Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Динамика формирования и структурная организация эукариотических полирибосом

ВАК РФ 03.01.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Динамика формирования и структурная организация эукариотических полирибосом"

На правах рукописи

Афонина Жанна Аркадьевна

ДИНАМИКА ФОРМИРОВАНИЯ И СТРУКТУРНАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ ЭУКАРИОТИЧЕСКИХ ПОЛИРИБОСОМ

03.01.03 - Молекулярная биология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

1 Я АПР

Москва-2013

005052033

Работа выполнена в Лаборатории механизмов биосинтеза белка Федерального государственного бюджетного учреждения науки Институте белка Российской академии наук при сотрудничестве с Институтом генетики и молекулярной и клеточной биологии, Отделом интегральной структурной биологии (Страсбург, Франция).

НАУЧНЫЕ РУКОВОДИТЕЛИ: доктор биологических наук, профессор,

академик Спирин Александр Сергеевич

кандидат биологических наук Широков Владимир Анатольевич

Карпова Галина Георгиевна, доктор химических наук, профессор, Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт химической биологии и фундаментальной медицины Сибирского отделения Российской академии наук, заведующая Лабораторией структуры и функции рибосом.

Дмитриев Сергей Евгеньевич, кандидат биологических наук, Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова», Научно-исследовательский институт. физико-химической биологии имени А.Н. Белозерского, старший научный сотрудник Лаборатории регуляции синтеза белка.

ВЕДУЩАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ:

Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта Российской академии наук.

Защита состоится 28 марта 2013 года в 11.00 часов на заседании Совета Д 501.001.76 по защите докторских и кандидатских диссертаций при Федеральном государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова» по адресу: 119234, Москва, Ленинские горы, МГУ, Биологический факультет, ауд. 389.

С диссертацией можно ознакомиться в Научной библиотеке МГУ имени М.В. Ломоносова (Фундаментальная библиотека. Ломоносовский проспект, 27, отдел диссертаций).

ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ:

Автореферат разослан «_» февраля 2013 года.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Полирибосома представляет собой группу рибосом, нанизанных на нить молекулы мРНК и последовательно транслирующих ее в одном направлении, от 5'-конца к З'-концу полирибонуклеотидной цепи. Полирибосомы являются основной формой существования транслирующих рибосом, универсальной как для прокариотических, так и эукариотических клеток.

В первых же электронно-микроскопических исследованиях полирибосом млекопитающих было замечено, что основными формами полирибосом являются кольца, одинарные ряды, зигзаги, спирали, а также двойные ряды, интерпретируемые в основном как «схлопнутые» кольцевые структуры. С другой стороны, функциональные исследования показали, что рибосомы полирибосом медленно обмениваются со свободными рибосомами и рибосомными субчастицами, и каждый новый раунд трансляции/инициации в полирибосомном пуле обеспечивается в основном за счет только что терминировавших рибосом. На основании этого была выдвинута гипотеза «циркулярной трансляции», согласно которой полирибосомы эукариот могут приобретать замкнутую кольцевую конфигурацию, благодаря чему рибосомы после терминации трансляции ре-инициируют на той же самой молекуле мРНК. Позднее был открыт возможный механизм циркуляризации мРНК в полирибосомах - взаимодействие кэп-связывающего белкового комплекса eIF4E-eIF4G (5'-конец мРНК) и поли(А)-связывающего белка (далее - РАВР) (З'-конец мРНК).

В настоящее время образование циркулярной структуры мРНК считается одним из ключевых этапов трансляции у эукариот, функциональным значением которого, возможно, является отбор правильно процессированных молекул мРНК и обеспечение высокой интенсивности их трансляции. В то же время, до сих пор не получено прямых доказательств существования взаимодействия 5'- и З'-концов мРНК в составе полирибосом. Не было предпринято попытки охарактеризовать одновременно и структурную организацию, и функциональные свойства полирибосом с точки зрения гипотезы «циркулярной трансляции».

Цель и задачи исследования. Основной целью данной работы было выяснение динамики формирования структуры и сопутствующих изменений функциональных свойств эукариотических полирибосом. Изучение полирибосом, сформированных in vivo, затруднено: как в процессе разрушения клетки, так и в ходе выделения полирибосом, может происходить изменение их морфологии. В то же время, было показано, что в эукариотических бесклеточных системах трансляции образуются полирибосомы, сходные по форме с таковыми in vivo.

Мы использовали разработанный в нашей лаборатории, длительно-работающий вариант бесклеточной системы трансляции на основе экстракта зародышей пшеницы для изучения формирования полирибосом на мРНК с различными нетранслируемыми областями (далее - НТО). Первой нашей задачей было сравнить динамику формирования полирибосом на кэпированных и

некэпированных мРНК с природными и случайными НТО. Для решения данной задачи мы использовали метод седиментации в сахарозном градиенте в сочетании с методом классической электронной микроскопии (далее - ЭМ). В рамках выполнения второй задачи мы исследовали функциональные свойства полирибосом с точки зрения гипотезы «циркулярной трансляции», а именно, обмен полисомных рибосом со свободными рибосомами, а также влияние конкурентной мРНК на трансляцию полисомной мРНК. Третьей задачей было изучение структурной организации полирибосом в процессе их формирования и функционирования, для чего были использованы методы классической и криоэлектронной микроскопии.

Научная новизна работы. Используя длительно-работающую систему трансляции на основе экстракта зародышей пшеницы в сочетании с методами седиментации в сахарозном градиенте, классической и криоэлектронной микроскопии, мы проследили за формированием полирибосом на различных мРНК в течение многих раундов трансляции и проанализировали их структурную организацию и функциональные свойства. Такой подход к изучению полирибосом был использован впервые. Основные результаты проведенной работы не имеют аналогов в мировой литературе и вносят значительный вклад в понимание процесса трансляции у эукариот. Так, прямо показано, что циркулярные полирибосомы формируются как на кэпированной, так и на кэп-независимой мРНК. Кроме того, нами была показана взаимосвязь структурной организации и функциональной активности полирибосом: оказалось, что избыточная заполненность мРНК рибосомами может приводить к замедлению, а возможно, также к полной остановке синтеза белка. На основании полученных данных нами предложен сценарий процесса формирования свободных цитоплазматических полирибосом.

Апробация работы. По материалам диссертации опубликовано 3 статьи в рецензируемых журналах. Результаты исследований были представлены на российских и международных конференциях: ЕМВО Conference «Protein Synthesis and Translational Control» (Heidelberg, Germany, 2011), Conférence GTBio (Paris, France, 2009), 13th Annual Meeting of the RNA Society (Berlin, Germany, 2008), The 8th International Engelhardt Conference on Molecular Biology «RNA-Protein Interactions» (Sergiyev Posad, Russia, 2006).

Структура диссертации. Диссертационная работа изложена на 146 страницах машинописного текста и состоит из следующих разделов: Введение, Обзор литературы, Материалы и методы, Результаты и их обсуждение, Заключение, Выводы и Список цитируемой литературы из 167 ссылок. Работа содержит 40 рисунков и 5 таблиц. Литературный обзор посвящен анализу исследований структурной организации и функциональных свойств полирибосом.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Список сокращений

ЭМ - электронная микроскопия; РАВР - Poly(A)-Binding Protein, поли(А)-связывающий белок; НТО (UTR) - нетранслируемая область мРНК, CECF -continuous exchange cell-free system, бесклеточная система с непрерывным обменом; ВТМ (TMV) - вирус табачной мозаики; н.о. - нуклеотидные остатки мРНК; CPS - counts per second, число фотонов в секунду; СРМ - counts per minute, число распадов в минуту; FTSC - fluorescein-5-thiosemicarbazide, флуоресцеин-5-тиосемикарбазид; крио-ЭТ - криоэлектронная томография.

Ключевые понятия

Раунд трансляции - время, необходимое для одного прочтения мРНК рибосомой и равное сумме времен инициации, элонгации и терминации. Время раунда трансляции экспериментально определяли как время, необходимое для появления первых молекул активного белка (GFP или люциферазы) в системе трансляции; оно составляло от 7 до 12 мин в зависимости от вида мРНК и условий трансляции в бесклеточной системе.

Загруженность полирибосом может быть описана как число рибосом на полисомной мРНК, а также как обратная величина - число нуклеотидных остатков кодирующей области мРНК, приходящееся на одну рибосому (обозначается далее как н.о. на рибосому). В данной работе используются оба варианта этой характеристики.

Диализная система трансляции - бесклеточная система с непрерывным обменом (CECF, continuous exchange cell-free system). Это система трансляции длительного действия, основанная на динамическом режиме работы, в котором происходит восполнение субстратов и удаление низкомолекулярных продуктов трансляции через полупроницаемую диализную мембрану, что поддерживает стабильные условия трансляции в течение многих часов работы системы.

Схемы использованных мРНК

5'UTRMklW„-scGFP-3'UTR42(A),00 cap-5'UTRIH<0i,|1,.scGR»-3' UTRN180

capped ß-globln _1_42(A)1Q0 UTR capped ß-globin N180 UTR

UTR t^msbixcfj 6ff UTR O^Sbp-СДр Off

52 225 750 42 100 52 225 750 180

N60 UTR }=>

60

5'UTR0be-i.i/c.3'UTRTMV

5 иТНод -LUC-3 UTRni

Obelin UTK

-с

TMV UTR GA UTR _

139 202

5'иТКТМу-и/с-3,1ЯКТМу

тмуитя

1650

.„-всСРР-З'иТ^,

сарре<1 р-ц1оЫп__

итн о^д ар-сьр

Гя—3

Часть 1. Динамика формирования полирибосом в бесклеточной системе

Согласно принятой в настоящее время гипотезе, мРНК эукариотических полирибосом имеет кольцевую конфигурацию и транслируется рибосомами «по кругу». Образование кольцевой структуры мРНК (циркуляризация мРНК), содержащей кэп-структуру на 5'-конце мРНК и поли(А)-последовательность на 3'-конце мРНК, происходит при участии кэп-связывающего комплекса еШ4Р и РАВР. 5'-концевая кэп-структура и З'-концевая поли(А)-последовательность обладают синергическим эффектом; считается, что усиление трансляции является следствием их взаимодействия при циркуляризашга такой мРНК. В нашей лаборатории было показано, что кэп-независимая 5-НТО из мРНК, кодирующей белок обелин гидроидного полипа ОЬеНа longissima, в сочетании с З'-НТО вирусной РНК также эффективно усиливает трансляцию мРНК (БЬаЫко с/ а/., ВШесИпо1. В'юещ., 2004, 88:730-739). Мы предположили, что данные НТО, по аналогии с 5'-концевой кэп-структурой и З'-концевой поли(А)-последовательностью, взаимодействуют с образованием циркулярной структуры мРНК. Для проверки этого предположения мы проанализировали процесс формирования полирибосом на некэпированной мРНК с 5'-НТО мРНК обелина и З'-НТО РНК вируса табачной мозаики (далее - ВТМ) (б'ЦТНоье-^'с-З'иТКтму) и на копированной полиаденилированной мРНК (б'иТЯр^о^п-лсО^-З'иТ^г^юо), а также на кэпированной и на «безлидерной» мРНК со случайными З'-НТО (сар-5'иТКр^|оЫп-^сС^Р-3'иТКы180 и 5'иТКСА-£.г(с-3'иТКмбо), для которых не предполагается взаимодействие концов мРНК. Формирование полирибосом происходило в диализной системе трансляции на основе экстракта зародышей пшеницы, анализ полирибосом проводили с помощью методов седиментации в сахарозном градиенте и ЭМ.

мРНК, содержащие синергические 5-НТО и З'-НТО, обеспечивали высокую скорость трансляции в течение более длительного времени, чем мРНК, в которых одна или обе НТО были случайными. Так, система трансляции на кэп-независимой мРНК 5'иТКоье-£-«с-3'иТКтму характеризовалась постоянной высокой скоростью трансляции в течение многих раундов трансляции (более 16 раундов, 120 мин) (Рис. 1А, мРНК 1), в то время как в системе трансляции на «безлидерной» мРНК со случайной З'-НТО (5'иТЯсд-/.иоЗ'иТК.цбо) скорость трансляции начинала снижаться уже после 8 раундов трансляции (60 мин) (Рис. 1А, мРНК 2).

мРНК1 мРНК 2

Время, мин Время, мин

Объем градиента, мл Объем градиента, мл

Рис. 1. Сравнение кинетических кривых синтеза белка (А) и процесса формирования полирибосом, проанализированного с помощью метода седиментации в сахарозном градиенте 15-45% (Б), на мРНК с 5'-НТО мРНК обелина и З'-НТО РНК ВТМ (мРНК 1) и на «безлидерной» мРНК со случайной З'-НТО (мРНК 2). Формирование полирибосом происходило в диализной системе трансляции. Время отбора проб из реакционной смеси для седиментации в сахарозном градиенте указано стрелками (А). Стрелками и цифрами указано число рибосом в полирибосомах; пунктир разделяет седиментограммы на зоны «легких» и «тяжелых» полирибосом (Б).

мРНКЗ

сар-5'иТЯр.8|оЫп-5сСЯЯ-3'иТВ42(А|1оо

мРНК 4

сар-5'итке.8|оЫп-5серр-з'итя„18()

0,0 2,5 5,0 7,5 10,0 Объем градиента, мл

0,0 2,5 5,0 7,5 10,0 Объем градиента, мл

Рис. 2. Сравнение кинетических кривых синтеза белка (А) и процесса формирования полирибосом (Б) на кэпированной мРНК с З'-концевой поли(А)-последовательностью (мРНКЗ) и без таковой (мРНК4). Формирование полирибосом происходило в диализной системе трансляции. Обозначения - как на Рис. 1.

Подобный, но менее выраженный эффект наблюдался также в случае кэпированных мРНК (Рис. 2А).

Как в случае кэпированных, так и в случае некэпированных мРНК формирование полирибосом происходило в течение многих раундов трансляции. В течение первых 4-5 раундов трансляции (30-40 мин) формировались полирибосомы с загруженностью около 100 нуклеотидных остатков кодирующей области мРНК, приходящихся на одну рибосому (далее - н.о. на рибосому). Такие полирибосомы были обозначены как «легкие» (Рис. 1Б и 2Б). Важно отметить, что приблизительно ту же величину загруженности рибосомами имеют полирибосомы in vivo - от 80 до 220 н.о. на рибосому (Arava et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 2003,100:3889-3894).

В течение последующей инкубации в системах трансляции как на кэпированных, так и некэпированных мРНК, формировались более загруженные рибосомами («тяжелые») полирибосомы (Рис. 1Б, 2Б). Интересно отметить, что «утяжеление» полирибосом в некоторых случаях приводило к тому, что «тяжелые» полирибосомы отделялись во время седиментации от «легких» полирибосом в виде обособленной зоны.

Соотношение количества «легких» и «тяжелых» полирибосом коррелировало со степенью активности системы трансляции. Так, в начальный период работы системы, при трансляции с постоянной скоростью, большая часть полирибосом как на кэпированных, так и некэпированных мРНК была представлена «легкими» полирибосомами. Накопление «тяжелых» полирибосом происходило на более поздних этапах работы системы и, как правило, коррелировало со снижением скорости трансляции. При этом в случае мРНК с синергическими НТО (cap-5'UTRp_0i0b¡n--K:GF/>-3'UTR42(A)ioo и 5'UTRobe-¿»o 3'UTRtmv) преобладающее содержание «легких» полирибосом сохранялось в течение длительного времени, соответствующего периоду активной трансляции в системе. При трансляции мРНК со случайными З'-НТО большая часть полисомных рибосом переходила в «тяжелые» полирибосомы в период замедления работы системы. Возможно, что причиной накопления «тяжелых» полирибосом (и снижения скорости трансляции) является деградация З'-концевой последовательности мРНК.

Общие закономерности, найденные при сравнении процесса формирования полирибосом на копированной полиаденилированной и кэп-независимой мРНК поддерживают предположение, что мРНК с 5'-НТО мРНК обелина и З'-НТО РНК ВТМ, подобно кэпированной мРНК с 3'-поли(А)-последовательностью, способна к формированию циркулярных полирибосом. Проведенный параллельно анализ полирибосом методом классической ЭМ (негативное контрастирование) показал, что на всех мРНК, включая «безлидерную» мРНК со случайной З'-НТО, основная часть полирибосом представлена двойными рядами (Рис. 3), которые схожи по форме с полирибосомами, сформированными in vivo (Yasaki et al., J. Electron Microsc. (Tokyo), 2000, 49:663-668). Более подробно структура

7

полирибосом на мРНК 5'иТКр.д|оЫп-.5,сОРР-3'иТЯ42{А)1оо и 5'иТЫоье-£иоЗ'иТКтму была проанализирована с помощью метода криоэлектронной томографии, результаты которой будут рассмотрены далее в главе 3.

мРНК 1 МРНК2

5,иткОЬе-1.ис-з'ит11шу З'итВидЧис-з'итк^о рис_ 3 Анализ формирования

полирибосом на мРНК с 5'-НТО мРНК обелина и З'-НТО РНК ВТМ (мРНК 1) и «безлидерной» мРНК со случайной З'-НТО (мРНК 2) методом классической ЭМ (негативное контрастирование). Аликвоты для ЭМ анализа отбирали в указанное время работы диализной системы трансляции (см. Рис. 1).

а ■ . , Г* '1."" - ь" 4 : * " «С

др 40 мин &

* ' 9 » I 1

г

.1

шщ ¡88

Часть 2. Функциональные свойства полирибосом

2.1 Трансляционная активность «легкой» и «тяжелой» фракций полирибосом

Как было отмечено выше, высокая скорость синтеза поддерживается полисомными рибосомами с пиком распределения в зоне «легких» полирибосом (более 100 н.о. на рибосому), а снижение скорости синтеза белка коррелирует с накоплением в системе трансляции «тяжелых» полирибосом (менее 100 н.о. на рибосому). Чтобы прямо показать зависимость между степенью загруженности полирибосом и их трансляционной активностью, мы сравнили скорость включения радиоактивных аминокислот в растущий полипептид в «легких» и «тяжелых» полирибосомах.

В систему трансляции с полирибосомами, сформированными в течение 120 мин работы диализной системы трансляции (около 10 раундов трансляции) на мРНК с синергическими 5'-НТО и З'-НТО РНК ВТМ (5'итаТМу-^с-3'иТЯТМу), были добавлены радиоактивно-меченые аминокислоты. Аликвоты, отобранные через разное время после добавления метки, анализировали седиментацией в сахарозном градиенте. Определяли оптическую плотность во фракциях градиента

и количество радиоактивности, связанной с полирибосомами в каждой из них. Далее мы рассчитали включение радиоактивных аминокислот в растущий полипептид на 1 ОЕ^бо рибосом для фракций, соответствующих «легким» и «тяжелым» полирибосомам для всех временных точек (Рис. 4). Оказалось, что в случае «легких» полирибосом включение меченых аминокислот в синтезируемый на рибосомах полипептид достигало плато в течение приблизительно 13 мин (данное время совпало с временем одного раунда трансляции - 12 мин), а в случае «тяжелых» полирибосом - в течение более, чем 30 мин инкубации с мечеными аминокислотами. Время достижения плато можно считать эквивалентным времени элонгации. Таким образом, можно сделать вывод, что трансляция мРНК в «тяжелых» полирибосомах происходит в 2-3 раза медленнее.

Рис. 4. Зависимость включения радиоактивных аминокислот в растущий полипептид на рибосомах в составе «легких» и «тяжелых» полирибосом (радиоактивность на 1 ОЕгею рибосом) от времени. Пары символов (круг и квадрат) соответствуют соседним фракциям «легких» (пустые символы) или «тяжелых» (заполненные символы) полирибосом.

Преформированные в течение 120 мин полирибосомы

инкубировали в системе трансляции с [ ыС]аминокислотами в течение 0, 4, 8, 16 и 24 мин. Количество связанной с полирибосомами метки анализировали после разделения полирпбосом в сахарозном градиенте 15-50%. Максимальное значение включения радиоактивных аминокислот на 1 ОЕ26П рибосом (плато) показано горизонтальной пунктирной линией. Время достижения этого значения в «легких» и «тяжелых» полирибосомах показано вертикальными линиями.

Мы предположили, что замедление трансляции в случае «тяжелых» полирибосом может происходить по причине избыточной заполненности мРНК рибосомами. Возможно, что при определенной степени загруженности полирибосом (когда на одну рибосому приходится менее 100 н.о. на рибосому) общая скорость продвижения рибосом вдоль цепи мРНК снижается из-за взаимных помех, . создаваемых рибосомными частицами при их несинхронизованном движении вперед (Spirin A.S., J. Biol. Chem., 2009, 284:2110321119).

В экспериментах, приведенных в этой части далее и описывающих функциональные свойства полирибосом как циркулярных структур, мы сосредоточились на анализе «легких» полирибосом как более активных и близких по степени загруженности к полирибосомам in vivo.

Время, мин

2.2. Обмен полисомных рибосом со свободными рибосомами и влияние избытка конкурентной мРНК на трансляцию полисомной мРНК

Одним из первых свидетельств, полученных в пользу гипотезы «циркулярной трансляции» в эукариотических полирибосомах, было обнаружение медленного обмена рибосом в составе полирибосом со свободными рибосомами. На основании этого было сделано предположение, что сайты терминации и инициации полисомной мРНК сближены, благодаря чему рибосомы после первого раунда трансляции вновь инициируют (ре-инициируют) на той же самой молекуле мРНК (Baglioni et al., Cold Spring Harbor Syinp. Quant. Biol., 1969, 34:555-565). Чтобы выяснить, обладают ли полирибосомы, образующиеся в бесклеточной системе трансляции на мРНК с 5'-НТО мРНК обелина и З'-НТО РНК ВТМ, свойствами, характерными для «циркулярной трансляции», мы измерили скорость обмена полисомных рибосом на данной мРНК со свободными [лН]рибосомами (эксперимент проведен совместно с Г.С. Копейной - Kopeina, Afonina et al., 2008).

В систему трансляции с полирибосомами, сформированными в течение 60 мин работы диализной системы трансляции (около 8 раундов трансляции) на мРНК 5'UTRobe-i-«c-3'UTRTMV, были добавлены радиоактивно-меченые рибосомы в количестве 8% рибосом трансляционной смеси. Аликвоты, отобранные через разное время после добавления [3Н]рибосом, анализировали седиментацией в сахарозном градиенте. Определяли оптическую плотность во фракциях градиента и количество радиоактивности, связанной с полирибосомами в каждой из них, и рассчитывали включение метки на единицу оптической плотности рибосом.

Рис. 5. Включение [3Н]рибосом в полирибосомы в процессе продолжающейся трансляции в бесклеточной системе. В систему трансляции с преформированными в течение 60 мин полирибосомами (на мРНК 5'UTRoi»-î-«c-3'UTRtmv. загруженность 150±50 н.о. на рибосому) добавляли [3Н]рибосомы, и через 0, 10, 20, 30, 40 и 60 мин после начала инкубации с [3Н]рибосомами отбирали аликвоты системы трансляции, которые анализировали методом седиментации в сахарозном градиенте 1545%. За 100% принимали отношение радиоактивности к оптической плотности фракций градиента в контрольном образце, в котором меченые рибосомы присутствовали в трансляционной смеси с самого начала. Указаны доверительные интервалы на основании 3 независимых экспериментов. Пунктирной линией обозначено время одного раунда трансляции.

Время, мин

В контрольном варианте ['Щрибосомы присутствовали в трансляционной смеси с самого начала работы диализной системы. Оказалось, что рибосомы полирибосом с загруженностью 150±50 н.о. на рибосому (9-15 рибосом в полирибосоме) обменивались со свободными рибосомами медленно: полный обмен достигался в течение 40 мин, или 5 раундов трансляции (Рис. 5).

Можно предположить, что в таких полностью сформированных полирибосомах большинство терминировавших полисомных рибосом ре-инициировали на той же самой мРНК, a de novo инициация свободными рибосомами вносила небольшой вклад по сравнению с ре-инициацией уже вовлеченных в трансляцию рибосом. В то же время, возможно и другое объяснение медленного обмена - терминировавшие полисомные рибосомы могут иметь более активное функциональное состояние, которое обеспечивает им преимущество перед свободными рибосомами. Мы проверили эту возможность, добавив в систему трансляции, содержащую полирибосомы, избыток конкурентной мРНК как «ловушку» для терминирующих полисомных рибосом. В качестве конкурента была выбрана мРНК с теми же НТО, что и полисом ная мРНК, но с другой кодирующей частью для различения продуктов трансляции (5'UTRobe-GFP- 3'UTRtmv).

После добавления конкурентной мРНК в систему трансляции после 60 мин ее работы, когда сформировались полирибосомы с загруженностью 150+50 н.о. на рибосому, скорость трансляции полисомной мРНК оставалась неизменной в течение 40 мин, или 4 раундов трансляции (Рис. 6, •). Это свидетельствует о том, что рибосомы в сформированных полирибосомах в основном продолжали транслировать свою мРНК, а не распределялись между конкурентной и полисомной мРНК. В то же время, добавление конкурентной мРНК через 20 мин после начала трансляции (Рис. 6, ■), когда пул транслирующих полирибосом

Рис. 6. Влияние конкурентной мРНК на трансляцию полисомной мРНК. В систему трансляции с 250 пмол/мл мРНК " 5'UTRobe-i."c-3'UTRTMV ( О )

дооавляли конкурентную 5'UTR0be-C?F/>-3UTRTMv

мРНК

в

1 0.5

х

0 40 80 120 160 Время, мин

концентрации 1250 пмол/мл через 20 мин ( ■ ) или 60 мин ( • ) после начала трансляции. В контрольном варианте обе мРНК в тех же концентрациях были добавлены в систему трансляции с самого начала инкубации (□ ). Стрелками указано время добавления конкурентной мРНК. Кинетические кривые трансляции построены на основе измерения активности люциферазы в аликвотах системы трансляции.

представлен в основном короткими полирибосомами (350+150 н.о. на рибосому), привело к снижению скорости трансляции до уровня контрольного варианта, в котором обе мРНК добавлены в систему трансляции с самого начала (Рис. 6,0).

Таким образом, суммируя все вышесказанное, можно заключить, что в коротких полирибосомах больший вклад в трансляцию вносит de novo инициация, тогда как в сформированных полирибосомах (150±50 н.о. на рибосому) происходит в основном ре-инициация терминировавших рибосом на полисомной мРНК. Иными словами, сформированные полирибосомы проявляют себя как функционально циркулярные.

2.3 Влияние ингибитора сканирования 5'-НТО на трансляцию полисомной

мРНК

В циркулярной полисомной мРНК со сближенными 5'- и З'-концами сайт терминации может находиться в непосредственной близости от инициаторного кодона, и терминирующие рибосомы могут ре-инициировать, минуя стадию сканирования 5'-НТО. В таком случае, трансляция в циркулярных полирибосомах может быть не зависима от фактора инициации eIF4A, обеспечивающего однонаправленное движение инициаторного 43S рибосомного комплекса за счет гидролиза АТФ до АДФ во время сканирования. Для проверки этого предположения мы изучили влияние негидролизуемого аналога АТФ - AMP-PNP - на трансляцию в бесклеточной системе на разных этапах формирования полирибосом. В систему трансляции с мРНК 5'UTRobe-GFP-3'UTR-rMv в разное время после начала инкубации был добавлен избыток AMP-PNP (до концентрации 2 мМ, в эквимолярном соотношении с Mg(OAc)2, при концентрации АТФ в системе 0,1 мМ). Влияние AMP-PNP оценивали по изменению скорости синтеза белка (GFP).

Внесение негидролизуемого аналога АТФ в начале инкубации вызывало практически полное ингибирование трансляции мРНК (de novo инициации) (Рис. 7, А). В случае добавления AMP-PNP через 10 мин трансляции, когда система содержит в основном короткие полирибосомы, трансляция продолжалась со скоростью, в несколько раз меньшей скорости контрольной системы (Рис. 7, ♦). Добавление AMP-PNP через 60 мин, однако, не вызывало никаких изменений в скорости трансляции (Рис. 7, ■). Устойчивость полирибосом, сформированных к 60 мин работы системы трансляции, вероятнее всего, указывает на то, что ре-инициация терминировавших рибосом в них осуществляется по механизму, не зависящему от активности фактора eIF4A. Возможно, что ре-инициация в коротких полирибосомах происходит по тому же механизму, но поскольку в таких полирибосомах велика доля de novo инициации, включающей сканирование 5'-НТО, трансляция в них оказывается чувствительной к ингибированию elF4A негидролизуемым аналогом АТФ.

О 20 40 60 80 100 120 Время, мин

Рис. 7. Влияние непиролизуемого аналога АТФ (АМР-Р№) на трансляцию в бесклеточной системе. К системе трансляции с мРНК 5'ита0ье-СРР-3'иТКтму добавляли АМР-РИР (до конечной концентрации 2 мМ, в эквимолярном соотношении с Ма(ОАс)2) до начала инкубации ( ▲ ), через 10 мин (♦) или 60мин (■) после начала инкубации. В контрольных вариантах АМР-Р№ не добавлялся (О) или через 60 мин инкубации вместо него был добавлен АТФ с М»(ОАс): (□). Исходная концентрация АТФ во всех вариантах была 0,1 мМ. Стрелками указано время добавления АМР-РЫР и АТФ. Кинетические кривые трансляции построены на основе измерения активности СИР в аликвотах.

Из полученных результатов можно сделать вывод, что функциональная циркулярность полирибосом находится в зависимости от стадии их формирования. На ранней стадии формирования, когда происходит заполнение мРНК рибосомами, de novo инициация вносит главный вклад в трансляцию, а доля ре-инициации терминировавших рибосом много меньше. В случае сформированных полирибосом pe-инициация является основным типом инициации. В нашей работе экспериментально обосновано предположение, что процесс pe-инициации не зависит от активности фактора eIF4A и осуществляется без стадии сканирования 5'-НТО. Интересно отметить, что ранее различная зависимость pe-инициации и de novo инициации была показана в отношении фактора elF4G (Novoa and Carrasco, Mol. Cell Biol, 1999, 19:2445-2454). Таким образом, ре-инициация терминировавших рибосом, по-видимому, имеет механизм, отличный от такового de novo инициации.

3.1 Локализация 5'- и З'-копцов цепи мРНК в полприбосомах

Полирибосомы, образующиеся в бесклеточной системе из зародышей пшеницы, в основном имеют двурядную морфологию (см. главу 1). Двурядные полирибосомы интерпретируются разными авторами либо как топологически циркулярные («схлопнутое» кольцо), либо как топологически линейные (с зигзагообразным или спиральным ходом цепи мРНК). Для того чтобы различить между циркулярной или линейной топологиями мРНК в двурядных

Часть 3. Структурный анализ полирибосом, формирующихся в бесклеточной системе

полирибосомах, мы использовали подход с ЭМ локализацией специфически маркированных 5'- и З'-концов полисомной мРНК. Для маркировки 5'-конца полисомной мРНК были использованы рибосомные 405 субъединицы, остановленные на стартовом кодоне в присутствии антибиотика эдеина. З'-конец мРНК, модифицированный флуоресцеин-5-тиосемикарбазидом (П^С), был маркирован в полирибосомах с помощью 10 нм частиц коллоидного золота, коньюгированных с антителами к флуоресцеин-изотиоцианату (НТС). При маркировке обоих концов мРНК расположение 5'- и З'-маркеров рядом, на одном торце полирибосомы, должно свидетельствовать о циркулярной организации мРНК в ней, а расположение их на разных торцах - о топологически линейной организации полисомной мРНК.

Формирование полирибосом происходило при трансляции в бесклеточной системе кэпированной полиаденилированной мРНК (сар-5'ЦТК.р.д|оьт-гсС-Р-Р-З'иТБЦо(А)зо), модифицированной по З'-концу П^С. Комплексы полирибосом с инициирующими 40Б субъединицами и коньюгатом антител с 10 нм частицами золота очищали, используя фракционирование на колонке 5ерЬасгу1 5-500 НЯ. и визуализировали методом классической ЭМ.

Рис. 8. Маркировка концов мРНК в полирибосомах, сформированных на модифицированной мРНК сар-5ОТ^д|Оып-ясС№-3'иТК40(А)30 (З'-РТБС) и инкубированных с эдеином. Показаны примеры ЭМ изображений полирибосом, содержащих инициаторную 408 субчастицу (А), полирибосом, ассоциированных с частицами 10 нм золота (конъюгированными с антителами к РГГС) (Б), а также полирибосом, одновременно содержащих оба маркера (инициаторную 40Б субчастицу на 5'-конце и частицу 10 нм золота на 3'-конце мРНК) либо на разных торцах полирибосомы (В), либо рядом на одном и том же торце полирибосомы (Г). Стрелками указаны инициаторные 40Б субчастицы (белая стрелка) и частицы 10 нм золота (черная стрелка).

В полирибосомах, содержащих только один из маркеров (либо 405 субъединица, либо 10 нм частица золота), маркер всегда располагался на торце полирибосомы (Рис. 8А, Б). В полирибосомах, в которых одновременно обнаруживались оба маркера (5-405 рибосомная субъединица и 3'-10нм частица золота), они располагались как на одном торце полирибосомы, так и, чаще, на разных торцах полирибосомы (Рис. 8В, Г). Таким образом, мы показали, что двурядные полирибосомы, сформированные на мРНК с кэпированной 5-НТО и 3'-концевой поли(А)-последовательностью, топологически могут быть различны, будучи либо с линейным, либо циркулярным ходом цепи мРНК. Этот вывод

впоследствии был подтвержден при использовании другого подхода к изучению структурной организации полирибосом - метода криоэлектронной томографии.

3.2 Анализ структуры полирибосом методом криоэлектронной томографии

Криоэлектронная томография применяется для получения информации о трехмерной структуре единичных объектов, таких, как клеточные органеллы или даже целые клетки. Мы использовали криоэлектронную томографию (далее -крио-ЭТ) для детального изучения трехмерной организации полирибосом в условиях, позволяющих сохранить их нативное состояние - в аморфном льду при сверхнизкой температуре.

3.2.1 Криоэлектронная томография и получение реконструированных моделей полирибосом

Для исследования использовали полирибосомы, сформированные в диализной системе трансляции на кэпированной полиаденилированной (5'UTRp. giobin-icGFP-3'UTR42(A)ioo) или кэп-независимой мРНК (5'UTRobe-GFP-3'UTRTMv)-Аликвоты трансляционной смеси, отобранные в разное время после начала инкубации, разбавляли в 5 раз буфером, близким по составу к буферу трансляционной смеси, и немедленно замораживали на ЭМ подложке при температуре жидкого азота. Съемку образца проводили в криоэлектронном микроскопе Polara F30 FEG (Philips) при поворотах образца с шагом в 3°, от -66° до +66°. 45 полученных двумерных изображений, содержащих информацию о различных проекциях полирибосом, выравнивали по реперным частицам золота и реконструировали (объединяли) в трехмерную карту плотности, или томограмму. Для извлечения информации об ориентации полисомных рибосом набор субтомограмм (фрагментов томограммы, содержащих одну рибосому), был статистически проанализирован методом максимального правдоподобия.

Рис. 9. Усредненная модель рибосомы, полученная при статистическом анализе полисомных рибосом. Указаны

характерные элементы структуры рибосомы. Ход мРНК в рибосоме показан линией со стрелками в направлении движения мРНК относительно рибосомы. Слева — перекрывающаяся проекция, справа — вид со стороны головок субъединиц. Головка 40S субъединицы представлена черным, тело 40S субъединицы - серым, 60S субъединица — белым цветом.

KJIKJR

Р1/Р2

В результате была получена усредненная модель рибосомы, а также параметры поворота и смещения для каждой из полисомных рибосом. Интерпретация томограммы проводилась путем вписывания усредненной модели в изначальную электронную плотность согласно найденным параметрам сдвига и поворота для каждой из полисомных рибосом. В итоге были получены реконструированные модели индивидуальных полирибосом.

Модель усредненной рибосомы обладает характерными чертами (Рис. 9), присущими структуре рибосомы, видимой при разрешении 30-40 А (головка, тело, клюв у 40S субъединицы; центральный выступ и Р1/Р2-выступ у 60S субъединицы). Важно отметить, что для получения усредненной модели была использована только информация, содержащаяся в самой томограмме, без привлечения какой-либо внешней модели. Соответствие усредненной модели известной структуре рибосомы при данном разрешении подтверждает корректность модели, а также найденных при усреднении значений поворота и смещения отдельных рибосом, и, следовательно, корректность реконструированных на основе этих параметров моделей полирибосом.

На основании информации о взаимном расположении и ориентации рибосом, содержащейся в моделях полирибосом, а также детальной информации о расположении мРНК в рибосоме, полученной благодаря известной структуре мРНК-рибосомного комплекса (Yusupova et al., Cell, 2001, 106:233-241), мы смогли определить вероятный ход цепи мРНК в каждой индивидуальной полирибосоме. Наибольшее предпочтение отдавалось такому ходу цепи мРНК, при котором она соединяла соседние рибосомы (с минимальным расстоянием между входом и выходом мРНК), и ее цепь не перекрещивалась. На Рис. 10 и 11 приведены реконструированные модели различных морфологических форм полирибосом и вероятный ход цепи мРНК в них. Стрелки указывают направление движения мРНК в каждой рибосоме (в сторону 5'-конца), пунктир соединяет места входа и выхода мРНК в ближайших рибосомах, с учетом указанных критериев.

Исследование полирибосом методом крио-ЭТ показало, что в условиях, позволяющих сохранить их нативную структурную организацию, полирибосомы представлены двурядной, кольцевой, полукольцевой, однорядной конфигурациями и плотноупакованными спиралями с 4 рибосомами на виток спирали, а также переходными формами с элементами спиральной организации. Анализ большого числа полирибосом на мРНК 5'иТКр.д]оЫп-лгО№-3'1ГГК42(А)1оо и 5'UTR0be-CFP-3'UTRTmv на различных стадиях формирования позволил нам предложить классификацию типов полирибосом, основанную на их трехмерной структурной организации. Такая классификация частично совпадает с морфологической, базирующейся на двумерных ЭМ изображениях полирибосом. Однако, оказалось, что полирибосомы, визуализируемые как двурядные на двумерных изображениях, в действительности представляют собой три типа полирибосом, отличающихся пространственной конфигурацией и топологией хода цепи мРНК в них. Мы также

обнаружили корреляцию между типом полирибосом и их загруженностью рибосомами.

3.2.2 Трехмерная структурная организация полирибосом

Анализ полирибосом, имеющих плоскую двурядную конфигурацию в реконструированных томограммах, обнаружил, что такие полирибосомы могут иметь как топологически циркулярную, так и топологически линейную организацию. В некоторой части двурядных полирибосом взаимная ориентация рибосом такова, что она соответствует противоположному ходу цепи мРНК в параллельных рядах рибосом (так, на Рис. 10А в ряду рибосом слева мРНК направлена вниз, а в ряду справа - вверх), что предполагает циркулярный ход и сближенность концов мРНК в таких полирибосомах. В двурядных полирибосомах другого типа, обнаруживаемых в том же препарате, рибосомы в обоих рядах ориентированы в одну сторону, что предполагает однонаправленный зигзагообразный ход цепи мРНК с 5'- и З'-концами, разнесенными по разным торцам полирибосомы (Рис. ] ОБ). Циркулярный ход цепи мРНК обнаруживался лишь в сравнительно небольшой доле (около 10%) двурядных полирибосом; такие полирибосомы всегда характеризовались низкой степенью загруженности (от 4 до 7 рибосом на одной цепи вРР-мРНК, что соответствует 190+50 н.о. на рибосому).

А о* 00* J £ * 0° s-r^i 4 L.J

180" v.? -Jh"-

-Ж 90» J щ 8 0" 5'■ J S3'

180°

В Ш- ч TbLjy - - 90' . я* 0" ■''5' \ r3' >

180s ■Ч

Рис. 10. Реконструированные модели полирибосом: А - двурядная полирибосома с циркулярным ходом цепи мРНК, Б - двурядная полирибосома с линейным (зигзагообразным) ходом цепи мРНК, В - кольцевая полирибосома. Головка 40S

субъединицы представлена черным, тело 40S субъединицы - серым, 60S субъединица — белым цветом. Поворот модели (90° или 180°) относительно исходного изображения (0°) показан круговой стрелкой (поворот вокруг вертикальной оси). На схемах показан вероятный ход мРНК. Ориентация цепи мРНК в каждой рибосоме представлена стрелкой (в направлении от входа мРНК в рибосому к выходу из нее), предполагаемая последовательность прохождения мРНК через рибосомы показана пунктиром. Полирибосомы сформированы при трансляции мРНК 5'UTRp.gi0bm--*cGFi>-3'UTR42(A)ioo в течение 15 мин (А и Б) или в течение 60 мин (В) в пшеничной диализной бесклеточной системе.

Большинство двурядных полирибосом имели зигзагообразную (топологически линейную) организацию и характеризовались как низкой, так и средней (75+15 н.о. на рибосому) степенью загруженности.

Полирибосомы кольцевой конфигурации были представлены как низко-, так и средне-загруженными полирибосомами (150+90 н.о. на рибосому). Циркулярная топология мРНК в таких полирибосомах хорошо подтверждалась строго организованным расположением рибосом в одной плоскости (Рис. 10В), особенно при низкой степени загруженности (190+50 н.о. на рибосому). При большей степени загруженности (150+90 н.о. на рибосому) некоторые рибосомы выступали из плоскости, образуя виток спирали (Рис. IIA). Подобный эффект наблюдался также в однорядных и двурядных полирибосомах средней степени загруженности

(80+20 н.о. на рибосому), как показано на Рис. 11Б.

Рис. 11. Реконструированные модели полирибосом: А — кольцевая полирибосома с участком спиральной организации (обозначен окружностью), Б - двурядная полирибосома с участком спиральной организации (обозначен окружностью). В — плотноупакованная полирибосома, имеющая конфигурацию левозакрученной спирали с 4 рибосомами на виток: боковой вид, поворот на 45°, торцевой вид со стороны З'-конца мРНК. Поворот модели (45°. 90° или 180°) показан круговыми стрелками. Другие обозначения - как на Рис. 10. Полирибосомы сформированы при трансляции мРНК 5'UTRobe-GFP-3'UTRtmv в течение 30 мин (А) или мРНК cap-5'UTRß.giobin-scGFP-

3'UTR42(a>ioo в течение 30 (Б) и 120 (В) мин в пшеничной диализной бесклеточной системе трансляции.

А С J4 " SO' # 0" г\ ft / ¡3- >

-ч 90е А

Плотноупакованные спирали с 4 рибосомами на виток - еще один обнаруженный тип топологически линейных полирибосом; ход цепи мРНК в них имеет характер левозакрученной спирали (Рис. 11В). К данному типу полирибосом относились все высоко-загруженные полирибосомы (на одну рибосому которых приходится меньше 60 и.о. мРНК). Следует отметить, что в проекции, показанной на Рис. 11В, такие спиральные полирибосомы имеют вид двойного ряда рибосом, и поэтому на двумерных изображениях (полученных как традиционной, так и крио-ЭМ), спиральные полирибосомы могут быть трудно отличимы от двурядных.

Упаковка рибосом в спиральных полирибосомах напоминает таковую в кристаллах: головки четырех 40S субъединиц направлены к центру и взаимодействуют таким образом, что выход мРНК из одной рибосомы и вход мРНК в другую рибосому находятся на расстоянии около 10 нм (в кристаллах 70S рибосом - 6 нм, Jenner et al., Nat. Struct. Mol. Biol., 2010, 17:1072-1078). Такая плотная упаковка рибосом обеспечивает максимально возможную загруженность полирибосом - всего 30 и.о. на рибосому.

Мы предполагаем, что образование спиральных полирибосом происходит при дальнейшем заполнении рибосомами средне-загруженных полирибосом с участками спиральной организации, которые, скорее всего, являются переходными формами между основными формами полирибосом (с загруженностью 160±75 н.о. на рибосому) и высоко-загруженной плотноупакованной спиральной формой (45+15 н.о. на рибосому). Такому переходу в случае топологически циркулярных кольцевых и двурядных полирибосом должно предшествовать «расцикливание» мРНК и преобразование полирибосомы в топологически линейную.

В недавних работах группы Баумайстера методом криоэлектронной томографии в клетках глиомы человека были идентифицированы полирибосомы, имеющие конфигурацию трехмерной спирали, тогда как полирибосомы с циркулярной организацией мРНК обнаружены не были (Brandt et al., Mol. Cell, 2010, 39:560-569). Полученные нами результаты впервые представляют структурные данные, полученные в «нативных» условиях, которые свидетельствуют о существовании эукариотических полирибосом с циркулярной топологией мРНК и о сближенности концов мРНК в такой полирибосоме. Таким образом, мы впервые прямо подтверждаем реальность модели циркуляризации полисомной мРНК. Интересно отметить, что такая модель подтверждается также и для полирибосом на кэп-независимой мРНК с синергическими НТО.

3.3 Динамика формирования полирибосом

Мы исследовали процесс формирования полирибосом на кэпированной полиаденилированной (5'UTRp.gi0b¡„-scGFP-3'UTR42(A)ioo) 11 па кэп-независимой мРНК с синергическими 5'- и З'-НТО (S'UTRobe-GFM'UTRTMv), проследив за соотношением рибосом в полирибосомах различных конфигураций в разное время работы диализной системы трансляции. Из реконструированных томограмм,

19

соответствующих временным точкам 15, 30, 60, 120 и 360 мин трансляции, было определено число рибосом во всех типах полирибосом - в топологически циркулярных (кольцевых, полукольцевых и двурядных) полирибосомах и отдельно в их переходных формах, в топологически линейных (двурядных и однорядных) полирибосомах и отдельно в их переходных формах, а также в плотноупакованных спиральных полирибосомах. Для каждой временной точки были рассчитаны доли рибосом в составе полирибосом основных и переходных форм (Рис. 12А и Б), и в составе полирибосом с различным типом топологии мРНК (Рис. 12В и Г).

Рис. 12. Доля полисомных рибосом в составе основных (розовый цвет), переходных (голубой цвет) и спиральной (синий цвет) форм полирибосом (А, Б), либо в составе топологически циркулярных (красный цвет), топологически линейных (зеленый цвет) и спиральных (синий цвет) полирибосом (В, Г), рассчитанная из реконструированных томограмм. А и В -формирование полирибосом на мРНК 5'иТКоье-С№-3'иТКтму, Б и Г - формирование полирибосом на мРНК 5'иТКр.д|0ып-^сС^Р-3'иТК42(д)1оо.

На Рис. 12 показана временная зависимость содержания рибосом в разных формах и типах полирибосом на двух мРНК. Через 15 мин (около 2 раундов) трансляции мРНК 5'иТР0ье-С^Р-3'иТКтму в системе обнаруживались полирибосомы малой степени загруженности (140+50 н.о. на рибосому), представленные как основными - кольцевыми, полукольцевыми, двурядными и однорядными, так и переходными формами с элементами спиральной организации. Спиральные полирибосомы практически не обнаруживались в течение первых раундов трансляции. Доля рибосом в основных формах полирибосом (без учета плотноупакованных спиральных полирибосом) изменилась незначительно в течение всего времени слежения, при этом степень их загруженности рибосомами также почти не изменялась, и на одну рибосому

приходилось 140+50 и.о. мРНК. Доля переходных форм, представленных полирибосомами с низкой и средней загруженностью (120+70 н.о. на рибосому), заметно снижалась к 120 мин (через 16 раундов трансляции). Напротив, доля плотноупакованных спиральных полирибосом увеличивалась в течение первых 120 мин трансляции: к этому времени в их составе находилось почти 50% всех полисомных рибосом, а загруженность достигала максимального значения (30 н.о. на рибосому). Следует подчеркнуть, что снижение доли переходных форм происходило одновременно с увеличением доли спиральных полирибосом, что подтверждает наше предположение об образовании спиральных полирибосом из переходных форм полирибосом.

Процесс формирования полирибосом на кэпированной мРНК 5'иТРр.д|0ыл-лсСГР-3'ита42(А)1оо (Рис. 12Б, Г) почти не отличался от такового на кэп-независимой мРНК (5'иТКоье-ОРР-3'иТЯтму). за исключением того, что доля рибосом в топологически циркулярных полирибосомах была заметно выше в первые 60 мин (около 8 раундов) трансляции. Возможно, это отражает более эффективную циклизацию мРНК за счет классического сар-е1Р4Е/40-РАВР-ро1у(А) механизма. Кроме того, к концу инкубации системы трансляции с кэпированной мРНК более 60% всех полисомных рибосом оказалось в составе плотноупакованных спиральных полирибосом. Необходимо отметить, что переход большей части полисомных рибосом в состав спиральных полирибосом коррелировал с падением активности этой системы, что свидетельствует о сниженной трансляционной активности плотноупакованных спиральных полирибосом. Это хорошо согласуется с результатами анализа скорости включения радиоактивной аминокислотной метки в полирибосомы различной загруженности, где «тяжелые» высоко-загруженные полирибосомы оказались заметно менее активны, чем «легкие» (см. раздел 2.1). Вероятнее всего, полирибосомы, которые визуализировались на седиментограммах в виде обособленной тяжелой зоны (см. часть 1, Рис. 1Б и 2Б), были представлены в основном спиральными полирибосомами, отделявшимися во время седиментации от «легких» полирибосом в результате структурного перехода в компактную конформацию. Таким образом, сочетание различных подходов к исследованию структуры полирибосом позволило нам составить общую картину формирования полирибосом, которая предлагается в Заключении.

Заключение

Модель динамики формирования эукариотических полирибосом

На основании полученных нами данных, с привлечением данных, имеющихся в литературе, мы предложили следующий сценарий поэтапного формирования эукариотических полирибосом и их последовательных конформационных превращений.

Первые рибосомы инициируют на мРНК по классическому механизму, включающему стадию сканирования 5'-НТО мРНК (de novo инициация). Сопряженно с первыми событиями инициации происходит сближение сайтов инициации и терминации мРНК (циркуляризация мРНК) за счет взаимодействия факторов инициации (eIF4G) с белками, ассоциированными с З'-НТО (РАВР). Рибосомы, заканчивающие свой первый раунд трансляции и терминирующие на границе с З'-НТО, осуществляют переход с сайта терминации непосредственно на инициирующий кодон той же самой мРНК и начинают новый раунд трансляции, минуя стадию сканирования 5'-НТО (ре-инициация).

Полисомная мРНК продолжает заполняться рибосомами за счет de novo инициации, и при этом все больше рибосом вовлекается в трансляцию путем ре-инициации трансляции терминировавших рибосом на той же самой мРНК. Слияние этих двух потоков инициации приводит к ускорению синтеза белка на циркулярной полирибосоме. В сформированной циркулярной полирибосоме (с загруженностью 150+50 н.о. на рибосому) доля de novo инициации обычно меньше доли ре-инициации трансляции. На данном этапе полирибосома является наиболее эффективной в синтезе белка.

При заполнении мРНК большим числом рибосом (при загруженности 90 и менее н.о. на рибосому), вследствие присущего рибосомам стохастического характера поступательного движении вдоль цепи мРНК, они начинают мешать друг другу, и общая скорость трансляции (элонгации) начинает падать. Во избежание дальнейшей перегрузки мРНК рибосомами срабатывает механизм отключения ре-инициации путем «расцикливания» полирибосомы, т.е. перевода ее в линейную форму. В образующейся линейной полирибосоме с достаточно большой загруженностью рибосомами обнаруживается тенденция к взаимодействию рибосом друг с другом с укладкой их в зигзаг. Топологически линейные зигзагообразные полирибосомы могут работать в стационарном режиме с умеренной скоростью, пользуясь механизмом de novo инициации и нормальной терминации.

Вследствие образования локальных сгущений движущихся по цепи мРНК рибосом, закономерных при перегрузке полирибосомы, а также возможных нарушений процесса терминации, может происходить дальнейшее, не компенсированное терминацией заполнение мРНК транслирующими рибосомами. В таком состоянии в полирибосоме начинают возникать флуктуирующие участки более плотной, трехмерной спиральной организации. При достижении

22

загруженности 60 и менее н.о. на рибосому уже большая часть полирибосомы или вся полирибосома представляет собой плотно упакованную спираль с 4 рибосомами на виток. Плотная упаковка рибосом в трехмерной спирали полирибосомы является причиной ее низкой трансляционной активности. Когда достигается максимально возможная плотность упаковки рибосом на полинуклеотидной цепи - около 30 н.о. на рибосому - в сформированной спиральной полирибосоме с 4 рибосомами на виток должна происходить полная остановка движения рибосом вдоль цепи мРНК и, таким образом, прекращаться процесс синтеза белка.

Выводы

1. Методами ультрацентрифугирования, классической электронной и криоэлектронной микроскопии показано, что формирование эукариотических полирибосом в пшеничной бесклеточной системе трансляции длительного действия происходит в течение многих раундов трансляции, т.е. многократного прочтения цепи мРНК рибосомами.

2. Показано сосуществование в трансляционной смеси различных морфологических типов полирибосом, таких как кольцо, разомкнутое кольцо, одинарный ряд, двойной ряд и трехмерная спираль.

3. Показано, что на кэп-независимой мРНК с синергическими НТО формируются циркулярные полирибосомы, структурно и функционально аналогичные полирибосомам на кэпированной и полиаденилированной мРНК.

4. Электронно-микроскопическая визуализация маркеров на 5'- и З'-концах полисомной мРНК (инициирующих 40Б рибосомных субъединиц и частиц коллоидного золота, соответственно) показала, что двурядные полирибосомы могут иметь как топологически циркулярный (маркеры на одном торце полирибосомы), так и топологически линейный ход цепи мРНК (маркеры на разных торцах).

5. Методом криоэлектронной томографии показано, что двурядные полирибосомы имеют циркулярную топологию («схлопнутое» кольцо) при низкой загруженности мРНК рибосомами, тогда как при средней загруженности преобладает линейная топология мРНК (зигзаг, или винтовая спираль с двумя рибосомами на виток). Высоко-загруженные полирибосомы (менее 60 н.о. на рибосому) имеют преимущественно левозакрученную трехмерную спиральную конфигурацию с 4-мя рибосомами на виток, линейной топологией мРНК и плотными межрибосомными контактами.

6. Обнаружено, что трансляционная активность рибосом в полирибосомах зависит от степени загруженности мРНК рибосомами. Наибольшую трансляционную активность проявляют рибосомы в полирибосомах с

23

низкой загруженностью, когда на рибосому приходится более 100 нуклеотидных остатков мРНК. Дальнейшее заполнение мРНК рибосомами приводит к снижению активности рибосом в полирибосомах. Снижение активности системы трансляции коррелирует с накоплением в ней высоко-загруженных трехмерных спиральных полирибосом.

7. На основании полученных нами данных, с привлечением данных, имеющихся в литературе, предложен сценарий поэтапного формирования эукариотических полирибосом и их последовательных конформационных превращений: «цикл —► зигзаг —> плотная спираль».

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

В рецензируемых журналах:

1. Afonina Zh.A., Myasnikov A.G., Khabibullina N.F., Belorusova A.Yu., Mcnctrct J.-F., Vasiliev V.D., Klaholz B.P., Shirokov V.A., Spirin A.S. Topology of mRNA chain in isolated eukaryotic double-row polyribosomes // Biochemistry (Moscow). 2013. V. 78. No 5. doi: 10.1134/S0006297913050027 (http://www.protein.bio.msu.ru/ biokhimiya/inpress/abs/BM12-325.html).

2. Myasnikov A.G., Afonina Zh.A., Klaholz B.P. Single particle and molecular assembly analysis of polyribosomes by single- and double-tilt cryo electron tomography // Ultramicroscopy. 2012. V. 126. P. 33-39.

3. Kopeina G.S., Afonina Zh.A., Gromova K.V., Shirokov V.A., Vasiliev V.D., Spirin A.S. Step-wise formation of eukaryotic double-row polyribosomes and circular translation of polysomal mRNA // Nucl. Acids Res. 2008. V. 36. P. 2476-2488.

В сборниках тезисов докладов конференций:

4. Myasnikov A.G., Afonina Zh.A., Menetret J.-F., Shirokov V.A., Spirin A.S., Klaholz B.P. High-order structure of eukaryotic polyribosomes form a left-handed supra-molecular helix // Conferences Jacques-Monod, Roscoff (Brittany), France, Abstract book, 2012. P. 107.

5. Afonina Zh.A., Belorusova A.Yu., Myasnikov A.G., Shirokov V.A., Klaholz B.P., Spirin A.S. Translation reinitiation efficiency of purified eukaryotic polyribosomes // EMBO Conference «Protein Synthesis and Translational Control», EMBL, Heidelberg, Germany, Abstract book, 2011. P. 110.

6. Myasnikov A.G., Afonina Z.A., Simonetti A., Marzi S., Klaholz B.P. Investigation of the protein synthesis machinery at different levels of organization through integrative cryo-EM // 26th European Crystallography Meeting, Darmstadt, Germany, Acta Cryst., 2010. V. A66. P. s21.

7. Широков B.A., Афонина Ж.А., Васильев В.Д., Спирин А.С., Мясников А.Г., Менетре Ж.-Ф., Клахольц Б.П. Трехмерная архитектура эукариотических полисом // Ежегодная научная конференция Института белка РАН, Институт белка РАН, Пущино, Московская область, Россия, Сборник тезисов, 2010. С. 5.

8. Myasnikov A.G., Afonina Zh.A., Menetret J.-F., Shirokov V.A., Spirin A.S., Klaholz B.P. The three-dimensional architecture of eukaryotic polyribosomes // Ribosome Conference, Orvieto, Italy, Abstract book, 2010. P. 186.

9. Afonina Zh.A., Myasnikov A.G., Menetret J.-F., Shirokov V.A., Spirin A.S., Klaholz B.P. Structure and function of eukaryotic polyribosome assemblies // Conference GTbio, Paris, France, Abstract book, 2009. P. 73.

10. Afonina Zh.A., Kopeina G.S., Shirokov V.A., Spirin A.S. 5' and 3'UTRs are not essential for circularization of eukaryotic polyribosomes // 13lh Annual Meeting of the RNA Society, Berlin, Germany, Program and abstracts book, 2008. P. 611.

П.Василенко КС., Широков B.A., Алехина O.M., Копеина Г.С., Афонина Ж.А., Громова К.В., Васильев В.Д., Спирин А.С. Инициация, формирование полирибосом и циркулярная трансляция в эукариотической бесклеточной белоксинтезирующей системе // IV съезд Российского общества биохимиков и молекулярных биологов, Новосибирск, Россия, Сборник тезисов, 2008. С. 157.

12.Shirokov V.A., Kopeina G.S., Gromova K.V., Afonina Zh.A., Vasiliev V.D., Spirin A.S. Step-wise formation of polyribosomes and circular translation of polysomal mRNA in a long-term eukaryotic cell-free system // International Conference on Protein Biosynthesis, Structure and Function, Institute of Protein Research RAS, Pushchino, Moscow Region, Russia, Program and Abstracts, 2007. P.ll.

13.Kopeina G.S., Shirokov V.A., Afonina Zh.A., Vassilenko K.S., Vasiliev V.D., Spirin A.S. // Heavy and super-heavy polysomes in a eukaryotic cell-free translation system // The 8th International Engelhardt Conference on Molecular Biology «RNA-Protein Interactions», Sergiyev Posad, Moscow Region, Russia, Program and abstracts book, 2006. P. 66.

Подписано в печать 24.02.2013г.

Усл.пл. - 1.5 Заказ №12567 Тираж: 90экз.

Копицентр «ЧЕРТЕЖ.ру» ИНН 7701723201 107023, Москва, ул.Б.Семеновская 11, стр.12 (495) 542-7389 www.chertez.ru

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Афонина, Жанна Аркадьевна, Пущино

Федеральное государственное бюджетное учреждение науки

ИНСТИТУТ БЕЛКА РОССИЙСКОЙ АКАДЕМИИ НАУК

На правах рукописи

04201354911

АФОНИНА ЖАННА АРКАДЬЕВНА

Динамика формирования и структурная организация эукариотических полирибосом

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Специальность 03.01.03 - молекулярная биология

Научные руководители: академик, д.б.н. A.C. Спирин к.б.н. В.А. Широков

Пущино — 2013

СОДЕРЖАНИЕ

ВВЕДЕНИЕ 7

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ 9

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 10

Глава 1. История открытия полирибосом 10

Глава 2. Распределение рибосом на мРНК в полирибосомах и загруженность

мРНК рибосомами 12

Глава 3. Полирибосомы in vivo и in vitro и другие формы организации рибосом.

Электронно-микроскопические исследования 14

3.1 Полирибосомы прокариот 14

3.2 Эукариотические полирибосомы 16

3.2.1 Мембранно-связанные полирибосомы 16

3.2.2 Свободные цитоплазматические полирибосомы 18

3.3 Полирибосомные структуры со спиральной организацией 20

3.4 Микрокристаллы рибосом в клетках 22

Глава 4. Гипотеза «циркулярной трансляции» в полирибосомах 24

4.1 Первые свидетельства в пользу гипотезы «циркулярной трансляции» 24

4.2 Роль фактора инициации eIF4F и поли(А)-связывающего белка в циркуляризации кэпированной полиаденилированной мРНК 26

4.3 Белки, предположительно участвующие в циркуляризации мРНК с неканоническими нетранслируемыми областями 28

4.4 Заключение 31

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 32

МАТЕРИАЛЫ 32

1.1 Реагенты 32

1.2 Оборудование 34

1.3 Плазмиды 35

МЕТОДЫ 39

1.1 Трансформация клеток Е. Coli 39

1.2 Выделение и очистка плазмидной ДНК 39

1.3 Обработка плазмид эндонуклеазами рестрикции 40

1.4 Электрофорез ДНК в агарозном геле 41

1.5 Обработка плазмиды pTZpG-SBP-CBP-GFP-AUTR, линеаризованной по сайту рестрикции Pvul, фрагментом Кленова 41

1.6 Котранскрипционное кэпирование (транскрипция in vitro) 42

1.7 Транскрипция in vitro 42

1.8 Полиаденилирование мРНК с помощью поли(А)-полимеразы 43

1.9 Химическая модификация З'-конца мРНК cap-5'UTRp-giobin-scGFP-3'UTR40(A)30 флуоресцеин-5-тиосемикарбазидом (FTSC) 44

1.10 Обработка мРНК РНКазой Н 44

1.11 Электрофорез РНК 45

1.12 Трансляция в бесклеточной системе на основе экстракта из зародышей пшеницы 45

1.13 Определение концентрации GFP 47

1.14 Измерение активности люциферазы 48

1.15 ТХУ-анализ проб трансляции, содержащих [14С]пептиды 48

1.16 Выделение 40S рибосомных субчастиц из пшеничного экстракта 48

1.17 Анализ полирибосом методом скоростного зонального ультрацентрифугирования в градиенте плотности сахарозы 49

1.18 ТХУ-анализ фракций сахарозного градиента, содержащих меченные изотопом углерода [14С]пептиды 50

1.19 Определение радиоактивности во фракциях сахарозного градиента по Черенкову 50

1.20 Выделение полисомной [32Р]мРНК из фракций сахарозного градиента 50

1.21 Выделение полирибосом методом гель-хроматографии на основе 8ер11асгу1 Б500 НЯ для анализа полирибосом методом электронной микроскопии 51

1.22 Электронно-микроскопический анализ фракций гель-хроматографии методом негативного контрастирования 51

1.23 Электронно-микроскопический анализ системы трансляции методом негативного контрастирования 51

1.24 Анализ полирибосом методом криоэлектронной томографии 52

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЯ 54

ЧАСТЬ 1. ФОРМИРОВАНИЕ ПОЛИРИБОСОМ В БЕСКЛЕТОЧНОЙ СИСТЕМЕ 54

Глава 1.1. Динамика формирования полирибосом на кэпированных мРНК 55

Глава 1.2. Динамика формирования полирибосом на некэпированных мРНК 58

Обсуждение результатов части 1 63

ЧАСТЬ 2. ФУНКЦИОНАЛЬНЫЕ СВОЙСТВА ПОЛИРИБОСОМ 66

Глава 2.1. Трансляционная активность «легкой» и «тяжелой» фракций полирибосом

66

Обсуждение результатов главы 2.1 69

Глава 2.2. Обмен полисомных рибосом со свободными рибосомами 70

Глава 2.3. Влияние избытка конкурентной мРНК на трансляцию полисомной мРНК

72

Глава 2.4. Влияние ингибитора сканирования 5'-НТО на трансляцию полисомной мРНК

Обсуждение результатов глав 2.2,2.3 и 2.4 75

ЧАСТЬ 3. СТРУКТУРНЫЙ АНАЛИЗ ПОЛИРИБОСОМ, ФОРМИРУЮЩИХСЯ

В БЕСКЛЕТОЧНОЙ СИСТЕМЕ ИЗ ЗАРОДЫШЕЙ ПШЕНИЦЫ 78

Глава 3.1. Локализация 5'- и З'-концов цепи мРНК в полирибосомах 78

3.1.1. Визуализация 5'-конца полирибосомной мРНК с помощью инициирующей

40Б субчастицы 79

3.1.2. Модификация З'-концамРНК сар-5'иТКр.?10ьт-А'с6,^Р-3'иТК4о(А)зо флуоресцеин-5-тиосемикарбазидом 80

3.1.3. Визуализация З'-конца полирибосомной мРНК при помощи 10 нм частиц коллоидного золота с антителами к Б1ТС 81

3.1.4 Выделение полирибосом методом гель-хроматографии 83 3.1.5. Локализация 5'- и З'-концов мРНК в полирибосомах, сформированных

на мРНК сар-5,иТКр.ё1оЫп-«сС/,Р-3'иТК40(А)30, меченной б-РТБС 84

Глава 3.2. Анализ динамики формирования полирибосом методом криоэлектронной

томографии 86

3.2.1. Получение препаратов полирибосом для исследования методом криоэлектронной микроскопии 87

3.2.2. Визуализация полирибосом методом криоэлектронной микроскопии 88

3.2.3. Трехмерная структурная организация полирибосом 89

3.2.4. Динамика формирования полирибосом 100 Обсуждение глав 3.1 и 3.2 106

Глава 3.3. Проверка сохранности З'-конца полисомной мРНК 111

Обсуждение результатов главы 3.3 119

ЗАКЛЮЧЕНИЕ 121

ВЫВОДЫ 124

БЛАГОДАРНОСТИ

126

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ ПРИЛОЖЕНИЯ

ВВЕДЕНИЕ

Полирибосома представляет собой группу рибосом, нанизанных на нить молекулы мРНК и последовательно транслирующих ее в одном направлении, от 5-конца к З'-концу полирибонуклеотидной цепи. Полирибосомы являются основной формой существования транслирующих рибосом, универсальной как для прокариотических, так и эукариотических клеток.

В первых же электронно-микроскопических исследованиях полирибосом млекопитающих было замечено, что основными формами полирибосом являются кольца, плоские спирали, а также двойные ряды, затем интерпретированные в основном как «схлопнутые» кольцевые структуры. С другой стороны, функциональные исследования показали, что рибосомы полирибосом медленно обмениваются со свободными рибосомами и рибосомными субчастицами, и каждый новый раунд трансляции/инициации в полирибосомном пуле обеспечивается в основном за счет только что терминировавших рибосом. На основании этого была выдвинута гипотеза «циркулярной трансляции», согласно которой полирибосомы эукариот могут приобретать замкнутую кольцевую конфигурацию, благодаря чему рибосомы после терминации трансляции ре-инициируют на той же самой молекуле мРНК. Позднее был открыт возможный механизм циркуляризации мРНК в полирибосомах - взаимодействие кэп-связывающего белкового комплекса eIF4E-eIF4G (5'-конец мРНК) и поли(А)-связывающего белка (далее - РАВР) (З'-конец мРНК).

В настоящее время образование циркулярной структуры мРНК считается одним из ключевых этапов трансляции у эукариот, функциональным значением которого, возможно, является отбор лишь правильно процессированных молекул мРНК и обеспечение высокой интенсивности их трансляции. В то же время, до сих пор не было получено прямых доказательств существования взаимодействия 5'- и З'-концов мРНК в составе полирибосом. Не было предпринято попытки охарактеризовать одновременно и структурную организацию, и функциональные свойства полирибосом с точки зрения гипотезы «циркулярной трансляции».

Основной целью данной работы было выяснение динамики формирования структуры и сопутствующих изменений функциональных свойств эукариотических полирибосом. Изучение полирибосом, сформированных in vivo, затруднено: как в процессе разрушения клетки, так и в ходе выделения полирибосом, может происходить изменение их морфологии. В то же время, было показано, что в эукариотических

бесклеточных системах трансляции образуются полирибосомы, сходные по форме с таковыми in vivo.

Мы использовали разработанный в нашей лаборатории, длительно-работающий вариант бесклеточной системы трансляции на основе экстракта зародышей пшеницы для изучения формирования полирибосом на мРНК с различными нетранслируемыми областями (далее - НТО). Первой нашей задачей было сравнить динамику формирования полирибосом на кэпированных и некэпированных мРНК с природными и случайными НТО. Для решения данной задачи мы использовали метод седиментации в сахарозном градиенте в сочетании с методом классической электронной микроскопии (далее - ЭМ). В рамках выполнения второй задачи мы исследовали функциональные свойства полирибосом с точки зрения гипотезы «циркулярной трансляции», а именно, обмен полисомных рибосом со свободными рибосомами, а также влияние конкурентной мРНК на трансляцию полисомной мРНК. Третьей задачей было изучение структурной организации полирибосом в процессе их формирования и функционирования, для чего были использованы методы классической и криоэлектронной микроскопии. Работа по определению структуры полирибосом проводилась совместно с Отделом интегральной структурной биологии Института генетики и молекулярной и клеточной биологии (Страсбург, Франция).

Таким образом, в данной работе одновременно охарактеризованы функциональные свойства и структурная организация эукариотических полирибосом; на основании полученных нами данных предложен сценарий процесса формирования свободных цитоплазматических полирибосом.

Список сокращений

БСА бычий сывороточный альбумин

ВТМ (TMV) вирус табачной мозаики SDS додецилсульфат натрия

ДТТ дитиотреит

крио-ЭТ криоэлектронная томография н.о. нуклеотидные остатки мРНК

НТО (UTR) нетранслируемая область мРНК ПААГ полиакриламидный гель

ЭМ электронная микроскопия

ЭР эндоплазматический ретикулум

CECF continuous exchange cell-free system,

бесклеточная система трансляции длительного действия СРМ counts per minute,

число распадов в минуту CPS counts per second,

число фотонов в секунду elF эукариотический фактор инициации

FITC fluorescein isothiocyanate,

флуоресцеин изотиоцианат FTSC fluorescein-5-thiosemicarbazide,

флуоресцеин-5-тиосемикарбазид РАВР poly(A)-binding protein,

поли(А)-связывающий белок

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Глава 1. История открытия полирибосом

Синтез белка в клетках происходит в полирибосомах, которые представляют собой комплекс нескольких (или большого числа) рибосом, последовательно транслирующих одну молекулу мРНК; при этом рибосомы находятся на разном расстоянии от 5'-конца мРНК, и соответственно, на разных стадиях синтеза полипептида. Впервые рибосомы были визуализированы Дж. Паладе в 1955 году методом ЭМ на срезах животных тканей; они были описаны как гранулы (частицы), тесно связанные с эндоплазматическим ретикулумом. В этой же работе было отмечено, что регулярно расположенные скопления рибосом чаще всего имеют форму двойных рядов, петель, плоских спиралей, колец и розеток [1].

Открытие полирибосом как трансляционно активных комплексов рибосом произошло в начале 60-х гг, когда уже были известны некоторые свойства рибосомы и ее базовые функции. В то время бесклеточная система трансляции являлась основным инструментом в изучении биосинтеза белка. Первые данные о существовании трансляционно активных комплексов рибосомной природы с большим коэффициентом седиментации были получены при использовании системы трансляции на основе лизата Е. coli, экстракта клеток печени крысы, ретикулоцитного лизата. Седиментационный анализ в градиенте концентрации сахарозы и электронная микроскопия были методами анализа рибосомных комплексов, формирующихся в процессе трансляции в бесклеточной системе.

В конце 50-х гг было показано, что рибонуклеопротеидные частицы, выделенные из Е. coli имеют коэффициенты седиментации 100S, 70S, 50S и 30S, и их соотношение зависело от концентрации ионов магния. 70Б-частица образовывалась из 50S и 30S частиц в соотношении 1:1, а lOOS-частица - из двух 70S частиц [2]. В 1960 эти данные были подтверждены с помощью метода ЭМ: визуализация рибонуклеопротеидных частиц из Е. coli (с помощью негативного и позитивного контрастирования) показала, что 100S-частица является димером 70S рибосомы, а 708-частица состоит из двух субчастиц, схожих по морфологии с 50S и 30S субчастицами [3].

Эксперименты с использованием меченых аминокислот показали, что значительная часть полипептида, синтезируемого в системе трансляции на основе лизата Е. coli, связана с рибосомным комплексом с коэффициентом седиментации 100S [4, 5]. «Полидесперсные рибосомные агрегаты» с коэффициентом седиментации 100-130S образовывались при добавлении в систему трансляции на основе лизата Е. coli поли(У)-РНК; радиоактивно-

меченый фенилаланин включался в полипептид только в составе этих комплексов [5]. Уотсон с сотр. показали, что добавление мРНК фага Т2 в систему трансляции на основе Е. coli также приводит к образованию «тяжелых» трансляционно активных рибосомных комплексов с коэффициентом седиментации больше 100S [6].

Рич с сотр. исследовали «мультирибосомные структуры», формирующиеся в бесклеточной системе на основе ретикулоцитного лизата [7, 8]. Широкий пик в градиенте сахарозы 15-30% (поглощающий при 260 нм), имевший в среднем коэффициент седиментации 170S, после нескольких процедур, осаждения и последующего центрифугирования в градиенте сахарозы 5-20% разделялся на отдельные пики с коэффициентами седиментации 108, 134, 154, 170 ед. Сведберга; присутствовали также более тяжелые комплексы. В 170S-комплексах обнаруживалось 85% синтезируемого гемоглобина. При добавлении РНКазы данные комплексы превращались в одиночные 76S частицы, а добавление ДНКаз не оказывало влияния на их стабильность. На основе полученных данных был сделан вывод, что трансляция осуществляется в рибосомных комплексах с большим коэффициентом седиментации, которые представляют собой рибосомы, соединенные цепью мРНК. Анализ ретикулоцитной бесклеточной системы трансляции методом ЭМ показал, что большая часть рибосом находится в виде «плотных скоплений», чаще всего состоявших из 5 рибосом. Такие кластеры рибосом были названы Ричем с сотр. полирибосомами [7, 8].

Сходные выводы были получены Гирером [9] и Ноллем с сотр. [10]. Гирер также показал наличие рибосомных комплексов с большим коэффициентом седиментации, активно включающих аминокислотную метку, в бесклеточной системе трансляции из ретикулоцитов [9]. Нолль с сотр. изучали рибосомные комплексы системы трансляции на основе экстракта печени крысы. В предложенной ими модели полирибосома, которая была названа ими эргосомой, представляла собой сферическую частицу с коэффициентом седиментации 200S, состоявшую из пяти 73 S рибосомных частиц с малыми субъединицами 73 S рибосом, обращенными к ее центру; рибосомы связывала мРНК, которая локализовалась в желобке между малой и большой субъединицами каждой из рибосом [10].

Исследования как прокариотических, так и эукариотических полирибосом показали, что их размер меняется в зависимости от длины мРНК. Так, Дарнелл с сотр. изучали формирование полирибосом в HeLa клетках при инфицировании полиовирусом. Было показано, что в нормальном состоянии в HeLa клетках полирибосомы имеют коэффициент седиментации около 200S. В первые часы инфицирования клеток полиовирусом происходила диссоциация полирибосом с коэффициентом седиментации

200S, а после 3 часов формировались рибосомные комплексы со средним коэффициентом седиментации 380-400S [11]. ЭМ анализ показал, что максимальное число рибосом в полирибосоме изменялось при этом от 40 до 60 [12]. Авторы провели корреляцию между размером полирибосом и размером мРНК, на которой они формируются: мРНК полиовируса имела коэффициент седиментации 35S, в то время как клеточные мРНК характеризовались коэффициентом седиментации в пределах 6-25S; авторы заключили, что на длинных мРНК образуются полирибосомы большего размера [11]. В другой работе было показано, что индукция клеток Е. coli метил-Р-тиогалактопиранозидом, разрешающая синтез ß-галактозидазы, сопряжена с формированием длинных полирибосом с числом рибосом до 30-50 [13, 14]. Ферментативная активность ß-галактозидазы была детектирована только во фракциях полирибосом большого размера, из чего авторы заключили, что длинные полирибосомы формируются на мРНК ß-галактозидазы, синтезируемой в результате индукции. Зная предельное число рибосом в формирующихся полирибосомах и среднее число нуклеотидных остатков (далее - н.о.) мРНК, приходящихся на одну рибосому в цитоплазматических полирибосомах (90 н.о., ретикулоцитная система трансляции, [7]), авторы определили размер и молекулярную массу мРНК ß-галактозидазы, которые составили приблизительно 3600 н.о. и 1,2 млн Да, соответственно [13]. Эти значения были близки к значениям, полученным для данной мРНК при хроматографическом разделении тотальной РНК Е. coli после индукции (1,1 млн Да, [15]). Данный результат был еще одним подтверждением прямой зависимости размера полирибосом от длины мРНК.

Глава 2. Распределение рибосом на мРНК в полирибосомах и загруженность мРНК рибосомами

Одними из первых, кто попытался определить, насколько плотно и равномерно рибосомы расположены на мРНК во время трансляции, были Уолин и Вальтер [16]. Добавляя микрококковую нуклеазу к преформированным в бесклеточной системе трансляции полирибосомам (на осно