Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Изучение биосинтеза сывороточных белков в бесклеточных системах

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Тимченко, Любовь Тимофеевна

ВВЕДЕНИЕ. б

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

Глава I» Церулоплазмин и трансферрин - металлопротеиды плазмы крови.

1.1. Структура и функции церулоплазмина

1.2. Биосинтез церулоплазмина . . «.

1.3. Строение трансферрина

1*4« Биологическая роль трансферрина.

1,5« Биосинтез трансферрина.

Глава 2» Биосинтез, внутриклеточный транспорт и процессинг секреторных белков

2*1. Топография синтеза секреторных белков

2.2. Транспорт белков через мембраны.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Глава 3. Материалы и методы

3.1. Выделение полирибосом из печени крысы

3.2. Выделение суммарной полирибосомной РНК из печени крысы.

3.3. Выделение суммарной высокомолекулярной РНК из цитоплазмы печени крысы.

3.4. Получение фракций РНК, обогащенных последовательностями мРНК церулоплазмина и . трансферрина.

3.5. Выделение поли(А)-содержащей РНК

3.6. Получение экстракта из зародышей пшеницы

3.7. Трансляция РНК в бесклеточной системе из зародышей пшеницы.

3.8.1. Получение лизата ретикулоцитов кролика

3»8;2i Обработка лизата ретикулоцитов.кролика микрококковой нуклеазой.

3.9. Трансляция. РНК в лизате ретикулоцитов кролика.

ЗЛО. Выделение клеточного сока из печени крысы

3.11. Трансляция полирибосом из печени крысы в реконструированной, системе.полирибосомы + клеточный сок.

3.12. Иммунопреципитация продуктов трансляции

3.13. Электрофорез радиоактивных белков . •

3.13Д. Электрофорез в трубках. » • - - . . i

3.13,2. Электрофорез в пластинчатом полиакриламицном геле.

3 .14 . Радиоавтография. и флюография. полиакриламидных гелей.

3.15.1. Выделение микросом.

3.15.2. Выделение фракции аппарата Гольдки.

Глава 4. Общая характеристика беоклвточных систем трансляции

4.1. Характеристика системы синтеза белка из зародышей пшеницы.

4*2. Характеристика реконструированной системы полирибосомы + клеточный сок.из печени крысы

4.3. Характеристика лизата из ретикулоцитов кролика как беоклеточной системы трансляции мРНК.

Глава 5. Биосинтез церулоплазмина в бесклеточных системах

5.1. Биосинтез церулоплазмина в бесклеточной системе из зародышей пшеницы.

5.2. Биосинтез церулоплазмина в реконструированной системе полирибосомы + клеточный сок .»

5.3. Биосинтез церулоплазмина в лизате из ретикулоцитов кролика.

Глава 6. Биосинтез трансферрина в бесклеточных системах.

6.1. Биосинтез трансферрина в бесклеточной системе из зародышей пшеницы.

6.2. Биосинтез трансферрина в реконструированной системе полирибосомы +клеточный сок

6.3. Биосинтез трансферрина в лизате ретикулоцитов кролика.

Глава 7. Биосинтез и посттрансляционное созревание трансферрина в субклеточных фракциях печени крысы.

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ.

ВЫВОДЫ

Введение Диссертация по биологии, на тему "Изучение биосинтеза сывороточных белков в бесклеточных системах"

Актуальность проблемы

Церулоплазмин (ЦП) и трансферрин (Тф) являются металлопротеидами плазмы крови, которые синтезируются в печени позвоночных животных* ЦП - это основной медьпротеид плазмы, обладающий специфической оксидазной активностью и медьтранспортной функцией. В частности, ЦП служит донором меди для внутриклеточных медьсодержащих ферментов - цитохромоксидазы, супероксиддисмутазы и др. Тф - это белок, транспортирующий железо и обеспечивающий перенос железа на гемоглобин в кроветворных клетках, а также -на другие гемощютевды - миоглобин, цитохромные компоненты дыхательной цепи, каталазу.

ЦП и Тф связаны между собой функционально, т.к. ЦП обладает ферроксидазной активностью и окисляет ионы Ре2+" в , т.е. способствует образованию ионов , которые связываются с апотрансферрином. В структурном отношении ЦП и Тф являются гликопротеидами, молекулы которых состоят из единственных полипептидных цепей, но характеризуются наличием участков внутренней гомологии (доменов). По-видимому, для этих двух белков характерны сходные пути эволюции, включающие стадии дупликации и трипликации предковых генов (III). Более того, в литературе имеются указания на возможное общее эволюционное происхождение этих двух металлопротеидов, основанные на обнаружении структурной гомологии аминокислотных последовательностей ЦП и Тф в функционально существенных участках, в частности, в местах связывания ионов металлов (Ca - для ЦП и Ре - для Тф) /III/.

Интерес к изучению механизмов синтеза и созревания ЦП и Тф обусловлен в значительной степени тем обстоятельством, что недо

- 7 статочность этих белков является ведущим фенотипическим проявлением некоторых тяжелых наследственных заболеваний человека. Так, недостаточность Тф (снижение концентрации Тф в кровотоке и нарушение способности Тф к связыванию железа) характерна для гемо-хроматоза /116/. Описаны также довольно редкие формы атранс-ферринемии, т.е. полного отсутствия Тф в кровотоке /135/. Недостаточность синтеза ЦП - это ведущий биохимический признак тяжелого наследственного заболевания с аутосомно-рецессивным типом наследования - гепатолентикулярной дегенерации, или болезни Вильсона-Коновалова /2,12,14,18,54,122,137/. Изучение молекулярных механизмов нарушений синтеза ЦП при этой мутации, проведенное в Лаборатории биохимической генетики НИИЭМ АМН СССР, показало, что в печени гомозиготных больных резко снижены как стационарная концентрация ЦП-мРНК, так и эффективность ее трансляции /14,54,137/. Кроме того, при болезни Вильсона-Коновалова имеет место нарушение посттрансляционного созревания ЦП в печени и секреция в циркуляцию незрелых и функционально неактивных форм ЦП /14/. В то же время в литературе отсутствует информация о последовательности реакций синтеза и созревания ЦП в нормальных гепатоцитах и лишь отдельные работы /118,147,148/ посвящены изучению синтеза Тф. Поэтому дальнейший прогресс в изучении молекулярных механизмов наследственной недостаточности биосинтеза ЦП и Тф должен быть связан с детальным исследованием цутей биосинтеза и посттрансляционной модификации этих белков в нормальном организме.

Один из широко используемых подходов к изучению синтеза и созревания секреторных белков - это анализ этих процессов в опытах на реконструированных бесклеточных системах, транслирую

- 8 щих соответствующие мРНК. Этот подход дает возможность оценки относительного содержания индивидуальных мРНК в гетерогенных препаратах РНК, идентификации первичных продуктов трансляции и воспроизведения реакций ко- и посттрансляционной модификации и трансмембранного переноса белков на реконструированных бесклеточных системах. В литературе нет сведений об изучении бесклеточной трансляции ЦП-мРНК и имеется лишь одна работа, в которой был исследован бесклеточный синтез Тф крысы /147/.

В то же время создание оптимальных бесклеточных систем для синтеза ЦП и Тф и изучение реакций созревания ЦП и Тф в этих системах является необходимым этапом в общей программе исследований, посвященных анализу экспрессии генов ЦП и Тф в нормальном организме и при наследственных заболеваниях с недостаточностью этих металлопротеидов. Цели и задачи исследования

Основной целью работы было изучение биосинтеза секреторных металлопротеидов ЦП и Тф в бесклеточных системах, идентификация первичных продуктов трансляции мРНК, кодирующих ЦП и Тф, изучение начальных (сопряженных с трансляцией) стадий созревания этих белков.

В конкретные задачи работы входило:

1) Получить и охарактеризовать три бесклеточные белоксинтезиру-ющие системы - экстракт зародышей пшеницы, лизат ретикулоци-тов кролика и реконструированную систему, содержащую полирибосомы и клеточный сок из печени крысы.

2) Установить оптимальные условия трансляции Тф-мРНК и ЦП-мРНК в этих бесклеточных системах.

3) Охарактеризовать первичные продукты трансляции ЦП-мРНК и

- 9

Тф-мРНК в трех белоксинтезирующих системах.

4) Изучить реакции котрансляционного созревания биосинтетических предшественников ЦП и Тф в бесклеточных системах, запрограммированных соответствующими мРНК.

5) В опытах с импульсной меткой in vivo изучить динамику появления новообразованного Тф в субклеточных фракциях печени крысы и охарактеризовать изменения молекулярной массы Тф, связанные с его внутриклеточным транспортом.

Научная новизна работы

В работе впервые созданы оптимальные условия для изучения трансляции мРНК церулоплазмина и трансферрина в трех бесклеточных белоксинтезирующих системах. Доля новообразованных ЦП и Тф соответственно равна 1-4% и 2-6$ суммарного продукта бесклеточной трансляции нефракционированной мРНК печени. В экстракте зародышей пшеницы ЦП-мРНК наиболее эффективно транслируется в среде с высокой ионной силой (186мМ К+), а трансляция Тф-мРНК в меньшей степени зависит от ионной силы среды инкубации.

Впервые показано, что ЦП синтезируется в форме предшественника ( ~ 122 кД), который характеризуется очень высокой чувствительностью к действию протеаз. Начальной стадией котрансляционного созревания ЦП в бесклеточной системе является протеолитическое отщепление ш2-концевой сигнальной последовательности (^4 кД), а затем следует инициация гликозилирования растущих цепей ЦП, связанных с полисомами.

Тф крысы синтезируется в бесклеточных системах в виде предшественника с избыточной последовательностью аминокислот (4 кД), из которых 2 кД приходится на 1Ш2нконцевой сигнальный пептид. Созревание Тф в субклеточных фракциях печени крысы но

- 10 сит многоступенчатый характер с разнонаправленными изменениями молекулярной массы.

Научно-практическое значение полученных результатов

Полученные в работе данные о последовательности парциальных реакций созревания ЦП и Тф и их связи с синтезом этих белков имеют существенное значение для выяснения молекулярных механизмов, лежащих в основе нарушений синтеза и процессинга ЦП и Тф при наследственных заболеваниях (гепатолентикулярная дегенерация, атрансферринемия, гемохроматоз). В работе оптимизированы условия бесклеточной трансляции ЦП- и Тф-мРНЕС. Обоснован выбор лизата ретикулоцитов как оптимальной системы для бесклеточного синтеза полноразмерных (или почти полноразмерных) первичных продуктов трансляции ЦП-мРНК, экстракта зародышей пшеницы - для изучения реакций модификации -концов продуктов трансляции и реконструированной системы из печени крысы - для анализа последовательности ранних стадий созревания белков, сопряженных с их синтезом на полирибосомах. Эти результаты представляют существенный интерес для практики работы лабораторий, исследующих биосинтез и созревание ЦП, Тф и других секреторных белков в опытах на бесклеточных системах. Структура диссертации

Диссертация состоит из введения, обзора литературы (главы I и II), материалов и методов исследования (глава III), собственных исследований (главы 1У-УТ1), обсуждения результатов и выводов. Работа иллюстрирована 34 рисунками и содержит II таблиц. Список литературы содержит 182 названия работ на русском и иностранных языках.

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Тимченко, Любовь Тимофеевна

- 158 -ВЫВОДЫ

1. Выделены и охарактеризованы высокоэффективные бесклеточные системы для синтеза белков: экстракт из зародышей пшеницы, лизат из ретикулоцитов кролика и реконструированная система полирибосомы + клеточный сок.

4 ,

2. При трансляции суммарной полисомной РНК из печени крысы в бесклеточных системах доля церулоплазмина и трансферрина составляет, соответственно, 1-4$ и 2-6$ суммарного продукта трансляции.

3. мРНК церулоплазмина транслируется наиболее эффективно при высокой концентрации ионов К+ (180-200мМ), На трансляцию трансферриновой мРНК изменение концентрации ионов К+ оказывает меньшее влияние.

4» Церулоплазмин синтезируется в лизате ретикулоцитов кролика в форме предшественника с молекулярной массой ^122 кД, обладающего высокой чувствительностью к действию протеаз. В других бесклеточных системах синтезируются протяженные НН2-концевые сегменты церулоплазмина (80-84 кД).

5. Процесс созревания церулоплазмина начинается реакцией отщепления сигнального пептида ( кД). Следующей стадией созревания является гликозилирование насцентных цепей церулоплазмина, Эти реакции происходят во время синтеза белковой цепи молекулы церулоплазмина.

6, Трансферрин крысы синтезируется в бесклеточных системах в форме предшественника с молекулярной массой 82 кД, Под действием ферментов, локализованных в мембранах печени крысы, происходит отщепление избыточной последовательности ( ^4 кД).

- 159

7« Процесс созревания трансферрина в субклеточных фракциях печени крысы сопровождается разнонаправленным изменением молекулярной массы биосинтетического предшественника трансферрина.

8. Трансферрин синтезируется дл^о на полирибосомах, связанных с мембранами эндоплазматического ретикулума. Через 15 мин после введения метки трансферрин накапливается в цистернах шероховатого ретикулума. Через 20 мин максимальное содержание радиоактивного трансферрина наблюдается во фракции гладкого ретикулума. В аппарате Гольджи радиоактивный трансферрин обнаруживается через 30 мин. Секреция трансферрина в кровоток начинается через 20-30 мин после введения метки и не снижается в течение часа. 160

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Тимченко, Любовь Тимофеевна, Ленинград

1. Василец И.М. Церулоплазмины, их молекулярная структура и биологические функции. Уоп.биол.химии 1973» 14, 172-201, "Наука"t М.

2. Вахарловский В.Г., Гайцхоки B.C., Киселев О.И., Мошков К.А.,

3. Цучкова Л.В., Шавловский М.М., Щульман В.Ш., Нейфах С.А. Генетический дефект синтеза церулоплазмина в полирибосомах печени при болезни Вильсона-Коновалова. Докл. АН СССР 1975, 222, 3, 716-719.

4. Гайцхоки B.C. Выделение информационных РНК эукариотических клеток. В кн.: Итоги науки и техники, ВИНИТИ АН СССР, сер. Мол.биол. 1976, 7,8-57.

5. Гайцхоки B.C. Молекулярная организация эукариотическихинформационных РНК. Мол.биол. 1979, 13, 4, 725-751.

6. Гайцхоки B.C. Информационные РНК клеток животных.1. Медицина, М., 1980.

7. Гайцхоки B.C., Львов В.М., Шварпман А.Л., Нейфах С.А.

8. Физико-химическая характеристика высокоочищенной мРНК церулоплазмина из печени крысы. Мол.биол. 1979, 13, 5, 1147*1160.

9. Гайцхоки B.C., Тимченко H.A., Тимченко Л.Т., Зфчкова Л.В.,

10. Асланов Х.А., Салихов Т.А. Характеристика полирибосом печени дернен, синтезирующих трансферрин. Биохимия 1981,46,8,1426-1434.

11. Гайцхоки B.C., Тимченко H.A., Тимченко Л.Т., Цучкова Л.В.,

12. Асланов Х.А., Салихов Т.А. Биосинтез и посттрансля-циооное созревание трансферрина в субклеточных фракциях печени крысы. Биохимия 1982, 47, I, 13-18.- 161

13. Дамащун Г., Дамашун X., Каюшина Р.Л., Кребер Р., Мошков К.А.,

14. Мюллер Й.» Нейфах С.А., Шршель X., Шавловский М.М., Бельке Ю. Определение молекулярного веса церулоплазми-на человека при помощи гидродинамических методов и рентгеновского малоуглового рассеяния. Биофизика 1976, I, вып.6, 965-^970.

15. Львов В.М., Шварцдаан АЛ., Гайцхоки B.C., Скобелева H.A.,

16. Фролова Л.Ю., Нейфах С.А. Ядерные предшественники информационной РНК, кодирующей церулоплазмин, из пече- . w W tни крысы. Мол.биол. 198I, 15, 4, 845-856.

17. Нейфах С.А., Алейникова Т.Д., Гайцзоки B.C., Цучкова Л.В.,

18. Монахов Н.К. Внутриклеточные белки-предшественники церулоплазмина. Докл. АН СССР 1979 , 244, I, 238*240.

19. Нейфах С .А., Вахарловский В. Г., Гайцхоки B.C., Монахов Н.К.,

20. Цучкова Л.В., Шварцман А.Л. Экспрессия гена церулоплазмина при болезни Вильсона-Коновалова. Вестник АМН СССР 1982, I, 53-63.

21. Носиков В.В., Брага Э.М., Шварцман А.Л., Львов В.М.,

22. Гайцхоки B.C., Киселев Л.Л., Скобелева H.A., Фролова1.• ,

23. Л.Ю., Нейфах С.А. Структурная организация гена церулоплазмина. Мол.биол. 1981, 15, 4, 835-844.

24. Цучкова Л.В., Гайцхоки B.C., Вахарловский В.Г., Шварцман

25. А.Л., Щульман В.Ш., Форкамф-Лауэ П.И., Нейфах С.А. Молекулярный дефект синтеза и созревания церулоплазмина при мутации Вильсона-Коновалова. Генетика 1982, ЗВ, 5, 14-21.

26. Тимченко H.A., Тимченко Л.Т., Шварцман А.Л., Салихов Т.А.,

27. Гайцхоки.В.С. .мРНК трансферрина из печени крысы. Мол.биол. 1983, 17, 2, 322-329.- 162

28. Тимченко Н.А., Шварщяан А.Л., Салихов Т.А.,Гайцхоки В.С.

29. Выделение высокоочшценной мРНК, кодирующей трансфер-рин, из печени крысы» Мол.биол», микробиол., ви-русол. 1983, I, 2, 33-35.

30. Фролова Л.Ю., Шварцман А.Л., Скобелева Н.А., Львов В.М.,

31. Ciechanover A., Schwartz A., Dautly-Varsat A., Lodish H.F.

32. Kinetics of internalization and recycling of transferrin and the transferrin receptor in a human hepatoma cell line1; J.Biol.Chem*. 1983» 258. 16, 9681-• mmm *9689 i- 165

33. Claries A.D., Gautier A.E., Edgl M.D., Knowles J.R.

34. Targeted point mutation that creates a unique EcoRI site within the signal codons of the ^-lactamase gene without altering enzyme secretion or procès4 • «sing. J.Biol.Chetn. 1982, 2J57, 14, 7930-7932.

35. Cbchet M., Gagnon P. , Hen R., Maroteaux L. » Perrin P. ,

36. Chem. 1977; 252, 22, 8310-8319. „ t . .44! H.g. , Noort W.L. Isolation of rat transferrin using

37. CUBr-activated Sepharose 4B. J. Clin. Ch em! Clin!'4 . .

38. Gagnon J., Talmiter R.D., Walsh R.Al Cbmparison of the

39. NH^-terminal sequence of ovalbumin as synthesized in vitro and in vivo. J.Biol.Chem. 1978, 253. 20, 7664-7668.4 • • *

40. Gorinsky B., Horsburgh C. , Lindley P.F., Moss D.'s-. ,

41. Habener J.P., Chang H.T., Potts J.T. Enzymic processingof pro parathyroid hoimone by cell-free extracts of parathyroid glands. Biochemistiy 1977,16,11,3910-3917.

42. Harano T., Otnura T;. Biogenesis of endoplasmic reticulummembrane in rat liver cells. III. Biogenesis of NADPH cytochrome c reductase and cytochrome b^ by loosely bound ribosomes. JCBiochem. (Tokyo) 1978, 84, I, 213-223.

43. Hart E.B., Sfceehbock H., Waddel I., Elvehjem Cf«A.1.on in nutrition. VII'. Cbpper as a supplement to iron for hemoglobin building in the rat*. J.Biol. Chem. 1928, J7, 2, 797-8I2V

44. Chem. I9821, 251, 15054-15058;4 1 ' *

45. Biochemistry 1976, I, 15-19.t * » . •

46. Kingston B.", Kingston B.Ii. , Putnam F.W. Chemical evidence that proteolytic cleavage causes the heterogeneity present in human ceruloplasmin preparation.4 t

47. Pro c. Nat I'i Ac a d. S*c i • USA 1977, 74, 12, 5377-5381: § ». . .82l Klausner R. D.*, Ashwell G. , Van Renswoude J., Harford J.B. ,m .

48. Bridges K^R. Binding of apotransferrin to R 562cellsï explanation of the transferrin cycle.

49. ProclNatlCAca d.Sci'. USA 1983, 80, 8; 2263-2266v « « • . • .83'i Klausner R. D., Van Renswoude J. * Ashwell G., Kempf C., Sehechter A.N., Dean A., Bridges K.Rl Receptormediated endocytosis of transferrin in K 562 Ce lié. * »

50. J.BioTlC&iem'. 1983, 258. 8, 4715-4724. $ * • * • <84*1 KreibichG. , Czako-Graham H. , Grebenan R., S'abat ini D. D.

51. EurtJCBiochertf: 1980, III, I, 49-584 • •

52. Lodish H.p., Rong N., Suider M., Straus G.J. A.M.

53. Heurmodson M.A. Amino acid sequence of honeybee prepromellitin synthesized in vitro»4 t • • •

54. ProcCNatKAcad.Sci. USA 1978, 75, 2, 701-704.i ••97s; Maccecchini M.L., Rudin Y., Sfchatz G. Transport of proteins across the mitochondrial outer membrane. Jl

55. AcadtSci'I USA 1982, 72» 8, 2504-2 508^4 • • •1.0T Magnusson S.", Sottrup-Jensen Ii/, ^Petersen T.E., Morris H.R., Dell

56. Mazurier J., Met z-Boutique X., Jolles J., Spik C.»

57. Montreil J. , Jolles P. Human lactotransferrin: molecular, functional and evolutionary comparisons with human serum transferrin and hen ovotransferrin. Experientia 1983, 39, I35-I4I!105.* McKnight G. S., Lee D. C., Hemmaplardh p. , Pinch A,,

58. McKnight G.S., PalmiterR.D.' Transcriptional regulation of the ovalbumin and conalbumin genes by steroid hormones in chicken oviduct! J.BiolVCihem'. 1979, 254, 18, 9050-9058!- 175

59. Meek R.L., Walsh K.A., Palmiter R.D. The signal sequenceof ovalbumin is located near the NH^-t erminus. J.Biol. Cfrem. 1982, 257, 20, 1224-1225.

60. Mercier JlC., Gaye T. Early events in secretion of mainmilk proteins! occurrence of precursors. J.Dairy Science 1982, 65» 299-316.

61. Metz-Boutique M.H,, Mazurier J., Jolles J. , Spik GV,

62. Montreil J.f, Jolles Pi The present state of the human lactoferrin sequence'. Study and alignment of the cyanogen bromide fragment and characterization of N- and C-t erminal domains. BIochim.Biophy s.Acta 1981, 670. 2, 243-254.

63. Meyer D.J., Dobb erst ein B. A membrane component essential for vectorial translocation of nascent proteins across the endoplasmic reticulums requirements for its extraction and reassociation with the membrane. Jl Cell Biol. 1980, 87» 2» 498-502.

64. Greaves Iff* The transferrin receptors' Trands

65. I& IPatzeit 0.> Labrecque A.D., Duguid jC'B^» Gar roll R;11 «4 at

66. JvP^ Chambon The chicken conalbumin genetstudies of the organization of cloned DNAs'.- • ~t « - .

67. Bucl^ Acids Res^' 1979; Ö; 2731-2749^ 134^ Plowman G^D;^ Brown Ji*^; Boris CiAl^' Sohoder J;';• » 4 * ■

68. Hikinmaa B'.t Sussman H.h;, Hellstrom RlB,'»- #

69. V, J*;1Peptprotein Re^ I982fi-I, 40-53V4 - . - 4 4" I ♦ 44'137^ Puchkova Ii; 7; ; Gaitskhoki V.S. t I/'vov Monakhov1 • ♦ 1 * -- 4 •

70. JlBiolCChew! 1979» 2^4, 23, 120I3-I20I9fl-4 •• • « 148s! Schreiber Gvl Dryburgh Hi, Weigand K., Schreiber MV,• . * ' *

71. Witt J1!! Seydewitz Hi; Howlett G'l Intracellular precursor foims of transferring acid glycoprotein and «¿-antitrypsin in human liverl Arch!

72. BiochemlBiophysl 1981, 212. 2, 319-328V< > • «1.9l Schule Gl, Blackburn Pi Role of mammalian RNAse inhibitor in cell-free protein synthesis! ProclNatll• * MM ' • '

73. AcadvScil USA 19791 10, 4898-4902*1• 1 • ' • • • •1.0I Schwartzman Alll; Gaitskhoki V.S., E'vov V.Ml j Hosikov» • 1 « , «

74. V^V.l Braga ElMl; Prolova iCYul'l Skobeleva N.Aly1 « 1 *

75. Diabetes 1978, 27, T? 145-148. 153V Steiner DM Insulin today; Diabetes 1977, £6, 322-340. 154; Steiner , Guinn P. S., Chan S.J,, Marsh J; , Tager H.S.

76. Processing mechanisms in the biosynthesis of pro-t einst Ann.NiTi Acadl Seil 1980, ¿45, I-I6»l I55!^ Steiner Quinn P.S.", Pat zeit CI'; Chan S.tfi, Marsh J.,

77. Blobel Gl Tryptic digestion and reconstitution of translocation activity for nascent presecretoiy184 . . tt proteins across microsomal membranes. Proci.Natlv4 » .

78. X76C Williams JV, Eli em an T. C; Kingston JlBl,' Wilkins A.Gl,•

79. J.Biol'i'Ohemi I983V 258. 8, 4972-4976V.1811 Zagorsk I W;1 Preparation and characterization of a wheat embryo cell-free extract active in the synthesis ofkigh molecular weight viral polypeptides;*

80. Anal^Biochant 1978, ¿g I, 316-333';— . • ,182^ Zanderer M;, liberti P. , Baglioni Gt Distribution ofkistone messenger RHA among free and membrane-associated polyribosomes of a mouse myeloma cell line^ JlMol^Biol^ I973t 79» 3, 577-586;