Мембраномоделирующие среды для бесклеточной продукции мембранных белков

Хабибуллина, Нелли Фамзуловна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Мембраномоделирующие среды для бесклеточной продукции мембранных белков
ВАК РФ 03.01.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Мембраномоделирующие среды для бесклеточной продукции мембранных белков"

005057068

11а правах рукописи

ХАБИБУЛЛИНА Нелли Фамзуловна

МЕМБРАНОМОДЕЛИРУЮЩИЕ СРЕДЫ ДЛЯ БЕСКЛЕТОЧНОЙ ПРОДУКЦИИ МЕМБРАННЫХ БЕЛКОВ

Специальность: 03.01.03 — Молекулярная биология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва - 2012

005057068

Работа выполнена на кафедре биоинженерии биологического факультета Федерального государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Московский государственный университет имени МВ.Ломоносова» и в лаборатории инженерии белка Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института биоорганической химии им. академиков М.М.Шемякина и Ю.А.Овчинникова Российской академии паук.

Научные руководители:

доктор биологических наук, профессор Долгих Дмитрий Александрович

кандидат биологических наук Люкманова Екатерина Назымовна

Официальные оппоненты:

Федоров Алексей Николаевич, доктор биологических наук, Курчатовский центр нано-, бионаук, информационных и конвергентных технологий с источниками синхротронного излучения и нейтронов и социогуманитарных наук Федерального государственного бюджетного учреждения «Национальный исследовательский центр «Курчатовский Институт», заведующий лабораторией биохимии.

Чупин Владимир Викторович, доктор химических наук, Федеральное государственно« бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Московский государственный университет тонких химических технологий им. М.В Ломоносова», профессор кафедры биотехнологии и бионанотехнологии.

Ведущая организация:

Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Центр «Биоинжеперия) Российской академии наук.

Защита состоится "15" ноября 2012 г. в 11.00 часов на заседании диссертационного совет; Д 501.001.76 по защите кандидатских и докторских диссертаций при Московско» государственном университете имени М.ВЛомоносова по адресу: 119234, Москва Ленинские Горы, МГУ, Биологический факультет, ауд. 389.

С диссертацией можно ознакомиться в Научной библиотеке МГУ имени М.В.Ломоносов (Фундаментальная библиотека, Ломоносовский проспект, 27, отдел диссертаций).

Автореферат разослан " октября 2012 года.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук

Крашенинников И.А.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы

Мембранные белки (МБ) человека являются перспективными мишенями для разработки новых фармакологических препаратов. Для создания лекарственных средств, обладающих высокой селективностью по отношению к мембранным рецепторам определенного типа, необходимо знание пространственной структуры рецептора-мишени. Несмотря на огромную важность для фундаментальных и прикладных исследований, в настоящее время МБ остаются малоизученными. Трудности, возникающие при структурно-функциональных исследованиях МБ, обусловлены рядом факторов. Во-первых, системы клеточной экспрессии в большинстве случаев не могут обеспечить продукцию МБ в нативной конформации в количествах, необходимых для структурных исследований. Применение гетерологичных систем, основанных на использовании бактериальных клеток, позволяет решить проблему количественного выхода МБ, однако часто приводит к агрегации молекул целевого белка и накоплению его в виде нерастворимых "телец включения". В этом случае для "восстановления" нативной конформации белковой молекулы требуется разработка процедуры ренатурации, эффективность которой часто невелика. Во-вторых, для стабилизации функционально активной конформации МБ требуется использование специальных мембраномоделирующих сред (мембранных миметиков), при этом выбор оптимального окружения для исследования конкретной белковой молекулы может представлять собой сложную и чрезвычайно трудоемкую задачу.

В последнее время для продукции МБ все чаще применяются бесклеточные белоксинтезирующие системы (ББС). Эти системы содержат все необходимые компоненты тля протекания процессов транскрипции и трансляции in vitro: ДНК, содержащую ген целевого белка, ДНК-зависимую РНК-полимеразу, факторы транскрипции и трансляции, .юлекулы тРНК, рибосомы, аминокислоты, нуклеотиды и энергетические субстраты. Зозможность синтеза белков как про-, так и эукариотического происхождения делает ББС /ниве реальным инструментом для решения многих задач современной молекулярной шологии и биотехнологии. Выходы целевых белков в таких системах достигают «скольких миллиграммов с 1 миллилитра реакционной смеси (PC), что позволяет толучать МБ в препаративных количествах. Помимо этого, в ББС можно осуществлять жнтез белков, токсичных для живых клеток. Открытый характер ББС делает возможным юбавление в PC различных компонентов и кофакторов, что в некоторых случаях юзволяет получать белки в нативной конформации. Так, например, для продукции МБ в застворимой форме в PC добавляют мембранные миметики, такие как мицеллы ;етергентов, липид-детергентные бицеллы, липосомы, липид-белковые нанодиски (ЛБН) и ip. Кроме того, ББС позволяют легко получать белковые препараты, селективно меченные ;табильными изотопами, что в ряде случаев облегчает проведение структурных «следований, например, методами ЯМР-спектроскопии.

Таким образом, разработка новых подходов для эффективной продукции МБ с использованием ББС является актуальной задачей молекулярной биологии и открывает новые возможности для структурно-функциональных исследований и практического применения этих фармакологически важных молекул.

Цель работы

Целью работы являлись разработка эффективных бесклеточных белоксинтезирующих систем на основе экстракта S30 Escherichia coli, а также изучение возможности применения различных мембраномоделирующих сред (мицелл детергентов, бицелл, липосом и липид-белковых нанодисков) для продукции МБ в растворимой форме с пространственной структурой, близкой к нативной, для их последующих структурно-функциональных исследований.

Объектами исследования являлись трансмембранный (ТМ) домен рецепторной тирозинкиназы ЕгЬВЗ человека (ТМ-ЕгЬВЗ), включающий одну ТМ-спираль, и мускариновый ацетилхолиновый рецептор Ml типа человека, содержащий семь ТМ-спиралей (М1-мАХР), относящийся к семейству рецепторов, сопряженных с G-белком (GPCR).

Основные задачи исследования

1) Разработать бесклеточные белоксинтезирующие системы для эффективной продукции ТМ-ЕгЬВЗ и М1-мАХР в количествах, достаточных для структурных и функциональных исследований.

2) Подобрать мембраномоделирующие среды, обеспечивающие синтез ТМ-ЕгЬВЗ и М1-мАХР в растворимой форме с пространственной структурой, близкой у нативной.

3) Методами ЯМР-спектроскопии провести сравнительный анализ пространственно? структуры ТМ-ЕгЬВЗ в различных мембраномоделирующих средах (мицеллы, бицеллы, липид-белковые нанодиски).

4) Подобрать условия очистки и ренатурации М1-мАХР в составе различных мембраномоделирующих сред.

5) Провести анализ лиганд-связывающей активности М1-мАХР в составе различны} мембраномоделирующих сред.

Научная новизна и практическая значимость работы

Все результаты, представленные в настоящей диссертационной работе, получень впервые.

1) Разработаны ББС для эффективной продукции ТМ-ЕгЬВЗ и М1-мАХР как в вид( осадка PC, так и в растворимой форме в присутствии мицелл детергентов, бицелл липосом и липид-белковых нанодисков (ЛБН).

2) Впервые методами ЯМР-спектроскопии определена пространственная структур; ТМ-ЕгЬВЗ в окружении мицелл додецилфосфохолина (ДФХ), и установлено, чтс димеризация домена происходит по мотиву, не типичному для рецепторны? тирозинкиназ семейства ErbB.

3) На примере ТМ-ЕгЬВЗ проведен сравнительный анализ эффективности бесклеточного синтеза МБ в растворимом и структурированном виде в присутствии различных мембранных миметиков. С использованием КД- и ЯМР-спектроскопии, а также кросс-сшивающих реагентов показано, что в окружении мицелл, бицелл и ЛБН ТМ-ЕгЬВЗ формирует спиральные структуры, способные к димеризации.

4) На примере ТМ-ЕгЬВЗ показана возможность проведения прямых структурных исследований МБ, котрансляционно встроенных в бицеллы и ЛБН, методами ЯМР-спектроскопии.

5) Показано, что использование в качестве А'-концевых партнеров Л'-конце в о го фрагмента бактериородопсина грамположительной бактерии Exiguobacterium sibiricum (ESR-таг), Л-конце в о го фрагмента рибонуклеазы А (S-таг) и белка Mistic из Bacillus subtilis позволяет увеличить выход М1-мАХР в 10 — 72 раза до уровня 0.5- 3.6 мг с 1 мл PC.

6) Осуществлен бесклеточный синтез М1-мАХР в присутствии ЛБН. Наличие правильной пространственной структуры лиганд-связывающего участка М1-мАХР, котрансляционно встроенного в ЛБН, подтверждено методом ЯМР-спектроскопии путем наблюдения специфического взаимодействия с антагонистом рецептора телензепином.

7) Разработаны протоколы солюбилизации и очистки М1-мАХР из осадка PC, а также ренатурации рецептора в смешанных мицеллах додецилмальтозид/холестерил гемисукцинат (ДДМ/ХГС). Показано наличие специфического взаимодействия М1-мАХР в составе мицелл ДДМ/ХГС с телензепином.

Результаты диссертационной работы могут быть интересны как с точки зрения фундаментальной науки, так и для прикладных разработок в области биотехнологии, фармакологии и медицины, например, при создании оптимальных протоколов продукции интегральных МБ. Кроме того, в перспективе, использование результатов работы может быть полезным для создания лекарственных препаратов, направленных на лечение онкологических заболеваний и расстройств нервной системы, связанных с дисфункциями рецепторных тирозинкиназ и мАХР.

Апробация работы

Основные материалы диссертационной работы докладывались и обсуждались на XXII Зимней международной молодежной научной школе "Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии" (Москва, Россия, 2009), конференции "Euromar" (Флоренция, Италия, 2010), 35-ом конгрессе FEBS (Гётеборг, Швеция, 20101), Втором русско-греческом симпозиуме BioNanoTox (Ираклион, Крит, Греция, 2011), XIX Международной конференции и дискуссионном научном клубе "Новые информационные технологии в медицине, биологии, фармакологии и экологии" (Ялта-Гурзуф, Крым, Украина, 2011), 36-ом конгрессе FEBS (Турин, Италия, 2011), Научной конференции по биоорганической химии и биотехнологии "X чтения памяти академика Юрия

Анатольевича Овчинникова" (Москва-Пущино, Россия, 2011), XXIV Зимней молодежной научной школе "Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии" (Москва, Россия, 2012), Научной конференции "Молекулярная и клеточная биология: прикладные аспекты" (Москва, Россия, 2012).

Личный вклад автора заключается в проведении теоретических и экспериментальных исследований. Основные результаты получены при непосредственном участии автора в планировании и проведении экспериментов. Исследования методами ЯМР-спектроскопии проведены совместно с к.ф.-м.н. н.с. К.С. Минеевым и к.ф.-м.н. с.н.с. 3.0. Шенкаревым, сотрудниками лаборатории биомолекулярной ЯМР-спектроскопии ИБХ РАН.

Публикации

По материалам диссертации опубликовано 15 работ, из которых 3- статьи в реферируемых научных журналах, включенных в список ВАК, 11 - тезисы Российских и международных конференций, также подана 1 заявка на патент РФ.

Структура и объем диссертации

Диссертация изложена на страницах машинописного текста, состоит из

Введения, трех глав (Обзор литературы, Материалы и методы, Результаты и обсуждение), а также Заключения и Выводов. Работа содержит Лв рисунков и 3 таблицы. Библиографический указатель содержит источников.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Бесклеточная продукция трансмембранного домена рецеиторной тнрозиикиназы

ЕгЬВЗ человека

Рецепторная тирозинкиназа ЕгЬВЗ принадлежит семейству рецепторов эпидермального фактора роста (EGFR, Epidermal Growth Factor Receptor; или ErbB, Erythroblastic Leukemia Viral Oncogene Homolog), участвующих в процессах пролиферации и дифференцировки клеток. Рецепторы семейства ErbB содержат вариабельный внеклеточный ^-концевой домен, отвечающий за связывание лигандов, мембранный домен, образованный одной TM-спиралью, и цитоплазматическую часть, в которую входят околомембранный домен, каталитический тирозинкиназный домен и С-концевая регуляторная область. За счет взаимодействия тирозинкиназных и TM-доменов рецепторы семейства ErbB формируют в мембране клетки каталитически неактивные гомо- или гетеродимерные комплексы. При связывании лиганда эти димеры рецепторов подвергаются конформационным перестройкам, ведущим к активации одного из внутриклеточных тирозинкиназных доменов. Дисфункция рецепторных тирозинкиназ часто является причиной злокачественной трансформации клеток.

Внутриклеточный тирозинкиназный домен рецептора ЕгЬВЗ не имеет самостоятельной ферментативной активности, тем не менее, так как рецепторы этого типа могут функционировать в виде гетеродимеров с другими представителями семейства ErbB, структурно-функциональные исследования ТМ-ЕгЬВЗ представляют интерес с точки

зрения создания новых биомедицинских препаратов, нацеленных па контролируемую регуляцию работы рецепторов семейства эпидермапьного фактора роста.

На основе гена, кодирующего ТМ-ЕгЬВЗ в виде слитной конструкции с геном тиоредоксина (плазмида была любезно предоставлена с.н.с. Лаборатории инженерии белка ИБХ РАН А.А.Шульгой), были получены последовательности генов ТМ-ЕгЬВЗ для продукции в виде индивидуального домена (остатки с 632 по 675, далее с 32 по 75), а также его укороченной мутантной формы (остатки 639-670, далее остатки 39-70, с заменой K39R, shTM-ЕгЬВЗ) (Рис.1). Обе последовательности содержали участки, кодирующие дополнительно А-концевой остаток Met и С-концевую гексагистидиновую последовательность (His6-Tar). Гены ТМ-ЕгЬВЗ и shTM-ЕгЬВЗ были клонированы в плазмиды на основе вектора pET22b(+) (Novagen, США) по сайтам рестрикции bideI и BamHl.

GKTHLTMALTVIAGLVVIFMMLGGTFLYWRGRRIQNKR (H)

TM-ErbB3 MQTLVLI ShTM-ЕгЬВЗ MG RTHLTMALTVIAGLWI

<H>6

Рис. I. Аминокислотные последовательности TM-ErbB3 и shTM-ЕгЬВЗ. Серым цветом выделены идентичные аминокислотные остатки.

В работе использовали ББС диализного типа на основе экстракта S30 Е. coli, в которой питающая и реакционная смеси разделены полупроницаемой мембраной. В качестве матриц использовали плазмиды pET-22b(+)/TM-ErbB3 и pET-22b(+)/shTM-ErbB3. Для продукции ТМ-ЕгЬВЗ был осуществлен подбор оптимальных концентраций ионов Mg2+ (11 мМ), К+ (80 мМ), а также плазмиды (0.3 мг/мл). Общее количество ТМ-ЕгЬВЗ, синтезированного в этих условиях, составило 1.8-2.0 мг/мл PC.

Выделение ТМ-ЕгЬВЗ из осадка реакционной смеси и анализ полученных препаратов

ТМ-ЕгЬВЗ является гидрофобным пептидом и при синтезе в бесклеточной системе образует нерастворимый осадок. Осадок PC, содержащий ТМ-ЕгЬВЗ, солюбилизировали либо в додецилсульфате натрия (ДСН), либо в додецилфосфохолине (ДХФ), детергенте наиболее часто используемом для структурных исследований методами ЯМР-спектроскопии. Солюбилизированные препараты очищали с помощью Ыг+-афинной хроматографии. Электрофоретический анализ показал высокую чистоту (>95%) очищенных препаратов ТМ-ЕгЬВЗ и отсутствие в них высокомолекулярных агрегатов (Рис. 2А, вкладка). Данные КД-спектроскопии подтвердили преимущественно спиральную структурную организацию ТМ-ЕгЬВЗ как в окружении мицелл ДСН, так и в мицеллах ДФХ (Рис. 2А). Содержание спиральных элементов во вторичной структуре белка в обоих случаях составляло примерно ~50%, что хорошо согласуется с данными, полученными ранее для других TM-доменов рецепторных тирозинкиназ семейства ErbB (-60%). Незначительное снижение доли спиральной структуры в случае ТМ-ЕгЬВЗ, видимо, связано с наличием в полученном белке дополнительного А-концевого остатка Met и шести С-концевых остатков His.

Для продукции селективно и тотально меченых вариантов домена в реакционную и питающую среды добавляли селективно или тотально меченые аминокислоты. Анализ селективно І5ЇМ-І1е-меченого варианта ТМ-ЕгЬВЗ методом ЯМР-спектроскопии выявил изменения в структуре домена при изменении молярного соотношения ДФХ/ТМ-ЕгЬВЗ в образце. Различные спектры ЯМР наблюдались при низких (молярное соотношение 45:1) и высоких (молярное соотношение 135:1) концентрациях детергента (Рис. 2Б). Вероятно, наблюдаемые конформационные переходы связаны с гомодимеризацией ТМ-ЕгЬВЗ при низких концентрациях ДФХ.

"Детергент: пептид'

135:1

118

1 мМ "Н-Ие ТМ-&ивЗ. 135 Ш ДФХ

119

фі 37

118

119

?120

121

i 55

?120

121

1 ыМ "М-ІІеТМ-ЬЬВЗ.

45 мМ ДФХ

i 49

♦

155 А

9 171

190 200

210 220 230 длина волны, нм

240 250

8.6 8.4 8.2 8.0 7.8 Н,м.д.

8.6 8.4 8.2 8.0 7.8 'Н.МЛ

Рис. 2. Исследование физико-химических свойств ТМ-ЕгЬВЗ. (А) КД-спектр и анализ в ПААГ (вкладка) препарата ТМ-ЕгЬВЗ. полученного из осадка РС и очищенного с помощью хроматографии на Ы1'-сефарозе в присутствии ДСН. 1 - маркер молекулярных масс, 2 -препарат ТМ-ЕгЬВЗ. (Б) 20 'Н,15Ы-НЯ(2С спектры '5Ы-11е-ТМ-ЕгЬВЗ, полученные при различных молярных соотношениях ДФХ/ТМ-ЕгЬВЗ. Вероятно, при соотношении 135:1 наблюдаются в основном мономеры домена, в то время как при соотношении 45:1 домен представлен в основном гомодимерами. Красным цветом показаны сигналы Ы-Не, имеющие внутримембранную локализацию.

Пространственная структура ТМ-ЕгЬВЗ в присутствии мицелл ДФХ, переход

"мономер-димер "

Для изучения пространственной структуры ТМ-ЕгЬВЗ в окружении мицелл ДФХ использовали укороченный вариант домена з11ТМ-ЕгЬВЗ, содержащий остатки (39-70). Для исследования эквимолярную смесь тотально 13С,15М-меченого з11ТМ-ЕгЬВЗ и эЬТМ-ЕгЬВЗ, состоящего из немеченых а.о., растворяли в суспензии мицелл ДФХ, при двух молярных соотношениях ДФХ/зЬТМ-ЕгЬВЗ (45:1 и 135:1). Общая концентрация домена в смеси составляла 2 мМ.

Исследование образца с молярным соотношением ДФХ/эЬТМ-ЕгЬВЗ 45:1 методами гетероядерной ЯМР-спектроскопии (Рис. 3) позволило установить, что пространственная структура бЬТМ-ЕгЬВЗ в окружении мицелл ДФХ включает в себя одну а-спираль, образованную а.о. с 42 по 70. В спектрах ЫОЕЗУ, измеренных с гетероядерной фильтрацией, наблюдались ЯЭО контакты между мечеными и немечеными молекулами домена. Полученные данные напрямую показали формирование молекулами зЬТМ-ЕгЬВЗ

спиральных симметричных гомодимеров с параллельной ориентацией субъединиц (Рис. 4). ЯМР исследование образца с молярным соотношением ДФХ/вЬТМ-ЕгЬВЗ 135:1 не выявило наличия межмолекулярных контактов, что подтвердило переход домена в мономерную форму при увеличении концентрации детергента. Согласно полученным данным переход мономер-димер не вызывает значительных изменений в пространственной структуре домена (Рис. ЗБ).

Т43 Т40

1.46

О 1МеР39№Я70 Т47

Р!67М58 М57 .

Н71

г«.

Ч?Т62 .

Р56

к70

155 л

К39 О

"УУЪ Ы2 У48 У 65 Ъ Ь52

1.59

Р63 А45 М44

Н76

М37

1Н, м.д.

"112 Б 90 мМ ДФХ

-114 360 <368*

С61

-116 » <338

-118 & 8

Т|ЗЖдфх^

-120 5

: ж (360 668 «

-122' 661

10 <338

-124 •л

270ммдфх£51

-126

<360 <368 ф

-128 <361

* в38

ИЗО

105

110

105

110

105

110

1Н, м.д.

Рис. 3. Фрагменты 1 Н-^-ТЮЗУ ЯМР-спектров 2 мМ смеси ,3С,'5М-5ЬТМ-ЕгЬВЗ/эЬТМ-ЕгЬВЗ в окружении мицелл ДФХ (40°С, рН 5.0). (А) Фрагмент спектра, измеренного в 90 мМ ДФХ. (Б) Фрагменты спектров, показывающие сигналы остатков ау, измеренные при различных концентрациях ДФХ. Конг/ентрация детергента подписана для каждого спектра. Сигналы мономера 5ИТМ-ЕгЬВЗ показаны красным цветом. Условия экспериментов (за исключением концентрации детергента) не изменялись.

Для большинства МБ показано, что парные взаимодействия между отдельными а-спиралями в ТМ-доменах осуществляются либо посредством 004-мотива (ХхххХ, где X один из остатков в, А, Т, а х - любой а.о.), либо через так называемый "семичленный повтор" (ХххххххХ, где X - один из остатков О, А или в). В аминокислотной последовательности ТМ-ЕгЬВЗ представлены два повторяющихся 004 мотива (43Тххх47Тххх5|0), расположенные в А'-концевом участке ТМ-домена. Однако данные ЯМР-спектроскопии показали, что, взаимодействие между а-спиралями ТМ-ЕгЬВЗ осуществляется посредством остатков

11хх52ЬУх551Рхх59Ьххх<53РЬхх<,7К с образованием

левозакрученного гомодимера (Рис. 4А). Поверхность взаимодействия образована неполярными а.о. и занимает около 70% от длины ТМ-домена (Рис. 4Б). Димеризация ТМ сегментов ТМ-ЕгЬВЗ осуществляется за счет взаимодействий Ван-Дер-Ваальса между алифатическими и ароматическими боковыми цепями остатков 49-59, стекинга ароматических боковых цепей остатков 63Р и л-катионных взаимодействий между ароматическими кольцами остатков 63Р и гуанидиновыми группами остатков Я (Рис. 4В). Наблюдаемый в ТМ-ЕгЬВЗ мотив димеризации отличается от мотивов, ответственных за образование гомо- и гетеродимеров у других рецепторов семейства ЕгЬВ, димеризация которых происходит по ОС4-мотивам, расположенным в М- и С-концевых участках ТМ-домена. Таким образом, в ходе исследования была определена пространственная структура гомодимера эЬТМ-ЕгЬВЗ в мембраномоделирующем окружении мицелл ДФХ, и были выявлены участки спиралей, ответственные за димеризацию.

Рис. 4. Пространственная структура димера вкТМ-ЕгЬВЗ (А) - Набор из 20 структур димера якТМ-ЕгЬВЗ, рассчитанных по данным спектроскопии ЯМР и совмещенных по атомам основной цепи а.о. 40-70 обеих субъединиц. Основные цепи мономеров показаны черным цветом, боковые цепи - зеленым и пурпурным. (Б) - Доля площади поверхности а.о., участвующая в образовании интерфейса димеризации. (В) - Структура гомодимера яЬТМ-ЕгЬВЗ в ленточном представлении. Показаны боковые цепи остатков, находящихся на интерфейсе димеризации и участвующих в образовании 1хх ЬУх 1Гхх Еххх ТЬхх Я мотива.

Синтез ТМ-ЕгЬВЗ в присутствии мицелл детергентов

Для исследования возможности получения полноразмерного варианта ТМ-домена ЕгЬВЗ в растворимом и структурированном виде в настоящей работе был опробован подход, основанный на добавлении различных мембраномоделирующих сред (мицелл детергентов, бицелл, липосом и ЛБН) непосредственно в реакционную смесь. В качестве тестируемых детергентов были использованы как неионные детергенты (Бридж-35, Бридж-58, Бридж-78, Бридж-98, ДДМ, Тритон Х-100, Твин 20), которые, согласно литературным данным, широко применяются для поддержания молекул МБ в растворимой форме, так и

цвиттерионный детергент ДФХ, часто используемый в структурных исследованиях МБ методами ЯМР-спектроскопии. В реакционную и питающую смеси детергенты добавляли в различных концентрациях в диапазоне от 0.2 до 2%.

0 2.2 В 2.0

5 У 18

1| 16

1.4

1.2

1 1.0 0.8

ей 0.6

0.4 0.2 5 0.0

Т Общий выход синтезированного ТМ-ЕгЬВЗ □ Растворимая фракция ТМ-ЕгЬВЗ

дтсп — +

8.4

'Н, и д.

8.2 8.0

1 _-1__________

л.

-• ------ - - - — — ... _

г 1 Г1

4 »«

18 14

«Да

118

119 ¿120 ^121

122

К. ДФХ ДДМ 35 58 78

98 Тритон Твим Х-100 20

2 3

15,

М-Ие-ТМ-ЕгЬВЗ/ Бридж-58

а 120

Бридж Детергент (1%)

Рис. 5. (А) - Анализ эффективности синтеза ТМ-ЕгЬВЗ в присутствии мицелл детергентов. К. - контрольный образец, синтезированный без добавления мембранных миметиков в РС. Приведены усредненные значения, полученные из трех независимых экспериментов, относительная ошибка составляла не более ¡5%. Содержание ТМ-ЕгЬВЗ в образцах ог/енивали с помощью вестерн-блоттинга по сравнению с очищенным препаратом ТМ-ЕгЬВЗ/Бридж-58, концентрация белка в котором была определена спектрофотометрически. (Б) - Анализ в П.4АГ препарата ТМ-ЕгЪВЗ. синтезированного и очищенного в присутствии Бридж-58. I- маркер молекулярных весов; 2- и 3- ТМ-ЕгЪВЗ до и после обработки ДТСП, соответственно. Полосы, относящиеся к мономеру и димеру ТМ-ЕгЬВЗ, отмечены одной и двумя звездочками. (В) -2й 'Н,'5Ы-Н8<2С-спектр "Ы-Пе-ТМ-ЕгЬВЗ, синтезированного и очищенного в присутствии Бридж-58, (Г) - 2й 'Н,1!Ы-Н8()С-спектр "Ы-Пе-ТМ-ЕгЬВЗ, синтезированного в присутствии Бридж-58 и очищенного в присутствии ДФХ. В препаратах для ЯМР-анализа концентрация ТМ-ЕгЬВЗ составляла 0.2 мМ, а соотношение ТМ-ЕгЬВЗ/детергент составляло ~ 1:50.

Анализ растворимой и нерастворимой фракций РС с помощью вестерн-блоттинга показал, что добавление неионных детергентов, за исключением Твин 20, значительно повышает содержание ТМ-домена в растворимой форме (-80-95% от общего количества синтезированного белка, Рис. 5А). Однако в случае детергента Тритон Х-100 наблюдалось снижение общего выхода домена по сравнению с другими неионными детергентами. Наибольшие выходы ТМ-ЕгЬВЗ в растворимой форме наблюдались при концентрации неионных детергентов, равной 1%. Цвиттерионный детергент ДФХ практически полностью подавлял продукцию ТМ-ЕгЬВЗ, выход домена в этом случае составлял не более 0.1-0.15 мг/мл РС (Рис. 5А). Наибольший выход домена (~1.9 мг/мл) наблюдался в присутствии мицелл Бридж-58. Методом КД-спектроскопии было показано, что ТМ-ЕгЬВЗ в окружении мицелл Бридж-58 обладает вторичной структурой, идентичной структуре домена, солюбилизированного из осадка РС в мицеллах ДФХ и ДСН (Рис. 2А).

Анализ методом ЯМР-спектроскопии препарата 15Ы-11е-ТМ-ЕгЬВЗ, синтезированного и очищенного на №2+-смоле в присутствии Бридж-58, показал, что пространственная структура домена в этой среде отличается от структуры, наблюдаемой в мицеллах ДФХ (Рис. 5В). С другой стороны, электрофоретический анализ препарата домена в мицеллах Бридж-58, обработанного кросс-сшивающим реагентом (дитиобис(сукцинимидил пропионатом), ДТСП) активным по отношению к свободным аминогруппам, выявил способность пептида к димеризации (Рис. 5Б). Кроме того, после замены детергента Бридж-58 на ДФХ с помощью хелат-афинной хроматографии был получен 'Н-15Ы-ШОС спектр 13ТМ-11е-ТМ-ЕгЬВЗ, идентичный спектру в мицеллах ДФХ (Рис. 5Г). Видимо, домен, синтезированный в присутствии мицелл Бридж-58, обладает "квазинативной'' структурой.

Синтез ТМ-ЕгЬВЗ в присутствии бицелл и липосом

На следующем этапе исследования в качестве мембраномоделирующей среды для бесклеточного синтеза были опробованы бицеллы, состоящие из смеси липида димиристоилфосфатидилхолина (ДМФХ) и детергента дигексаноилфосфатидилхолина (ДГФХ) в молярном соотношении 1:2. Анализ растворимой и нерастворимой фракций РС с помощью вестерн-блоттинга обнаружил, что добавление бицелл способствует синтезу домена в растворимой форме, при этом оптимальная концентрация липида составляла 14.5 мМ (Рис. 6А). Однако только 30% от общего количества синтезированного ТМ-ЕгЬВЗ (-0.6

| Общий выход синтезированного ТМ-ЕгЪВЗ А □ Растворимая фракция ТМ-ЕгЬВЗ

§ г

5 Я

СО

Й41

2.2 2.0 1.8 1.6 1.4 1.2 1.0 0.8 -06 " 0.4 0.21" 00

8.4 8.2 8.0

'Н, м.д. 7.8 8.4

8.2 8.0 7.8

118 15ы-11е-тм-егызз/ м-ие-тм-егьвз/

♦ . дфх дмфх/дгфх

сг 119 149 ^ 137 149 <Ъ о 137

г «? 120 т— 155 С> 155

121 й 171 171

122 б в

К. бицеллы °

мМ, ДМФХ

Рис. 6. (А) - Анализ эффективности синтеза ТМ-ЕгЬВЗ в присутствии бицелл ДМФХ/ДГФХ (1:2) и липосом. К. - контрольный образец, синтезированный без добавления мембранных миметиков в РС. Приведены усредненные значения, полученные из трех независимых экспериментов, относительная ошибка составляла не более 15%. Содержание ТМ-ЕгЬВЗ в образцах оценивали с помощью вестерн-блоттинга (см. подпись к Рис. 5). (Б)- 2Р Н, Ы-НЯОС-спектр 13Ы-11е-ТМ-ЕгЬВЗ в мицеллах ДФХ. (В) - 20 'Н'3Ы-ТК05У-спектр РС, содержащей ,5Ы-Ие-ТМ-ЕгЬВЗ, синтезированный в присутствии бицелл ДМФХ/ДГФХ (1:2). В препаратах для ЯМР-анализа концентрация ТМ-ЕгЬВЗ составляла ~ 0.2 мМ.

мг/мл) находилось в растворимой фракции РС, что практически в 3 раза ниже, чем при использовании мицелл Бридж-58. В отличие от мицелл, в присутствии бицелл ДМФХ/ДГФХ ТМ-ЕгЬВЗ приобретал структуру, близкую к структуре домена в мицеллах ДФХ, что было продемонстрировано с помощью анализа препарата |5М-11с-ТМ-ЕгЬВЗ методами ЯМР-спектроскопии (Рис. 6В).

Также был опробован синтез ТМ-ЕгЬВЗ в присутствии моноламеллярных липосом ДМФХ. Оказалось, что добавление липосом в РС также способствовало синтезу ТМ-ЕгЬВЗ в растворимой форме. В этом случае содержание домена в растворимой фракции РС составило около 30% от общего количества синтезированного ТМ-ЕгЬВЗ, что сопоставимо с результатами, полученными в присутствии бицелл (Рис. 6А).

Синтез ТМ-ЕгЬВЗ в присутствии липид-белковых нанодисков

Липид-белковые нанодиски (ЛБН), или реконструированные незрелые частицы липопротеинов высокой плотности, являются альтернативной мембраномоделирующей средой. Каждый липид-белковый нанодиск представляет собой фрагмент бислойной мембраны, сформированный из -150-200 молекул фосфолипидов, гидрофобная часть которого экранирована от растворителя двумя молекулами аполипопротеина (в работе использовали фрагмент аполипопротеина А1 человека (42-243), так называемый М8Р).

Для синтеза ТМ-ЕгЬВЗ в растворимой форме были использованы ЛБН различного липидного состава, содержащие как анионные, так и цвиттерионные липидные молекулы с насыщенными и ненасыщенными жирнокислотными цепями. Анализ растворимой и нерастворимой фракций РС с помощью вестерн-блоттинга показал, что добавление ЛБН независимо от липидного состава значительно повышает содержание ТМ-домена в растворимой форме (-80-90% от общего количества синтезированного белка, Рис. 7А). Оптимальная концентрация ЛБН в РС составляла 0.05 мМ, повышение концентрации нанодисков до 0.2 мМ лишь незначительно увеличивало количество домена, синтезированного в растворимой форме.

Комплексы ТМ-ЕгЬВЗ/ЛБН были выделены из растворимой фракции РС и очищены на №+-сефарозе благодаря наличию Шэб-таг, эксклюзивно представленного на молекуле домена. Электрофоретический анализ (Рис. 7В, 3 дорожка) выявил совместную очистку молекул ТМ-ЕгЬВЗ и М81', что подтвердило формирование комплекса домена с ЛБН. Последующий анализ очищенных препаратов ТМ-ЕгЬВЗ/ЛБН методом гель-фильтрации показал, что только при использовании ЛБН, содержащих насыщенные липиды (ДМФХ и ДМФГ), размер комплексов составлял ~ 10 нм, что соответствует характерному размеру нанодисков. В случае же использования ЛБН, содержащих ненасыщенные липиды ПОФХ и смесь ПОФХ/ДОФГ, при котрансляционном встраивании домена наблюдалось разрушение нанодисков, сопровождающееся формированием комплексов размером -1525 нм и высвобождением молекул МвР (пик на хроматограмме, соответствующий размеру - 6 нм) (Рис. 7Б). Возможно, при встраивании пептида в ЛБН, содержащие ненасыщенные липиды, происходило слияние нанодисков (процесс, описанный ранее в литературе для липопротеиновых частиц высокой плотности).

Анализ структуры ТМ-ЕгЬВЗ в комплексе с ЛБН, содержащими ДМФХ и ДМФГ, был проведен методами ЯМР-спектроскопии с использованием селективно |5Ы-11е-меченого варианта ТМ-ЕгЬВЗ. Полученные 2Б '}1,'5Ы-ТК05У спектры комплексов ТМ-ЕгЬВЗ/ЛБН (Рис. 8Б, В) были сходны со спектрами домена в присутствии мицелл ДФХ (Рис. 8А). Чтобы подтвердить предполагаемое отнесение сигналов 15Ы-Пе в присутствии ЛБН/ДМФХ, был синтезирован селективно иЫ-11е-меченый укороченный вариант домена зЬТМ-ЕгЬВЗ, содержащий только 2 остатка Не. 2Т) 'н^ЛЖ^У спектр этого препарата (Рис. 8В, красные контуры) подтвердил предполагаемое отнесение сигналов остатков Не.

Т Общий выход синтезированного Д TM-ElbB3

О Растворимая фракция ТМ-ЕгЬВЗ р 2.2

I! ь 1.2 1.0

х s

jjS" g-e

Ш 0.6 і F 0.2 0.0

______L_

Г 1 •

- — — — _ -

•пустые" ЛБН ТМ-ЕгЬВЗ/ЛБН "пустые"ТМ-ЕгЬВЗ

б Диаметр Стокса, нм в ЛБН ЛБН

25 0152 9.3 5.7 3.5 25Л152 9.3 5.7 3.5 _ ^ ^ _„„

ЦIЫI

—116

MSP

1.5 2 2.5 3 3.5 1.5 2 2.5 3 3.5 Объем элюции, мл

ТМ-ЕгЬВЗ 1 2 3

— 45

— 35

— 25

— 18 — 14

кДэ

К. ДМФХ ПОФХ ПОФХ/ ДМФГ ДОФГ Липидный состав ЛБН

Рис. 7. (Д) - Анализ эффективности синтеза ТМ-ЕгЬВЗ в присутствии ЛБН. К. - контрольный образец, синтезированный без добавления мембранных миметиков в PC. Приведены усредненные значения, полученные из трех независимых экспериментов, относительная ошибка составляла не более 15%. Содержание ТМ-ЕгЬВЗ в образцах оценивали с помощью вестерн-блоттинга (см. подпись к Рис. 5). (Б)- Гель-фильтрационный анализ (Superdex-200, Tricorn 5/200, GE Healthcare) препаратов ЛБН различного липидного состава: до ("пустые ") и после котрансляционного встраивания ТМ-ЕгЬВЗ. ДМФГ-димиристоилфосфатидилглицерин. ПОФХ-пальмитоилолеоилфосфатидшхолин, ПОФХ/ДОФГ - смесь ПОФХ и

диолеоилфосфатидилглицерина (3:1). Звездочкой отмечен пик. соответствующий свободным молекулам MSP. (В) - Анализ в ПААГпрепаратов "пустых" ЛБН и комплексов ТМ-ЕгЬВЗ/ЛБН после очистки на Ni2*-сефарозе. 1- и 2- препарат ЛБН/ДМФХ до и после обработки ДТСП: 3-и 4- препарат ТМ-ЕгЬВЗ/ЛБН/ДМФХ до и после обработки ДТСП, 5- маркер молекулярных весов. Полосы, относящиеся к мономеру, димеру и тримеру ТМ-ЕгЬВЗ, отмечены одной, двумя и тремя звездочками, соответственно.

Анализ олигомерного состояния домена, встроенного в ЛБН/ДМФХ, с использованием кросс-сшивающего реагента ДТСП выявил присутствие как мономеров, димеров, так и тримеров ТМ-ЕгЬВЗ (Рис. 7В). Кроме того, на электрофорограммах наблюдались полосы, соответствующие мономеру и димеру MSP, а также комплексам ТМ-ЕгЬВЗ/MSP (Рис. 7В). Видимо, синтезированный ТМ-ЕгЬВЗ котрансляционно встраивается в нанодиски в виде мономера и впоследствии формирует гомодимеры. При этом встроенные молекулы домена не могут самопроизвольно покидать нанодиск и перемещаться между нанодисками. Статистическое распределение ТМ-ЕгЬВЗ между нанодисками в процессе синтеза ведет к формированию комплексов, содержащих одну,

две, три и т.д. молекулы домена. Вследствие этого при реакции с ДТСП в препарате фиксируются не только специфически образованные гомодимеры, но и различные неспецифически образованные комплексы.

Таким образом, было показано, что ЛБН, содержащие насыщенные липиды, являются оптимальной мембраномоделирующей средой для высокоэффективного синтеза ТМ-ЕгЬВЗ в растворимой и структурированной форме. Кроме того, показана возможность проведения прямых структурных исследований ТМ-ЕгЬВЗ, котрансляционно встроенного в бицеллы и ЛБН, методами ЯМР-спектроскопии.

8.4 8.2 8.0 7.8

Н, м.д. 8.4 8.2 8.0

7.8

8.4 8.2 8.0 7.8

Ч г

1П

118

119

120

I 49

О-

155

121

122 а

М-Не-ТМ-ЕгЬВЗ/ ^ ДФХ

137

171

ІЧ-ІІе-ТМ-ЕгЬВЗ/ ЛБН/ДМФГ

Ы-Ие-вЬТМ-ЕгЬВЗ, ЛБН/ДМФХ

ЛБН/ДМФХ

Рис. 8. 20 'Н, ,5Ы-ЯМР спектры различных препаратов ТМ-ЕгЬВЗ. (А) - Н8<2С-спектр ,5Ы-Ие-ТМ-ЕгЬВЗ в мицеллах ДФХ. (Б) - ТЮЪУ-спектр 15Ы-Пе-Ш-ЕгЬВЗ, синтезированного в присутствии ЛБН/ДМФГ. (В) - Наложение ТЯОВУ спектров '}Ы-11е-ТМ-ЕгЬВЗ (черные контуры) и 15Ы-Пе-зИТМ'ЕгЬВЗ (красные контуры), синтезированных в присутствии ЛБН/ДМФХ. Концентрация ТМ-ЕгЬВЗ 0.1 мМ.

Бесклеточная продукция мускаринового ацетилхолинового рецептора М1 типа

Мускариновые ацетилхоли новые рецепторы человека (мАХР) относятся к рецепторам, сопряженным с С-белками (ОРСЯ), первого типа. Они являются интегральными МБ, и имеют в своем составе 7 ТМ-спиралей (Рис. 9). Мускариновые ацетилхолиновые рецепторы выступают в качестве основных рецепторов ацетилхолина в парасимпатической нервной системе, но они также широко распространены и в центральной нервной системе. Лиганды, действующие на мАХР, в настоящее время широко используются в медицинских целях, например, для расширения зрачков в офтальмологии (атропин), для предотвращения морской болезни (скополамин), для лечения астмы (ипратропиум бромид) и болезни Паркинсона (тропацин). Эти рецепторы также являются перспективными мишенями для создания новых биомедицинских препаратов, нацеленных на лечение болезни Альцгеймера, шизофрении и наркомании. В ЦНС человека (неокортекс, гиппокамп и полосатое тело головного мозга) самым распространенным рецептором мАХР является рецептор М1 типа (М1-мАХР), который влияет на активность фосфолипазы С и опосредует ацетилхолин-индуцированный оборот инозитол-3-фосфата. Эти процессы влияют на мыслительную деятельность, сознание, обучение и память. Разработка эффективных систем продукции М1-мАХР в

функционально активной форме необходима для решения задач, связанных со структурно-функциональными исследованиями этого рецептора, а также для создания новых лекарственных препаратов.

Дизайн гена М1-мАХР

В работе использовали модифицированный вариант М1-мАХР, в котором были укорочены внеклеточная JV-концевая последовательность (удалены а.о. 1-18), последовательность, кодирующая третью внутриклеточную петлю между 5 и 6 ТМ спиралями (удалены а.о. 225-353) и внутриклеточная С-концевая последовательность (удалены а.о. 427-460), которые согласно литературным данным не участвуют в связывании лигандов. С целью уменьшения склонности молекул М1-мАХР к агрегации при образовании "ненативных" межмолекулярных дисульфидных связей методами сайт-направленного мутагенеза была осуществлена замена неспаренных остатков Cys (69, 205, 417, 421. 435, 460), имеющих трансмембранную и цитоплазматическую локализацию, на остатки Ser. Были сохранены внемембранные остатки Cys98 и Cys 178, Cys391 и Cys394, образующие дисульфидные связи (Рис. 9). Кроме того, в молекулу М 1-мАХР была введена С-концевая гексагистидиновая последовательность.

Ген укороченного варианта М 1-мАХР (М 1-мАХР) синтезировали методом ПЦР, используя праймеры, последовательность которых была рассчитана с помощью программы DNA Works с учетом частоты встречаемости ко донов в Е. coli. Полученный ген клонировали в вектор рЕТ22Ь(+) по сайтам рестрикции Nde\ и HindiII. В результате был получен вектор рЕТ22Ь(+)/М1-мАХР.

Рис. 9. Дизайн мутантного гена Ml-мЛХР. 1- Укороченная внеклеточная N-концевая область. 2- Замена остатков Cys (69, 205. 417, 421, 435, 460) на Ser. 3- Укороченная внутриклеточная петля между 5 и 6 ТМ-спиралями рецептора. 4- Укороченная внутриклеточная С-концевая область. Показаны дисульфидные связи между Cys98/Cysl78 и Cys391/Cys394.

Бесклеточный синтез М1-мАХР с различными N-концевыми партнерами

Прямая экспрессия укороченного гена М1-мАХР в ББС на основе экстракта S30 из Е. coli была малоэффективна. Выход целевого белка после очистки не превышал 0.05 мг с 1 мл PC. Мы предположили, что низкий выход М1-мАХР связан с малой эффективностью процесса инициации трансляции, вызванной образованием вторичной структуры фрагментом мРНК в области начала целевого гена. Для подтверждения этого предположения в гене М1-мАХР была проведена замена 5'-концевой последовательности, кодирующей внеклеточные .V-концевые а.о., предшествующие первой ТМ спирали (остатки 19-23), на нуклеотидную последовательность, кодирующую 6 первых а.о. бактериородопсина ESR (ESR-таг, MEEVNL). Бактериородопсин ESR из грамположительной бактерии Exiguobacterium sibiricum является структурным гомологом GPCR и также содержит 7 ТМ спиралей. Для гена ESR ранее наблюдалась высокоэффективная прямая экспрессия в ББС (выход целевого белка до 1.6 мг/мл PC). Введенная замена позволила увеличить эффективность продукции М1-мАХР до ~ 0.5 мг/мл. Полученные результаты подтвердили важную роль 5'-концевой последовательности гена для эффективной экспрессии в бесклеточной системе.

Для дальнейшей оптимизации бесклеточной продукции М1-мАХР были опробованы четыре А'-копцевых партнера. Два из них, Т7-таг (фрагмент лидерной последовательности белка 10 бактериофага Т7, 11 а.о., MASMTGGQQMG) и белок TRX (11.8 кДа), ранее применяли для бесклеточной продукции белков семейства GPCR, в то время как белок Mistic (12.8 кДа) использовали для продукции GPCR в клетках Е. coli. Кроме того, была опробована последовательность S-таг, кодирующая А'-концевой фрагмент рибонуклеазы А (16 а.о., MKETAAAKFERQHMDS), который применяется для детекции и очистки рекомбинантных белковых препаратов с помощью аффинной хроматографии и который ранее не применяли в качестве //-концевого партнера для рекомбинантной продукции МБ. В отличие от метода, использованного при дизайне гибридного гена с 5'-концевой последовательностью, кодирующей ESR-таг, нуклеотидные последовательности, кодирующие Т7-таг, TRX, Mistic и S-таг, были добавлены в единой рамке считывания на 5'-конец гена Mi-мАХР. Плазмида, содержащая ген Mistic, была любезно предоставлена с.н.с. Лаборатории инженерии белка ИБХ РАН Л.Е.Петровской.

Во всех случаях использование Л'-концевых партнеров вело к увеличению выхода М1-мАХР (Рис. 10А). Наиболее эффективными партнерами являлись S-таг (~ 3.6 мг/мл PC) и Mistic (3.0 мг/мл PC). Очищенные препараты М1-мАХР, солюбилизированные в детергенте ДСН (1%), были проанализированы с помощью электрофореза в ПААГ (Рис. 10Б). На электрофореограммах наблюдались отдельные полосы, соответствующие мономерам, димерам рецептора и агрегатам более высокого порядка. Наблюдаемая степень агрегации белковых препаратов зависела от последовательности использованного А-концевого партнера, а также, возможно, от концентрации белкового препарата в образце. Так, например, наибольшее количество высокомолекулярных агрегатов наблюдалось в образцах S-Tar-Ml-мАХР и Mistic-мАХР, синтез которых проходил с наибольшей эффективностью. Методом КД-спектроскопии была проанализирована

вторичная структура гибрида Е8Я-таг-М1-мАХР, который в растворе ДСН демонстрировал меньшую степень агрегации (Рис. 10В). Анализ полученных данных выявил преобладание а-спиральной структуры (а-спираяь 65 %, (3-лист 4 %, Р-поворот 9 %, неупорядоченная структура 22 %), что указывает на наличие частично сформированной вторичной структуры рецептора в окружении детергента ДСН. Следует отметить, что содержание сс-спиральных структурных элементов в молекуле укороченного рецептора М1-мАХР, рассчитанное по аналогии с известными кристаллическими структурами М2 и МЗ-мАХР, должно составлять ~ 72%. Дальнейшая работа была продолжена с Е8Ы-таг-М1-мАХР.

4,03.»......

з,о

И1,6

I 0,5-О

200 210 220 230 240 длина волны, нм

Рис. 10. (А). Анализ эффективности бесклеточного синтеза М1-мАХР в зависимости от используемого Ы-концевого партнера. Уровень синтеза М1-мАХР в отсутствие дополнительных Ы-концевых последовательностей обозначен «П.Э.» (прямая экспрессия). Уровень синтеза гибридных белков показан «незаполненными» столбцами, количество синтезированного М1-мАХР (столбцы серого цвета) показано за вычетом доли, занимаемой Ы-концевыми партнерами. Каждое приведенное значение получено на основе усреднения результатов 5 независимых экспериментов. (Б) - Электрофоретический анализ эффективности синтеза вариантов М1-мАХР с различными Ы-концевыми партнерами. (В) -КД-спектр Е8Я-таг-М1-мАХР в присутствии мицелл ДСН. Белки синтезировали в виде осадка РС без добавления мембраномоделирующих сред. Осадки растворяли в детергенте ДСН (1%) в присутствии 8М мочевины. Количественное содержание белковых препаратов оценивали спектрофотометрически по поглощению на длине волны 280 нм после очистки с помогцью А72+-афинной хроматографии в присутствии 1% ДСН.

Синтез ЕНН-таг-М1-мАХР в растворимой форме в присутствии мицелл детергентов

Для синтеза в растворимой форме ЕЗЯ-таг-МЬмАХР в реакционную и питающую смеси добавляли мицеллы неионных детергентов типа Бридж, Тритон Х-100 и Твин 20 в концентрации 1%. Электрофоретический анализ продуктов синтеза показал, что при использовании Бридж-58 более 90% от общего количества синтезированного белка находилось в растворимой фракции РС (0.36 мг/мл). При этом добавление Бридж-35, -78 и -98 приводило к снижению уровня продукции целевого белка в 2.5 раза (до 0.15 мг/мл). Детергенты Тритон Х-100 и Твин 20 также подавляли синтез белка, при этом их добавление в РС не способствовало продукции Е8Я-таг-М1-мАХР в растворимой форме (Рис. 11 А).

Электрофоретический анализ Е811-таг-М1-мАХР, синтезированного в присутствии Бридж-58 и очищенного с помощью хелат-аффинной хроматографии на №2+-сефарозе. показал, что во фракции, элюированной 100 мМ имидазолом, наравне с мономерами Е8Я-таг-М1-мАХР присутствуют высокомолекулярные агрегаты (Рис. 11Б, дорожка 7). Видимо, использование мицелл детергента Бридж-58 в качестве мембраномоделирующей среды хотя и способствует синтезу белка в растворимой форме, однако не обеспечивает условий для стабилизации мономерного состояния белка в растворе. Более того, эксперименты по взаимодействию с селективным агонистом рецептора телензипином, проведенные методами ЯМР-спектроскопии, показали отсутствие связывания ЕЗЯ-таг-М!-мАХР с лигандом, что свидетельствует об отсутствии у рекомбинантного рецептора нативной структуры в окружении мицелл Бридж-58.

0,3

* овцбе количество синтезированного

ШІ-таг-МІмАХР •РэсЩхйия фракцйя Е8К-тзг-М1-«АХР

.„„„л......

г 1 п .....П.....И......1........11

116,0 — 66,2 — 45.0 тт 35,0 —

26,0 — 18,4 — 14,4 —

ЕЗЯ-таг-МІ-мАХР

мер

14,4

•да

Бридж- Бридж- Бридж- Бридж- Тритон Твин-20 К0НТР°ЛЬ 36 58 78 98 Х-100

1 2 3 4 5 6 7

Рис. 11. (А) - Анализ эффективности синтеза Е8Я-таг-М1-мАХР в растворимой форме в присутствии мицелл детергентов. Приведены усредненные значения, полученные из трех независимых экспериментов, относительная ошибка составляла не более 15%. Содержание Е8Я-таг-М1 -мАХР в образцах оценивали по сравнению с препаратом рецептора в Бридж-58, очищенным на №2' -сефарозе, концентрация белка в котором была определена спектрофотометрически. (Б) - Электрофоретический анализ препаратов Е51(-таг-М1 -мАХР после очистки. 1— маркер молекулярных весов, 2- препарат, солюбилизированный из осадка РС и очищенный в присутствии ДФХ, 3-6- препарат, солюбилизированный из осадка РС и очищенный в присутствии ДФХ и смеси восстановленной (С-Ж) и окисленной (ОйВСу форм глутатиона, взятых в разных молярных соотношениях (1:1, 2:1, 4:1 и 10:1 — дорожки 3, 4, 5, б, соответственно), 7- препарат, синтезированный и очищенный в присутствии мицелл Бридж-58, 8- очищенный препарат, синтезированный в присутствии ЛБН/ДМФХ.

Синтез ЕЗЯ-таг-М 1-мАХР в присутствии липид-белковых нанодисков

Для синтеза ЕЗЯ-таг-МЬмАХР в растворимой форме в качестве мембранного миметика также были опробованы ЛБН. Из опыта работы с ТМ-ЕгЬВЗ было известно, что только ЛБН, содержащие насыщенные липиды, не разрушаются при котрансляционном встраивании белка. Для синтеза ЕвЯ-таг-М 1-мАХР ЛБН, содержащие насыщенные липиды ДМФХ и ДМФГ, добавляли в РС в концентрации 0.1 мМ. После синтеза растворимая фракция РС была очищена с помощью хелат-аффинной хроматографии. Электрофоретический анализ фракций, элюированных 300 мМ имидазолом, показал ассоциацию БЭЯ-таг-М 1-мАХР с ЛБН (Рис. 11Б, дорожка 8). Гель-фильтрационный анализ препаратов Е8Я-таг-М1-мАХР/ЛБН/ДМФХ и Е8Я-таг-М1-мАХР/ЛБН/ДМФГ выявил, что

только в случае использования ЛБН/ДМФХ в препарате сохраняется некоторое количество нанодисков с характерным диаметром — 10 нм. При этом в обоих случаях наблюдалось слияние нанодисков с образованием частиц размером более 20 нм (Рис. 12А).

Активность препарата ESR-Tar-Ml-мАХР/ЛБН/ДМФХ исследовали методом ЯМР-спектроскопии в экспериментах по взаимодействию с телензепином. Химическая формула телензепина и одномерный 'Н ЯМР-спектр лиганда приведены на рисунке 13А. В полученном ЯМР-спектре наблюдалось два набора сигналов лиганда, что указывало на наличие в растворе смеси двух изомеров телензепина, отличающихся конфигурацией (eis-Itrans-) связи N-C(O), которая имеет частично двойной характер. Для исследования активности полученного препарата рецептора к раствору телензепина (10 мкМ) постепенно добавляли раствор комплекса ESR-Tar-Ml-мАХР/ЛБН/ДМФХ. В одномерных спектрах ЯМР наблюдали сигнал от метальной группы телензепина (2.6 м.д.), который не перекрывался с сигналами от СН2- групп липидов из ЛБН (Рис. 13Б). При увеличении концентрации комплекса ESR-Tar-Ml-мАХР/ЛБН/ДМФХ сигнал метальной группы телензепина постепенно ослаблялся и сдвигался в сильное поле, что свидетельствовало о наличии взаимодействия между лигандом и рецептором. В качестве контроля было проведено титрование раствора телензепина "пустыми" ЛБН/ДМФХ, не содержащими рекомбинантный рецептор. Анализ полученных спектров подтвердил, что телензепин не взаимодействует с "пустыми" ЛБН.

Диаметр Стокса, нм Диаметр Стокса, нм 25.0 15.2 9.3 5.7 3.5 25.0 15.2 9.3 5.7 3.5

-пустые" ЛБН ESR-Tar-MI-иАХР

Диаметр Стокса, нм 25.0 15.2 9.3 5.7 3.5 25.0 15.2 9.3 5.7 3.5

Д дмфх ДМФХ Г J^ ДМФГ/^

J \ ДМФГ

1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 А Объем элюции, мл

1Л 2,0 2.5 3.0 3.5 Б Объем элюции, мл

1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 Объем элюции, мл

Рис. 12. (А). Гель-фильтрационный анализ (8ирегс!ех-200, Тг1СОгп 5/200) препаратов ЛБН различного липидного состава: до ("пустые ") и после котрансляционного встраивания ЕЗЯ-таг-МГмАХР. Звездочкой отмечен пик, соответствующий нанодискам (диаметр ~ 10 нм). (Б). Гель-фильтрационный анализ препаратов ЕБР-таг-МГмАХР, солюбилизированных из осадка РС и очищенных в присутствии мицелл ДФХ. /.- препарат, очищенный без добавления глутатиона, 25 — препараты, очищенные в присутствии смесей восстановленной (С8Н) и окисленной (ТЖЛЗ) форм глутатиона, взятых в разных молярных соотношениях (1:1, 2:1, 4:1, 10:12 — хроматогрешмы 2, 3, 4. 5, соответственно). Звездочкой отмечен пик, соответствующий мономеру Е5Р-таг-М1-мАХР в мицеллах ДФХ (диаметр — 6.3 нм).

4 3 2 1 [м.д.]

Рис. 13. (А). Ю ' Н ЯМР-спектр телензепина (ЮмМ Трис-НС1. рН 7.0. 35°С). Показано отнесение некоторых сигналов лиганда. (Б). Фрагменты одномерных ' Н-ЯМР-спектров 10 мкМ телензепина (ЮмМ Трис-НС1. рН 7.0. 35°С) в присутствии увеличивающейся концентрации препарата ЕЯЯ-таг-МГмАХР/ЛБН/ДМФХ (1- 0 мкМ, 2- ЮмкМ, З-ЗОмкМ. 4- 50 мкМ. 5- 70 мкМ). Об увеличении концентрации ЛБН свидетельствовал рост интенсивности сигналов от СН2- и СНз-групп липидов.

Согласно литературным данным, связывание низкомолекулярных лигандов мускаринового рецептора М1 типа происходит в специальном "кармане", сформированном взаимодействующими ТМ-спиралями 3, 4, 5, 6 и 7, а также второй внеклеточной петлей. Таким образом, полученные результаты по специфическому связыванию телензепина с рецептором ЕвЯ-таг-М 1-мАХР, котрансляционно встроенным в ЛБН/ДМФХ, указывают на корректно сформированную структуру лиганд-связывающего участка и возможно на правильную упаковку всего ТМ домена рецептора.

Ренатурация Е.УН-таг-М 1-мАХР из осадка реакционной смеси

Альтернативой бесклеточному синтезу МБ в растворимой форме является синтез белка в виде осадка РС без добавления каких-либо мембраномоделирующих компонентов. В этом случае для получения функционально активного препарата МБ необходима ренатурация. Для растворения ЕЗЯ-таг-М 1-мАХР из осадка РС был использован «жесткий» детергент ДСН в сочетании с 8М мочевиной. Денатурированный белок наносили наМГ+-сефарозу, после чего производили постепенную замену ДСН и мочевины на более «мягкий» детергент ДФХ. Для формирования внутримолекулярных дисульфидных связей, важных для функциональной активности рецептора, к препарату Ев Я-таг-М 1-мАХР, солюбилизированному в ДФХ, добавляли смеси восстановленной (08Н) и окисленной (ОБЗО) форм глутатиона в различных соотношениях. Электрофоретический анализ полученных препаратов показал, что замена ДСН на ДФХ приводит к преимущественной стабилизации мономера рецептора в растворе (Рис. 11, дорожки 2-6). Анализ с помощью гель-фильтрации подтвердил формирование мономерной формы рецептора в мембраномоделирующем окружении мицелл ДФХ, характеризующейся компактной упаковкой с характерным диаметром ~ 6.3 нм (Рис. 12Б). При этом размер комплекса Е8Я-таг-М1-мАХР/ДФХ не зависел от присутствия вЗН/ОЗЗО. Конечный выход рецептора, очищенного в мицеллах ДФХ, составил 0.21 мг/мл РС.

Для тестирования активности полученного препарата ЕЗЯ-таг-М 1-мАХР к нему добавляли телензепин в молярном соотношении рецептор/лиганд 1:1. В качестве контроля использовали мицеллы ДФХ, не содержащие рецептор. Эффективность взаимодействия с лигандом оценивали по количеству несвязавшегося телензепина методом ВЭЖХ. Проведенные эксперименты не выявили специфического связывания ЕЭК-таг-МЬмАХР, встроенного в мицеллы ДФХ, с телензепином (Рис. 14А).

Из литературных данных известно, что производные холестерина такие как 3-[(3-холамидопропил)-диметиламмоний-]-1-пропансульфонат (ХАПС) и холестерил гемисукцинат (ХГС) способны стабилизировать структуру белков ОРСЯ в растворе. ЕЭК,-таг-М 1-мАХР из раствора мицелл ДФХ был реконструирован в смешанные мицеллы ДДМ/ХГС и бицеллы ХАПС/ДМФХ. Кроме того, для ренатурации рецептора были опробованы моноламеллярные липосомы диолеоилфосфатидилхолина (ДОФХ). Анализ связывания телензепина с препаратами БЭЯ-таг-М 1-мАХР, реконструированными в смешанные мицеллы ДДМ/ХГС, бицеллы ХАПС/ДМФХ и липосомы ДОФХ (Рис. 14),

выявил наличие статистически достоверного связывания (уровень значимости р<0,05 по 11-критерию Манна-Уитни) только в случае комплекса ЕБЯ-таг-М 1-мАХР/ДДМ/ХГС (Рис. 14Б). Полученные результаты свидетельствуют о корректном формировании структуры лиганд-связывающего участка и, возможно, всего ТМ домена рецептора в этом мембраномоделирующем окружении.

-ДОФХ

"ДМФХ/ХАПС*

Г***) Исходное количество телемэелина в растворе (100%)

О Тепенэепин. оставшийся в растворе после связываний с 'пустым" ыиметиком □ Теленэелин, оставшийся в раствор® после связывания с комплексом •ЕБЯ-таг-МЦ-мАХР/тшети«-

Рис. 14. Анализ эффективности связывания телензепина с комплексами Е5Я-таг-М1-мАХР/мембранный миметик. (А) - Мицеллы ДФХ. (Б) - Смешанные мицеллы ДДМ/ХГС. (В) -Липосомы ДОФХ. (Г) - Смешанные бицеллы ДМФХ/ХАПС. В каждом случае использовалась равная концентрация рецептора и телензепина (3 мкМ). Каждый столбец соответствует усредненному результату четырех независимых измерений, величина полос погрешностей соответствует одному стандартному отклонению.

выводы

1. Разработаны эффективные бесклеточные белоксинтезирующие системы на основе экстракта S30 Е. coli для продукции спиральных мембранных белков: трансмембранного домена рецепторной тирозинкиназы ЕгЬВЗ человека (ТМ-ЕгЬВЗ) и мускаринового ацетилхолинового рецептора человека (М1-мАХР). Показано, что добавление мембраномоделирующих сред в реакционную смесь позволяет синтезировать ТМ-ЕгЬВЗ и М1-мАХР в растворимой форме.

2. Определена пространственная структура ТМ-ЕгЬВЗ в мембраномоделируюгцем окружении мицелл додецилфосфохолина. Показано, что гомодимеризация ТМ-ЕгЬВЗ происходит по отличному от других рецепторных тирозинкиназ семейства ЕгЬВ структурному мотиву.

3. Проведено сравнение влияния различных мембраномоделирующих сред (мицелл детергентов, бицелл, липосом, липид-белковых нанодисков) на синтез ТМ-ЕгЬВЗ в растворимой и структурированной форме. Показано, что котрансляционное встраивание домена ТМ-ЕгЬВЗ в бицеллы и нанодиски, содержащие насыщенные липиды, приводит к формированию структуры ТМ-ЕгЬВЗ, близкой к структуре домена в мицеллах додецилфосфохолина. Показано, что при котрансляционном встраивании ТМ-ЕгЬВЗ в нанодиски, содержащие ненасыщенные липиды, происходит разрушение (слияние) нанодисков.

5. Проведено сравнение влияния различных Д-концевых партнеров на эффективность бесклеточного синтеза М1-мАХР. Показано, что оптимальным партнером для продукции рецептора является А-конце вой фрагмент (6 а.о.) бактериородопсина из Exiguobacterium sibiricum.

6. Показано, что при котрансляционном встраивании М1-мАХР в нанодиски, содержащие насыщенные липиды, происходит образование комплексов, способных специфически взаимодействовать с селективным агонистом телензепином, что указывает на формирование правильной пространственной структуры лиганд-связывающего участка рецептора.

7. Разработаны протоколы солюбилизации и очистки М1-мАХР из осадка реакционной смеси, а также ренатурации рецептора в смешанных мицеллах додецилмальтозид/холестерил гемисукцинат. Показано наличие специфического взаимодействия ренатурированного рецептора с телензепином, что указывает на формирование правильной пространственной структуры лиганд-связывающего участка.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ Статьи:

1) Хабибуллина Н.Ф.. Люкманова Е.Н., Копеина Г.С., Шенкарев З.О., Арсеньев А.С., Долгих Д.А., Кирпичников М.П. Разработка и оптимизация сопряженной бесклеточной системы синтеза трансмембранного домена рецепторной тирозинкиназы ЕгЬВЗ // Биоорганическая химия. 2010. Т. 36. № 5. С. 654-660.

2) Mineev K.S., Khabibullina N.F., Lyukmanova E.N., Dolgikh D.A., Kirpichnikov M.P., Arseniev A.S. Spatial structure and dimer-monomer equilibrium of the ЕгЬВЗ transmembrain domain in DPC micelles // Biochim Biophys Acta. 2011. V. 1808. P. 2081-2088.

3) Lyukmanova E.N., Shenkarev Z.O., Khabibullina N.F.. Kopeina G.S., Paramonov A.S., Mineev K.S., Tikhonov R.V., Shingarova L.N., Petrovskaya L.E., Dolgikh D.A., Arseniev A.S., Kirpichnikov M.P. Lipid-protein nanodiscs for cell-free production of integral membrane proteins in a soluble and folded state: comparison with detergent micelles, bicelles and liposomes // Biochim Biophys Acta. 2012. V. 1818. P. 349-358.

Патентная заявка:

1) Люкманова E.H., Хабибуллина Н.Ф.. Шулепко М.А., Кульбацкий Д.С., Шенкарев З.О., Долгих Д.А., Кирпичников М.П. Способ получения рекомбинантных белков в бесклеточных системах синтеза. Патентная заявка РФ № 2012133162(052591) от 02.08.2012.

Тезисы докладов:

1) Хабибуллина Н.Ф., Люкманова Е.Н., Минеев К.С., Арсеньев А.С., Долгих Д.А., Кирпичников М.П. Продукция трансмембранных доменов тирозинкиназ ЕгЬВЗ и ErbB4(V18E) в бесклеточной системе // XXII Зимняя международная молодежная научная школа "Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии". Москва (Россия). 2009. С. 122.

2) Lyukmanova E.N., Kopeina G.S., Khabibullina N.F., Shenkarev Z.O., Paramonov A.S., Mineev K.S., Arseniev A.S., Dolgikh D.A., Kirpichnikov M.P. Cell-free production of membrane proteins for NMR studies // Euromar and 17tK 1SMAR Conference. Florence (Italy). 2010. P. 211.

3) Khabibullina N.. Lyukmanova E., Mineev K., Arseniev A., Dolgikh D., Kirpichnikov M. Cell-free production of the transmembrane domain of the human receptor tyrosine kinase ErbB // 35th FEBS Congress "Molecules of life". Gothenburg (Sweden). 2010. P. 286.

4) Lyukmanova E.N., Khabibullina N.F.. Shingarova L.N., Petrovskaya L.E., Shenkarev Z.O., Arseniev A.S., Dolgikh D.A., Kirpichnikov M.P. Large-scale cell-free production of membrane proteins // 2nd Russian-Hellenic Symposium "Biomaterials and bionanomaterials: recent advances and safety - toxicology issues. Heraklion, Crete (Greece). 2011. P.46.

5) Люкманова Е.Н., Хабибуллина Н.Ф.. Шенкарев 3.0., Арсеньев А.С., Долгих Д.А., Кирпичников М.П. Бесклеточная продукция мембранных белков в системе транскрипции-трансляции // XIX Международная конференция и дискуссионнй научный клуб "Новые информационные технологии в медицине, биологии, фармакологии и экологии. Достижения современной биоорганической химии и перспективы их применения". Ялта-Гурзуф, Крым (Украина). 2011. С. 42.

6) Khabibullina N.F., Lyukmanova E.N., Shenkarev Z.O., Paramonov A.S., Mineev K.S., Arseniev A.S., Dolgikh D.A., Kirpichnikov M.P. Different approaches for effective cell-free synthesis of integral membrane proteins with different topologies in a soluble form // 36th FEBS Congress "Biochemistry for tomorrow's medicine". Torino (Italy). 2011. P. 112.

7) Mineev K.S., Khabibullina N.F.. Lyukmanova E.N., Dolgikh D.A., Kirpichnikov M.P., Arseniev A.S. Spatial structure and detergent-dependent dimer-monomer equilibrium of ЕгЬВЗ transmembrane domain in DPC micelles // 36th FEBS Congress "Biochemistry for tomorrow's medicine". Torino (Italy). 2011. P. 118.

8) Хабибуллина Н.Ф.. Люкманова E.H., Шенкарев 3.0. Мембраномоделирующие среды для бесклеточной продукции мембранных белков: мицеллы детергентов, бицеллы, липосомы и липид-белковые нанодиски // Научная конференция по биоорганической химии и биотехнологии "X чтения памяти академика Юрия Анатольевича Овчинникова". Москва-Пущино (Россия). 2011. С. 73.

9) Минеев К.С., Бочаров Э.В., Люкманова Е.Н., Хабибуллина Н.Ф.. Гончарук М.В., Арсеньев А.С. Топология и энергетика взаимодействий между трансмембранными а-спиралями рецепторов ErbB // Научная конференция по биоорганической химии и биотехнологии "X чтения памяти академика Юрия Анатольевича Овчинникова". Москва-Пущино (Россия). 2011. С. 47.

10) Кульбацкий Д.С., Хабибуллина Н.Ф.. Шулепко М.А., Шенкарев З.О., Люкманова Е.Н., Долгих Д.А. Рекомбинантная продукция мускаринового ацетилхолинового рецептора человека, белка семейства GPCR, в функционально активной форме // XXIV Зимняя молодежная научная школа "Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии". Москва (Россия). 2012. С. 38.

11) Хабибуллина Н.Ф.. Люкманова Е.Н., Шулепко М.А., Кульбацкий Д.С., Шенкарев З.О., Долгих Д.А., Кирпичников М.П. Бесклеточная продукция мембранных белков: новые возможности для медицины будущего // Научная конференция "Молекулярная и клеточная биология: прикладные аспекты". Москва (Россия). 2012 г. С. 15.

Подписано в печать:

12.10.2012

Заказ № 7700 Тираж -100 экз. Печать трафаретная. Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (499) 788-78-56

wvvw.autoreferat.ru

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Хабибуллина, Нелли Фамзуловна

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Мембранные белки и формирование их пространственной структуры in vitro.

1.2. Бесклеточные белоксинтезирующие системы.

1.3. Продукция мембранных белков в бесклеточных системах синтеза.

1.4. Модификация N- и С-концевых последовательностей мембранных белков для повышения уровня бесклеточного синтеза и эффективности очистки.

1.5. Тирозинкиназы семейства рецепторов эпидермапьного фактора роста человека.

1.6. Мускариновые ацетилхолиновые рецепторы человека.

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

2.1 Материалы.

2.1.1. Реактивы и ферменты.

2.1.2. Штаммы.

2.1.3. Плазмидные векторы.

2.1.4. Питательные среды для роста бактериальных культур.

2.1.5. Синтетические олигонуклеотиды.

2.2. Методы.

2.2.1. Общие молекулярно-генетические методы.

2.2.1.1. Трансформация клеток Е. coli плазмидной ДНК.

2.2.1.2. Выделение плазмидной ДНК.

2.2.1.3.Расщепление ДНК эндонуклеазами рестрикции, выделение ДНК из агарозного геля и лигирование.

2.2.2. Получение генетических конструкций.

2.2.2.1. Получение генетических конструкций, содержащих ген ТМ-ЕгЬВЗ.

2.2.2.2. Получение генетических конструкций, содержащих ген укороченного мускаринового ацетилхолинового рецептора Ml типа.

2.2.2.2.1. Конструирование гена укороченного варианта М1-мАХР.

2.2.2.2.2. Конструирование генетических последовательностей, кодирующих варианты М1-мАХР с различными iV-концевыми последовательностями.

2.2.2.2.3. Получение генетической конструкциирЕТ22Ъ(+)/Т7-таг- М1-мАХР.

2.2.2.2.4. Получение генетической конструкциирЕТ22Ъ(+)/Б-таг-М1-мАХР.

2.2.2.2.5. Получение экспрессирующих вектороврЕТ22Ъ(+)/ЕБК-таг-М1-мАХР.

2.2.3. Продукция мембранных белков в бесклеточной системе на основе экстракта S30 Escherichia coli.

2.2.3.1. Выделение экстракта S30 из Е. coli.

2.2.3.2. Синтез белка в бесклеточной системе на основе экстракта S30 из Е. coli.

2.2.4. Гель-электрофорез белков в ПААГ в присутствии ДСН.

2.2.5. Вестерн-блоттинг.

2.2.6. Гель-фильтрация.

2.2.7. Анализ белковых препаратов методом КД-спектроскопии.

2.2.8. Ренатурация ТМ-ЕгЬВЗ из осадка PC.

2.2.9. Солюбилизация М1-мАХР с различными ^-концевыми последовательностями из осадка РС

2.2.10. Солюбилизация мутантного укороченного варианта М1-мАХР из осадка РС.

2.2.11. Встраивание М1-мАХР в липосомы.

2.2.12. Анализ лиганд-связывающей активности М1-мАХР.

2.2.13. Выделение ТМ-ЕгЬВЗ и М1-мАХР, синтезированных в присутствии детергентов, из реакционной смеси.

2.2.14. Выделение белка, ассоциированного с липид-белковыми нанодисками.

2.2.15. Химическое кросс-сшивание ТМ-ЕгЬВЗ по свободным аминогруппам.

2.2.16. Исследование лиганд-связывающей активности М1-мАХР, встроенного в липид-белковые нанодиски, с помощью спектроскопии ЯМР.

2.2.17. Получение ЯМР-спектров ТМ-ЕгЬВЗ.

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

3.1. Бесклеточная продукция трансмембранного домена рецепторной тирозинкиназы ЕгЬВЗ человека

3.1.1. Мутагенез ТМ-ЕгЬВЗ человека.

3.1.2. Оптимизация бесклеточной белоксинтезирующей системы для продукции ТМ-ЕгЬВЗ.

3.1.3. Выделение и очистка ТМ-ЕгЬВЗ из осадка реакционной смеси.

3.1.4. Пространственная структура ТМ-ЕгЬВЗ в присутствии мицелл ДФХ, переход "мономер-димер".

3.1.5. Синтез ТМ-ЕгЬВЗ в присутствии мицелл детергентов.

3.1.6. Синтез ТМ-ЕгЬВЗ в присутствии бицелл и липосом.

3.1.7. Синтез ТМ-ЕгЬВЗ в присутствии лпид-белковых нанодисков.

3.2. Бесклеточная продукция мускаринового ацетилхолинового рецептора М1 типа.

3.2.1. Дизайн гена М1 -мАХР.

3.2.2. Бесклеточный синтез М1-мАХР с различными iV-концевыми партнерами.

3.2.3. Синтез ESR-таг-Ш-мАХР в растворимой форме в присутствии мицелл детергентов.

3.2.4. Синтез ESR-Tar-Ml-мАХР в присутствии липид-белковых нанодисков.

3.2.5. Ренатурация ESR-Tar-Ml-мАХР из осадка реакционной смеси.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Мембраномоделирующие среды для бесклеточной продукции мембранных белков"

В последнее время для продукции МБ все чаще применяются бесклеточные белоксинтезирующие системы (ББС). Эти системы содержат все необходимые компоненты для протекания процессов транскрипции и трансляции iti vitro: ДНК, содержащую ген целевого белка, ДНК-зависимую РНК-полимеразу, факторы транскрипции и трансляции, молекулы тРНК, рибосомы, аминокислоты, нуклеотиды и энергетические субстраты. 8

Возможность синтеза белков как про-, так и эукариотического происхождения делает ББС универсальным инструментом для решения многих задач современной молекулярной биологии и биотехнологии. Выходы целевых белков в таких системах достигают нескольких миллиграммов с 1 миллилитра реакционной смеси (PC), что позволяет получать МБ в препаративных количествах. Помимо этого, в ББС можно осуществлять синтез белков, токсичных для живых клеток. Открытый характер ББС делает возможным добавление в PC различных компонентов и кофакторов, что в некоторых случаях позволяет получать белки в нативной конформации. Так, например, для продукции МБ в растворимой форме в PC добавляют мембранные миметики, такие как мицеллы детергентов, липид-детергентные бицеллы, липосомы, липид-белковые нанодиски (ЛБН) и др. Кроме того, ББС позволяют легко получать белковые препараты, селективно меченные стабильными изотопами, что в ряде случаев облегчает проведение структурных исследований, например, методами ЯМР-спектроскопии.

Цель работы

Объектами исследования являлись трансмембранный (ТМ) домен рецепторной тирозинкиназы ЕгЬВЗ человека (ТМ-ЕгЬВЗ), включающий одну

ТМ-спираль, и мускариновый ацетилхолиновый рецептор М1 типа человека, содержащий семь ТМ-спиралей (М1-мАХР), относящийся к семейству рецепторов, сопряженных с в-белком (вРСЯ).

Основные задачи исследования

2) Подобрать мембраномоделирующие среды, обеспечивающие синтез ТМ-ЕгЬВЗ и М1-мАХР в растворимой форме с пространственной структурой, близкой к нативной.

3) Методами ЯМР-спектроскопии провести сравнительный анализ пространственной структуры ТМ-ЕгЬВЗ в различных мембраномоделирующих средах (мицеллы, бицеллы, липид-белковые нанодиски).

4) Подобрать условия очистки и ренатурации М1-мАХР в составе различных мембраномоделирующих сред.

5) Провести анализ лиганд-связывающей активности М1-мАХР в составе различных мембраномоделирующих сред.

Научная новизна и практическая значимость работы

Все результаты, представленные в настоящей диссертационной работе, получены впервые.

1) Разработаны ББС для эффективной продукции ТМ-ЕгЬВЗ и М1-мАХР как в виде осадка РС, так и в растворимой форме в присутствии мицелл детергентов, бицелл, липосом и липид-белковых нанодисков (ЛБН).

2) Впервые методами ЯМР-спектроскопии определена пространственная структура ТМ-ЕгЬВЗ в окружении мицелл додецилфосфохолина (ДФХ), и установлено, что димеризация домена происходит по мотиву, не типичному для рецепторных тирозинкиназ семейства ЕгЬВ.

3) На примере TM-ErbB3 проведен сравнительный анализ эффективности бесклеточного синтеза МБ в растворимом и структурированном виде в присутствии различных мембранных миметиков. С использованием КД- и ЯМР-спектроскопии, а также кросс-сшивающих реагентов показано, что в окружении мицелл, бицелл и ЛБН ТМ-ЕгЬВЗ формирует спиральные структуры, способные к димеризации.

4) На примере ТМ-ЕгЫЗЗ показана возможность проведения прямых структурных исследований МБ, котрансляционно встроенных в бицеллы и ЛБН, методами ЯМР-спектроскопии.

5) Показано, что использование в качестве iV-концевых партнеров TV-концевого фрагмента бактериородопсина грамположительной бактерии Exiguobacterium sibiricum (ESR-таг), TV-концевого фрагмента рибонуклеазы А (S-таг) и белка Mistic из Bacillus subtilis позволяет увеличить выход М1-мАХР в 10 - 72 раза до уровня 0.5 - 3.6 мг с 1 мл PC.

11 создания лекарственных препаратов, направленных на лечение онкологических заболеваний и расстройств нервной системы, связанных с дисфункциями рецепторных тирозинкиназ и мАХР.

Заключение Диссертация по теме "Молекулярная биология", Хабибуллина, Нелли Фамзуловна

выводы

2. Определена пространственная структура ТМ-ЕгЬВЗ в мембраномоделирующем окружении мицелл додецилфосфохолина. Показано, что гомодимеризация ТМ-ЕгЬВЗ происходит по отличному от других рецепторных тирозинкиназ семейства ErbB структурному мотиву.

5. Проведено сравнение влияния различных TV-концевых партнеров на эффективность бесклеточного синтеза М1-мАХР. Показано, что оптимальным партнером для продукции рецептора является TV-концевой фрагмент (6 а.о.) бактериородопсина из Exiguobacterium sibiricum.

БЛАГОДАРНОСТИ

Глубоко и искренне благодарю своих научных руководителей к.б.н., с.н.с. Лаборатории инженерии белка ИБХ РАН Екатерину Назымовну Люкманову и д.б.н., профессора кафедры биоинженерии биологического факультета МГУ имени М.В.Ломоносова Дмитрия Александровича Долгих. Хочу поблагодарить заведующего Отделом биоинженерии и декана Биологического факультета МГУ академика Михаила Петровича Кирпичникова за предоставленную возможность выполнения диссертационной работы в Лаборатории инженерии белка ИБХ РАН. Выражаю свою глубокую признательность сотрудникам Лаборатории биомолекулярной ЯМР-спектроскопии ИБХ РАН к.ф.-м.н. Константину Сергеевичу Минееву и к.ф-м.н. Захару Олеговичу Шенкареву, а также руководителю Лаборатории профессору, д.х.н. Александру Сергеевичу Арсеньеву за неоценимую помощь в исследовании полученных белков методами ЯМР-спектроскопии.

Выражаю свою искреннюю благодарность за помощь, ценные советы к.х.н., с.н.с. Лаборатории инженерии белка ИБХ РАН Людмиле Николаевне Шингаровой и к.х.н. Вульфсону Андрею Николаевичу. Кроме того, за ценные советы, помошь, теплоту и предоставление плазмидных векторов говорю большое спасибо к.б.н., с.н.с. Лаборатории инженерии белка ИБХ РАН Ладе Евгеньевне Петровской. Благодарю студентов МФТИ Дмитрия Кульбацкого, Кристину Капицкую и Ивана Бутенко за оказание посильной помощи в работе и создание теплой рабочей обстановки. Также хочу поблагодарить всех сотрудников Лаборатории инженерии белка ИБХ РАН за внимание и поддержку.

Выражаю свои благодарность и признательность к.б.н., с.н.с. Лаборатории механизмов биосинтеза белка Института белка РАН Владимиру Анатольевичу Широкову за неоценимую помощь и советы при выполнении работы, а также хочу поблагодарить заведующего Лабораторией механизмов биосинтеза белка академика Александра

110

Сергеевича Спирина за предоставленную возможность выделять экстракт S30 из Е. coli на базе его Лаборатории.

Выражаю благодарность сотрудникам кафедры биоинженерии биологического факультета МГУ и ее руководителю д.ф-м.н. Константину Вольдемаровичу Шайтану за своевременную помощь в решении организационных вопросов, возникавших во время выполнения диссертационной работы.

Сердечно благодарю своих родных и друзей, которые поддерживали меня и были рядом.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Результаты диссертационной работы демонстрируют возможность применения бесклеточных белоксинтезирующих систем для продукции МБ различной топологии. В ходе исследования были разработаны эффективные системы для продукции мембранного домена тирозинкиназы ЕгЬВЗ человека, содержащего одну ТМ-спираль, а также мускаринового ацетилхолинового рецептора человека М1 типа, имеющего в своем составе семь ТМ-спиралей. Кроме того, была изучена возможность применения различных мембраномоделирующих сред (мицелл детергентов, липид-детергентных бицелл, липосом и липид-белковых нанодисков) для продукции ТМ-ЕгЬВЗ и М1-мАХР в растворимой форме с пространственной структурой, близкой к нативной.

Методами ЯМР-спектроскопии была определена пространственная структура димера ТМ-ЕгЬВЗ в окружении мицелл ДФХ. Был проведен сравнительный анализ структуры ТМ-ЕгЬВЗ, котрансляционно встроенного в различные мембраномоделирующие среды. Было показано, что при встраивании в бицеллы и нанодиски формируется пространственная структура домена, близкая к наблюдаемой в мицеллах ДФХ.

Было показано, что М1-мАХР, котрансляционно встроенный в нанодиски, либо реконструированный из осадка реакционной смеси в смешанные мицеллы ДДМ/ХГС, способен специфически взаимодействовать с селективным антагонистом рецептора телензепином. Таким образом, в окружении этих мембраномоделирующих сред происходит формирование правильной пространственной структуры лиганд-связывающего участка рецептора.

Представленная работа показывает, что бесклеточные белоксинтезирующие системы в сочетании с применением подходящих мембраномоделирующих сред являются эффективным инструментом для продукции препаратов МБ в растворимой и структурированной форме для структурных и функциональных исследований этих молекул.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Хабибуллина, Нелли Фамзуловна, Москва

1. Fink A., Sal-Man N., Gerber D., Shai Y. Transmembrane domains interactions within the membrane milieu: Principles, Advances and Challenges // Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Biomembranes. 2012. V.l 818. № 4. P. 974983.

2. Henderson R. The structure of the purple membrane from Halobacterium halobium: analysis of the x-ray diffraction pattern // Journal of molecular biology. 1975. V. 93. № 2. P. 123-138.

3. Финкелыптейн А., Птицын О. Физика белка // Книжный дом Университет, Москва. 2005.

4. Chothia С., Levitt М., Richardson D. Structure of proteins: packing of alpha-helices and pleated sheets // Proceedings of the National Academy of Sciences. 1977. V. 74. № 10. P. 4130-4134.

5. Popot J.L., Engelman D.M. Membrane protein folding and oligomerization: the two-stage model // Biochemistry. 1990. V. 29. № 17. P. 40314037.

6. Engelman D., Chen Y., Chin C.-N., Curran A., Dixon A., Dupuy A., Lee A., Lehnert U., Matthews E., Reshetnyak Y., Senes A., Popot J.-L. Membrane protein folding: beyond the two stage model // FEBS letters. 2003. V. 555. № 1.1. P. 122-125.

7. Kyte J., Doolittle R.F. A simple method for displaying the hydropathic character of a protein // Journal of molecular biology. 1982. V. 157. № 1. P. 105132.

8. Von Heijne G. Membrane protein structure prediction. Hydrophobicity analysis and the positive-inside rule // Journal of molecular biology. 1992. V. 225. № 2. P. 487-494.

9. Jones D., Taylor W., Thornton J. A mutation data matrix for transmembrane proteins // FEBS letters. 1994. V. 339. № 3. P. 269-275.

10. Arkin I.T. Statistical analysis of predicted transmembrane a-helices // Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Protein Structure and Molecular Enzymology. 1998. V. 1429, № 1. P. 113-128.

11. Arkin I., Adams P., MacKenzie K., Lemmon M., Brunger A., Engelman D. Structural organization of the pentameric transmembrane alpha-helices of phospholamban, a cardiac ion channel // The EMBO Journal. 1994. V. 13. № 20. P. 4757-4764.

12. Partridge A.W., Therien A.G., Deber C.M. Polar mutations in membrane proteins as a biophysical basis for disease // Peptide Science. 2002. V. 66. № 5. P. 350-358.

13. Zhou F., Cocco M., Russ W., Brunger A., Engelman D. Interhelical hydrogen bonding drives strong interactions in membrane proteins // Nature Structural Biology. 2000. V. 7. № 2. P. 154-160.

14. Curran A.R., Engelman D.M. Sequence motifs, polar interactions and conformational changes in helical membrane proteins // Current Opinion in Structural Biology. 2003. V. 13. № 4. P. 412-417.

15. Zhou F.X., Merianos H.J., Brunger A.T., Engelman D.M. Polar residues drive association of polyleucine transmembrane helices // Proceedings of the National Academy of Sciences. 2001. V. 98. № 5. P. 2250-2255.

16. Gratkowski H., Lear J.D., DeGrado W.F. Polar side chains drive the association of model transmembrane peptides // Proceedings of the National Academy of Sciences. 2001. V. 98. № 3. P. 880-885.

17. MacKenzie K.R., Prestegard J.H., Engelman D.M. A transmembrane helix dimer: structure and implications // Science. 1997. V. 276. № 5309. P. 131133.

18. Russ W.P., Engelman D.M. The GxxxG motif: A framework for transmembrane helix-helix association // Journal of Molecular Biology. 2000. V. 296. №3. P. 911-919.

19. Mendrola J.M., Berger M., King M., Lemmon M. The single transmembrane domains of ErbB receptors self-associate in cell membranes // Journal of Biological Chemistry. 2002. V. 277. № 7. P. 4704-4712.

20. Escher C., Cymer F., Schneider D. Two GxxxG-like motifs facilitate promiscuous interactions of the human ErbB transmembrane domains // Journal of Molecular Biology. 2009. V.389. № 1. P. 10-16.

21. Stanley A.M., Fleming K.G. The transmembrane domains of ErbB receptors do not dimerize strongly in micelles // Journal of Molecular Biology. 2005. V. 347. № 4. P. 759-772.

22. Schneider D., Engelman D.M. Motifs of two small residues can assist but are not sufficient to mediate transmembrane helix interactions // Journal of Molecular Biology. 2004. V. 343. № 4. P. 799-804.

23. Bocharov E., Mayzel M., Volynsky P., Mineev K., Tkach E., Ermolyuk

24. Y., Schulga A., Efremov R., Arseniev A. Left-handed dimer of EphA2114transmembrane domain: helix packing diversity among receptor tyrosine kinases // Biophysical Journal. 2010. V. 98. № 5. P. 881-889.

25. Kahn T.W., Sturtevant J.M., Engelman D.M. Thermodynamic measurements of the contributions of helix-connecting loops and of retinal to the stability of bacteriorhodopsin // Biochemistry. 1992. V. 31. № 37. P. 8829-8839.

26. Hunt J., Rath P., Rothschild K., Engelman D. Spontaneous, pH-dependent membrane insertion of a transbilayer a-helix // Biochemistry. 1997. V. 36. №49. P. 5177-15192.

27. Hunt J., Earnest T., Bousche O., Kalghatgi K., Reilly K., Horvath C., Rothschild K., Engelman D. A biophysical study of integral membrane protein folding // Biochemistry. 1997. V. 36. № 49. P. 15156-15176.

28. Duong M.T., Jaszewski T.M., Fleming K.G., MacKenzie K.R. Changes in apparent free energy of helix-helix dimerization in a biological membrane due to point mutations // Journal of Molecular Biology. 2007. V. 371. № 2. P. 422-434.

29. Smith S., Eilers M., Song D., Crocker E., Ying W., Groesbeek M., Metz G., Ziliox M., Aimoto S. Implications of threonine hydrogen bonding in the glycophorin A transmembrane helix dimer // Biophysical Journal. 2002. V. 82. № 5. P. 2476-2486.

30. Call M.E., Schnell J.R., Xu C., Lutz R.A., Chou J.J., Wucherpfennig K.W. The Structure of the Transmembrane Dimer Reveals Features Essential for Its Assembly with the T Cell Receptor // Cell. 2006. V. 127. № 2. P. 355-368.

31. Call M.E., Wucherpfennig K.W., Chou J.J. The structural basis for intramembrane assembly of an activating immunoreceptor complex // Nature Immunology. 2010. V. 11. № 11. P. 1023-1029.

32. Anbazhagan V., Munz C., Tome L., Schneider D. Fluidizing the Membrane by a Local Anesthetic: Phenylethanol Affects Membrane Protein Oligomerization // Journal of Molecular Biology. 2010. V. 404. № 5. P. 773-777.

33. Holt A., Killian J.A. Orientation and dynamics of transmembrane peptides: the power of simple models // European Biophysics Journal. 2010. V. 39. №4. P. 609-621.

34. Cymer F., Veerappan A., Schneider D. Transmembrane helix-helix interactions are modulated by the sequence context and by lipid bilayer properties // Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Biomembranes. 2012. V. 1818. № 4. P. 963973.

35. Guignard L., Ozawa K., Pursglove S.E, G.Otting; Dixon N.E. NMR analysis of in vitro-synthesized proteins without purification: a high-throughput approach // FEBS Letters. 2002. V. 524. № 1-3. P. 159-162.

36. Spirin A.S., Baranov V.I., Ryabova L.A., Ovodov S.Y., Alakhov Y.B. A continuous cell-free translation system capable of producing polypeptides in high yield // Science. 1988. V. 242. № 4882. P. 1162.

37. Kim D.M., Choi C.Y. A semicontinuous prokaryotic coupled transcription/translation system using a dialysis membrane // Biotechnology progress. 1996. V. 12. № 5. P. 645-649.

38. Спирин A.C. Молекулярная биология. Рибосомы и биосинтез белка // Издательский центр "Академия". Москва. 2011. С. 95.

39. Cymer F., Schneider D. Transmembrane helix-helix interactions involved in ErbB receptor signaling // Cell Adhesion & Migration. 2010. V. 4. № 2. P. 299-312.

40. Fernández С., Wüthrich К. NMR solution structure determination of membrane proteins reconstituted in detergent micelles // FEBS Letters. 2003. V. 555. № l.P. 144-150.

41. Franzin C., Gong X., Thai K., Yu J., Marassi F. NMR of membrane proteins in micelles and bilayers: the FXYD family proteins // Methods. 2007. V. 41. №4. P. 398-408.

42. Berrier C., Park K.-H., Abes S., Bibonne A., Betton J.-M., Ghazi A. Cell-free synthesis of a functional ion channel in the absence of a membrane and in the presence of detergent // Biochemistry. 2004. V. 43. № 39. P. 12585-12591.

43. Klammt C., Schwarz D., Lohr F., Schneider B., Dotsch V., Bernhard F. Cell-free expression as an emerging technique for the large scale production of integral membrane protein // FEBS Journal. 2006. V. 273. № 18. P. 4141-4153.

44. Junge F., Schneider B., Reckel S., Schwarz D., Dotsch V., Bernhard F. Large-scale production of functional membrane proteins // Cellular and Molecular Life Sciences. 2008. V. 65. № 11. P. 1729-1755.

45. Sobhanifar S., Reckel S., Junge F., Schwarz D., Kai L., Karbyshev M., Lohr F., Bernhard F., Dotsch V. Cell-free expression and stable isotope labelling strategies for membrane proteins // Journal of Biomolecular NMR. 2010. V. 46. № l.P. 33-43.

46. Hovijitra N., Wuu J., Peaker B., Swartz J. Cell-free synthesis of functional aquaporin Z in synthetic liposomes // Biotechnology and Bioengineering. 2009. V. 104. № l.P. 40-49.

47. Moritani Y., Nomura S., Morita I., Akiyoshi K. Direct integration of cell-free-synthesized connexin-43 into liposomes and hemichannel formation // FEBS Journal. 2010. V. 277. № 16. P. 3343-3352.

48. Wuu J.J., Swartz J.R. High yield cell-free production of integral membrane proteins without refolding or detergents // Biochimica et Biophysica Acta

49. BBA)-Biomembranes. 2008. V. 1778. № 5. P. 1237-1250.118

50. Park K.H., Billon-Denis E., Dahmane T., Lebaupain F., Pucci B., Breyton C., Zito F. In the cauldron of cell-free synthesis of membrane proteins: playing with new surfactants // New Biotechnology. 2011. V. 28. № 3. P. 255-261.

51. Bayburt T.H.,. Sligar S.G. Single-molecule height measurements on microsomal cytochrome P450 in nanometer-scale phospholipid bilayer disks // Proceedings of the National Academy of Sciences. 2002. V. 99. № 10. P. 67256730.

52. Ritchie T., Grinkova Y.V., Bayburt T.H., Denisov I.G., Zolnerciks J.K., Atkins W.M., Sligar S.G. Reconstitution of membrane proteins in phospholipid bilayer nanodiscs // Methods in Enzymology. 2009. V. 464. P. 211-231.

53. Bayburt T.H., Sligar S.G. Membrane protein assembly into Nanodiscs // FEBS Letters. 2010. V. 584. № 9. P. 1721-1727.

54. Leitz A.J., Bayburt T.H., Barnakov A.N., Springer B.A., Sligar S.G. Functional reconstitution of beta 2-adrenergic receptors utilizing self-assembling Nanodisc technology // Biotechniques. 2006. V. 40. № 5. P. 601.

55. Katzen F., Peterson T.C., Kudlicki W. Membrane protein expression: no cells required // Trends in Biotechnology. 2009. V. 27. № 8. P. 455-460.

56. Yang J., Cirico T., Katzen F., Peterson T.C., Kudlicki W. Cell-free synthesis of a functional G protein-coupled receptor complexed with nanometer scale bilayer discs // BMC biotechnology. 2011. V. 11. № 57. P. 1-8.

57. Schwarz D., Dötsch V., Bernhard F. Production of membrane proteins using cell-free expression systems // Proteomics. 2008. V. 8. № 19. P. 3933-3946.

58. Staunton D., Schlinkert R., Zanetti G., Colebrook S.A., Campbell I.D. Cell-free expression and selective isotope labelling in protein NMR // Magnetic Resonance in Chemistry. 2006. V. 44. V.S1. P. S2-S9.

59. Morita E., Shimizu M., Ogasawara T., Endo Y., Tanaka R., Kohno T. A novel way of amino acid-specific assignment in 1H-15N HSQC spectra with a wheat germ cell-free protein synthesis system // Journal of Biomolecular NMR. 2004. V. 30. № 1. P. 37-45.

60. Ozawa K., Dixon N., Otting G. Cell-free synthesis of 15N-labeled proteins for NMR studies // IUBMB Life. 2005. V. 57. № 9. P. 615-622.

61. Klammt C., Lohr F., Schafer B., Haase W., Dotsch V., Ruterjans H., Glaubitz C., Bernhard F. High level cell-free expression and specific labeling of integral membrane proteins // European Journal of Biochemistry. 2004. V. 271. № 3. P. 568-580.

62. Ozawa K., Wu P., Dixon N., Otting G. 15N-Labelled proteins by cell-free protein synthesis //FEBS Journal. 2006. V. 273. № 18. P. 4154-4159.

63. Etezady-Esfarjani T., Hiller S., Villalba C., Wuthrich K. Cell-free protein synthesis of perdeuterated proteins for NMR studies // Journal of Biomolecular NMR. 2007. V. 39. № 3. P. 229-238.

64. Hall M., Gabay J., Débarbouillé M., Schwartz M. A role for mRNA secondary structure in the control of translation initiation // Nature. 1982. V. 295. P. 616-618.

65. Staunton D., Schlinkert R., Zanetti G., Colebrook S., Campbell I. Cellfree expression and selective isotope labelling in protein NMR // Magnetic Resonance In Chemistry. 2006. V. 44. P. S2-S9.

66. Roosild T., Greenwald J., Vega M., Castronovo S., Riek R., Choe S. NMR structure of Mistic, a membrane-integrating protein for membrane protein expression// Science. 2005. V. 307. № 5713. P. 1317.

67. Sassenfeld H.M., Brewer S.J. A polypeptide fusion designed for the purification of recombinant proteins // Nature Biotechnology. 1984. V. 2. № 1. P. 76-81.

68. Bucher M.H., Evdokimov A.G., Waugh D.S. Differential effects of short affinity tags on the crystallization of Pyrococcus furiosus maltodextrin-binding protein // Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 2002. V. 58. №3. P. 392-397.

69. Terpe K. Overview of tag protein fusions: from molecular and biochemical fundamentals to commercial systems // Applied microbiology and biotechnology. 2003. V. 60. № 5. P. 523-533.

70. Blommel P.G., Fox B.G. A combined approach to improving large-scale production of tobacco etch virus protease // Protein expression and purification. 2007. V. 55. № 1. P. 53-68.

71. Arnau J., Lauritzen C., Petersen G.E., Pedersen J. Current strategies for the use of affinity tags and tag removal for the purification of recombinant proteins // Protein Expression and Purification. 2006. V. 48. P. 1-13.

72. Sun Q., Chen L., Cao L., Fang L., Chen C., Hua Z. An improved strategy for high-level production of human vasostatin 120-180 // Biotechnol. Prog. 2005. V. 21. P. 1048-1052.

73. Karpeisky M.Y., Senchenko V.N., Dianova M.V., Kanevsky V.Yu. Formation and properties of S-protein complex with S-peptide-containing fusion protein // FEBS Letter. 1994. V. 339. № 3. P. 209-212.

74. Kim J.S., Raines R.T. A misfolded but active dimer of bovine seminal ribonuclease // European Journal of Biochemistry. 1994. V. 224. № l.P. 109-114.

75. Chen L., Merzlyakov M., Cohen T., Shai Y., Hristova K. Energetics of ErbB 1 transmembrane domain dimerization in lipid bilayers // Biophysical Journal. 2009. V. 96. № 11. P. 4622-4630.

76. Baulida J., Kraus M., Alimandi M., Di Fiore P., Carpenter G. All ErbB receptors other than the epidermal growth factor receptor are endocytosis impaired // Journal of Biological Chemistry. 1996. V. 271. № 9. p. 5251.

77. Tao R.H., Maruyama I.N. All EGF (ErbB) receptors have preformed homo-and heterodimeric structures in living cells // Journal of Cell Science. 2008. V. 121. № 19. 3207-3217.

78. Hellyer N.J., Cheng K., Koland J.G. ErbB3 (HER3) interaction with the p85 regulatory subunit of phosphoinositide 3-kinase // Biochemical Journal. 1998. V.333.Pt3.P. 757.

79. Yarden Y., Sliwkowski M.X. Untangling the ErbB signalling network // Nat Rev Mol Cell Biol. 2001. V. 2. № 2. P. 127-137.

80. Bennasroune A., Fickova M., Gardin A, Dirrig-Grosch S., Aunis D, Cremel G., Hubert P. Transmembrane peptides as inhibitors of ErbB receptor signaling // Molecular biology of the cell. 2004. V. 15. № 7. P. 3464-3474.

81. Beerli R.R., Hynes N.E. Epidermal growth factor-related peptides activate distinct subsets of ErbB receptors and differ in their biological activities // Journal of Biological Chemistry. 1996. V. 271. № 11. P. 6071-6076.

82. Bouyain S., Longo P., Li S., Ferguson K., Leahy D. The extracellular region of ErbB4 adopts a tethered conformation in the absence of ligand // Proceedings of the National Academy of Sciences. 2005. V. 102. № 42. P. 1502415029.

83. Burgess A., Cho H., Eigenbrot C., Ferguson K., Garrett T., Leahy D., Lemmon M., Sliwkowski M., Ward C., Yokoyama S. An open-and-shut case? Recent insights into the activation of EGF/ErbB receptors // Molecular cell. 2003. V. 12. № 3. P. 541-552.

84. Cho H.S., Leahy D.J. Structure of the extracellular region of HER3 reveals an interdomain tether // Science. 2002. V. 297. № 5585. P. 1330.

85. Cho H., Mason K., Ramyar K., Stanley A., Gabelli S., Denney D.Jr, Leahy D. Structure of the extracellular region of HER2 alone and in complex with the Herceptin Fab // Nature. 2003. V. 421. № 6924. P. 756-760.

86. Ferguson K., Berger M., Mendrola J., Cho H.-S., Leahy D., Lemmon M. EGF activates its receptor by removing interactions that autoinhibit ectodomain dimerization // Molecular cell. 2003. V. 11. № 2. P. 507-517.

87. Bagossi P., Horvath G., Vereb G., Szollosi J., Tozser J. Molecular modeling of nearly full-length ErbB2 receptor // Biophysical Journal. 2005. V. 88. №2. P. 1354-1363.

88. Sweeney C., Carraway K.L. Negative regulation of ErbB family receptor tyrosine kinases // British journal of cancer. 2004. V. 90. № 2. P. 289-293.

89. Bocharov E.V., Mineev K.S., Volynsky P.E., Ermolyuk Y.S., Tkach E.N. , Sobol A.G., Chupin V.V., Kirpichnikov M.P., Efremov R.G., Arseniev A.S. Spatial structure of the dimeric transmembrane domain of the growth factor receptor

90. ErbB2 presumably corresponding to the receptor active state // Journal of Biological Chemistry. 2008. V. 283. № 11. P. 6950.

91. Zhang H., Berezov A., Wang Q., Zhang G., Drebin J., Murali R., Greene M. ErbB receptors: from oncogenes to targeted cancer therapies // Journal of Clinical Investigation. 2007. V. 117. № 8. P. 2051.

92. Sorkin A., Goh L.K. Endocytosis and intracellular trafficking of ErbBs // Experimental cell research. 2009. V.315. № 4. P. 683-696.

93. Smith S., Smith C., Shekar S., Peersen O., Ziliox M., Aimoto S. Transmembrane interactions in the activation of the Neu receptor tyrosine kinase // Biochemistry. 2002. V. 41. № 30. P. 9321-9332.

94. Kasprzyk P.G., Song S.U., Di Fiore P.P., King C.R. Therapy of an animal model of human gastric cancer using a combination of anti-erbB-2 monoclonal antibodies // Cancer research. 1992. V. 52. № 10. P. 2771-2776.

95. Hedhli N., Russell K.S. Cytostatic drugs, neuregulin activation of erbB receptors, and angiogenesis // Current hypertension reports. 2010. V. 12. P. 411417.

96. Citri A., Alroy I., Lavi S., Rubin C., Xu W., Grammatikakis N.,

97. Patterson C., Neckers L., Fry D., Yarden Y. Drug-induced ubiquitylation and126degradation of ErbB receptor tyrosine kinases: implications for cancer therapy // The EMBO Journal. 2002. V. 21. № 10. P. 2407-2417.

98. Hynes N.E., Lane H.A. ERBB receptors and cancer: the complexity of targeted inhibitors //Nature Reviews Cancer. 2005. V. 5. № 5. P. 341-354.

99. Hsieh A., Moasser M. Targeting HER proteins in cancer therapy and the role of the non-target HER3 // British journal of cancer. 2007. V. 97. № 4. P. 453-457.

100. Sithanandam G., Anderson L. The ERBB3 receptor in cancer and cancer gene therapy // Cancer gene therapy. 2008. V. 15. № 7. P. 413-448.

101. Tebben A., Schnur D. Beyond rhodopsin: G protein-coupled receptor structure and modeling incorporating the beta2-adrenergic and adenosine A (2A) crystal structures // Methods in molecular biology (Clifton, NJ). 2011. V. 672. P. 359-386.

102. Erlenbach I., Kostenis E., Schmidt C., Hamdan F., Pausch M., Wess J. Functional expression of Ml, M3 and M5 muscarinic acetylcholine receptors in yeast // Journal of neurochemistry. 2001. V. 77. № 5. P. 1327-1337.

103. Levey A.I., Stormann T.M., Brann M.R. Bacterial expression of human muscarinic receptor fusion proteins and generation of subtype-specific antisera // FEBS Letters. 1990. V. 275. № 1-2. P. 65-69.

104. Wess J. Muscarinic Acetylcholine Receptor Knockout Mice: Novel Phenotypes and Clinical Implications // Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 2004. V. 44. P. 423-450.

105. Bee M.S., Hulme E.C. Functional analysis of transmembrane domain 2 of the Ml muscarinic acetylcholine receptor // Journal of Biological Chemistry. 2007. V. 282. №44. 32471.

106. Hulme E., Lu Z., Saldanha J., Bee M. Structure and activation of muscarinic acetylcholine receptors // Cholinergic mechanisms: function and dysfunction. 2004. V. 8. P.55.

107. Ishii M., Kurachi Y. Muscarinic acetylcholine receptors // Current pharmaceutical design. 2006. V. 12. № 28. P. 3573-3581.

108. Resende R.R., Adhikari A. Cholinergic receptor pathways involved in apoptosis, cell proliferation and neuronal differentiation // Cell Commun Signal. 2009. V. 7. P. 20.

109. Hegde S.S., Mammen M., Jasper J.R. Antimuscarinics for the treatment of overactive bladder: current options and emerging therapies // Current Opinion in Investigational Drugs. 2004. V. 5. № 1. P. 40-49.

110. Hegde S.S. Muscarinic receptors in the bladder: from basic research to therapeutics // British journal of pharmacology. 2006. V. 147. № S2. P. S80-S87.

111. Racke K., Matthiesen S. The airway cholinergic system: physiology and pharmacology // Pulmonary pharmacology & therapeutics. 2004. V. 17. № 4. P. 181-198.

112. Bartus R.T. On neurodegenerative diseases, models, and treatment strategies: lessons learned and lessons forgotten a generation following the cholinergic hypothesis // Experimental Neurology. 2000. V. 163. № 2. P. 495-529.

113. Román G.C. Cholinergic dysfunction in vascular dementia // Current psychiatry reports. 2005. V. 7. № 1. P. 18-26.

114. Messer Jr W.S. Cholinergic agonists and the treatment of Alzheimer's disease // Current topics in medicinal chemistry. 2002. V. 2. № 4. P. 353-358.

115. Maeda S., Lameh J., Mallet W.G., Philip M., Ramachandran J., Sadee W. Internalization of the Hml muscarinic cholinergic receptor involves the third cytoplasmic loop //FEBS Letters. 1990. V. 269. № 2. P. 386-388.

116. Lu Z.L., Saldanha J.W., Hulme E.C. Transmembrane Domains 4 and 7 of the Ml Muscarinic Acetylcholine Receptor Are Critical for Ligand Binding and the Receptor Activation Switch // Journal of Biological Chemistry. 2001. V. 276. № 36. P. 34098-34104.

117. Ward S.D., Curtis C.A., Hulme E.C. Alanine-scanning mutagenesis of transmembrane domain 6 of the Ml muscarinic acetylcholine receptor suggests that Tyr381 plays key roles in receptor function // Molecular pharmacology. 1999. V. 56. №5. P. 1031-1041.

118. Kaye R., Saldanha J., Lu Z.-L., Hulme E. Helix 8 of the Ml Muscarinic Acetylcholine Receptor: Scanning Mutagenesis Delineates a G Protein Recognition Site // Molecular pharmacology. 2011. V. 79. № 4. P. 701-709.

119. Kukkonen A., Perakyla M., Akerman K., Nasman J. Muscarinic toxin 7 selectivity is dictated by extracellular receptor loops // Journal of Biological Chemistry.2004. V. 279. № 49. P. 50923.

120. Espinoza-Fonseca L.M., Trujillo-Ferrara J.G. Identification of multiple allosteric sites on the Ml muscarinic acetylcholine receptor // FEBS Letters. 2005. V. 579. № 30. P. 6726-6732.

121. Espinoza-Fonseca L.M., Trujillo-Ferrara J.G. The existence of a second allosteric site on the Ml muscarinic acetylcholine receptor and its implications for drug design // Bioorganic & medicinal chemistry letters. 2006. V. 16. № 5. P. 12171220.

122. Peng J., Vaidehi N., Hall S., Goddard III W. The predicted 3D structures of the human Ml muscarinic acetylcholine receptor with agonist or antagonist bound // ChemMedChem. 2006. V. 1. № 8. P. 878-890.

123. Espinoza-Fonseca L., Pedretti A., Vistoli G. Structure and dynamics of the full-length Ml muscarinic acetylcholine receptor studied by molecular dynamics simulations // Archives of biochemistry and biophysics. 2008. V. 469. № l.P. 142150.

124. Kruse A., Hu J., Pan A., Arlow D., Rosenbaum D., Rosemond E., Green H., Liu T., Chae P., Dror R., Shaw D., Weis W., Wess J., Kobilka B. Structure and dynamics of the M3 muscarinic acetylcholine receptor // Nature. 2012. V. 482. № 7386. P. 552-556.

125. Haga K., Kruse A., Asada H., Yurugi-Kobayashi T., Shiroishi M.,

126. Zhang C., Weis W., Okada T., Kobilka B., Haga T., Kobayashi T. Structure of the130human M2 muscarinic acetylcholine receptor bound to an antagonist // Nature. 2012. V. 482. №7386. P. 547-551.

127. Hanahan D. Studies on transformation of Escherichia coli with plasmids // Journal of Molecular Biology. 1983. V. 166. № 4. P. 557-580.

128. Zubay G. In vitro synthesis of protein in microbial systems // Annual review of genetics. 1973. V. 7. № 1. P. 267-287.

129. Spirin A.S. Cell-free translation system // Springer Verlag: Berlin, Heidelberg, New York. 2002.

130. Spirin A.S., Swartz J.R. Cell-Free Protein Synthesis Systems: Historical Landmarks, Classification, and General Methods // Cell-Free Protein Synthesis. 2008. P. 1-34.

131. Schagger H., Von Jagow G. Tricine-sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis for the separation of proteins in the range from 1 to 100 kDa // Analytical biochemistry. 1987. V. 166. № 2. P. 368-379.

132. Enami I., Satoh K., Katoh S. Crosslinking between the 33 kDa extrinsic protein and the 47 kDa chlorophyll-carrying protein of the PSII reaction center core complex // FEBS Letters. 1987. V. 226. № 1. P. 161-165.

133. Wittekind M., Muller L. HNCACB, a high-sensitivity 3D NMR experiment to correlate amide-proton and nitrogen resonances with alpha- and betacarbon resonances in proteins // J Magn Reson. 1993. V. Ser B. 101. P. 201-205.

134. Kay L.E., Ikura M., Tschudin R., Bax A. 3-Dimensional triple-resonance NMR spectroscopy of isotopically enriched proteins // J. Magn. Reson. 1990. V. 89. P. 496-514.

135. Bax A., Clore G.M., Gronenborn A.M. ^^H correlation via isotropic mixing of 13C magnetization: a new three-dimensional approach for assigning !H and 13C spectra of 13C-enriched proteins // J. Magn. Reson. 1990. V. 88. P. 425.

136. Davis A., Keeler J., Laue E.D., Moskau D. Experiments for recording pure absorption heteronuclear correlation spectra using pulsed field gradients // J. Magn. Reson. 1992. V. 98. P. 207-216.

137. Kuboniwa H., Grzesiek S., Delaglio F., Bax A. Measurement of HN-H alpha J couplings in calcium-free calmodulin using new 2D and 3D water-flip-back methods // J Biomol NMR. 1994. V. 4. № 6. P. 871-878.

138. Archer S.J., Ikura M., Torchia D.A., Bax A. An alternative 3D NMR technique for correlating backbone 15N with side chain H beta resonances in larger proteins //J. Magn. Reson. 1991. V. 95. P. 636-641.

139. Stuart A., Borzirelli K., Withka J., Palmer A. Compensation for Variations in 1H-13C Scalar Coupling Constants in Isotope filtered NMR experiments // J. Am. Chem. Soc. 1999. V. 121. P. 5346-5347.

140. Marion D., Ikura M., Tschudin R., Bax A. Rapid recording of 2D NMR-spectra without phase cycling—application to the study of hydrogen-exchange in proteins // J. Magn. Reson. 1989. V. 85. P. 393-399.

141. Kay L.E., Keifer P., Saarinen T. Pure absorption gradient enhanced heteronuclear single quantum correlation spectroscopy with improved sensitivity // J Am Chem Soc. 1992. V. 114. P. 10663-10665.

142. Piotto M, Saudek V, Sklenar V. Gradient-tailored excitation for singlequantum NMR spectroscopy of aqueous solutions // J Biomol NMR. 1992. V. 2. № 6. P. 661-665.

143. Hiller S., Wider G., Etezady-Esfarjani Т., Horst R., Wuthrich K. Managing the solvent water polarization to obtain improved nmr spectra of large molecular structures // J Biomol NMR. 2005. V. 32. № 1. P. 61-70.

144. Fulton D.B., Hrabal R., Ni F. Gradient-enhanced TOCSY experiments with improved sensitivity and solvent suppression // J. Biomolecular NMR. 1996. V. 8. P. 213-218.

145. Keller R.L.J, Wutrich K. Optimizing the process of nuclear magnetic resonance spectrum analysis and computer aided resonance assignment // Diss. Eth. № 15947 (www.nmr.ch). (Диссертация на соискание степени доктора естественных наук).

146. Guntert P., Mumenthaler С., Wutrich К. Torsion angle dynamics for NMR structure calculation with the new program DYANA // J. Mol. Biol. 1997. V. 273. P. 283-298.

147. Klammt C., Schwarz D., Dotsch V., Bernhard F. Cell-free production of integral membrane proteins on a preparative scale // Methods in Molecular Biology. 2007. V. 375. P. 57-78.

148. Goerke A.R., Swartz J.R. Development of cell-free protein synthesis platforms for disulfide bonded proteins // Biotechnology and bioengineering. 2008. V. 99. №2. P. 351-367.

149. Yu T.Y., Raschle Т., Hiller S., Wagner G. Solution NMR spectroscopic characterization of human VDAC-2 in detergent micelles and lipid bilayer nanodiscs // Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Biomembranes. 2012. V. 1818. № 6. P. 1562-1569.

150. Isaksson L., Enberg J., Neutze R., Goran Karlsson B., Pedersen A. Expression screening of membrane proteins with cell-free protein synthesis // Protein expression and purification. 2012. V. 82. № 1. P. 218-225.

151. Thompson A., Liu J., Chun E., Wacker D., Wu H., Cherezov V., Stevens R. GPCR stabilization using the bicelle-like architecture of mixed sterol-detergent micelles // Methods. 2011. V. 55. P. 310-317.

152. Rosenbaum D., Rasmussen S., Kobilka B. The structure and functions of G-protein-coupled receptors // Nature. 2009. V. 459. № 7245. P. 356- 363.

Информация о работе

Хабибуллина, Нелли Фамзуловна
кандидата биологических наук
Москва, 2012
ВАК 03.01.03

Диссертация

Мембраномоделирующие среды для бесклеточной продукции мембранных белков - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы