Котрансляционное формирование функционально активных белков в процессе трансляции в бесклеточных системах

Коммер, Айгар Акселович

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Котрансляционное формирование функционально активных белков в процессе трансляции в бесклеточных системах
ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Котрансляционное формирование функционально активных белков в процессе трансляции в бесклеточных системах"

На правах рукописи

003460414

КОММЕР Айгар Акселович

КОТРАНСЛЯЦИОННОЕ ФОРМИРОВАНИЕ ФУНКЦИОНАЛЬНО АКТИВНЫХ БЕЛКОВ В ПРОЦЕССЕ ТРАНСЛЯЦИИ В БЕСКЛЕТОЧНЫХ СИСТЕМАХ

03.00.03. - молекулярная биология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва - 2008

003460414

Работа выполнена в лаборатории механизмов биосинтеза белка Института белка РАН.

НАУЧНЫЙ РУКОВОДИТЕЛЬ:

доктор биологических наук,

профессор академик Спирин Александр Сергеевич

ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ:

доктор биологических наук Калинина Наталья Олеговна

кандидат химических наук Бони Ирина Венедиктовна

ВЕДУЩАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ:

Институт молекулярной биологии им. В.А. Энгелыардта РАН

Защита диссертации состоится 28 НОЯБРЯ 2008 года на заседании совета Д 501.001.76 по защите докторских и кандидатских диссертаций при Московском государственном университете имени М.В.Ломоносова по адресу: 119992, Москва, Ленинские горы, МГУ имени М.В.Ломоносова, НИИ физико-химической биологии имени А.Н. Белозерского, Лабораторный корпус «А», ауд. 536.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке биологического факультета МГУ имени М.В.Ломоносова.

Автореферат разослан: 24 октября 2008 года.

Ученый секретарь диссертационного совета кандидат биологических наук

И.А. Крашенинников

Актуальность проблемы. Приобретение белком уникальной пространственной структуры является необходимым условием осуществления его биологической функции. Сворачивание белка остаётся самым непонятным в настоящее время этапом в процессе передачи наследственной информации от ДНК к функциональному белку. Механизм этого процесса и управляющие им законы не выяснены, несмотря на разнообразные экспериментальные и теоретические подходы, применяемые для его изучения и моделирования. Таким образом, актуальность темы исследований следует из фундаментальной значимости проблемы. Кроме того, пристальный интерес к механизмам сворачивания обеспечен важностью их понимания для медицины и биотехнологии. Наиболее актуальны в решении проблемы сворачивания экспериментальные работы, в которых сворачивание белков исследуется в условиях максимального приближения к природной ситуации, к сворачиванию синтезированных de novo белков в клетках и бесклеточных экстрактах. Работа направлена на изучение сворачивания синтезированного de novo белка и определению этапа биосинтеза, на котором синтезируемая полипептидная цепь приобретает пространственную структуру нативного биологически активного белка.

Цель и задачи работы. В настоящее время принято считать, что котрансляционное сворачивание многодоменного белка происходит подоменно (Netzer and Hartl, 1997), т.е. пространственная структура каждого домена формируется только после его синтеза и появления из рибосомы. Следствием этой концепции является вывод о пост-трансляционном сворачивании однодоменных белков. Цель настоящей работы состояла в том, чтобы выяснить, возможно ли формирование незавершенным однодоменным белком, находящимся на рибосоме, пространственной структуры, идентичной или близкой соответствующей части нативной структуры правильно свёрнутого домена. Были поставлены следующие задачи: 1) определить, связывают ли растущие цепи а-глобина человека гемин, добавленный в бесклеточную систему трансляции; 2) выяснить, могут ли растущие полипептиды связывать свободный гем, не находящийся в составе эндогенного гемоглобина; 3) определить, по достижении какой длины растущие полипептиды приобретают компетентность к специфичному связыванию гема; 4) выяснить, можно ли синтезировать в бактериальной бесклеточной системе функционально активный белок, содержащий дисульфидные связи - проинсулин человека; 5) подобрать условия синтеза, при которых сворачивание проинсулина в нативную структуру происходит с высоким выходом. Научная новизна и практическая ценность работы. В работе впервые показано, что однодоменный белок (а-глобин человека) способен приобретать конформацию,

компетентную к связыванию лиганда (гема), в процессе синтеза на рибосоме, т.е. котрансляционно. При этом обнаружено, что третичная структура растущей цепи а-глобина, компетентная к связыванию гема, формируется задолго до построения полноразмерной цепи этого белка. Также были получены свидетельства в пользу того, что формирование структуры гем-связывающего центра глобина происходит в непосредственной близости от пептидилтрансферазного центра рибосомы. Кроме того, в работе показано, что в бесклеточной системе трансляции можно синтезировать функционально активный белок, содержащий дисульфидные связи -проинсулин человека, а также найдены условия для получения высокого выхода правильно свёрнутого новосинтезированного проинсулина.

Структура работы. Диссертация состоит из следующих разделов: «Введение», «Обзор литературы», «Материалы», «Методы исследования», «Результаты и обсуждение», «Выводы» и «Список литературы». Работа содержит 15 рисунков и 9 таблиц.

Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на международных конференциях: the EMBO/FEBS/IUB Advanced Course "Mechanism and Control of Translation" (Noordwijkerhout, the Netherlands, 1990), the Fifth Annual Meeting of the RNA Society "RNA 2000" (Madison, Wisconsin, the USA, 2000), the International Conference in Honour of Alexander Spirin "Protein Biosynthesis" (Pushchino, 2001).

РЕЗУЛЬТАТЫ

1. Котрансляционное связывание гема полипептидными цепями а-глобина, синтезируемыми в бесклеточной системе из ретикулоцитов кролика

Для проверки гипотезы о том, что гем может связываться с растущими цепями а-глобина, синтез белка провели в бесклеточной системе из лизата ретикулоцитов кролика в присутствии меченого гемина. Для мечения гемина был применен метод тритиевой бомбардировки (Kolb, Kommer et al. 1987; Yusupov and Spirin 1988). Оказалось, что после мечения тритием и очистки спектральные свойства гемина не изменились. Такой [3Н]гемин добавляли в транслирующую систему, содержащей оптимальную концентрацию (30 мкМ) немеченого гемина. Избыток меченого гемина, добавленного в систему в концентрации 37 мкМ, не снижал скорости синтеза и количества синтезированного продукта. Кроме [3Н]гемина, в системе трансляции присутствовал также [14С]лейцин. Для анализа связывания гемина использовали центрифугирование в градиенте сахарозы и измерение тритиевой и углеродной

радиоактивности во фракциях. Было выявлено, что значительное количество [3Н]гемина обнаруживается во фракции полирибосом, что свидетельствовало в пользу котрансляционного присоединения тема к глобину. Чтобы определить, является ли связывание гема специфичным, т.е. присоединён ли он к глобиновой пептидил-тРНК, в бесклеточную систему трансляции после трёх минут инкубации был добавлен пуромицин (1 мМ). Инкубацию продолжали еще пять минут и затем проводили центрифугирование и измерение радиоактивности во ' фракциях сахарозного градиента. В отличие от эксперимента без пуромицина, ни меченный [14С]лейцином глобин, ни [3Н]гемин не были обнаружены во фракциях полирибосом (рис. 1 А, Б). Поскольку пуромицин вызывал освобождения растущих полипептидов из рибосомы, одновременный уход из полирибосом синтезируемого белка и меченого гемина указывал на специфичное связывание последнего с растущими цепями глобина на рибосоме.

дно пробирки

9 11 13 15 17 19 21

Номер фракции

-14

-10 .

-6

-2

т ю ?

-6

Рисунок 1. Включение [иС]лейцина и [3Н]гемина во фракцию полирибосом системы трансляции из лизата ретикулоцитов кролика. (А) Без добавления пуромицина. (Б) После обработки пуромицином. Последние семь фракций верхней части градиента не показаны.

Как следует из рис. 1, [3Н]гемин оказался связанным преимущественно с полирибосомами, содержащими пять - шесть рибосом. Можно было предположить, что включение гема происходило на заключительных стадиях синтеза глобина,

после появления имидазольных групп гистидинов F и Е спиралей, необходимых для связывания гема. Это предположение подкреплялось данными о том, что большой протеолитический фрагмент молекулы (3-глобина, включающей остатки 31-104, способен к связыванию гема (Craik, Buchman etal. 1981).

С другой стороны, специфичное связывание гема с полирибосомами в ретикулоцитном экстракте не являлось прямым свидетельством его взаимодействия с растущими цепями глобина, поскольку могло быть и следствием взаимодействия между растущими цепями и полноразмерными свободными субъединицами глобина, содержащими меченый гемин. Хотя считается, что формирование тетрамера гемоглобина происходит посттрансляционно, возможность сборки тетрамера на рибосоме не может быть полностью исключена. Вместе с тем очевидно, что тетрамеризация глобина на рибосоме возможна лишь в случае формирования специфической пространственной структуры растущей цепи на рибосоме, поскольку только такая структура могла обеспечить сродство к свободным субъединицам белка.

Известно, что денатурированный глобин или миоглобин не способен связывать группу гема. Также известно, что удаление или замещение гема может сопровождаться денатурацией гемоглобина, в то время как добавление гема к апогемоглобину или апомиоглобину вызывает формирование нативной структуры молекул (Antonini and Brunori 1971). Следовательно, можно заключить, что формирование пространственной структуры глобина происходит во время синтеза на рибосоме, т.е. котрансляционно, а связывание гема, вероятно, стимулирует котрансляционное формирование третичной структуры молекулы белка.

2. Котрансляционное связывание гема цепями а-глобина, синтезируемыми в отсутствие свободных молекул гемоглобина

Таким образом, было показано, что растущие полипептидные цепи глобина способны связывать гем в процессе синтеза в бесклеточной системе из ретикулоцитов кролика (Komar, Kommer et al. 1993). Однако оставалось неясным, в какой форме гем связывается с растущими цепями: в свободном состоянии или в составе полноразмерной молекулы глобина с предварительно связанным гемом. Для ответа на этот вопрос необходимо было выяснить, способны ли растущие цепи а-глобина котрансляционно связывать гем в отсутствие избытка свободных молекул (3-глобина (или, соответственно, растущие цепи (3-глобина - свободных молекул а-глобина). Очевидно, что для решения этой задачи следовало воспользоваться бесклеточной системой трансляции, не содержащей предсинтезированных молекул

глобина. Такой системой является система из экстракта зародышей пшеницы. Для трансляции in vitro была выбрана мРНК а-глобина, сродство которого к тему в десять раз превышает сродство р-глобина (Antonini and Brunori 1971; Winterhalter, loppolo et al. 1971) и который, в отличие от 0-глобина, не формирует тетрамерную структуру (Bucci 1981). На рис. 2 показано, что [3Н]гемин обнаруживается во фракции рибосом, транслирующих мРНК а-глобина в системе из зародышей пшеницы. Добавление пуромицина к образцу перед центрифугированием приводило к освобождению как меченного [353]метионином полипептида, так и большей части связанного с рибосомами [3Н]гемина. Пуромициновый тест прямо указывал на то, что гем находится в комплексе с растущей цепью а-глобина. Поскольку синтез а-глобина происходил в отсутствие предсинтезированного гемоглобина, очевидно, что растущие цепи связывали гем напрямую, в виде свободной молекулы, а не в виде комплекса с (3-гпобином.

О 12

Е а

г 15

- 10

г* ® f

го X S

15 Д «

L О

10 15 Номер фракции

Рисунок 2. Включение [365]метионина и [3Н]гемина во фракцию рибосом зародышей пшеницы, транслирующих мРНК полноразмерного а-глобина. Верхняя панель: без добавления пуромицина. Нижняя панель: после обработки луромицином перед центрифугированием.

0.5

+ пуромицин

0.4 -

3. Связывание гема незавершенными растущими цепями а-глобина

На следующем этапе работы было выяснено, какой длины должна достигать растущая полипептидная цепь глобина, чтобы связать гем. Предполагалось, что связывание гема станет возможным, когда обе имидазольные группы гистидинов Е и F спирали, необходимых для связывания гема, будут выдвинуты из рибосомы. Принимая во внимание, что транслирующая рибосома может защитить приблизительно 15-40 аминокислотных остатков растущего пептида (Malkin and Rich 1967; Blobel and Sabatini 1970; Smith, Tai et al. 1978), можно было предположить, что только растущие пептиды длиной в приблизительно 100 аминокислотных остатков и длиннее способны к связыванию гема (Komar, Kommer et al. 1993).

Для ответа на поставленный вопрос использовали метод остановки трансляции антисмысловыми олигодезоксирибонуклеотидами. Если молекулу мРНК гибридизовать с олигонуклеотидом, комплементарным определённому ее участку, то рибонуклеаза Н будет атаковать рибонуклеиновую часть РНК-ДНК-дуплекса. Используя антисмысловые олигодезоксирибонуклеотиды, комплементарные различным участкам мРНК, можно получать усечённые мРНК, кодирующие полипептиды заданной длины и не содержащие терминирующего кодона в рамке считывания. Трансляция таких мРНК действительно приводит к образованию растущих полипептидов определенной заданной длины, присоединённых к рибосоме в виде пептидил-тРНК. В условиях полного гидролиза рибонуклеаза Н делает разрез преимущественно на 5' конце участка РНК, находящегося в комплексе с олигодезоксирибонуклеотидом (Donis-Keller 1979). Таким образом, длину растущего пептида можно задавать с высокой точностью.

Первый эксперимент был проведён с мРНК а-глобина, в которой отсутствовал последний, З'-концевой кодирующий триплет и вся З'-проксимальная последовательность после этого кодона. При помощи центрифугирования в градиенте сахарозы было показано, что неполный растущий пептид а-глобина длиной 140 аминокислотных остатков без учёта инициаторного метионина (так называемый а-глобин 140) способен котрансляционно связывать гем в процессе трансляции в системе зародышей пшеницы. Незавершенный пептид глобина из 100 остатков (а-глобин 100) также связывал гемин котрансляционно (рис. ЗА). Удивительно, но такое же связывание было обнаружено и с более коротким пептидом длиной 86 аминокислотных остатков, в котором отсутствовал остаток гистидина в положении 87, связывающийся с гемом в полноразмерном глобине (рис. ЗБ).

Определение 3' концов и определение нуклеотидной последовательности мРНК а-глобина 86 показали небольшую гетерогенность 3' концов этой усечённой мРНК. Гетерогенность мРНК предполагает гетерогенность продукта ее трансляции. Для проверки того, действительно ли глобиновый пептид длиной 86 (а не более) аминокислотных остатков способен связывать гем, были проведены эксперименты с мРНК а-глобина 86, полученной другим способом и гомогенной по З'-концевой последовательности. Для получения такой мРНК сначала с помощью ПЦР амплифицировали последовательность, содержащую ЭРб промотор и участок гена а-глобина, кодирующий 86 М-концевых аминокислотных остатков. Далее продукт ПЦР транскрибировали с помощью ДНК-зависимой РНК-полимеразы фага ЭР6 и очищали стандартными методами. Полученный транскрипт использовали в опыте, результат которого представлен на рис. ЗВ. Как видно из рисунка, растущий а-глобиновый пептид длиной в 86 остатков способен связывать гем.

0.5

0.4

0.3

0.2

| 0.1 СО

< 05 I

0.4 0.3 0.2 0.1

5 10 15 20 25

Номер фракции

+ пуромицин

Рисунок 3. Подпись см. ниже.

0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1

5 10

Номер фракции

0 12

Н 5

и О

- 10

О 20

Г 10

Рисунок 3.

Включение [368]метионина и [3Н]гемина во фракции рибосом зародышей пшеницы, транслирующих усечённые мРНК а-глобина. Верхние панели: без добавления пуромицина. Нижние панели: после обработки пуромицином перед центрифугированием. (А) а-глобин 100, (Б) а-глобин 86, (В) а-глобин 86,

синтезированный на матрице, полученной транскрипцией ПЦР-фрагмента (см. текст ниже), (Г) а-глобин 75, (Д) а-глобин 65.

+ пуромицин

Номер фракции

0.5 -т 0.4 -0.3 -0.2 -0.1 0.5 0.4 -0.3 -0.2 -0.1

+ пуромицин

0 12

- 10

- 5

- 10

О ? си

15 2

- 5

Рисунок 3. Подпись см. выше.

4. Связывание гема на рибосомах с короткими растущими цепями а-глобина

Как было известно из экспериментов in vitro, протеолитический фрагмент молекулы а-глобина, включающий остатки 31-104, способен связывать гем (Craik, Buchman et al. 1981). Такое же связывание было продемонстрировано для фрагмента полипептида минимиоглобина (остатки 32-139)(De Sanctis, Falcioni et al. 1994). Для определения необходимой и достаточной длины цепи глобина, по достижении которой происходит котрансляционное связывание гема, мы транслировали укороченные мРНК а-глобина (рис. 4), позволяющие получать более короткие растущие пептиды.

5' AUG 58 His* 87 His* идА у

■==< 1 ■

! | А * | |

34 65 75 86 100 140

Leu Ala Asp Leu Leu Туг

full 140 100 86 75 S5 34

Рисунок 4. Продукты бесклеточной трансляции усечённых мРНК а-глобина. Вверху - схема мРНК а-глобина. Стрелки указывают на места разрезания молекулы рибонукпеазой Н, под ними обозначены ожидаемые С-концевые аминокислоты продукта трансляции. Звёздочками отмечены остатки гистидина, вовлечённые в связывание гема. Внизу - радиоавтограф геля денатурирующего БОЗ-злектрофореза продуктов трансляции усечённых мРНК. Горизонтальными стрелками отмечены маркеры молекулярной массы (кДа). Цифры над дорожками соответствуют длине Ы-концевых полипептидов а-глобина.

Длина этих коротких пептидов остатка. За включением радиоактивно

составляла 75, 65 и 34 аминокислотных

меченных метионина и гемина в растущие

фрагменты глобина следили с помощью центрифугирования в градиенте сахарозы. Использовали систему трансляции из зародышей пшеницы, как описано выше. В отличие от экспериментов с более длинными полипептидами (рис. 3, А и Б), было обнаружено значительно более слабое связывание [3Н]гемина с рибосомами, несущими растущие полипептиды длиной 34, 65, и 75 аминокислотных остатков (рис. 3,ГиД).

5. Зависимость связывания гема от длины незавершенных растущих цепей а-глобина

Так как все изучаемые полипептиды имеют равное количество остатков метионина (в положениях 1 и 33), соотношение [3Н]гемин/[358]метионин может использоваться для определения стехиометрии комплекса гема с растущей цепью, что, в свою очередь, служит мерой эффективности связывания гема с растущими полипептидами разной длины. На рисунке 5 показана зависимость стехиометрии комплекса от длины растущей цепи глобина. Для подсчета стехиометрии измеряли радиоактивность [3Н] и [35S] во фракциях сахарозного градиента, соответствующих зоне 80S рибосом. Из измеренных значений вычитали фон, в качестве которого служила радиоактивность рибосомных фракций другого градиента, в котором центрифугировали аликвоту того же образца, но после обработки пуромицином. Небольшое количество гемина, обнаруживаемое на рибосомах с короткими пептидами длиной 34, 65, или 75 аминокислотных остатков, может быть объяснено неспецифической адсорбцией гема. Можно также предположить, что гем связывается с полипептидной цепью глобина на ранних стадиях синтеза, когда первые аминокислотные остатки, способные его связывать, появляются из пептидилтрансферазного центра. Но на этих стадиях связывание гема недостаточно прочно, чтобы сформировать устойчивый комплекс с глобином.

Концепция котрансляционного сворачивания белка предполагает возможность котрансляционного связывания лиганда. Так, изучение биосинтеза белка D1 из мембраносвязанного реакционного центра хлоропласта выявило котрансляционное связывание хлорофилла с фрагментом молекулы D1 (Mullet, Klein et al. 1990; Kim, Klein et al. 1991). Было логично предположить, что гем связывается котрансляционно в случае глобинов (Krasheninnikov, Komar et al. 1991; Komar, Kommer et al. 1993). Известно, что удаление или замещение гема сопровождается денатурацией гемоглобина, тогда как добавление гема к апогемоглобину или апомиоглобину вызывает формирование нативной структуры молекулы (Antonini and Brunori 1971; Yip, Waks et al. 1972; Waks, Yip et al. 1973; Leutzinger and Beychok 1981). Показано

также, что мини-апо-(3-глобин (остатки 31-104) или миниапомиоглобин (остатки 32139) после добавления гема сохраняют конформацию, подобную полноразмерной молекуле (Craik, Buchman et al. 1981; De Sanctis, Falcioni et al. 1994). Кроме того, ориентация гема в полости молекулы глобина и координационные связи иона железа в миниглобинах такие же, как в целых молекулах (De Sanctis, Falcioni et al. 1994). На основе этих данных можно ожидать, что связывание гема с растущими цепями глобина служит тестом на котрансляционное сворачивание глобинов. В настоящей работе была определена длина растущей цепи глобина, по достижении которой наблюдается связывание гема в процессе трансляции.

60 80 100 120 140

Аминокилотные остатки

Рисунок 5. Зависимость количества гемина, связавшегося с растущими глобиновыми полипептидами, от их длины. Полипептиды синтезировали в бесклеточной системе, используя усечённые мРНК а-глобина. Звёздочка обозначает данные эксперимента, где мРНК получена с помощью транскрипции ПЦР фрагмента. Для расчётов использовали фракции из сахарозных градиентов, соответствующие зоне 80S рибосом.

Показано столь же эффективное котрансляционное связывание [3Н]гемина с растущими цепями глобина длиной 140, 100, и 86 аминокислотных остатков, что и связывание с полноразмерной молекулой. Тот факт, что пуромицин вызывает одновременное освобождение меченого [35в]метионином полипептида и [3Н]гемина из рибосом (Рис. 2 и 3), указывает на то, что либо растущий пептид длиной 86

аминокислотных остатков обладает пространственной структурой, позволяющей его правильное взаимодействие с группой тема, либо связывание тема способствует формированию правильной третичной структуры. Следовательно, котрансляционное образование пространственной структуры глобина может происходить на ранних стадиях его синтеза. Известно, что N-концевые пептиды ингибитора химотрипсина-2, химически синтезируемые с N-конца, приобретают нативную пространственную структуру in vitro, по достижении длины 62-63 аминокислотных остатков (de Prat Gay, Ruiz-Sanz et al. 1995). По-видимому, то же самое происходит в случае растущего а-глобина 86 и более длинных полипептидов глобина, синтезируемых рибосомой.

6. Формирование структуры гем-связывающего центра глобина

Для иллюстрации наших результатов на рис. 6 представлена модель известной пространственной структуры a-цепи дезоксигемоглобина человека (Fermi, Perutz et al. 1984) (рис. 6A) и модель неполной цепи а-глобина 86 (рис. 6Б), полученная путем удаления С-концевых остатков модели пространственной структуры a-цепи. Известно, что множество аминокислотных остатков в молекуле а-глобина вовлечены в формирование контактов с группой гема; это остатки Met-32, Tyr-42, Phe-43, His-45, Phe-46, Lys-61, Val-62, Ala-65, Leu-83, Leu-86, Leu-91, Val-93, Asn-97, Phe-98, Leu-101, Leu-136, и два связанных гемом остатка гистидина - His-58 и His-87 (Fermi, Perutz et al. 1984).

Из наших экспериментов следует, что растущий пептид длиной 86 аминокислотных остатков, в котором отсутствует гем-связывающий остаток гистидина в положении 87, тем не менее способен связывать гем. Возможно, это означает, что контакты с остальными гем-связывающими аминокислотными остатками достаточны для специфического связывания гема. В полипептиде длиной 86 аминокислотных остатков одиннадцать вовлечены в связывание гема (рис. 6Б). Так как растущий пептид длиной 75 остатков не связывает группу гема (рис. ЗГ), можно предположить, что остатки лейцина в положениях 83 и 86 обеспечивают необходимые контакты, являясь частью кармана гема, и позволяют растущей цепи из 86 аминокислотных остатков эффективно связывать гем. Исходя из этого, логично предположить, что все С-концевые остатки полипептида вовлечены в формирование пространственной структуры и участвуют в образовании Е и F спиралей. Следовательно, растущая цепь полипептида может сворачиваться в непосредственной близости от пептидилтрансферазного центра рибосомы, а не после выхода из внутририбосомного туннеля. Это ставит под сомнение отождествление рибосомного туннеля с каналом, выводящим растущий пептид из

пептидилтрансферазного центра рибосомы на ее поверхность (Kolb, Kommer et al. 1987; Ryabova, Selivanova et al. 1988; Wang, Sakai et al. 1995).

Рисунок 6. Стереопара проволочных моделей а-глобина (А) и а-глобина 86 (Б), черный цвет - а-углеродный остов и гем, серый - боковые цепи остатков, вовлечённых в связывание тема.

Если предположить, что рибосомный туннель скрывает С-концевой сегмент растущего полипептида (Bernabeu and Lake 1982; Selmer and Liljas, 2008), тогда растущий глобин из 86 аминокислотных остатков должен связывать гемин либо без спирали F, если только 15 аминокислотных остатков скрыты внутри рибосомы, либо без спиралей Е и F, если 30-40 аминокислот размещаются внутри рибосомы.

Последнее кажется маловероятным. Скорее, экранирование С-концевой части растущего пептида можно объяснить связыванием цитоплазматического белкового комплекса NAC (Nascent peptide Associated Complex), связывающегося с растущим пептидом и защищающего приблизительно 30 С-концевых аминокислотных остатков от протеолиза (Wiedmann, Sakai et al. 1994; Wang, Sakai et al. 1995). Поскольку модель функционирования комплекса предполагает циклы связывания и освобождения (Wang, Sakai et al. 1995), можно предположить, что этот комплекс диссоциирует от растущих пептидов, когда они приобретают пространственную структуру.

Исходя из всего вышеизложенного можно заключить, что полипептидная цепь глобина начинает сворачиваться при участии гема на ранних этапах синтеза этого белка на рибосоме.

7. Препаративный синтез проинсулина человека в бесклеточной системе

Очередной задачей работы было выяснение возможности синтеза и правильного формирования в условиях бесклеточной системы трансляции глобулярного белка другого типа, а именно белка, содержащего дисульфидные связи. В качестве такого белка был выбран проинсулин человека.

Препаративное получение проинсулина проводили, используя бактериальную бесклеточную систему транскрипции-трансляции. Матрицей для синтеза служила плазмида pETinsHise, в которой нуклеотидная последовательность, кодирующая проинсулин человека с шестичленным олигогистидиновым трактом на С-конце полипептида, находилась под контролем промотора РНК-полимеразы фага 17. Аминокислотная последовательность проинсулина, кодируемая этой плазмидой, приведена на рис. 7.

Для синтеза проинсулина использовали бесклеточную систему S30 экстракта Е. coli (Chekulayeva, Kurnasov et al. 2001; Martemyanov, Shirokov et al. 2001; Shirokov, Simonenko et al. 2002), работающую в формате непрерывного обмена низкомолекулярных компонентов (CECF). Однако в такой системе от 30 до 60% всего синтезированного проинсулина оказывалось в осадке. Очевидно, что такой результат свидетельствовал о неправильном сворачивании значительной части синтезируемого белка.

Рисунок 7. Аминокислотная последовательность проинсулина человека, закодированная в плазмиде pETInsHis6. Серым цветом выделены аминокислотные остатки, отсутствующие в лроинсулине человека.

В последующих опытах был осуществлен поиск условий, позволяющих получать синтезируемый проинсулин в растворимой форме с гораздо большим выходом. Для анализа распределения белка между фазами раствора и осадка реакционную смесь по завершении работы системы трансляции фракционировали с помощью низкоскоростного центрифугирования. Количество белка в осадке и надосадочной жидкости измеряли по радиоактивности [14С]лейцина, включенного в состав белка. В серии экспериментов варьировали объём реакционной смеси, концентрацию S30 экстракта и температуру. В подобранных условиях бесклеточной системы (микрореактор объёмом 50 мкл, 30°С, 35% S30 экстракта Е. coli, отсутствие дитиотреита) за 24 часа было синтезировано 75 мкг проинсулина, что соответствовало 1,5 мг на 1 мл системы, лишь 15 мкг (20% синтезированного белка) находилось в осадке. В реакторе фирмы Roche (Martin, Kawaguchi et al. 2001), вмещающем 1 мл реакционной смеси, было получено 1,8 мг проинсулина, из которых 0,3 мг (17%) находилось в осадке. Был сделан вывод, что увеличение объёма реакционной смеси не сказывается отрицательно на количестве и растворимости синтезируемого проинсулина (Рис. 8).

Существенным параметром, влияющим на растворимость синтезированного проинсулина, оказалась концентрация S30 экстракта Е. coli в системе трансляции. Результаты препаративного синтеза при разных концентрациях экстракта приведены в таблице 1. Снижение концентрации экстракта приводило к увеличению фракции растворимого продукта синтеза, достигая значений в 90% и выше. При этом количество синтезированного белка оставалось высоким даже при концентрации экстракта, составляющей 17,5%. Вероятно, сворачивание проинсулина происходило более эффективно при замедленном синтезе, осуществляемом при низких концентрациях экстракта. В пользу этого предположения свидетельствует также факт повышения эффективности сворачивания при снижении температуры

N# / /

^SNCSLVQLENYCN^

g \

инкубации системы до 25°С. В предварительных опытах было установлено, что при температуре 30°С бесклеточные системы синтеза белка производят наибольшее количество проинсулина. Оказалось, однако, что снижение температуры до 25°С приводит к увеличению фракции растворимого проинсулина, незначительно снижая общее количество синтезированного белка.

Проинсулин, мг/мл 2

1,5-

0.5-

Рисунок 8. Синтез проинсулина человека в системе трансляции с непрерывным обменом (СЕСР) в реакторах разного объёма. Количество белка в осадке и надосадочной жидкости измеряли по радиоактивности включенного в состав белка [14С]лейцина. Серые столбики - осадок. Белые столбики - надосадочная жидкость. Во врезках показаны ЗОЗ-электрофореграммы аликвот из фракций осадка и надосадочной жидкости, полученных с помощью центрифугирования реакционной смеси. Гели окрашены Кумасси 6-250.

Фракция растворимого белка **"' —ПРОИНСУЛИН

Правильность формирования дисульфидных связей в молекуле проинсулина проверяли методом пептидных карт, получаемых с помощью гидролиза белка протеазой V8 (Cowley and Mackin 1997). С помощью низкоскоростного центрифугирования из реакционной смеси удаляли агрегаты синтезированного белка. Из надосадочной жидкости выделяли проинсулин при помощи аффинной

хроматографии на никелевой сефарозе. Полученный практически чистый проинсулин гидролизовали протеазой V8 из Staphylococcus aureus. Пептиды гидролизата разделяли методом высокоэффективной гидрофобной хроматографии на жидкостном хроматографе. Для идентификации пептидов их молекулярные массы определяли с помощью масс-спектрометрии. На пептидных картах не удалось обнаружить пептидных фрагментов проинсулина, связанных дисульфидными мостиками, хотя фрагменты проинсулина, не содержащие цистеиновых остатков, были представлены на пептидных картах в количествах, близких к эквимолярным. В контрольном опыте, когда протеолизу подвергали проинсулин после расщепления дисульфидных мостиков дитиотреитом, были найдены практически все пептиды, образование которых под действием протеазы V8 теоретически возможно.

Таблица 1. Влияние концентрации S30 экстракта £ со//' в бесклеточной системе транскрипции-трансляции на растворимость синтезируемого проинсулина человека.

Концентрация S30 экбтракта Е. coli Проинсулин в растворе, мг/мл системы трансляции Проинсулин в осадке, мг/мл системы трансляции Фракция растворимого проинсулина, %

8,8 % 0,66 0,03 96

17,5% 2,39 0,16 94

17,5% 2,7 0,20 93

35% 2,89 1,77 62

35% 2,96 1,30 69

52,5 % 3,32 3,78 47

В дальнейших опытах использовали плазмиду рЕНпв, кодирующую

проинсулин без гексагистидинового тракта, чтобы исключить его возможное влияние

на сворачивание белка или образование дисульфидных мостиков в синтезируемом

проинсулине. Нуклеотидная последовательность проинсулина человека находилась

в плазмиде под контролем промотора РНК-полимеразы фага Т7. Кодоны трех

добавочных С-концевых аминокислот и кодоны С-концевого гексагистидинового

тракта в последовательности отсутствовали (рис. 7). Оказалось, однако, что

удаление гистидинового тракта не привело к улучшению сворачивания проинсулина.

Бесклеточный синтез проинсулина без гистидинового тракта проводили в течении 24

часов в системе, содержащей 17,5% экстракта ЭЗО. В такой системе при 30°С за 24 часа было синтезировано 1,4 мг проинсулина на 1 мл реакционной смеси. При этом 0,92 мг синтезированного белка находилось в осадке.

8. Синтез проинсулина человека в присутствии детергентов

Для улучшения сворачивания синтезируемого проинсулина было решено добавить в систему трансляции детергенты в концентрациях, не ингибирующих белковый синтез. Синтез проинсулина проводили в присутствии дигитонина или Вгу-35. Концентрацию проинсулина в осадке и надосадочной жидкости определяли по плотности окрашивания полосы белка на электрофореграмме. Наилучшие результаты дало использование детергента Вгу-35 в концентрации 0,2% (рис. 9): было получено 1,5 мг проинсулина на 1 мл реакционной смеси, и только 0,08 мг находилось в осадке. Электрофореграммы белков из осадка и надосадочной жидкости приведены на рисунке 10. Видно, что фракция осадка состоит из практически чистого проинсулина, а в надосадочной жидкости проинсулин является одним из мажорных компонентов. Таким образом, показано, что добавление детергентов в бесклеточную систему транскрипции-трансляции не мешает синтезу белка и позволяет увеличивать выход растворимого продукта.

мг/мл

1.6 1-

1.2 -

0.8

0.4

О --------

проинсулин проинсулин проинсулин

+0,5% дигитонин +0,2% ВгН-35

Рисунок 9. Синтез проинсулина человека в бесклеточной системе трансляции непрерывного обмена в присутствии детергентов. Для анализа распределения белка между фазами раствора и осадка систему трансляции по завершении её работы фракционировали с помощью низкоскоростного центрифугирования. Количество белка в осадке и надосадочной жидкости измеряли по радиоактивности [14С]лейцина, включенного в состав белка. Серые столбики - осадок, белые -надосадочная жидкость.

ФРАКЦИЯ РАСТВОРИМОГО БЕЛКА

кДа

21.5 Ш

Рисунок 10. Электрофоретический анализ проинсулина человека, синтезированного в бесклеточной

3q'q системе трансляции в присутствии

детергента. Реакцию проводили 24 часа при 30°С в системе с 17,5% экстрактом в 14.3 'Ш « присутствии детергента Вгу-35 (0,2%).

Образцы из осадка и надосадочной

mm * - Проинсулин g 5 жидкости фракционировали с помощью

электрофореза (Schägger and von Jagow

1987). Гель окрашивали Кумасси G-250.

2,4

9. Определение активности проинсулина по активации рецептора инсулина

Для проверки правильности сворачивания проинсулина использовали тест на биологическую активность. Известно, что инсулин, полученный с помощью обработки проинсулина трипсином и карбоксипептидазой В, способен эффективно активировать рецептор инсулина (Zick, Kasuga et al. 1983). Интактный проинсулин также вызывает активацию рецептора инсулина, но в 50 раз более слабую. Поэтому синтезированный проинсулин перед тестированием обрабатывали трипсином и карбоксипептидазой В для получения инсулина.

Проинсулин получали так же, как описано в разделе 8. Синтез в бесклеточной системе трансляции проводили в присутствии 0,2% детергента Brij-35. После окончания синтеза реакционную смесь центрифугировали при 14000хд. Функциональную активность тестировали и в надосадочной жидкости, и в осадке после ренатурации белка. Надосадочную жидкость использовали как таковую, не выделяя из нее проинсулин. Полученный осадок, состоящий из практически чистого проинсулина, растворяли и ренатурировали по описанной методике (Winter, Lilie et al. 2002). Ренатурированный проинсулин обрабатывали трипсином и карбоксипептидазой В (Kemmler, Peterson et al. 1971) для получения инсулина. Аликвоту из надосадочной жидкости обрабатывали трипсином и

карбоксипептидазой В в таких же условиях. После протеолиза из реакционных смесей отбирали пробы, эквивалентные по содержанию синтезированного белка, и проводили реакцию с рецептором инсулина (Zick, Kasuga et ai. 1983). Для контроля использовали эквимолярную пробу коммерчески доступного инсулина («Novo Nordisk», Дания), добавив её к бесклеточной системе транскрипции-трансляции, не содержащей плазмиды. Результаты теста на обнаружение правильно свёрнутого проинсулина приведены на рис. 11. Очевидно, что в бесклеточной системе S30 экстракта Е. coli удалось синтезировать правильно свёрнутый проинсулин человека в растворимой форме. Фракция правильно свёрнутых молекул превышала 30% от количества синтезированного белка.

120000

80000

а и

40000 -

'! s 1 Ein

Q.Ü « О X со s 'С

u as

aс

-о I X

Я и

° й-Q. 3

ь-

СВ I

а)

О.

СЕ X

с >

X S

о о. п.

05 Ю

со s

CD CT)

s с

>, о

X S

Рисунок 11. Реакция активации рецептора инсулина. Источник инсулина указан под соответствующим столбиком гистограммы. В качестве контроля использовали аликвоту системы транскрипции-трансляции, не содержащей плазмиды, и препарат коммерчески доступного инсулина, добавленный к такой же аликвоте.

выводы

1. Обнаружено, что меченый гем избирательно связывается с рибосомами, синтезирующими глобин в бесклеточных системах трансляции ретикулоцитов кролика и зародышей пшеницы. Сделан вывод о приобретении полипептидными цепями специфической пространственной структуры, необходимой для связывания тема, в ходе их синтеза (котрансляционное сворачивание).

2. С помощью трансляции а-глобиновых мРНК, укороченных с З'-конца и лишенных стоп-кодона, выявлено, что способность связывать гем отсутствует у синтезируемых рибосомой глобиновых полипептидов длиной 75 аминокислотных остатков и менее и возникает по достижении растущей цепью длины 86 остатков и более.

3. Поскольку специфическое связывание тема возможно лишь при участии Е и Р спйралей гем-связывающего кармана (остатки 52-71 и 80-89, соответственно) в строго определенной ориентации, сделан вывод о котрансляционном формировании вторичной и третичной структуры этого кармана на рибосоме в непосредственной близости от пептидил-трансферазного центра.

4. На примере проинсулина человека продемонстрирована возможность синтеза функционально активного белка, содержащего дисульфидные связи, в бактериальной бесклеточной системе.

5. Показано, что замедление синтеза проинсулина в бесклеточной системе путем понижения температуры и снижения концентрации ряда компонентов системы, а также присутствие некоторых детергентов, может приводить к увеличению доли правильно свёрнутых молекул синтезируемого белка.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Колб В.А., Коммер А.А., Спирин А.С. (1987) Существует ли канал для синтезируемого на рибосоме пептида? Мечение транслирующих рибосом атомарным тритием. Докл. АН СССР, 296,1497-1501.

2. KomarA.A., KommerA., Krasheninnikov I.A., Spirin A.S. (1993) Cotranslational heme binding to nascent globin chains. FEBS Lett. 326, 261-263.

3. Kolb V.A., Makeyev E.V., Kommer A., Spirin A.S. (1995) Cotranslational folding of proteins. Biochem. Cell Biol.,73,1217-1220.

4. KomarA.A., KommerA., Krasheninnikov I.A., Spirin A.S. (1997) Cotranslational folding of globin. J. Biol. Chem. 272,10646-10651.

5. Kolb V.A., Kommer A., Spirin, A.S. (2002) Co-translational protein folding in prokaryotic and eukaryotic cell-free translation systems. In "Cell-Free Translation Systems", Ed. Spirin A.S., Springer-Verlag, Heidelberg, Berlin, New-York, 131-140.

6. Коммер A.A., Дашкова И.Г., Есипов Р.С., Мирошников А.И., Спирин А.С. (2005) Получение функционально активного проинсулина человека в бесклеточной системе трансляции. Докл. Акад. Наук, 401,696-700.

7. Svetlov M.S., KommerA., Kolb V.A., Spirin, A.S. (2006). Effective cotranslational folding of firefly luciferase without chaperones of Hsp70 family. Protein Science, 15, 242-247.

8. Shirokov V.A., Kommer A., Kolb V.A., Spirin, A.S. (2007) Continuous-exchange protein-synthesizing systems. In"Methods in molecular biology. In vitro transcription and translation protocols", Ed. Guido Grandi, Humana Press, Totowa, New Jersey, 1955.

Подписано в печать 21.10.2008 г.

Печать трафаретная

Заказ № 1001 Тираж: 100 экз.

Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (499) 788-78-56 www.autoreferat.ru

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Коммер, Айгар Акселович

ОГЛАВЛЕНИЕ.

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Первые бесклеточные системы трансляции.

1.1.1. Открытие синтеза белка в клеточных экстрактах.

1.1.2. Трансляция экзогенных матриц.

1.2. Прокариотические и эукариотические типы бесклеточных систем экспрессии.

1.2.1. Экстракт Е. col!.

1.2.2. Экстракт зародышей пшеницы (WGE).

1.2.3. Лизат ретикулоцитов кролика (RRL).

1.3. Форматы бесклеточных систем.

1.3.1. «Batch» формат.

1.3.2. Длительно работающие системы.

1.3.3. Бесклеточные системы непрерывного потока (CFCF).

1.3.4. Бесклеточные системы с непрерывным обменом (CECF).

1.3.5. «Чистая» система Уэда.

1.3.6. Искусственная клетка.

1.4. Матрицы для бесклеточных систем.

1.4.1. Структура прокариотической матрицы.

1.4.2. Трансляция безлидерных мРНК.

1.4.3. Кодоновый контекст.

1.4.4. Редкие ко доны.

1.4.5. Использование сигнальных пептидов.

1.4.6. Стабилизация матриц.

1.4.7. Одновременная экспрессия разных генов.

1.5. Экстракты Е. coli.

1.5.1. Генетика.

1.5.2. Выращивание клеток для приготовления бесклеточных экстрактов.

1.5.3. Приготовление экстракта.

1.6. Увеличение продуктивности бесклеточных систем.

1.6.1. Mg2+и фосфат.

1.6.2. Другие соли.

1.6.3. Нуклеотиды.

1.6.4. Аминокислоты.

1.6.5. Стабилизирующие компоненты.

1.6.6. Другие факторы.

1.6.7. Обеспечение системы энергией.

1.6.8. Соотношение объёма реакционной смеси и её поверхности.

1.7. Применение бесклеточных систем.

1.7.1. Включение неприродых аминокислот.

1.7.2. Применение бесклеточного синтеза для решения структуры белка.

1.7.3. Синтез антибактериальных пептидов.

1.7.4. Синтез мембранных белков.

1.7.5. Другие примеры использования бесклеточных систем.

1.8. Сворачивание белка.

1.8.1. Влияние температуры на сворачивание белка.

1.8.2. Влияние лигандов на сворачивание белка.

1.8.3. Синтез белков с диульфидными мостиками.

1.8.4. Влияние молекулярных шаперонов на сворачивание синтезируемого белка.

1.8.5. Влияние детергентов.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ.

2. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

2.1. Котрансляционное связывание гема полипептидными цепями а-глобина, синтезируемыми в бесклеточной системе из ретикулоцитов кролика.

2.2. Котрансляционное связывание гема цепями а-глобина, синтезируемыми в отсутствие свободных молекул гемоглобина.

2.3. Связывание гема незавершенными растущими цепями а-глобина.

2.4. Связывание гема на рибосомах с короткими растущими цепями а-глобина.

2.5. Зависимость связывания гема от длины незавершенных растущих цепей а-глобина.

2.6. Формирование структуры гем-связывающего центра глобина.

2.7. Препаративный синтез проинсулина человека в бесклеточной системе.

2.8. Синтез проинсулина человека в присутствии детергентов.

2.9. Определение активности проинсулина по активации рецептора инсулина.

МАТЕРИАЛЫ.

3. МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

3.1. Получение мРНК а-глобина.

3.2. Получение меченого гемина.

3.3. Расщепление мРНК а-глобина рибонуклеазой Н.

3.4. Получение мРНК а86, гомогенной по З'-концевой последовательности.

3.5. Трансляция в бесклеточной системе лизата ретикулоцитов кролика.

3.6. Бесклеточный синтез белка в экстракте из зародышей пшеницы.

3.7. Центрифугирование в градиенте сахарозы.

3.8. Оптимизация условий бесклеточного синтеза проинсулина.

3.9. Синтез проинсулина в препаративном масштабе.

3.10. Анализ формирования дисульфидных связей в проинсулине.

3.10.1. Приготовление хелирующей сефарозы.

3.10.2. Очистка проинсулина, содержащего гексагистидиновый тракт, с помощью металл-хелатной хроматографии.

3.10.3. Гидролиз синтезированного проинсулина протеазой V8.

3.11. Препаративный синтез проинсулина без гистидинового тракта.

3.12. Протеолиз синтезированного проинсулина для получения инсулина.

3.13. Определение активности инсулина по способности активировать рецептор.

3.14. Электрофорез белков в полиакриламидном геле.

3.14.1. Анализ белков с молекулярной массой более б кДа.

3.14.2. Анализ А и В цепей инсулина.

3.14.3. Электрофорез ДНК в агарозном геле.

3.14.4. Электрофорез РНК в полиакриламидном геле.

ВЫВОДЫ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Котрансляционное формирование функционально активных белков в процессе трансляции в бесклеточных системах"

Приобретение белком уникальной пространственной структуры является необходимым условием осуществления его биологической функции. Сворачивание белка остаётся самым непонятным в настоящее время этапом в процессе передачи наследственной информации от ДНК к функциональному белку. Механизм этого процесса и управляющие им законы не выяснены, несмотря на разнообразные экспериментальные и теоретические подходы, применяемые для его изучения и моделирования. Пристальный интерес к этой проблеме вызван не только её фундаментальной значимостью, но и важностью понимания механизмов сворачивания для медицины и биотехнологии. Сейчас известно, что многие наследственные заболевания связаны с мутациями, нарушающими сворачивание какого-либо белка. В частности, с нарушением сворачивания коллагена связаны многие болезни соединительной ткани (Baum and Brodsky 1999). К болезням, вызванным неправильным сворачиванием белков, относят также так называемые «прионовые заболевания» (Kelly 1998). Очевидна также важность знания закономерностей сворачивания белков для белковой инженерии и биотехнологии. Известно, что сверхпродукция целевых белков в клетках-продуцентах часто увеличивает уровень ошибок сворачивания, что приводит к образованию «телец включения». Это является серьёзным ограничением в получении больших количеств биологически активных рекомбинантных белков в условиях их суперпродукции.

Наиболее актуальны в решении проблемы сворачивания экспериментальные работы, в которых сворачивание белков исследуется в условиях максимального приближения к природной ситуации, к сворачиванию синтезированных de novo белков в клетках и бесклеточных экстрактах. Настоящая работа направлена на изучение сворачивания синтезированного de novo белка и определению этапа биосинтеза, на котором синтезируемая полипептидная цепь приобретает пространственную структуру нативного биологически активного белка. Подходы к исследованию сворачивания белка разнообразны и многочисленны. Однако подавляющее большинство этих исследований относится к сворачиванию полноразмерных полипептидных цепей в нативную структуру, когда в качестве исходного состояния цепи выступает полностью или частично денатурированный белок. Главным инструментом нашего исследования послужили бесклеточные системы трансляции, являющиеся хорошей моделью для изучения сворачивания белка в клетке, но допускающие значительно большую свободу для вмешательства и анализа, чем сама клетка.

В настоящее время принято считать, что котрансляционное сворачивание многодоменного белка происходит подоменно {Netzer and Hart! 1997), т.е. пространственная структура каждого домена формируется только после его синтеза и появления из рибосомы. Следствием этой концепции является вывод о посттрансляционном сворачивании однодоменных белков. Цель настоящей работы состояла в том, чтобы выяснить, возможно ли формирование незавершенным однодоменным белком, находящимся на рибосоме, пространственной структуры, идентичной или близкой соответствующей части нативной структуры правильно свёрнутого домена.

В нашей работе были поставлены следующие задачи: 1) определить, связывают ли растущие цепи а-глобина человека гемин, добавленный в бесклеточную систему трансляции; 2) выяснить, могут ли растущие полипептиды связывать свободный гем, не находящийся в составе эндогенного гемоглобина; 3) определить, по достижении какой длины растущие полипептиды приобретают компетентность к специфичному связыванию гема; 4) выяснить, можно ли синтезировать в бактериальной бесклеточной системе функционально активный белок, содержащий дисульфидные связи - проинсулин человека; 5) подобрать условия синтеза, при которых сворачивание проинсулина в нативную структуру происходит с высоким выходом.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Заключение Диссертация по теме "Молекулярная биология", Коммер, Айгар Акселович

выводы

1. Обнаружено, что меченый гем избирательно связывается с рибосомами, синтезирующими глобин в бесклеточных системах трансляции ретикулоцитов кролика и зародышей пшеницы. Сделан вывод о приобретении полипептидными цепями специфической пространственной структуры, необходимой для связывания гема, в ходе их синтеза {котрансляционное сворачивание).

3. Поскольку специфическое связывание гема возможно лишь при участии Е и F спиралей гем-связывающего кармана (остатки 52-71 и 80-89, соответственно) в строго определенной ориентации, сделан вывод о котрансляционном формировании вторичной и третичной структуры этого кармана на рибосоме в непосредственной близости от пептидил-трансферазного центра.

Приношу глубокую и искреннюю благодарность моему учителю и научному руководителю академику Александру Сергеевичу Спирину. Глубоко признателен Вячеславу Адамовичу Колбу, Марату Миратовичу Юсупову и Игорю Александровичу Крашенинникову за обучение, столь пригодившееся мне в научной работе.

От всего сердца благодарен Славе Колбу за многолетнюю дружбу и поддержку, всестороннюю помощь в течение всей моей работы, за инициирование процесса защиты и неоценимую помощь в написании, обсуждении и редактировании материалов диссертации, а также за выполнение огромного объёма организационной работы перед защитой диссертации.

Особая благодарность моему другу Антону Комару, совместно с которым мы работали в трудные девяностые годы и получили все результаты по котрансляционному сворачиванию глобина.

Отдельная благодарность моей супруге Ирине Дашковой. Вместе с ней была выполнена работа по бесклеточному синтезу проинсулина, и эта работа не появилась бы без её помощи и поддержки, особенно в написании диссертации.

Искренне благодарен моим коллегам Славе Колбу, Максиму Светлову, Володе Широкову, Кириллу Шишову и всему составу лаборатории механизмов биосинтеза белка Института белка РАН за всестороннюю помощь в работе и добрые, дружеские отношения. Столь же признателен коллегам по кафедре молекулярной биологии МГУ Виктору Васильевичу Асееву и Ивану Алексеевичу Аджубею за дружескую поддержку и помощь.

Глубоко благодарен В.Д. Васильеву, К.С. Василенко, A.T. Гудкову, А.Б. Четверину, И.А. Крашенинникову и А.В. Шишкову за интерес к моей работе и плодотворные дискуссии.

Хотел бы поблагодарить моих близких друзей за огромный вклад, внесённый в настоящую работу на эмоциональном и моральном уровне. Я очень признателен: Славе Колбу, Ларисе Николаевой, Серёже Яралову, Кате Бестужевой, Кириллу и Наташе Шишовым.

Приношу благодарность, моим оппонентам - за взятый ими на себя труд, К.В. Шишову -за организационную помощь, С. Хаустову-за редактирование автореферата.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Коммер, Айгар Акселович, Москва

1. Бони, И. В. (2006). "Разнообразие молекулярных механизмов инициации трансляции упрокариот." Молекулярная биология 40(4): 658-68.

2. Колб, В. А., А. А. Коммер, А. С. Спирин (1987). "Существует ли канал для синтезируемогона рибосоме пептида? Мечение транслирующих рибосом атомарным тритием." Докл. АН СССР 296: 1497-1501.

3. Коммер, А. А,, И. Г. Дашкова, Р. С. Есипов, А. И. Мирошников, А. С. Спирин (2005).

4. Получение функционально активного проинсулина человека в бесклеточной системе трансляции," Доклады Академии Наук 401: 696-700.

5. Коробко, В. Г., Е. Ф. Болдырева, Л. Н. Шингарова, А. И. Мирошников, В. Г. Гавриков, А. В.

6. Agashe, V. R., S. Guha, Н. С. Chang, P. Genevaux, М. Hayer-Hartl, М. Stemp, С. Georgopoulos,

7. F. U. Hart), J. М. Barral (2004). "Function of trigger factor and DnaK in multidomain protein folding: increase in yield at the expense of folding speed." Cell 117(2): 199-209.

8. Ahn, J. H., C. Y. Choi, D. M. Kim (2005). "Effect of energy source on the efficiency oftranslational termination during cell-free protein synthesis." Biochem Biophys Res Commun 337(1): 325-9.

9. Ahn, J. H.( H. S. Chu, T. W. Kim, I. S. Oh, C. Y. Choi, G. H. Hahn, C. G. Park, D. M. Kim (2005).

10. Cell-free synthesis of recombinant proteins from PCR-amplified genes at a comparable productivity to that of plasmid-based reactions." Biochem Biophys Res Commun 338(3): 1346-52.

11. Ahn, J. H., M. Y. Hwang, К. H. Lee, C. Y. Choi, D. M. Kim (2007). "Use of signal sequences as anin situ removable sequence element to stimulate protein synthesis in cell-free extracts." Nucleic Acids Res 35(4): e21.

12. Alakhov, Y. В., V. I. Baranov, S. I. Ovodov, L. A. Ryabova, A. S. Spirin (1995). Method ofpreparing polypeptides in cell-free translation system. United States Patent. 5478730.

13. Ali, M., H. Suzuki, T. Fukuba, X. Jiang, H. Nakano, T. Yamane (2005). "Improvements in thecell-free production of functional antibodies using cell extract from protease-deficient Escherichia coli mutant." J Biosci Bioeng 99(2): 181-6.

14. Anderson, C. W., J. W. Straus, B. S. Dudock (1983), "Preparation of a cell-free proteinsynthesizing system from wheat germ." Methods Enzymol 101: 635-44.

15. Anfinsen, С. B. (1973). "Principles that govern the folding of protein chains." Science181(96): 223-30.

16. Antonini, E. and M. Brunori (1971). Hemoglobin and myoglobin in their reactions withligands. Frontiers of biology. A. Neuberger and E. L. Tatum. Amsterdam,, North-Holland Publishing Company. 21:436.

17. Bain, J. D., C. Switzer, A. R. Chamberlin, S. A. Benner (1992). "Ribosome-mediatedincorporation of a non-standard amino acid into a peptide through expansion of the genetic code." Nature 356(6369): 537-9.

18. Baranov, V. I., N. V. Belitsina, A. S. Spirin (1979). "The use of columns with matrix-boundpolyuridylic acid for isolation of translating ribosomes." Methods Enzymol 59: 382-97.

19. Baranov, V. I., I. Morozov, S. A. Ortlepp, A. S. Spirin (1989). "Gene expression in a cell-freesystem on the preparative scale." Gene 84(2): 463-6.

20. Baranov, V. I. and A. S. Spirin (1993). "Gene expression in cell-free system on preparativescale." Methods Enzymol 217: 123-42.

21. Baum, J. and B. Brodsky (1999). "Folding of peptide models of collagen and misfolding indisease." Curr Opin Struct Biol 9(1): 122-8.i

22. Belitsina, N. V., M. A. Glukhova, A. S. Spirin (1979). "Elongation factor G-promotedtranslocation and polypeptide elongation in ribosomes without GTP cleavage: use of columns with matrix-bound polyuridylic acid." Methods Enzymol 60: 761-79.

23. Bergman, L. W. and W. M. Kuehl (1979). "Formation of an intrachain disulfide bond onnascent immunoglobulin light chains." J Biol Chem 254(18): 8869-76.

24. Bernabeu, C. and J. A. Lake (1982). "Nascent polypeptide chains emerge from the exitdomain of the large ribosomal subunit: immune mapping of the nascent chain." Proc Natl Acad Sci U S A 79(10): 3111-5.

25. Betton, J. M. (2003). "Rapid translation system (RTS): a promising alternative forrecombinant protein production." Curr Protein Pept Sci 4(1): 73-80.

26. Birjukov, S. V., P. N. Simonenko, V. A. Shirokov, S. G. Majorov, A. S. Spirin (2003). Methodfor synthesis of polypeptides in cell-free systems. United States Patent. #6,518,058 Bl.

27. Birjukov, S. V., P. N. Simonenko, V. A. Shirokov, A. S. Spirin (2004). Method for synthesis ofpolypeptides in cell-free systems. United States Patent. #6,783,957 Bl.

28. Blobel, G. and D. D. Sabatini (1970). "Controlled proteolysis of nascent polypeptides in ratliver cell fractions. I. Location of the polypeptides within ribosomes." J Cell Biol 45(1): 130-45.

29. Borsook, H. (1950). "Protein turnover and incorporation of labeled amino acids into tissueproteins in vivo and in vitro." Physiol Rev 30(2): 206-19.

30. Boyer, M. E., J. A. Stapleton, J. M. Kuchenreuther, C. W. Wang, J. R. Swartz (2008). "Cell-freesynthesis and maturation of FeFe. hydrogenases." Biotechnol Bioeng 99(1): 59-67.

31. Bucci, E. (1981). "Preparation of isolated chains of human hemoglobin." Methods Enzymol76: 97-106.

32. Buchberger, В., W. Mutter, A. Roder (2002). Matrix reactor: A new scalable reactor principlefor cell-free protein expression. Cell-free translation systems. A. S. Spirin. Berlin, Heidelberg, New York, Springer-Verlag: 121-28.

33. Busso, D., R. Kim, S. H. Kim (2003). "Expression of soluble recombinant proteins in a cell-freesystem using a 96-well format." J Biochem Biophys Methods 55(3): 233-40.

34. Busso, D., R. Kim, S. H. Kim (2004). "Using an Escherichia coli cell-free extract to screen forsoluble expression of recombinant proteins." J Struct Funct Genomics 5(1-2): 69-74.

35. Calhoun, К. A. and J. R. Swartz (2005a). "An economical method for cell-free proteinsynthesis using glucose and nucleoside monophosphates." Biotechnol Prog 21(4): 114653.

36. Calhoun, K. A, and J. R. Swartz (2005b). "Energizing cell-free protein synthesis with glucosemetabolism." Biotechnol Bioeng90(5): 606-13.

37. Calhoun, K. A. and J. R. Swartz (2006). "Total amino acid stabilization during cell-free proteinsynthesis reactions." J Biotechnol 123(2): 193-203.

38. Carmel, G. and J. W. Coulton (1991). "Internal deletions in the FhuA receptor of Escherichiacoli K-12 define domains of ligand interactions." J Bacteriol 173(14): 4394-403.

39. Chekulayeva, M. N., О. V. Kurnasov, V. A. Shirokov, A. S. Spirin (2001). "Continuousexchange cell-free protein-synthesizing system: synthesis of HIV-1 antigen Net." Biochem Biophys Res Commun 280(3): 914-7.

40. Chen, H., Z. Xu, P. Cen (2006). "High-level expression of human beta-defensin-2 gene withrare codons in E. coli cell-free system." Protein Pept Lett 13(2): 155-62.

41. Chen, H., Z. Xu, N. Xu, P. Cen (2005). "Efficient production of a soluble fusion proteincontaining human beta-defensin-2 in E. coli cell-free system." J Biotechnol 115(3): 30715.

42. Chen, W., J. Helenius, I. Braakman, A. Helenius (1995). "Cotranslational folding and calnexinbinding during glycoprotein synthesis." Proc Natl Acad Sci U S A 92(14): 6229-33.

43. Chumpolkulwong, N., K. Sakamoto, A. Hayashi, F. Iraha, N. Shinya, N. Matsuda, D. Kiga, A.

44. Urushibata, M. Shirouzu, K. Oki, T. Kigawa, S. Yokoyama (2006). "Translation of 'rare' codons in a cell-free protein synthesis system from Escherichia coli." J Struct Funct Genomics 7(1): 31-6.

45. Clemens, M. J. (1984). Translation of Eukaryotic Messenger RNA in Cell-Free Extracts.

46. Transcription and translation : a practical approach. B. D. Hames and S. J. Higgins. Oxford ; Washington, D.C., IRL Press: 231-270.

47. Conti, E., L. F. Lloyd, J. Akins, N. P. Franks, P. Brick (1996). "Crystallization and preliminarydiffraction studies of firefly luciferase from Photinus pyralis." Acta Crystallogr D Biol Crvstalloer 52(Pt 4): 876-8.

48. Cowley, D. J. and R. B. Mackin (1997). "Expression, purification and characterization ofrecombinant human proinsulin." FEBS Lett 402(2-3): 124-30.

49. Craik, C. S., S. R. Buchman, S. Beychok (1981). "02 binding properties of the product of thecentral exon of beta-globin gene." Nature 291(5810): 87-90.

50. Davis, J., D. Thompson, G. S. Beckler (1996). "Large scale dialysis cell-free system,"

51. Pro mega Notes Mae. 56:14-21.

52. Dawson, R. M. C., D. C. Elliott, W. H. Elliot, К. M. Jones (1990). Data for Biochemical

53. Research. New York, Oxford University Press.48. de Prat Gay, G., J. Ruiz-Sanz, J. L. Neira, F. J. Corrales, D. E. Otzen, A. G. Ladumer, A. R.

54. Fersht (1995). "Conformational pathway of the polypeptide chain of chymotrypsininhibitor-2 growing from its N terminus in vitro. Parallels with the protein folding pathway." J Mol Biol 254(5): 968-79.

55. De Sanctis, G., G. Falcioni, F. Polizio, A. Desideri, B. Giardina, F. Ascoli, M. Brunori (1994).

56. Demidov, V. V. (2004). Get it cell-free! Innovative technologies for high-throughput proteinexpression in vitro. Modem Drug Discovery. Washington D.C., American Chemical Society: 61-5.

57. Donis-Keller, H. (1979). "Site specific enzymatic cleavage of RNA." Nucleic Acids Res 7(1):179.92.

58. Endo, Y., Т. Oka, K. Ogata, Y. Natori (1993). "Production of dihydrofolate reductase by animproved continuous flow cell-free translation system using wheat germ extract." Tokushima J Exp Med 40(1-2): 13-7.

59. Endo, Y., S. Otsuzuki, K. Ito, K. Miura (1992). "Production of an enzymatic active proteinusing a continuous flow cell-free translation system." J Biotechnol 25(3): 221-30.

60. Fermi, G., M. F. Perutz, B. Shaanan, R. Fourme (1984). "The crystal structure of humandeoxyhaemoglobin at 1.74 A resolution." J Mol Biol 175(2): 159-74.

61. Fink, A. L. (1999). "Chaperone-mediated protein folding." Physiol Rev 79(2): 425-49.

62. Forster, A. C., Z. Tan, M. N. Nalam, H. Lin, H. Qu, V. W. Cornish, S. C. Blacklow (2003).

63. Programming peptidomimetic syntheses by translating genetic codes designed de novo." Proc Natl Acad Sci U S A 100(11): 6353-7.

64. Frydman, J., H. Erdjument-Bromage, P. Tempst, F. U. Hartl (1999). "Co-translational domainfolding as the structural basis for the rapid de novo folding of firefly luciferase." Nat Struct Biol 6(7): 697-705.

65. Frydman, J., E. Nimmesgern, K. Ohtsuka, F. U. Hartl (1994). "Folding of nascent polypeptidechains in a high molecular mass assembly with molecular chaperones." Nature 370(6485): 111-7.

66. Gale, E. F. and J. P. Folkes (1954). "Effect of nucleic acids on protein synthesis and aminoacid incorporation in disrupted staphylococcal cells." Nature 173(4417): 1223-7.

67. Ganoza, M. С., C. Cunningham, R. M. Green (1985). "Isolation and point of action of a factorfrom Escherichia coli required to reconstruct translation." Proc Natl Acad Sci U S A 82(6): 1648-52.

68. Georgopoulos, C. and W. J. Welch (1993). "Role of the major heat shock proteins asmolecular chaperones." Annu Rev Cell Biol 9: 601-34.

69. Gesteland, R. F. (1966). "Isolation and characterization of ribonuclease I mutants of

70. Escherichia coli." J Mol Biol 16(1): 67-84.

71. Gething, M. J. and J. Sambrook (1992). "Protein folding in the cell." Nature 355(6355): 3345.

72. Gilmore, R., M. C. Coffey, G. Leone, K. McLure, P. W. Lee (1996). "Co-translationaltrimerization of the reovirus cell attachment protein." EMBO J 15(11): 2651-8.

73. Green, R. H., B. R. Glick, M. C. Ganoza (1985). "Requirements for in vitro reconstruction ofprotein synthesis." Biochem Biophys Res Commun 126(2): 792-8.

74. Gurevich, V. V., I. D. Pokrovskaya, T. A. Obukhova, S. A. Zozulya (1991). "Preparative in vitromRNA synthesis using SP6 and T7 RNA polymerases." Anal Biochem 195(2): 207-13.

75. Hanes, J. and A. Pluckthun (1997). "In vitro selection and evolution of functional proteins byusing ribosome display." Proc Natl Acad Sci U S A 94(10): 4937-42.

76. Hardesty, В., R. Arlinghaus, J. Schaeffer, R. S. Schweet (1963). "Hemoglobin andpolyphenylalanine synthesis with reticulocyte ribosomes." Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 28: 215-22.

77. Hartl, F. U. (1996). "Molecular chaperones in cellular protein folding." Nature 381(6583):571.9.

78. Hecht, S. M., B. L. Alford, Y. Kuroda, S. Kitano (1978). ""Chemical aminoacylation" oftRNA's." J Biol Chem 253(13): 4517-20.

79. Henshaw, E. C. and R. Panniers (1983). "Translational systems prepared from the Ehrlichascites tumor cell." Methods Enzymol 101: 616-29.

80. Hirao, I., T. Ohtsuki, T. Fujiwara, T. Mitsui, T. Yokogawa, T. Okuni, H. Nakayama, K. Takio, T.

81. Yabuki, T. Kigawa, K. Kodama, T. Yokogawa, K. Nishikawa, S. Yokoyama (2002). "An unnatural base pair for incorporating amino acid analogs into proteins." Nat Biotechnol 20(2): 177-82.

82. Hirao, I., S. Yoshizawa, K. Miura (1993). "Stabilization of mRNA in an Escherichia coli cellfree translation system." FEBS Lett 321(2-3): 169-72.

83. Hohsaka, T. and M. Sisido (2002). "Incorporation of non-natural amino acids into proteins."

84. CurrOpin Chem Biol 6(6): 809-15.

85. Ishihara, G., M. Goto, M. Saeki, K. Ito, T. Hori, T. Kigawa, M. Shirouzu, S. Yokoyama (2005).

86. Expression of G protein coupled receptors in a cell-free translational system using detergents and thioredoxin-fusion vectors." Protein Expr Purif 41(1): 27-37.

87. Ishikawa, К., K. Sato, Y. Shima, I. Urabe, T. Yomo (2004). "Expression of a cascading geneticnetwork within liposomes." FEBS Lett 576(3): 387-90.

88. Jackson, R. and T. Hunter (1970). "Role of methionine in the initiation of haemoglobinsynthesis." Nature 227(5259): 672-6.

89. Jackson, R. J. and T. Hunt (1983). "Preparation and use of nuclease-treated rabbitreticulocyte lysates for the translation of eukaryotic messenger RNA." Methods Enzymol 96: 50-74.

90. Jewett, M. C. and J. R. Swartz (2004a). "Rapid expression and purification of 100 nmolquantities of active protein using cell-free protein synthesis." Biotechnol Prog 20(1): 102-9.

91. Jewett, M. C. and J. R. Swartz (2004b). "Mimicking the Escherichia coli cytoplasmicenvironment activates long-lived and efficient cell-free protein synthesis." Biotechnol Bioeng 86(1): 19-26.

92. Jiang, X., К. Oohira, Y. Iwasaki, H. Nakano, S. Ichihara, T. Yamane (2002). "Reduction ofprotein degradation by use of protease-deficient mutants in cell-free protein synthesis system of Escherichia coli." J Biosci Bioeng 93(2): 151-6.

93. Jiang, X., Y. Ookubo, I. Fujii, H. Nakano, T. Yamane (2002). "Expression of Fab fragment ofcatalytic antibody 6D9 in an Escherichia coli in vitro coupled transcription/translation system." FEBSLett 514(2-3): 290-4.

94. Josephson, К., M. C. Hartman, J. W. Szostak (2005). "Ribosomal synthesis of unnaturalpeptides." J Am Chem Soc 127(33): 11727-35.

95. Kang, S. H., D. M. Kim, H. J. Kim, S. Y. Jun, K. Y. Lee, H. J. Kim (2005). "Cell-free production ofaggregation-prone proteins in soluble and active forms." Biotechnol Prog 21(5): 1412-9.

96. Kang, S. H., T. J. Oh, R. G. Kim, T. J. Kang, S. H. Hwang, E. Y. Lee, C. Y. Choi (2000). "Anefficient cell-free protein synthesis system using periplasmic phosphatase-removed S30 extract." J Microbiol Methods 43(2): 91-6.

97. Keller, E. B. and J. W. Littlefield (1957). "Incorporation of C14-amino acids intoribonucleoprotein particles from the Ehrlich mouse ascites tumor." J Biol Chem 224(1): 13-30.

98. Keller, E. B. and P. C. Zamecnik (1956). "The effect of guanosine diphosphate andtriphosphate on the incorporation of labeled amino acids into proteins." J Biol Chem 221(1): 45-59.

99. Kelly, J. W. (1998). "The alternative conformations of amyloidogenic proteins and theirmulti-step assembly pathways." Curr Opin Struct Biol 8(1): 101-6.

100. Kemmler, W., J. D. Peterson, D. F. Steiner (1971). "Studies on the conversion of proinsulin toinsulin. I. Conversion in vitro with trypsin and carboxypeptidase B." J Biol Chem 246(22): 6786-91.

101. Keum, J. W., J. H. Ahn, C. Y. Choi, К. H. Lee, Y. C. Kwon, D. M. Kim (2006). "The presence of acommon downstream box enables the simultaneous expression of multiple proteins in an E. coli extract." Biochem Biophys Res Commun 350(3): 562-7.

102. Kiga, D., K. Sakamoto, K. Kodama, T. Kigawa, T. Matsuda, T. Yabuki, M. Shirouzu, Y. Harada,

103. Kigawa, Т., Т. Matsuda, Т. Yabuki, S. Yokoyama (2008). Bacterial cell-free system for highlyefficient protein synthesis. Cell-free protein synthesis : methods and protocols. A. S. Spirin and J. R. Swartz. Weinheim, Wiley-VCH: 83-97.

104. Kigawa, Т., Y. Muto, S. Yokoyama (1995). "Cell-free synthesis and amino acid-selectivestable isotope labeling of proteins for NMR analysis." J Biomol NMR 6(2): 129-34.

105. Kigawa, Т., Т. Yabuki, Y. Yoshida, M. Tsutsui, Y. Ito, T. Shibata, S. Yokoyama (1999). "Cell-freeproduction and stable-isotope labeling of milligram quantities of proteins." FEBS Lett 442(1): 15-9.

106. Kigawa, Т., E. Yamaguchi-Nunokawa, K. Kodama, T. Matsuda, T. Yabuki, N. Matsuda, R.1.hitani, O. Nureki, S. Yokoyama (2001). "Selenomethionine incorporation into a protein by cell-free synthesis." J Struct Funct Genomics 2(1): 29-35.

107. Kigawa, Т. and S. Yokoyama (1991). "A continuous cell-free protein synthesis system forcoupled transcription-translation." J Biochem 110(2): 166-8.

108. Kiho, Y. and A. Rich (1964). "Induced Enzyme Formed on Bacterial Polyribosomes." Proc Natl1. Acad Sci U S A 51:111-8.

109. Kim, D. M. and C. Y. Choi (1996). "A semicontinuous prokaryotic coupledtranscription/translation system using a dialysis membrane." Biotechnol Prog 12(5): 645-9.

110. Kim, D. M., C. Y. Choi, J. H. Ahn, T.-W. Kim, N.-Y. Kim, l.-S. Oh, C.-G. Park (2006).

111. Development of a Rapid and Productive Cell-free Protein Synthesis System." Biotechnol. Bioprocess Eng. 11: 235-39.

112. Kim, D. M., T. Kigawa, C. Y. Choi, S. Yokoyama (1996). "A highly efficient cell-free proteinsynthesis system from Escherichia coli." Eur J Biochem 239(3): 881-6.

113. Kim, D. M. and J. R. Swartz (1999). "Prolonging cell-free protein synthesis with a novel ATPregeneration system." Biotechnol Bioeng 66(3): 180-8.

114. Kim, D. M. and J. R. Swartz (2000a). "Oxalate improves protein synthesis by enhancing ATPsupply in a cell-free system derived from Escherichia coli." Biotechnol. Lett. 22:1537-42.

115. Kim, D. M. and J. R. Swartz (2000b). "Prolonging cell-free protein synthesis by selectivereagent additions." Biotechnol Prog 16(3): 385-90.

116. Kim, D. M. and J. R. Swartz (2001). "Regeneration of adenosine triphosphate fromglycolytic intermediates for cell-free protein synthesis." Biotechnol Bioeng 74(4): 30916.

117. Kim, D. M. and J. R. Swartz (2004). "Efficient production of a bioactive, multiple disulfidebonded protein using modified extracts of Escherichia coli." Biotechnol Bioeng 85(2): 122-9.

118. Kim, J., P. G. Klein, J. E. Mullet (1991). "Ribosomes pause at specific sites during synthesisof membrane-bound chloroplast reaction center protein Dl." J Biol Chem 266(23): 14931-8.

119. Kim, R. G. and C. Y. Choi (2000). "Expression-independent consumption of substrates incell-free expression system from Escherichia coli." J Biotechnol 84(1): 27-32.

120. Kim, R. G. and C. Y. Choi (2001). "Expression-independent consumption of substrates incell-free expression system from Escherichia coli." J Biotechnol 84(1): 27-32.

121. Kim, T. W., J. W. Keum, I. S. Oh, C. Y. Choi, H. C. Kim, D. M. Kim (2007). "An economical andhighly productive cell-free protein synthesis system utilizing fructose-1,6-bisphosphate as an energy source." J Biotechnol 130(4): 389-93.

122. Kim, T. W., J. W. Keum, I. S. Oh, C. Y. Choi, C. G. Park, D. M. Kim (2006). "Simple proceduresfor the construction of a robust and cost-effective cell-free protein synthesis system." J Biotechnol 126(4): 554-61.

123. Kim, T. W., D. M. Kim, C. Y. Choi (2006). "Rapid production of milligram quantities ofproteins in a batch cell-free protein synthesis system." J Biotechnol 124(2): 373-80.

124. Klammt, С., F. Lohr, В. Schafer, W. Haase, V. Dotsch, H. Ruterjans, C. Glaubitz, F. Bernhard2004). "High level cell-free expression and specific labeling of integral membrane proteins." Eur J Biochem 271(3): 568-80.

125. Klammt, C., D. Schwarz, F. Lohr, B. Schneider, V. Dotsch, F. Bernhard (2006). "Cell-freeexpression as an emerging technique for the large scale production of integral membrane protein." Febs J 273(18): 4141-53.

126. Knapp, K. G., A. R. Goerke, J. R. Swartz (2007). "Cell-free synthesis of proteins that requiredisulfide bonds using glucose as an energy source." Biotechnol Bioeng 97(4): 901-8.

127. Knapp, K. G. and J. R. Swartz (2004). "Cell-free production of active E. coli thioredoxinreductase and glutathione reductase." FEBS Lett 559(1-3): 66-70.

128. Knapp, K. G. and J. R. Swartz (2007). "Evidence for an additional disulfide reductionpathway in Escherichia coli." J Biosci Bioeng 103(4): 373-6.

129. Kodama, K., S. Fukuzawa, H. Nakayama, T. Kigawa, K. Sakamoto, T. Yabuki, N. Matsuda, M.

130. Shirouzu, K. Takio, K. Tachibana, S. Yokoyama (2006). "Regioselective carbon-carbon bond formation in proteins with palladium catalysis; new protein chemistry by organometallic chemistry." Chembiochem 7(1): 134-9.

131. Ко lb, V. A., E. V. Makeyev, A. Kommer, A. S. Spirin (1995). "Cotranslational folding ofproteins." Biochem Cell Biol 73(11-12): 1217-20.

132. Kolb, V. A., E. V. Makeyev, A. S. Spirin (1994). "Folding of firefly luciferase duringtranslation in a cell-free system." Embo J 13(15): 3631-7.

133. Kolb, V. A., E. V. Makeyev, A. S. Spirin (2000). "Co-translational folding of an eukaryoticmultidomain protein in a prokaryotic translation system." J Biol Chem 275(22): 16597601.

134. Komar, A. A., A. Kommer, I. A. Krasheninnikov, A. S. Spirin (1993). "Cotranslational hemebinding to nascent globin chains." FEBS Lett 326(1-3): 261-3.

135. Komar, A. A., A. Kommer, I. A. Krasheninnikov, A. S. Spirin (1997). "Cotranslational foldingof globin." J Biol Chem 272(16): 10646-51.

136. Krasheninnikov, I. A., A. A. Komar, I. A. Adzhubei (1991). "Nonuniform size distribution ofnascent globin peptides, evidence for pause localization sites, and a contranslational protein-folding model." J Protein Chem 10(5): 445-53.

137. Krogh, A., B. Larsson, G. von Heijne, E. L. Sonnhammer (2001). "Predicting transmembraneprotein topology with a hidden Markov model: application to complete genomes." J Mol Biol 305(3): 567-80.

138. Kudlicki, W., J. Chirgwin, G. Kramer, B. Hardesty (1995). "Folding of an enzyme into anactive conformation while bound as peptidyl-tRNA to the ribosome." Biochemistry 34(44): 14284-7.

139. Kudlicki, W., G. Kramer, B. Hardesty (1992). "High efficiency cell-free synthesis of proteins:refinement of the coupled transcription/translation system." Anal Biochem 206(2): 38993.

140. Kuem, J. W., T. W. Kim, C. G. Park, C. Y. Choi, D. M. Kim (2006). "Oxalate enhances proteinsynthesis in cell-free synthesis system utilizing 3-phosphoglycerate as energy source." J Biosci Bioeng 101(2): 162-5.

141. Kung, H. F„ B. Redfield, В. V. Treadwell, B. Eskin, C. Spears, H. Weissbach (1977). "DNAdirected in vitro synthesis of beta-galactosidase. Studies with purified factors." J Biol Chem 252(19): 6889-94.

142. Kung, H. F., B. Redfield, H. Weissbach (1979). "DNA-directed in vitro synthesis of betagalactosidase. Purification and characterization of stimulatory factors in an ascites extract." J Biol Chem 254(17): 8404-8.

143. Kuruma, У., K. Nishiyama, Y. Shimizu, M. Muller, T. Ueda (2005). "Development of aminimal cell-free translation system for the synthesis of presecretory and integral membrane proteins." Biotechnol Prog 21(4): 1243-51.

144. Kwon, Y. C., G. H. Hahn, К. M. Huh, D. M. Kim (2008). "Synthesis of functional proteinsusing Escherichia coli extract entrapped in calcium alginate microbeads." Anal Biochem 373(2): 192-6.

145. Lamborg, M. R. and P. C. Zamecnik (1960). "Amino acid incorporation into protein byextracts of E. coli." Biochim Biophys Acta 42: 206-11.

146. Lee, К. H., H. A. Joung, J. H. Ahn, К. O. Kim, I. S. Oh, Y. B. Shin, M. G. Kim, D. M. Kim (2007).

147. Real-time monitoring of cell-free protein synthesis on a surface plasmon resonance chip." Anal Biochem 366(2): 170-4.

148. Leutzinger, Y. and S. Beychok (1981). "Kinetics and mechanism of heme-induced refoldingof human alpha-globin." Proc Natl Acad Sci U S A 78(2): 780-4.

149. Li, H., M. Inoue, T. Yabuki, M. Aoki, E. Seki, T. Matsuda, E. Nunokawa, Y. Motoda, A.

150. Kobayashi, T. Terada, M. Shirouzu, S. Koshiba, Y. J. Lin, P. Guntert, H. Suzuki, Y. Hayashizaki, T. Kigawa, S. Yokoyama (2005). "Solution structure of the mouse enhancer of rudimentary protein reveals a novel fold." J Biomol NMR 32(4): 329-34.

151. Lin, L., G. N. DeMartino, W. C. Greene (1998). "Cotranslational biogenesis of NF-kappaBp50 by the 26S proteasome." CeN 92(6): 819-28.

152. Littlefield, J. W., E. B. Keller, J. Gross, P. C. Zamecnik (1955). "Studies on cytoplasmicribonucleoprotein particles from the liver of the rat." J Biol Chem 217(1): 111-23.

153. Liu, D. V., J. F. Zawada, J. R. Swartz (2005). "Streamlining Escherichia coli S30 extractpreparation for economical cell-free protein synthesis." Biotechnol Prog 21(2): 460-5.

154. Lockard, R. E., B. Alzner-Deweerd, J. E. Heckman, J. MacGee, M. W. Tabor, U. L.

155. RajBhandary (1978). "Sequence analysis of 5'32P. labeled mRNA and tRNA using polyacrylamide gel electrophoresis." Nucleic Acids Res 5(1): 37-56.

156. Luisi, P. L. (2002). "Toward the engineering of minimal living cells." Anat Rec 268(3): 20814.

157. Maeda, Т., M. Inoue, S. Koshiba, T. Yabuki, M. Aoki, E. Nunokawa, E. Seki, T. Matsuda, Y.

158. Makeyev, E. V., V. A. Kolb, A. S. Spirin (1996). "Enzymatic activity of the ribosome-boundnascent polypeptide." FEBS Lett 378(2): 166-70.

159. Malkin, L. I. and A. Rich (1967). "Partial resistance of nascent polypeptide chains toproteolytic digestion due to ribosomal shielding." J Mol Biol 26(2): 329-46.

160. Marcus, A., D. Efron, D. P. Weeks (1974). "The wheat embryo cell-free system." Methods1. Enzvmol 30(0): 749-54.

161. Marcus, A., B. Luginbill, J. Feeley (1968). "Polysome formation with tobacco mosaic virus

162. RNA." Proc Natl Acad Sci U S A 59(4): 1243-50.

163. Martemyanov, К. A., V. A. Shirokov, О. V. Kurnasov, A. T. Gudkov, A. S. Spirin (2001). "Cellfree production of biologically active polypeptides: application to the synthesis of antibacterial peptide cecropin." Protein Expr Purif 21(3): 456-61.

164. Martin, G. A., R. Kawaguchi, Y. Lam, A. DeGiovanni, M. Fukushima, W. Mutter (2001).

165. High-yield, in vitro protein expression using a continuous-exchange, coupled transcription/ translation system." Biotechniques 31(4): 948-50, 952-3.

166. Matsuura, Т., H. Yanagida, J. Ushioda, I. Urabe, T. Yomo (2007). "Nascent chain, mRNA, andribosome complexes generated by a pure translation system." Biochem Biophys Res Commun 352(2): 372-7.

167. Maurer, P., A. Moratzky, C. Fecher-Trost, V. Flockerzi, U. Lenk, T. Sommer, C. Volzing, R.

168. Zimmermann (2003). Cell-free synthesis of membrane proteins on a preparative scale. Cell-free protein expression. J. R. Swartz. Berlin, Heidelberg, New York, Springer-Verlag: 133-39.

169. McCarthy, J. E., W. Sebald, G. Gross, R. Lammers (1986). "Enhancement of translationalefficiency by the Escherichia coli atpE translational initiation region: its fusion with two human genes." Gene 41(2-3): 201-6.

170. McLaren, R. S., S. F. Newbury, G. S. Dance, H. C. Causton, C. F. Higgins (1991). "mRNAdegradation by processive 3'-5' exoribonucleases in vitro and the implications for prokaryotic mRNA decay in vivo." J Mol Biol 221(1): 81-95.

171. McQuillen, K., R. B. Roberts, R. J. Britten (1959). "Synthesis of Nascent Protein by

172. Ribosomes in Escherichia Coli." Proc Natl Acad Sci U S A 45(9): 1437-47.

173. Merrick, W. C. (1983). "Translation of exogenous mRNAs in reticulocyte lysates." Methods1. Enzvmol 101:606-15.

174. Michel-Reydellet, N., K. Calhoun, J. Swartz (2004). "Amino acid stabilization for cell-freeprotein synthesis by modification of the Escherichia coli genome." Metab Eng 6(3): 197203.

175. Michel-Reydellet, N., К. Woodrow, J. Swartz (2005). "Increasing PCR fragment stability andprotein yields in a cell-free system with genetically modified Escherichia coli extracts." J Mol Microbiol Biotechnol 9(1): 26-34.

176. Morita, E. H., T. Sawasaki, R. Tanaka, Y. Endo, T. Kohno (2003). "A wheat germ cell-freesystem is a novel way to screen protein folding and function." Protein Sci 12(6): 121621.

177. Mouat, M. F. (2000). "Dihydrofolate influences the activity of Escherichia coli dihydrofolatereductase synthesised de novo." Int J Biochem Cell Biol 32(3): 327-37.

178. Mullet, J. E., P. G. Klein, R. R. Klein (1990). "Chlorophyll regulates accumulation of theplastid-encoded chlorophyll apoproteins CP43 and D1 by increasing apoprotein stability." Proc Natl Acad Sci U S A 87(11): 4038-42.

179. Murtas, G., Y. Kuruma, P. Bianchini, A. Diaspro, P. L. Luisi (2007). "Protein synthesis inliposomes with a minimal set of enzymes." Biochem Biophys Res Commun 363(1): 12-7.

180. Nemetz, C., S. Wessner, S. Krupka, M. Watzele, W. Mutter (2002). Cell-free expression ofsoluble human erythropoietin. Cell-free translation systems. A. S. Spirin. Berlin, Heidelberg, New York, Springer-Verlag: 157-163.

181. Netzer, W. J. and F. U. Hartl (1997). "Recombination of protein domains facilitated by cotranslational folding in eukaryotes." Nature 388(6640): 343-9.

182. Nicola, A. V., W. Chen, A. Helenius (1999). "Co-translational folding of an alphavirus capsidprotein in the cytosol of living cells." Nat Cell Biol 1(6): 341-5.

183. Nirenberg, M. W. (1963). "Cell-free protein synthesis directed by messenger RNA."1. Methods Enzvmol. 6:17-23.

184. Nirenberg, M. W. and J. H. Matthaei (1961). "The dependence of cell-free protein synthesisin E. coli upon naturally occurring or synthetic polyribonucleotides." Proc Natl Acad Sci U S A 47:1588-602.

185. Nishimura, N., Y. Kitaoka, A. Mimura, Y. Takahara (1993). "Continuous protein synthesissystem with Escherichia coli S30 extract containing endogenous T7 RNA polymerase." Biotechnol. Lett. 15: 785-90.

186. Nishimura, N., Y. Kitaoka, M. Niwano (1995). "Cell-free system derived from heat-shocked

187. Escherichia coli: Synthesis of enzyme protein possessing higher specific activity." J. Ferment. Bioeng. 79:131-35.

188. Noireaux, V. and A. Libchaber (2004). "A vesicle bioreactor as a step toward an artificialcell assembly." Proc Natl Acad Sci U S A 101(51): 17669-74.

189. Noren, C. J., J. Spencer, S. J. Anthony-Cahill, M. C. Griffith, P. G. Schultz (1989). "A generalmethod for site-specific incorporation of unnatural amino acids into proteins." Science 244(4901): 182-8.

190. Oberholzer, Т., К. H. Nierhaus, P. L. Luisi (1999). "Protein expression in liposomes."

191. Biochem Biophys Res Commun 261(2): 238-41.

192. Ohashi, H., Y. Shimizu, B. W. Ying, T. Ueda (2007). "Efficient protein selection based onribosome display system with purified components." Biochem Biophys Res Commun 352(1): 270-6.

193. Olins, P. O. and S. H. Rangwala (1989). "A novel sequence element derived frombacteriophage T7 mRNA acts as an enhancer of translation of the lacZ gene in Escherichia coli." J Biol Chem 264(29): 16973-6.

194. Palmiter, R. D., J. Gagnon, K. A. Walsh (1978). "Ovalbumin: a secreted protein without atransient hydrophobic leader sequence." Proc Natl Acad Sci U S A 75(1): 94-8.

195. Pavlov, M. Y. and M. Ehrenberg (1996). "Rate of translation of natural mRNAs in anoptimized in vitro system." Arch Biochem Biophys 328(1): 9-16.

196. Pelham, H. R. and R. J. Jackson (1976). "An efficient mRNA-dependent translation systemfrom reticulocyte lysates." Eur J Biochem 67(1): 247-56.

197. Peters, Т., Jr. and L. K. Davidson (1982). "The biosynthesis of rat serum albumin. In vivostudies on the formation of the disulfide bonds." J Biol Chem 257(15): 8847-53.

198. Peterson, E. A. and D. M. Greenberg (1952). "Characteristics of the amino acidincorporating system of liver homogenates." J Biol Chem 194(1): 359-75.

199. Phillips, D. (1967). "The hen egg-white lysozyme molecule." Proc Natl Acad Sci U S A 57(2):484.95.

200. Pratt, J. M. (1984). Coupled transcription translation in prokaryotic cell-free systems.

201. Transcription and translation : a practical approach. B. D. Hames and S. J. Higgins. Oxford ; Washington, D.C., IRL Press: 179-209.

202. Qi, H., Y. Shimizu, T. Ueda (2007). "Ribosomal protein SI is not essential for the transtranslation machinery." J Mol Biol 368(3): 845-52.

203. Ramaswamy, К., H. Saito, H. Murakami, K. Shiba, H. Suga (2004). "Designer ribozymes:programming the tRNA specificity into flexizyme." J Am Chem Soc 126(37): 11454-5.

204. Rich, A., J. Warner, H. M. Goodman (1963). "The structure and function of polyribosomes."

205. Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 28: 269-85.

206. Roberts, В. E. and В. M. Paterson (1973). "Efficient translation of tobacco mosaic virus RNAand rabbit globin 9S RNA in a cell-free system from commercial wheat germ." Proc Natl Acad Sci USA70(8): 2330-4.

207. Roberts, R. В., Ed. (1958). Microsomal Particles and Protein Synthesis. New York,1. Pergamon Press.

208. Ryabova, L., E. Volianik, O. Kurnasov, A. Spirin, Y. Wu, F. R. Kramer (1994). "Coupledreplication-translation of amplifiable messenger RNA. A cell-free protein synthesis system that mimics viral infection." J Biol Chem 269(2): 1501-5.

209. Ryabova, L. A., D. Desplancq, A. S. Spirin, A. Pluckthun (1997). "Functional antibodyproduction using cell-free translation: effects of protein disulfide isomerase and chaperones." Nat Biotechnol 15(1): 79-84.

210. Ryabova, L. A., I. Morozov, A. S. Spirin (1998). "Continuous-flow cell-free translation,transcription-translation, and replication-translation systems." Methods Mol Biol 77: 179-93.

211. Ryabova, L. A., S. A. Ortlepp, V. I. Baranov (1989). "Preparative synthesis of globin in acontinuous cell-free translation system from rabbit reticulocytes." Nucleic Acids Res 17(11): 4412.

212. Ryabova, L. А., О. M. Selivanova, V. I. Baranov, V. D. Vasiliev, A. S. Spirin (1988). "Does thechannel for nascent peptide exist inside the ribosome? Immune electron microscopy study." FEBS Lett 226(2): 255-60.

213. Ryabova, L. A., L. M. Vinokurov, E. A. Shekhovtsova, Y. B. Alakhov, A. S. Spirin (1995).

214. Acetyl phosphate as an energy source for bacterial cell-free translation systems." Anal Biochem 226(1): 184-6.

215. Sambrook, J., E. F. Fritsch, T. Maniatis (1989). Molecular cloning : a laboratory manual.

216. Cold Spring Harbor, N.Y., Cold Spring Harbor Laboratory Press.

217. Sawasaki, Т., Y. Hasegawa, M. Tsuchimochi, N. Kamura, T. Ogasawara, T. Kuroita, Y. Endo2002). "A bilayer cell-free protein synthesis system for high-throughput screening of gene products." FEBS Lett 514(1): 102-5.

218. Sawasaki, Т., Т. Ogasawara, R. Morishita, Y. Endo (2002). "A cell-free protein synthesissystem for high-throughput proteomics." Proc Natl Acad Sci USA 99(23): 14652-7.

219. Schagger, H. and G. von Jagow (1987). "Tricine-sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gelelectrophoresis for the separation of proteins in the range from 1 to 100 kDa." Anal Biochem 166(2): 368-79.

220. Schweet, R., H. Lamfrom, E. Allen (1958). "The Synthesis of Hemoglobin in a Cell-Free

221. System." Proc Natl Acad Sci U S A 44(10): 1029-35.

222. Selmer, M. and A. Liljas (2008). "Exit biology: battle for the nascent chain." Structure 16(4):498.500.

223. Shimizu, Y., A. Inoue, Y. Tomari, T. Suzuki, T. Yokogawa, K. Nishikawa, T. Ueda (2001). "Cellfree translation reconstituted with purified components." Nat Biotechnol 19(8): 751-5.

224. Shimizu, Y., Y. Kuruma, B. W. Ying, S. Umekage, T. Ueda (2006). "Cell-free translationsystems for protein engineering." FebsJ 273(18): 4133-40.

225. Shine, J. and L. Dalgarno (1974). "The З'-terminal sequence of Escherichia coli 16Sribosomal RNA: complementarity to nonsense triplets and ribosome binding sites." Proc Natl AcadSciUSA 71(4): 1342-6.

226. Shirokov, V. A., A. Kommer, V. A. Kolb, A. S. Spirin (2007). "Continuous-exchange proteinsynthesizing systems." Methods Mol Biol 375:19-55.

227. Shishkov, A. V., E. S. Filatov, E. F. Simonov, M. S. Unukovich, V. I. Gol'danskii (1976).

228. Preparation of tritium-labeled biologically active compounds." Dokl Akad Nauk SSSR 228(5): 1237-9.

229. Siekevitz, P. (1952). "Uptake of radioactive alanine in vitro into the proteins of rat liverfractions." J Biol Chem 195(2): 549-65.

230. Sitaraman, K., D. Esposito, G. Klarmann, S. F. Le Grice, J. L. Hartley, D. K. Chatterjee (2004).

231. A novel cell-free protein synthesis system." J Biotechnol 110(3): 257-63.

232. Smith, W. P., P. C. Tai, B. D. Davis (1978). "Interaction of secreted nascent chains withsurrounding membrane in Bacillus subtilis." Proc Natl Acad Sci U S A 75(12): 5922-5.

233. Spirin, A. S. (1991). Cell-free protein synthesis bioreactor. Frontiers in Bioprocessing II P.

234. Todd, S. K. Sikdar and M. Beer. Washington, D.C, American Chemical Society: 1-43.

235. Spirin, A. S. (2002). Cell-free translation systems. Berlin, Heidelberg, New York, Springer1. Verlag.

236. Spirin, A. S. (2004). "High-throughput cell-free systems for synthesis of functionally activeproteins." Trends Biotechnol 22(10): 538-45.

237. Spirin, A. S., V. I. Baranov, L. A. Ryabova, S. Y. Ovodov, Y. B. Alakhov (1988). "A continuouscell-free translation system capable of producing polypeptides in high yield." Science 242(4882): 1162-4.

238. Spirin, A. S. and J. R. Swartz (2008). Cell-free protein synthesis systems: historicallandmarks, classification, and general methods. Cell-free protein synthesis : methods and protocols. A. S. Spirin and J. R. Swartz. Weinheim, Wiley-VCH: 1-34.

239. Svetlov, M. S., A. Kommer, V. A. Kolb, A. S. Spirin (2006). "Effective cotranslational foldingof firefly luciferase without chaperones of the Hsp70 family." Protein Sci 15(2): 242-7.

240. Tate, C. G. (2001). "Overexpression of mammalian integral membrane proteins forstructural studies." FEBS Lett 504(3): 94-8.

241. Tissieres, A., D. Schlessinger, F. Gros (1960). "Amino Acid Incorporation into Proteins by

242. Escherichia Coli Ribosomes." Proc Natl Acad Sci USA 46(11): 1450-63.

243. Tohda, H., N. Chikazumi, T. Ueda, K. Nishikawa, K. Watanabe (1994). "Efficient expressionof E. coli dihydrofolate reductase gene by an in vitro translation system using phosphorothioate mRNA." J Biotechnol 34(1): 61-9.

244. Udagawa, Т., Y. Shimizu, T. Ueda (2004). "Evidence for the translation initiation ofleaderless mRNAs by the intact 70 S ribosome without its dissociation into subunits in eubacteria." J Biol Chem 279(10): 8539-46.

245. Ueda, T. (2008). The constructive approach for cell-free translation. Cell-free proteinsynthesis : methods and protocols. A. S. Spirin and J. R. Swartz. Weinheim, Wiley-VCH: 35-50.

246. Ueda, Т., H. Tohda, N. Chikazumi, F. Eckstein, K. Watanabe (1991). "Phosphorothioatecontaining RNAs show mRNA activity in the prokaryotic translation systems in vitro." Nucleic Acids Res 19(3): 547-52.

247. Ugarov, V. I., I. Morozov, G. Y. Jung, A. B. Chetverin, A. S. Spirin (1994). "Expression andstability of recombinant RQ-mRNAs in cell-free translation systems." FEBS Lett 341(1): 131-4.

248. Uzawa, Т., A. Yamagishi, T. Ueda, N. Chikazumi, K. Watanabe, T. Oshima (1993). "Effects ofpolyamines on a continuous cell-free protein synthesis system of an extreme thermophile, Thermus thermophilus." J. Biochem. (Jpn.) 114: 732-34.

249. Vinarov, D. A., B. L. Lytle, F. C. Peterson, E. M. Tyler, B. F. Volkman, J. L. Markley (2004).

250. Cell-free protein production and labeling protocol for NMR-based structural proteomics." Nat Methods 1(2): 149-53.

251. Voloshin, A. M. and J. R. Swartz (2005). "Efficient and scalable method for scaling up cellfree protein synthesis in batch mode." Biotechnol Bioeng 91(4): 516-21.

252. Voloshin, A. M. and J. R. Swartz (2008). Large-scale batch reactions for cell-free proteinsynthesis. Cell-free protein synthesis : methods and protocols. A. S. Spirin and J. R. Swartz. Weinheim, Wiley-VCH: 207-235.

253. Volyanik, E. V., A. Dalley, I. A. McKay, I. Leigh, N. S. Williams, S. A. Bustin (1993). "Synthesisof preparative amounts of biologically active interleukin-6 using a continuous-flow cell-free translation system." Anal Biochem 214(1): 289-94.

254. Vorderwulbecke, S., G. Kramer, F. Merz, T. A. Kurz, T. Rauch, B. Zachmann-Brand, B. Bukau,

255. E. Deuerling (2004). "Low temperature or GroEL/ES overproduction permits growth of Escherichia coli cells lacking trigger factor and DnaK." FEBS Lett 559(1-3): 181-7.

256. Wada, Т., M. Shirouzu, T. Terada, Y. Ishizuka, T. Matsuda, T. Kigawa, S. Kuramitsu, S. Y.

257. Park, J. R. Tame, S. Yokoyama (2003). "Structure of a conserved CoA-binding protein synthesized by a cell-free system." Acta Crystallogr D Biol Crystallogr 59(Pt 7): 1213-8.

258. Wang, L., A. Brock, B. Herberich, P. G. Schultz (2001). "Expanding the genetic code of

259. Escherichia coli." Science 292(5516): 498-500.

260. Wang, S., H. Sakai, M. Wiedmann (1995). "NAC covers ribosome-associated nascent chainsthereby forming a protective environment for regions of nascent chains just emerging from the peptidyl transferase center." J Cell Biol 130(3): 519-28.

261. White, S. H. (2004). "The progress of membrane protein structure determination." Protein1. Sci 13(7): 1948-9.

262. Wiedmann, В., H. Sakai, T. A. Davis, M. Wiedmann (1994). "A protein complex required forsignal-sequence-specific sorting and translocation." Nature 370(6489): 434-40.

263. Winnick, T. (1950). "Studies on the mechanism of protein synthesis in embryonic andtumor tissues. II. Inactivation of fetal rat liver homogenates by dialysis, and reactivation by the adenylic acid system." Arch Biochem 28(3): 338-47.

264. Winter, J., H. Lilie, R. Rudolph (2002). "Renaturation of human proinsulin-a study onrefolding and conversion to insulin." Anal Biochem 310(2): 148-55.

265. Winterhalter, К. H., C. loppolo, E. Antonini (1971). "Distribution of heme in systemscontaining heme-free and heme-bound hemoglobin chains." Biochemistry 10(20): 37905.

266. Woodrow, К. A., I. O. Airen, J. R. Swartz (2006). "Rapid expression of functional genomiclibraries." J Proteome Res 5(12): 3288-300.

267. Woodrow, K. A. and J. R. Swartz (2007). "A sequential expression system for highthroughput functional genomic analysis." Proteomics 7(21): 3870-9.

268. Wuu, J. J. and J. R. Swartz (2008). "High yield cell-free production of integral membraneproteins without refolding or detergents." Biochim Biophys Acta.

269. Xu, Z., H. Chen, X. Yin, N. Xu, P. Cen (2005). "High-level expression of soluble human betadefensin-2 fused with green fluorescent protein in Escherichia coli cell-free system." Appl Biochem Biotechnol 127(1): 53-62.

270. Yabuki, Т., Т. Kigawa, N. Dohmae, K. Takio, T. Terada, Y. Ito, E. D. Laue, J. A. Cooper, M.

271. Kainosho, S. Yokoyama (1998). "Dual amino acid-selective and site-directed stable-isotope labeling of the human c-Ha-Ras protein by cell-free synthesis." J Biomol NMR 11(3): 295-306.

272. Yabuki, Т., Y. Motoda, K. Hanada, E. Nunokawa, M. Saito, E. Seki, M. Inoue, T. Kigawa, S.

273. Yokoyama (2007). "A robust two-step PCR method of template DNA production for high-throughput cell-free protein synthesis." J Struct Funct Genomics 8(4): 173-91.

274. Yamamoto, Y. I., H. Nagahori, S. Yao, S. T. Zhang, E. Suzuki (1996). "Hollow fiber reactor forcontinuous flow cell-free protein production." J. Chem. Eng. Jpn. 6:1047-50.

275. Yamane, Т., Y. Ikeda, T. Nagasaka, H. Nakano (2005). "Enhanced cell-free protein synthesisusing a S30 extract from Escherichia coli grown rapidly at 42 degrees С in an amino acid enriched medium." Biotechnol Prog 21(2): 608-13.

276. Yamasaki, К., T. Kigawa, M. Inoue, M. Tateno, T. Yamasaki, T. Yabuki, M. Aoki, E. Seki, T.

277. Matsuda, Y. Tomo, N. Hayami, T. Terada, M. Shirouzu, A. Tanaka, M. Seki, K. Shinozaki, S. Yokoyama (2005). "Solution structure of an Arabidopsis WRKY DNA binding domain." Plant Cell 17(3): 944-56.

278. Yang, J., G. Kanter, A. Voloshin, R. Levy, J. R. Swartz (2004). "Expression of active murinegranulocyte-macrophage colony-stimulating factor in an Escherichia coli cell-free system." Biotechnol Prog 20(6): 1689-96.

279. Yang, J., K. Kobayashi, H. Nakano, J. Tanaka, T. Nihira, Y. Yamada, T. Yamane (1999).

280. Modulator-mediated synthesis of active lipase of Pseudomonas sp. 109 by Escherichia coli cell-free coupled transcription/translation system." J Biosci Bioeng 88(6): 605-9.

281. Yin, G. and J. R. Swartz (2004). "Enhancing multiple disulfide bonded protein folding in acell-free system." Biotechnol Bioeng 86(2): 188-95.

282. Ying, B. W., H. Taguchi, M. Kondo, T. Ueda (2005). "Co-translational involvement of thechaperonin GroEL in the folding of newly translated polypeptides." J Biol Chem 280(12): 12035-40.

283. Ying, В. W., H. Taguchi, H. Ueda, Т. Ueda (2004). "Chaperone-assisted folding of a singlechain antibody in a reconstituted translation system." Biochem Biophvs Res Commun 320(4): 1359-64.

284. Ying, B. W., H. Taguchi, T. Ueda (2006). "Co-translational binding of GroEL to nascentpolypeptides is followed by post-translational encapsulation by GroES to mediate protein folding." J Biol Chem 281(31): 21813-9.

285. Yip, Y. К., M. Waks, S. Beychok (1972). "Influence of prosthetic groups on protein foldingand subunit assembly. I. Conformational differences between separated human alpha-and beta- globins." J Biol Chem 247(22): 7237-44.

286. Yokoyama, S. (2003). "Protein expression systems for structural genomics andproteomics." Curr Opin Chem Biol 7(1): 39-43.

287. Yoshida, A., S. Watanabe, J. Morris (1970). "Initiation of rabbit hemoglobin synthesis:methionine and formylmethionine at the N-terminal." Proc Natl Acad Sci U S A 67(3): 1600-7.

288. Yu, M., J. Souaya, D. A. Julin (1998). "The 30-kDa C-terminal domain of the RecB protein iscritical for the nuclease activity, but not the helicase activity, of the RecBCD enzyme from Escherichia coli." Proc Natl Acad Sci U S A 95(3): 981-6.

289. Yu, W., K. Sato, M. Wakabayashi, T. Nakaishi, E. P. Ko-Mitamura, Y. Shima, I. Urabe, T.

290. Yomo (2001). "Synthesis of functional protein in liposome." J Biosci Bioeng 92(6): 590-3.

291. Yusupov, M. M. and A. S. Spirin (1988). "Hot tritium bombardment technique for ribosomesurface topography." Methods Enzvmol 164:426-39.

292. Zarucki-Schulz, Т., С. Jerez, G. Goldberg, H. F. Kung, К. H. Huang, N. Brot, H. Weissbach1979). "DNA-directed in vitro synthesis of proteins involved in bacterial transcription and translation." Proc Natl Acad Sci U S A 76(12): 6115-9.

293. Zawada, J. and J. Swartz (2005). "Maintaining rapid growth in moderate-density

294. Escherichia coli fermentations." Biotechnol Bioeng 89(4): 407-15.

295. Zawada, J. and J. Swartz (2006). "Effects of growth rate on cell extract performance in cellfree protein synthesis." Biotechnol Bioeng 94(4): 618-24.

296. Zick, Y., M. Kasuga, C. R. Kahn, J. Roth (1983). "Characterization of insulin-mediatedphosphorylation of the insulin receptor in a cell-free system." J Biol Chem 258(1): 75-80.

297. Zubay, G. (1973). "In vitro synthesis of protein in microbial systems." Annu Rev Genet 7:267.87.

Информация о работе

Коммер, Айгар Акселович
кандидата биологических наук
Москва, 2008
ВАК 03.00.03

Диссертация

Котрансляционное формирование функционально активных белков в процессе трансляции в бесклеточных системах - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы