Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Ковалентные модификации факторов элонгации

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Ковалентные модификации факторов элонгации"

МОСКОВСКИЙ ОРДЕНА ЛЕНИНА, ОРДЕНА ОКТЯБРЬСКОЙ РЕВОЛЮЦИИ, ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ игл. М.В.ЛОМОНОСОВА

БИОЛОГИЧЕСКИЙ ФАКУЛЬТЕТ

На правах рукописи

СИТИКОВ Альберт Самигуллович

УДК 547.963.3

КОВА1ЕНТНЫЕ МОДИФИКАЦИИ ФАКТОРОВ ЭЛОНГАЦИИ

03.00.03 - Молекулярная биология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва - 1988

Работа выполнена в Институте белка АН СССР.

Научный руководитель: доктор биологических наук, член-корреспондент АН СССР Л.П.Овчинников.

Официальные оппоненты: доктор химических наук, профессор Б.И.Курганов, кандидат биологических наук А.С.Степанов.

Ведущая организация: Институт молекулярной биологии АН СССР.

Автореферат разослан " 3 " ..[¡А^/Ок^ 1988 года.

Защита состоится » 4 " Олька А я 1988 года в -часов на заседании Специализировадного совета Д.053.05.70 при Московском государственном университете им. М.В.Ломоносова.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке биологического факультета МГУ.

Ученый секретарь Совета кандидат химических наук

В.Н.Каграманов

I • | ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

| Актуальность проблемы. Характерным отличием эукариотичес-ких 'клеток от ярокариотических является более высокая степень структурной организации и компартментализации внутриклеточных процессов. Внутриклеточное пространство эукариотической клетки структурно и функционально разделено на специфические компарт-менты, как правило ограниченные мембранами (ядро, митохондрии, хлоропласта, эндоплазматический ретикулум и др.). Характерно для эукариотических меток и наличие ядерного и цитоплазмати-ческого скелета.

Структурная организация аппарата трансляции эукариот также имеет ряд особенностей в сравнении с прокариотами. В эукариотических клетках мРНК и ее предшественники существуют в виде ри-бонуклеопротеидных частиц - информосом (Спирин и др., 1964). Полирибосомы эукариот содержат большое количество лабильно ассоциированных с ними нерибосомных белков. Среди этих белков были обнаружены белки, участвующие в процессе трансляции (факторы инициации, элонгации и аминоацил-тРНК-синтетазы). Ассоциация этих белков с полирибосомами осуществляется за счет их неспецифического сродства к РЖ полирибосом. Шло предположено, что лабильная ассоциация белков аппарата трансляции с полирибосомами нужна для их компартментализации, то есть локального концентрирования вблизи мест в большом объеме эукариотической клетки. Компартментализация всех компонентов аппарата трансляции должна приводить к существенному повышению эффективности трансляции (Зр1г1п, 1978).

• Был предложен способ регуляции трансляции за счет изменения степени компартментализации белков аппарата трансляции, то есть за счет изменения неспецифического сродства этих белков к полирибосомам. Известно, что ковалентные модификации белков могут играть регуляторную роль в клеточных процессах, а также влиять на сродство РКК-связывающих белков к РНК. В частности, было показано, что ам>-рибозилирование фактора элонгации ер-2 под действием дифтерийного токсина приводит к утрате фактором сродства к РНК и, как следствие, к декомпартментализации из полирибосом, что может быть причиной инактивации белкового синтеза в этом случае.

Цель и задачи исследования. Целью работы явилось исследование физиологических ковалентных модификаций белков полирибосом-ного комплекса и изучение влияния таких модификаций на ассоциацию этих белков с полирибосомами.

В связи с этим перед нами стояли следующие задачи:

1) отработать метод выделения полирибосом и лабильно ассоциированных с ними белков ("полирибосомного комплекса");

2) исследовать способность белков, ассоциированных с полирибосомами, АВР-рибозшшроваться под действием эндогенных ферментов;

3) исследовать способность этих белков фосфорилироваться под действием эндогенных протеинкиназ;

4) исследовать влияние ковалентных модификаций лабильно связанных белков полирибосом на их способность к ассоциации с полирибосомаш.

Научная новизна и практическая ценнооть работы. В результате проделанной работы были подобраны условия для выделения "полирибосомного комплекса", то есть препарата полирибосом с лабильно ассоциированными с ниш дополнительными белками. Оказалось, что в таком комплексе находятся все факторы, необходимые для процесса трансляции. Полученный полирибосомный комплекс обладал белок-синтезирущей активностью, сравниваемой с белок-синтезируицей активностью лизатов. Благодаря отсутствию в поли-рибосомном комплексе "балластных" (ненужных для трансляции) белков удалось получить более высокую удельную радиоактивность белков, что важно с практической точки зрения для ускорения детектирования вновь синтезированных белков методом радиоавтографии после электрофореза.

Исследовано АБр-рибозилирование и фосфорилирование белков в полирибосомном комплексе. Показано, что одним из апр-рибозили-руемых белков является фактор элонгации ер-2, а одним из фосфо-рилируемых белков - фактор элонгации ер-1« . Таким образом, обнаружены две ранее неизвестные ферментативные активности клетки: абр-рибозилтрансфераза ер-2 и Ег-Тс^-киназа. Исследованы некоторые свойства ер-1о<-киназы. Установлено, что аор-рибо-зилирование ер-2 под действием клеточной арр-рибозилтрансферазы происходит в той же части молекулы белка, которая аор-рибозили-руется под действием дифтерийного токсина. Предположено, что апр-рибозилирование ер-2 клеточным ферментом ингибирует его активность подобно дифтерийному токсину, вызывая диссоциацию фактора из лабильных комплексов с полирибосомами.

Показано, что фосфорилирование ер-1 по сх-субъединице приводит к диссоциации фактора из лабильных комплексов с полирибосомами. Предположено, что это должно приводить к уменьшению скорости элонгации полипептидных цепей.

Апробация работы. Основные результаты работы были доложены на 4 Советско-Итальянском симпозиуме "Макромолекулы в функционирующей клетке" (Киев, '1984), на Международной конференции "Структура, функция и генетика рибосомы" (Техас, США, 1985), на рабочем совещании емво (Патрас, Греция, 1986), на симпозиуме "Регуляция биосинтеза белка" (Коли Спринг Харбор, США, 1987), а также на заседании кафедры молекулярной биологии биологического факультета МГУ им. М.В.Ломоносова 2 июня 1987. года.

Структура работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, посвященного свойствам факторов элонгации эукариот и их роли в регуляции трансляции, экспериментальной части, выводов и списка цитированной литературы (134 источника). Диссертация изложена на 117 страницах машинописного текста, включает 27 рисунков. По теме диссертации опубликовано 6 печатных работ.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУВДЕНИЕ

1. Получение и характеристика полирибосомного комплекса

Эукариотические полирибосомы представляют собсй сложный комплекс, состоящий из рибосом, мРНП и большого количества дополнительных, лабильно ассоциированных белков. Последние составляют до 30^ общей массы полирибосом. Лабильно ассоциированные белки полирибосом являются компонентами аппарата трансляции: факторами инициации, элонгации, аминоацил-тРНК-синтетазами и др. (ОусЫппИсотг еЬ а1.,1978; Миних и др., -1985). Предполагается, что номпартментализация этих белков на полирибосомах повышает эффективность процесса трансляции.

Полирибосомный комплекс из экстрактов ретикулоцитов кролика выделяли методом гель-фильтрации через сефакрил э-зоо. Известно, что в "свободном объеме" колонки с сефанрилом з-зоо выходят частицы, имеющие молекулярный вес более одного миллиона. Для ускорения процесса фильтрации и получения препарата без увеличения его объема экстракт центрифугировали через предварительно просушенную колонку с сефакрилом э-зоо.

Было показано, что при гель-фильтрации экстрактов из ретикулоцитов кролика через сефакрил з-зоо в "свободном объеме" выходит практически весь рибосомннй материал экстракта: полирибосомы, монорибосомы и их субчастицы. Соотношение рибосом и полирибосом, равно как и профиль седиментационного распределения полирибосом при центрифугировании в градиенте сахарозы остаются неизменными. Концентрация белка в таком препарате варьирует от

6' до 15 мг/мл, содержание гемоглобина становится менее 1% от исходного. Препарат, как и предполагалось, содержит большое количество нерибосомных дополнительных белков. Спектр белков в полученном препарате резко отличается от спектра белков экстракта из ретикулоцитов кролика (рис.1).

гемоглобин

РисД. Гель-электрофорез белков в додецилсульфате натрия. А: 2 мкл исходного лизата ретикулоцитов кролика; Б: 25 мкл лизата ретикулоцитов кролика, пропущенного через сефакрил э-зоо (препарата "полирибосомного комплекса).

Полученный препарат (полирибосомный комплекс) сохраняет способность исходного экстракта синтезировать белок. При сравнении скорости биосинтеза белка в полирибосомном комплексе со скоростью биосинтеза белка в исходном экстракте оказалось, что в расчете на единицу объема они практически не отличаются (рис.2А). Белок-синтезирукицая активность полученного нами полирибосомного комплекса в расчете на мг белка в -15 раз выше, чем в исходном экстракте из ретикулоцитов кролика (рис.2Б). Таким образом, полученный нами препарат полирибосомного комплекса можно рассматривать и как бесклеточную систему трансляции, не уступающую

время, мин

Рис.2. Синтез белка в бесклеточной системе трансляции.

А: Включение р^С лейцина в новосинтезированный белок в расчете на единицу объема системы трансляции; Б: Включение [Т4с лейцина в новосинтезированный белок в расчете на мг суммарного белка системы трансляции.

•-• ретикулоцитный лизат после гель-фильтрации на

акрилексе АП-2 (АП-2 лизат); □—о ретикулоцитный лизат после гель-нфильтрации на

сефакриле Б-ЗОО (з-зоо лизат); х—х контрольный ретикулоцитный лизат.

по скорости включения аминокислот в белок лучшим системам трансляции из эукариот. По включений же аминокислот на мг белка полученная наш система является наиболее эффективной среди всех из-

вестных эукариотических бесклеточных систем трансляции. Способность полирибосомного комплекса поддерживать нормальную скорость биосинтеза белка свидетельствует о том, что среди дополнительных, лабильно ассоциированных с полирибосомами белков, находятся все факторы, необходимые для трансляции мРНК.

2. Эндогенное Арр-рибозилирование в политэибосомном комплексе

В последнее время накапливаются данные, что ADP-рибозили-рование белков является способом регуляции многих клеточных процессов. Мы исследовали ADF-рибозилирование белков в полири-босомном комплексе. Для этого полирибосомный комплекс инкубировали с р2Р jfiAD и после инкубации препарат подвергали гель-электрофорезу в присутствии додецилсулъфата натрия. Высушенные гели радиоавтографировали и анализировали набор меченых белков.

На рис.ЗА представлен радиоавтограф, демонстрирующий набор белков, метящихся в полирибосомном комплексе при инкубации с радиоактивным NAD+. На радиоавтограмме видно, что метка включилась в несколько полипептидов с молекулярными весами около 38, 60, 85, 96, 120 кДа.

А Б

Рис.3. ADP-рибозилирование белков в препарате полирибосомного комплекса (ОД o.e. л2бо) (А), в препарате EF-2 (5 мкг) (В) и в.их смеси (Б). Приведены радиоавтограммы после гель-электрофореза.

По результатам тонкослойной хроматографии препарат [ ^2р ] ИЛ1)+ не содержал радиоактивных примесей и в течение инкубации не обнаруживал заметных превращений. Радиоактивная метка из |с* -32р|атр в белки не включалась, а при инкубации полирибо-сомного комплекса с ¡^-32р|атр спектр меченых (фосфорилирован-гмх) белков был совершенно'шшм. Все это позволяет заключить, что мечение белков при инкубации с р2р|1Ш>+ является результатом их АБР-рибозилирования.

Хорошо известна реакция АЛР-рибозилирования фактора элонгации ЕР-2, катализируемая дифтерийным токсином. Эта реакция идет по уникальному аминокислотному остатку ЕР-2 - дифтамиду. Отсутствие дифтамида в ЕР-2 никак не сказывается на активности фактора, но АЮР-рибозилироваше дафгамада в ЕР-2 приводит к полному ингибированию активности фактора. Нами было предположено, что дифтамид ер-2 служит мишенью для клеточных АОР-рибозил-трансфераз, а Аир-рибозилирование ЕР-2 - один из способов регуляции биосинтеза белка в клетке.

В препарате полирибосомного комплекса, инкубированного с р2р|гш)+ , обнаруживался АБР-рибозилированный белок с молекулярным весом 96 кДа, на одномерном гель-электрофорезе совпадавший с ЕР-2 (рис.ЗА). При добавлении избытка очищенного ЕР-2 в инкубационную смесь, содержащую р2Р^А0+ и препарат полирибосомного комплекса, включение метки в белок с молекулярным весом 96 кДа заметно увеличивалось. Этот белок становился основным радиоактивно меченным компонентом (рис.ЗБ). В то же время контрольная инкубация ЕР-2 с р2р|юш+ не приводила к включению метки в белок (рис.ЗВ).

Можно заключить, что полирибосомный комплекс содержит ферментативную активность, ответственную за АЮР-рибозилирование фактора элонгации ЕР-2.

Добавляя большой избыток фактора элонгации ЕР-2 к препарату полирибосомного комплекса, мы добились того, что фактор ЕР-2 становился основным АСР-рибозилирующимся компонентом такой смеси (рис.4А). После обработки этой смеси эластазой набор радиоактивно меченных фрагментов (рис.4В) совпадал с набором меченых фрагментов, образующихся при эластазной обработке ЕР-2, АЩ>-рибози-лированного дифтерийным токсином (рис.4Б,Г), Таким образом, и эндогенная АОР-рибозилтрансфераза полирибосомного комплекса, и дифтерийный токсин модифицируют один и тот же участок ЕР-2, содержащий дифтамид. При осаждении реакционной смеси 80% ацетоном (в этих условиях радиоактивный ИА1)+ и большинство белков выпадают в осадок) с последующим растворением осадка в буфере для

Рис.4, ADP-рибозилирование в препарате полирибосомного комплекса, содержащем избыток EF-2. под действием клеточной ADP-рибозилтрансферазы и -^Р NAD+ (А,В) либо дифтерийного токсина и had (Б,Г). После ADP-рибозилирования препарат подвергали ограниченному протеолизу в присутствии эластазы (В,Г). Приведены радиоавтограммы после гель-электрофореза.

инкубации происходит заметное усиление ADP-рибозилирования белков. Оно становится сопоставимо по интенсивности с ADP-рибозили-рованием ер-2 -под действием дифтерийного токсина. Спектр ADP-ри-бозилируемых белков изменяется, и основным ADP-рибозилирущимся компонентом становится фактор элонгации EF-2. Механизм активации ADP-рибозилирования'под действием ацетона пока неясен. Возможно, в щлетоне растворяется некий ингибитор ADP-рибозилтрансфе-раз гидрофобной природы. Не исключено, однако, что в этих условиях происходит лишь неспецифическая химическая (неферментативная) модификация белков.

Ранее было показано, что adp-рибозилирование EF-2 по дифт-амиду под действием дифтерийного токсина приводит к утрате фактором неспецифического сродства к РНК и к диссоциации модифицированного фактора из полирибосом (Sitikov et ai. , 1984). Предположено, что декомпартментализация adp-рибозилированного ер-2

из полирибосом является одной из причин ингибирования белкового синтеза. Вполне вероятно, что АВР-рибозилирование ЕР-2, катализируемое клеточным ферментом, также идет по дифтамиду и представляет собой физиологический способ регуляции трансляции.

3. фосфорилирование белков в полирибосомном комплексе

3.1. Набоц бежов_по.^ибосомного_кощлексаА фосфориллр^е-мых в разных_условиях

Фосфорилирование белков является широко распространенным способом регуляции внутриклеточных процессов. Мы исследовали эндогенное фосфорилирование в полирибосомном комплексе. При инкубации полирибосомного комплекса с |^-"32р|атр при ионных условиях, близких к физиологическим, фосфорилируется целый ряд белков (рис.5А). При инкубации такого комплекса с |;Г--32р|атр в отсутствие одновалентных ионов радиоактивная метка включается только в один полипептид с молекулярной массой около 50 кДа (рис.5Б), который не метился в условиях, близких к физиологическим. Другими словами, в низкой ионной силе происходит активация протеиякиназы, специфичной по отношению к белку 50 хДа.

А Б

Рис.5. Фосфорилирование белков в полирибосомном комплексе. Приведены радиоавтограммы после гель-электрофореза. А: фосфорилирование в условиях физиологической ионной силы;

Б: фосфорилирование в отсутствие ионов к .

Мы обратили внимание на то, что положение в геле после электрофореза белка 50 кДа, избирательно фосфорилируемого при низкой ионной силе, совпадает с положением «-субъединицы фактора элонгации ер-1. При добавлении препарата ер-1 в инкубационную смесь включение радиоактивной метки в белок 50 кДа заметно увеличивается (рис.6А,Б). В то же время контрольная инкубация ер-1 с не приводит к включению метки в о<-субъедини-

цу фактора элонгации ер-1 (рис.бВ). Из этих данных можно сделать виппп ■"то фосфорюшруешй в низкой ионной силе полипептид явля-субъединицей фактора элонгации ер-1. Действительно, при

Рис.6.

-50 «На

Фосфорилирование белков при низкой ионной силе в полирибосомном комплексе

(A), в препарате ер-1

(B) и в их смеси (Б). Приведены радиоавтограм-мы после гель-электрофореза.

двумерном анализе по О'Фарреллу -субъединица ер-1 и белок 50 кДа, фосфорилируемый в полирибосомном комплексе в условиях низкой ионной силы,занимают одно и то же положение (рис.7). Таким образом, в полирибосомном комплексе в отсутствие одновалентных катионов активируется протеинкиназа, строго специфичная к фактору элонгации ер-1ос - ер-1 -киназа.

3.2. Изучение ..некоторых свойств ер-1 о< -киназы

Очистку ер-1ос-киназы проводили из экстрактов ретикулоцитов кролика, используя две основные стадии: хроматографию на РНК-се-фарозе и на гидроксилапатите. На первой стадии была достигнута очистка приблизительно в 200 раз, и затем на гидроксилапатите фермент был очищен еще в 20 раз. Тем не менее, полученный препа-

А

-1?

Г

рОСОО

Рис.7. Двумерный анализ по О'Фарреллу белков полирибосомного комплекса, инкубированных с [X-32р]атр при низкой ионной силе (А) и фактора элонгации ер-1 (Б). А: радиоавтограмма; Б: окрашивание Кумасси.

рат был гетерогенен, и мы не смогли идентифицировать ЕР-1^-кина-зу среди других компонентов. На первой стадии очистки-хроматографии на РНК-сефарозе - ЕР-1с^-киназа адсорбировалась на иммобилизованной РНК. Следовательно, эта киназа принадлежит к классу РНК-связывагацих белков. Как правило, в этот класс попадают белки, имеющие непосредственное отношение к процессу трансляции. Большинство других традиционных способов очистки белков оказались малоэффективными для выделения этой киназы. При изохроматофоку-сировании с применением системы "ррьс" ("Фармация"), например, происходило даже некоторое уменьшение удельной активности киназы. Однако в этом случае нам удалось оценить ее изоэлектричес-кую точку, которая оказалась равной 6,8 ед. рН. Используя гру-боочищенный препарат ер-1 с* -киназы, мы исследовали некоторые ее свойства.

Кинетика фосфорилирования в таком препарате на протяжении длительного времени практически линейна. Как и ожидалось, зависимость ферментативной активности киназы обратно пропорциональ-

на концентрации ионов калия. Оптимум ее работы находится при нулевой концентрации к+. Ионы натрия практически не влияют на активность ер-1с* -киназы. Активность ef-1o<. -киназы зависит от концентрации ионов Mg2+ и имеет оптимум при 6 мМ MgCi2. Активируют EF-1 сх -киназу и ионы других двухвалентных металлов, такие как Саг+, (Лп2+, но с несколько меньшей эффективностью по сравнению с Mg2+. Практически не влияет на активность киназы изменение рН в широком диапазоне значений (от 6 до 9 ед. рН).

Активность ef-1o<-киназы стимулируется'при добавлении РНК (мРНК > рРНК » тРНК).

При температурах, близких к нулю, киназа практически неактивна, а при температурах выше 65°С она необратимо инактиви-руется.

Мы идентифицировали аминокислотный остаток, фосфорилируемый в факторе элонгации ер-1о< под действием киназы, методом высоковольтного электрофореза на бумаге, предварительно гидролизовав меченый фактор до аминокислот. Оказалось, что в факторе фосфо-рилируется треониновый остаток.

Нам не удалось отнести ЕР-1 <л-киназу ни к одному из известных классов протеинкиназ. В специальном исследовании мы установили, что ни казеин, ни гистоны не являются ее субстратами. EF-1 ot -киназа не стимулируется ни сАМР, ни cGMP. Ее активность не зависит также от присутствия калмодулина, а ингибитор калмо-дулинзависимых протеинкиназ - трифторпиразин - не уменьшает ее активность. Форболовые эфиры и диацилглицерин также не влияют на активность ЕР-Чс*-киназы. Отличительной особенностью киназы является то, что в качестве донора фосфатной группы она, наряду с атр, в равной степени использует другие нуклеозидтрифосфаты -gtp, стр, utp. Ингибирование ферментативной активности EF-1'X-киназы минимальными концентрациями ионов калия и стимулирование РНК также являются ее характерными особенностями. Все это позволяет заключить, что EF-1 с*-киназа относится к новому классу клеточных протеинкиназ. Данные о свойствах ef-1-x-киназы сведены в таблицу.

3.3. Фа£тор_элонгацш_ЕР-2 докиаает_полирибосомы после ¡|юсфорилирования_

Центрифугирование в сахарозном градиенте полирибосомного комплекса с последующей инкубацией каждой фракции сахарозного градиента с -32р]атр в условиях низкой ионной силы показало, что радиоактивная метка, включаемая в ТХУ-нерастворимый продукт, обнаруживается как в зоне моно-, так и в зоне полирибосом (рис Ж,

Таблица

Свойства EF-1 <х-киназы

Ж"

ГШ

1. Акцепторы фосфатной группы

2. Доноры фосфатной группы

3. Модифицируемый аминокислотный остаток

4. Оптимум к+

5. Оптимум Мв2+

6. Оптимум рН

7. Изоэлектрическая точка

8. Молекулярный вес

9. Влияние ионов Са2

10. Калмодулин 'И. Трифторпиразин

12. Влияние высокомолекулярной РНК

13. Связывание с РНК

14. Место локализации в клетке

.2+

ТОЛЬКО ЕР-1СЧ

в равной степени атр, стр, СТР, итр

треонин

О мМ (30 мМ полностью ингибирует)

6-8 мМ

6-9 ед. рН

~ 6,8 ед. рН

не определили

слегка'стимулирует

не влияет

не влияет

активирует

связывается

полирибосомы

внизу). При этом распределение включенной в белок метки коррелирует с полирибосомным профилем. Анализ ТХУ-нерастворимого продукта при помощи электрофореза с последующей радиоавтографией показал, что вся метка и в этом эксперименте включилась только в один белок, идентифицированный нами ранее как фактор элонгации EF-1 (рис.8А, вверху). Можно заключить, что и EF-1 с< -кина-за, и фосфорилируемый ею EF-1 распределяются в градиенте сахарозы в соответствии с профилем полирибосом, то есть, очевидно, ассоциированы с ними.

Если же центрифугировать в сахарозном градиенте препарат полирибосомного комплекса с заранее добавленным к нему избытком экзогенной высокомолекулярной РНК, то после центрифугирования и инкубации фракций с [У-32р]атр радиоактивная метка обнаруживается в пострибосомнои зоне (рис.8Б). Это означает, что экзогенная РНК вытесняет из поли- и монорибосом фактор элонгации ef-1, что было известно ранее (Власик и др., 1983), и, вероятно, ef-1cx-киназу. Чтобы окончательно доказать, что РНК вытесняет EF-1-л-ки-назу из рибосом, к фракциям градиента был добавлен экзогенный ef-1 и они были проинкубированы с I /Г--32? 1 атр • Оказалось, что

50000

см с\г со

й

РР

10 2

260

НОМЕР ФРАКЦИИ

Рис.8. Седиментационное распределение 7 o.e. А?аг, препарата полирибосомного комплекса после центрифугирования в градиенте сахарозы.

I/ -Згр]лтр был добавлен после центрифугирования (А,Б) либо до центрифугирования (В). В случае Б к препарату полирибосом было добавлено 20 o.e. 16s рРНК перед центрифугированием. Сверху даны радиоавтографам после гель-электрофореза меченых белков из соответствующих Фракций градиента.

— включение

3?.

р в белок (иш/мин х Ю-4);

оптическое поглощение материала при 260 нм (o.e.).

EF-1 не стимулирует включение метки во фракциях, соответствующих зоне моно- и полирибосом, в то время как во фракциях пост-рибосомальной зоны избыток ЕР-1 приводит к увеличению радиоактивного ТХУ-нерастворимого продукта.

Таким образом, можно заключить, что экзогенная РНК вытесняет из комплексов с моно- и полирибосомами как фактор элонгации ЕР—1, так и ef-loí-киназу. Из этого следует, что эти комплексы лабильны и что, очевидно, и ЕР-1сх-киназа, и сам ef-1 удерживаются на рибосомах за счет сродства к РНК.

Для выяснения роли фосфорилирования ef-1 в неспецифическом связывании этого фактора с рибосомами был проведен следующий эксперимент. Центрифугирование в сахарозном градиенте фравдии рибосом и ассоциированных с ними белков, в которой предварительно в УСЛОВИЯХ НИЗКОЙ ИОННОЙ СИЛЫ и jV-32p]ATP 0ЫЛ профосфори-лирован фактор элонгации ер-1, показало, что весь радиоактивно меченный ер-1 обнаруживается на верху градиента, в зоне свободных белков. Фосфорилированный ер-1 не обнаруживается в комплексе с моно- и полирибосомами (рис.8В). Так как центрифугирование мы проводим при температуре от 2°С до 4°С, то дофосфорилирования ер-1 в процессе центрифугирования не происходит, так как при этих температурах ер-1 с<-киназа неактивна. Об этом же свидетельствуют и эксперименты, в которых [¿¡"-32р|атр добавляли к препарату полирибосомного комплекса и немедленно (без инкубации) наносили эту смесь на сахарозный'градиент. В этом случае включения метки в ер-1 ни в одной фракции сахарозного градиента обнаружить не удавалось. Таким образом, можно заключить, что фосфорилирова-ние фактора элонгации ер-1 приводит к утрате им неспецифического сродства к полирлбосомам. Мы считаем, что это должно приводить к уменьшению скорости элонгации полипептидной цепи и служить способом регуляции трансляции на уровне элонгации.

ВЫВОДЫ

1. Отработан метод выделения комплекса полирибосом с лабильно ассоциированными белками гель-фильтрацией на сефакриле S-300. Показано, что такой полирибосомный комплекс может служить эффективной бесклеточной системой трансляции.

2. Исследовано ADP-рибозилирование белков полирибосомного комплекса. Показано, что комплекс содержит ADP-рибозилтрансфера-зу, переносящую остаток ADP-рибозы с had+ на ряд белков этого комплекса. Одним из ADP-рибозилируемых белков оказался фактор элонгации EF-2.

Предположено, что ADP-рибозилтрансфераза ef-2 участвует в физиологической регуляции скорости трансляции.

3. Исследовано фосфорилирование белков полиркбосомного комплекса. Показано, что в комплексе с полирибосомами находятся про-теинкиназы, фосфорилирующие целый ряд белков комплекса. Обнаружено, что в условиях низкой ионной силы избирательно фосфорили-руется о<-субъединица фактора элонгации ef-1. Фосфорилирование происходит по треониновому остатку и ведет к диссоциации фактора из комплексов с полирибосомами. Предполагается, что фосфорилирование ef-1iX, катализируемое ef-1-киназой, регулирует белковый синтез на стадии элонгации.

4. Исследованы некоторые свойства EF-1-киназы. Показано, что эта протеинкиназа отличается от всех протеинкиназ, известных ранее. Она активируется рибонуклеиновыми кислотами, в качестве субстратов в равной степени использует все четыре рибонуклеозид-трифосфата и ингибируется минимальными концентрациями ионов каши.

Материалы диссертации опубликованы в следующих работах:

-I. А.С.Ситиков, Е.К.Давыдова, Л.П.Овчинников. Ингибирование белкового синтеза при adp-рибозилировании ef-2 сопровождается диссоциацией фактора из полирибосом. - Тез. стенд, сообщ. 4-го симп. СССР-Италия ''Макромолекулы в функционирующей клетке", Киев, -1984, с.113.

2. A.S.Sitikov, E.K.Davydova, L.P.Ovchinnikov. Endogenous ADP-ribosylation of elongation factor 2 in polyribosome fraction of rabbit reticulocytes. - FEBS Lett., 1984, v.176, p.261-263.

3. E.K.Davydova, A.S.Sitikov, L.P.Ovchinnikov. Phosphorylation of elongation factor 1 in polyribosome fraction of rabbit reticulocytes. - FEBS Lett., 1984, v.176, p.401-405.

4. L.P.Ovchinnikov, E.K.Davydova, A.S.Sitikov. Effect of physiological covalent modifications of eucaryotic elongation factors on their association with polyribosomes. - International conference on the "Structure, Function and Genetics of Ribo-зошаз", Thesis. Texas (USA), 1985, p.11-13-

5. L.P.Ovchinnikov, A.T.Alzhanova, E.K.Davydova, V.B.Minikh, A.S.Sitikov, A.N.Fedorov, A.S.Spirin. Compartmentation of proteins of the eucaryotic translation machinery on polyribosomes. - EMBO-Viorkshop, Thesis. Patras (Greece), 1986, p.24.

6. L.P.Ovchinnikov, E.K.Davydova, A.S.Sitikov, P.N.Simonenko, A.G.Ryasanov, P.G.Natapov, E.A.Shestakova, A.S.Spirin. Covalent modifications of the elongation factor 2 (EF-2) and elongation rate regulation. - Gold Spring Harbor Conference on Translational Control, Thesis. Cold Spring Harbor Labora-

tory (USA), 1987, p.39.