase from E. coli. Nature, 369, 761-766.

154. Javid B., MacAry P.A., Lehner P.J. (2007). Structure and function: heat shock proteins and adaptive immunity. J. Immunol., 179, 2035-2040.

155. Jenkins N., Murphy L., Tyther R. (2008). Post-translational modifications of recombinant proteins: significance for biopharmaceuticals. Mol. Biotechnol., 39, 113118.

156. Johnson J.L., Raushel F. (1996). Influence of primary sequence transpositions on the folding pathways of ribonuclease Tl. Biochemistry, 35, 10223-10233.

157. Johnson A.E. (2004). Functional ramifications of FRET-detected nascent chain folding far inside the membrane-bound ribosome. Biochem. Soc. Trans., 32, 668-672.

158. Johnson A.E. (2005). The co-translational folding and interactions of nascent protein chains: a new approach using fluorescence resonance energy transfer. FEBS Lett., 579, 916-920.

159. Jungbauer L.M., Bakke C.K., Cavagnero S. (2006). Experimental and computational analysis of translation products in apomyoglobin expression. J. Mol. Biol., 357, 1121-1143.

160. Kayed R., Head E., Thompson J.L., Mclntire T.M., Milton S.C., Cotman C.W., Glabe C.G. (2003). Common structure of soluble amyloid oligomers implies common mechanisms of pathogenesis. Science, 300, 486^489.

161. Kelly J. (1998). Alternative conformation of amyloidogenic proteins and their multi-step assembly pathways. Curr. Opin. Struct. Biol., 8, 101-106.

162. Kibria F.M., Lees W.J. (2008). Balancing conformational and oxidative kinetic traps during the folding of bovine pancreatic trypsin inhibitor (BPTI) with glutathione and glutathione disulfide. J. Am. Chem. Soc., 130, 796-797.

163. Kiho Y., Rich A. (1964). Induced enzyme formed on bacterial polyribosomes. Proc. Natl. Acad. Sci USA, 51, 111-118.

164. Kim J., Klein P.G., Mullet J.E. (1991). Ribosomes pause at specific sites during synthesis of membrane-bound chloroplast reaction center protein Dl. J. Biol. Chem., 266, 14931-14938.

165. Kim J., Eichacker L.A., Rudiger W., Mullet J.E. (1994). Chlorophyll regulates accumulation of the plastid-encoded chlorophyll proteins P700 and Dl by increasing apoprotein stability. Plant Physiol., 103, 907-916.

166. Kirk T.Z., Evans J.S., Veis A. (1987). Biosynthesis of type I procollagen. Characterization of the distribution of chain sizes and extent of hydroxylation of polysome- associated pro-alpha-chains. J. Biol. Chem., 262, 5540-5545.

167. Kiseleva E.V. (1989). Secretory protein synthesis in Chironomus salivary gland cells is not coupled with protein translocation across endoplasmic reticulum membranes. Electron microscopic evidence. FEBS Lett., 257, 251-253.

168. Klein G., Sjorgen H.O., Klein E., Hellstrom K.E. (1960). Demonstration of resistance against methylcholanthrene-induced sarcomas in the primary autochthonous host. Cancer Res., 20, 1561—1572.

169. Kleizen B., van Vlijmen T., de Jonge H.R., Braakman I. (2005). Folding of CFTR is predominantly cotranslational. Mol. Cell, 20, 277-287.

170. Klumpp M., Baumeister W., Essen L.O. (1997). Structure of the substrate binding domain of a thermosome, an archaeal group II chaperonin. Cell, 91, 263-270.

171. Kolb V.A., Makeyev E.V., Spirin A.S. (1994). Folding of firefly luciferase during translation in a cell-free system. EMBO J., 13, 3631-3637.

172. Kolb V.A., Makeyev E.V., Spirin A.S. (2000). Co-translational folding of an eukaryotic multidomain protein in a prokaryotic tranlation system. J. Biol. Chem., 275, 16597-16601.

173. Komar A.A., Kommer A., Krasheninnikov I.A., Spirin A.S. (1993). Cotranslational heme binding to nascent globin chains. FEBSLett., 326, 261-263.

174. Komar A.A., Jaenicke R. (1995). Kinetics of translation of gamma B crystallin and its circularly permutated variant in an in vitro cell-free system: possible relations to codon distribution and protein folding. FEBS Lett., 376, 195-198.

175. Komar A.A., Kommer A., Krasheninnikov I.A., Spirin A.S. (1997). Cotranslational folding of globin. J. Biol. Chem., 272, 10646-10651.

176. Komar A.A., Guillemet E., Reiss C., Cullin C. (1998). Enhanced expression of the yeast Ure2p protein in Escherichia coli: the effect of synonymous codon substitutions at a selected place in the gene. Biol. Chem., 379, 1295-1300.

177. Komar A.A., Lesnik T., Reiss C. (1999). Synonymous codon substitutions affect ribosome traffic and portein folding during in vitro translation. FEBS Lett., 462,387-391.

178. Komar A.A. (2009). A pause for thought along the co-translational folding pathway. Trends Biochem. Sei., 34, 16-24.

179. Kourie J.I., Shorthouse A.A. (2000). Properties of cytotoxic peptide-induced ion channels. Am. J. Physiol. Cell Physiol., 278, C1063-C1087.

180. Kourie J.I., Henry C.L. (2002). Ion channel formation and membrane-linked pathologies of misfolded hydrophobic proteins: the role of dangerous unchaperoned molecules. Clin. Exp. Pharmacol. Physiol., 29, 741-753.

181. Kramer G., Kudlicki W., McCarthy D., Tsalkova T., Simmons D., Hardesty B. (1999). N-terminal and C-terminal modifications affect folding, release from the ribosomes and stability of in vitro synthesized proteins. Int. J. Biochem. Cell Biol., 31,231-241.

182. Kramer G., Ramachandiran V., Hardesty B. (2001). Cotranslational folding -omnia mea mecum porto? Int. J. Biochem. Cell Biol., 33, 541-543.

183. Kramer G., Rauch T., Rist W., Vorderwulbecke S., Patzelt H., SchulzeSpecking A., Ban N., Deuerling E., Bukau B. (2002). L23 protein functions as a chaperone docking site on the ribosome. Nature, 419, 171-174.

184. Krasheninnikov I.A., Komar A.A., Adzhubei I.A. (1991). Nonuniform size distribution of nascent globin peptides, evidence for pause localization sites, and a cotranslational protein-folding model. J. Prot. Chem., 10, 445-453.

185. Kruse M., Brunke M., Escher A., Szalay A., Tropschug M., Zimmermann R. (1995). Enzyme Assembly after de Novo Synthesis in Rabbit Reticulocyte Lysate Involves Molecular Chaperones and Immunophilins. J. Biol. Chem., 270, 2588-2594.

186. Kubelka J., Hofrichter J., Eaton W.A. (2004). The protein folding "speed limit". Curr. Opin. Struct Biol, 14, 76-88.

187. Kudlicki W., Odom O.W., Kramer G., Hardesty B. (1994). Activation and release of enzymatically inactive, full-length rhodanese that is bound to ribosomes as peptidyl-tRNA.Biol. Chem., 269, 16549-16553.

188. Kudlicki W., Odom O.W., Kramer G., Hardesty B. (1994). Chaperone-dependent folding and activation of ribosome-bound nascent rhodanese. Analysis by fluorescence. J. Mol Biol, 244, 319-331.

189. Kudlicki W., Kitaoka Y., Odom O.W., Kramer G., Hardesty, B. (1995). Elongation and folding of nascent ricin chains as peptidyl-tRNA on ribosomes: the effect of amino acid deletions on these processes. J. Mol Biol, 252, 203-212.

190. Kudlicki W., Odom O.W., Kramer G., Hardesty B., Merrill G.A., Horowitz P.M. (1995). The importance of the N-terminal segment for DnaJ-mediated folding of rhodanese while bound to ribosomes as peptidyl-tRNA. J. Biol Chem., 270, 1065010657.

191. Kudlicki W., Chirgwin J., Kramer G, Hardesty B. (1995). Folding of an enzyme into an active conformation while bound as peptidyl-tRNA to the ribosome. Biochemistry, 34, 14284-14287.

192. Kudlicki W., Odom O.W., Merrill G., Kramer G., Hardesty B. (1995). Inhibition of the release factor-dependent termination reaction on ribosomes by DnaJ and the N-terminal peptide of rhodanese. J. Bacteriol., 177, 5517-5522.

193. Kudlicki W., Odom O.W., Kramer G, Hardesty B. (1996). Binding of an N-terminal rhodanese peptide to DnaJ and to ribosomes. J. Biol Chem., 271, 3116031165.

194. Kudlicki W., Coffman A, Kramer G, Hardesty B. (1997). Ribosomes and ribosomal RNA as chaperons for folding of proteins. Fold Des., 2, 101-108.

195. Kudlicki W., Coffman A, Kramer G, Hardesty B. (1997). Renaturation of rhodanese by translational elongation factor (EF) Tu. Protein refolding by EF-Tu flexing. J. Biol. Chem., 272, 32206-32210.

196. Kunkel T.A. (1985). Rapid and efficient site-specific mutagenesis without phenotypic selection. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82, 488^192.

197. J., Deutsch C. (2005). Folding zones inside the ribosomal exit tunnel. Nat. Struct. Mol. Biol., 12, 1123-1129.

198. Ma L.C., Anderson S. (1997). Correlation between disulfide reduction and conformational unfolding in bovine pancreatic trypsin inhibitor. Biochemistry, 36, 3728-3736.

199. Macario A.J., Malz M., Conway de Macario E. (2004). Evolution of assisted protein folding: the distribution of the main chaperoning systems within the phylogenetic domain archaea. Front Biosci., 9, 1318-1332.

200. Macario A.J., Conway de Macario E. (2007). Molecular chaperones: multiple functions, pathologies, and potential applications. Front Biosci., 12, 2588-2600.

201. Maggioni M.C., Liscaljet I.M., Braakman I. (2005). A critical step in the folding of influenza virus HA determined with a novel folding assay. Nat. Struct. Mol. Biol., 12, 258-263.

202. Maier T., Ferbitz L., Deuerling E., Ban N. (2005). A cradle for new proteins : trigger factor at the ribosome. Curr. Opin. Struct. Biol., 15, 201-212.

203. Makeyev E.V., Kolb V.A., Spirin A.S. (1996). Enzymatic activity of the ribosome-bound nascent polypeptide. FEBSLett., 378, 166-170.

204. Mamathambika B.S., Bardwell J.C. (2008). Disulfide-linked protein folding pathways. Annu. Rev. Cell dev. Biol., 24, 211-235.

205. Mansell T.J., Fisher A.C., DeLisa M.P. (2008). Engineering the protein folding landscape in gram-negative bacteria. Curr. Protein Pept. Sci., 9, 138-149.

206. Marin M. (2008). Folding at the rhythm of the rare codon beat. Biotechnol. J., 3, 1047-1057.

207. Matthews B.W. (2005). The structure of E, coli beta-galactosidase. C. R. Biol., 328, 549-556.

208. McGinnes L.W., Morrison T.G. (1996). Role of cotranslational disulfide bond formation in the folding of the hemagglutinin-neuraminidase protein of Newcastle disease virus. Virology, 224, 465-476.

209. McShane H., Pathan A.A., Sander C.R., Keating S.M., Gilbert S.C|(2004). Recombinant MVA85A boosts BCG-primed and naturally acquired antimycobacterial immunity in humans. Nature Med., 10, 1240-1244.

210. Mendoza J.A., Rogers E., Lorimer G.H., Horowitz P M. (1991). Chaperonins facilitate the in vitro folding of monomelic mitochondrial rhodanese. J. Biol. Chem., 266, 13044-13049.

211. Merz F., Boehringer D., Schaffitzel C., Preissler S., Hoffmann A., Maier T., Rutkowska A., Lozza J., Ban N., Bukau B., Deuerling E. (2008). Molecular mechanism and structure of Trigger Factor bound to the translating ribosome. EMBO J., 21, 1622-1632.

212. Molinari M., Helenius A. (2002). Analyzing cotranslational protein folding and disulfide formation by diagonal sodium dodecyl sulfate-polyacrilamide gel electrophoresis. Methods Enzymol., 348, 35-42.

213. Molinari M. (2007). N-glycan structure dictates extention of protein folding or onset of disposal. Nat. Chem. Biol., 3, 313-320.

214. Morano K.A. (2007). New tries for an old dog: the evolving world of Hsp70. Ann. N YAcad. Sci., 1113, 1-14.

215. Mukhopadhyay P., Basak S., Ghosh T.C. (2007). Synonymous codon usage in different protein secondary structural classes of human genes: implication for increased non-randomness of GC3 rich genes towards protein stability. J. Biosci., 32, 947-963.

216. Mullet J.E., Klein P.G., Klein R.R. (1990). Chlorophyll regulates accumulation of the plastid-encoded chlorophyll apoproteins CP43 and D1 by increasing apoprotein stability. Proc Natl Acad Sci USA, 87, 4038-4042.

217. Murry-Brelier A., Goldberg M.E. (1988). Kinetics of appearance of an early immunoreactive species during the refolding of acid-denatured Escherichia coli tryptophan synthase 132 subunit. Biochemistry,27, 7633-7640.

218. Mustafa A. S. (2001). Biotechnology in the development of new vaccines and diagnostic reagents against tuberculosis. Current Pharmaceutical Biotechnology, 2, 157-173.

219. Mizukami S., Kajiwara C., Ishikawa H., Katayama I., Yui K., Udono H. (2008). Both CD4+ and CD8+ T cell epitopes fused to heat shock cognate rpotein (hsc70) can function to eradicate tumors. Cancer Sci., 99,1008-1015.

220. Nagradova N.K. (2004). Protein folding in the cell: on the mechanisms of its acceleration. Biochemistry (Mosc.), 69, 830-843.

221. Nagradova N. (2007). Enzymes catalyzing protein folding and their cellular functions. Curr. Protein Pept. Sci., 8, 273-282.

222. Neckers L., Tatu U. (2008). Molecular chaperones in pathogen virulence: emerging new targets for therapy. Cell Host Microbe, 4, 519-527.

223. Neira J.L., Fersht A.R. (1999). Exploring the folding funnel of a polypeptide chain by biophysical studies on protein fragments. J. Mol. Biol., 285, 1309-1333.

224. Nelson R.J., Ziegelhoffer T., Nicolet C., Werner M., Craig E.A. (1992). The translation machinery and 70 kd heat shock protein cooperate in protein synthesis. Cell, 71, 97-105.

225. Netzer W., Hartl F.U. (1997). Recombination of protein domains facilitated by co-translational folding in eukaryotes. Nature, 388, 343-349.

226. Nicola A.V., Chen W., Helenius A. (1999). Co-translational folding of an alphavirus capsid protein in the cytosol of living cells. Nat. Cell Biol., 1, 341-345.

227. Olsen A.W., van Pinxteren L.A.H., Okkels L.M., Rasmussen P.B., Andersen P. (2001). Protection of mice with a tuberculosis subunit vaccine based on a fusion protein of antigen 85B and ESAT-6. Infection and Immunity, 69, 2773 2778.

228. Onuchic J., Wolynes P.G., Luthey-Schulten Z., Socci N. (1995). Toward an outline of the topography of a realistic protein-folding funnel. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92, 3626-3630.

229. Op De Beek A., Cocquerel L., Dubuisson J. (2001). Biogenesis of hepatitis C virus envelope glycoproteins. J. Gen. Virol., 82, 2589-2594.

230. Otzen D.E., Fersht A.R. (1998). Folding of circular and permuted chymotrypsin inhibitor 2: retention of the folding nucleus. Biochemistry, 37, 81398146.

231. Pelham H.R. (1986). Speculations on the functions of the major heat shock and glucose-regulated proteins. Cell, 46, 959-961.

232. Peters T., Davidson L.K. (1982). The biosynthesis of rat serum albumin. In. vivo studies on the formation of the disulfide bonds. J. Biol. Chem., 257, 8847-8853.

233. Pileri P., Uematsu Y., Campagnoli S., Galli G., Falugi F., Petracca R., Weiner A.J., Houghton M., Rosa D., Grandi G., Abrignani S. (1998). Binding of hepatitis C virus to CD81. Science, 282, 938-941.

234. Pockley A.G., Muthana M., Calderwood S.K. (2008). The dual immunoregulatory roles of stress proteins. Trends Bio chem. Sci., 33, 71-79.

235. Polier S., Dragovic Z., Hartl F.U., Bracher A. (2008). Structural basis for the cooperation of Hsp70 and HspllO chaperones in protein folding. Cell, 133, 10681079.

236. Ptitsyn O.B. (1987). Protein folding: hypotheses and experiments. J. Protein Chem., 6, 273-293.

237. Ptitsyn O.B. (1995). Molten globule and protein folding. Adv. Protein Chem., 47, 83-229.

238. Purvis I.J., Bettany A.J., Santiago T.C., Coggins J.R., Duncan K., Eason R., Brown A.J. (1987). The efficiency of folding of some proteins is increased by controlled rates of translation in vivo. A hypothesis. J. Mol. Biol., 193, 413-417.

239. RansonN.A., DunsterN.J., Burston S.G., Clarke A.R. (1995). Chaperonins can catalyse the reversal of early aggregation steps when a protein misfolds. J. Mol. Biol., 250, 581-586.

240. Randall L.L., Topping T., Hardy S., Pavlov M., Freistroffer D., Ehrenberg M. (1997). Binding of SecB to ribosome-bound polypeptides has the same characteristics as binding to full-length, denatured proteins. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94, 802-807.

241. Redick S.D., Schwarzbauer J.E. (1995). Rapid intracellular assembly of tenascin hexabrachions suggests a novel cotranslational process. J. Cell Sci., 108, 1761-1769.

242. Reid B.G., Flynn G.C. (1996). GroEL binds to and unfolds rhodanese posttranslationally J. Biol. Chem., 271, 7212-7217.

243. Reilly M.M. (1998). Genetically determined neuropathies. J. Neurol., 245, 613.

244. Roder H., Colon, W. (1997). Kinetic role of early intermediates in protein folding. Curr. Opin. Struct. Biol. 7, 15-28.

245. Rocha W., Verreault A. (2008). Clothing up DNA for all seasons: Histone chaperones and nucleosome assembly pathways. FEBSLett., 582, 1938-1949.

246. Rochet J.C. (2007). Novel therapeutic strategies for the treatment of protein-misfolding diseases. Expert Rev. mol. Med., 9, 1-34.

247. Rommelaere H., De Neve M., Melki R., Vandekerckhove J., Ampe C. (1999). The cytosolic class II chaperonin CCT recognizes delineated hydrophobic sequences in its target proteins. Biochemistry, 38, 3246-3257.

248. Ross C.A. (2002). Polyglutamine pathogenesis: emergence of unifying mechanisms for Huntington's disease and related disorders. Neuron, 35, 819-822.

249. Roth R.A., Pierce S. (1987). In vivo cross-linking of protein disulfide isomerase to immunoglobulins. Biochemistry, 26, 4179-4182.

250. Rothe A., Hosse R.J., Power B.E. (2006). Ribosome display for improved biotherapeutic molecules. Expert Opin. Biol. Ther., 6, 177-187.

251. Routsias J.G., Tzioufas A.G. (2006). The role of chaperone proteins in autoimmunity. Ann. NY Acad. Sei., 1088, 52-64.

252. Rüdiger S., Buchberger A., Bukau B. (1997). Interaction of Hsp70 chaperones with substrates. Nat. Struct. Biol., 4, 342-349.

253. Rüdiger S., Germeroth L., Schneider-Mergener J., Bukau B. (1997). Substrate specificity of the DnaK chaperone determined by screening cellulose-bound peptide libraries. EMBO J., 16, 1501-1507.

254. Rutkowska A., Mayer M.P., Hoffmann A., Merz F., Zachmann-Brand B., Schaffitzel C., Ban N., Deuerling E., Bukau B. (2008). Dynamics of trigger factor interaction with translating ribosomes. J. Biol. Chem., 283, 4124-4132.

255. Sachs D.H., Schechter A.N., Eastlake A., Anfinsen C.B. (1972). An immunological approach to the conformational equilibria of polypeptides. Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 69, 3790-3794.

256. Saibil H.R. (2008). Chaperone machines in action. Curr. Opin. Struct. Biol., 18, 35-42.

257. Saiki R.K., Gelfand, D.H., Stoffel S., Schorf S.J., Higuchi R., Horn G.T., Mullis K.B., Erlich H.A. (1988). Primer-directed enzymatic amplification of DNA with a thermostable DNA polymerase. Science, 239, 487-491.

258. Sakahira H., Nagata S. (2002). Co-translational folding of caspase-activated Dnase with Hsp70, Hsp40, and inhibitor of caspase-activated Dnase. J. Biol. Chem., 277,3364-3370.

259. Salamanca S., Chang J.Y. (2006). Pathway of oxidative folding of a 3-disulfide alpha-lactalbumin may resemble either BPTI model or hirudin model. Protein J., 25, 275-287.

260. Sánchez I.E., Morillas M., Zobeley E., Kiefhaber T., Glockshuber R. (2004). Fast folding of the two-domain semliki forest virus capsid protein explains co-translational proteolytic activity. J. Mol. Biol., 338, 159-167.

261. Sargent F. (2007). Constructing the wonders of bacterial world: biosynthesis of complex enzymes. Microbiology, 153, 633-651.

262. Sauk J.J., Smith T., Noms K., Ferreira L. (1994). Hsp47 and the translation-translocation machinery cooperate in the production of alpha 1 (I) chains of type I procollagen. J. Biol. Chem., 269, 3941-3946.

263. Schatz G. (1996). The Protein Import System of Mitochondria. J. Biol. Chem., 271,31763-31766.

264. Schlesinger M.J., Levinthal C. (1965). Complementation at the molecular level of enzyme interaction. Annu. Rev. Microbiol., 19, 267-284.

265. Schwarz R., Istrail S., King J. (2001). Frequencies of amino acid strings in globular protein sequences indicate suppression of blocks of consecutive hydrophobic residues. Protein. Sci., 10, 1023-1031.

266. Segal B.H., Wang X.Y., Dennis C.G., Youn R., Repasky E.A., Manjili M.H., Subjeck J.R. (2006). Heat-shock proteins as vaccine adjuvants in infections and cancer. Drug Discov. Today, 11, 534-540.

267. Shagger H., von Jagow G. (1987). Tricine-sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis for the separation of proteins in the range from 1 to 100 kDa. Anal. Biochem., 166, 368-379.

268. Shakhnovich E.I. (1997). Theoretical studies of protein-folding thermodynamics and kinetics. Curr. Opin. Struct. Biol., 7, 29-40.

269. Shaner L., Morano K.A. (2007). All in the family: atypical Hsp70 chaperones are conserved modulators of Hsp70 activity. Cell Stress Chaperones, 12, 1-8.

270. Shimizu Y., Kuruma Y., Ying B.W., Umekage S., Ueda T. (2006). Cell-free translation systems for protein engineering. FEBS J., 273, 4133-4140.

271. Shinde U.P., Liu J.J., Inouye M. (1997). Protein memory through altered folding mediated by intramolecular chaperones. Nature, 389, 520-522.

272. Sinclair J.F., Waddle J J., Waddill E.F., Baldwin T.O. (1993). Puri®ed native subunits of bacterial luciferase are active in the bioluminescence reaction but fail to assemble into the a/3 structure. Biochemistry, 32, 5036-5044.

273. Sinclair J.F., Ziegler M.M., Baldwin T.O. (1994). Kinetic partitioning during protein folding yields multiple native states. Nature Struct. Biol., 1, 320-326.

274. Skeiky Y.A.W., Sadoff J.C. (2006). Advances in tuberculosis vaccine strategies. Nat. Rev. Microbiol., 4, 469-476.

275. Smith T.F. (1995). Models of protein folding. Science, 268, 959-961.

276. Sota H., Hasegawa Y., Iwakura M. (1998). Detection of conformational changes in an immobilized protein using surface plasmon resonance. Anal. Chem., 70, 2019-2024.

277. Spirin A.S., (1986). Ribosome Structure and Protein Biosynthesis. Publisher: Benjamin/Cummings Pub. Co., 162-183.

278. Srivastava P. (2002). Interaction of heat shock proteins with peptides and antigen presenting cells: chaperoning of the innate and adaptive immune responses. Annu. Rev. Immunol., 20, 395-425.

279. Stemp M.J., Guha S., Hartl F.U., Barral J.M. (2005). Efficient production of native actin upon translation in a bacterial lysate supplemented with the eukaryotic chaperonin TRiC. Biol. Chem., 386, 753-757.

280. Stefani M., Dobson C.M. (2003). Protein aggregation and aggregate toxicity: new insights into protein folding, misfolding diseases and biological evolution. J. Mol. Med., 81, 678-699.

281. Sugihara J., Baldwin T.O. (1988). Effects of 30 end deletions from the Vibrio harveyi luxB gene on luciferase subunit folding and enzyme assembly: generation of temperature-sensitive polypeptide folding mutants. Biochemistry, 27, 2872-2880.

282. Suh W.C., Lu C.Z., Gross C.A. (1999). Structural features required for the interaction of the Hsp70molecular chaperone DnaK with its cochaperone DnaJ. J. Biol. Chem., 274, 30534-30539.

283. Svetlov M.S., Kommer A., Kolb V.A., Spirin A.S. (2006). Effective cotranslational folding of firefly luciferase without chaperones of the Hsp70 family. Protein Sci., 15, 242-247.

284. Szabo A., Korszun R., Hartl F.U., Flanagan J. (1996). A zinc finger-like domain of the molecular chaperone DnaJ is involved in binding to denatured protein substrates. EMBO J., 15, 408-417.

285. Tabtiang R.K., Cezairliyan B.O., Grant R.A., Cochrane J.C., Sauer R.T. (2005). Consolidating critical binding determinants by noncyclic rearrangement of protein secondary structure. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 102, 2305-2309.

286. Taddei N., Capanni C., Chiti F., Stefani M., Dobson C.M., Ramponi G. (2001). Folding and aggregation are selectively influenced by the conformational preferences of the a-helices of muscle acylphosphatase. J. Biol. Chem., 276, 37149-37154.

287. Taniuchi H., Parr G.R., Juillerat M.A. (1986). Complementation in folding and fragment exchange. Methods Enzymol, 131, 185-217.

288. Taylor W.R. (2006). Topological accessibility shows a distinct asymmetry in the fold of beta/alpha proteins. FEBS Lett, 580, 5263-5267.

289. Thanaraj T.A., Argos P. (1996). Ribosome-mediated translational pause and protein domain organization. Protein Sci., 5, 1594-1612.

290. Thanaraj T.A., Argos P. (1996). Protein secondary structural types are differently coded on messenger RNA. Protein Sci., 5, 1973-1983.

291. Thirumalai D., Lorimer G.H. (2001). Chaperonin-mediated protein folding. Ann. Rev. Biophys. Biomol. Struct., 30, 245-260.

292. Thoden J., Holden H., Fisher A., Sinclair J., Wesenberg G., Baldwin T.O., Rayment I. (1997). Structure of the beta 2 homodimer of bacterial luciferase from Vibrio harveyi: X-ray analysis of a kinetic protein folding trap. Protein Sci., 6, 13-23.

293. Thomas P.J., Qu B.H., Pedersen P.L. (1995). Defective protein folding as a basis of human disease. Trends. Biochem. Sci., 20, 456-459.

294. Tian G., Vainberg I.E., Tap W.D., Lewis S.A., Cowan N.J. (1995). Specificity in chaperonin-mediated protein folding. 375, 250-253.

295. Tobian A.A., Harding C.V., Canaday D.H. (2005). Mycobacterium tuberculosis heat shock fusion protein enhances class I MHC cross-processing and presentation by B lymphocytes. J. Immunol., 174, 5209-5214.

296. Todd M., Viitanen P., Lorimer G.H. (1994). Dynamics of the chaperonin ATPase cycle: implications for facilitated protein folding. Science, 265, 659-666.

297. Todd M.J., Lorimer G.H., Thirumalai D. (1996). Chaperonin-facilitated protein folding: optimization of rate and yield by an iterative annealing mechanism. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93, 4030-4035.

298. Tomala K., Korona R. (2008). Alleviation of deleterious effects of protein mutation through inactivation of molecular chaperones. Mol. Genet. Genomics, 280, 409-417.

299. Turner G.C., Varshavsky A. (2000). Detecting and measuring cotranslational protein degradation in vivo. Science, 289, 2117-2120.

300. Vega C.A., Kurt N., Chen Z., Rüdiger S., Cavagnero S. (2006). Binding specificity of an alpha-helical protein sequence to a full-length Hsp70 chaperone and its minimal substrate-binding domain. Biochemistry, 45, 13835-13846.

301. Veis A., Kirk T.Z. (1989). The coordinate synthesis and cotranslational assembly of type I procollagen. J. Biol. Chem., 264, 3884-3889.

302. Vembar S.S., Brodsky J.L. (2008). One step at a time: endoplasmic reticulum-associated degradation. Nat. Rev. Mol. Cell Biol., 9, 944-957.

303. Vignais M.L., Corbier C., Mulliert G., Branlant C., Branlant G. (1995). Circular permutation within the coenzyme binding domain of the tetrameric glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase from Bacillus stearothermophilus. Protein Sei., 4, 994-1000.

304. Viguera A.R., Blanco F.J., Serrano L. (1995). The order of secondary structure elements does not determine the structure of a protein but does affect its folding kinetics. J. Mol. Biol., 247, 670-681.

305. Viguera A.R., Serrano L., Wilmanns M. (1996). Different folding transition states may result in the same native structure. Nat. Struct. Biol., 3, 874-880.

306. Walker K.B., Keeble J., Colaco C. (2007). Mycobacterial heat shock proteins as vaccines a model of facilitated antigen presentation. Curr. Mo I. Med., 7, 339350.

307. Wang Y., Kelly J.T., Karttunen T. (2001). CD40 is a cellular receptor mediating mycobacterial heat shock protein 70 stimulation of CC-chemokines. Immunity, 15, 971 983.

308. Wedemeyer W.J., Welker E., Narayan M., Scheraga H.A. (2000). Disulfide bonds and protein folding. Biochemistry, 39, 4207-4216.

309. Wegrzyn R.D., Deuerling E. (2005). Molecular guardians for newborn proteins: ribosome-associated chaperones and their role in protein folding. Cell Mol. Life Scl, 62, 2727-2738.

310. Weikl T.R., Dill K.A. (2003). Folding kinetics of two-state proteins: effect of circularization, permutation, and crosslinks. J. Mol. Biol, 332, 953-963.

311. Weissman J.S., Kim P.S. (1992). The pro region of BPTI facilitates folding. Cell, 71, 841-851.

312. Weissman J., Kashi Y., Fenton W.A., Horwich A.L. (1994). GroEL-mediated protein folding proceeds by multiple rounds of binding and release of nonnative forms. Cell, 78, 693-702.

313. Winderickx J., Delay C., De Vos A., Klinger H., Pellens K., Vanhelmont T., Van Leuven F., Zabrocki P. (2008). Protein folding diseases and neurodegeneration: lessons learned from yeast. Biochim. Biophys. Acta, 1783, 1381-1395.

314. Woolhead C.A., McCormick P.J., Johnson A.E. (2004). Nascent membrane and secretory proteins differ in FRET-detected folding far inside the ribosome and their exposure to ribosomal proteins. Cell, 116, 725-736.

315. Yagnik A.T., Lahm A., Meola A., Roccasecca R.M., Ercole B.B., Nicosia A., Tramontano A. (2000). A model for the hepatitis C virus envelope glycoprotein E2. Proteins, 40, 355-366.

316. Yi M., Kaneko S., Yu D.Y., Murakami S. (1997). Hepatitis C virus envelope proteins bind lactoferrin. J. Virol., 71, 5997-6002.

317. Ying B.W., Taguchi H., Kondo M., Ueda T. (2005). Co-translational involvement of the chaperonin GroEL in the folding of newly translated polypeptides. J. Biol. Chem., 280, 12035-12040.

318. Ying B.W., Taguchi H., Ueda T. (2006). Co-translational binding of GroEL to nascent polypeptides is followed by post-translational encapsulation by GroES to mediate protein folding. J. Biol. Chem., 281, 21813-21819.

319. Young R. A. (1990). Stress proteins and immunology. Annu. Rev. Immunol, 8, 401-420.

320. Yurkova M.S., Patel A.H., Fedorov A.N. (2004). Characterisation of bacterially expressed structural protein E2 of hepatitis C virus. Prot. Exp. Purif., 37, 119-125.

321. Zabin I., Villarejo M.R. (1975). Protein complementation. Annu. Rev. Biochem., 44, 295-313.

322. Zako T., Deguchi H., Kitayama A., Ueda H., Nagamune T. (2000). Refolding of a firefly luciferase immobilized on agarose beads. J. Biochem., 127, 351-354.

323. Zako T., Harada K., Mannen T., Yamaguchi S., Kitayama A., Ueda H., Nagamune T. (2001). Monitoring of the refolding process for immobilized firefly luciferase with a biosensor based on surface plasmon resonance. J. Biochem., 129, 14.

324. Zahn R., Pluckthun A. (1994). Thermodynamic partitioning model for hydrophobic binding of polypeptides by GroEL. II. GroEL recognizes thermally unfolded mature b-lactamase. J. Mol. Biol., 242, 165-174.

325. Zahnd C., Amstutz P., Pluckthun A. (2007). Ribosome display: selecting and evolving proteins in vitro that specifically bind to a target. Nat. Methods, 4, 269-279.

326. Zeilstra-Ryalls J.H., Somerville R.L. (1992). Protein-protein interaction in the alpha-complementation system of beta-galactosidase. Curr. Top. Cell Regul., 33, 81104.

327. Zhang T., Bertelsen E., Benvegnu D., Alber T. (1993). Circular permutation of T4 lysozyme. Biochemistry, 32, 12311-12318.

328. Zhang J., Randall G., Higginbottom A., Monk P., Rice C.M., McKeating J.A. (2004). CD81 is required for hepatitis C virus glycoprotein-mediated viral infection. J. Virol., 78, 1448-1455.

329. Zhong T., Arndt K. (1993). The yeast SIS1 protein, a DnaJ homolog, is required for the initiation of translation. Cell, 73, 1175-1186.

330. M.E., Hendrickson W.A. (1996). Structural analysis of substrate binding by the molecular chaperone DnaK. Science, 272, 1606-1614.

331. Ziegler M M., Goldberg M.E., Chaffotte A.F., Baldwin T.O. (1993). Refolding of luciferase subunits from urea and assembly of the active heterodimer. J. Biol. Chem., 268, 10760-10765.

332. Zipser D., Perrin D. (1963). Complementation between the products of the (3-galactosidase structural gene of E. coli. Cold Spring Harbor symp. Quant. Biol., 28, 533-537.

333. Ziv G., Haran G., Thirumalai D. (2005). Ribosome exit tunnel can entropically stabilize alpha-helices. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 102, 18956-18961.

334. Zubay G. (1973). In Vitro synthesis of proteins in microbial systems. Annu. Rev. Genet., 7, 267-287.

Информация о работе

Федоров, Алексей Николаевич
доктора биологических наук
Москва, 2009
ВАК 03.00.04

Диссертация

Биосинтетическое сворачивание белков - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему Биосинтетическое сворачивание белков ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Биосинтетическое сворачивание белков"

Содержание диссертации, доктора биологических наук, Федоров, Алексей Николаевич

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Федоров, Алексей Николаевич

Библиография Диссертация по биологии, доктора биологических наук, Федоров, Алексей Николаевич, Москва

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Биосинтетическое сворачивание белков
ВАК РФ 03.00.04, Биохимия