Теоретическое исследование барьеров внутреннего вращения и механизма сворачивания белков

Башаров, Махмуд Ашыг-оглы

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Теоретическое исследование барьеров внутреннего вращения и механизма сворачивания белков
ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Теоретическое исследование барьеров внутреннего вращения и механизма сворачивания белков"

□03487ВЭЭ

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК ИНСТИТУТ ТЕОРЕТИЧЕСКОЙ И ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЙ БИОФИЗИКИ

на правах рукописи

БАШАРОВ МАХМУД АШЫГ-ОГЛЫ

ТЕОРЕТИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ БАРЬЕРОВ ВНУТРЕННЕГО ВРАЩЕНИЯ И МЕХАНИЗМА СВОРАЧИВАНИЯ

БЕЛКОВ

03.00.02 - биофизика

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора физико-математических наук

1 О ДЕК 2009

Пущино - 2009

003487699

Работа выполнена в Институте теоретической и экспериментальной биофизики РАН

Научный консультант: доктор биологических наук Аллахвердиев С.И.

Официальные оппоненты:

доктор физико-математических наук, профессор Туманян В.Г.

доктор химических наук, профессор Шишков A.B.

доктор физико-математических наук, профессор Романовский Ю.М.

Ведущая организация: Институт биофизики клетки РАН

Защита состоится " _20 (¿¿г. в * I на заседании

Диссертационного совета Д 501.001.96 при Московском государственном университете по адресу: 119991, Москва, ГСП-1 Воробьевы горы, МГУ, Биологический факультет, ЛИК, аудитория «Новая».

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке биологического факультета МГУ.

Автореферат разослан

М т^ 20 о%

Ученый секретарь Диссертационного совета доктор биологических наук, ^—■)

профессор ~Г7~к- '- Кренделева Т.Е.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Проблема сворачивания белка, т.е., выяснение того, каким образом формируется нативная конформация белка на основе первичной структуры, признана одной из актуальных в физико-химической биологии. Понимание механизма сворачивания белков необходимо для решения многих фундаментальных и практических задач биологии, медицины и биотехнологии на молекулярном уровне. Важнейшими среди них являются: предсказание и разработка методов предсказания пространственной структуры белков и пептидов, изучение влияния специфических мутационных изменений на структуру белков и активность ферментов, создание мутантных белков со специфическими характеристиками и искусственных белков с заданными свойствами, разработка и создание новых физиологически активных пептидов, изучение механизмов болезней, связанных с неправильным сворачиванием белков, таких как болезни Альцгеймера, Паркинсона, Кройесфельда-Якобса.

Решением этой проблемы интенсивно занимаются во многих научных коллективах мира исходя из двух концепций. Согласно одной из них белки сворачиваются в процессе биосинтеза, по мере выхода полипептидной цепи из рибосомы, котрансляционно (рис.1). Концепция была обоснована тем, что синтез белковой цепи на рибосоме происходит с N-конца к С-концу направленно и подтверждается результатами многочисленных экспериментов in vivo и на белоксинтезирующих модельных системах. Однако неизвестно, как могут сворачиваться белки котрансляционно.

Рис.1. Ко- (слева) и поспрансляционное (справа) сворачивание белков

Вторая концепция посттрансляционная, согласно которой нативная конформация белка формируется после синтеза и полного выхода полипептидной цепи из рибосомы из состояния случайного клубка (рис.1). Концепция была основана на результатах т уИго двух типов экспериментов. Один тип эксперименты по денатурации-ренатурации белков, по результатам которых некоторые малые глобулярные белки приобретали вид случайного клубка при денатурации и быстро восстанавливали нативную структуру спонтанно после удаления денатурирующего воздействия. Результаты другого типа экспериментов связаны с получением синтетических аналогов рада нативных белков путем химического синтеза, в частности рибонуклеазы А, лизоцима, инсулина человека На этих же результатах базируется теоретическая основа

концепции в виде двух гипотез и пара утверждений. Одной из них гипотеза случайного клубка, согласно которой полипептадные цепи денатурированных и новосинтезированных на рибосоме белков представляются как случайные клубки. Вторая гипотеза термодинамическая, которая устанавливает, что нативной конформации белка соответствует наименьшая свободная энергия Гиббса системы полипептидная цепь и физиологическая среда. Общеприняты утверждения, что процесс сворачивания белка может быть представлен как переход «клубок - глобула», и что сворачивание белков in vivo и ренатурация денатурированных белков происходят по одинаковым или схожим механизмам из состояния случайного клубка. Опираясь на эти гипотезы и утверждения, преобладающее большинство исследований по выяснению механизма процесса сворачивания белков ведутся на основе посттрансляционного подхода. При этом широко используют как эксперименты по денатурации и ренатурации белков, так и различные теоретические подходы, в частности, основанные на соображениях статистической механики, как удобные in vitro модели. Однако решить проблему сворачивания белков на этой основе до сих пор не удается.

Важный фундаментальный вопрос на пути решения проблемы сворачивания - объяснение быстрого сворачивания белков, поскольку число доступных полипептидной цепи дискретных конформаций астрономическое, и поэтому потребовалось бы астрономическое время, чтобы цепь приобретала соответствующую нативному белку единственную конформацию путем перебора всевозможных вариантов. Тем не менее, белки сворачиваются и это они делают очень быстро (парадокс Левинталя).

Итак, решение проблемы сворачивания белков требует ответить на обозначенные выше три фундаментальных вопроса: 1) сворачиваются ли белки ко- или посттрансляционно, т.е., в процессе, или после синтеза полипептидиой цепи на рибосоме, 2) каков механизм сворачивания белков, 3) каково объяснение быстрого сворачивания белков?

Движущей силой процесса сворачивания белка является спонтанное стремление системы полипептидная цепь - вода (основная компонента физиологической среды) к стабилизации, уменьшению свободной энергии Гиббса. Она может быть записана в виде

AG =Д Н -TAS + AG (*)

стад. цепь цепь гидрат.

где АН - энтальпия цепи, которая представляет собой

цепь

внутримолекулярные и межмолекулярные взаимодействия полипептидной цепи и растворителя суммарно, AS^ - энтропия цепи, AG ¡d свободная

энергия гидратации (сольватации) цепи, которая включает в себе также свободную энергию растворителя, 7- температура. Предложены различные формулы и рецепты для вычисления каждого из входящих в выражение (*) вкладов. Эти рецепты, однако, далеки от совершенства. В частности, давно

известно, что популярные функционалы, построенные на основе потенциалов невалентного взаимодействия тина "б-ехр" или "6-72" и торсионных потенциалов, используемые для оценок потенциальной энергии полипептидов, страдают от очевидных серьезных недостатков. Поэтому является актуальным создание простых и надежных расчетных методов для реалистической оценки потенциальной энергии, внутримолекулярных и межмолекулярных взаимодействий полипептидов.

Цель работы. На основании вышеизложенного, основной целью данной диссертационной работы ямялось исследование проблемы сворачивания белков с использованием расчетно-теоретических и аналитического подходов. Работа посвящена фундаментальным вопросам проблемы: I) сворачиваются ли белки котрансляционно в процессе биосинтеза, или после синтеза и выхода из рибосомы посттрансляционно, 2) каков механизм сворачивания белков, а также оценки 3) энтальпийного вклада в свободную энергию сворачивания белков и 4) величины барьеров внутреннего вращения вокруг единичных связей основной цепи полипептидов и их роли в сворачивании белков.

Задачи исследования. В ходе работы были определены и решались следующие фундаментальные задачи.

- Создание надежного расчетного метода для конформационного анализа и изучения взаимодействия полипептидов и других органических молекул - модифицированного метода фрагмент-фрагментных взаимодействий (ФФВ);

- Создание алгоритмов и вычислительных программ для: построения молекулярной модели олигопептвдов, расчетов поверхности потенциальной энергии(ППЭ) олигопептвдов и отдельных аминокислотных остатков в них, обработки данных банка белковых структур и вычисления конформации полипептидных цепей из атомных координат белков, статистического анализа конформации аминокислотных остатков в трехмерных структурах белков, построения информационных карт;

Расчетно-теоретическое исследование ППЭ олигопептидов

аминокислот методом ФФВ и оценка величины БВВ вокруг связей NC и

С С полипептидной цепи белков;

- Анализ конформаций аминокислотных остатков в трехмерных структурах белков из банка белковых данных;

Систематизация литературных данных по химически синтезированным белкам и выяснение их отношение к проблеме сворачивания белков;

- Выяснение наличия остаточной упорядоченной структуры в белках при их денатурации на основе анализа известных экспериментальных данных;

- Выяснение степени адекватности ко- и посттрансляционного подходов изучению механизма сворачивания белков;

- Выдвижение возможного механизма сворачивания белков и предъявление подтверждающих этот механизм данных.

Научная новизна работы. Проведено фундаментальное исследование по выяснению реалистических оценок барьеров внутреннего вращения в белках:

Разработан надежный расчетный метод для оценок барьеров внутреннего вращения (БВВ) в белках - модифицированный метод фрагмент-фрагментных взаимодействий (ФФВ) для информационного анализа и изучения взаимодействия полипептидов и других органических молекул.

Установлено, методом ФФВ, что величины БВВ вокруг связей ЫС и

С С основной цепи полипептидов, которые традиционно считаются незначительными, около 0,7 ккал/моль для обеих величин, достаточно значительны и составляют соответственно около 16 ккал/моль - что сопоставимо с транс-цис барьером пептидной связи, и б ккал/моль.

Обоснована невыгодность нахождения в структуре белков неглициновых остатков в положительной - с положительным значением

угла вращения <р вокруг связи Д'С - коиформации. Представлено надежное косвенное экспериментальное подтверждение наличия высокого

энергетического барьера при вращении вокруг связей Л'С в белках на основе аначиза трехмерных структур белков из банка белковых данных.

Обоснована, на основе анализа известных данных о химически синтезированных белках, что возможность получения синтетических белков подтверждает наличия взаимосвязи между первичной структурой и нативной конформацией белков и вряд ли свидетельствует о посттрансляционном сворачивании белков.

Выявлена обшая закономерность, из систематизации литературных данных, о наличии остаточных упорядоченных структур в белках в сильно денатурирующих условиях в отличие от традиционных представлений, рассматривающих денатурированные белки как случайные клубки, что свидетельствует о недостаточной обоснованности представления процесса сворачивания белка как переход клубок - глобула.

Представлено обоснование котранедяционного в процессе биосинтеза полипептидной цепи на рибосоме сворачивания белков. Предложен механизм сворачивания белков и предъявлены подтверждающие этот механизм и его универсальность данные.

Научно-практнческан значимость полученных результатов.

Разработан расчетный метод для конформационного анализа и изучения взаимодействия органических молекул и полипептидов. Метод может быть использован для изучения структуру, конформаций, энергию взаимодействия, дипольные моменты различных молекул и молекулярных комплексов. Даны реалистические оценки величины БВВ вокруг связей

а а

NC и С С основной цепи полипептидов, что может способствовать развитию структурной протеомики и сыграть важную роль в исследованиях проблемы сворачивания и пространственной структуры белков. Обоснована концепция котрансляционного сворачивания белков, что существенно облегчает целенаправленный поиск эффективных путей для реалистического описания соотношения между аминокислотной последовательностью и пространственной структурой белков. Предложен механизм сворачивания белков, что позволит разработать адекватные алгоритмы и методы для предсказания пространственной структуры пептидов и белков на основе известной первичной структуры. Полученные по теме диссертации результаты используются в учебных курсах по молекулярной биофизике в ряде университетах США, по меньшей мере, и могут быть использованы в учебных курсах других вузов по молекулярной биофизике, биохимии, молекулярной биологии. Они могут найти активное применение в биотехнологических разработках и молекулярной медицине, при проектировании и создании новых эффективных лекарственных препаратов пептидной природы.

Апробация работы. Результаты работы были представлены на: VI и VII Всесоюзных симпозиумах по межмолекулярному взаимодействию и конформациям молекул (Вильнюс, 1982; Рига, 1986), I Всесоюзном биофизическом съезде (Москва, 1982), IX Всесоюзном совещании по квантовой химии (Иваново, 1985), I международной школе-конференции молодых ученых стран-членов СЭВ по биофизике (Братислава, 1985), Российской научной конференции с участием зарубежных ученых «Математические модели нелинейных возбуждений, переноса, динамики, управления в конденсированных системах и других средах» (Тверь, 1994), Международной научной конференции «Математические модели нелинейных возбуждений, переноса, динамики, управления в конденсированных системах и других средах» (Тверь, 1996), International Symposium "Protein Structure, Stability and Folding. Fundamental and Medical Aspects" (Moscow, 1998), 3-rd International Conference on Molecular Structural Biology (Vienna, 1999).

Личный вклад автора в проведенных исследованиях. Постановка задач и их решение, создание алгоритмов и компьютерных программ, проведение расчетов, получение и интерпретация представленных в диссертации результатов принадлежат самому автору.

Публикации. По материалам диссертации опубликованы 27 статьей в отечественных и зарубежных журналах.

Объем, структура, общая характеристика диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, результатов исследования и их обсуждения, выводов, списка опубликованных по теме диссертации и цитированных работ. Объем диссертации составляет 191 стр. и включает 39 рисунков, 37 таблиц и 498 ссылок. Во введении представлены актуальность

проблемы и краткий анализ известных подходов к ее решению, цель исследования, отражена научная новизна работы. В обзоре литературы представлены успехи, достигнутые в исследованиях проблемы сворачивания белков. Раздел «результаты и обсуждение» состоит из трех частей, включающих 10 глав. В первой части рассматриваются основы гипотезы случайного клубка применительно к белкам, где внимание сосредоточено на обсуждении БВВ в белках. Для оценок БВВ в белках предлагается новая улучшенная версия расчетного метода ФФВ. Приведены результаты расчетов поверхности потенциальной энергии олигопептидов ряда аминокислот, полученные с применением метода ФФВ. Значительное место уделено результатам обработки данных о трехмерных структурах белков из банка белковых структур и анализу конформаций аминокислотных остатков встречаемых в этих структурах. Вторая часть посвящена анализу концепции посттрансляционного сворачивания белков. Результаты указывают на недостаточную обоснованность адекватности посттрансляционного подхода решению проблемы сворачивания белков. В третьей части вкратце прослежен биогенез белковой цепи от начала ее биосинтеза на рибосоме и до завершения сворачивания в разных водных компартментах клетки. Имеющиеся данные позволили обосновать, почему белки должны сворачиваться котрансляционно, и предложить возможный механизм сворачивания белков. Приведены данные, известные из литературы экспериментальные, и собственные, полученные в расчетах олигопептидов, которые поддерживают предлагаемую схему сворачивания белков.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ. Обзор занимает первые две главы работы. Первая посвящена результатам экспериментальных и теоретических исследований проблемы сворачивания белков на основе постгрансляционного подхода; приведено краткое описание популярных моделей сворачивания. Во второй главе представлены результаты исследований биосинтеза и сворачивания белков in vivo и на синтезирующих белок модельных системах, которые подтверждают котрансляционное сворачивание белков.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

В преобладающем большинстве исследованиях по выяснению механизма сворачивания белков полипептидные цепи денатурированных и новосинтезированных на рибосоме белков рассматривают как случайные неупорядоченные клубки, а процесс сворачивания представляют как спонтанный переход полипептидной цепи из этого состояния в максимально упакованную уникальную глобулярную структуру, соответствующей наименьшей свободной энергии системы полипептидная цепь и физиологическая среда. Т.е., исходным объектом считают состояние случайного клубка полипептидных цепей белков. Для выяснения того,

насколько оправдано такое рассмотрение, наши исследования над проблемой сворачивания белков мы начнем с анализа характеристик состояния случайного клубка белковой полипептидной цепи.

Случайный клубок, по определению, состояние свободносочлененной линейной полимерной цепи, в которой могут происходить свободные вращения вокруг ее единичных химических связей. Применительно к полипептидной цепи основными признаками случайного клубка считают: возможности соседних вдоль цепи аминокислотных остатков к независимым вращениям, и способности соединенных единичными связями атомных групп цепи совершать относительно свободные вращения вокруг таких связей. Т.е., свойства и признаки состояния случайного клубка полипептидной цепи связывают с БВВ, полагая, что обусловлены они малыми, незначительными величинами БВВ вокруг ее единичных химических связей.

Анализу традиционных и выяснению реалистических оценок БВВ в белках посвящена первая часть работы, состоящая из четырех глав (гл.3-6).

Часть первая. Барьеры внутреннего вращения (БВВ) в белках

Глава 3. Общепринятое представление о БВВ в белках.

Исследователи, занимающихся проблемой сворачивания белков считают,

а а

что БВВ вокруг единичных связей NC и С С главной подипептидной цепи и большинства связей боковых цепей аминокислотных остатков белков незначительны, а вращение вокруг этих связей происходит почти свободно. Предположение о незначительности БВВ в белках было сделано в 1960-е годы, из-за невозможности определить их экспериментально. Рядом авторов было предложено, что они должны быть близкими к экспериментально известным малым значениям БВВ вокруг аналогичных связей в малых органических молекулах, в частности, различных производных амидной группы (Scheraga, AdPhysOrgChem,6,103,1968; Ramachandran&Sasisekharan-ld/'ra/Cfefl!,23,283,1968). Рекомендованные

а а

значения БВВ вокруг связей NC и С С главной цепи для обеих величин составляют в среднем около 0,7 ккал/моль. Именно эти, сравнимые с кТпри нормальной температуре, значения цитируют обычно при обсуждении величины БВВ в белках (Tanford, AdProtChem,23,121,1968; Creighton, BiochJ, 270,1990; Smith etal,Fold&Des,I,R95,\9%\ Fitzkee&Rose PNAS, 101,12497, 2004; Финкелыягейн и Птицын «Физика белка» 2005). На предположении о незначительности БВВ построены и популярные модели (например, спиновое стекло, решеточные) и подходы к решению проблемы сворачивания (напр. использующие приближение случайной энергии) белков.

Глава 4. БВВ в белках значительно выше общепринятых для них значений: расчетно-теоретпческое обоснование. Как известно, достаточно точные значения БВВ можно получить квантово-химическими

ab initio методами. Расчеты поверхности потенциальной энергии (ППЭ) дипептидов методами ab initio проводятся регулярно с начала 1970-х. Что касается олигопептидов, рассчитать их методами ab initio невозможно, и поэтому нужны надежные и простые расчетные методы.

К концу 1970-х Головановым, Соболевым и Волькенштейном были разработаны новая потенциальная функция и алгоритмы с целью создания надежного расчетного метода для оценок внутри- и межмолекулярных взаимодействий молекул (ЖСХ:20,26,1981; ДАН ССС?:259,877,1981). На основе этих разработок нами был создан метод связь-связевых взаимодействий для конформационного анализа и изучения взаимодействия органических молекул (Башаров и др. 1984а-1984е). Впоследствии нами были созданы и улучшенные версии метода: метод фрагмент-фрагментных взаимодействий (ФФВ) (Башаров и др. 1989а, 19896) и модифицированный метод ФФВ (Башаров 1995а). Последняя версия метода - она представлена в главе 6 - является одним из основных результатов диссертации. Метод воспроизводит достаточно адекватно ППЭ дипептидов, полученные квантово-химическими ab initio методами (Башаров 19956, 1996), а также позволяет рассчитать ППЭ олигопептидов. При оценке величины БВВ в белках будем использовать результаты наших расчетов ППЭ ди- и олигопептидов ряда аминокислот методом ФФВ и расчетов дипептидов методами ab initio, сосредоточенных на БВВ вокруг

a a

связей NC и С С главной полипептидной цепи белков.

ППЭ дипептидов. Дипептиды глтина и станина. Карты двумерной ППЭ глицинового и аланинового дипептидов, полученные методом ФФВ, представлены на рис.2, а относительные энергии некоторых конформаций и значения барьеров перехода между ними - в табл.1. Согласно этим данным, относительные энергии популярных конформаций аминокислотных остатков в белках и барьеры перехода между ними значительны. В

частности, БВВ вокруг связи NC (C7(R)-au <f-=(k,ц/=90с} составляет не

менее 16 ккал/моль, а вокруг связи С С (C7(R)-aR; (р=-90е,у=0е) - не менее 5 ккал/моль.

Дипептиды других аминокислот. Нами были рассчитаны полные ППЭ Е (ф, % /j дипептидов серина, валина, фенилаланина и тирозина, где % - углы вращения вокруг связей боковых цепей аминокислот (Башаров 19956, 1996; неопубликованные результаты данной работы). Углы ф, ц/и варьировали в интервале от -180° до 180", ф, /// с шагом 10°, а ъ ~ 30°. Число рассмотренных конформаций каждого дипептида составило 37*37*13*п, где и число вращательных степеней боковой цепи остатка. Известны и расчеты ППЭ дипептидов ряда аминокислот методами ab initio.

Из результатов наших и ab initio расчетов следует, что ППЭ рассмотренных дипептидов в определенных конформациях их боковых радикалов мало отличаются от ППЭ дипептида аланина. Заметная разница лишь в том, что доступные области конформационного пространства

значительно сужается с увеличением размера боковых цепей. Важным из результатов является то, что БВВ вокруг связей N0" и СС рассмотренных дипептидов сравнимы с соответствующими величинами БВВ в дипептидах глицина и аланина (составляют в среднем около 16 и 6 ккал/моль;см.далее).

Рис.2. ППЭ дипептидов глицина (слева) и аланина (справа) по методу ФФВ.

Вертикальное направление представляет вращение вокруг связи С С по углу

ц/, а горизонтальное - N0 по углу (р. Крестиками обозначены минимумы. Цифры на эквипотенциальных линиях - относительная энергия в ккал/моль. Энергия областей заштрихованных параллельными линиями - от 15 до 25 ккал/моль, дважды заштрихованных - более 25 ккал/моль (Башаров 19956).

Табл.1. Относительные энергии некоторых конформаций дипептидов глицина

__и аланина (энергия в ккал/моль, углы в градусах)_

Конформация |_ Относительная энергия__

_|_Глицин__Алании

___О I из ш К ШЖШ [ч МИШ Ш т

С5 180 180 0.0 0.0 0.0 0,8 0,7 1,5 2,3 1,4 3,4

С7(Я) -90 60 1.4 1.0 3.3 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0

ак -60 -50 9.6 4.5 8.9 4,7 6,5 9,3 3,0 6,7 8,1

С7(Я)-ал -90 0 7.5 5.5 5.5 7,9 9,5 ЩГ~ 4,9 7,9

С7(Р.)-а1, 0 90 ¡9.2 16.0 21.7 ¡7.8 ¡9,7 16,0 17,2 Г

-___0_ -90______________25,5 18 24,5 "I

С7(Ь) 60 -110__________"11,9 14 ~ 11,0 Г

а(Р 60 50____ 10,6 5,0 8,4

АЬ тШо:[ I]-НШет&КоЬ80п,Лйе51о/,76,83,1979;[2]-Ре1ег8&Ре1ег507,1981;

tЗ]-Wtighl&BorkmanД^'%'sCteж,86.3856,!982;[4]-Schafer еш1 КкетРкуз, 72,1439, 1982; й-БсаксШе еШШСБ,105,3438,1983; [»]- Метод ФФВ: Башаров (19956).

ППЭ глицина и танина в олигопептидах. Нами были рассчитаны ППЭ олигопептидов глицина и аланина, от ди- до декапептида в их спиральных конформациях, а также серединного 5-го и концевого 9-го остатков в декапептидах глицина и аланина в конформациях правой «-спирали (ф-~ 60°, 1//=~4()"), близкой к вытянутой (ф^!40°, ц/=150°) и С7(ф^80°, 1//=80°).

Величины БВВ вокруг связей ЫСа и СаС исследованных нами аминокислот в олигопептидах более наглядно отражены на кривых на рис.3 и 4 соответственно. Кривые представляют, приблизительно, одномерные

профили предпочтительного пути конформационных изменений (изменения потенциальной энергии) остатков в пространстве Е (ф, цг)\ на рис.3 в зависимости от угла ф (¡7 (ф)) и на рис.4 в зависимости от угла y/{U (у/)), по всему интервалу их значений (~18(f< ф, iy < + 18(f). Эти пути проходят по двум оврагам ППЭ, по углу ф приблизительно через седловую точку ф = (Р,ц/= 9(f, и по углу ц>- ф = -9(Р, ц/ = (Р, как это видно из карт на рис.2. Кривые построены на основе ППЭ соответствующих остатков следующим образом. На рис.3 на каждой кривой величина энергии при угле

соответствует минимуму потенциальной энергии на ППЭ данного остатка в зависимости от угла у в интервале 0° <ц/ < 180° при фиксированном ф,. Аналогично, на рис.4 на каждой кривой величина энергии при % соответствует минимуму энергии на ППЭ в зависимости от угла ф в интервале -180° <ф < 0° при фиксированном щ. Таким образом, кривые на рис.3 представляют потенциальную энергию вращения вокруг связи NC", а на рис.4 - вокруг связи СаС соответствующих аминокислотных остатков в полипептидной цепи. Нулевой энергии на кривых на обоих рисунках соответствует предпочтительная конформация.

На кривых U (ф) локальному минимуму в правой части соответствует конформация левой а-спирали, а величина потенциальной энергии при максимуме с координатой ф~ 0° представляет величину БВВ вокруг связи NCa (рис.3). Аналогичным образом, на кривых U (щ) локальному минимуму в правой части соответствует конформация правой а-спирали, а величина потенциальной энергии при максимуме с координатой ц/~ 00 представляет величину БВВ вокруг связи СС (рис.4).

Общий вид карты ППЭ и расположение минимумов и седловых точек на ней, а также предпочтительные пути конформационных изменений по углам ф и ц/, описанные выше, в основном характерны также для других аминокислотных остатков, кроме пролина, в определенных конформациях их боковых радикалов. Утверждение известно из результатов расчетов ППЭ дипептидов с использованием эмпирических потенциальных функций, а также ряда не рассмотренных нами аминокислот методами ab initio.

Величины БВВ вокруг связей NC* и С"С аминокислот в дипептидах и олигопептидах, полученные в наших расчетах, представлены в таблицах в правой части рис.3 и 4. Для дипептидов приведены также величины БВВ, оцененные из имеющихся в литературе карт ППЭ, рассчитанные квантово-химическими ab initio методами.

Согласно представленным данным, БВВ вокруг связи NC в дипептидах составляет 16-22 ккал/моль, в среднем 18,5 ккад/моль, по данным квантово-химических расчетов, и 15,1 - 18,2 ккал/моль, в среднем 16,7 ккал/моль, по результатам наших расчетов (рисЗ).

-180 -120 -«0 0 <f>

Ссылка

Gly 18,2 [*}

Ala 17,6 П

Val 16,0 П

>15,<20 m

Ser 15,1 п

>15, <20 m

Phe 16,4 m

Туг 16,7 Г]

Thr >15,<20 Г31

lie >15,<20 m

(a)

n-Ala Высота барьера Г*1

2 17,6

3 16,0

4 15,4

5 15,1

6 14,8

7 14,7

8 14,5

9 14,4

10 14,4

—•— Í-Aja

■ о

—г-— М

- S-Ala

—■ 6-А1Э

- -о- - 7-Ato

—•— e-Ala

—-о— 9-Ala

■ А..... 10-Ala

•180 -120 -60 О <Р 00 120 180

(б)

Пептид Высота барьера [*

Gly9C7

Gly9al

Ala9C5

A1a9al

Gly5C7

Ala5C7

Glv5C5

A1Ó5C5

(о)

16,7 17,4 16,6 16,7 16,2 16,1 16,4 16,0

■leo -120_-ео

О «о во 120 180

Рис.3. Предпочтительные пути конформационных изменений по углу ф (Щф)) и величина БВВ вокруг связи NCa ряда аминокислот в (а)- дипептидах, (6)-олигопептидах аланина, (с)- 5-го и 9-го остатков в декапептидах Gly и Ala в конформациях С7, a (al) и С5, полученные по методу ФФВ [*].Энергия в ккал/моль. Данные ab initio дипептидов: Gly и Ala см. табл.1; [l]-Peters&Peters JMolStr,88,157, 1982; [2]-Peters&Peters /М>/«г,90,305,1982; [3]- Peters&Peters J Mo №,90,305,1982.

(ц/)) и величина БВВ вокруг связи СаС ряда аминокислот в (а)- дипептидах, (б)- олигонептидах аланина, (с)- 5-го и 9-го остатков в декапептидах Gly и Ala в конформациях С7, a (al) и С5, полученные по методу ФФВ [*].Энергия в ккал/моль. Данные аЪ initio дипептидов: Gly и Ala см. табл.1; [lJ-Peters&Peters JMolStr,88,157, 1982; [2]-Peters&Peters JMolStr,90,305,1982; [3]- Peters&Peters JMolStr,90,305,1982.

В олигопептидах глицина и аланина величина БВВ вокруг связи КС1 постепенно уменьшается с увеличением числа остатков, с 17,2 ккал/моль в дипептиде до 15 ккал/моль в пентапептиде. Она остается почти неизменной с октапептида, составляя 14,4 ккал/моль. Уменьшение барьера обусловлено малым увеличением энергии стабилизации кулоновского вклада с увеличением числа остатков. Основным составляющим барьера является энергия обменного отталкивания занятых молекулярных орбиталей. Для серединного 5-го и концевого 9-го остатков в трех избранных конформациях декапептидов глицина и аланина величина БВВ вокруг связи NC" составляет 15-16,8 ккал/моль, в среднем 16 ккал/моль.

Величина БВВ вокруг связи С"С в дипептидах составляет 5-10 ккал/моль, 7,5 ккал/моль в среднем, по данным квантово-химических расчетов, и 5,3 - 8 ккал/моль, в среднем 6,6 ккал/моль, по результатам наших расчетов (рис.4). В олигопептидах аланина величина барьера несколько уменьшается с увеличением числа остатков, с 7,4 ккал/моль в дипептиде до 5,3 ккал/моль в пентапептиде. Уменьшение барьера обусловлено уменьшением вклада электростатического отталкивания. Величина барьера остается почти неизменной с гексапептида, составляя около 5 ккал/моль. Для серединного 5-го и концевого 9-го остатков в конформациях правой а-спирали (ф^50°, ч/=-50°), близкой к С5(ф=-14(Р, ц>=150°) и С7(ф=-80°, q/=8(f) декапептидов глицина и аланина величина БВВ вокруг связи с"С составляет 5,3 - 7,8 ккал/моль, в среднем 6,5 ккал/моль. Основным составляющим барьера во всех случаях является электростатическое отталкивание.

Влияние изменения молекулярной геометрии на ППЭ пептидов. Расчеты ab initio дипептидов с оптимизацией молекулярной геометрии показывают, что как относительные энергии отдельных конформеров, так и высота барьеров между ними претерпевают заметные изменения за счет значительной деформации молекулярной геометрии (Hiller&Robson, JTheor. Biol, 1979,76,83; Head-Gordon et al,JACS, 1991,113,5989). Однако, согласно данным белковой кристаллографии и кристаллохимии (Engh&Huber, Act. Cryst. 1991 .A47.392), а также полученным нами из анализа молекулярной геометрии олигопептидов, заметные деформации в плотноуиакованной и напряженной атомной системе, какой является полипептидная цепь, приводят к недопустимому сближению валентно-несвязанных атомов.

Итоги расчетов ППЭ олигопептидов. БВВ вокруг связей NC и СС главной иепи полгтептидов. На основании представленных выше результатов мы заключаем, что величина БВВ вокруг связей NC" и С*С в полипептидной цепи белков составляет, приблизительно, около 16 ккал/моль и 6 ккал/моль соответственно. Надежность предлагаемых значений может быть оправдана надежностью методов расчета, с использованием которых они получены. Надежность широкого базиса квантово-химических ab initio методов, безусловно, вполне приемлема. Надежность метода ФФВ проверена на многочисленных органических

молекулах различного класса, а также дипептидах. Несомненно, рассчитанная величина БВВ зависит в определенной степени от геометрии молекулы - мы использовали стандартные геометрии пептидов. Предлагаемые значения БВВ вокруг связей N0" и СаС, естественно, не претендуют быть абсолютно точными, но они однозначно обозначают порядок этих величин и, по нашему мнению, близки к действительным их значениям. Они значительно выше традиционно считаемых для них общепринятых - около 0,7 ккал/моль для обеих величин.

Глава 5. БВВ в белках значительно выше предполагаемых для них традиционных значений: экспериментальное подтверждение данными о кристаллических структурах белков. Можно привести достаточно надежное косвенное экспериментальное подтверждение существования высоких барьеров в белках. Для того чтобы показать это, остановимся на

барьере вращения вокруг связи ЛГС .

Теоретические предпосылки. Обратим внимание на предпочтительные пути конформационных изменений ряда аминокислотных остатков по углу

(р при вращении вокруг связи ИС, представленные на рис.3. Назовем отрицательной конформацию остатка с отрицательным значением угла <р, и положительной с положительным значением угла <р. Из рис.3 видно, что ддя неглициновых остатков практически запрещен переход из

отрицательных конформаций в положительные через линию <¡>=±180 . В тоже время глициновый остаток может переходить через эту линию в положительную конформацию и обратно беспрепятственно. Видно также, что возможные переходы неглициновых остатков между доступными отрицательными и положительными конформациями могут осуществляться

о а

через линию д>=0 путем преодоления Л'С барьера, который по нашим оценкам составляет около 16 ккал/моль. Величина достаточно значительна и почти сопоставима с хорошо известным значением барьера между транс-и цис- конформациями пептидной связи (около 1В ккал/моль), что должна делать практически нереализуемым переход неглициновых остатков из отрицательных конформаций в положительные, если принимать во внимание тот факт, что на рибосоме полипептидная цепь наиболее вероятно синтезируется в правой а-спиральной конформаций (1лт&8ртп,1985, МВ, 188,565).

Обратим внимание и на локальный минимум потенциальной энергии в области положительных конформаций (рис.3), которому соответствует конформация левой а-спирачи. Он выше глобального минимума на ~8 ккал/моль в дипептидах, на ~4 ккал/моль в тетранептиде и на ~1 ккал/моль в декапептвде. Поэтому приобретение неглициновыми остатками этой конформаций не только затруднено кинетически из-за высоких барьеров, но и невыгодно остаткам находиться в этой конформации термодинамически, как следует из оценки по формуле Больцмана-Аррениуса.

Основываясь на представленных результатах .можно сделать следующий вывод. В структуре белка глициновые остатки могут встречаться и в отрицательных и в положительных конформациях, тогда как неглициновые остатки могут находиться лишь в отрицательных конформациях, приобретение положительных конформаций этими остатками маловероятно. Достоверность этого вывода можно проверять экспериментально, путем компьютерного анализа конформаций аминокислотных остатков встречаемых в кристаллических структурах глобулярных белков. Такой анализ нами был проведен.

Использовали данные банка о трехмерных структурах белков (PDB\ версия 1990г.). Из банка отобрази файлы, которые содержали координаты атомов расшифрованных при разрешении 2Е и лучше белковых структур (всего 185). Белки принадлежали различным классам или типам по функциональным и семейственным отношениям: транспорта электрона, транспорта кислорода, медьсодержащие, нуклеазы, токсины, флавопротеины, ферросеропротеины, иммуноглобулины, лизоцимы, кальцийсвязывающие, ингибиторы, металлогидролазы, протеиназы, лиазы, зимогены, комплексы ферментов, и др. Из файлов РОВ выбрали координаты атомов и вычислили длины валентных связей, валентные и двугранные углы для дальнейшей обработки. Обработку данных PDB и необходимые вычисления проводили с использованием собственных алгоритмов и программ.

Предварительные результаты обработки PDB. Прежде всего сравнивали полярности (знаки) конформационного угла <р неглициновых остатков и угла со пептидной связи между всеми остатками, эквивалентные в структурах различных состояний того же белка, а также в идентичных субьединицах олигомерных белков. Наиболее заметные результаты следующие.

A. В белковой структуре не приводит к изменению полярности конформации по углу q> неглициновых остатков и по углу со всех пептидных связей изменение функционального состояния (связывание лигандов, кофакторов, ингибиторов), условий кристаллизации и кристаллической формы белка, кристаллизационной среды и рН, а также мутации белка.

Б. Не меняются полярности угла ср неглициновых остатков и всех пептидных связей, эквивалентных в структурах белка выделенного из различных источников и идентичных субъединиц белка.

B. По мере увеличения разрешения и улучшения качества расшифровки, в структуре белка уменьшается число неглициновых остатков в положительной конформации.

Учитывая эти результаты, из 185 структур мы отобрази: наиболее точную структуру среди различных структур того же белка, структуру одного представителя различных лигандных, функциональных и мутантных состояний того же белка, а также белка выделенного из различных источников, структуру одной субъединицы из идентичных

субъединиц белка. Число отобранных структур для дальнейшего анализа составило 81.

Анализ распределения конформаиий аминокислотных остатков в белковых структурах. Общее число аминокислотных остатков в 81 структуре (без учета концевых остатков белковых цепей) составило 14706. В соответствии со сделанным из анализа ППЭ пептидов выводом, конформации глициновых и неглициновых остатков анализировали отдельно. Соответствующие карты распределения представлены на рис.5.

Рис.5. Карты распределения конформаций глициновых (слева) и неглициновых (справа) остатков в 81 белковой структуре (Башаров 1997).

В 81 структуре из 1371 глициновых остатков в положительной конформации находятся 798 (58,3%). Число неглициновых остатков и их относительная встречаемость в положительных конформациях в каждой структуре приведены в табл.4. Суммарное число неглициновых остатков во всех структурах составило 13335, из которых в положительных конформациях находятся 507 (3,8%). В 30-и структурах доля неглициновых остатков в положительных конформациях составляет не более 2%, в 12-и структурах - не более 1%. В семи структурах неглициновые остатки в положительной конформации не встречаются (табл.4).

Представленные данные о достаточно низкой встречаемости неглициновых остатков в положительных конформациях в белковых структурах, по нашему мнению, свидетельствуют об энергетической невыгодности этих конформаций, а также о наличии значительного БВВ

вокруг связей NC белков, и таким образом, указывают на правдоподобность сделанного нами из расчетов ППЭ пептидов вывода. Более того, детальный анализ показал, что белковые структуры, в которых в положительных конформациях относительно много неглициновых остатков, далеки от совершенства, и что координаты атомов многих из таких остатков определены плохо. Эти вопросы обсуждаются в следующих параграфах.

Белковые структуры с серьезными ошибками. Из представленных в табл.4 структур выберем те, в которых доля неглициновых остатков в положительных конформациях составляет 7,6% и более (т.е. в два и более раза больше их средней встречаемости). Таких оказалось девять: ПГОБ (разрешение 1,98Е, относительная встречаемость неглициновых остатков в

положительных конформациях 8,1%), ЗРАВ (2Е, 12,5%), 1АСХ (2Е, 9,8%), ШХВ (1,38Е, 10,9%), 3\УОЛ (1,8Е, 8,7%), П«^ (2Е, 8,5%), 25Ш (1,5Е, 13,1%), 2500 (2Е, 8,1%) и 41Х>0 (2Е, 10,9%). Их анализировали более детально.

Табл.4. Встречаемости неглициновых остатков в положительной

конформации в 81 структуре

а б в г д е а б в г Д е а б в г д е

1ЕСА 134 123 0 0.0 1 2ШВ 147 141 1 0.7 0 4ННВ 283 263 2 0.8 1

ПЮЭ 564 520 42 8.1 30 1Ш1 151 145 2 1.4 0 1НМ<3 111 106 2 1.9 1

1МВО 151 141 2 1.4 0 1ССЯ 109 98 1 1.0 0 2ССУ 125 115 2 1.7 0

ЗСУТ 101 89 0 0.0 0 2С2С 110 102 3 2.9 0 351С 80 73 1 1.4 0

2В5С 83 77 2 2.6 0 2СОУ 105 95 1 1.1 0 1АгА 127 115 3 2.6 0

1Рлг 118 110 4 3.6 1 1РСУ 97 87 0 0.0 2 4Р01 104 101 7 6.9 0

1РБХ 52 48 3 6.3 0 зюсы 50 45 2 4.4 1 1Н1Р 83 78 2 2.6 0

4РХЫ 136 122 5 4.1 0 1БХ1 145 127 5 3.9 0 1СРУ 106 98 4 4.1 0

11СВ 73 68 0 0.0 0 5ШС 159 146 2 1.4 0 1РВ4 441 401 17 4.2 3

ЗРАВ 424 392 49 12.5 2 1ЯЕ1 105 97 3 3.1 2 2ШЕ 112 99 4 4.0 0

ШБ 47 44 0 0.0 1 1РРТ 34 33 1 3.0 0 20У0 54 50 2 4.0 1

4РТ1 56 50 1 2.0 0 2С12 63 61 2 3.3 0 1АСХ 105 92 9 9.8 0

1МЫ 24 22 0 0.0 0 2ЕВХ 60 55 2 3.6 0 18ЫЗ 63 54 2 3.7 1

1№(В 60 55 6 10.9 4 2С^ 265 246 10 4.1 0 3\\Ч}А 169 127 11 8.7 0

ШВ<2 74 69 3 4.3 0 1С1Ш 44 40 0 0.0 0 2РАВ 112 105 3 2.8 0

ЮО? 172 159 9 5.7 0 2\УИР 102 97 1 1.0 0 6ЬУ2 127 115 6 5.2 0

11.21 128 117 7 6.0 0 2ШЛ 162 151 2 1.3 0 28№ 139 130 17 13.1 1

тем 122 119 1 0.8 2 120 117 10 8.5 2 11ШТ 102 90 3 3.3 2

5СРА 305 282 5 1.8 3 ЗТЪЫ 314 278 16 5.8 1 9РАР 210 182 3 1.6 1

2АЬР 196 165 4 2.4 1 2АРЯ 323 276 3 1.1 2 2АСТ 216 188 7 3.7 1

2АРР 321 281 6 2.1 2 5СНА 231 209 8 3.8 0 2С6А 243 220 7 3.2 0

ЗЯР2 222 204 8 3.9 1 ЗЕ8Т 238 213 5 2.3 0 2РКА 228 206 7 3.4 2

2РЯК 277 244 8 3.3 1 1ТОЫ 224 204 7 3.4 1 гЭбА 179 147 4 2.7 1

1ТСМ 220 195 7 3.6 0 ЮЭЕ 333 295 5 1.7 2 2САВ 254 238 4 1.7 2

2СТ5 435 402 5 1.2 0 Ю01 331 308 7 2.3 0 ШР1 180 166 3 1.8 2

2СУР 291 267 7 2.6 0 30118 459 418 12 2.9 2 ЗБРЯ 160 150 3 2.0 2

2СРР 403 378 4 1.1 3 41.00 327 303 33 10.9 0 2800 596 496 40 8.1 0

Примечание. Графы а - е обозначают соответственно: код белка в банке белковых структур, общее число аминокислотных остатков в структуре (без учета концевых), общее число неглициновых остатков, число неглициновых остатков в положительных конформациях, относительное число неглициновых остатков в положительных конформациях, количество цис-пептидных связей.

Анализ расстояний между валентно несвязанными атомами. Вычисляли эти расстояния и сравнивали их с уменьшенными на 0,5Е значениями стандартных наименьших контактных расстояний между соответствующими атомами. Межатомные расстояния, которые оказывались меньше выбранных для сравнения значений, считали аномально короткими. В результате анализа мы обнаружили 45 аномально

коротких расстояний в структуре 1HDS, 233 - FAB, 2) - 1ЛСХ, 11 -1NXB, 4 - IRNS, 92 - 2SOD, 62 - 4LDG. В структурах 2SNS и 3WGA аномально короткие межатомные расстояния обнаружено не было.

Анализ валентных связей и валентных углов. Вычисленные длины валентных связей и валентные углы главной цепи белков сравнивали с их стандартными значениями. Считали их аномальными, если валентные связи

отклонялись от стандартных более чем на 0,35Е, а углы более чем на 20 . Было выявлено в структуре 1HDS 215 аномальных валентных связей, а 1NXB и 1RNS по две. В 1IIDS 126 валентных связей главной цепи отклоняются от стандартных более чем на 0,4Е, а 42 - более чем на 0,5Е. В структуре 1HDS имеется 480 аномальных валентных углов, 2SOD - 38, 3FAB - 2, NXB - 18, RNS - 5, 4LDG - 6. В 1HDS 160 валентных углов

отклоняются от соответствующих стандартных более чем на 30, а 71 -

более чем на 40 . В 2SOD таких углов имеются соответственно 10 и 3.

Сравнение полярности угла ф эквивалентных остатков в идентичных субъединииах 1HDS и 2SOD. Анализ показал, что в четырех идентичных субъединицах 2SOD из 40 неглициновых остатков в положительных конформациях только восемь составляют эквивалентную пару, по два остатка в каждой субъедннице. В 1HDS из 45 остатков в положительных конформациях в двух идентичных парах субъединиц только четыре оказались эквивалентными (по одному остатку в каждой идентичной паре).

Цис-пептидные связи в 1HDS. Среди представленных в табл.4 структура 1HDS (гемоглобин лани) единственная, в которой в цис- конформации много пептидных связей (30). В тоже время в структуре других гемоглобинов - человека (4ННВ) и лошади (2МНВ), несмотря на высокую гомологию в первичной структуре, всего одна цис- пептидная связь.

Хиралъностъ остатков. Результаты анализа показали, что остатки Phe-33 первой, Val-112 второй и Asp-116 четвертой субъединицы 1IIDS, Arg-1, Lys-51 и Ghi-56 1NXB, как ни странно, находятся в D-изомерной форме.

Представленные выше данные свидетельствуют о наличии серьезных ошибок в структурах 1HDS, 1NXB и 2SOD. Относительно остальных шести структур можно отметить следующее. По заметкам авторов расшифровавших структуру 3FAB, она определена неточно и может содержать ошибки (Saul et al, 1978,JBiolChem,253,585). В структуре 4LDG мы обнаружили заметное количество аномально коротких межатомных расстояний и аномальных валентных углов (см. выше). Сравнение этой структуры лактатдегидрогеназы с опубликованной в литературе новой уточненной структурой показало, что . вместо 34 неглициновых остатков в положительных конформациях в старой структуре, в новой их всего 16. Структура нуклеазы 2SNS уточнена при достаточно высоком (1,54Е) разрешении и в ней неглициновых остатков в положительных конформациях 17. Таких остатков в новой структуре оказалось всего 7. При анализе литературы мы обнаружили, что структура 1RNS несовершенна также: по заметке авторов «структура лишена точности». Что касается

1АСХ, помимо указанных выше ошибок, авторы отмечают, что координаты атомов получены в промежуточном этапе уточнения.

Итак, результаты анализа девяти белковых структур, з которых относительно много неглициновых остатков в положительных конформациях, показывают, что восемь из них (ШВБ, ЗРАЗ, 1АСХ, 1МХВ, ШЫБ, 28Ы5,2800,41,00) содержат оккбкл, Эти структура мы исключили из дальнейшего анализа. Что касается дезятой структуры - 3>У0А, из И неглициновых остатков в положительных конформациях восемь ко два находятся в четырех гомологичных доменах молекулы. Таким образом, наличие в белковой структуре относительно много кеглиникоаых остатков в положительной конформации оказалось простым показателем несовершенства этой структуры. Неглвдгаовыг остатки в положительных конформациях в остальных 73 структурах анализировали также.

Отрицательные конформации негяитяовых остатков к белках. Карты распределения конформаций глициновых и неглзивновьас остагкоз в 73 структурах представлены на рис.5. Сравнивая этк карты с аналогичными картами на рис.4 для 81 структуры визуально, можно убедиться в тем, что они заметно "чистые": распределение конформацкё остатков в отдельных областях более компактное и «резкое». Доля неглкцинсзых остатков в положительных конформациях в 73 структурах составила 2,7% - 301 остатка из 11230, по сравнению с 3,а% в 81 структуре. Встречаемости каждого из 20 канонических аминокислотных остатков з положительных конформациях в 81 и 73 структурах приведена в табл.5.

щщ . 'У-. •

• •. 1 '

Рис. 5. Карты Рамачандрана глициновых (а) и неглкгияозых (5) остаткоз в 73 белковых структурах (Башароч 1997).

Далее мы анализировали каждого из 301 кеглицинезого остатка в положительной конформации отдельно, путем инспекции их молекулярной геометрии на корректность. Длины ватентных связей и валентные углы основной цепи остатков сравнивали со стандартными общепринятыми значениями соответствующих величин. Остатки., для которых рассчитанные из структурных данных наблюдаемые, значения отклонялись

о а

от стандартных более чем на 0.2Е для ватентных езязей, 7 для угла А'С С и

5 для остальных валентных углов, и пептидных связей от планарности

более чем на 15 , классифицировали как с некорректной молекулярной геометрией. Таких остатков оказалось 46. Конформация 13 других остатков, по меньшей мере, попадала в запрещенные области конформационной карты.

Табл.5. Встречаемости 20 канонических аминокислотных остатков в положительных конформациях в 81 и 73 белковых структурах

a 6 в

1 2 3 1 2 3 1 2 3

Тгр 218 1 0,46 196 0 0,0 196 0 0,0

Pro 654 4 0,61 548 2 0,36 546 0 0,0

Val 1109 12 1,08 895 5 0,56 890 0 0,0

lie 672 6 0,89 593 4 0,67 591 2 0,34

Thr 962 23 2,39 795 7 0,88 788 0 0,0

Leu 1115 26 2,33 920 12 1,30 911 3 0,33

Phe 533 8 1,50 454 7 1,54 450 3 0,67

Met 228 5 2,19 200 4 2,00 199 3 1,51

Glu 713 20 2,81 630 13 2,06 622 5 0,80

Lys 882 38 4,31 716 15 2,09 710 9 1,27

Arg 485 18 3,71 422 9 2,13 418 5 1,20

Ala 1247 41 3,29 1053 23 2,18 1039 9 0.87

Cys 365 11 3,01 315 7 2,22 311 3 0,96

Ser 1179 60 5,09 988 26 2,63 976 14 1,43

Gin 548 25 4,56 456 14 3,07 446 4 0,90

Tyr 536 22 4,10 481 16 3,33 472 7 1,48

His 375 23 6,13 281 11 3.91 276 6 2,17

Asp 801 51 6.37 689 33 4,79 675 19 2,81

Asn 716 113 15,78 596 93 15,60 551 48 8,71

X 13335 507 3.8 11233 301 2,68 11067 140 1,26

Gly 1371 798 58,20 1141 688 60,30 1141 688 60,30

Примечание, а- в 81 структуре, б- в 73 структурах, в- в 73 структурах без учета остатков, чьи координаты определены некорректно. Столбцы 1-3: общее число остатков, число остатков в положительных конформациях, относительное число остатков в положительных конформациях. неглициновые остатки суммарно.

В результате анализа литературы мы обнаружили, что координаты атомов 111 остатков определены плохо: или их не видны на карте электронной плотности, или они имеют слабую электронную плотность, или обладают высоким температурным фактором (табл.5, столбец в). Таким образом, из 301 остатка атомные координаты 170 остатков нуждаются в уточнении. Если исключить эти остатки из расчета, то относительное число неглициновых остатков в положительных конформациях составило бы 1,2%.

Представленные выше результаты, полученные нами из анализа белковых структур, по нашему мнению, являются вполне надежной

поддержкой сделанного нами из расчетов ППЭ пептидов вывода о

значительности величины барьера при вращении вокруг NC связей и о невыгодности положительных конформаций неглициновых остатков в белках.

Глава 6. Модифицированный метод фрагмецт-фрагментных взаимодействий (ФФВ) для конформационного анализа и изучения взаимодействия олигопептидов и других биоорганических молекул.

Оценка потенииалъной энергии молекул. В 1970-е гг. в работах Голованова, Соболева и Волькенштейна (ДАН СССР: 1977,236,1140; 1977,237,375; ЖСХ,1979, 20,26;М>л.биол, 1979,13,633) были высказаны соображения, которые можно было использовать для создания простого расчетного метода для конформационного анализа и изучения взаимодействия биоорганических молекул. Предполагается, что молекулы составлены из фрагментов, в качестве которых рассматриваются не атомы, а локализованные единичные связи (ЛЕС) и неподеленные электронные пары (НП). Энергия взаимодействия между двумя молекулами А и В (межмолекулярное взаимодействие - ММВ), или двумя группами А и В одной молекулы (внутримолекулярное взаимодействие - ВМВ) определяется суммарной энергией взаимодействия их фрагментов а и Ъ-Еаъ'.

= (О,

ЕаЬ оценивается по выражению: ЕаЬ = Е^,,. + Еобм отт. + Етрл,р. + Eäucn, (2). Вклады в правой части обозначают соответственно: кулоновский, обменного отталкивания, переноса заряда, дисперсионный. Они оцениваются по следующим соотношениям:

Екул. = S 4i Qj (Riß 11 ЕоЯ.шжт. ~ K¡ (S^t)2 (Rat)'3 ,

ida jeb

Епер.зар. = - [(Siao)2 + (ScaCb/j, -Edirai. = - K3 (Rah)'6 (3),

где q¡ , q¡ - заряды фрагментов а и b, Щ - расстояние между зарядовыми центрами. Бзазь - интеграл перекрывания занятых молекулярных орбиталей (МО) фрагментов а и b, S^a - интеграл перекрывания занятой МО фрагмента а со свободной МО фрагмента 6, Зсазь - интеграл перекрывания свободной МО фрагмента а с занятой МО фрагмента Ь. Иаь - расстояние между центрами дисперсионных сил фрагментов, K¡, К2, и К3- параметры.

Кулоновский вклад Е вычисляется из данных о распределении зарядов

в молекуле. Считается, что в каждой молекуле имеются положительные зарады атомов, определяемые суммой заряда ядра и заселенностью орбиталей атома, и отрицательные точечные заряды связей, расположенные на связи между атомами на расстоянии ковалентного радиуса. Величины зарядов определяются по данным электрических моментов тестовых молекул.

Дисперсионный вклад оценивается на основе формулы Лондона: Е (D) = 1.5Hah (la + Ib)'' ссааь (Raj6, по выражению f(Rah)*E(D) (4)

где Ia и 4 - потенциалы ионизации, а аа и аь - поляризуемости фрагментов а и b, Rab - расстояние между центрами фрагментов, f(Rab) - функция, медленно убывающая с расстоянием. Объединение выражений (1) - (4) дает общий вид функционала для вычисления энергии взаимодействия двух молекул А и В или двух групп А и В одной молекулы:

Елв-TLE*" II (II q,qi(Rl/l-l-51J(Rab)*Iah(Ia+hr1aaab

(Rab)'6 - K2 f(S3aai)2 +(SCaa)2] + К, Ы2 (Ratf3 (5)

Для вычисления Eas по выражению (5), необходимо: смоделировать фрагменты (единичные, двойные и сопряженные связи, НП), выбрать характеристики фрагментов, уточнить выражения для вкладов и вид функционала, определить параметры.

На основе изложенного выше алгоритма нами был создан метод связь-связевых взаимодействий (Башаров и др.1984а-1984е) и его улучшенная версия - метод ФФВ (Башаров и др. 1989а,1989б). Метод ФФВ позволил реалистически оценить ВМВ и ММВ в малых молекулах. Однако он имел по меньшей мере два серьезных недостатка: а) ВМВ и ММВ оценивались независимо с использованием двух различных наборов параметров К] и К^

б) для расчетов ВМВ был введен дополнительный параметр «смягчения» кулоновского взаимодействия НП, кратных и сопряженных связей. Кроме того, метод давал завышенные значения равновесных межмолекулярных расстояний для некоторых комплексов. Эти недостатки оставляли под сомнением применимость метода для расчетов длинных цепных молекул -в том числе и полипептидов, в силу того, что таких молекулах взаимодействие отдаленных вдоль цепи фрагментов можно рассматривать как межмолекулярное, а взаимодействие близких - как внутримолекулярное.

Модифицированный метод ФФВ. Вклады оценивали по формулам (3) -(4), энергию взаимодействия - по выражению (5). Модели фрагментов использовали те же, что и в методе ФФВ. В отличие от предыдущей версии метода, дисперсионный вклад оценили иначе. Известно, что формула Лондона дает завышенные значения энергии взаимодействия в средних расстояниях. Этот эффект учитывается медленно убывающей с расстоянием функцией f(R). В предыдущей версии метода ее мы определяли как: f(Rat) = /. если Е„ь > 4.5Е, а в расстояниях Rah < 4.5Е дисперсионный вклад считали постоянным и равным его значению при Rab=4.5E\ Е0исп = ED(Rat) = ED(Rab=4.5E). В новой версии функцию f(R) мы определяли из расчетов тестовых молекул в видc:f(Rat) = (2Rai/(Ro + Rah)/, где Ro = Rab если Rab > 4.5E, R0 = 4.5E если 2E < Rab < 4.5E, R0 = 4.5E, Rab = 2.OE если Rab < 2.0E. В предыдущей версии метода потенциал ионизации всех фрагментов мы считали одинаковым и равным 13,6эв. В новой версии каждый фрагмент имел собственный потенциал ионизации, которого мы определяли из потенциалов ионизации простых тестовых молекул. Далее нами были выбраны или определены, из расчетов тестовых

молекул, новые характеристики и параметры ЛЕС, НП, кратных и сопряженных связей: величины и распределение зарядов, расположение орбитальных центров, зарядов и дисперсионных сил. Из расчетов тестовых молекул был найден один набор параметров К и К^ для оценок как ВМВ

так и ММВ (вместо двух наборов в предыдущей версии). Подробно метод описан в диссертации и опубликован (Башаров 1995а).

Метод ФФВ и внутримолекулярное взаимодействие (ВМВ). Рассчитали БВВ и дипольные моменты значительного числа «тестовых» молекул (углеводороды насыщенные и с двойными и сопряженными связями, эфиры, альдегиды, кетоны, органические кислоты, аминокислоты, амиды, пептиды), для которых были известны экспериментальные или полученные в строгих ab initio расчетах значения соответствующих величин. Во всех рассмотренных примерах точно воспроизводятся предпочтительные и метастабильные конформащш, БВВ и дипольные моменты молекул. Некоторые результаты приведены в таблицах 6 и 7.

Метод ФФВ и межмолекулярное взаимодействие (ММВ). В расчетах мы выясняли предпочтительную конфигурацию, равновесное расстояние, энергию связывания и дипольные моменты димеров и комплексов органических молекул: неполярных, полярных и неполярных с полярными. С физико-химической точки зрения, исследованные классы комплексов интересны тем-, что они являются простыми моделями гидрофобных и гидрофильных взаимодействий в белках. Результаты расчетов комплексов мы не приводим; они представлены в диссертации в трех таблицах и опубликованы в печати (Башаров 1995а). Анализ отдельных вкладов в общую энергию показал, что предпочтительная конфигурация комплексов неполярных молекул формируется в основном за счет дисперсионного вклада. Определяющим вкладом в стабилизацию комплексов неполярных молекул с полярными, а также димеров и комплексов полярных молекул является кулоновский.

Полученные в наших расчетах результаты свидетельствуют о том, что метод ФФВ довольно хорошо воспроизводит барьеры внутреннего вращения в молекулах различных классов, предпочтительные конфигурации димеров и комплексов различных молекул и энергию их связывания. Это дает основание полагать, что данный метод может быть использован для изучения ВМВ и ММВ органических молекул, в том числе и олигопептидов.

Применение метода ФФВ к задачам молекулярной биофизики. ППЭ глииина. станина и их метиловых эфиров. Исследование ППЭ этих молекул представляет интерес в связи с тем, что аминокислоты являются «строительными блоками» полипептидных цепей, а их эфиры можно рассмотреть как простые модели заряженных аминоацил-т-РНК. Полученные в расчетах этих молекул результаты можно резюмировать следующим образом.

Таб.б. БВВ (ккал/моль) и дипольные моменты (ц дебай) насыщенных молекул

Молекула БВВ Ц

Экспер. аЬ тШо ФФВ Экспер. ФФВ

СНз -СН3 2.93 2.6-3.32 2.97

СНз -С2Н5 3.33 3.45 3.60

СНз -СН2СН2СН3 т-г 3.4± 0.4 3.58 4.13

С2Н5 - С2Н5 г-г 6.1-7.4 5.72 8.38

Д(г-г) 0.6 1.13 0.74

СН3-СН(СН3)2 3.9+0.7 - 4.53

СНз - С(СНз)з 4.5±0.2 5.40

СНз-Шг 1.96 2.13 2.19 1.33 1.62

СНз-ШСНз 3.28 3.62 3.66 1.03 1.40

СНз-ВДСНЖ 4.41 - 4.73 0.63 1.19

СНз-СН2Ш2 3.74 3.57 1.51

СНз СН2-№2т-г - 2.23 2.72 1.51

Д(т-г) 0.52 0.44 1.51

СНз-ОН 1.09 1.06 1.34 1.71 1.60

СНз - ОСНз 2.72 2.98 3.17 1.30 1.01

СНз - СН2ОН 2.84 1.54

СНзСН2-ОН т-г 1.34 1.68 1.54

Л(т-г) 0.63 0.49 1.54

СНз-СНг ОСНз 3.3 3.11 1.22

Примечание, т-г - транс-гош; Д(т-г) - разность энергий транс-гош. г-г - гош-гош.

Табл.7. БВВ (ккал/моль) в молекулах с кратными и сопряженными связями

Молекула БВВ

Экспер аЬ тШо ФФВ экспер. ФФВ

СНз-СНСН2 1.98 1.55 1.89

СНз -С(СНз)СН2 2.21 1.70 1.99

Цис- СНз -СНСНСНз 0.731 0.42 0.57

Транс- СНз -СНСНСНз 1.95 1.54 1.80

СНз-С(СН)зСНСН2 2.03 2.24

СН3-С6Н5 0.014 0.02

Орто- СП;, -С6Н4СН3 1.49 1.46

СНз -сн=о 1.16 1.09 0.93 2.69 2.12

СНз-С(СНз)К) 0.78 0.97 2.90 2.22

СНз -СНОО 1.18 1.50 1.79 2.09

СНз-С(СНз)=С=0 2.07 1.93 1.94 2.12

СНз-СН^СН, 1.64 1.90 1.74

СНз -СН=№ОН -транс 1.83 1.98 0.94

СНз-ОСНО 1.19 3.68 1.39 1.77 1.70

СН3 -СООН 0.48 1.1 0.51 1.70 1.62

СНз -СОИНг 0.15-1.16 1.14 3.4-3.9 3.76

СНз-СОЫНСНз 0.06-1.10 0.94 3.6-4.2 3.78

СН3СОКН-СН3 -.73 - -.03 0.92 3.6-3.9 3.78

СНз -ШСНО 0.1-и 0.12-0.86 0.82 3.4-3.9 3.66

Относительные энергии стабильных и предпочтительной конформаций, а также величины барьеров между этими конформациями не превышают 3 ккал/моль. Эти результаты можно отнести и к другим аминокислотам и их эфирам, поскольку у аминокислот атомы боковой группы удалены достаточно от аминной и карбоксильной группы.

Н-ж водородные связи в пептидах. Методом ФФВ нами была исследована возможность образования специфических Нл водородных связей в комплексах амидов, пептидах и белках. В образовании таких связей в качестве акцептора протона выступают ,т-связн (пептидные связи основной цепи полипептидов и сопряженные связи боковой цепи ароматических и полярных аминокислотных остатков), а донором - атомы водорода при атомах И, О и С. В исследованиях на модельных системах нами было установлено, что энергия Н-ж связей может составлять до 2,5 ккал/моль (Башаров и др. 19866,19876), и поэтому эти связи могут сыграть существенную роль в формировании и стабилизации пространственной структуры белков. На основании нашего предсказания Н-п связи были обнаружены в структуре миоглобина, а впоследствии в трехмерных структурах многих белков.

С использованием метода ФФВ нами были рассчитаны ППЭ дипептидов глицина, аланина, валина, фенилаланипа, серина и тирозина, гомологичных олигопептидов (от ди- до декапептида) глицина и аланина. Полученные результаты были представлены в главе 4.

Часть вторая. Степень адекватности посттрансляционного подхода решению проблемы сворачивания белков

Глава 7. Степень обоснованности гипотезы случайного клубка применительно к полипептидной цепи. Обычно в исследованиях по выяснению механизма сворачивания белков объектом исследования рассматривают состояние случайного клубка полипептидных цепей белков. Насколько обосновано такое рассмотрение? Выяснению этого вопроса посвящена настоящая глава работы.

Гипотеза случайного клубка и БВВ. В предыдущей части работы из

____а

расчетов ППЭ олигопептидов мы выяснили, что БВВ вокруг связей АГС и

С С главной цепи полипептидов значительны и составляют около 16 ккал/моль и 6 ккал/моль соответственно. Наличие высоких энергетических барьеров дает основание считать полипептидную цепь белка достаточно жесткоцепной макромолекулой. Понятие же «случайный клубок», как известно, используется для описания гибкоцепных линейных макромолекул, в которых возможны свободные вращения. Это понятие было применено к белкам на основании предположения о незначительности БВВ в полипептидных цепях.

Белки при денатурации не приобретают вид случайного клубка (обзор нового поколения денатуранионных экспериментов). Экспериментальной базой для рассмотрения исходным состоянием случайного клубка

полипептидных цепей в процессе сворачивания белков послужили, в основном, полученные к началу 1970-х в экспериментах денатурации результаты, согласно которым белки проявляли характеристики случайного клубка при денатурации, при этом остаточные упорядоченные структуры не наблюдались. С целью выяснения надежности этих результатов, мы провели анализ литературы по исследованию денатурации белков с использованием нового поколения точных биохимических и биофизических методов.

Анализ показал, что полученные в многочисленных экспериментах в течение около последних двух десятилетий результаты нового поколения по денатурации белков противоположны результатам классических экспериментов. Согласно новым результатам, почти все исследованные белки остаются достаточно компактными и обладают значительной остаточной вторичной и третичной структурами при любых, даже сильно денатурирующих условиях. Т.е., любое денатурированное состояние белка далеко от состояния случайного клубка. Такие результаты в частности были получены на белках фосфоглицераткиназа, иммуноглобулин-связывающий домен белка L, барстар, субтилизиновый ингибитор, цитохром с и его мутанты, рибонуклеаза А и ее S- пептид, ДНК связывающий домен 434-репрессора, FK506 связывающий белок, барназа, лизоцим, шаперонин GroEL, папаин, стафилококковая нуклеаза, химотрипсиновый игибитор-2, субтилизин, р-лактамаза, апомиоглобин, парвальбумин, а-амилаза, лактальбумин, трипсиновый ингибитор, рибонуклеаза Т1, и многие др.

Новосинтезированные белки не имеют вид случайного клубка. В посттрансляционном подходе полипептидные цепи новосинтезированных на рибосоме белков представляют как случайные клубки. Следует отметить, что такое представление не имеет экспериментальную основу или разумного объяснения. Наоборот, множественные эксперименты in vivo демонстрируют, что белки сворачиваются котрансляционно (глава 2), т.е., полипептидные цепи структурируются в процессе биосинтеза.

Глава 8. Синтетические белки и проблема сворачивания белков.

Возможность получения синтетических аналогов нативных белков путем химического синтеза традиционно считают одним из серьезных доводов в пользу посттрансляционного сворачивания белков. Она, как полагают, также отвергает котрансляционное сворачивание белков, поскольку химический синтез белковой цепи обычно проводится в противоположном к биосинтезу направлении, от С-конца к N-концу. Мы впервые провели анализ данных о химически синтезированных белках. Результаты позволили нам дать достаточно адекватное объяснение - почему в экспериментах удавалось получить синтетические аналоги белков, вкратце следующим образом.

Приобретение химически синтезированной полипептидной цепью, обладающей идентичной с нативным белком ковалентной структурой,

особой конформации для проявления специфической биологической функции, происходит благодаря ярко выраженным особенностям вторичной и третичной структуры наливного белка. Проявление этих особенностей химически синтезированными полипептидными цепями происходит лишь при тщательном подборе для каждого индивидуального белка особых методик и благоприятствующих условий в экспериментах для того, чтобы воспроизвести желаемое известное заранее свойство нативного белка; иначе генерировать функциональную конформацию для химически синтезированных иолнпептидных цепей было невозможно. Возможность получения синтетических аналогов нативных белков, по нашему мнению, лишь подтверждает, что имеется взаимосвязь между первичной структурой и нативной конформацией белка и вряд ли свидетельствует о посттрансляционном сворачивании белков.

Глава 9. Эксперименты деиатурацпи-рснатурации и проблема сворачивания белков. Денатурация и физические свойства белков. Эксперименты по денатурации и ренатурации традиционно используют как удобный способ для выяснения механизма сворачивания белков. Обычно эти эксперименты проводятся следующим образом. Объектом для исследования используют нативный белок. Сначала внешним воздействием (химические реагенты, температура, рН и др.) нарушают наливную конформацию - белок денатурируют. Далее воздействие убирают и следят за восстанавливаемостью той же исходной нативной структуры белковой молекулы во времени. Такой прием - обычный способ изучения физических свойств исследуемого объекта (твердых тел, полимеров и составляющих их молекул), таких, как упругость, эластичность, гибкость, деформация и т.д. Способность макромолекулы к конформационным изменениям тоже является важным се физическим свойством. С этой позиции можно оценивать и процесс денатурации-ренатурации белков. При денатурации белок претерпевает конформационные изменения под внешним воздействием, преодолевая энергетические барьеры по вращательным степеням свободы. Глубина денатурации (степень нарушения нативной структуры) белка, очевидно, может зависеть как от гибкости (жесткости) самой полипептидной цепи, так и от характера и величины внешнего воздействия. Зависимость конформационных изменений белка от величины внешнего воздействия может быть представлена следующим образом. Если структурно-функциональные характеристики белка не претерпевают заметных изменений под воздействием внешней силы, то имеет место устойчивость (стабильность) -одно из важных физических свойств нативной структуры. В терминах конформации молекул это может означать, что полипептидная цепь пе преодолевает барьеры по вращательным степеням свободы, а совершает крутильные колебания в пределах соответствующих нативной конформации потенциальных ям. Далее, с увеличением внешнего воздействия белок начинает денатурировать, преодолевая энергетические

барьеры по вращательным степеням свободы, и переходить в отличное от нативного конформационное состояние. При этом могут проявиться, в зависимости от величины внешнего воздействия, свойства эластичности и невозвратной денатурации - другие физические характеристики белка. Показателем того или иного свойства может служить время спонтанной релаксации белка из денатурированного в нативное состояние после удаления денатурирующего воздействия. Область эластичности нативной структуры может быть идентифицирована "биологически приемлемым" релаксационным временем, протяженность которого составляет, допустим, до нескольких минут в лучшем случае. Если нативная конформация белка не восстанавливается за это время, значит, белок переведен в область необратимой денатурации. Проявление всех трех типов свойств белками в экспериментах по денатурации и ренатурации, известно, явление обычное.

Основываясь иа вышеизложенном обсуждении и принимая во внимание результаты нового поколения кинетических экспериментов, о том, что почти все белки при любых денатурирующих условиях обладают значительной остаточной вторичной и компактной структурами (глава 7), нет запрещающих причин для следующего предположения. Структурированные элементы, которые наблюдаются в белках при их денатурации, вполне возможно, служат центрами ренатурации, от которых начинается восстановление исходной нативной структуры денатурированного белка. Мы полагаем также, что спонтанная ренатурация проявление физических свойств белков и вряд ли имеет тесное отношение к фундаментальной проблеме сворачивания белков in vivo. Как нам представляется, в исследованиях денатурации-ренатурации белков имеют дело с изучением их физических свойств (гибкость, жесткость, эластичность, стабильность, и др.) или характеристик (спиральность, компактность, вращательный радиус, температура плавления, и др.) белков в зависимости от внешнего воздействия (химические реагенты, рН, температура, давление и т.д.).

Времена ренатурации денатурированных и in vivo сворачивания белков. Считается, что ренатурация денатурированного белка и сворачивание того же белка in vivo происходят за одинаковое время, которое сравнимо со временем биосинтеза полипептидной цепи. Это мнение, однако, и противоречивое и неверное. Прежде всего, тем, что, согласно посттрансляционной концепции, полипептидная цепь начинает сворачиваться после синтеза и полного выхода из рибосомы. Поэтому нет никакой взаимосвязи между временами биосинтеза полипептидной цепи на рибосоме и сворачиванием этой цепи вне рибосомы. Процессы биосинтеза и сворачивания различны по своей природе: первый - это сопряженный химический и требующий энергию механохимический, тогда как второй -спонтанный физический. Оба процесса происходят независимо друг от друга и в различных местах, разделенных расстоянием между пептидилтрансферазным центром и местом выхода цепи из рибосомы (70 -100Е), по меньшей мере. Биосинтез белка занимает время, равное

произведению среднего периода элонгации цепи на один аминокислотных остаток (около 0,1 с/остаток) на число остатков в среднем. О времени же сворачивания белков достоверно известно лишь то, что белки проявляют активность сразу после выхода из рибосомы и даже раньше. Что же касается быстрого спонтанного восстановления нативного состояния денатурированных белков в ренатурационных экспериментах, это явление нерядовое. Во многих случаях регенерировать нативной конформации белков после денатурации задача достаточно проблематичная.

-4

Белки сворачиваются, как традиционно считают, за времена 10 с - 10

с, а вторичные и компактные структуры в белках, как известно,

-4 -2

формируются за времена 10 с - 10 с. В то время как наблюдаемое время для наращивания полипептидной цепи на один аминокислотный остаток рибосомой составляет в среднем 0,1с (см. третью часть). Из сравнения этих масштабов следует, что времена формирования вторичных структур и компактных состояний в полипептидной цепи, а также предполагаемые времена для сворачивания белков в целом, меньше времени изменения химической структуры полипептидной цепи на один аминокислотный остаток при биосинтезе. Именно поэтому мы считаем, что достаточно проблематично выяснить механизм формирования нативной конформации белка в исследованиях, которые используют целые белки или полноценной длины полипептидные цепи белков, как это делают в экспериментах по денатурацни-ренатурации. Как было отмечено выше, полипептидные цепи денатурированных и ново синтезированных белков не имеют вид случайного клубка. Поэтому не имеет твердую основу утверждение, что полипептидная цепь сворачиваться в нативную структуру из этого состояния, а процесс сворачивания белка может быть представлен как перехода «клубок - глобула».

Степень обоснованности термодинамической гипотезы для белков. Эта гипотеза является одной из основополагающих посттрансляционного подхода к сворачиванию белков. Она была выдвинута на основе полученных к началу 1970-х экспериментальных результатов, согласно которым белки приобретали вид случайного клубка при денатурации (гипотеза о случайном клубке) и восстанавливали исходное нативное состояние спонтанно после удаления денатурирующего воздействия (принцип спонтанности самоорганизации нативной конформации). Однако согласно результатам нового поколения экспериментов (глава 7), денатурированные белки не приобретают вид случайного клубка, а обладают значительной остаточной вторичной и компактной структурой. Кроме того, спонтанная ренатурация денатурированных белков событие, скорее исключение, нежели правило; необходимы значительные усилия для ренатурации белка в экспериментах.

В последние годы появляется все большее число данных, которые свидетельствуют о том, что функционально активное состояние многих белков не является наиболее стабильным термодинамически (Вакег&А§аг(1,

ß/oc/jem:1994,33,7505; Thomas etaI,TIBS:\995,20,456; Baker, NatStrBiol -.1998,5,1021; Berkenpas etal,EMBO J: 1995,14,2969; Sohl etal,Nature: 1998,392,817). Объяснением этих наблюдений может быть то, что из-за высоких энергетических барьеров молекула белка может находиться в кинетически стабильном и термодинамически метастабильном состоянии, соответствующей нативному белку, достаточно долго, не имея возможности приобрести соответствующую глобальному минимуму свободной энергии конформацию. Высокие энергетические барьеры в полипептидной цепи, как мы установили (глава 4), имеет место.

Заключение. Посттрансляционная концепция сворачивания белков базируется на двух гипотезах (статистический клубок и термодинамическая) и двух утверждениях (что процесс фолдинга белка может быть представлен как перехода клубок - глобула, и что ренатурация может служить удобной моделью фолдинга), выдвинутых на основе старых экспериментальных данных. В данной части работы мы пытались представить достаточно надежную базу, которая наводит легкое сомнение на надежность этой базы и теоретической основы посггрансляционной концепции, ее полную адекватность решению проблемы сворачивания белков.

Часть третья. Котрансляционное постепенное сворачивание белков

Результаты множественных экспериментов in vivo и на модельных системах свидетельствуют о котрансляционном, во время биосинтеза сворачивании белков (введение, глава 1). Принимая во внимание эти результаты, а также представленный во второй части анализ степени адекватности посттрансляционного подхода решению проблемы сворачивания белков, мы пытались найти обоснование, почему белки должны сворачиваться котрансляционно и выяснить возможный механизм процесса сворачивания на этой основе. Чтобы решить эти задачи, мы полагали, что необходимо проследить биогенез белков от начала их биосинтеза на рибосоме и до завершения сворачивания. При этом учитывать следующие, по меньшей мере, факторы: 1) механизм, способ и скорость импорта полипептидных цепей из рибосомы в цитоплазму для сворачивания, 2) возможные изменения в химической структуре -аминокислотной последовательности - и пространственной структуре полипептидной цепи, которые она может претерпевать в цитоплазме с начала выхода из рибосомы и до завершения сворачивания, 3) силы, обуславливающие сворачивание белков, 4) времена сворачивания белков и белковых фрагментов.

Глава 10. Сворачивание белка около рибосомы. Почему белки должны сворачиваться котрансляционно? Как известно, белковая цепь строится в пептидилтрансферазном центре рибосомы с N-конца, по одному аминокислотному остатку. Синтезируемая цепь продвигается далее по

узкому рибосомному каналу и котранслядионно выходит из рибосомы в цитоплазму (рис.6).

Известно, что рибосомный канал заполнен водой, а его стенки обладают редгезивным свойством, - полипептидная цепь не прилипает к стенкам канала. Установлены размеры канала, которые составляют, по разным данным, по длине 50 - 100Е, и в диаметре 15 - 28Е. Известно также, что полипептидная цепь продвигается по каналу и выходит из него без резких изгибов в развернутом виде.

Рис.6. Схематическое представление синтезирующей полипептид рибосомы. (А)- узнающий антикодон участок, (Р)-пептидилтрансферазный центр, (Ех)-место выхода цепи из рибосомы. (Адаптирован из: Спирин, «Молекулярная биология» том I (1986).)

Обратим внимание на скорость выхода полипептидной цепи из рибосомы, т.е. скорость элонгации цепи на рибосоме. Средние скорости элонгации полипептидных цепей различных белков определены в разных клетках и при различных условиях в многочисленных экспериментах in vivo и на модельных системах. Определены также абсолютные скорости трансляции отдельных кодонов м-РНК в E.coli. Наибольшая скорость составила 21,6 кодонов/с, следовательно, наименьшее время для трансляции одного кодона - 0,046 секунды. Учитывая это значение, можно даже предполагать, что наименьший период трансляции кодонов -периодичность поступления остатков в цитоплазму, не быстрее 0,01 с/остаток (т.е., меньше наименьшего наблюдаемого периода почти в пять раз). Справедливость нашего предположения обоснована (Basharov,2003). Можно посмотреть и цитированные там литературу, где обсуждается взаимосвязь скорости и надежности трансляции м-РНК на рибосоме, а также принимать во внимание данные о том, что в водной среде максимальная скорость питаемого нуклеозид-трифосфатом клеточного

мотора не быстрее 10 /сек (Vale,1996, JCellBioh 135,291; Kinosita et al, 1998, Cell: 93,21).

Далее сосредоточимся на данных о временах сворачивания белков и белковых фрагментов. Хорошо известно, что характеристические времена

-12 -7

конформационных изменений молекул составляет 10 - 10 с, «-спирали и

-7 -4

/?-листы в полипептидах формируются за 10 - 10 с (Eigen,1968,ChimPhys:

-5 -2

65,53), а компактные состояния за 10 - 10 с (Eaton et а/,1997,CurrOpinStrBiol:l,10). Сворачивание малых однодоменных белков,

-4 -2

как полагают, происходит 10 - 10 с (Ptitsyn, 1991,FEBS l.eit,285,176; Sosnick

е/а/,1997,РЛ'/15:94,8545). Белки сворачиваются очень быстро также /и vivo (Kolb et al, JBC.21S, 16597).

При сопоставлении представленных выше временных масштабов становится очевидным, что формирование вторичных структур и компактных состояний в полипептидной цепи происходит быстрее изменения ее химической структуры на один аминокислотный остаток при биосинтезе. Даже сама нагтивная конформация белка может формироваться быстрее по сравнению с самым коротким периодом элонгации полипептидной цепи на один остаток на рибосоме. Поэтому, пока очередной любой остаток присоединяется к полипептидной цепи в пептидилтрансферазном центре, в выступающем из рибосомы N-концевом сегменте цепи могут формироваться и a-спирали, и р-листы, и компактные состояния, и какая-нибудь определенная пространственная структура самого сегмента Именно этот простой и очевидный вывод, по нашему мнению, является надежным обоснованием того, почему белки должны сворачиваться в процессе биосинтеза полипептидной цепи на рибосоме -котрансляционно.

Примерный механизм сворачивания белков: котрансляционное постепенное формирование нашивной конформаиии. Как было отмечено выше: а) аминокислотные остатки синтезируемой полипептидной цепн поступают из рибосомы в цитоплазму для сворачивания с N-концевого, последовательно друг за другом и постепенно с периодичностью не быстрее 0,01с; б) времена сворачивания белковых фрагментов и белков .меньше этого времени. Опираясь лишь на эти данные, и учитывая наблюдения, о том, что рибосома и синтезируемая полипептидная цепь не образуют ассоциаты ни при синтезе цепи и ни после его завершения, можно сформулировать следующую простую и вполне очевидную примерную схему процесса сворачивания белка в непосредственной близости рибосомы.

- Сворачивание белка начинается с момента выхода первого N-концевого аминокислотного остатка полипептидной цепи из рибосомы в цитоплазму, продолжается во время трансляции цепи и завершается после выхода из рибосомы С-концевого последнего остатка.

- Сворачивание белка происходит последовательными этапами, по мере транслокации остатков цепи из рибосомы. На каждом этапе формируется определенная структура N-концевого сегмента цепи, выступающего из рибосомы, причем вторичная и третичная структуры сегмента формируются одновременно и вместе. Число и последовательность этапов процесса аналогичны тем, что и событий трансляции при биосинтезе цепи.

- Элементы вторичной структуры (а-сгшрали, /?-листы, повороты), сформированные на каждом этапе, могут разрушаться, изменяться или оставаться неизменными на следующем этапе, после удлинения сегмента на очередной аминокислотный остаток.

- На всех этапах процесса формирование структуры N-концзвон части цепи, а также на последнем этапе - нативной структуры белка, происходит

не дольше 0,01с. Общее время процесса сворачивания белка имеет такой же порядок, что и суммарное время синтеза цепи на рибосоме.

Предлагаемая нами модель схематически представлена в левой части рис.1, на примере полностью а-спирального белка апомиоглобина, где зафиксированы четыре стадии сворачивания синтезируемого на рибосоме полипептида во времени. Отметим, что при формулировке модели мы полагали, что область поверхности рибосомы, возле которой полипептидная цепь сворачивается, составлена из полярных аминокислотных остатков и сильно гидратирована. Предположение поддерживается данными о кристаллической структуре рибосомы и наблюдениями о том, что рибосома и синтезируемая полипептидная цепь не образуют ассоциаты во время синтеза цепи до его завершения. Гидратный слой, по-видимому, экранирует (явление, скорее, сильно выраженное в клеточной биологии), синтезируемую и сворачивающуюся цепь от взаимодействия с рибосомой.

Анализ известных моделей о возможном механизме сворачивания белков. В данном параграфе диссертации представлен анализ известных моделей о возможном механизме котрансляционного сворачивания белков и указаны их недостатки. Результаты анализа опубликованы (Башаров 20006).

Глава 11. Сворачивание белка в компартмеитах клетки отдаленпых от рибосомы. Полипептидиые цепи многих белков транслируются в отдаленные от рибосомы различные водные компартменты клеток и сворачиваются там. Ими являются в прокариотических клетках периплазма, а в клетках эукариот, в частности, -матрикс и межмембранное пространство митохондрий, строма, межмембранное пространство и тилакоидный люмен хлоропласт, люмен зндоплазматического ретикулуума (ЭР), матрикс пероксисом. Для того, чтобы выяснить процесс сворачивания белков в этом случае, проследим, как и в случае сворачивания белка около рибосомы, судьбу белковых цепей в компартменте, с момента поступления туда и до завершения сворачивания, учитывая при этом механизм, способ и скорость импорта цепи, возможные изменения, которые может она претерпевать, а также силы обуславливающие сворачивание и времена сворачивания белков и белковых фрагментов.

Полипептидные цепи предшественников белков пересекают одну или несколько мембран, чтобы попасть в компартменты сворачивания. (Пути транспорта определяет расположенный впереди Ы- конца цепи прекурсор, состоящий из одного или нескольких расщепляемых сигнальных пептидов.) Цепи поступают в компартмент через узкий гидрофильный белковый канал в мембране диаметром 20 - 26Е. Канал является частью системы импорта белков, транслокона. Все транслоконы сильно похожи (рис.7). Они состоят из нескольких мембрано-встроенных, -причаленных или -ассоциированных гетероолигомерных белков, которые формируют четыре функционально

разные системы: узнавания и примачивания сигнального пептида, проводящий белок узкий гидрофильный трансмембранный канал, узнавания и процессинга сигнальной последовательности, транслокационный мотор.

Транслокация полипептидных цепей в различные компартментьт сворачивания происходит по одинаковому механизму. Предшественники полипептиды импортируются в компартменты в развернутом виде Ы-концом (рис.7). Сигнальный пептид отщепляется сигнальной пептидазой котранслокационно, как только 1^-конец цепи поступает в компартмент. Любая другая реакция процессинга полипептидной цепи в компартменте происходит котранслокационно также (напр., гликозилирование остатков А.т в люмене ЭР). Импорт полипептидов в компартмент осуществляется посредством транслокационного мотора, за счет энергии АТФ или ГТФ.

Рис.7. Система и механизм импорта полипептидов в митохондрии (а) и хлоропласта (б) (Haucke&Schatz, 1997, TICB, 7,103), бактерии (E.coli) и эукариот (S.cerevisiae) (Pohlschroder et al, 1997,Cell,91,563). Импорт белков из цитоплазмы осуществляется транслоконом внешней (ОМ) и внутренней (IM) мембран митохондрий (Tom, Tim) и хлоропласта (Oep/lap, 1ер/1ар). По мере синтеза пробелки могут ассоциировать в цитоплазме с шаперонами (Hsp70. MSF), которые доставляют их к рецепторным белкам на внешней мембране. SRP- сигнал-узнаюшая частица. SecYEG и Sec61 формируют проводящий белок канал в мембране. Hsp70, mHsp70, sHsplOO, SecA, Kar2 -транслокационные моторы.

Итак, согласно известным данным молекулярной клеточной биологии, изложенным выше вкратце, транслокация полипептидных цепей белков в отдаленные от рибосомы компартменты клетки происходит определенным, одинаковым как из рибосомы, образом. Цепи поступают в эти компартменты N-концом в развернутом виде из узкого белкового канала в мембране, как из канала рибосомы в цитоплазму (рис.8).

Выясним теперь скорость транслокации полипептидных цепей через мембрану в компартменты, которая почти не исследована. Представляется разумным, если предположим, что транслокация цепей через мембраны осуществляется при скоростях не быстрее высокой скорости элонгации полипептидной цепи на рибосоме, т.е. с периодичностью 0,01 с/остаток (см. предыдущий §). Предположение справедливо в случае котрансляционной

транслокации полипептидной цепи в люмен ЭР, по меньшей мере, т.е. когда рибосома причалена к мембране ЭР и непосредственно синтезирует цепь прямо в люмен через транслокационный канал мембраны (рис.8б).

Рис.8. Полипептвдные цепи поступают в различные компартменты из узкого канала рибосомы (а) или транслокона в мембране (Ь, с) и сворачиваются там во время транслокации, ко- (а, Ь), или посттрансляционно (с) (Basharov. 2003).

Предположение поддерживается оценочными экспериментальными

данными: от 20 до 30 остатков переходит через мембрану E.coli в

периплазму за время от нескольких сек. до одной мин. (Economou

eta/, 1995,Се//: 83,1171), максимальный период транслокации цепи через

внутреннюю мембрану митохондрий посредством транслокона -0,7

с/остаток (Schwartz & Matouschek, 1999,Л\'Л5':96,13086). Предположение

оправдано, если учесть уже упомянутые данные о том, что в водной среде

максимальная скорость клеточного мотора не быстрее ! 0 /сек, я тем, что рибосома и транслоконы обладают общими структурно-функциональными особенностями в части выполнения транслокационных функций. Рибосома сама является транслокационной машиной и состоит из тех же функциональных элементов, что и транслоконы, за исключением системы процессинга сигнального пептида.

Вышеизложенное обсуждение можно резюмировать так. Для сворачивания, импорт аминокислотных остатков полипептидных цепей из транслоконов в мембране в отдаленные от рибосомы компартменты и из рибосомы в цитоплазму происходит одинаковым образом: направленно N-концевым, последовательно и постепенно с периодичностью не быстрее 0,01секунды. Таким образом, сворачивание белка в отдаленных от рибосомы водных компартментах также может произойти согласно предложенной выше схеме сворачивания белка возле рибосомы, с единственной разницей, что термин «рибосома» следует заменить на «транслокон».

Глава 12. Поддерживающие предлагаемый механизм сворачивания белков данные. Здесь мы приводим ряд известных экспериментальных

данных и некоторые результаты наших расчетов, которые, по нашему мнению, поддерживают предложенную нами модель сворачивания белков.

Основу предлагаемой модели составляет три важных положения. Первое: субстратный полипептид не образует ассоциат с рибосомой при биосинтезе и транслоконом при транслокации через мембраны, а также при сворачивании, т.е., транслокационный комплекс или рибосома в сворачивании белка не участвует. Второе: за время поступления каждого очередного аминокислотного остатка в компартмент (не меньше 0,01с), формируется определенная структура N-концевого сегмента цепи, находящегося в компартменте. И третье: сформированная на каждом этапе структура динамична - она может измениться с изменением химической структуры цепи по мере постепенного роста Все три положения достаточно очевидны.

Первое положение экспериментальный факт, установленный клеточными биологами (Nissen etal,2000,Science:2S9,920; Kramer eíal,2001, IntJBioch&CellBiol, 33,541). В этой связи мы обращаем особое внимание на экранирующую роль гндратного слоя вблизи полярной белковой поверхности, около которой сворачивается белок. Второе положение хорошо известные данные о временах формирования вторичных и компактных структур в полипептидной цепи. Оно подтверждается также результатами экспериментов in vivo, согласно которым белки проявляют активность сразу после выхода из рибосомы, или даже пока продолжается синтез полипептидной цепи.

Что касается третьего положения о динамическом изменении конформации цепи по мере ее удлинения в каждом цикле элонгации, оно, прежде всего, очевидно из природы физических сил, вызывающих сворачивание белков. Изменение химической структуры полипептидной цепи при ее росте по одному аминокислотному остатку, обуславливает дополнительные взаимодействия нового остатка с остальными и молекулами среды. Подтверждающие это положение некоторые данные приведены ниже.

Динамичность конформации в зависимости от длины полипептидной цепи. Экспериментальная поддержка модели. Конформационный анализ десяти различной длины фрагментов полипептидной цепи химотрипсинового ингибитора (ХИ2; 64 остатков) проведен методами КД, ЯМР и др. (Prat Gay et al,\995a,JMolBiol.254,96S; l995b,PNAS,92,3683). Нативная структура ХИ2 составлена из одной a-спирали (остатки 12-24), шести /Ншстов (3-5, 8-11, 28-34, 45-51, 55-58, 60-64) и четырех /^-поворотов (5-8,25-28, 35-42,52-54). Фрагменты состояли из 5 (ХИ2-5), 13 (ХИ2-13), 25 (ХИ2-25), 28 (ХИ2-28), 40 (ХИ2-40), 50 (ХИ2-50), 53 (ХИ2-53), 60 (ХИ2-60), 62 (ХИ2-62) и 63 (ХИ2-63) N-концевых остатков. Пептиды ХИ2-5 и ХИ2-13 проявляют признаки /^-поворота, тогда как в нативиом белке остатки 1-13 образуют два ß-листа и один поворот. Пептиды ХИ2-25 и ХИ2-28 неупорядоченно компактны, тогда как в нативном ХИ2 остатки 12 -

24 образуют стабильную а-спираль. Пептид ХИ2-40 обладает компактной структурой с гидрофобным кластером, а ХИ2-49 компактнее, но натишюоподобпые взаимодействия в них отсутствуют. Фрагмент ХИ2-53 обладает хорошо сформированным мини ядром, а ХИ2-60 свернут сильнее и более компактен. В формировании нативноподобной структуры ХИ2 определяющую роль играют пять С-конпевых остатков. Эти результаты свидетельствуют о том, что пространственная структура цепи ХИ2 при ее постепенном удлинении динамична - вторичная и третичная структуры полипептида постепенно меняются по мере его роста.

В исследованиях зависимости структуры семи фрагментов барназы от длины биофизическими методами установлено, что вторичная и третичная структуры фрагментов формируются вместе и динамичны: компактность неуклонно растет в фрагментах с длиной от 22 до 68 остатков по мере удлинения цени, потом резко падает в фрагменте с длиной 79 остатков, а затем снова растет (Кека&РегеЬ!, 1999, М!о1Шо1:287,421).

Результаты исследований зависимости структуры Ы-концевых фрагментов апомиоглобина с длиной 36,77 и 119 остатков представлены на рис. 9, где также приведены известные схемы сворачивания этого белка.

Uf**todU HMapoMb MX«KUb м*

ЬфгарДе WvMoniwd«« taking Ьмп»«»* Ц^ЮС*

•раМв 1-эв «аИ>1.77 ieo4*it-119 Г J щ

Рис.9. Схемы сворачивания апо-Мб. а- ренатурация из денатурированного состояния (Jennings &Wright,1993, Sci:262,892; ЯМР); b- гипотетический механизм на основе посттрансляционного подхода: цепь имеет вид случайного клубка пока не синтезирована полностью; с- другой гипотетический механизм: вторичная структура формируется по мере синтеза соответствующего сегмента цепи;

d- механизм, предложенный на основе ЯМР исследований (Chow etа!., 2003).

Основной вывод этих исследований такой же, как и в случае с белком ХИ-2: вторичная и третичная структуры динамичны и значительно меняются с удлинением цепи. Содержание элементов вторичной структуры исследованных фрагментов и нативного апомиоглобина приведены в табл.8. Сравнивая данные соответствующих столбцов панелей and рис.9 и табл.8 можно убедиться и в том, что пути формирования пространственной структуры апомиоглобина из денатурированного мочевиной состояния и при постепенном росте его полипептидной цепи отличаются кардинально.

Таблица 8. Содержание элементов вторичной структуры в апомиоглобине _(апо-Мб) и его фрагментах _

Фрагмент апо-Мб Содержание элементов (в долях)

ар p + t гс

(1-36) апо-Мб 0.04 0.40 0.62 0.34

(1-77) апо-Мб 0.16 0.29 0.51 0.33

(1 - 119) апо-Мб 0.30 0.18 0.40 0.30

(1-153) апо-Мб (нативный) 0.50 0.04 0.28 0.21

Примечание. Символы а, Д p+t и гс соответственно обозначают: «-спирали, Д-листы, Д-листы плюс Д-повороты, неупорядоченные структуры (random coil).

Зависимость стабильности спиральных конформаиий олигопептидов от длины иепи. Динамическое изменение конформации полипептидной цепи в зависимости от ее длины следует из наших расчетов ППЭ олигопептидов глицина и аланина методом ФФВ. В качестве примера в табл.9 приведены относительные энергии двух конформеров последовательных олигопептидов этих аминокислот. Конформеры соответствуют популярным конформациям: полностью вытянутой С} (<р----±180', у±18(f) которая, как считают, наиболее удобно представляет конформацию статистического клубка, и а-спиральной (tp=-6(P, \j/=-4(f).

Таблица 9. Относительные энергии двух конформаиий олигопептидов глицина и аланина с длиной от двух до десяти остатков (в ккал/моль)

п- гептид Gly Ala

C5(r=180o,v=180o ) а(<р=-60°,у=-40°) С5(Г=180>=180°) а((Г-60°,\р-40°)

ЛЕ пол. ДЕкул. ДЕ пол. ДЕкул. ДЕ пол. ДЕ кул. ДЕ пол. ДЕкул.

2 0,8 0,8 6,7 6,4 3,9 0,0 6,7 6,4

3 0,6 0,6 5,2 5,2 3,8 0,4 5,7 5,1

4 0,7 0,6 3,8 4,0 3,8 0,4 4,1 4,0

5 0,6 0,6 2,9 3,4 3,8 0,3 3,1 3,1

6 0,6 0,6 2,3 2,9 3,8 0,3 3,1 3,3

7 0,6 0,6 1,8 2,3 3,8 0,3 2,4 2,7

8 0,6 0,6 1,4 2,0 3,8 0,3 1,4 2,0

9 0,6 0,6 1,1 1,7 3,8 0,3 1,1 1,8

10 0,6 0,6 0,9 1,5 3,8 0,3 0,9 1,6

В таблице приведены также величины кулоновского вклада в общую потенциальную энергию. Из представленных в табл.9 данных следует, что в олигопептидах аланина от дипептида до пентапептида предпочтительной является полностью вытянутая Сз конформация, а начиная с пентапептида предпочтительной становится а-спиральная. В дипептиде глицина а-спиральная конформация невыраженная, энергия ее стабилизации растет с увеличением числа остатков, с 6,7 ккал/моль в дипептиде до 0,6 ккал/моль в

декапептиде, и судя по тенденции, она становится предпочтительной начиная с одиннадцати пептида.

Заключение. Изменение химической структуры полипептидной цепи белка на один аминокислотный остаток при биосинтезе происходит на порядки медленнее формирования элементов вторичной структуры и компактных состояний в развернутой цепи, а также предполагаемого для сворачивания белков времени. Именно поэтому белки должны сворачиваться котрансляционно, в процессе биосинтеза. Сворачивание белка динамический процесс формирования пространственной структуры постепенно удлиняющегося с М-конца полипептида, происходящий последовательными этапами по мере его роста - изменения химической структуры, в процессе биосинтеза первичной структуры. На каждом этапе этого процесса, протяженность которого не дольше 0,01 сек, формируются, одновременно и сопряженно, вторичная и третичная структуры синтезированного М-концевого сегмента, которые могут изменяться на следующем этапе, а на последнем этапе - нативной структуры полной нативной последовательности полипептидной цепи белка.

Основные быводы

I. Впервые проведено фундаментальное исследование по выяснению реалистических оценок барьеров внутреннего вращения (БВВ) вокруг связей ЫС и С С главной цепи полипептидов.

1. Разработан новый полуэмпирический расчетный метод для конформационного анализа и изучения взаимодействия олигопептидов и других органических молекул - модифицированный метод фрагмент-фрагментных взаимодействий (ФФВ). Показано, что метод позволяет получить реалистические данные о структуре, конформациях, барьерах внутреннего вращения и дипольных моментах широкого класса органических молекул, предпочтительные структуры, стабильные конфигурации, энергии взаимодействия и дипольные моменты димеров и комплексов таких молекул, исследовать структуру, конформации и поверхности потенциальной энергии аминокислот и их дипептидов.

2. Расчетами методом ФФВ полной поверхности потенциальной энергии аминокислот глицина и аланина и их метиловых эфиров, - как простые модели аминоацил-т-РНК, установленол что относительные энергии предпочтительной и равновесных конформаций аминокислот и величины потенциальных барьеров между этими конформациями составляют не более 3 и 5 ккал/моль соответственно.

3. Расчетами комплексов амидов и пептидов методом ФФВ установлено, что в белках возможны образования специфических //-/т водородных связей с энергией стабилизации до 2,5 ккал/моль, которые могут сыграть существенную роль в формировании и стабилизации пространственной

структуры белков; наличие таких связей в структурах белков было обнаружено впоследствии кристаллографами.

4. Впервые даны реалистические оценки барьеров внутреннего вращения вокруг связей ЫС и СС главной цепи полипептидов. Исследованиями методом ФФВ полной поверхности потенциальной энергии ряда олигопептидов (глицина и аланина от ди- до декапептида, дипептидов серина, валина, фенилаланина и тирозина, серединного пятого и концевого девятого остатков в декапептвдах глицина и аланина) установлено, что барьер вращения вокруг связей КС составляет около 16 ккал/моль - что сопоставимо с транс-цис барьером пептидной связи, и вокруг связей С С - около 6 ккал/моль. Эти величины значительно выше общепринятых традиционных значений около 0,7 ккал/моль для обоих барьеров.

5. Из-за высоких барьеров вращения вокруг связей КС и СС в белках аминокислотные остатки обладают ограниченной способностью к конформационным изменениям, и возможностью находиться лишь в нескольких дискретных конформациях. Маловероятно, что неглициновые остатки могут приобрести конформацию с положительным значением угла

вращения <р вокруг связи КС из-за высоких барьеров вращения вокруг

связей КС , так как синтез белка на рибосоме происходит в конформации правой о-спирали. Стабильность нативной структуры и способности к ренатурации белков, избирательное каталитическое действие ферментов, а также эффективность сворачивания белков, скорее всего, обусловлены высокими потенциальными барьерами вращения вокруг связей А1С и СС полипептидной цепи.

6. Установлено, - из анализа данных банка белковых структур о кристаллических структурах белков (РОВ), что изменение функционального состояния, условий кристаллизации, кристаллизационной среды, кристаллической формы, а также мутации белка не приводит к изменению полярности конформации по углу <р неглициновых остатков. В наилучшим образом расшифрованных белковых структурах неглициновые остатки в положительных конформациях встречаются редко. Наличие в структуре белка заметного числа неглициновых остатков в положительной конформации указывает на присутствие локальных неточностей в расшифровке структуры, что может служить простым критерием оценки качества при расшифровке структуры белков традиционными методами рентгеновской кристаллографии и ЯМР. Эти результаты надежное косвенное экспериментальное подтверждение наличия достаточно высокого БВВ вокруг связей КС в белках, на основе которых также может быть создан новый вычислительный подход для дополнительного уточнения белковой структуры.

II Полипептидная цепь белка вряд ли может приобрести состояние случайного клубка из-за высоких БВВ вокруг связей КС и СС так как понятие «случайный клубок» приемлемо, по определению, для

свободносочлененных линейных макромолекул, в которых возможны свободные вращения. Белки не приобретают вид случайного клубка в сильно денатурирующих условиях в отличие от традиционных представлений, а обладают значительной упорядоченной структурой -общая закономерность, выявленная из систематизации результатов нового поколения точных экспериментов по денатурации белков. Вследствие этих данных, по-видимому, является недостаточно обоснованным представление процесса сворачивания белка как переход клубок - глобула.

III. Сравнительный анализ известных данных биофизики, физической химии и клеточной биологии в области протеомики свидетельствует о том, что удлинение белковой цепи на один аминокислотный остаток при биосинтезе происходит на порядки медленнее формирования элементов вторичной структуры и компактных состояний в развернутом полипсптидс и предполагаемого для сворачивания белков времени. На этом основании, белки должны сворачиваться в процессе биосинтеза - котрансляциошго - в соответствии со следующей схемой. Сворачивание белка происходит последовательными этапами, по мере выхода аминокислотных остатков синтезируемой полипептидной цепи из рибосомы. На каждом этапе формируется конкретная конформация N-концевой части цепи, выступающей из рибосомы, которая может измениться на следующем этапе. На всех этапах процесса, формирование структуры N-концевой части, а на последнем этапе - нативной конформации белка происходит по времени не более 0,01 секунды. Предложенный механизм подтверждается рядом биофизических экспериментов, а его универсальность - данными клеточной биологии.

Список основных публикаций

1. Башаров М.А., Волькенштейн М.В., Голованов И.Б., Ермаков Г.Л., Научитель В.В., Соболев В.М. (1984а). Связь-связевые взаимодействия. I. Простое соотношение для оценок связь-связевого взаимодействия. Ж. структ. химии 25, N1, 31-35,

2. Башаров М.А., Волькенштейн М.В., Голованов И.Б., Соболев В.М. (19846). Связь-связевые взаимодействия. II. Барьеры внутреннего вращения в насыщенных органических молекулах. Ж. структ. химии 25, N1,36-41.

3. Башаров М.А., Волькенштейн М.В., Голованов И.Б., Соболев В.М. (1984в). Связь-связевые взаимодействия. III. Барьеры внутреннего вращения в ненасыщенных углеводородах. Ж. структ. химии 25, N2,3-8.

4. Башаров М.А., Волькенштейн М.В., Голованов И.Б., Ермаков Г.Л., Соболев В.М. (1984г). Связь-связевые взаимодействия. IV. Барьеры внутреннего вращения в альдегидах, кетонах, сложных эфирах, органических кислотах, амидах и аминокислотах. Ж. структ. химии 25, N2, 9-13.

5. Башаров М.А., Волькенштейн М.В., Голованов И.Б., Ермаков Г.Л., Научитель В.В., Соболев В.М. (1984д). Связь-связевые взаимодействия. V.

Димеры молекул водорода и углеводородов различных классов. Ж. структ. химии 25, N3,17-22.

6. Башаров М.А., Волькенштейн М.В., Голованов И.Б., Научитель В.В., Соболев В.М. (1986а). Роль электростатических взаимодействий в стабилизации а-спиралей пептидов. Дога. АН СССР 286,1261-1264.

7. Башаров М.А., Волькенштейн М.В., Голованов И.Б., Лазарев Ю.А., Соболев В.М. (19866). Ня-связи в амидах и пептидах. Докл. АН СССР 287, 211-215.

8. Башаров М.А., Волькенштейн М.В., Голованов И.Б., Гренадер А.К., Ермаков Г.Л. (1986в). Конформационный анализ и корреляционное соотношение структура-активность некоторых потенциально активных антиаритмиков лидокаинового ряда. Биофизика 31, 741-746.

9. Башаров М.А., Волькенштейн М.В., Голованов И.Б., Научитель ВВ, Соболев В.М. (1987а). Стабильность а-спиральной структуры олигопептидов. Молекулярная биология 21,743-749.

10. Башаров М.А., Волькенштейн М.В., Голованов И.Б., Научитель В.В., Соболев В.М. (19876). Роль Нл-водородных связей в стабилизации спиральных структур олигопептидов. Молекулярная биология 21, 13391345.

11. Башаров М.А., Волькенштейн М.В., Голованов И.Б., Научитель В.В., Соболев В.М. (1987в). Роль Нзг-водородных связей и электростатических взаимодействий в стабилизации различных структур пептидов. В сб: Межмолекулярное взаимодействие и конформации молекул. Ред. Петропавлов H.H., Зоркий П.М., Пущино, 96-104.

12. Башаров М.А., Волькенштейн М.В., Голованов И.Б. (1988). Влияние боковых радикалов на структуру пептидов. Поверхности потенциальной энергии модельных дипептидов аланина и фенилаланина. Молекулярная биология 22,1217-1225.

13. Башаров М.А., Волькенштейн М.В., Голованов И.Б., Научитель В.В., Соболев В.М. (1989а). Метод фрагмент-фрагментных взаимодействий. 1. Краткое описание и документация метода для оценок межмолекулярных взаимодействий. Ж. обшей химии 59, 489-502.

14. Башаров М.А., Волькенштейн М.В., Голованов И.Б., Научитель В.В., Соболев В.М. (19896). Метод фрагмент-фрагментных взаимодействий. II. Оценки внутримолекулярных взаимодействий. Ж. обшей химии 59,503-512.

15. Башаров М.А. (1990). Некоторый взгляд на формирование пространственной структуры белков. Молекулярная биология 24,1274-1282.

16. Башаров М.А. (1995а). Модифицированный метод фрагмент-фрагментных взаимодействий для изучения внутри- и межмолекулярных взаимодействий. Журнал физической химии 69,1422-1426.

17. Башаров М.А. (19956). Поверхности потенциальной энергии пептидов и конформации аминокислотных остатков в белках. Предварительные результаты обработки банка белковых структур. Биофизика 40,260-273.

18. Башаров М.А. (1996). Роль стартовой конформации в формировании пространственной структуры белка. Отрицательные конформации

неглициновых остатков в белковых структурах. Докл.Лтд.наук 348, 115118.

19. Башаров М.А. (1997а). Распределение конформаций аминокислотных остатков, встречающихся в трехмерных структурах белков. Анализ неглициновых остатков, находящихся в "положительных" конформациях. Биофизика 42, 753-764.

20. Башаров М.А. (19976). Роль шаперонинов в сворачивании белков. Новая модель архитектуры строения GroEL/GroES комплекса. Биохимия 62, 489-498,

21. Башаров М.А. (2000а). Концепция посттрансляционного сворачивания белков: насколько она реалистична? Биохимия 65,1400-1408.

22. Башаров М.А. (20006). Котрансляционное сворачивание белков. Биохимия 65,1639-1644.

23. Башаров М.А. (2002). Имеют ли синтетические белки отношение к проблеме сворачивания белков? Биофизика 47,989-995.

24. Basharov, М.А. (2002). Protein folding: Chemically synthesized proteins. In: Recent Research Developments in Protein Folding, Stability and Design. M. Gromiha, S. Selveraj, Eds. (Research Signpost, Trivandrum, India), pp. 167-175.

25. Basharov, M.A. (2003). Protein folding. J. Cell. Mol. Med. 7,223-237.

26. Basharov, M.A., Allakhverdiev, S.I. (2008). Expedience of protein folding modeling during progressive elongation of polypeptide chain. The Open Struct.Biology J. 2, 31-32.

27. Basharov, M.A. (2008). Protein folding: Requirement for simulations on the basis of sequential growth of polypeptides. Biochemistry: An Indian J. 2,63-65.

Принято в печать 17.11.2009. Заказ № 18. Тираж 80 экз.

ООО «Фотон-век» ИНН 5039008988 г.Пущино, Московская область. (916) 982-18-60 (4967) 73-94-32 beornot@r ambler, ru http://photon-vek. narod. ru

Содержание диссертации, доктора физико-математических наук, Башаров, Махмуд Ашыг-оглы

Введение

Обзор литературы

Глава 1. Концепция посттрансляционного сворачивания белков

1.1. Экспериментальное обоснование концепции

1.2. Теоретическая основа концепции

1.2.1. Гипотеза случайного клубка

1.2.2. Термодинамическая гипотеза

1.2.3. Сворачивание белка как переход клубок — глобула

1.3. Экспериментальное исследование проблемы сворачивания белков

1.3.1. Расплавленная глобула и ее предшественник

1.3.2. Феноменологичекие модели сворачивания белков

1.4. Теоретическое моделирование белковой структуры

1.4.1. Эмпирические модели предсказания белковой структуры

1.4.2. Аналитические модели фолдинга

1.4.2.1. Простые эмпирические потенциалы. Потенциальная энергия полипептидной цепи. Силовые поля

1.4.2.2. Приближение случайной энергии и эффективные потенциалы. Решеточные модели белка

1.4.3. Учет влияния растворителя

1.5. Парадокс Левинталя

Глава 2. Концепция котрансляционного сворачивания белков 30 Заключение

Результаты и обсуждения

Часть первая. Барьеры внутреннего вращения (БВВ) в белках

Введение: Проблема сворачивания белка и БВВ

Глава 3. Традиционное представление о БВВ в белках

3.1. Общепринятые величины БВВ в белках

3.2. Оценка величины БВВ в белках с использованием эмпирических потенциальных функций

Выводы

Глава 4. БВВ вокруг связей NCа и СаС в белках значительно выше общепринятых для них значений: расчетно-теоретическое обоснование

4.1. Введение

4.2. Поверхности потенциальной энергии (ППЭ) дппептидов

4.2.1. Дипептиды глицина и аланина

4.2.2. Дипептиды ряда других аминокислот

4.3. Особенности ППЭ глицина и аланина в олигопептидах

4.3.1. ППЭ олигопептидов глицина и аланина

4.3.2. ППЭ 5-го и 9-го остатков в декапептидах глицина и аданина

4.4. Влияние изменения молекулярной геометрии на ППЭ олигипептидов

4.5. Итоги расчетов ППЭ олигопептидов. БВВ вокруг связей NCa и СаС главной цепи полипептидов

4.6. Выводы

4.7. Рисунки и таблицы

Глава 5.* БВВ в белках значительно выше предполагаемых для них традиционных значений. Экспериментальное подтверждение данными о кристаллических структурах белков косвенно

5.1. Теоретические предпосылки

5.2. Предварительные результаты обработки банка белковых структур

5.3. Анализ распределения конформаций аминокислот в белках

5.4. Белковые структуры с серезными ошибками

5.5.Отрицательные конформации неглициловых остатков в белках

Выводы

Введение Диссертация по биологии, на тему "Теоретическое исследование барьеров внутреннего вращения и механизма сворачивания белков"

Более полвека назад в экспериментах по изучению физико-химических и биологических свойств белков было обнаружено, что некоторые белки при определенных условиях проявляют свойство ренатурации — при удалении денатурирующего воздействия после денатурации восстанавливают свое исходное функционально-активное состояние, значит и нативную пространственную структуру (Neurath et al., 1944; Anson, 1945; Lumry & Eyring, 1954). Несколько позднее, на основании результатов экспериментов по исследованию денатурации и ренатурации рибонуклеазы А, демонстрирующие обратимость процесса денатурации, было выдвинуто предположение о том, что вся необходимая информация для установления нативной вторичной и третичной структуры белка находится в его первичной структуре — аминокислотной последовательности полипептидной цепи (White, Jr., 1961). Это предположение вскоре стало одной из центральных аксиом молекулярной биологии, автором которой считают Анфинсена, ссылаясь на его известную, представляющую Нобелевскую лекцию, работу ''Principles that govern the folding of protein chains" (Anfinsen, 1973).

В цитированной работе Анфинсеном была постулирована очень обнадеживающая в перспективе знаменитая термодинамическая гипотеза, согласно которой нативной конформации белка соответствует наименьшая свободная энергия Гиббса системы полипептидная цепь и физиологическая среда После выхода в свет работы Анфинсена в 1973 году, выяснение того, как сворачиваются белки и каким образом они делают это быстро и надежно, т.е. механизма сворачивания белка, стало одной из актуальных проблем молекулярной физико-химической биологии.

Считается, что понимание механизма сворачивания белков необходимо для решения на молекулярном уровне многих фундаментальных и практических задач биологии, медицины, биотехнологии. Важнейшими среди них являются: предсказание и разработка методов предсказания пространственной структуры белков и пептидов на основе известной первичной структуры, изучение влияния специфических мутационных изменений на пространственную структуру белков и активности ферментов, создание мутантных белков со специфическими характеристиками и искусственных белков с заданными свойствами, разработка и создание новых физиологически активных пептидов, выяснение механизмов болезней, вызванных неправильным сворачиванием белков, такие как болезни Альцгеймера, Паркинсона, Кройесфельда-Якобса.

Для решения проблемы сворачивания белка обычно исходят из двух концепций, двух разных подходов. Согласно одной концепции, нативная конформация белка формируется котрансляционно - в процессе биосинтеза полипептидной цепи на рибосоме по мере выхода из нее. Концепция обосновывалась тем, что биосинтез цепи на рибосоме происходит с ее N-конца к С-концу направленно (рис.1).

Рис.1. Ко- (слева) и посттрансляционное (справа) сворачивание белков То, что белки сворачивается котрансляционно, подтверждается результатами многочисленных экспериментов in vivo. Согласно этим результатам, полипептидные цепи белков будучи еще связанные с рибосомой: проявляют ферментативную активность присущие готовым белкам, связывают конформационные антитела готовых белков, формируют правильные, которые имеются в нативном белке, внутри- и межцепные дисульфидные связи, связывают лиганды или кофакторы, необходимые для выполнения белками свойственных им функций, формируют защищенные о г ферментативного расщепления компактные структуры. Однако неизвестно, как могут сворачиваться белки котрансляционно.

Другой подход к выяснению механизма сворачивания белков предполагает, что нативная конформация белка формируется посттрансляционно - после синтеза и полного выхода полипептидной цепи из рибосомы из состояния случайного клубка рис.1). Подход был основан на базе результатов двух типов in vitro экспериментов, полученных к началу 1970-х. Один тип - эксперименты по денатурации-ренатурации белков, по результатам которых многие денатурированные малые, глобулярные белки быстро восстанавливали натпвную структуру спонтанно после удаления денатурирующего воздействия. Результаты другого типа экспериментов связаны с получением синтетических аналогов ряда нативных белков путем химической сшивки аминокислот с использованием метода Меррифилда твердофазного синтеза,, в частности, рибонуклеазы-А, лизоцима, инсулина человека, цитохрома С. ,

Учитывая упомянутые выше результаты двух типов in vitro экспериментов, была сформулирована и теоретическая основа концепции посттрансляционного сворачивания белков в 1970-е годы в виде двух гипотез и пару утверждений. Одна гипотеза - гипотеза случайного клубка (random coil), согласно которой полипептидные цепи денатурированных и новосинтезированных на рибосоме белков 4 представляются как случайные статистические клубки. Другая гипотеза - уже упомянутая термодинамическая. Утверждается, что процесс сворачивания белка может быть представлен как переход «клубок - глобула», и что формирование нативной конформации белка in vivo и при ренатурации из денатурированного состояния (называют сворачиванием in vitro) происходят по одинаковому механизму и из состояния случайного клубка.

Опираясь на перечисленные выше гипотезы и утверждения a priori, в течение около последних лет сорока почти все теоретические и экспериментальные исследования по выяснению механизма сворачивания белков проводятся на основе посттрансляционного подхода. При этом широко используют эксперименты по денатурации и ренатурации белков и различные теоретические подходы, в частности, основанные на соображениях статистической механики, как удобные in vitro модели. В результате интенсивных исследований были предложены ряд феноменологических моделей механизма сворачивания белков (такие как каркасная, диффузионное столкновение, нуклеационное коллапсирование, и др.), а также разные теории и модели для описания, как самих белков, так и процесса их сворачивания. Была открыта расплавленная глобула - преднативное метастабильное компактное структурное состояние белка. Однако выяснить механизм сворачивания белков на основе посттрансляционного подхода не удается до сих пор.

Важным фундаментальным вопросом на пути решения проблемы сворачивания белка является выяснение того, каким образом белки сворачиваются быстро, поскольку число доступных полипептидной цепи дискретных конформаций астрономическое, и потребовалось бы астрономическое время, чтобы цепь приобрела единственную, соответствующую нативному белку конформацию путем перебора всевозможных вариантов. Тем не менее, белки сворачиваются и это они делают очень быстро, что является парадоксом, известным как парадокс Левинталя.

Итак, решение проблемы сворачивания белков требует ответить на обозначенные выше три фундаментальных вопроса: 1) сворачиваются ли белки ко-или посттрансляционно, т.е. в процессе, или после синтеза полипептидной цепи на рибосоме, 2) каков механизм сворачивания белков, и 3) каково объяснение быстрого сворачивания белков?

Одной из основных целей при выяснении механизма сворачивания белков является предсказание нативной пространственной структуры белков по их известной первичной структуре - аминокислотной последовательности. Она формируется в результате конформационных превращений полипептидной цепи, под воздействием внутри- и межмолекулярных сил взаимодействия аминокислотных 5 остатков цепи друг с другом и с молекулами среды. В результате цепь приобретает нативную конформацию, преодолевая различные энергетические барьеры по углам вращения ф и цг вокруг связей NC" и СаС главной цепи и по углам х вокруг связей боковых цепей аминокислотных остатков. Движущей силой сворачивания белка является спонтанное стремление системы полипептидная цепь и вода (основная компонента физиологической среды) к уменьшению свободной энергии стабилизации (свободная энергия Гиббса). Она может быть записана в виде

AGCma6 ~ А Нцепь - Т А5цепь + Д&гидрат (*) где АНцепь- энтальпия (связывающая энергия), AS,,ct,b- энтропия и AGei„)pam - свободная энергия гидратации (сольватации) цепи, Т- температура в абсолютной шкале.

Предложены различные рецепты и формулы для вычисления каждого из входящих в выражение (*) вкладов, а также эмпирические модели, учитывающие гидратацию полипептидной цепи. Эти рецепты, однако, все еще достаточно далеки от совершенства. В частности, давно известно, что функционалы используюемые для оценок энтальпиппого вклада - внутри- и межмолекулярных взаимодействий, построенные на основе атом-атомных потенциалов невалентного взаимодействия типа "6-ехр" Букингема или "6-12" Леннарда-Джонса и торсионных потенциалов, страдают от очевидных серьезных недостатков (Scheraga, 1968; Каплан и Родимова 1978; Pullman, 1980; Vasquez et al., 1994). Поэтому на пути решения проблемы сворачивания белков является актуальным создание простых и надежных расчетных методов для реалистической оценки внутри- и межмолекулярных взаимодействий полипептидов, и время от времени в литературе предлагаются новые потенциальные функции или модифицированные варианты существующих потенциалов.

Па основании изложенного выше, целью данной диссертационной работы являлась исследование проблемы сворачивания белков с использованием расчетно-теоретических и аналитических подходов. Работа посвящена следующим фундаментальным вопросам проблемы:

- Создание надежного расчетного метода для оценок внутри- и межмолекулярных взаимодействий (энтальпии) полипептидов и других биоорганических молекул;

- Создание алгоритмов и вычислительных программ для: построения'молекулярной модели олигопептидов, расчетов поверхности потенциальной энергии (ППЭ) олигопептидов и отдельных аминокислотных остатков в них, обработки данных банка белковых структур и вычисления конформации полипептидных цепей из атомных координат белков, статистического анализа конформации аминокислотных остатков в трехмерных структурах белков, построения конформационных карт;

- Расчетно-теоретическое исследование ППЭ олигопептидов аминокислот и оценки величины барьеров внутреннего вращения вокруг связей NCa и СаС главной цепи полипептидов с использованием созданного метода и роли этих барьеров в изучении проблемы сворачивания белков;

- Выяснение степени адекватности двух посттрансляционного и котрансляционного подходов для решения проблемы сворачивания белков, обоснование одного из них;

- Выяснение возможного механизма процесса сворачивания белков, предявление потверждающих предложенный) схему данных.

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, результатов исследования и их обсуждения, основных выводов и списка опубликованных по теме и цитированных 498 работ. Во введении представлены актуальность проблемы, цель и задачи исследования. В обзоре литературы, состоящим из двух глав, представлены успехи, достигнутые в исследованиях проблемы сворачивания белков. Раздел «результаты исследований и обсуждение» состоит из трех частей, включающих 10 глав. В первой части основное внимание сосредоточено на оценке барьеров внутреннего вращения (БВВ) в белках. Предлагается новый расчетный метод для конформационного анализа и изчения взаимодействия полипептидов и других органических молекул - модифицированный метод фрагмент-фрагментных взаимодействий (ФФВ). Приведены результаты расчетов поверхности потенциальной энергии дипептидов и олигопептидов ряда аминокислот, полученные с применением метода ФФВ. Даны оценки величины БВВ вокруг связей NCa и СаС полипептидной цепи белков. Значительное место уделено анализу трехмерных структур белков из банка белков и конформаций аминокислотных остатков встречаемых в этих структурах. Вторая часть посвящена анализу подхода посттрансляционного сворачивания белков. На основе результатов делается вывод о неполной адекватности данного подхода решению проблемы сворачивания белков. В третьей части диссертации прослежен биогенез белковой цепи вкратце от начала биосинтеза на рибосоме до завершения сворачивания в водных компартментах клетки. Имеющиеся данные о структуре рибосомы, особенностях биосинтеза полипептидных цепей, временах. биосинтеза и сворачивания белков позволили обосновать, почему белки должны сворачиваться» котрансляционно и предложить возможный механизм сворачивания белков на этой основе. Приведены данные; экспериментальные - известные из литературы, и собственные - полученные в расчетах олигопептидов, которые поддерживают предлагаемую схему сворачивания белков.

Заключение Диссертация по теме "Биофизика", Башаров, Махмуд Ашыг-оглы

Основные результаты и выводы

Разработан надежный полуэмпирический расчетный метод для конформационного анализа и изучения взаимодействия полипептидов и других органических молекул - метод фрагмент-фрагментных взаимодействий (ФФВ).

С использованием метода ФФВ установлено:

Относительные энергии предпочтительной и стабильных конформаций аминокислот и величины барьеров между этими конформациями не превышают 3 ккал/моль.

В белках возможны образования специфических, Н-я водородных связей с энергией стабилизации до 2,5 ккал/моль. Эти связи могут сыграть существенную роль в формировании и стабилизации пространственной структуры белков.

Величины барьеров внутреннего вращения (БВВ) вокруг связей NC и СС по диэдральиым углам (р и ц/ основной цепи полипептндов, которые традиционно считаются незначительными и сравнимы с кТпри комнатной температуре (в среднем около 0,7 ккал/моль для обеих величин), достаточно высокие. БВВ вокруг связей NC составляет около 16 ккал/моль, что сопоставимо с транс-цис барьером пептидной связи, а вокруг связей СС - около 6 ккал/моль.

Наличие высоких БВВ вокруг связей NC полипептидов подтверждается данными о кристаллических структурах белков косвенно, следующими результатами анализа данных банка белковых структур (PDB):

В наилучшим образом расшифрованной структуре белка доля неглициновых остатков в положительных - с положительным значением угла (р - конформациях и пептидных связей в цис-конформации составляет менее 2 процентов. В структуре многих белков не встречаются пеглнциновые остатки в положительной и пептидные связи в цис- конформации.

Изменение функционального состояния, условий кристаллизации, кристаллизационной среды, кристаллической формы, а также мутационные изменения белка не приводят к изменению в его пространственной структуре полярности (знака) угла вращения (р вокруг связи NCa неглициновых остатков, а также угла со всех пептидных связей.

Наличие в структуре белка заметного числа неглициновых остатков в положительной конформации указывает на возможные локальные ошибки в ней. Это может служить простым критерием оценки качества расшифрованной структуры и может быть использовано в процедурах уточнения структуры белка методами структурного анализа.

Из-за высоких БВВ вокруг связей NC и СС аминокислотные остатки в белках обладают ограниченной способностью к конформационным изменениям и возможностью находиться лишь' в нескольких дискретных конформациях. Стабильность нативной структуры и способность к ренатурации белков, избирательное каталитическое действие ферментов и выполнение белками свойственных им функций, а также эффективное сворачивание белков, более вероятно, обусловлены наличием высоких БВВ вокруг связей NC и СС полипептидной цепи.

Из-за высоких БВВ вокруг связей NC и СС полипептидные цепи белков вряд ли могут приобрести состояние случайного клубка, так как по определению в этом состоянии вращения вокруг связей NC и СС должны быть свободными. Поэтому, и по причине того, что белки в сильно денатурирующих условиях не денатурируют полностью, а обладают остаточной упорядоченной структурой, возникает сомнение в твердой обоснованности постатрансляционного подхода к решению проблемы сворачивания белков.

Удлинение белковой цепи на один аминокислотный остаток при биосинтезе происходит на порядки медленнее формирования элементов вторичной структуры и компактных состояний в развернутой полипептидной цепи, о чем свидетельствует сравнительный анализ известных данных. На этом основании и учитывая известные данные о том, что рибосома и синтезируемая полипептидная цепь не образуют ассоциат, белки должны сворачиваться котрансляционно в соответствии со следующей схемой. Сворачивание белка происходит последовательными этапами, по мере поступления аминокислотных остатков полипептидной цепи из рибосомы в цитоплазму. На каждом этапе формируется конкретная конформация N-концевой части цепи, выступающей из рибосомы, которая может измениться на следующем этапе. На всех этапах процесса, формирование структуры N-концевой части, а также на последнем этапе нативной конформации белка происходит за времена не больше 0,01 секунды.

Список опубликованных по теме диссертации основных работ

1. Башаров М.А., Волькенштейн М.В., Голованов И.Б., Ермаков Г.Л., Научитель В.В., Соболев В.М. (1984а). Связь-евязевые взаимодействия. I. Простое соотношение для оценок связь-связевого взаимодействия. Ж. структ. химии 25, N1, 31-35.

5. Башаров М.А., Волькенштейн М.В., Голованов И.Б., Ермаков Г.Л., Научитель В.В., Соболев В.М. (1984д). Связь-связевые взаимодействия. V. Димеры молекул водорода и углеводородов различных классов. Ж. структ. химии 25, N3,17-22.

6. Башаров М.А., Волькенштейн М.В., Голованов И.Б., Научитель В.В., Соболев В.М. (1986а). Роль электростатических взаимодействий в стабилизации а-спиралей пептидов. Докл. АН СССР 286, 1261 -1264.

7. Башаров М.А., Волькенштейн М.В., Голованов И.Б., Лазарев Ю.А., Соболев В.М. (19866) Ня-связи в амидах и пептидах. Докл. АН СССР 287, 211-215.

8. Башаров М.А., Волькенштейн М.В., Голованов И.Б., Гренадер А.К., Ермаков Г.Л. (1986в). Конформационный анализ и корреляционное соотношение структура — активность некоторых потенциально активных антиаритмиков лидокаинового ряда. Биофизика 31, 741-746.

9. Башаров М.А., Волькенштейн М.В., Голованов И.Б., Научитель В.В., Соболев В.М. (1987а). Стабильность а-спиральной структуры олигопептидов. Молекулярная биология 21, 743-749.

10. Башаров М.А., Волькенштейн М.В., Голованов И.Б., Научитель В.В., Соболев В.М. (19876). Роль Нтс-водородных связей в стабилизации спиральных структур олигопептидов. Молекулярная биология 21, 1339-1345.

11. Башаров М.А., Волькенштейн М.В., Голованов И.Б., Научитель В.В., Соболев В.М. (1987в). Роль Ня-водородных связей и электростатических взаимодействий в стабилизации различных структур пептидов. В сб: Межмолекулярное взаимодействие и конформации молекул. Ред. Петропавлов И.Н., Зоркий П.М., Пущино, 96-104.

13. Башаров М.А., Волькенштейн М.В., Голованов И.Б., Научитель В.В., Соболев В.М. (1989а). Метод фрагмент-фрагментных взаимодействий. I. Краткое описание и документация метода для оценок межмолекулярных взаимодействий. Ж. обшей химии 59,489-502.

18. Башаров М.А. (1996). Роль стартовой конформации в формировании пространственной структуры белка. Отрицательные конформации неглициновых остатков в белковых структурах. Докл. Акад. наук 348, 115-118.

19. Башаров М.А. (19976). Роль шаперонинов в сворачивании белков. Новая модель архитектуры строения GroEL/GroES комплекса. Биохимия 62, 489-498.

20. Башаров М.А. (1997а). Распределение конформаций аминокислотных остатков, встречающихся в трехмерных структурах белков. Анализ неглициновых остатков, находящихся в "положительных" конформациях. Биофизика 42, 753-764.

21. Башаров М.А. (2000). Концепция посттрансляционного сворачивания белков: насколько она реалистична? Биохимия 65, 1400-1408.

22. Башаров М.А. (2000). Котрансляционное сворачивание белков. Биохимия 65, 1639-1644.

23. Башаров М.А. (2002). Имеют ли синтетические белки отношение к проблеме сворачивания белков? Биофизика 47, 989-995.

24. Basharov, М.А. (2002). Protein folding: Chemically synthesized proteins. In: Recent Research Developments in Protein Folding, Stability and Design, M. Gromiha, S. Selveraj, Eds. (Research Signpost, Trivandrmn, India), pp. 167-175.

25. Basharov, M.A. (2003). Protein folding. J. Cell. Mol. Med. 7, 223-237.

26. Basharov, M.A., Allakhverdiev, S.I. (2008). Expedience of protein folding modeling during progressive elongation of polypeptide chain. The Open Struct. Biology J. 2, 31-32.

27. Basharov, M.A. (2008). Protein folding: Requirement for simulations on the basis of sequential growth of polypeptides. Biochemistry: An Indian J. 2, 63-65.

Заключение

Представленные в этой заключительной, третьей части работы данные и соображения можно резюмировать следующим образом.

Изменение химической структуры полипептидной цепи белка на один аминокислотный остаток при биосинтезе происходит по времени (составляет не менее 0,01с; наблюдаемое при наиболее благоприятных условиях минимальное время 0,046с) медленнее формирования элементов вторичной структуры (составляет

П Л с <1

10 - 10' с) и компактных состояний (10* - 10' с) в полипептидной цепи, а также предполагаемого для сворачивания белков времени (10"4— 10"2с). Этот факт являются твердым основанием того, почему белки должны сворачиваться котрансляционно в процессе биосинтеза.

Белки сворачиваются котрансляционно (котранслокационно), в соответствии со следующей схемой. Сворачивание белка начинается с момента поступления из транслокационного комплекса (рибосома или транслокон в мембране) N-концевого аминокислотного остатка его полипептидной ^ цепи в компартмент сворачивания, продолжается во время транслокации цепи и завершается после импорта последнего С-концевого остатка в компартмент. Процесс сворачивания белка происходит последовательными этапами, по мере транслокации аминокислотных остатков цепи в компартмент сворачивания. На каждом этапе формируется определенная (конкретная) структура N-концевой части цепи, выступающей из транслокационного комплекса, которая может измениться на следующем этапе. На всех этапах процесса фолдинга формирование структуры N-концевой части цепи, а также на последнем этапе - нативной конформации белка, происходит быстрее необходимого времени для совершения транслокационным комплексом транслокационного цикла, которое не меньше 0,01 секунды.

Для сворачивания белков более подходящим является термин «котранслокационное» сворачивание, нежели «котрансляционное», тем более термин «трансляция», как принято, обозначает процесс трансляции генетического кода в первичную, аминокислотную последовательность белка.

Библиография Диссертация по биологии, доктора физико-математических наук, Башаров, Махмуд Ашыг-оглы, Пущино

1. Anfinsen, C.B., and Haber, E. (1961). Studies on die reduction and re-formation of protein disulfide bonds./. Biol. Chem. 236, 1361-1363.

2. Anfinsen, C.B. (1973). Principles that govern the folding of protein chains. Science 181,223-230.

3. Anfinsen, C.B. & Scheraga, H.A. (1975). Experimental and theoretical aspects of protein folding. Adv.in Prot. Chem 29, 205-300.

4. Anson, M.L. (1945). Protein denaturation and the properties of protein groups. Adv. in Prot. Chem. 2, 361-386.

5. Arcus, V.L., Vuilleumier, S., Freund, S.M.V., Bycroft, M., and Fersht, A.R. (1994). Toward solving the folding pathway of barnase: The complete backbone I3C, 15N, and *H NMR assignments of its pH-denatured state. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91, 94129416.

6. Ami, R., Heinemann, U., Tokuoka, R., and Saenger, W. (1988). Three-dimensional structure of the ribonuclease T1 *2'-GMP complex at 1.9A resolution. J. Biol. Chem. 263, 15358-15368.

7. Baca, M., Muir, T.W., Schnolzer, M., & Kent S.B.FI. (1995). Chemical ligation of cysteine containing peptides: synthesis of a 22kDa tethered dimer of HIV-1 protease. J. Am. Chem. Soc. 117,1881-1887.

8. Baker, D., and Agard, D.A. (1994). Kinetics versus thermodynamics in protein folding. Biochemistry 33, 7505-7509.

9. Baker, D. (1998). Metastable states and folding free energy barriers. Nat.Struct.BioL 5,1021-1024.

10. Baldwin, RL (1995). a-helix formation by peptides of defined sequence. BiophChem. 55,127-135.

11. Baldwin, R.L. (2007). Energetics of protein folding. J Mol Biol 371, 283-301. Baldwin, R.B., and Rose, G.D. (1999a). Is protein folding hierarchic? I. Local structure and peptide folding. Trends Biochem. Sci. 24, 26-33.

12. Ban, N., Nissen, P., Hansen, J., Moore, P.B., and Steitz, T.A. (2000). The complete atomic structure of the large ribosomal subunit at 2.4 A resolution. Science 289, 905920.

13. Bayer, E., Jung, G., & Hagenmaier, H. (1968). Untersuchungen zur totalsynthese des ferredoxins -I. Tetrahedron 24, 4853-4860.

14. Brant, D.A., & Flory, P.J. (1965a). The configuration of random polypeptide chains. I. Experimental results. J. Am. Chem. Soc. 87,2788-2791.

15. Brant, D.A., & Flory, P.J. (1965b). The configuration of random polypeptide chains. II. Theory. J. Am. Chem. Soc. 87, 2791-3000.

16. Brant, D.A., Miller, W.G., and Flory, P.J. (1967). Conformational energy estimates forstatistically coiling polypeptide chains. J. Mol. Biol. 23, 47-65.

17. Brimacombe, R. (2000). The bacterial ribosome at atomic resolution. Structure 8,1. R195-R200.

18. Bryngelson, J.D., Onuchic, J.N., Socci, N.D., and Wolynes, P.G. (1995). Funnels, pathways, and the energy landscape of protein folding: a synthesis. Proteins 21, 167195.

19. Bukau, В., and Horwich, A. (1998). The FIsp70 and Hsp60 chaperone machines. Cell 92,351-366.

20. Bukau, В., Deuerling, E., Pfund, Ch., Craig, E.A. (2000). Getting newly synthesized proteins into shape. Cell 101, 119-122.

21. Burgess AW, Scheraga HA. Assessment of some problems associated with prediction of the three-dimensional structure of a protein from its amino-acid sequence. (1975). Proc Natl Acad Sci USA 72, 1221-1225.

22. Calmettes, P., Roux, В., Durand, D., Desmadril, M., & Smith, J.C. (1993). Configurational distribution of denatured phosphoglycerate kinase. J. Mol. Biol. 231, 840-848.

23. Carra, J.H., and Privalov, P.L. (1996). Thermodynamics of denaturation of staphylococcal nuclease mutants: an intermediate state in protein folding. FASEB J. 10, 67-74.

24. Chaffotte, A.F., Guijjarro, J.I., Guillou, Y., Delepierro, M., and Goldberg M.E. (1997). The "pre-molten globule", a new intermediate in protein folding. J. Protein Chem. 16, 433-439.

25. Chan, H.S., and Dill, K.A. (1991). "Sequence space soup" of proteins and copolymers. J.Chem.Phys. 95, 3775-3787.

26. Chan, H.S., and Dill, K.A. (1993). Energy landscape and the collapse dynamics of homopolymers. J. Chem. Phys., 99, 2116-2127.

27. Chan, H.S., and Dill, K.A. (1994). Transition states and folding dynamics of proteins and heterepolymers. J. Chem. Phys. 100, 9238-9257.

28. Chavancy, G., and Garel, J.-P. (1981). Does quantitative tRNA adaptation to codon content in mRNA optimize the ribosomal translational efficiency? Proposal for a translational system model. Biochimie 63, 187-195.

29. Chen, W., Helenius, J., Braakman, I., and Helenius, A. (1995). Cotranslational folding and calnexin binding during glycoprotein synthesis. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92, 6229-6233.

30. Chen, X., & Schnell, D.J. (1999). Protein import into chloroplasts. Trend.Cell Biology 9,222-227.

31. Chothia, C. (1984). Principles that determine the structure of proteins.A. Rev.Biochem. 53,537-572.

32. Clark-Lewis, I., Aebersold, R., Ziltener, H., Schrader, J.W. Hood, L.E., & Kent, S.B.H. (1986). Automated chemical synthesis of a protein growth factor for hemopoietic cells, interleukin-3. Science 231, 134-139.

33. Cotton, F.A., Hazen, E.E.,Jr., and Legg, M.J. (1979). Staphylococcal nuclease: proposed mechanism of action based on structure of enzyme-thymidine 3',5'-bisphosphate-calcium ion complex at 1.5A resolution. Proc.Natnl.Acad.Sci. USA 76, 2551-2555.

34. Cowie, D.B., Spiegelman, S., Roberts, R.B., and Duerksen, J.D. (1961). Ribosomebound p-galactosidase. Proc.Natl.Acad.Sci.USA 47, 114-122.

35. Creighton, Т.Е. (1988). Toward a better understanding of protein folding pathways.

36. Proc. Natl. Acad.Sci USA 85, 5082-5086.

37. Creighton, Т.Е. (1990). Protein folding. Biochem. J. 270, 1-16.

38. Creighton, Т.Е. (1991). Stability of folded conformations. Cur.Opin.in Struct. Biol. 1,5.16.

39. Daggett, V., and Fersht, A.R. (2003). The present view of the mechanism of protein folding. Nat Rev Mol Cell Biol 4, 497-502.

40. Dawson, P.E., Muir, T.W., Clark-Lewis, I., & Kent, S.B.H. (1994). Synthesis of proteins by native chemical ligation. Science 266, 776-779.

41. Dawson, P.E., Churchill, M.J., Ghadiri, M.R., & Kent S.B.H. (1997). Modulation of reactivity in native chemical ligation through the use of thiol additives. J. Am. Chem. Soc. 119, 4325-4329.

42. De Cohen, JL (1970). Folding of the polypeptide chain during biosynthesis./. Mol. Biol. 49,405-414.

43. Derrida, B. (1981). Random energy model: An exactly solvable model of disordered systems. Phys.Rev. B24, 2613-2626.

44. Di Nola A., Berendsen H.J.C., and Edholm O. (1984). Free energy deter mination of polypeptide conformations generated by molecular dynamics. Macromolecules, 17, 2044-2050.

45. Dill, K.A., Bromberg, S., Yue, K., Fiebig, K.M., Yee, D.P., Thomas, P.D., and Chan, H.S. (1995). Principles of protein folding A perspective from simple exact models. Protein Sci. 4, 561-602.

46. Dill, K.F., & Shortle, D. (1991). Denatured states of proteins. Ann. Rev. Biochem. 60, 795-825.

47. Dinur, U, & Hagler, AT (1991).Approaches to empirical force fields. In:"Review of computational chemistry", (eds. K.B. Lipkowitz and D.B. Boyd), pp.99-164. Wiley-VCH, New York, NY.

48. Dobson, C.M. (1992). Unfolded proteins, compact states and molten globules. Curr. Opin. Struct. Biol. 2, 6-12.

49. Drakenberg Т., Dahlqvist K.-I., and Forsen S. J. (1972). The barriers to internal rotation in amides. IV. N,N-dimethylamides; Substituent and solvent effects. J.Phys.Chem. 16, 2178-2183.

50. Duong, F., Eichler, J., Price, A., Leonard, M.R., and Wickner, W. (1997). Biogenesis of the gram-negative bacterial envelope. Cell 91, 567-573.

51. Economou, A., Pogliano, J.A., Beckwith, J., Oliver, D.B., Wickner, W. (1995). SecA membrane cycling at SecYEG is driven by distinct ATP binding and hydrolysis events and is regulated by SecD and SecF. Cell 83, 1171-1181.

52. Eigen, M. (1968). Dynamics of conformational changes in helical macromolecules. Chim.Phys. 65, 53.

53. Ellis, R.J., and van der Vies, S.M. (1991). Molecular chaperones. Annu.Rev.Biochem. 60, 321-347.

54. Ellis, R.J., and Hartl, F.-U. (1996). Protein folding in the cell: competing models of chaperonin function. FASEBJ. 10, 20-26.

55. Ellis, R.J., and Hartl, F.-U. (1999). Principles of protein folding in the cellular environment. Curr. Opin. inStruct. Biology 9, 102-110.

56. Ellis, R.J., and Pinheiro, T.J.T. (2002). Danger misfolding proteins. Nature 416,483484.

57. Ellis, J. R., and Minton, A.P. (2006). Protein aggregation in crowded environments. Biol. Chem. 387, 485-497.

58. Engh, R.A., and Huber, R. (1991). Accurate bond and angle parameters for X-ray protein structure refinement. Acta Cryst. A47, 392-400.

59. Epstein, C.J., Goldberger, R.F., and Anfinsen, C.B. (1963). The genetic control of tertiary protein structure: studies with model systems. Cold Spring Harbor Symp. Ouantit. Biology 28, 439-449.

60. Epstein, H.F., Schechter, A.N., Chen, R.F., and Anfinsen, C.B. (1971). Folding of staphylococcal nuclease: kinetic studies of two processes in acid renaturation. JMol Biol. 60, 499-508.

61. Ewig, C.S., Thacher, T.S., and Hagler, A.T. (1999). Derivation of class II force fields, 7: Nonbonded force field parameters for organic compounds. J. Phys. Chem. B33, 6998-7014.

62. Fabiola, F., Bertram, R., Korostelev, A., and Chapman, M.S. (2002). An improved hydrogen bond potential: Impact on medium resolution protein structures. Protein Science 11, 1415-1423.

63. Fersht, A., and Daggett, V. (2002). Protein folding and unfolding at atomic resolution. Cell 108, 573-582.

64. Ferrer, M., Woodward, C., and Barany, G. (1992). Solid-phase synthesis of bovine pancreatic trypsin inhibitor (BPTI) and two analogues. Int. J. Peptide Protein Res. 40, 194-207.

65. Fink, A.L., Calciano, L.J., Goto, Y., Kurotsa, Т., & Palleros, D.R. (1994). Classification of acid denaturation of proteins: intermediate and unfolded states. Biochemistry 33, 12504-12511.

66. Finkelstein, A.V., and Reva, B.A. (1991). A search for the most stable folds of protein chains. Nature, 351, 497-499.

67. Finkelstein, A.V., and Badretdinov, A.Y. (1997). Rate of protein folding near the point of thermo-dynamic equiluibriun between the coil and the most stable chain fold. Fold. & Design,!, 115-121.

68. Fischer, G., and Sclimid, F.X. (1990). The mechanism of protein folding. Implications of in vitro refolding models for de novo protein folding and translocation in the cell. Biochem. 29, 2205-2212.

69. Fischcr D., Rice D., Bowie J.U., and Eisenberg D. (1996). Assigning amino acid sequences to 3D protein folds. FASEBJ., 10, 126-136.

70. Fitzkee, N.C., and Rose, G.D. (2004). Reassessing random-coil statistics in unfolded proteins. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101, 12497-12502.

71. Flanagan, J.A., Kataoka, M., Fujisawa, Т., & Engelman, D.M. (1993). Mutations can cause large changes in the conformation of a denatured state. Biochemistry 32, 1035910370.

72. Freire, E., andBiltonen, R.L. (1978). Statistical mechanical deconvolution of thermal transitions in macromolecules. I. Theory and application to homogeneous systems. Biopolymers 17, 463-479.

73. Frydman, J., Nimmesgern, E., Ohtsuka, K., and Hartl, F.U. (1994). Folding of nascent polypeptide chains in a high molecular mass assembly with molecular chaperones. Nature 370,111-117.

74. Fueno, Т., Nagase, S., Tatsumi, K., Yamaguchi, K. (1972). An intermolecular perturbation approach to the cycloaddition of carbens toward olefins. Reaction path and stereoselectivity. Theoret. Chim. Acta 26,43-54.

75. Fukui, K., and Fujimoto, H. (1968). An MO theoretical interpretation of the nature chemical reactions. Partitioning analysis of the interaction energy. Bull. Chem. Soc. Japan 41,1989-1997.

76. Ganguly, P. (1995). Orbital radii and enviroment-independent transferable atomic length scales:J.Am.Chem.Soc. 117, 1777-1782,

77. Garel, J.-R. (1978). Early steps in the refolding reaction of reduced ribonuclease A. J. Mol. Biol. 118,331-345.

78. Gillespie, J.R., and Shortle, D. (1997). Characterization of long-range structure in the denatured state of staphylococcal nuclease. I. Paramagnetic relaxation enhancement by nitroxide spin labels. J. Mol. Biol. 268, 158-169.

79. Go N., Taketomi H. (1978). Respective roles of short- and long- range interactions in protein folding. Proc. Natnl.Acad.Sci. USA 75, 559-563.

80. Go, N. (1983). Theoretical studies of protein folding. Ann. Rev. Biophys. Bioeng. 12, 183-210.

81. Goldman, Y.E., and Brenner, B. (1987). Molecular mechanism of muscle contraction. Ann. Rev. Physiol. 49, 629-636.

82. Godbole, S., Hammack, В., and Bowler, B.E. (2000). Measuring denatured state energetics: Deviations from random coil behavior and implications for the folding of i so-1-cytochrome c. J. Mol. Biol. 296, 217-228.

83. Gorovits, B.M., Seale, J.W., Horowitz, P.M. (1995). Residual structure in urea-denatured chaperonin GroEL. Biochemistry 34, 13928-13933.

84. Goto, Y., Takahashi, N. and Fink, A.L. (1990). Mechanism of acid-induced folding of proteins. Biochemistry 29, 3480-3488.

85. Griebenow, K., and Klibanov, A.M. (1996). On protein denaturation in aqueous-organic mixtures but not in pure organic solvents. J. Am. Chem. Soc. 118, 1169511700.

86. Guo, Z., and Thirumalai, D. (1997). The nucleation-collapse mechanism in protein folding: evidence for the non-uniqueness of the folding nucleus. Folding & Design 2, 377-391.

87. Gutin A.M., Shakhnovich E.I. (1993). Ground state of random copolymers and thediscrete random energy model. J.Chem.Phys. 98, 8174-8177.

88. Gutte, В., and Merrifield, R.B. (1969). The total synthesis of an enzyme with

89. Ribonuclease A activity. J. Am. Chem. Soc. 91, 501-502.

90. Gutte, В., & Merrifield, RB (1971). The synthesis of Ribonucleae A.

91. J. Biol. Chem,246,1922-1941.

92. Hackeng, T.M., Mounier, C., Bon, C., Dawson, P.E., & Griffin, J.H. (1997). Total chemical synthesis of enzymatically active human type II secretory phospholipase A2. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94, 7845-7850.

93. Hackeng, T.M., Fernandez, J.A., Dawson, P.E., Kent, S.B.H. and Griffin, J.H. (2000).

94. Chemical synthesis and spontaneous folding of a multidomain protein: Anticoagulantmicroprotein S. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97, 14074-14078.

95. Hagiwara, D., Neya, M., Yoshio, M., Hemmi, K., & Hashimoto, M. (1984). Totalsynthesis of urogastrone (human epidermal growth factor, h-EGF).

96. J. Chem.Soc. Chem. Commun. 1676-1678.

97. Hancock, W.S., Prescott, D.J., Marshall, G.R. and Vagelos, P.R. (1972). Acyl-carrier protein. XVIII. Chemical synthesis and characterization of a protein with acyl-carrier protein activity. J. Biol. Chem. 247, 6224-6233.

98. Hansen, W.J., Lingappa, V.R., and Welch, W.J. (1994). Complex environment of nascent polypeptide chain. J. Biol. Chem. 269, 26610-26613.

99. Haschemeyer, A.E.V. (1976). Kinetics of protein synthesis in higher organisms in vivo. Trends biochem. Sci. 1, 133-136.

100. Haucke, V., and Schatz, G. (1997). Import of proteins into mitochondria and chloroplasts. Trends in Cell Biology 7, 103-106.

101. Hardesty, В., Tsalkova, T, and Kramer, G (1999). Co-translational folding. Curr. Op.Struct.Biol. 9, 111-114.

102. Heath, W.F., & Merrifield, R.B. (1986). A synthetic approach to structure-function relationships in the murine epidermal growth factor molecule. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83, 6367-6371.

103. Head-Gordon, Т., Head-Gordon, M., Frisch, M.J., Brooks III, C.L., and Pople, J.A. (1991).Am. Chem. Soc. 113, 5989-5997.

104. Hirschmann, R., Nutt, R.F., Veber, D.F., Vitali, R.A, Varga, S.L., Holly, F.W., and

105. Jackson, E. (1998). How do small single-domain proteins fold? Folding & Design 3, R81-R91.

106. Jackson, E., and Fersht, A.R. (1991). Folding of chymotrypsin inhibitor-2. 1. Evidence for a two-state transition. Biochemistry 30, 10428-10435.

107. Jaenicke, R. (1987). Folding and Association of proteins. Prog. Biophys. Mol. Biol. 49, 117-237.

108. Jaennicke, R. (1991). Protein Folding: local structures, domains, subunits, and assemblies. Biochemistry 30, 3147-3161.

109. Johnson M.S., Overington J.P. and Blundell, T.L. (1993). Alignment and searching for common protein folds using a databank of structural alignments. J. Mol. Biol. 231, 735-752.

110. Jones T.A., and Thirup S. (1986).Using known substructures in protein model building and crystallography. EMBOJ., 5, 819-822.

111. Jorgensen, W.L., and Rives, J.T. (1988). The OPLS (optimized potential for liquid simulations) potential functions for proteins, energy minimization for crystals of cyclic peptides and crambin. J. Am. Chem. Soc. 110, 657-666.

112. Kamatari, Y.O., Konno, Т., Kataoka, M., & Akasaka, K. (1996). The methanol-inducedglobular and expanded denatured states of cytochrome c: a study by CD fluorescence,

113. NMR and small-angle X-ray scattering. J. Mol. Biol. 259, 512-523.

114. Kang, Y.K., Gibson, K.D., Nemethy, G., and Scheraga, Ы.А. J.Phys.Chem. 1988, V.92,4739.4742.

115. Karplus M., and Weaver D.L.(1976). Protein-folding dynamics. Nature 260, 404-406. Karplus M., and Weaver D.L.(1979). Diffusion-collision model for protein folding. Biopolymers 18, 1421-1437.

116. Karplus M., and Weaver D.L.(1994). Protein folding dynamics: The diffusion-collision model and experimental data. Protein Science 3, 650-668. Karplus M. & Petsko GA (1990). Molecular dynamics simulations in biology .Nature,347,631-637.

117. Karplus, M., and McCammon, J.A. (1983). Dynamics of Proteins: Elements and Function. Ann.Rev.Biochem. 53, 263-300.

118. Karplus M., Kushick J. (19810.Method for estimating the cong- urational entropy of macromolecules. Macromolecules 1981, V.14, 325-332.

119. Karplus, M. (1997). The Levinthal paradox: yesterday and today. Fold. & Design 2, S69-S75.

120. Kataoka, M., and Goto Y. (1996). X-ray solution scattering studies of protein folding. Folding & Design 1, R107-R114.

121. Kiefhaber, Т., Bachmann, A., Wildegger, G., and Wagner, C. (1997). Direct measurement of nucleation and growth rates in lysozyme folding. Biochemistry 36, 5108-5112.

122. Kiho, Y., and Rich, A. (1964). Induced enzyme formed on bacterial polyribosomes. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 51, 111-118.

123. Kimura, Т., Chino, N., Kumagaye, S., Kuroda, H., Emura, J., and Sakakibara, S. (1990). Strategy for the synthesis of large peptides; synthesis of angiogenin as an example. Biochem. Soc. Trans. 18, 1297-1299.

124. Kinosita, K., Yasuda, R., Noji, H., Ishiwata, S., and Yoshida M. (1998). FrATPase: a rotary motor made a single molecule. Cell 93, 21-24. Kippen, AD, Sancho,J, and Fersht,AR (1994). Folding of barnase in parts. Biochem. 33;3778-3786.

125. Klimkowski, V.J., Ewbank, J.D., Van Alsenoy, C., Scarsdale, J.N., Schafer, L. (1982).

126. Molecular orbital constrained electron diffraction studies. Conformational analysis ofthe methyl ester of glycine. J. Am. Chem. Soc. 104, 1476-1480.

127. Kolb, V.A., Makeyev, E.V., and Spirin, A.S. (1994). Folding of firefly luciferaseduring translation in a cell-free system. EMBO J. 13, 3631-3637.

128. Kolb, V.A., Makeyev, E.V., and Spirin, A.S. (2000). Co-translational folding of aneukaryotic multidomain protein in a prokaryotic translation systemfirefly luciferaseduring translation in a cell-free system. J. Biol. Chem. 275, 16597-16601.

129. Kollman P.A. (1993). Free energy calculations: applications to chemical andbiochemical phenomena. Chem. Rev. 93, 2395-2417.

130. Komar, A.A., Kommer, A., Krasheninnikov, I.A., and Spirin, A.S. (1997).

131. Cotranslational folding of globin. J. Biol. Chem. 272, 10646-10651.

132. Komar, A.A., Kommer, A., Krashenininnikov, I.A., and Spirin, A.S. (1993).

133. Cotranslational heme binding to nascent globin chains. FEBS Lett., 326, 261-263.

134. Konno, Т., Kataoka, M., Kamatari, Y., Kanaori, K., Nosaka, A., & Akasaka, K. (1995).

135. Solution X-ray scattering analysis of cold-, heat-, and urea-denatured states in aprotein, Streptomyces subtilisin inhibitor. J.Mol. Biol. 251, 95-103.

136. Kouranov, A., and Schnell, D.J. (1996). Protein translocation at the envelope andthylakoid membranes of chloroplasts. J. Biol. Chem. 211, 31009-31012.

137. Kramer, G., Ramachandiran, V., and Hardesty, B. (2001). Cotranslational foldingomnia mea mecum porto? Int. J. Biochem. & Cell Biol. 33, 541-553.

138. Krasheninnikov, I.A., Komar, A.A., and Adzhubei, I.A. (1991). Nonuniform sizedistribution of nascent globin peptides, evidence for pause localization sites, and acotranslational protein-folding model. J. Prot. Chem. 10, 445-454.

139. Kudlicki, W, Chirgwin,J, Kramer,G, and Hardesty,B. (1995a). Folding of an enzymeinto an active conformation while bound as peptidyl-tRNA to the ribosome.

140. Biochemistrty 34, 14284-14287.

141. Kuwajima, K. (1989). The molten globule states as a clue for understanding the folding and cooperativity of globular-protein structure. Proteins: Struct. Fund. Genet. 6, 87103.

142. Prediction of protein conformation on the basis of a search for compact structures; teston avian pancreatic polypeptide. Protein Science, 2, 1715-1731.1.wo A., Kazmierkiewicz R., Czapleswki C., Groth M., Oldziej S., Wawak R.J.,

143. Karplus, M. (1998). All-atom empirical potential for molecular modeling and dynamics studies of proteins. J. Phys. Chem. B102, 3586-3616.

144. Makeyev E.V., Kolb, V.A., and Spirin, A.S. Enzymatic activity of the ribosome-bound nascent polypeptide. (1996). FEBS Lett. 378, 166-170.

145. Matthews, C.R. (1993). Pathways of protein folding. Ann. Rev. Biochem. 62, 653-683. May, Т., and Soil, J. (1999). Chloroplast precursor protein translocation. FEBS Letters 452, 52-56.

146. Mayo, S., Olafson, В., and Goddard, W.I. (1990). DREIDING: A generic force field for molecular simulations.,/. Phys. Chem. 94, 8897-8909.

147. McDonald, D.Q., and Still, W.C. (1992). AMBER torsional parameters for the peptide backbone. Tetrahedron Lett. 33, 7743-7746.

148. Miller, WG, & Goebel, CV (1968). Dimensions of protein random coils. Biochemistry!,3925-3935.

149. Miller, KJ (1990). Additivity methods in molecular polarizability. J.Am.Chem.Soc.m$551-%542.

150. Mullet, J.E., Klein, P.G., and Klein, R.R. (1990). Chlorophyll regulates accumulation of the plastid-encoded chlorophyll apoproteins CP43 and D1 by increasing apoprotein stability. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 4038-4042.

151. Neira, J.L., and Rico, M. (1997). Folding studies on ribonuclease A, a model protein. Folding & Design 2, Rl-Rl 1.

152. Neurath, H., Greenstein, J.P., Putnam, F.W., and Erickson, J.O. (1944). The chemistry of protein denaturation. Chem.Reviews 34, 157-265.

153. Onuchic, J.N., Wolynes, P.G., Luthey-Schulten, Z., and Socci, N.D. (1995). Toward an outline of the topology of a realistic protein-folding funnel. Proc. Natnl. Acad. Sci. USA 92, 3626-3630.

154. Onuchic, J.N., Socci, N.D. Luthey-Schulten, Z., and Wolynes, P.G. (1996). Protein-folding funnels: the nature of the transition state ensemble. Folding & Design 1,441450.

155. Ooi Т., Oobatake M., Nemethy G., and Scheraga H.A. (1987). Accessible surface areas as a measure of the thermodynamic parameters of hydration of peptides. Proc.Natnl.Acad.Sci. USA 84, 3086-3090.

156. O'Shea, E.K., Rutkowski, R., Stafford III, W.F., and Kim, P.S. (1989a). Preferential heterodimer formation by isolated leucine zippers from fos and jun. Science 245, 646648.

157. O'Shea, E.K., Rutkowski, R., and Kim, P.S. (1989b). Evidence that the leucine zipper is a coiled coil. Science 243, 538-542.

158. Pace, C.N., and Creighton, Т.Е. (1986). The disulfide folding pathway of ribonuclease T1. J. Mol. Biol. 188, 477-486.

159. Pace, C.N., Grimsley, G.R., Thomson, J.A., and Barnett, B.J. (1988). Conformational stability and activity of ribonuclease T1 with zero, one, and two intact disulfide bonds. J. Biol. Chem. 263, 11820-11825.

160. Pappu, RV., & Weaver, DL (1998). The early folding kinetics of apomyoglobin. Prot.Sci. 7,480-490.

161. Palmiter, R.D. (1973). Ovalbumin messenger ribonucleic acid translation. J. Biol. Chem. 248,2095-2106.

162. Petrescu, A.J., Receveur, V., Calmettes, P., Durand, D., and Smith, J.C. (1998). Excluded volume in the configurational distribution of a strongly-denatured protein. Protein Sci. 7,1396-1403.

163. Petrescu, A.J., Calmettes, P., Durand, D., Receveur, V., and Smith, J.C. (2000). Change in backbone torsion angle distribution on protein folding. Protein Sci. 9, 11291136.

164. Pophristic, V., and Goodman, L. (2001). Hyperconjuction not steric repulsion leads to the staggered structure of ethane. Nature 411, 565-568.

165. Prat Gay, G., Ruiz-Sanz, J., Neira, J.L., Itzhaki, L.R, and Fersht, A.R. (1995b). Folding of nascent polypeptide chain in vitro: Cooperatve formation of structure in aprotein module. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92, 3683-3686.

166. Ptitsyn O.B. (1991). How does protein synthesis give rise to the 3D-structure? FEBS Lett. 285, 176-181.

167. Ptitsyn O.B. (1995b). Molten globule and protein folding. Adv.Protein Chem. 47, 83229.

168. Pullman, B. (1980). Proteins, nucleic acids and their constituents. In: "Quantum mechanics of molecular conformations", Pullman, В., Ed., Chapter 4, p. 296.

169. Radford, S.E., and Dobson, C.M. (1999). From computer simulations to human disease: emerging themes in protein folding. Cell 97, 291-298.

170. Ramachandran, G.N., and Sasisekharan, V. (1968). Conformation of polypeptides and proteins. Advan. Prot. Chem. 23, 283-437.

171. Ramakrishnan, V. (2002). Ribosome structure and mechanism of translation. Cell 108, 557-572.

172. Ramasharma, K., Sairam, M.R., Seidah, N.G., Chretien, M., Manjunath, P., & Schiller, P.W. Isolation, structure, and synthesis of a human seminal plasma peptide with inhibin-like activity. (1984). Science 223, 1199-1201.

173. Rapoport, T.A., Jungnickel, В., and Kutay, U. (1996). Protein transport across the eukaryotic endoplasmic reticulum and bacterial inner membranes. Annu. Rev. Biochem. 65, 271-303.

174. Rassow, J., Dekker, P.J., Wilpe, S., Meijer, M., and Soli, J. (1999). The preprotein translocase of the mitochondrial inner membrane: function and evolution. J. Mol. Biol. 286, 105-120.

175. Richards, F.M. (1985). Calculation of molecular volumes, and areas for structures of known geometry. Methods Enzymol. 115, 440-464.

176. Richardson, J.S. (1981). The anatomy and taxonomy of protein structure. Adv. Prot. Chem. 34,167-339.

177. Ripoll D.R., Liwo A. and Scheraga H.A. (1998). New Developments of the Electrostatically Driven Monte Carlo Method Test on the Membrane-Bound Portion ofMelittin. Biopolymers, 46, 117-126.

178. Rooman M.J., and Wodak S.J. (1992). Extracting information on folding from the amino acid sequence: consensus regions with preferred conformation in homologous proteins. Biochemistry 31, 10239-10249.

179. Ryabova, L.A., Selivanova, O.M., Baranov, V.I., Vasiliev, V.D., and Spirin, A.S. (1988). Does the chanell for nascent peptide exist inside the ribosome. FEBS Lett. 226, 255-260.

180. Sali A., Shakhnovich E.I., and Karplus M. (1994a). Kinetics of protein folding A lattice model study of the requirements for folding to the native state. J.Mol.Biol. 235, 1614-1636.

181. Sali A., Shakhnovich E.I., and Karplus M. (1994b). How does a protein fold? Nature 369; 248-251.

182. Schatz, G. (1996). The protein import system of mitochondria. J. Biol. Chem. 271, 31763-31766.

183. Schatz, G., and Dobberstein, B. (1996). Common principles of protein translocation across membranes. Science 271, 1519-1526.

184. Scheraga, H.A. (1968). Calculations of conformations of polypeptides. Adv. Phys. Org. Chem. 6, 103-184.

185. Scheraga, H.A., Scott, R.A., Vanderkooi, G., Leach, S.J., Gibson, K.D., Ooi, Т., and Nemethy, G. (1967). In: "Conformation of Biopolymers" (G.N. Ramachandran, ed.), V. 1, p.43. Academic Press, New York.

186. Schindler, Т., and Schmid, F.X. (1996). Thermodynamic properties of an extremely rapid protein folding reaction. Biochemistry 35, 16833-16842.

187. Schmitz, L.R., and Allinger, N.L. (1990). Molecular mechanics calculations (MM3) on aliphatic amines. J. Am. Chem. Soc. 112, 8307-8315.

188. Schoemaker, B.A., Wang, G., and Wolynes, P.G. (1997). Structural correlations inprotein folding funnels. Proc. Natnl. Acad. Sci. USA 94, 777-782.

189. Schwalbe, H., Fiebig, K.M., Buck, M., Jones, J.A., Grimshaw, S.B., Spencer, A.,

190. Glaser, S.J., Smith, L.J., and Dobson, C.M. (1997). Structural and dynamical propertiesof a denatured protein. Heteronuclear 3D NMR experiments and theoreticalsimulations of lysozyme in 8 M urea. Biochemistry 36, 8977-8991.

191. Schwarz, G. (1965). On the kinetics of the helix-coil transition of polypeptides insolution. J. Mol. Biol. 11, 64-77.

192. Schwarz, H.S., Hinz, H.-J., Mehlich, A., Tschesche, H., and Wenzel, H.R. (1987). Stability Studies on Derivatives of the Bovine Pancreatic Trypsin Inhibitor. Biochemistry 26, 3544-3551.

193. Schwarz, M.P., and Matouschek, A. (1999). The dimensions of the protein import channels in the outher and inner mitochondrial membranes. Proc. Natnl. Acad. Sci USA 96, 13086-13090.

194. Scott, RA, and Scheraga, PI.A. (1966). Conformational analysis of. macromolecules. III.

195. Semisotnov G.V, Rodionova, N.A., Kutyshenko, V.P., Ebert, В., Blank, J., and Ptitsyn, O.B. (1987). Sequental mechanism of refolding of carbonic anhydrase B. FEBS Lett. 224, 9-13;

196. Shakhnovich E.I., and Gutin A.M. 1989a. Formation of unique structure in polypeptide chains Theoretical investigation with the aid of a replica approach. Biophys. Chem. 28, 1667-1680.

197. Shakhnovich E.I., and Gutin A.M. 1989b. The nonergodic "spin-glass-like" phase of heteropolymer with quenched disordred sequence of links. Europhys.Lett. 8, 327-332.

198. Sieber, P., Kamber, В., Hartmann, A., Johl, A., Riniker, В., and Rittel, W. (1977). Total synthesis of human insulin. IV. Description of the final steps. Helv. Chim. Acta 60, 27-37.

199. Simon, S.M., and Blobel, G. (1991) A protein-conducting channel in the endoplasmic reticulum. Cell 65, 371-380.

200. Sharp, J.J., Robinson, A.B., and Kamen, M.D. (1973). Synthesis of a polypeptide with lysozyme activity. J. Am. Chem. Soc. 95, 6097-6108.

201. Shortle, D. (1996). The denatured state (the other half of the folding equation) and its role in protein stability. FASEB J. 10, 27-34.

202. Smith, L.J., Fiebig, K.M., Schwalbe, H., and Dobson, C.M. (1996). The concept of a random coil. Residual structure in peptides and denatured proteins. Folding & Design 1, R95-R106.

203. Sorensen, M.A., and Pedersen, S. (1991). Absolute in vivo translation rates of individual codons in E.coli. The two glytamic acid codons GAA and GAG. J. Mol Biol. 222, 265-280.

204. States, D.J., Creighton, Т.Е., Dobson, C.M., and Karplus, M. (1987). Conformations of intermediates in the folding of the pancreatic trypsin inhibitor. J. Mol Biol. 195, 731739.

205. Stout, G.H., Turley, S., Sieker, L.C., and Jensen, L.H. (1988). Structure of ferredoxin T from Azotobacter vinelandi. Proc. Natnl. Acad. Sci. USA 85, 1020-1022.

206. Suenram, R.D., and Lovas, F.J. (1980). Millimeter wave spectrum og glycine. A new con former. J. Am. Chem. Soc. 102, 7180-7184.

207. Tainer, J.A., Getzoff, E.D., Веет, K.M., Richardson, J.S., and Richardson, D.C. (1982). Determination and analysis of the 2A structure of copper,zinc superoxide dismutase. J.Wol. Biol. 160, 181-217.

208. Taketomi H., Ueda Y., and Go N. (1975). Studies on protein folding, unfolding andfluctuations by computer simulation. Int.J. Pept. Protein Res. 7, 445-459.

209. Tam, J.P., Marquardt, H., Rosberger, D.F., Wong, T.W., and Todaro, G.J. (1984).

210. Synthesis of biologically active rat transforming growth factor I. Nature 309, 376-378.

211. Tam, J.P., Sheikh, M.A., Solomon, D.S., and Ossowski, L. (1986). Efficient synthesisof hyman type a transforming growth factor: its physical and biologicalcharacterization. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83, 8082-8086.

212. Tanford, C. (1968). Protein denaturation. Adv. Protein Chem. 23, 121-282.

213. Taniuchi, H., and Anfinsen, C.B. (1969). An experimental approach to the study of thefolding of staphylococcal nuclease. J. Biol. Chem. 244, 3864-3875.

214. Taniuchi, H. (1970). Formation of randomly paired disulfide bonds in des-(121-124)ribonuclease after reduction and reoxidation. J. Biol. Chem. 245, 5459-5468.

215. Tsalkova, Т., and Hardesty, В., (1998). Different conformations of the nascent peptideson the ribosomes. In: «Protein Structure, Stability and Folding». Intern.Symp.,

216. Moscow. ONTI, PNC RAN, Pushchino, 178.

217. Tsou, C.-L. (1988). Folding of the nascent peptide chain into a biologically active protein. Biochemistry 27, 1809-1812.

218. Unger, R., and Moult J. (1993). Genetic algorithms for protein folding simulations. J.Mol.Biol. 231, 75-81.

219. Uversky, V.N., & Ptitsyn, O.B. (1996). Further evidence on the equilibrium "pre-molten globule state: four state GdmCl-induced unfolding of (3-lactamase at low temperature. J. Mol. Biol. 255, 215-228.

220. Vishveshwara, S., and Pople, J.A. (1977). Molecular orbital theory of the electronic structures of organic compounds. 32. Conformations of glycine and related systems. J. Am. Chem. Soc. 99, 2422-2426.

221. Wang Y., and Shortle D. 1995. The equilibrium folding pathway of staphylococcal nuclease: Identification of .the most stable chain-chain interactions by NMR and CD spectroscopy. Biochemistry 34, 15895-15905.

222. Warme, P.K., Momany, F.A., Rumball, S.V., Tuttle, R.W., and Scheraga, H.A. (1974). Computation of Structures of Homologous Proteins. Alpha-lactalbumin from Lysozyme. Biochemistry 13, 768-782.

223. Weiner, S.J., Kollman, P.A., Nguyen, D.T., and Case, D.A. (1986). An all atom fieldfor simulations of proteins and nucleic acids. J. Comput. Chem. 7, 230-252.

224. Weinhold, F. (2001). A new twist on molecular shape. Nature 411, 539-541.

225. Weiss, Manfred S., Brandl, M., Suhnel, J., Pal, D., and Hilgenfeld, R. (2001). Morehydrogen bonds for the (structural) biologist. TIBS 26, 521-523.

226. Weissman, J.M., and Kim, P.S. (1991). Reexamination of the folding of BPTI:

227. Predominance of native intermediates. Science 253, 1386-1393.

228. Wesson, L., and Eisenberg, D. (1992). Atomic solvation parameters applied tomolecular dynamics of proteins in solution. Protein Sci. 1, 227-235.

229. Wetlaufer, D.B., and Ristow, S. (1973). Acquisition of three-dimensional structure ofproteins. Anmi. Rev. Biochem. 42, 135-158:

230. Wetlaufer, D.B. (1973). Nucleation, rapid folding and globular intrachain regions in proteins. Proc.Natnl.Acad.Sci. USA 70, 697-701.

231. Whangbo, M.H., Schlegel, H.B., and Wolfe, S. (1977). Molecular orbitals from group orbitals. 3. Quantitative perturbational molecular orbital analysis of ab initio SCF -MO wave functions. J. Am. Chem. Soc. 99,1296-1304.

232. White, F.H., Jr. (1961). Regeneration of native secondary and tertiary structures by airoxidation of reduced Ribonuclease. J. Biol. Chem. 236, 1353-1360.

233. White, J.L, Hackert, M.L., Buehner, M., Adams, M.J., Ford, G.C., Lentz, Jr., P.J.,

234. Smiley, I.A., Steindel, S.J., and Rossman, M.J. (1976). A comparison of the structuresof apoDogfish M4 lactate dehydrogenase and its ternary complexes. J. Mol. Biol. 102,759.779.

235. Wickner, W., and Leonard, M.R. (1996). Escherichia coli preprotein translocase. J. Biol. Chem. 271-, 29514-29516.

236. Williams, S., Causgrove, T.P., Gilmanshin, R., Fang, K.S., Callender, R.H., Woodruff, W.H., and Dyer, R.B. (1996). Fast events in protein folding: helix melting and formation in a small peptide. Biochemistry 35, 691-697.

237. Wilson, K.S., andNoller, H.F. (1998). Molecular movement inside the translational engine. Cell 92, 337-349.

238. Wilken, J., and Kent, S.B.H. (1998). Chemical protein synthesis.\Cur.Opin. Biotechnology 4,412—426.

239. Wolynes, P.G., Onuchic, D., Thirumalai, D. (1995). Navigating the folding routes. Science 267,1619-1622.

240. Wong, K.B., Freund, S.M.V., and Fersht, A.R. (1996). Cold denaturation of barstar: 'H, 15N, and 13C NMR assignment and characterisation of residual structure. J. Mol. Biol. 259, 805-818.

241. Wright, L.R., and Borkman, R.F. (1980). Ab initio self-consistent field calculations on some small amino acids. J. Am. Chem. Soc. 102, 6207-6210.

242. Yamashiro, D., Li, C.H., Ramasharma, K., & Sairam, M.R. (1984). Synthesis and biological activity of human inhibin-like peptide-(l-31). Proc. Natnl. Acad. Sci. USA 81, 5399-5402.

243. Zwanzig, R., Szabo, A., and Bagchi, В (1992). Levinthal's paradox. Proc. Natnl.Acad.Sci. USA 89, 20-22.

244. Zwanzig, R. (1995). Simple model of protein folding kinetics. Proc. Natnl. Acad.Sci. USA 92, 9801-9804.

245. Башаров M.A., Волькенштейн M.B., Голованов И.Б., Ермаков Г.Л., Научитель В.В., Соболев В.М. (1984а). Связь-связевые взаимодействия. I. Простое соотношение для оценок связь-связевого взаимодействия. Ж. структ. химии 25, N1,31-35.

246. Башаров М.А., Волькенштейн М.В., Голованов И.Б., Научитель В.В., Соболев В.М. (19876). Роль Нтг-водородных связей в стабилизации спиральных структур олигопептидов. Молекулярная биология 21, 1339-1345.

247. Башаров М.А., Волькенштейн М.В., Голованов И.Б. (1988). Влияние боковых радикалов на структуру пептидов. Поверхности потенциальной энергии модельных дипептидов аланина и фенилалапина. Молекулярная биология 22, 1217-1225.

248. Башаров М.А., Волькенштейн М.В., Голованов И.Б., Научитель В.В., Соболев В.М. (1989а). Метод фрагмент-фрагментных взаимодействий. I. Краткое описание и документация метода для оценок межмолекулярных взаимодействий. Ж. обшей химии 59,489-502.

249. Башаров М.А. (2000). Концепция посттрансляционного сворачивания белков: насколько она реалистична? Биохимия 65, 1400-1408.

250. Башаров М.А. (2000). Котрансляционное сворачивание белков. Биохимия 65, 1639-1644.

251. Бартенев Г.М., Френкель С.Я. (1990) Физика полимеров, Химия, Ленинград. Биндер К., Хеерман Д.В. (1995) Моделирование методом Монте-Карло в статистической физике. М., «Наука», Физматлит 141стр.

252. Бирштейн Т.М., Птицын О.Б. (1964). Конформации макромолекул. М.: Наука 391 стр.

253. Бурштейп А.И. (1978). Молекулярно-кииетические аспекты химической физики конденсированного состояния. Успехи химии XLVII 212-234.

254. Верещагин А.Н. (1980). Поляризуемость молекул. М.: Наука 177 стр. Волынская А.В., Касумова Э.А.ю Шишков А.В. (1998). О механизме разворачивания глобулярных белков. Рибонуклеаза А. Молек.биология 32, 463472.

255. Волькенштейн М.В. (1959) Конфигурационная статистика полимерных цепей. Из.-во АН СССР, Москва Ленинград.

256. Голованов И.Б. и Волькенштейн М.В. (1977). Взаимодействия валентно-несвязанных атомов и двухцентровые вклады в полную энергию молекул. Докл. АН СССР 236, 1140-1143.

257. Голованов И.Б., Соболев В.М., Волькенштейн М.В. (1981а). Взаимодействие валентно-несвязанных атомов и двухцентровые вклады в полную энергию молекулы. Журнал структ. химии 20, 26-30.

258. Голованов И.Б., Научитель В.В., Соболев В.М., Волькенштейн М.В. (19816). Простой принцип структурно-энергетического соответствия и его использование для моделирования взаимодействия между молекулами водорода. Докл. АН СССР 259, 877-881.

259. Готлиб Ю.Я., Даринский А.А., Светлов Ю.Е. (1986) Физическая кинетика макромолекул, Химия, Ленинград.

260. Дашевскип В.Г. (1982). Конформационный анализ органических молекул. М., Химия, С. 272.

261. Каплан И.Г., Родимова О.Б. (1978). Межмолекулярные взаимодействия. Успехи физ. наук 126, 403-449.

262. Каплан И.Г. (1982). Введение в теорию межмолекулярных взаимодействий. М., Наука, С.311.

263. Китайгородский А.И. (1971). Молекулярные кристаллы. М., Наука, 424 стр. Колб В.А. (2001) Котрансляционное сворачивание белков. Молекулярная биология 35, 682-690.

264. Крашенинников И.А., Комар А.А., Аджубей И.А. (1988). Роль кластеров редких кодонов в определении границ участков полипептидной цепи с однотипной вторичной структурой в процессе ко-трансляционного сворачивания белка. Докл.АН СССР, 303,995-999.

265. Крашенинников И.А., Комар А.А., Аджубей И.А. (1989). Роль вырожденности кода в определении пути котрансляционного сворачивания белка. Биохимия, 54, 187-200.

266. Лим В.И. (1991). Котрансляционное, косекреторное сворачивание белка и его ренатурация из денатурированного состояния. Биофизика, 36, 441-454.

267. Паулинг Jl. (1947). Природа химической связи. М.-Л., Госхимиздат, 440с. Плетнев В.З., Кузин А.П., Малинииа, Л.В. (1982). Структура актиноксантина на атомном уровне. Биоорг.химия 8, 1637-1643.

268. Попов Е.М. (1989). Структурная организация белков. Москва: Наука, 352с. Попов Е.М. (1995). Белки и пептиды. Том 1. Москва: Наука, 448с. Птицын О.Б. (1973). Стадийный механизм самоорганизации белковых молекул. Докл. Акад. наук СССР, 210, 1213-1215.

269. Рубин А.Б. (1987). Биофизика, (книга 1) Москва: "Высшая школа", 319с. Финкельштейн А.В., Птицын О.Б. (2005). Физика белка. Москва, "Университет". Френкель С.Я. (1965). Введение в статистическую теорию полимеризации. М.-Л. Наука, 350с.

270. Сочава И.В., Смирнова О.И. (1993). Теплоемкость увлажненных и обезвоженных глобулярных белков. Денатурационный инкремент теплоемкости. Молекулярная биология, 27, 348-357.

271. Спирин А.С. (1986). Молекулярная биология. Структура рибосом и биосинтез белка. М.: Высшая школа, 303с.

272. Уверский В.Н. (1998). Разнообразие компактных форм денатурированных белков. Диссертация на соискание ученой степени д.ф-м.н Пущино, 4ЮС.

Информация о работе

Башаров, Махмуд Ашыг-оглы
доктора физико-математических наук
Пущино, 2009
ВАК 03.00.02

Диссертация

Теоретическое исследование барьеров внутреннего вращения и механизма сворачивания белков - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы